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희철 운
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1 1) 대한한의학방제학회지제 16 권 2 호 THE KOREAN JOURNAL OF ORIENTAL MEDICAL PRESCRIPTION 16(2):193~204, 2008 木香함유 과 이간세포보호에미치는영향 박종찬, 윤용갑 * 성심한의원, * 원광대학교한의과대학방제학교실 ABSTRACT Effects of Radix Saussurea on hepatoprotection Jong-Chan Park, Young-Gab Yun* Sung Sim Oriental Clinic, *Department of Oriental Medical Prescription, Wonkwang University Dehydrocostus lactone () and Mokko lactone () were isolated from Saussureae Radix, and their effects on heme oxygenase-1 (HO-1) expression and hepatoprotection in the liver cell line HepG2 were investigated. induced HO-1 expression and HO activity in a dose-dependent manner, whereas lacking one double bond property at 11 and 13 carbons on its own chemical structure had no apparent effects. also induced Nrf2 nuclear translocation and enhanced antioxidant response element (ARE) activation which mediated HO-1 gene transcription. Pretreatment with protected HepG2 cells against oxidative damages caused by H2O2. Interestingly, the hepatoprotective effects of appeared to be associated with HO enzymatic activation, HO-1 expression and Nrf2 activation, because blockage of HO activity by a HO inhibitor and inhibition of HO-1 and Nrf2 cellular synthesis by small interfering RNA abolished heptoprotection afforded by. Taken together, this investigation provides evidence supporting that Saussureae Radix is hepatoprotective against oxidative stress that causes abnormal liver damages. 교신저자 : 윤용갑 전북익산시신용동 원광대학교한의과대학방제학교실 Tel : yunyg@wonkwang.ac.kr 접수 : 2008/ 12/ 03 채택 : 2008/ 12/ 12

2 194 박종찬, 윤용갑 Key word : Dehydrocostus lactone (), Mokko lactone (), Saussureae Radix, heme oxygenase-1 (HO-1) Ⅰ. 緖論木香 (Radix Sausurea Seu Inulea) 은국화과에속하는다년생草本인唐木香川木香土木香의根을말한다. 五香密香木香神土木香靑木香五香木香川木香唐木香등의異名이있으며, 唐木香川木香은중국및인도등지에서재배하고, 土木香은우리나라에서재배하며, 가을겨울에채취하여잔뿌리를제거하고, 햇볕에말려사용한다. 性味는辛苦溫無毒하고, 脾胃大腸肝膽經에작용하며, 胃腸氣滯肝失疎泄行氣止痛健脾消食등의효능이있는것으로알려져있다 1-6). 木香에는목향에는 sesquiterpene계정유를 1~ 2.5% 함유하고있고, 그주성분은 costunolide, dehydrocostuslactone, α-, β-cyclocostunolide, alantolactone 등이며, 기타 amino acidsesquiterpene계화합물인 saussureamine A~E가함유되어있으며, 鎭靜作用降壓作用抗菌作用腸筋肉緊張抑制作用氣管支平滑鎭靜作用腸活動抑制作用등이있는것으로알려져있다 7-12). 한편, 東醫寶鑑中木香이사용된處方은 337 方이있으며, 이중木香이主藥으로사용된경우는 65개의處方이있다 13-20). 65개의處方에대한活用病症을분석해보면, 泄瀉, 痢疾, 便秘, 疝病, 脹滿, 積聚, 食欲不振, 呑酸, 吐酸, 反胃, 醒酒등으로소화기계통의질환에많이사용하였으며, 현대의학적으로관찰하면위장관이나간기능에관련된질환이주류를이루고있다. 최근연구에의하면 heme oxygenase-1 (HO-1) 은세포손상을초래하는산화스트레스를효율적으로제거하고손상된세포의재생을촉진하며, 간에서발생되는과다한염증반응을억제함으로써간세포를효과적으로보호하는작용이있는것으로보고되고있다 21-29). 이에저자는 HepG2를이용하여木香에함유된 dehydrocotus loctone () 과 mokko loctone () 을에탄올로분리하여이들이산화적스트레스에대한간세포보호에미치는영향과간세포보호, 간이식, 간세포재생, 간에서독성물질해독작용등에직접적으로관여하고있는것으로알려져있는 HO-1 발현유도및활성도, 발현유도기전등을연구하여보고하는바이다. Ⅱ. 材料및方法 1. 시약및재료 배양배지 (RPMI 1640), antibiotic/antimycotic 및 Trypsin-EDTA 는 Gibco/BRL (Grand Island, NY, USA) 로부터구입하였고, FBS (fetal bovine serum) 는 U.S. Bio-Technologies 사로부터구입하여사용하였다. HO-1 항체, Nrf2 항체, FITC-Ig 항체및 β-actin 항체는 Santa Cruz 사 (Santa Cruz, CA, USA) 로부터구입하여사용하였다. 모든세포배양용기및튜브는 Falcon 사 (Becton Dikinson, San Jose, CA, USA) 로부터구입하여사용하였고, DAPI 및기타시약은 Sigma 사 (St. Louis, Missouri, USA) 에서구입하여사용하였다.

