Korean Journal of Microbiology (2019) Vol. 55, No. 3, pp pissn DOI eissn Copyright

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1 Korean Journal of Microbiology (2019) Vol. 55, No. 3, pp pissn DOI eissn Copyright c 2019, The Microbiological Society of Korea 형광리포터를활용한효모단백질잡종기법개발 박성균 서수련 * 황병준 * 강원대학교의생명과학대학분자생명과학과 Yeast two-hybrid assay with fluorescence reporter Seong Kyun Park, Su Ryeon Seo*, and Byung Joon Hwang* Department of Molecular Bioscience, College of Biomedical Science, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Republic of Korea (Received August 2, 2019; Revised August 27, 2019; Accepted August 27, 2019) Yeast two-hybrid (Y2H) technique has been used to study protein-protein interactions, but its application particularly to a large-scale analysis of protein interaction networks, is limited by the fact that the technique is labor-intensive, based on scoring colonies on plate. Here, we develop a new reporter for the measurement of the protein-protein interactions by flow cytometry. The yeast harboring interacting proteins can also be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or magnetic-activated cell sorting (MACS). When two interacting proteins are present in the same yeast cell, a reporter protein containing 10 tandem repeats of c-myc epitope becomes localized on the surface of the cell wall, without affecting cell growth. We successful measured the surface display of c-myc epitope upon interacting p53 with SV40 T antigen by flow cytometry. Thus, the newly developed Y2H assay based on the display of c-myc repeat on yeast cell wall could be used to the simultaneous analysis of multiple protein-protein interactions without laborious counting colonies on plate. Keywords: flow cytometry, fluorescence reporter, protein-protein interaction, yeast two-hybrid 세포내에서이루어지는단백질간의상호작용에대한정보는생명현상을이해하는데있어서매우중요한의미를갖는 *For correspondence. (B.J. Hwang) bjhwang@kangwon.ac.kr; Tel.: ; Fax: / (S.R. Seo) suryeonseo@kangwon.ac.kr; Tel.: ; Fax: 다. 생화학 (biochemistry), 단백질체학 (proteomics), 분자동력학 (molecular dynamics), 신호전달 (signal transduction) 등의다양한학문에서단백질간의상호작용을밝히기위한노력이현재까지지속되고있다. 최근사용되고있는단백질간의상호작용을분석하는방법들은 co-immunoprecipitation (co-ip), fluorescence resonance energy transfer (FRET), yeast twohybrid assay 및 bimolecular fluorescence complementation (BiFC) 등이잘알려져있다 (Rual et al., 2005; Berggard et al., 2007). 그중에서도 yeast two-hybrid assay는효모세포내에서특정단백질에물리적으로결합하는상호작용파트너단백질을선별하기위하여고안된방법이다. 그원리는전사인자의 DNA 결합도메인과전사활성화도메인을서로다른 plasmid에서특정단백질과융합된형태로발현하였을때, 각도메인에융합된단백질간의물리적결합으로하나의복합체 (complex) 를이루게되면서리포터유전자의발현을유도하고, 이들근거로단백질간의물리적결합유무를판별한다. 일반적으로 DNA 결합도메인에는연구대상단백질을융합하고전사활성도메인에는라이브러리를구성하여특정단백질에결합하는파트너단백질을선별하는형식이가장널리사용되고있다. 대표적인리포터는 LacZ, MEL1의효모 colony의색상변화를유도하는유전자와 HIS3, ADE2, URA3의특정아미노산이나핵산의합성에관련된유전자들이알려져있다 (Fields and Song, 1989; Fields and Sternglanz, 1994; Van Criekinge and Beyaert, 1999; Sambrook and Russell, 2006; Bruckner et

