NextSeq 550 시스템 안내서( )

Transcription

1 NextSeq 550 시스템안내서 연구전용. 진단절차에는사용할수없음. ILLUMINA 소유권카탈로그번호 SY DOC 문서번호 v02 KOR 2016년 3월 맞춤프로토콜선택기로간단한전체작업흐름안내서사용자지정 support.illumina.com/custom-protocol-selector.html

2 이문서와이문서에수록된내용은 Illumina, Inc. 및그자회사 ("Illumina") 의재산이며여기에설명된제품의사용과관련하여전적으로계약에보증된고객의사용만을위한것이며그외의목적으로는사용할수없습니다. 이문서와이문서에수록된내용은다른목적으로사용되거나배포될수없으며, Illumina 로부터사전서면승인없이는어떤방식으로도전달, 공개또는복제될수없습니다. Illumina 에서는이문서를통해특허, 상표, 저작권또는관습법적권한또는타사의유사권한에따라어떠한라이선스도양도하지않습니다. 이문서의지침은여기에설명된제품의올바르고안전한사용을위해적절한교육을받은자격을갖춘사람을통해서엄격하고정확하게준수되어야합니다. 해당제품을사용하기에앞서이문서의모든내용을철저히읽고숙지해야합니다. 여기에포함된모든지침을완전히읽거나정확하게따르지않을경우제품손상, 사용자나다른사람의인체부상, 그리고다른재산에대한손해가발생할수있습니다. Illumina 는여기에설명된제품 ( 그부품이나소프트웨어포함 ) 을잘못사용하여발생하는일에대해어떠한책임도지지않습니다 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cbot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, ForenSeq, Genetic Energy, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iscan, iselect, MiniSeq, MiSeq, MiSeqDx, MiSeq FGx, NeoPrep, NextBio, Nextera, NextSeq, Powered by Illumina, SureMDA, TruGenome, TruSeq, TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, 호박빛주황색및하단흐름디자인은미국및 / 또는다른국가에서 Illumina, Inc. 및 / 또는해당자회사의상표입니다. 여기에포함된그밖의모든이름, 로고및기타상표는해당소유자의재산입니다. ii 문서번호 v02 KOR

3 개정내역 문서날짜변경내용설명 문서번호 v02 자료번호 문서번호 v 년 3 월 2015 년 10 월 B 2015 년 5 월 A 2015 년 5 월 인덱싱고려사항이라는제목의섹션이추가되었습니다. 플로우셀검사단계가제거되었습니다. 시약카트리지에라이브러리를장착하는단계에장착용량과농도가명시되었습니다. 권장공급업체의 NaOCl 에해당하는제품은일반실험실용동급제품이라고명시되었습니다. 연례예방관리서비스에대한권장사항이추가되었습니다. 개요및시작장의정보가재편되었습니다. 시스템설정을사용자지정하기위한지침이추가되었습니다. 문제해결장에서 Live Help( 실시간도움말 ) 지침이제거되었습니다. 이기능은제어소프트웨어에서제거되었습니다. 시약카트리지의예약된저장소에대한설명이수정되었습니다. 최초릴리스 NextSeq 550 시스템안내서 iii

4 iv 문서번호 v02 KOR

5 목차 개정내역목차 iii v 1 장개요 1 소개 2 추가리소스 3 기기컴포넌트 4 시퀀싱소모품개요 7 2 장시작 11 기기시작 12 시스템설정사용자지정 13 실행설정사용자지정 14 사용자공급소모품및장비 15 3 장시퀀싱 17 소개 18 시퀀싱작업흐름 19 시약카트리지준비 20 플로우셀준비 21 시퀀싱용라이브러리준비 22 시퀀싱실행설정 23 실행진행률모니터링 29 자동실행후세척 31 4 장스캐닝 33 소개 34 스캔작업흐름 35 DMAP 폴더다운로드 36 어댑터에 BeadChip 장착 37 스캔설정 38 스캔진행률모니터링 40 5 장관리 41 소개 42 수동세척수행 43 소프트웨어업데이트 46 기기종료 48 부록 A 문제해결 49 NextSeq 550 시스템안내서 소개 50 문제해결파일 51 자동검사오류해결 53 폐시약용기가가득참 55 재혼성화작업흐름 56 BeadChip 및스캔오류 58 Custom 레시피및레시피폴더 60 시스템검사 61 RAID 오류메시지 63 시스템설정구성 64 v