3 木香함유 과 이간세포보호에미치는영향 세포배양인체간암세포주 (human hepatoma cell line, HepG2) 를 ATCC (American Tissue Culture Collection) 로부터구입하여 10% FBS, antibiotic/ antimycotic (100 U/mL penicillin, 25 μg/ml amphotericin D, 100 μg/ml streptomycin) 및 1.5% sodium bicarbonate가첨가된 RPMI 1640 배지에서 95% 공기, 5% CO 2, 습기가충분한 37 의대기로배양하였다. 세포는 10 cm 배양접시에 개가되도록 2~3일에한번씩분주하여배양하였다. 3. 약재선정, 추출, 분리및구조규명본연구에서는한방문헌에기초하여간질환치료에약효를지니고있다고예상되는한약재를선정한후문헌적으로보고되어있는선정된식물의화학성분을검색하였다. 선정된약재들을모두원광대학교한의과대학본초학교실에서기증받았으며, ethanol을이용 1차추출한후연구방법에기술한분석법을이용하여추출혼합물의활성정도를측정하며활성이있는것으로확인된대상물은다음의과정을이용하여정제하였다. 생리활성측정결과를바탕으로각각의추출물의연구우선순위를먼저결정하고가장우선순위가높은시료는사용된분석법에서강한효과를갖고있으나그화학성분이널리밝혀지지않은시료가선택되었다. 일단우선순위가결정되면, 선정된추출물은대략적인혼합물의극성정도에따라용매의분획에의해구분하였다. 일반적으로본연구에서는물과 hexane, ethyl acetate, butanol 사이의연속적인 solvent partitioning 방법에의하여 4개의분획물을확보하고얻어진각각의분획물에대한활성정도에근거하여계속적인분리과정을지속하였다. 계속적인분리과정으로서얻어진분획물에대한 thin layer chromatography 분석및 NMR spectroscopy 분석에의하여혼합물내에존재하는 유기물질들의대략적인극성정도및대략적인형태를예측할수있으며, 이에따라다음단계의분리과정 ( 일반적으로 flash column chromatography) 을위한고정상의종류를선택할수있다. 예를들어, 수용성이높은시료의경우는 reversed-phase silica gel chromatography가우선시도되었고, 그외에 ion exchange chromatography, hydrophilic resin을이용한 size exclusion chromatography 등이경우에따라서시도되었다. 지용성이높은시료의경우는 normal-phase silica gel chromatography 를우선적으로적용되었고, 그외에 Sephadex LH-20 등을이용한 size exclusion chromatography 등이사용하였다. 이상의초기분리과정에서얻어지는분획중활성물질을함유한분획은추가적인 column chromatography 혹은 HPLC (High Performance Liquid Chromatography) 를이용한분리과정을통하여순수한물질을정제하였다. 분리과정중얻어지는각각의분획물은 Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy 분석을통하여분리정도및혼합물내에존재하는화합물의종류를예측할수있으며, 경우에따라서는기지물질을확인할수도있었다. 분리된순수천연물질의구조분석은 Electron-Impact Mass spectrometry (EIMS), Electro-Spray Ionization Mass spectrometry(esims) 및 500 MHz NMR Spectrometer 등을이용하여다음과같이진행한다. NMR 및 MS 분석을통한분자식및부분구조예상, 기지물질의확인, High Resolution MS 분석을통한분자식확인, Homonuclear decoupling, COSY, TOCSY 분석을통한분자내의 spin-system 규명, HMQC experiments 분석에따른분자내의 One-bond C-H correlations 규명, Selective INEPT, HMBC techniques 등을통한 Long-range C-H correlations 확인및이에따른분자의평면 (2차원) 구조확인, NOE, NOESY, 혹은 ROESY 실험을기초로한분자의공간 (3차원 ) 구조분석, 이상의모든 NMR 실험은원광대