2 200 Park et al. al., 2009). Yeast two-hybrid assay 방법을이용하여대규모연구를진행하였을때가장문제가되는점은리포터유전자들이대규모선별에적합하지않다는것이다. 현재사용되고있는리포터들은필수적으로한천배지를이용하는데, 선별에사용되는라이브러리의다양성이높을수록더많은양의한천배지를사용해야된다. 따라서대규모선별을진행하는데있어서많은노동과시간이소요된다 (Berggard et al., 2007; Blikstad and Ivarsson, 2015). 따라서본연구는새로운 yeast two-hybrid 리포터개발을통해서대규모선별과정을보다효율적으로수행할수있게하였다. 새로운리포터유전자는반복된항원 (c-myc epitope) 을효모표면에발현하고, 형광또는자성물질이표지된항체의염색을통하여 fluorescence-activated cell sorting (FACS) 또는 magnetic-activated cell sorting (MACS) 를이용하여손쉽게리포터를발현하는효모세포를선별하였다. 결과적으로새로운리포터유전자의도입에따라기존분석방법의한천배지사용을제거함으로써분석비용과시간, 노동력을현저히낮출수있고, 높은수준의다양성을갖는라이브러리를이용한대규모단백질결합분석을쉽게수행할수있을것으로기대한다. 재료및방법 대장균주및배양조건본연구에서사용된대장균주는 Escherichia coli Top10F' (F'{lacI q Tn10(Tet R )} mcra (mrr-hsdrms-mcrbc) Φ80 lacz M15 lacx74 reca1 arad139 (ara-leu)7697 galu galk rpsl enda1 nupg, Invitrogen) 이며, 재조합벡터의수용, 보존, 증폭및회수에이용하였다. 일반적으로 LB 배지 (1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl) 를이용, 37 C에서배양하였다. 필요에따라서 ampicillin (100 μg/ml), tetracycline (12.5 μg/ml) 또는 kanamycin (25 μg/ml) 을첨가하여재조합벡터를포함하고있는대장균을선별하였다. 효모균주및배양조건리포터유전자의발현수준은 EBY100 (MATa GAL1-AGA1:: URA3 ura3-52 trp1 leu2 1 his3 200 pep4::his2 prb1 1.6R can1 GAL, Invitrogen) 효모균주를사용하였다. Yeast two-hybrid 분석은 JC993 (MATa gal4 gal80 trp1-901 ura3-52 leu2-3 leu2-112 his3 URA3::GAL1-LacZ, ATCC ) 균주를사용하 였다. 효모균주배양은완전배지 YPD (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose) 와최소배지 SDCAA (6.7% Yeast nitrogen base, Amino acid drop out mixture, 2% Glucose, 형질전환체선별및유지에사용 ), SGCAA (6.7% Yeast nitrogen base, Amino acid drop out mixture, 2% Galactose, 1% Raffinose, 리포터유전자의발현유도에사용 ) 를사용하였다. 한천배지에는 1.6% 한천 (agar) 을첨가하였다. 일반적으로효모는 30 C에서배양하였다. Yeast two-hybrid assay 관련 plasmid 및 primer DNA Yeast two-hybrid assay 에필요한벡터인 pgadt7, pgadt7-t, pgbkt7, pgbkt7-p53, pgbkt7-lam, PCL19 (Clontech) 은 Top10F에저장하였으며, 진위여부를여러제한효소를처리하여나타나는절편의크기를통하여확인하였다. 본연구에서사용된 primer의서열정보는 Table 1에정리하였다. Leu2-GFP 발현벡터제작 pgadt7, pgadt7-t (Clontech) 를기반으로 Leu2 유전자의 C-말단의종결코돈을제거하고 TurboGFP 유전자를연결하여 pgad-tgfp, pgad-t-tgfp 벡터를구축하였다. TurboGFP 유전자는 pgipz plasmid를주형으로 TurboGFP (F) SacII, TurboGFP STOP (R) AscI primer를이용하여 PCR 증폭하였고벡터는 pgadt7과 pgadt7-t를주형으로 pgadt7-leu2- [turbogfp] (F) SacII, pgadt7-leu2-[turbogfp] (R) Asc1 primer를이용하여 PCR 증폭하였다. 얻어진벡터와 TurboGFP 유전자를 SacII와 AscI 제한효소자리를이용하여재조합하였다. 