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승헌 누
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1 칼슘신호에의한 Cl - /HCO 3 - exchanger 의활성조절 연세대학교대학원 의과학과 조민재

2 칼슘신호에의한 Cl - /HCO 3 - exchanger 의활성조절 지도교수 이민구 이논문을석사학위논문으로제출함 2005 년 12 월일 연세대학교대학원 의과학과 조민재

3 조민재의석사학위논문을인준함 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 연세대학교대학원 2005 년 12 월일

4 감사의글 생명에대한관심으로첫발을내디딘연구자로서의길,2 년이라는짧지만은않은시간동안많은것을배우고느낄수있었습니다. 생명체가얼마나복잡한시스템으로되어있는지그리고생물학교과서그림하나하나를만들기위해많은사람들의피땀어린노력이들어가있다는것을직접느낄수있었습니다. 많이부족한저에게오늘이있도록도와주시고힘이되어주신많은분들께깊이감사드립니다. 먼저연구자로서의첫길을열어주시고지도해주신이민구교수님께감사드립니다. 교수님의연구에대한열정과실험결과에대한통찰력은마음에새겨본받도록하겠습니다. 학장업무로바쁘실텐데도저희를격려해주시고이끌어주셨던김경환교수님, 항상따뜻하게말을건네시고다독여주신김혜영교수님, 항상열심히일하시는박경수교수님감사드립니다. 마라톤을좋아하시는멋진안영수교수님, 약리학교실을위해여러가지로신경써주시는김동구교수님, 연구에대한열정으로가득차신장정원교수님께도감사드립니다. 그리고심사위원으로제연구에관심을가지고여러가지조언을해주신서정택, 허만욱교수님감사합니다. 실험에대해서여러가지로조언을해주었던완이형과나에게실험실을소개시켜주고어려울때힘이되어주었던지현이에게감사드립니다. 처음실험을가르쳐준주영누나, 입담이좋아웃음을선사해주었던원선누나, 항상반겨주는지하누나, 서로에게힘이될수있었던영웅이, 항상열심히하는지현이, 항상밝은웃음으로대해주는친누나같은정남누나, 그리고이성희선생님, 정수, 준오, 재석이모두에게감사드리고랩식구들이있었기에지금의내가있을수있다고생각합니다. 그리고항상교실의궂은일을맡아해오신임종수, 김건태, 민선해선생님감사합니다. 이름을다나열하지는못하지만힘들때힘을북돋워주고고민이있을때자기일처럼생각해주신약리학교실원모두에게진심으로감사드립니

5 다. 마지막으로자식들공부시키느라힘든농사일도마다않으시고항상뒤에서믿고지켜봐주시던어머니와아버지께진심으로감사드립니다. 부모님이계시기에지금의제가있을수있습니다. 그리고동생들민기, 형주에게도감사하는마음을전하고싶습니다. 이제막첫발을내디뎠을뿐입니다. 앞으로더열심히살아가는모습보여드리려고노력하겠습니다 년 12 월조민재

6 차례 그림및표차례 국문요약 I. 서론 1 3 I. 재료및방법 6 1. 실험재료및관류액 6 2. 세포배양및 transfection 6 3. 역전사중합효소연쇄반응 7 4. 세포내 ph 측정 8 5. 세포내칼슘신호측정 9 I. 결과 10 1.CAPAN-1 세포에서칼슘신호에의한 Cl - /HCO - 3 교환활성화 10 2.CAPAN-1 세포에서발현하는 AE 아형검색 11 3.HEK293 세포에서칼슘신호측정 칼슘신호에의한 SLC4familyAnionExchanger 의기능변동 5. 칼슘신호에의한 SLC26family AnionExchanger 의기능변동 IV. 고찰 V. 결론참고문헌 영문요약 27

7 그림차례 그림 1.CAPAN-1 세포에서 ATP 와 ionomycin 에의한 Cl - - /HCO 3 교환변화. 10 그림 2.CAPAN-1 세포에서발현하는 AE 아형. 12 그림 3.HEK293 세포에서 ATP 와 ionomycin 에의한칼슘신호측정. 13 그림 4.SLC4family AE 아형의칼슘신호에의한기능변동. 15 그림 5.CFTR 발현시 SLC4family AE 아형의칼슘신호에의한 기능변동. 16 그림 6.DRA 의칼슘신호에의한기능변동. 17