4 196 박종찬, 윤용갑 학교의 500 MHz NMR spectrometer를이용하여수행하였다. 경우에따라서는위에서언급한실험만으로구조결정이불가능한경우가있을수있으며, 이러한경우에는추가적인 NMR 실험, MS-MS 방법또는추가적인화학반응등의방법을이용하였다. 상기와같은실험은원광대학교약학대학에의뢰하여필요한추출물및순수화합물을얻었다. 본실험에사용한木香의추출물인 과 도위와같은방법으로분리동정하였다. 4. 세포생존율분석 HepG2 세포주의세포생존율을 MTT (2-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 방법을이용하여분석하였다. 간기하면, 세포주를 24-웰플래이트에웰당 개가되도록분주한다음및약제를 12 시간처리하고 H2O2를 12 시간처리한다음 50 μg/ml이되도록 MTT를첨가하여 2~4시간동안반응시켰다. MTT와생존세포로부터생성된보라색불용성 formazan을 0.1% SDS 용액으로용해하여 595 nm 파장에서흡광도를측정하고대조군과비교하여백분율 (%) 로표시하였다. 5. Western blot analysis 세포에발현되는특정단백질을조사하기위해서는충분히확보된세포에서총단백질을분리하고이것을 SDS-PAGE gel에일정량적제한후에전기장을주어단백질의분자량에따라분리한다. 단백질이분자량에따라서분리된 gel에 NC 막을부착한다음전기적특성을이용하여 gel에있는단백질을 NC 막으로이동시킨다. 단백질이동을완결한후, 단백질이부착된 NC 막에특정단백질과반응하는일차-항체를부착하고이항체의부착여부를판별할수이차-항체를부착시켜특정단백질의발현정도를확인한다. 6. HO-1 activity 측정목적세포에 0.1 M potassium phosphate 완충용액 200 μl를부과한후에초음파처리하여원침한다. 이후상층액에반응용액 (50 μm hemin, 1 mm NADPH, 2 mm glucose-6-phosphate, 1U glucose-6-phosphate dehydrogenase) 를부과한후에 37 o C에서 30분동안반응시켜 bilirubin량을 spectrophotometer 로측정하여분석한다. 7. ARE activity 측정 GST-Ya ARE (5 -TAG CTT GGA AAT GAC ATT GCT AAT GGT GAC AAA GCA ACT TT-3 ) 를 promoterless luciferase pgl-3 basic vector (Promerga) 에도입, pgl-luc-are를제작하였다. 제작된 pgl-luc-are (0.5 μg ) 는 cell/well의 24 well plate 2.0 μg (1:4, w/w) 의 TransIT-LT1 polyamine cell transfection reagent (Mirus Co.) 와혼합하여 28 에서 4시간동안 transfection한후신선한배지를첨가해주었다. 72시간경과후, PBS (phosphate-buffered saline) 으로세척한 cell을 110 μl Glo lysis buffer (Promega) 에서용균하였다. 용균된시료는 luciferase activity 측정을위해동량의 Bright Dlo Substrate (Promega) 와혼합하여 Luciferase Assay System (Promega) 의방법에준하여 Victor II luminometer microplate reader에서활성을측정하였다. 8. 형광염색세포에목적한시약을처리한다음목적시간에회수하여 70% ethanol로세포를부착시켰다. Acetone 을이용하여세포막및핵막의투과성을증가시킨다음 Nrf2 항체를 2시간부착시켰다. PBS로 3번세척한다음 FITC가표지된 2차항체를 2시간동안부착시켰다. PBS로 3번세척한다음고정액으로고정하고, 형광현미경으로관찰하였다. 한편핵의존재영역을확인하기위해서핵