효모표면에 myc epitope 발현벡터제작효모표면 mycepitope 발현벡터는 pyd1 (Invitrogen) 를기반으로제작하였다. Agα1 유전자는 EBY100 효모균주의 genomic DNA를주형으로 Agα1 (F) BglII, AgαI (R) PmeI primer를이용하여 PCR 산물을얻은후제한효소 BglII와 PmeI 이용하여 pyd1 벡터에재조합하여 pgal1-agα1 벡터의구축하였다. c-myc epitope (EQKLISEEDL) 은 phab006 (unpublished) 를주형으로 Myc1 (F) MluI, Myc1 (R) HindIII primer를이용하여 PCR 산물을증폭하였다. PCR 산물과 pyd1 벡터를제한효소 HindIII를처리한후, T4 DNA ligase를처리하여연결하고 Myc1 (F) MluI, GS linker (R) XhoI primer를이용한 PCR을통해서 c-myc epitope의 3' 말단에 GS linker가연결된 PCR 산 미생물학회지제 55 권제 3 호

3 Yeast two-hybrid assay with fluorescence reporter 201 Table 1. Nucleotide sequences of the primers used in this study Primer name TurboGFP (F) SacII, TurboGFP STOP (R) AscI pgadt7-leu2-[turbogfp] (F) SacII pgadt7-leu2-[turbogfp] (R) Asc1 Agα1 (F) BglII AgαI (R) PmeI Myc1 (F) MluI Myc1 (R) HindIII GS linker (R) XhoI Agα1 S.P 20 (R) MluI AgαI 350 a.a (F) XhoI MFα1 (F) BglII MFα1 (R) MluI Myc 5, 10 (F) MluI Myc 5 (R) HindIII Myc 10 (R) HindIII Integ. GAL1 (F) SacII Integ. Agα1 (R) SacII Sequence (5' 3') GCG ATC GTG ACC GCG GAT GGA GAG CGA GAG CGG GGC TCA GAC GGC GCG CCT TAT TCT TCA CCG GCA TCT GCA T GCG ATC GTG ACC GCG GAG CAA GGA TTT TCT TAA CTT GGC TCA GAC GGC GCG CCT AAA AAG ATT CTC TTT T CTA ATG AGA TCT ATG TTC ACT TTT CTC AAA AT TAA TTT GTT TAA ACT TTC GAT AAC ATT CTG TTA GAT ACG CGT TCC CAT CGA TTT AAA CAC GAG AAG CTT CAT TTC ATT CAA GTC ATG TAT CTC GAG AGT CAT GCT AGC AGA ACC AC CAG ATG ACG CGT GAT ATC GTT GAT ATT TAT AG TTC AAG CTC GAG CTT GAT ACC ATA GCA AAT AC GCT ACG AGA TCT ATG AGA TTT CCT TCA ATT TT CAT AGC ACG CGT AGC TTC AGC CTC TCT TTT CT GAC TCA ACG CGT AAC ACA CAG TAT GTT TTT GAT GCC ATG AAG CTT GGA CAT TTT GAT CGA CTG ATT AAG CTT GCC ATT AGC GGC GGT CAT TAC CCG CGG ACG GAT TAG AAG CCG AG CTG ACT CCG CGG TTT CGA TAA CAT TCT GCG AT 물을증폭하였다. MFα1 (secretory signal peptide sequence) 을얻기위해 ppiczαa (Invitrogen) 벡터를주형으로 MFα1 (F) BglII, MFα1 (R) MluI primer를이용하여 PCR 산물을얻은후, c-myc_gs linker PCR 산물과함께제한효소 MluI을처리한후 T4 DNA ligase를처리하여연결하고 Agα1 S.P 20 (R) MluI, Agα1 350 aa (F) XhoI primer를이용하여 PCR 산물을얻은후, 제한효소 MluI과 XhoI 을처리하여 pgal1-agα1 벡터에재조합하여 pgal1-agα1- myc1 벡터를제작하였다. Myc5 및 myc10 tandem repeat epitope 은 padh-aga2-myc10 (unpublished) 을주형으로 myc5는 Myc5, 10 (F) MluI, Myc5 (R) HindIII, myc10은 Myc5, 10 (F) MluI, Myc10 (R) HindIII primer를이용하여 PCR을통하여얻은후제한효소 MluI과 HindIII를처리하여 pgal1-agα1-myc1 에재조합하여 pgal1- Agα1-myc5, pgal1-agα1-myc10 벡터를제작하였다. 본연구를통하여제작된모든벡터는 sanger sequencing을통하여정확한염기서열을검증하였다. 