8 국문요약 Ca 2+ 신호에의한 Cl - /HCO 3 - exchanger 의활성조절 췌관세포는 140 mm의중탄산염 (HCO - 3 ) 을포함하는췌액을분비한다. 고농도의중탄산염은강산에의해십이지장이손상되는것을방지하며췌액분비의원동력이되어 mucin plugging 에의하여췌관이막히는것을방지하는등소화에중요한역할을한다. 췌관세포내강막에존재하는 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator(cftr) 와 Cl - /HCO - 3 exchanger(ae) 는중탄산염분비기전에중요한역할을한다.cAMP 신호는 CFTR 의존적인 AE 의활성을크게증가시켜중탄산염의분비를증가시키며 CFTR 유전자에돌연변이가생긴경우중탄산염분비가감소하게된다.cAMP 신호뿐만아니라칼슘신호도중탄산염의분비를증가시킬수있다. 하지만그분자기전에대해서는아직알려진바가없다. 본실험에서는칼슘신호에의한중탄산염분비에관여하는분자기전을탐색하고자하였으며특히칼슘신호에의해활성화되는 AE 들을검색하고자하였다. 췌관세포인 CAPAN-1 세포에서칼슘신호에의해 AE 의교환활성이증가한다는것을확인하였다.AE1,AE2,AE3 그리고 DRA 를각각 HEK293 세포에발현시킨경우 ATP 에의해유발된세포내칼슘신호에의해서 AE 의교환활성변화는나타나지않았다. 또한, AE1,AE2,AE3,DRA 를 CFTR 과동시발현시킨경우에도칼슘신호에의한 AE 의교환활성변화는관찰되지않았다. 따라서췌관세포에서칼슘신호에의한 Cl - /HCO - 3 교환활성의증가는 camp 신호와는다른분자기전에의해일어날수있으며, 이과정에본실험에서사용한 AE 이외의 SLC26A8, SLC26A9, SLC26A11 등다른종류의 AE 들이 - 1 -

9 관여하고있다고생각된다. 핵심되는말 : 중탄산염,CFTR,anion exchanger, 칼슘 - 2 -

10 Ca 2+ 신호에의한 Cl - /HCO 3 - exchanger 의활성조절 < 지도교수이민구 > 연세대학교대학원의과학과 조민재 Ⅰ. 서론 췌관세포는 140 mm의중탄산염 (HCO - 3 ) 을췌관으로분비한다. 이러한고농도의중탄산염분비는소화에중요한역할을한다. 중탄산염은십이지장으로들어오는강산의위액을중화시켜십이지장을보호하는역할을하며, 췌장에서분비되는여러소화효소가췌액에잘녹을수있는환경을제공하여부적절한소화효소활성에의해췌장관이손상되는것을방지한다. 1 또한췌관세포를통한중탄산염의분비는췌액이분비되는원동력이되어적절한췌액의부피와 mucin 농도를유지하여 mucin plugging 에의하여췌장관이막히는것을방지한다. 2,3 췌관세포를통한중탄산염의분비에는췌관세포측저막의 Na + /H + exchanger(nhe), Na + -HCO - 3 cotransporter(nbc), Na +,K + -ATPase, 내강막의 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator(cftr), Cl - /HCO - 3 exchanger(ae) 등여러가지세포막이온수송단백들이 - 3 -

11 관여하고있다. 4 이중췌관세포내강막의 CFTR 과 AE 가중탄산염분비에중요한역할을한다고알려져있다. 5,6 CFTR 은중탄산염을직접분비하기보다는 AE 를통해서세포내에축적된 Cl - 를다시배출하여 AE 가계속해서작동하기위한 Cl - 농도차이를유지하는역할을한다. 뿐만아니라췌장관세포의내강막에서 CFTR 과 AE 는서로상호작용하여 CFTR 의발현은 AE 의활성을증가시킬수있으며,AE 는 CFTR 의 Cl - 전도도를증가시킬수있다. 7,8,9,10 중탄산염분비조절에핵심적인역할을수행하고있는 CFTR 에발생하는변이는만성췌장염및낭포성섬유증 (cystic fibrosis) 과같은질환을일으키며, 이러한환자의경우중탄산염분비장애로인한소화장애와십이지장의손상그리고췌관에서의 mucin plugging 발생과부적절한소화효소활성이일어나게된다. 11 췌관에서중탄산염의분비를촉진하는대표적신호는 secretin, vasoactiveintestinalpeptide(vip) 등의자극에의한세포내 camp 농도증가이다. camp 는 protein kinase A(PKA) 를통해 CFTR 의 Cl - 전도도를활성화시키고 CFTR 의존적인 Cl - /HCO - 3 exchanger 의활성을증가시켜대량의중탄산염분비를가능하게한다. 1,11 camp 신호이외에도콜린성수용체, purinergic 수용체 (P2R), protease-activated receptor(par) 등의활성에의한칼슘신호도췌관에서중탄산염의분비를유도한다. 12,13 기니피그의췌관에서 purinergic 수용체효현제인 ATP 에의해중탄산염의분비가증가하며, 14 사람췌관세포인 CAPAN-1 세포에서측저막의 PAR2 수용체와내강막의 purinergic 수용체의활성이중탄산염분비를증가시킬수있다. 15,16 또한췌장선세포의 zymogen granule 이췌관으로분비되면서 ATP 가같이분비되어췌관내강막의 P2R 을활성화시켜세포내칼슘신호를일으켜중탄산염분비를증가시킬수있다. 17,18 SLC4 와 SLC26 의두개의 genefamily 가 Cl - /HCO - 3 exchanger 기능을한다.SLC4 family 는 11 개의유전자로구성되어있으며그중 Cl - - /HCO 3-4 -