6 부록 B 실시간분석 67 실시간분석개요 68 실시간분석작업흐름 70 부록 C 아웃풋파일및폴더 73 시퀀싱출력파일 74 아웃풋폴더구조시퀀싱 78 스캐닝아웃풋파일 79 스캐닝아웃풋폴더구조 80 인덱스 81 기술지원 85 vi 문서번호 v02 KOR

7 1 장개요개요 1 장 소개 2 추가리소스 3 기기컴포넌트 4 시퀀싱소모품개요 7 NextSeq 550 시스템안내서 1

8 개요 소개 시퀀싱기능 배열스캐닝기능 Illumina NextSeq 550 시스템은고처리량시퀀싱과배열스캐닝사이를원활하게전환해주는단하나의솔루션입니다. } 고처리량시퀀싱 NextSeq 550 을사용하여엑솜, 전체게놈, 전사체시퀀싱을수행하고 TruSeq 및 Nextera 라이브러리를지원할수있습니다. } 플로우셀유형 플로우셀은높은아웃풋및중간아웃풋용구성에서사용할수있습니다. 각플로우셀유형은호환되는사전충전시약카트리지와함께키트로제공됩니다. } RTA( 실시간분석 ) 통합분석소프트웨어가이미지분석및 base calls 등기기내데이터분석을수행합니다. NextSeq 는차별화된중요한구성및기능을갖춘 RTA v2 라는 RTA 구현을사용합니다. 자세한내용은 67 페이지의실시간분석을참조하십시오. } BaseSpace 통합 데이터분석, 저장및협업을위한 Illumina 유전체학컴퓨팅환경인 BaseSpace 와시퀀싱작업흐름이통합되었습니다. BaseSpace 용으로구성된기기의경우 BaseSpace Prep(BaseSpace 준비 ) 탭에서라이브러리정보와실행매개변수를지정합니다. BaseSpace 에설정된실행은실행을설정하는동안기기인터페이스에표시됩니다. 실행이진행되면아웃풋파일이실시간으로 BaseSpace 또는 BaseSpace Onsite 에스트리밍됩니다. } 제어소프트웨어의통합배열스캐닝 NextSeq 550 을사용하면동일한제어소프트웨어로동일한기기에서배열스캔과고처리량시퀀싱사이를전환할수있습니다. } 확장이미지생성기능 NextSeq 550 의이미지생성시스템에는 BeadChip 스캐닝에적합하도록표면적이더큰이미지를생성할수있는소프트웨어및대수정기능이포함되어있습니다. } BeadChip 유형 호환되는 BeadChip 유형으로는 CytoSNP-12, CytoSNP-850K, Karyomap- 12 가있습니다. } BeadChip 어댑터 재사용가능한 BeadChip 어댑터로 BeadChip 을기기에쉽게장착할수있습니다. } 데이터분석 BlueFuse Multi 소프트웨어를사용하여배열데이터를분석할수있습니다. 2 문서번호 v02 KOR

9 추가리소스 다음설명서는 Illumina 웹사이트에서다운로드할수있습니다. 리소스 NextSeq 시스템현장준비안내서 ( 문서번호 ) 설명 실험실공간, 전기적요건및환경적고려사항에대한내용을담고있습니다. 추가리소스 NextSeq 시스템안전및규정준수안내서 ( 문서번호 ) RFID 리더 - 모델번호 TR 사용자안내서 ( 문서번호 ) NextSeq 시스템용라이브러리 Denaturation 및희석 ( 문서번호 ) NextSeq Custom 프라이머안내서 ( 문서번호 ) BaseSpace 도움말 (help.basespace.illumina.com) 작업안전고려사항, 규정준수설명서, 기기라벨지정에대한내용을담고있습니다. 기기의 RFID 리더, 규정준수인증및안전고려사항에대한내용을담고있습니다. 시퀀싱실행시준비된라이브러리를 Denaturation 및희석하고 PhiX 컨트롤 ( 선택사항 ) 을준비하기위한지침을담고있습니다. 이단계는대부분의라이브러리유형에적용됩니다. Illumina 시퀀싱프라이머대신 Custom 시퀀싱프라이머를이용하는방법에대한내용을담고있습니다. BaseSpace 사용정보와제공되는분석옵션에대한내용을담고있습니다. 설명서, 소프트웨어다운로드, 온라인교육및자주묻는질문과답변 (FAQ) 등의정보를이용하려면 Illumina 웹사이트의 NextSeq 550 지원페이지를방문하시기바랍니다. NextSeq 550 시스템안내서 3