효모표면에 myc epitope 발현리포터의효모유전체에삽입 Homologous DNA recombination을이용하여효모유전체 integration을유도하기위하여 prs303 (NEB) 벡터을사용하였다. pgal1-agα1-myc10 벡터를주형으로, Integ. GAL1 (F) SacII, Integ. Agα1 (R) SacII primer를이용하여 PCR 산물을얻은후제한효소 SacII를처리하여 prs303 벡터에재조합하여 prs-pgal1-agα1-myc10 벡터를제작하였다. 효모의형질전환형질전환하루전 YPD 배지에효모를접종하고 30 C에서배양한다. 다음날 OD 600 값을측정하여 YPD 배지에최종 OD 600 이 0.1이되도록접종한후, 30 C에서 OD 600 이 0.6이될때까지배양한다. 700 g에서 5분간원심분리후, 배지를제거하고, 멸균증류수를이용하여효모 pellet을 washing한후, 증류수를원심분리제거한다. 여기에 1.5 ml 1.1X TE/LiAc solution (0.11 M Lithium acetate in TE) 을넣고 pellet을 washing한후, 원심분리제거후 0.6 ml 1.1X TE/LiAc solution을넣어 pellet 을현탁하게만들어서 competence를부여하였다. 얻어진 50 μl competent 효모에 plasmid 100 ng과 yeast career DNA 5 μg (5 mg/ml) mixture와잘섞은후 0.5 ml PEG/TE/LiAc solution (50% PEG, 0.1 M Lithium acetate in TE) 를넣고 30 C에서 30 분간방치후, 20 μl DMSO (Molecular biology grade) 를넣고 42 C에서 15분간방치한다. 이후원심분리를통해서상층액을모두제거하고, 1 ml 0.9% NaCl을넣어 pellet을현탁후, 적합한 SDCAA 한천배지에도말하여형질전환체를선별하였다. Korean Journal of Microbiology, Vol. 55, No. 3

4 202 Park et al. Galactose induction Plasmid를보유하고있는효모균주를 SD/-Trp 배지 (6.7% Yeast nitrogen base w/o amino acid, 5% Casamino acid, 2% Glucose) 에접종하여 24시간동안배양 (30 C, 200 rpm) 후, 700 g에서 5분간원심분리를통해서배지를제거하고, SG/-Trp 배지 (6.7% Yeast nitrogen base w/o amino acid, 5% Casamino acid, 2% Galactose, 1% Raffinose) 를이용하여 2차례 washing 하여잔존하는 glucose를제거하였으며, 최종 OD 600 값이 1.0 이되도록 SG/-Trp 배지에접종하여 24시간동안배양 (22 C, 230 rpm) 하였다. Antibody staining 의효모세포 (OD 600 = 1.0) 를준비하여 WB buffer (1X PBS with 0.5% BSA, 2 mm EDTA) 로한차례 washing을한후, WB buffer에 mouse α-c-myc 항체 (9e10, 2 mg/ml) 를 1:500 비율로희석하고 100 μl를이용하여효모 pellet을현탁후, 4 C 에서 30분간 1차항체염색하였다. 1차염색후 WB buffer를이용한세척을통하여항체를최대한제거하였다. 2차항체염색은 WB buffer에형광현미경을이용한분석은 goat α-mouse IgG- Alexa Flour 568 항체 (2 mg/ml) 를 flow cytometer를이용한분석은 goat α-mouse IgG-Cy5 항체 (2 mg/ml) 를 1:500의비율로희석하고 100 μl를이용하여효모 pellet을현탁후 4 C에서 30분간염색하였다. 1X PBS로한차례 washing 후, 형광을관찰하였다. 결과및고찰 형광리포터를활용한 yeast two -hybrid assay 개발본연구는기존리포터들을활용한 yeast two-hybrid assay 가대규모분석연구에많은노력이필요하며, 그주된원인이대량의한천배지를사용해야하기때문이라고판단하였다. 선별에사용되는라이브러리의다양성이증가할수록양성 clone 을선별하기위해필요한한천배지의양이지수적으로증가하기때문에많은시간과비용그리고노동력이뒷받침되어야대규모분석이가능하다. 따라서분석과정을효율적인방향으로발전시키기위하여새로운형태의리포터시스템을적용하는것이본연구의궁극적인목표이다. 따라서 yeast two-hybrid assay의한천배지사용을대체하기위한대안으로 FACS를사용하는것이대규모분석에매우적합하다고판단하였고이를이용하기위한리포터시스템을구축하였다 (Fig. 1). 첫째, pgadt7 ( 전사활성도메인융합단백질을발현하는 plasmid) 의 LEU2 유전자에 TurboGFP 유전자를결합하여 LEU2-GFP 융합단백질이발현되는 pgad-tgfp plasmid를제작하였다 (Fig. 1A). 이 plasmid는 FACS를이용하여양성 clone을선별함에있어서, 본 plasmid를보유하고있는형질전환 clone을 GFP 형광발현을이용해서선별하기위하여도입하였다. 둘째, 효모의표면에총 10개의 c-myc epitope이발현되는리포터시스템을효모유전체상에구축하였다. 반복되는 myc epitope이효모표면발현단백질인 Agα1 (SAG1) 단 형광현미경을이용한분석 본연구에서는 slide glass를이용한효모의형광을확인하기위하여 Leica DM2500 (upright microscope) 를사용해서 GFP 및 RFP 형광을관찰하였다. 