12 exchanger 기능을가지고있는것은 SLC4A1(AE1), SLC4A2(AE2), SLC4A3(AE3), SLC4A9(AE4) 19 이다. 20 먼저밝혀진 SLC4 family 와구조적으로는다르지만기능적으로비슷한 SLC26 family 는 10 개의유전자로구성되어있는데, 각각은이온특이성이나발현조직분포에서차이를보이고있다. 21 이중 Cl - /HCO - 3 exchanger 기능을가지고있는것은 SLC26A3(DRA) 22, SLC26A4(Pendrin), SLC26A6(Pat-1),23,24,25, SLC26A7 26,SLC26A8 27,SLC26A9 28 이다. 여러가지 AE 의아형중 camp 신호에의해서 CFTR 의존적으로활성화될수있는것은 SLC26A3,SLC26A4,SLC26A6 라고알려져있다. 9 췌관세포에서는 camp 신호뿐만아니라칼슘신호도중탄산염의분비에중요한역할을하고있다. 하지만칼슘신호에의한중탄산염분비의분자기전에대해서는아직밝혀진바가없다. 본실험에서는세포내칼슘신호가각 AE 아형의기능에미치는영향을살펴봄으로써칼슘신호에의한중탄산염분비증가의분자적기전을밝히고자하였다

13 Ⅱ. 재료및방법 1. 실험재료및관류액 Fura-2-AM 과 2,7 -bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein (BCECF-AM) 은 Molecular Probes(Eugene, OR, U.S.A) 로부터구입하였고 ATP 외다른시약은 Sigma(St. Louis, Missouri, U.S.A) 로부터구입하였다. 기본관류액은 140 NaCl,5 KCl,1 MgCl 2,1 CaCl 2, 10 D-Glucose 그리고 10 mm HEPES 로구성되어있으며, NaOH 를사용하여 ph 를 7.4 로맞추었다. 고농도 K + (100 mm K + ), HCO - 3 관류액은 25NaCl,100KCl,1MgCl 2,1CaCl 2,10D-glucose,5 HEPES 그리고 25 mm NaHCO 3 로구성되어있으며, ph 는 7.4 로맞추었다. 고농도 K + (100 mm K + ),Cl - -free HCO - 3 관류액은 25 Na + -gluconate, 100 K + -gluconate, 1 MgSO 4, 1 hemicalcium cyclamate,10d-glucose,5hepes 그리고 25mM NaHCO 3 로구성되어있으며,pH 는 7.4 로맞추었다. 모든 HCO - 3 관류액은 95% O 2,5% CO 2 가스를계속해서주입하여 ph 를유지하였다. 모든관류액의삼투압은 310mOsm 로맞추었다. 2. 세포배양및 transfection HEK293, CAPAN-1 세포주는 ATCC(American Type Culture Colection,Rockvile,MD,U.S.A) 에서구입하였으며각각 10% FBS,1% penicilin/streptomycin 을첨가한 DMEM 과 RPMI1640 배양액을넣고각각 10% 와 5% CO 2 incubator 에서배양하였다.CAPAN-1 세포는 cover slip 위에서 10% FBS 가첨가된 RPMI1640 배양액으로 5% CO 2 incubator 에서하루동안배양후실험하였다. HEK293 세포는 10% FBS 가첨가된 DMEM 배양액으로 10% CO 2 incubator 에서하루동안배양한후 Lipofectamine Reagent(Life Technologies, Carlsbad, CA, - 6 -

14 U.S.A) 를이용하여각각의 Anion Exchanger 아형 clone 을 transfection 하고, 그후 48~72 시간배양후실험하였다. 실험에사용한 AE1,AE2, AE4,DRA,CFTR 유전자 clone 은 Dr.S.Mualem 으로부터받았다 역전사중합효소연쇄반응. CAPAN-1 세포에 Guanidinium thiocyanate phenolchloroform(trizol, Invitrogen,Carlsbad,CA,U.S.A) 을처리해서원심분리후상층액을얻어 isopropanol 로침전시켜 totalrna 를추출하였다.totalRNA 에서 random hexamer 와 oligo dt primer(invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A) 를이용하여 reversetranscriptase(superscript I,Invitrogen,Carlsbad,CA, U.S.A) 로역전사하여 cdna 를합성하였다. cdna 와각 AE 아형특이적인 primer, Taq DNA polymerase(promega, Madison, WI, U.S.A) 를사용하여 PCR 을수행하였고,0.1 µg/mlethidium bromide 가포함된 2% agarosegel 에서전기영동하여확인하였다. 사용한 primer 의염기서열과예상 PCR product 의크기는다음과같다. AE1:sense(5'-CCC TAG ACC CTC CCC CAC CAT TCC AC-3') antisense(5'-gcc TTT GCT TCT ACC CCT GCC TGT GC-3') PCR product:319basepairs AE2:sense(5'-ATG CCG CCC AAA CAC CAC CCA GAT G-3') antisense(5'-cgg CTG TCC CTC GGT GGC GGC TAC A-3') PCR product:317basepairs AE3:sense(5'-GGA GTT GGG GGG CTC TGA GGC GAC-3') antisense(5'-tcg GAC ACG CCC ATC AGC CCC TCG-3') PCR product:243basepairs AE4:sense(5'-AGC GCT TGG ACT GCC TTG GTA TGT-3') antisense(5'-agg GGG AAG ATG ATG GCT GCA GGG GTA GAC-3') PCR product:432basepairs DRA:sense(5'-TGC CAC AGC CAA CAG AAA AAT CAA A-3') - 7 -