5 木香함유 과 이간세포보호에미치는영향 197 을 DAPI 로염색하였다. HO-1 발현을유도하였다. 9. 통계분석실험결과는 mean ± S.D. 로표시하였으며유의성검정은 student's t-test에의하였으며 p 값이 0.01 이하인것만유의성이있는것으로하였다. Control Ⅲ. 實驗結果 Actin HO-1 1. 木香추출물의 HO-1 발현유도효과산화스트레스에대하여간세포를보호할것으로예측되는갈근 (Puerariae Radix), 고삼 (Sophorae Radix), 단삼 (Salviae Miltorrhizae Radix), 대황 (Rhei Rhizoma), 만형자 (Viticis Fructus), 백모근 (Imperatae Rhizoma) 방기 ( Sinomeni Caulis et Rhizoma), 목향 (Radix Saussureae) 시호 (Bupleuri Radix) 등 9개한약재로부터에탄올추출물을얻고, 이것을세포독성이나타나지않은 200 μl/ml 농도로 HepG2 간세포에 12시간처리한다음에총단백질을분리하여 HO-1 발현여부를 Western blot 분석법으로조사하였다. 비록항산화효과가있다고보고되어있으나 8개의한약재추출물은 HO-1 발현을유도하지못했다. 그러나이와는다르게木香추출물은 HO-1 발현을유도하였다. 2. HO-1 발현활성물질순수분리세포에활성이있는수순물질을용이하게분리하기위하여유기용매를사용하여木香추출물로부터 HO-1 발현활성을보이는 dehydrocostus lactone () 순수분리하고대조순수물질로 과유사한구조를가진 mokko lactone() 을순수분리하였으며, 각각의화학적구조는 Fig. 2에제시한바와같다. 두순수물질의화학적구조의차이점으로 에는 11번탄소와 13번탄소에이중결합이존재하고 에는존재하지않는다. Fig. 3에서와같이 은농도의존적으로 Fig. 1. Effect of ethanol extracts of medicinal plants on HO-1 expression in HepG2 cells. Each extract at 200 μg/ml was exposed for 12 h to HepG2 cells; 1: Pueraria thunbergiana, 2: Sophora angustifolia Sieb, 3: Salvia miltorrhiza Bunge, 4: Rheum coreanum Nakai, 5: Vitex rotundifolia, 6: Imperata cylindrica, 7: Menispermum trilobum Thunb, 8: Sausurea Seu Inulea, and 9: Bupleurum falcaum. HO-1 expression was determined by Western blot analysis. H H O O H H O O Dehydrocostus lactone Mokko lactone () () Fig. 2. Chemical structures of active dehydrocostus lactone and inactive mokko lactone isolated from ethanol extract of Saussureae Radix. 13

6 198 박종찬, 윤용갑 HO-1 Actin HO-1 Actin Concentration(μM) Fig. 3. Effects of and on HO-1 expression in HepG2 cells. HepG 2 cells were exposed for 12 h to either or at indicated concentrations, total proteins were isolated and Western blot analysis was thereafter performed for HO-1 protein detection. HO activity (pmole of bilirubin/protein) Control (μm) (μm) Fig. 4. Effects of and on HO enzymatic activation in HepG2 cells. HepG 2 cells were exposed for 12 h to either or at indicated concentrations, enzymes were isolated and HO enzymatic activity was thereafter analyzed for 1 h. 3. 이 HO-1 활성도에미치는영향세포에는항상발현되어있는 HO-2와특정환경에서발현이유도는 HO-1이있다. 