한천배지상의효모 colony 형광관찰에는 Leica DM IL LED (inverted microscope) 를사용하였다. 현미경이미지는 MetaMorph (Molecular Devices) software를이용해서분석하였다. (A) Flow cytometry 를이용한형광분석 Moflo XDP high speed cell sorter (Backman coulter) 를사용하여형광을분석하였다. GFP 형광은 488 nm laser를이용하여 excitation을유도하였고, 이를통한 emission은 FL1 detector (530/30 band pass filter) 를통하여확인하였다. Cy5에의한형광은 633 nm laser를이용하여 excitation을유도하였고, 이를통한 emission은 FL10 detector (650/40 band pass filter) 를통하여확인하였다. 데이터의분석에는 Kaluza (Backman coulter) 분석프로그램을사용하였다. (B) Fig. 1. Vectors and reports used in this study. (A) pgadt7 and pgadtgfp plasmids. The pgad-tgfp plasmid expresses LEU2-TurboGFP, but not LEU2. (B) The fluorescence reporter developed in this study contains 10 repeats of c-myc epitope that is localized on the cell wall of Saccharomyces cerevisiae. 미생물학회지제 55 권제 3 호

Yeast two-hybrid assay with fluorescence reporter 203 백질의 C말단약 300개아미노산부분과 fusion 형태로효모표면에발현될수있도록하였다. 형광단백질을사용하지않고효모표면에발현되는 myc epitope 항원을리포터로사용함으로써응용범위를넓혔다.

(A) (B) pgad-tgfp plasmid 검증 pgad-tgfp plasmid가효모안으로도입되었을때 LEU2- turbogfp 단백질이정상적으로발현되는지확인하기위하여 JC993 효모균주에 pgadt7 또는 pgad-tgfp plasmid를보유하고있는형질전환체에서 GFP 형광발현을관찰하였다 (Fig. 2A).

5 Yeast two-hybrid assay with fluorescence reporter 203 백질의 C말단약 300개아미노산부분과 fusion 형태로효모표면에발현될수있도록하였다. 형광단백질을사용하지않고효모표면에발현되는 myc epitope 항원을리포터로사용함으로써응용범위를넓혔다. 즉, 항원을사용했을때형광염료가표지된항체염색을통하여 FACS 선별도가능하고, 항체가표면에부착된자성 bead를이용한 MACS 선별을수행할수있다. (A) (B) pgad-tgfp plasmid 검증 pgad-tgfp plasmid가효모안으로도입되었을때 LEU2- turbogfp 단백질이정상적으로발현되는지확인하기위하여 JC993 효모균주에 pgadt7 또는 pgad-tgfp plasmid를보유하고있는형질전환체에서 GFP 형광발현을관찰하였다 (Fig. 2A). pgad-tgfp plasmid를보유하고있는형질전환효모에서만 GFP 형광이발현되는것으로보아 LEU2-turboGFP 가정상적으로발현되고있는것을확인하였다. 다음 TurboGFP 유전자와연결되어있는 LEU2 유전자가효모내, plasmid 도입을확인하기위한선발표지유전자로사용되기때문에 LEU2-turboGFP 단백질이효모성장에영향을주는지여부를확인하였다. 만약융합된 turbogfp 단백질이 LEU2 단백질기능에영향을준다면추후에진행될 yeast twohybrid 분석결과에영향을줄가능성이존재하였다. pgadt7 또는 pgad-tgfp plasmid를보유하는형질전환효모의성장을비교하여 LEU2-turboGFP 단백질이효모성장에미치는영향을확인하였다. 한천배지또는액체배지배양상에서진행된두실험에서 pgadt7 또는 pgad-tgfp plasmid를보유하고있는형질전환효모들의성장이거의차이가없는것을확인하였다 (Fig. 2B and C). 효모표면항원표지리포터의검증특정집단을선택적으로선별할수있는 FACS 기술에사용될수있는형태의리포터가대규모단백질상호작용체분석에적합하다고판단하였다. 이를위해서효모표면에특정항원을발현하는리포터를제작, 분석하였다. 먼저효모표면에항원이발현될수있도록하기위하여효모의표면에위치하는단백질인 Agα1 (SAG1) 을이용하여항원이효모표면에발현되도록하였다. 항원으로는 c-myc epitope (EQKLISEEDL) 을사용하였고, 항원수에따른리포터의효용성차이가있을것으로예상되어항원수를 1개 (pgal1-agα1-myc1), 5개 (pgal1-agα1-myc5), 10개 (pgal1-agα1-myc10) 를포함하는발현 plasmid를제작하였다 (Fig. 3A). 