15 antisense(5'-ggg GGA ATG TCG ACC AGC AGA G-3') PCR product:330basepairs Pendrin:sense(5'-GTT TACTAG CTG GCCTTA TAT TTG GACTGT-3') antisense(5'-agg CTA TGG ATT GGCACT TTG GGA ACG-3') PCR product:484basepairs SLC26A6:sense(5'-TAG GGG AGG TTG GGC CAG GGA TGC-3') antisense(5'-tgccgg GAA GTG CCA AACAGG AAG TAG AT-3') PCR product:456basepairs SLC26A7:sense(5'-CACTGTGTCTGGGATAATGTTGG-3') antisense(5'-cca GTT GCA GCA CAA ACA TG-3') PCR product:353basepairs SLC26A8:sense(5'-CCA AGA CCC AGA CCG AGA TG-3') antisense(5'-gag TCT GAG ACT GGG TGG AAG C-3') PCR product:150basepairs SLC26A9:sense(5'-TCC AGG TCT TCA ACA ATG CCA C-3') antisense(5'-cga ATC TTG TGC ATG TAG CGA G-3') PCR product:400basepairs SLC26A11:sense(5'-ATC CCG CCC TTC TCA GTG AC-3') antisense(5'-tag TCC AGA GAC AGC AGC ACC AG-3') PCR product:329basepairs 4. 세포내 ph 측정 Cover slip 위에서배양한세포를 ph 측정용형광물질인 BCECF-AM 이 4µM 함유된기본관류액에서 10 분간 loading 한후관류 chamber 에장착한다음 excitation 487 nm 및 442 nm 와 emission 510 nm 에서의형광을 Delta Ram System(PTI,NJ,U.S.A) 을이용하여측정하였다.pH 6.2 와 ph 7.2 의 145mM KCl,10mM HEPES 그리고 5 µm nigericin 관류액을이용하여 487/442 ratio 를 ph i 로보정하였다

16 mm Cl - 가포함된 HCO 3 - 관류액을흘려주다가 Cl - -freehco 3 - 관류액을 흘려주면 ph i 가상승하게되는데,Cl - /HCO 3 - 교환활성은단위시간에 증가하는 ph i 를통하여측정하였다. 5. 세포내칼슘신호측정 Cover slip 위에서배양한 HEK293 세포에칼슘형광물질인 Fura2-AM 을 30 분간상온에서 loading 하였다.Fura2 가 loading 된세포를관류 chamber 에장착후기본관류액을흘리면서 excitation 355 nm 및 380 nm 와 emission 510 nm 에서 Fura2 의형광을 Delta Ram system(pti,nj,u.s.a) 을이용해서측정하였다

17 Ⅲ. 결과 1.CAPAN-1 세포에서칼슘신호에의한 Cl - /HCO - 3 교환활성화췌관세포는다양한종류의 P2R 을내강막과측저막모두에가지고있으며 ATP 에의해세포내칼슘신호를유발한다. 12,17 이러한칼슘신호는기니피그의췌관또는사람췌관세포에서 CFTR- 의존적인 Cl - /HCO - 3 exchanger(ae) 를활성화한다. 14,15 정상 CFTR 을발현하는사람췌관세포에서 ATP 에의한칼슘신호가 AE 를활성화하는것을확인하였다. a mm Cl - b ATP 100 µm ionomycin 1.5 µm 7.45 mm Cl min min ph i 7.30 ph i c 7.15 HCO - 3 influx ( ph i /min) Control ATP Ionomycin 그림 1.CAPAN-1 세포주에서 ATP 와 ionomycin 에의한 Cl - /HCO 3 - 교환변화. CAPAN-1 세포에서 BCECF 를사용하여 ph i 변화를측정하였다.ATP(a) 와 ionomycin(b) 에의해 Cl - /HCO 3 - 교환이현저히증가하였다. : 표준오차