을농도별로처리한다음세포에서 HO-2 및 HO-1을분리하여이들의효소활성을조사하였다. Fig. 4에제시한바와같이 은 HO 활성을증가시켰으나, HO-1 발현에영향이없는 은 HO 활성증가에유의한효과를보이지않았다. 이결과는 에의한 HO 활성증가가 HO-1 활성증가에의한것이며항상발현되어있는 HO-2의발현에의한것이아님을보여준다. 4. 의 HO-1 발현유도메커니즘세포에서 HO-1 발현은세포질에존재하는핵인자 Nrf2의활성에의한이단백질의핵내로의이동과관련이있다. 세포질에서핵내로이동한 Nrf2는표적유전자의전사를지시할수있는결합부위에존재하는 antioxidant response element (ARE) 에결합한다. 이후 Nrf2-ARE 의결합이형성되면표적유전자인 HO-1의발현을전사된다. 한편 Nrf2가무분별하게핵내로이동하는것을차단하기위하여이단백질은 Keap1 단백질과결합되어비활성화상태로존재한다. 어떤원인에의해서 Keap1이 Nrf2에서이탈할경우자유로운상태로전환된 Nrf2는핵내부로이동한다. Keap1 이 Nrf2에서이탈되는메커니즘에대하여다수의이론이있으나, 가장설득력을얻고있는이론에는 Keap1 단백질에존재하는여러개의 thiol 基가변형되어 Keap1 단백질의구조적변화를가져오고결국에는 Nrf2를구속할수있는능력을상실하는순차적메커니즘이있다. 이이론은 thiol 基와결합을용이하게형성하는여러가지천연물의활성을설명하는데사용되고있다. 과 은단백질에있는 thiol 基를변형시킬수있는능력에있어서차이점이있다. 즉, 은 11번과 13번탄소사이에이중결합이없기

7 木香함유 과 이간세포보호에미치는영향 199 때문에 thiol 基의변형을가져올수가없다. 반면, 은단백질에존재하는 thiol 基와용이하게결합할수있고그결과단백질의변형을초래할수가있다. 이 Nrf2를핵내부로의이동을촉진할수있는지 Nrf2 항체에형광물질을표지하여 Nrf2의이동을관찰하였다. Fig. 5에의하면 은 Nrf2 의핵내부로의이동을매개한다. 반면 은 Nrf2의핵내부이동을유도할수없었다. 또한 Nrf2의핵내부로의이동에기인하는 ARE 활성의증가가 처리군에서발견되었으나, 처리군에서는발견되지못했다 (Fig. 6). DAPI Nrf2-FITC Control Fig. 5. Effects of and on Nrf2 nuclear translocation in HepG2 cells. HepG 2 cells were exposed for 2 h to either or at 10 μm, fixed and stained with anti-nrf2 antibody conjugated with fluorescent FITC. The nuclei were stained with DAPI to show where to exist. When -treated cells were confirmed under fluorescence microscopy, Nrf2 proteins were localized into the nuclei. Luciferase activity (% of Control) Control Fig. 6. Effects of and on ARE activation in HepG2 cells. HepG 2 cells were transiently tranfected with reporter plasmids containing ARE, and exposed for 12 h to either or at 10 μm. The cells were then extracted and luciferase activity was measured. 5. 산화스트레스에대한 의세포보호효과 세포에서 HO-1 발현은세포보호에있어서중요한역할을담당한다. 첫째로 HO-1은각종효소의퇴화과정에서유리된산화성헴을분해하여산화스트레스생성을조기에차단한다. 둘째로 HO-1 활성결과로생성되는헴분해산물빌리루빈은항산화작용이있어산화스트레스를제거한다. 셋째로다른헴분해산물일산화탄소는세포신호물질로작용하여항산화메커니즘을작동시킨다. 마지막으로 HO-1 활성결과로유리된철이온은이것의재흡수를촉진하는 ferritin의발현을촉진하여부가적인항산화작용을촉진한다. 종합적으로세포에서발현된 HO-1은산화스트레스를제거하여세포보호효과를제공한다.