제작된 plasmid는 (C) Fig. 2. Growth of the yeast expressing LEU2-TurboGFP. (A) The yeast harboring pgad-tgfp plasmid successfully expresses Leu2-TurboGFP. The GFP signal was observed on agar plate. The pgadt7 plasmid contains LEU2 gene and pgad-tgfp contains LEU2-TurboGFP, but not LEU2, were transformed into JC-993 strain. GFP signal was only observed in yeast colonies expressing LEU2-TurboGFP. (B) Dilution assay on agar plate, measuring growth rate of the yeast harboring pgadt7 or pgadtgfp plasmid. (C) Growth rate of the yeast harboring pgadt7 or pgadtgfp plasmid, measured in liquid culture. EBY100 (Invitrogen) 효모균주에형질전환하였다. 각형질전환체에서 galactose를이용하여발현을유도한후, 효모표면에발현된 c-myc 항원을형광염료가표지된항체를이용하여염색한후형광현미경과 flow cytometry를이용하여 c-myc 항원의발현정도를관찰하였다 (Fig. 3). 온전한 Agα1을발현하였을때에효모표면에항체가염색되지않는것과비교하여 c-myc 항원을표면에발현하는형질전환효모의경우표면 Korean Journal of Microbiology, Vol. 55, No. 3

그 이 유는 단백질 간의 약한 물리적 결합이 발생할 경우, 리포터 발 현 수준이 상대적으로 낮을 것으로 예측할 수 있고, 이 경우 항 원 수가 적은 리포터를 사용하였을 때 선별이 되지 않을 가능 성이 높기 때문에 가급적 항원 수가 많은 리포터를 적용하여 상대적으로 약한 물리적 결합까지 측정하기 위함이다.

6 204 Park et al. 에 결합한 항체에 의한 형광을 확인할 수 있었으며, 형광은 항 원의 수가 증가할수록 더 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있 었다(Fig. 3). 이를 통하여 제작된 리포터 발현 카세트가 정상 적으로 제작되었음을 확인하였다. 동시에 yeast two-hybrid 분 석에 리포터로써 항원 수가 가장 많은 10개의 항원으로 구성 된 리포터가 분석에 가장 유리할 것이라고 판단하였다. 그 이 유는 단백질 간의 약한 물리적 결합이 발생할 경우, 리포터 발 현 수준이 상대적으로 낮을 것으로 예측할 수 있고, 이 경우 항 원 수가 적은 리포터를 사용하였을 때 선별이 되지 않을 가능 성이 높기 때문에 가급적 항원 수가 많은 리포터를 적용하여 상대적으로 약한 물리적 결합까지 측정하기 위함이다. 표면 항원 발현 리포터가 도입된 효모 균주의 검증 본 연구를 통하여 새롭게 개발된 리포터를 효모의 유전체에 삽입하기 위하여 prs303 (YIP) plasmid에 pgal1-agα1-myc10 리포터 카세트를 cloning하여 prs-pgal1-agα1-myc10 plasmid 를제작하고, HIS3 ORF를이용한homologous DNA recombination 을 통하여 효모의 유전체 상에 리포터 카세트가 삽입된 SK10 효모균주를 확보하였다. 이 균주에서 이미 물리적 결합이 확 인된 p53과 SV40 large T 항원을 이용하여 SK10 효모균주에 서 myc10 리포터의 정상적인 발현을 확인하였다(Fig. 4). DBD 와 AD plasmid를 갖는 형질전환 효모를 SD/-Leu, Trp 한천배 지 상에서 배양 후, 10개 colony를 한곳에 모은 후, 형광 염료가 표지된 항체 및 flow cytometry를 이용하여 리포터 발현 정도, (A) 즉 효모 표면에 발현되는 c-myc 항원 양을 측정하였다. 물리적 결합이 검증된 p53과 SV40 T을 발현하는 plasmid를 함께 보 유하는 형질전환 효모 경우, c-myc 항원이 표면에 정상적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, SV40 T 대신에 p53과 물 리적인 결합이 없는 lamin A 형질전환 효모 경우, 리포터가 전 혀 발현되지 않았다(Fig. 4). 또한 pgad-tgfp plasmid 경우, GFP 형광을 보유하고 있는 효모에서만 리포터 유전자의 발 현이 확인되는 것으로 보아 LEU2-GFP 발현에 따른 형질전 환체 선별이 효과적으로 이루어지고 있음을 확인할 수 있었 다(Fig. 4). (B) Fig. 3. Brighter fluorescence signal was detected by increasing the numbers of c-myc epitope on reporter. (A) Agα1 c-terminal domain fused with one, five, or ten copies of c-myc epitope was expressed from galactose-inducible promoter, UAS. After growing yeasts in the medium containing galactose for 24 h, yeasts were stained with anti-c-myc antibody, and then with anti-mouse IgG conjugated with Alexa Flour568 dye. (B) The fluorescence signal was measured by flow cytometry after staining with anti-c-myc antibody, and then with anti-mouse IgG conjugated with Cy5. Red, yeasts expressing pgal1-agα1; Orange, pgal1-agα1-myc1; Yellow, pgal1agα1-myc5; Green, pgal1-agα1-myc10. 