18 정상 CFTR 을발현하는사람췌관세포인 CAPAN-1 세포를 cover slip 에배양한후 Cl - /HCO - 3 교환변화를측정하였다.CAPAN-1 세포는칼슘신호에의해활성화될수있는 K + channel 과 CaCC(Ca 2+ activated Cl - channel) 가발현하고있기때문에 Cl - /HCO - 3 교환변화에대한칼슘신호의영향을정확히측정할수가없다. 따라서 K + channel 과 Cl - channel 을통한전기생성적인이온의이동을억제할수있는 100mM K + 을포함하는 HCO - 3 관류액상황하에서 Cl - /HCO - 3 교환을측정하였다. 149 mm Cl - 를포함하는 HCO - 3 관류액을흘려주다가 Cl - - free HCO 3 관류액을흘려주게되면 Cl - /HCO - 3 exchanger 가정상적상황과반대방향으로작동하여 Cl - 가세포밖으로이동하고 HCO - 3 가세포안으로들어가 ph i 가상승하게되는데, 이때 ph i 가상승하는정도로 AE 의활성을측정하였다. CAPAN-1 세포주에고농도 (100 µm) 의 ATP 자극을주었을때 Cl - /HCO - 3 교환이증가하였다. 또한칼슘이온투과체 (ionophore) 인 ionomycin 0.5µM 을이용하여칼슘신호를일으켰을때에도 AE 의교환이현저히증가하였다 ( 그림1). 2.CAPAN-1 세포에서발현하는 AE 아형검색 CAPAN-1 세포에서발현하는 AE 아형을검색하기위하여지금까지 Cl - /HCO - 3 교환기능이있다고알려진 SLC4 family 의 AE1(SLC4A1), AE2(SLC4A2), AE3(SLC4A3), AE4(SLC4A9) 와 SLC26 family 의 DRA(SLC26A3), Pendrin(SLC26A4), SLC26A6, SLC26A7, SLC26A8, SLC26A9,SLC26A11 를대상으로 RT-PCR 을수행하였다 그결과 CAPAN-1 세포는 SLC4 family 의 AE1~AE4, SLC26A6 family 의 Pendrin, SLC26A6, SLC26A8, SLC26A9, SLC26A11 등이발현하였다 ( 그림 2).CAPAN-1 세포에서발현하지않는 DRA 와 SLC26A7 은양성대조군인 T84 세포에서발현하고있음을확인하였다.DRA 의경우실제

19 췌관세포에서는발현하고있다고알려져있지만, 21 사람췌관세포인 CAPAN-1 세포에서는발현하지않았다. 3.HEK293 세포에서칼슘신호측정각 AE 아형의칼슘신호에의한활성변화를알아보기위하여다른세포에비하여내재적인 AE 활성이적고 CFTR 을발현하지않는 HEK293 세포를사용하였다.HEK293 세포가 P2R 을발현하고있는지알아보기위하여 ATP 자극에의한칼슘신호를측정하였다. HEK293 a 400 bp 300 bp AE1 AE2 AE3 AE4 500 bp 400 bp 300 bp b DRA Pendrin SLC26A6 200 bp c SLC26A7 SLC26A8 SLC26A9 SLC26A11 DRA SLC26A7 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp T-84 그림 2.CAPAN-1 세포에서발현하는 AE 아형.CAPAN-1 세포로부터얻은 cdna 를이용하여 RT-PCR 을수행한결과 CAPAN-1 세포는 SLC4 family 의 AE1~AE4, SLC26 family 의 Pendrin, SLC26A6, SLC26A8, SLC26A9, SLC26A11 을발현하였다

20 세포에 100 µm 의 ATP 자극을주었을때높은칼슘의증가를 나타내었다. 30 칼슘이온투과체인 ionomycin 을 0.5µM 처리하였을때에도 역시칼슘의증가를확인할수있었다 ( 그림 3). 4. 칼슘신호에의한 SLC4family Anion Exchanger 의기능변동칼슘신호에의한각 AE 아형의 Cl - /HCO - 3 교환기능변동을측정하기위해서각 AE 아형을 HEK293 세포에발현시켰다.Cover slip 위에서배양한 HEK293 세포에 Lipofectamine 과 Plus Reagent 를이용하여 transfection 한후 48~72 시간이지나면충분한양의 AE 가발현하게 그림 3. HEK293 세포에서 ATP 와 ionomycin 에의한칼슘신호측정. HEK293 세포를 cover slip 위에서하루동안배양한후칼슘형광물질인 Fura2-AM 을 30 분간상온에서 loading 한후칼슘신호를측정하였다.HEK293 세포는 ATP 와 ionomycin 에의해높은칼슘증가를나타내었다