8 200 박종찬, 윤용갑 간세포에서 HO-1 발현유도효과가확인된 의항산화작용에의한세포보호효과를조사하였다. 이조사에서산화스트레스는산화성이강한 H 2O 2 를이용하여직접적으로유도하였으며, H 2O 2 와 이직접적으로반응하는것을방지하기위하여 을 12시간전처리한다음 을제거하고 H 2O 2 를처리하였다. Fig. 7에나타난바와같이 은 H 2O 2 에대하여세포보호효과를제공한다. 이러한세포보호효과는 HO-1 활성을저해하는 SnPP의처리에의해서상실되었다. 또한 HO-1 발현의상위단계로판명된 Nrf2의생성을차단하거나, HO-1 발현을 sirna를이용하여차단한결과세포보호효과가상실되었다. 이런결과가의미하는바는 은 Nrf2 활성에의한 HO-1 발현유도하고, 그결과로 HO-1은유리헴을분해하여산화스트레스에대하여저항성을제공한다고볼수있다. Cell viability (% of Control) Control * * ** ** ** - - SnPP - Nrf2 sirna H 2 O 2 - HO-1 sirna Fig. 7. Cytoprotective effects of on H 2O 2 damage in HepG2 cells. HepG 2 cells were pre-incubated for 12 h with at 10 μm, washed three times with fresh media and then exposed for 12 h to H 2O 2 at 200 μm in the presence or absence of 50 μm of SnPP. In another experimental condition, HepG2 cells were transiently transfected with sirna for Nrf2 or HO-1, pre-incubated with and exposed to H 2O 2. Cell viability was determined by MTT assay. *p<0.05 with respect to untreated control and **p<0.05 with respect with each indicated control. IV. 考察木香이主藥으로活用되는方劑 13-20) 를살펴보면飱泄, 滑泄, 寒泄症狀과일반설사및痢疾에활용된加減木香散, 木香散, 四柱散, 固眞湯, 木香散六神丸, 四磨散등이있으며食傷症과食欲不振醒酒呑酸, 吐酸反胃에활용된處方으로는豆蔲橘紅散, 安胃散, 人參開胃湯, 錢氏異功散, 千金養脾元, 神仙不醉丹, 透膈湯, 香橘餠定生丹등이있다. 이러한처방에관련된병증은모두소화기계통질환이나간병변있을때나타나는증후군들이므로여기에활용된主藥으로활용된木香도간경변이나소화기계통에직 / 간접적인연관성이있을것으로추축되며특히疝病은괄약근의경련성통증에해당되는병증인데여기에활용되는처방인楊氏麝香元, 秘傳茱萸內消元, 二香丸, 聚香飮子, 木香金鈴丸에모두木香을主藥으로사용하고있는것으로보아木香이간경변성괄약근의경련성통증에도깊은연관성이있는것으로사료된다. 또한간경변말기에脹滿腹水등의病症이초래되는데한의학적으로이와같은病症에활용할수있는木香散, 木香分氣丸, 消脹元, 破積導飮丸, 進食丸, 廣朮化癖丸, 至聖丸등의處方이모두木香을主藥으로사용하고있는것으로보아木香은간경변의치료에밀접한연관성이있음을문헌적으로시사하고있는바木香유래함유성분에서간세포보호작용과산화적손상에관련된 HO-1의발현과작용기전에관련된연구를착수하게되었다. 간은영양소, 알코올및약물대사가활발히진행되면서다양한산화스트레스에가장많이노출될수있는장기중의하나이다. 산화스트레스는간에존재하는다양한항산화물질에의해서효율적으로제거되어간에직접적으로는피해가가지