10 개요 기기컴포넌트 NextSeq 550 시스템은터치스크린모니터와상태표시줄, 세가지부분으로구성됩니다. 그림 1 기기컴포넌트 이미지생성부분 A 이미지생성부분 시퀀싱용플로우셀또는스캐닝용 BeadChip 어댑터가들어있습니다. B 터치스크린모니터 제어소프트웨어인터페이스를사용하여기기구성과설정을활성화합니다. C 상태표시줄 처리중 ( 파란색 ), 기기를살펴보아야함 ( 주황색 ), 시퀀싱준비완료 ( 녹색 ), 다음 24시간내에세척예정 ( 노란색 ) 으로기기상태를나타냅니다. D 완충제부분 완충제카트리지와폐시약용기가들어있습니다. E 시약부분 시약카트리지가들어있습니다. 이미지생성부분에있는대에는시퀀싱용플로우셀또는스캐닝용 BeadChip 어댑터를배치하기위한배열핀 3 개가포함되어있습니다. 플로우셀또는 BeadChip 어댑터를장착하면이미지생성부분도어가자동으로닫히고컴포넌트가제자리로이동합니다. 시약및완충제부분 NextSeq 550 에서시퀀싱실행을설정하려면시약부분과완충제부분에접근하여실행소모품을장착하고폐시약용기를비워야합니다. 4 문서번호 v02 KOR

11 그림 2 시약및완충제부분 기기컴포넌트 NextSeq 소프트웨어 A 시약부분도어 도어오른쪽하단모서리의걸쇠를사용하여시약부분을에워쌉니다. 시약부분에는시약카트리지가들어있습니다. Sipper와플루이딕시스템을통해시약이펌프되고나서플로우셀에펌프됩니다. B 시약카트리지 사전충전된일회용소모품입니다. C 완충제카트리지 사전충전된일회용소모품입니다. D 폐시약용기 각실행후폐기용폐시약을수집합니다. E 완충제부분도어 도어왼쪽하단모서리의걸쇠를사용하여완충제부분을에워쌉니다. 기기소프트웨어에는시퀀싱실행또는배열스캐닝을수행하는통합애플리케이션이포함됩니다. } NCS(NextSeq 제어소프트웨어 ) 제어소프트웨어는시퀀싱실행또는배열스캐닝설정단계를안내합니다. } RTA( 실시간분석 ) 소프트웨어 시퀀싱실행시 RTA 는실행중에이미지분석및 base calls 를수행합니다. NextSeq 550 은이전버전과차별화된중요한구성및기능을갖춘 RTA v2 를사용합니다. 자세한내용은 67 페이지의실시간분석을참조하십시오. 상태아이콘 제어소프트웨어인터페이스화면의상단오른쪽모서리에있는상태아이콘은실행설정또는실행중에나타나는상태변경을신호로알립니다. 상태아이콘 상태이름 설명 상태양호 시스템이정상입니다. 처리중시스템이처리중입니다. 경고경고가발생했습니다. 경고는실행을중지시키지않으며진행하기전에조치를취할필요가없습니다. 오류오류가발생했습니다. 오류가발생하면실행을진행하기전에조치를취해야합니다. 상태가변경되면이를알리기위해아이콘이깜박입니다. 아이콘을선택하면상태에대한설명을볼수있습니다. Acknowledge( 확인 ) 를선택하여메시지를수락하고 Close( 닫기 ) 를선택하여대화상자를닫습니다. NextSeq 550 시스템안내서 5

12 개요 전원버튼 NextSeq 전면의전원버튼으로기기와기기컴퓨터의전원을켤수있습니다. 기기의전원상태에따라전원버튼은다음과같은동작을수행합니다. 전원상태 동작 기기의전원이꺼짐버튼을짧게누르면전원이켜집니다. 기기의전원이켜짐 기기의전원이켜짐 버튼을짧게누르면전원이꺼집니다. 정상적인기기종료를확인하는대화상자가화면에표시됩니다. 전원버튼을 10 초간누르고있으면기기와기기컴퓨터가강제종료됩니다. 기기가응답하지않는경우에만이방법으로기기의전원을끕니다. 참고시퀀싱실행중에기기의전원을끄면실행이즉시종료됩니다. 실행종료는최종명령입니다. 실행소모품은다시사용할수없으며, 실행의시퀀싱데이터는저장되지않습니다. 재사용가능 BeadChip 어댑터개요 재사용가능 BeadChip 어댑터는스캐닝중에 BeadChip 을수용합니다. BeadChip 은고정클립으로어댑터의오목한선반에고정됩니다. 그러면 BeadChip 어댑터가이미지생성부분의대에장착됩니다. 그림 3 재사용가능 BeadChip 어댑터 A B BeadChip 어댑터고정클립 6 문서번호 v02 KOR