21 된다. AE 발현의확인은 GFP(Green Fluorescent Protein) 를 cotransfection 하여 GFP 의형광으로확인할수있고또한 Cl - - /HCO 3 교환기능이 mock vector 를 transfection 한 HEK293 의 basal 교환기능보다향상된것으로판별하였다.SLC4 family 의 AE1,AE2,AE3 clone 1μg을 transfection 하여 HEK293 세포에발현시켰을경우 HEK293 세포의 basalcl - /HCO - 3 교환보다 4~10 배까지상승하였다. 특히 AE1 과 AE2 의경우아주높은 Cl - /HCO - 3 교환기능을보였다. AE1~AE3 를발현하는 HEK293 세포는 100 µm 의 ATP 자극에의하여 Cl - - /HCO 3 교환기능의변동을보이지않았다 ( 그림 4). CAPAN-1, CFPAC-1 세포등의췌관세포에서칼슘신호에의한 Cl - /HCO - 3 교환활성증가에는 CFTR 의발현이중요한역할을한다. 15 각 AE 아형의칼슘신호에의한활성증가에 CFTR 의영향을알아보기위해 HEK293 세포에 AE 와 CFTR 을동시발현시킨후 Cl - /HCO - 3 교환을측정하였다. HEK293 세포에 AE1(0.2 μg ), AE2(0.2 μg ), AE3(1 μg ) 과 CFTR(1 μg ) 을 cotransfection 하였을경우에도 ATP 에의한 AE1, AE2, AE3 의 Cl - /HCO - 3 교환기능변동에영향을주지않았다 ( 그림 5)

22 a Mock b AE1 ph i ph i c mm Cl mm Cl - 1 min AE2 1 min phi 7.2 ATP 100µM 7.0 ATP 100µM ph i d min AE mm Cl mm Cl min 7.2 ATP 100µM 7.0 ATP 100µM e - HCO 3 Influx ( ph/min) C o ntr ol A TP Mock AE1 AE2 AE3 그림 4.SLC4 family AE 아형의칼슘신호에의한기능변동.SLC4family 의 AE 를 HEK293 세포에 transfection 한후 Cl - /HCO - 3 교환기능을측정하였다. AE1(b),AE2(c),AE3(d) 에서 ATP 에의한 Cl - /HCO - 3 교환활성은보이지않았다. : 표준오차

23 a Mock + CFTR b AE1 + CFTR mm Cl mm Cl min min 7.6 ph i 7.4 ph i ATP 100µM 7.0 ATP 100µM c d AE2 + CFTR AE3 + CFTR mm Cl mm Cl min min ph i 7.4 ph i ATP 100µM 7.0 ATP 100µM e - HCO 3 Influx ( ph/min) C o n tr o l A T P 0. 0 M ock AE1 AE2 AE 3 +C FTR +C FTR +CFTR +C FTR 그림 5.CFTR 발현시 SLC4 family AE 아형의칼슘신호에의한기능변동. HEK293 세포에각각의 AE 와 CFTR 을 cotransfection 시킨후 Cl - /HCO - 3 교환기능을측정하였다.CFTR 의발현이 AE1(b),AE2(c),AE3(d) 의칼슘신호에의한 Cl - /HCO - 3 교환변동에영향을주지않았다. : 표준오차

24 5. 칼슘신호에의한 SLC26family Anion Exchanger 의기능변동 SLC26 family AE 에는 10 개의아형이존재한다 개의아형중 Cl - /HCO - 3 교환기능이있다고알려져있는것은 DRA, Pendrin, SLC26A6,SLC26A7,SLC26A8,SLC26A9 이다.HEK293 세포에 DRA, Pendrin,SLC26A6,SLC26A7,SLC26A9 의 AE 아형을 transfection 하여 Cl - /HCO - 3 교환을측정하였으나 DRA 를제외한나머지아형에서는 HEK293 세포의 basalcl - /HCO - 3 교환기능과비교해많은증가를보이지않았다 ( 자료표시않음 ).DRA 는 basal 교환기능에비해 4배정도높은 a DRA b DRA + CFTR mm Cl mm Cl min min ph i 7.4 ph i ATP 100µM 7.0 ATP 100µM c HCO3- Influx ( ph/min) Control ATP 0.00 DRA DRA + CFTR 그림 6. DRA 의칼슘신호에의한기능변동. HEK293 세포에 DRA 를 transfection 하거나 DRA 와 CFTR 을 cotransfection 하여 Cl - /HCO 3 - 교환기능을측 정하였다.DRA 는칼슘신호에의하여기능변동을보이지않았다. : 표준오차