9 木香함유 과 이간세포보호에미치는영향 201 않는다. 그러나산화스트레스가과량으로유발되거나또는간에풍부하게존재하던항산화물질이어떤원인에의해서고갈될경우간은산화스트레스에의해다소손상을받을수가있다. 독성물질에노출된간세포는짧은시간에괴사되거나정상적인기능을수행할수없게손상되는경우가있다. 일반적으로산화스트레스에의해서손상된간세포는간에존재하는대식세포인 Kupffer 세포에의해서 1차적으로탐식되어대식세포의활성화를가져오고, 활성화된 Kupffer 세포는여러가지세포활성물질을분비하여여러종류의면역세포를간으로유입시킨다. 이어서, 면역세포간의상호작용에의한 2차적인염증반응이초래되어결국간은더이상간장으로서역할을수행할수없게된다. 최근여러연구결과에의하면 HO-1은세포의손상을초래하는산화스트레스를효율적으로제거하고, 산화스트레스에의해서손상된세포의재생을촉진하는것으로알려졌다 ) 또한 HO-1은간에서발생된부적절한과다염증반응을억제한다. 37) HO-1은일차적으로세포손상의필연적결과로나타나는산화스트레스유발물질 free heme 을 bilirubin, carbon monoxide (CO) 및 Fe(II) 로분해하고제거하는효소이다. 이차적으로 HO-1에의해서생성된 bilirubin은강한항산화효과가있으며, Fe(II) 는세포내철의함량을조절하여항산화작용을유도하는 ferrintin 효소를유도한다. 또한, CO는 nitric oxide (NO) 와유사한효과가있으나 NO 보다독성이적은기체성물질로세포의사멸및과다염증을차단한다. 37) 종합적으로간세포에서 HO-1 발현은산화스트레스에대하여저항성을제공할뿐만아니라간에서발생하는부적절한염증을효과적으로제거하여간을보호할수있다. 본연구는간세포로 HepG2를사용하여, 이세포에서 HO-1 발현및활성을유도할수있는한약재를선별하고, 유효성분을분리한다음 HO-1 발현유도메커니즘을규명하고자하였다. 또한, 한약재의유효성분에의해서발현된 HO-1이간세포보호에효과가있는지조사하였다. 본연구로부터木香의유효성분 이 HO-1 발현을유도하여산화스트레스에의한간세포손상을억제할수있음을알수있었다. 간보호효과가있을것으로예측되는 8종의한약재에서에탄올추출물을얻었다. 각각의추출물 200 μg/ml은 HepG2 세포에대하여유의한독성을유도하지않았다. 이농도의추출물을 HepG2 세포에 12 시간처리한다음세포를회수하고, 총단백질을분리하여 SDS-PAGE로분자량에따른단백질을분석하였다. HO-1 단백질은 anti-ho-1 항체를이용하여 Western blotting 방법으로분석하였다. 8개의추출물중에서 1개가 HO-1 발현을유도하였으며, 이것은木香추출물로판명되었다 (Fig. 1). 이추출물을유기용매로분획하여 HO-1 활성을보이는순수물질을분리하였다. 木香추출물에서얻어진 HO-1 활성순수물질과유사한구조를가진비활성순수물질의화학적구조를 Fig. 2와 Fig. 3에제시하였으며, 각각화합물명은 과 로판명되었다. 특히 은농도의존적으로 HO-1 활성을증가시켰다 (Fig. 4). 다음으로 에의한 HO-1 유도메커니즘및간세포보호효과에대하여보다자세히연구하였다. 핵인자 Nrf2는 HO-1과같은항산화 / 세포보호효소발현및항산화물질생성을전사하는역할을수행한다. 21) Nrf2는비활성상태에서세포질내에있으며, 이것이핵으로무분별하게이동하는것을방지하는 Keap1과결합되어있다. Keap1에는세포내산화상태에반응하는작동센서 (sensor) 가있다. Nrf2가핵으로이동하는메커니즘으로 1) Nrf2 또는 Keap1이인산화되어핵으로이동한다는이론과, 2) Keap1에있는작동센서가 on 상태로유지되어 Nrf2가 Keap1으로부터분리되고이로써 Nrf2가핵으로이동한다는이론이있다. 이러한두경로를통해서핵으로이동한 Nrf2는표적유전자 (target gene) 에있는 ARE binding