13 시퀀싱소모품개요 NextSeq 550 에서시퀀싱실행을수행하려면일회용 NextSeq 500/550 키트가필요합니다. 각키트에는시퀀싱실행에필요한시약과플로우셀 1 개가들어있습니다. 플로우셀과시약카트리지, 완충제카트리지는정확한소모품추적기능과호환성을지원하기위해 RFID( 무선주파수식별 ) 를사용합니다. 키트호환성라벨지정 키트컴포넌트는플로우셀과시약카트리지간의호환성을표시하기위해색상으로구분된표시기로라벨이지정되어있습니다. 항상호환되는시약카트리지와플로우셀을사용하십시오. 완충제카트리지가일반적으로사용됩니다. 각플로우셀과시약카트리지에는 High( 높음 ) 또는 Mid( 중간 ) 라는라벨이붙어있습니다. 실행용소모품을준비할때항상라벨을확인하십시오. 시퀀싱소모품개요 키트유형 라벨에표시된내용 High Output 키트컴포넌트 Mid Output 키트컴포넌트 플로우셀개요 그림 4 플로우셀카트리지 A 레인쌍 A 레인 1과 3 B 레인쌍 B 레인 2와 4 C 플로우셀카트리지프레임 플로우셀은유리기반기질로, 클러스터가생성되고시퀀싱반응이일어납니다. 플로우셀은플로우셀카트리지에들어있습니다. 플로우셀에는쌍으로이미지가생성되는레인 4 개가들어있습니다. } 레인 1 과 3( 레인쌍 A) 은동시에이미지가생성됩니다. } 레인 2 와 4( 레인쌍 B) 는레인쌍 A 의이미지생성이완료되면이미지가생성됩니다. 플로우셀에는레인 4 개가들어있지만하나의라이브러리또는일련의라이브러리풀만플로우셀에서시퀀싱됩니다. 라이브러리는단일저장소의시약카트리지에장착되며플로우셀의모든레인 4 개에자동전달됩니다. NextSeq 550 시스템안내서 7

14 개요 각레인의이미지는타일이라는작은이미지생성구역에생성됩니다. 자세한내용은 75 페이지의플로우셀타일을참조하십시오. 시약카트리지개요 시약카트리지는클러스터링및시퀀싱시약으로미리채워져있으며알루미늄포장지에싸인저장소와 RFID 추적으로구성된일회용소모품입니다. 그림 5 시약카트리지 시약카트리지에는준비된라이브러리를장착할수있는지정된저장소가포함되어있습니다. 실행이시작되면라이브러리가저장소에서플로우셀로자동전달됩니다. 여러저장소가자동실행후세척용으로예약됩니다. 세척액은완충제카트리지에서예약된저장소로펌프되어시스템을통과한다음폐시약용기로펌프됩니다. 경고이시약에는생식계에영향을미칠수있는독성지방족아마이드인포름아마이드가들어있습니다. 흡입, 섭취하거나피부또는눈에접촉할경우인체에상해를입을수있습니다. 보안경, 장갑, 실험실가운등의보호장비를착용하십시오. 사용한시약은화학폐기물로취급하고현지정부안전표준에따라폐기하시기바랍니다. 환경, 건강및안전정보는 support.illumina.com/sds.html 에서본키트에관한 SDS 를참조하십시오. 준비된저장소 그림 6 숫자가매겨진저장소 8 문서번호 v02 KOR