미생물학회지 제55권 제3호 Fig. 4. The pgal1-agα1-myc10 reporter integrated into yeast genome was expressed by the physical interaction of p53 with SV40 T antigen proteins, but not with Lamin A. The expression of c-myc epitope was measured by flow cytometry after staining with anti c-myc antibody, and then with Cy5-conjugated 2nd antibody.

7 Yeast two-hybrid assay with fluorescence reporter 205 적요 Yeast two-hybrid는특정단백질에대한상호작용파트너단백질의선별을위한방법으로개발되었다. 하지만대규모단백질상호작용체분석을수행하기에요구되는노동과대량의한천배지사용에따른문제에의해널리사용되지못하고있다. 따라서본연구에서는새로운리포터시스템을 yeast two-hybrid 방법에도입하여 fluorescence-activated cell sorting (FACS) 또는 magnetic-activated cell sorting (MACS) 를이용하여상호작용파트너단백질을포함하는효모클론을손쉽게선별할수있도록하였다. 새로운리포터시스템은 c-myc 항원결정기가총 10번반복되는형태로효모표면에발현되도록하였으며, p53과 SV40 T항원을이용한실험을통하여리포터단백질의정상적인발현을 flow cytometry 분석을통하여확인하였다. 따라서, 새로운리포터시스템을도입한 yeast twohybrid 방법은대규모상호작용체분석을위해필요한노력을현저히줄일수있을것으로기대한다. 감사의말 References Berggard T, Linse S, and James P Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics 7, Blikstad C and Ivarsson Y High-throughput methods for identification of protein-protein interactions involving short linear motifs. Cell Commun. Signal. 13, 38. Brückner A, Polge C, Lentze N, Auerbach D, and Schlattner U Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10, Fields S and Song O A novel genetic system to detect proteinprotein interactions. Nature 340, Fields S and Sternglanz R The two-hybrid system: An assay for protein-protein interactions. Trends Genet. 10, Rual JF, Venkatesan K, Hao T, Hirozane-Kishikawa T, Dricot A, Li N, Berriz GF, Gibbons FD, Dreze M, Ayivi-Guedehoussou N, et al Towards a proteome-scale map of the human proteinprotein interaction network. Nature 437, Sambrook J and Russell DW Two-hybrid systems. CSH Protoc. 2006, pii: pdb.prot3889. Van Criekinge W and Beyaert R Yeast two-hybrid: State of the art. Biol. Proced. Online 2, 이논문은보건복지부암정복추진연구개발사업 (Grant Number HA17C0035) 의지원을받아수행되었음 (B.J. Hwang). Korean Journal of Microbiology, Vol. 55, No. 3

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Æ¯ÇãÃ» '' - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - ' - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - Super-Bio Co., Ltd. KWON, Suk-Tae Thermostable DNA Polymerase-encoding Gene from Thermus sp. X-1 an d Amino Acid Sequence