25 Cl - /HCO - 3 교환기능을나타내었다. DRA 를발현하고있는 HEK293 세포에 ATP 자극을주고 Cl - /HCO - 3 교환기능을측정한결과 ATP 에의해유발된칼슘신호에의한활성변동은보이지않았다 ( 그림 6a). DRA 는 CFTR 과상호작용하며 camp 신호에의하여 CFTR 의존적으로활성화된다고알려져있다. 9 HEK293 세포에 DRA(0.2 μg ) 를 CFTR(1 μg ) 과 cotransfection 하여동시발현시켰을때, DRA 의 Cl - /HCO - 3 교환기능이 camp 신호에의해활성화되는것을확인할수있었다.( 자료표시않음 ) 하지만칼슘신호를일으키는 ATP 에의해서는 Cl - /HCO - 3 교환기능에변동을보이지않았다 ( 그림 6b)

26 Ⅳ. 고찰 사람의췌관세포는 140 mm 에이르는고농도의중탄산염을분비한다. 고농도중탄산염의분비는 mucin plugging 에의해췌관이막히거나 부적절한 소화효소 활성에 의해 췌관이 손상되는 것을 방지한다. 췌관에서 중탄산염의 분비에 대한 많은 연구가 진행되고 있지만, 아직 중탄산염분비의정확한기전은밝혀지지않았다. 4 대부분의중탄산염의 분비는췌관내강막에존재하는 AE 에의해이루어지며,CFTR 이 AE 의 기능 조절에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 2,5,6,9 CFTR 유전자에 돌연변이가 생긴 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis) 환자에서는 췌관 중탄산염분비가제대로이루어지지않아췌액의중탄산염결핍현상을 보인다. 지금까지 CFTR- 의존적중탄산염분비에대한많은연구들은 secretin 또는 vasoactive intestinal peptide(vip) 등에 의한 camp 신호를 중심으로 이루어졌다. 11 camp 신호는 CFTR 의존적 중탄산염 분비를 증가시키며, DRA, Pendrin, SLC26A6 등의 AE 가 camp 신호에 의해 CFTR 의존적으로 활성화될 수 있다. camp 신호 뿐만이 아니라 칼슘신호를 일으키는 콜린성 수용체,PAR2(protease-activated receptor 2), P2R 등의 활성이 췌액과 중탄산염의 분비를 증가시킬 수 있다. 췌관세포인 CAPAN-1 의 측저막에 trypsin 을 처리하거나 내강막에 ATP 를 주었을 때, 내강막의 Cl - /HCO - 3 교환이 현저히 증가하는 것을 관찰하였다. 15 이러한 Cl - /HCO - 3 교환의증가는 camp 신호에의한 PKA 경로를통하지않고칼슘신호에의존적이며, 정상적인 CFTR 의발현을 필요로한다. 본실험에서는현재까지알려진여러가지 AE 의아형들에 대하여 각각 칼슘신호에 의한 활성 변화를 관찰하여 췌관세포에서 칼슘신호에 의한 Cl - /HCO - 3 교환의 증가를 분자적인 관점에서 설명하고자하였다. CAPAN-1 세포에서 칼슘신호에 의한 Cl - /HCO - 3 교환활성의 증가를

27 확인하였다.CAPAN-1 세포에칼슘신호를일으키는물질로는 ATP 와 ionomycin 을사용하였다. CAPAN-1 세포는 P2R 을발현하고있어 ATP 에의해세포내칼슘신호가일어나며, 칼슘 ionophore 인 ionomycin 도세포내칼슘신호를일으킨다. 15 Cl - /HCO - 3 교환의측정은 CaCC 와 CFTR 을통한전기생성적인 Cl - 의이동을막기위하여고농도의 K + (100 mm K + ) 관류액에서수행하였다.CAPAN-1 세포는측저막과내강막으로분화되지않은상태에서도 ATP 와 ionomycin 자극에의해 Cl - /HCO - 3 교환의증가를나타내었다 ( 그림 1). CAPAN-1 세포에서 Cl - /HCO - 3 교환은 AE 에의해이루어진다. AE 에는여러가지아형들이존재하는데, 지금까지 SLC4family 와 SLC26 family 가알려져있다. 20,21 각각의 AE 아형들이 CAPAN-1 세포에서어떻게발현하고있는지를알아보기위하여각아형들에대하여 RT-PCR 을수행하였다. 그결과 CAPAN-1 세포는 AE1~AE4,Pendrin, SLC26A6,SLC26A8,SLC26A9,SLC26A11 등을발현하였다. 췌장관의내강막에는 DRA 와 SLC26A6 가다량발현하고있어중탄산염의분비에중요한역할을하고있다고알려져있다. 10 하지만 CAPAN-1 세포에서는 DRA 는발현하고있지않았다 ( 그림 2). 각각의 AE 아형의 Cl - /HCO - 3 교환성질을알아보기위하여 HEK293 세포를사용하였다. 9 HEK293 세포는내재적인 AE 활성이낮으며, CFTR 을발현하고있지않다. 칼슘신호를일으키는효현제로는 ATP 를사용하였다.HEK293 세포도 P2R 을발현하고있어 ATP 에의해높은칼슘신호를나타내었다 ( 그림 3). 각각의 AE 아형을 lipofectamine 과 plus reagent 를이용하여 transfection 하여 HEK293 세포에발현시킨후 Cl - /HCO - 3 교환성질을측정하였다.AE clone 의발현확인은 GFP 를 cotransfection 하여 GFP 형광과 AE transfection 시나타나는 Cl - - /HCO 3 교환의증가로확인하였다. 본실험에서사용한 AE1,AE2,AE3,DRA 의네가지아형은모두 HEK293 세포에발현하였을때 Cl - /HCO - 3 교환의증가를나타내었다