15 위치 설명 7, 8, 9 Custom 프라이머 ( 선택사항 ) 용으로예약됨 10 라이브러리장착 Custom 프라이머에대한내용은 NextSeq Custom 프라이머안내서 ( 문서번호 ) 를참조하십시오. 위치 6 번에서제거가능한저장소 사전충전시약카트리지에는포름아마이드가함유된 denaturation 시약이위치 6 번에들어있습니다. 시퀀싱실행후사용되지않는시약을안전하게폐기할수있도록위치 6 번의저장소를꺼낼수있습니다. 자세한내용은 25 페이지의위치 6 번에서사용한저장소제거를참조하십시오. 시퀀싱소모품개요 완충제카트리지개요 완충제카트리지는완충제와세척액으로사전충전된저장소세개로구성되어있는일회용소모품입니다. 완충제카트리지의내용물은하나의플로우셀을시퀀싱하기에충분합니다. 그림 7 완충제카트리지 NextSeq 550 시스템안내서 9

16 10 문서번호 v02 KOR

17 2 장시작시작 2 장 기기시작 12 시스템설정사용자지정 13 실행설정사용자지정 14 사용자공급소모품및장비 15 NextSeq 550 시스템안내서 11

18 시작 기기시작 전원스위치를 I( 켜짐 ) 위치로전환합니다. 그림 8 기기뒷면의전원스위치 1 시약부분위에있는전원버튼을누릅니다. 전원버튼을누르면기기의전원이켜지고통합기기컴퓨터및소프트웨어가시작됩니다. 그림 9 기기전면의전원버튼 2 운영체제의로드가완료될때까지기다립니다. NCS(NextSeq 제어소프트웨어 ) 가시작되고시스템이자동으로초기화됩니다. 초기화단계가완료되면 Home( 홈 ) 화면이열립니다. 3 로그인자격증명을입력하도록시스템이구성된경우다음과같은기본값사용자이름과암호를사용하여로그인합니다. } 사용자이름 : sbsuser } 암호 : sbs123 그렇지않으면사이트에지정된자격증명을사용하여로그인합니다. 12 문서번호 v02 KOR

19 시스템설정사용자지정 시작옵션선택 제어소프트웨어에는시작옵션, 입력기본설정, 오디오설정및기기이름에대한사용자지정가능시스템설정이포함되어있습니다. 1 Manage Instrument( 기기관리 ) 화면에서 System Customization( 시스템사용자지정 ) 을선택합니다. 2 다음과같은시작옵션중에서선택합니다. } 제어소프트웨어인터페이스를전체화면으로사용하려면 Kiosk Mode( 키오스크모드 ) 를선택합니다. } 기기컴퓨터의 Windows 에액세스하도록허용하려면 Windows Mode(Windows 모드 ) 를선택합니다. 이모드에서는버튼위치와같은소프트웨어인터페이스와의상호작용이변경될수있습니다. 3 Save( 저장 ) 를선택하여설정을저장하고다음화면으로이동합니다. 시스템설정사용자지정 입력옵션및오디오표시기설정 1 Manage Instrument( 기기관리 ) 화면에서 System Customization( 시스템사용자지정 ) 을선택합니다. 2 기기에입력하기위해화상키보드를활성화하려면 Use on-screen keyboard( 화상키보드사용 ) 체크박스를선택합니다. 3 다음과같은경우에오디오표시기를켜려면 Play audio( 오디오재생 ) 체크박스를선택합니다. } 기기를초기화할때 } 실행이시작될때 } 특정오류가발생할때 } 사용자상호작용이필요할때 } 실행이완료되었을때 4 Save( 저장 ) 를선택하여설정을저장하고다음화면으로이동합니다. 기기 ID 사용자지정 1 Manage Instrument( 기기관리 ) 화면에서 System Customization( 시스템사용자지정 ) 을선택합니다. 2 기기의기본설정이미지를지정하려면 Browse( 찾아보기 ) 를선택하고해당이미지를지정합니다. 3 Nick Name( 별칭 ) 필드에기기의기본설정이름을입력합니다. 4 Save( 저장 ) 를선택하여설정을저장하고다음화면으로이동합니다. 이미지와이름이각화면의왼쪽상단모서리에표시됩니다. NextSeq 550 시스템안내서 13