10 202 박종찬, 윤용갑 site에부착되고그결과로 ARE-의존유전자의전사가시작된다. 전사되어단백질로전환된다수의단백질분자중에서항염증및세포보호작용이있는단백질분자에는 HO-1이있다. 종합적으로, HO-1 상위신호전달경로 (signal transduction pathway) 에는핵인자 Nrf2에의존하는 ARE의활성증가가있다. 따라서 HO-1 유전자를전사하는 Nrf2의핵내부로의이동및 ARE 활성증가는 HO-1 유도메커니즘을연구하는유용한표적이될수있다. HO-1 발현유도활성을보이는물질 이 Nrf2 활성에어떠한영향을주는지조사하였다. 처리군에서 Nrf2의핵내로의이동이관찰되었으나, HO-1 유도비활성을보이는 처리군에서는대조군과비교하여어떤차이점도발견할수없었다 (Fig. 5). 또한, Nrf2 핵내로의이동한결과에의한 ARE 활성이대조군에비해유의하게증가된것을확인할수있었다 (Fig. 6). 따라서 에의한 HO-1 발현은 Nrf2 핵내로의이동에기인하는 ARE 활성증가와관련이있음을알수있었다. 일반적으로 HO-1 발현은산화스트레스에대하여저항성을제공한다. 30) 활성물질을 12 시간동안전처리하여 HO-1 발현을유도한다음 H 2O 2 를이용한산화스트레스를유도시켰다. Fig. 7에제시된바와같이활성물질은산화스트레스에대하여저항성을제공했으며, 이런저항성은 HO-1 활성과밀접한관계가있음을확인할수있었다. 즉, HO-1 활성저해제를처리한세포에서는산화스트레스저항성이감소되었다. 이상의결과를종합하면, 木香에서순수분리된 은핵인자 Nrf2 핵내로의이동을유도하여 ARE 활성을증가시키고, 그결과로 HO-1이발현되며발현된 HO-1은간독성을유도하는산화스트레스에대하여저항성을제공함으로써간보호효과를제공하는것으로판단된다. V. 結論 H 2 O 2 매개산화스트레스에대한木香에서순수분리된 의간세포보호효과를조사하여, 다음과같은결과를얻었다. 1. HepG2 세포에서 은농도의존적으로 HO-1 발현을유도하였다. 반면유사한구조를가진 DL은 HO-1 발현유도에효과가없었다. 에만존재하는활성이중결합이 HO-1 발현에중요한역할을할수있음을알수있었다. 2. 은 HO 활성을농도의존적으로증가시켰으나, 은어떤유의한효과를보이지못했다. 3. 은 HO-1 발현에관여하는상위신호체계인 Nrf2의핵내부로의이동을유도하였으며, 이것의결과로 ARE 활성증가가관찰되었다. 반면 은 ARE 활성을유도하지못했다. 4. 은 H 2 O 2 매개산화스트레스에대하여세포보호효과를제공하였다. 산화스트레스에대한세포보호효과는 에의한 HO-1 발현유도, Nrf2 활성증가및 HO-1 활성증가와관련이있었다. 이상의결과를종합하여다음과같은결론을유도할수있었다. 첫째로, 은 Nrf2의핵내부로의이동을유도하여 ARE 활성을증가시킴으로써 HO-1 발현을유도하였다. 둘째로, 에의해서발현된 HO-1은산화스트레스에대하여세포보호효과를제공하였다. 이러한결과에의하면木香은간에작용하여항산화효과를증가시킴으로써간을보호할수있음을시사한다. 또한木香의약리효과에는 HO-1 발현유도효과외에도여러가지다른효과가있을것으로추정되며이들효과에대한더많은연구가요청된다.

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,