28 AE1,AE2,AE3,DRA 는 ATP 에의해유발된칼슘신호에의해활성변화를보이지않았다.( 그림4). 또한각 AE 를 CFTR 과동시발현시킨후 CFTR 의존적인 Cl - /HCO - 3 교환을측정하였을경우에도 ATP 에의한 AE 의활성변화은나타나지않았다 ( 그림5). camp 신호는 CFTR 의존적으로 DRA,SLC26A4,SLC26A6 를활성화한다. 9 따라서칼슘신호에의한중탄산염분비의증가는 camp 신호와다른분자기전에의하여이루어진다고생각된다. 또한지금까지췌관내강막의중탄산염분비에 DRA,SLC26A6 등이중요한역할을한다고생각되었지만, 칼슘신호에의한중탄산염분비의증가에는 SLC26A8, SLC26A9,SLC26A11 등의 AE 가중요한역할을하리라생각된다

29 Ⅴ. 결론 본연구에서는췌관세포의중탄산염분비에있어서칼슘신호의역할을 분자적인관점에서살펴보았으며다음과같은결과를얻었다. 1. 고농도 K + 함유관류액에서 CAPAN-1 세포는칼슘신호를일으키는 ATP 와 ionomycin 에의해서 Cl - /HCO 3 - 교환기능이현저히증가하였다. 2. CAPAN-1 세포에발현하고있는 AE 아형을 RT-PCR 을통하여 확인한결과,SLC4 family 의 AE1,AE2,AE3,AE4 와 SLC26 family 의 Pendrin, SLC26A6, SLC26A8, SLC26A9, SLC26A11 이 확인하였다. 발현함을 3.HEK293 세포에 AE1,AE2,AE3 를 transfection 후칼슘신호에의한 AE 활성변화를측정한결과 ATP 자극에의하여교환기능에변화가없었다. 또한 CFTR 을동시발현한후칼슘신호에의한활성변화를측정하였을때에도 ATP 자극에의하여교환기능이증가하지않았다. 4.DRA 는 ATP 자극에의해교환기능이증가하지않았으며,DRA 와 CFTR 을동시발현하였을경우에도 ATP 에의해교환기능이증가하지 않았다. 이상의결과를종합하여볼때, 칼슘신호에의한중탄산염분비의증가는 AE1,AE2,AE3,DRA 를통해서이루어지지않는다. 칼슘신호에의한중탄산염분비의증가는 camp 와는다른분자적기전으로일어난다고생각할수있으며 SLC26A8,SLC26A9,SLC26A11 등본실험에서기능을검색하지않은다른 AE 가관여하고있다고생각된다

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34 Abstract Modulation of Cl - /HCO - 3 exchanger activity by Ca 2+ signal Min Jae JO Department of Medical Science The Graduate School, Yonsei University (Directed by Associate Professor Min Goo Lee) Pancreatic duct cels secrete bicarbonate (HCO - 3 )-rich fluid into pancreatic duct.high concentration of bicarbonate is important for digestive function and maintaining the patency of pancreatic ductal tree.although themechanisms ofpancreatic bicarbonatesecretion are not fuly understood yet,it is widely accepted that cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and Cl - - /HCO 3 exchanger(anion exchanger,ae)play an importantrolein bicarbonate secretion.aes such as DRA,SLC26A4,SLC26A6 can be activated CFTR-dependently by camp signal.although calcium signalcan also activate bicarbonate secretion, litle is known about the molecular mechanism. In this study,we investigated the molecular basis of Cl - - /HCO 3 exchange activation by calcium signal in pancreatic duct. It was confirmed that calcium signal evoked by ATP and ionomycin can

35 activatecl - /HCO - 3 exchangeactivity in CAPAN-1.Among AE1,AE2, AE3,and DRA which wetested,noneoftheabovetransporterswere activated by calcium signalin HEK293 celwhen expressed with or without CFTR. This result suggests that Cl - /HCO - 3 exchange activation by calcium signalis mediated through diferentmolecular mechanism from thatofcamp signaland is mediated through other AEsthanAE1,AE2,AE3andDRA. Key W ords:bicarbonate,cftr,anion exchanger,calcium

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Æ¯ÇãÃ» '' - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - ' - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - Super-Bio Co., Ltd. KWON, Suk-Tae Thermostable DNA Polymerase-encoding Gene from Thermus sp. X-1 an d Amino Acid Sequence