20 시작 실행설정사용자지정 제어소프트웨어에는실행설정기본설정과사용하지않은시약제거에필요한사용자지정가능설정이포함되어있습니다. 실행설정옵션지정 1 Manage Instrument( 기기관리 ) 화면에서 System Customization( 시스템사용자지정 ) 을선택합니다. 2 Save( 저장 ) 를선택하여 Run Customization( 실행사용자지정 ) 으로이동합니다. 3 Use Advanced Load Consumables( 고급소모품장착사용 ) 체크박스를선택하여한화면에서모든실행소모품을장착할수있는옵션을활성화합니다. 4 자동검사를성공적으로완료한후에시퀀싱또는스캐닝을자동으로시작하려면 Skip Pre-Run Check Confirmation( 실행전검사확인건너뛰기 ) 체크박스를선택합니다. 5 Save( 저장 ) 를선택하여설정을저장하고화면을종료합니다. 자동제거옵션설정 1 Manage Instrument( 기기관리 ) 화면에서 System Customization( 시스템사용자지정 ) 을선택합니다. 2 Save( 저장 ) 를선택하여 Run Customization( 실행사용자지정 ) 으로이동합니다. 3 Purge Consumables at End of Run( 실행종료시소모품제거 ) 체크박스를선택하여각실행후사용되지않은시약을시약카트리지에서폐시약용기로자동으로옮깁니다. 참고소모품을제거하면작업흐름에시간이자동으로추가됩니다. 4 Save( 저장 ) 를선택하여설정을저장하고화면을종료합니다. 14 문서번호 v02 KOR

21 사용자공급소모품및장비 NextSeq 550 에서사용되는소모품과장비는다음과같습니다. 시퀀싱실행용사용자공급소모품 소모품 공급업체 용도 1N NaOH ( 수산화나트륨 ) 일반실험용품공급업체 라이브러리 Denaturation(0.2N로희석 ) 200mM Tris-HCl, ph7 일반실험용품공급업체 라이브러리 Denaturation 알코올천, 70% 이소프로필 VWR, 카탈로그번호 플로우셀세척및일반용도 또는에탄올, 70% ( 또는동급 ) 일반실험용품공급업체 일회용장갑, 비분말성 (powderfree) 일반실험용품공급업체 일반용도 보풀이적게이는실험실용티슈 VWR, 카탈로그번호 ( 또는동급 ) 플로우셀세척 사용자공급소모품및장비 기기관리용사용자공급소모품 소모품공급업체용도 NaOCl, 5% ( 차아염소산나트륨 ) 트윈 20 사용자공급장비 Sigma-Aldrich, 카탈로그번호 ( 또는일반실험실용동급 ) Sigma-Aldrich, 카탈로그번호 P7949 수동실행후세척을사용하여기기세척 (0.12% 로희석 ) 수동세척옵션을사용하여기기세척 (0.05% 로희석 ) 물, 일반실험실용순수일반실험용품공급업체기기세척 ( 수동세척 ) 일반실험실용순수지침 항상일반실험실용순수또는탈이온수를사용하여기기절차를수행합니다. 수돗물을사용해서는안됩니다. 사용가능한물등급또는동급의물은다음과같습니다. } 탈이온수 } Illumina PW1 } 18 메그옴 (MΩ) 수 } Milli-Q 수 } Super-Q 수 } 분자생물실험용순수 품목냉동고, -25 ~-15, 성에방지형얼음통냉장고, 2 ~8 공급원일반실험용품공급업체일반실험용품공급업체일반실험용품공급업체 NextSeq 550 시스템안내서 15

22 16 문서번호 v02 KOR

23 3 장시퀀싱시퀀싱 3 장 소개 18 시퀀싱작업흐름 19 시약카트리지준비 20 플로우셀준비 21 시퀀싱용라이브러리준비 22 시퀀싱실행설정 23 실행진행률모니터링 29 자동실행후세척 31 NextSeq 550 시스템안내서 17

24 시퀀싱 소개 NextSeq 550 에서시퀀싱실행을수행하려면, 시약카트리지및플로우셀을준비한다음, 소프트웨어의메시지에따라실행을설정하고시작합니다. 클러스터생성및시퀀싱이기기내에서수행됩니다. 실행이후기기에이미장착된컴포넌트를사용하여기기세척이자동으로시작됩니다. 클러스터생성 클러스터생성중에단일 DNA 분자는플로우셀표면에매여있다가증폭을거쳐클러스터를형성합니다. 시퀀싱 분석 클러스터에서는형광라벨이붙은각사슬종결자별필터조합과 2 채널시퀀싱화학반응을사용하여이미지가생성됩니다. 플로우셀의타일하나에대한이미지생성이완료되면다음타일의이미지가생성됩니다. 이프로세스가시퀀싱주기마다반복됩니다. 이미지분석후에는소프트웨어에서 base calls, 필터링을수행하고 quality score 를평가합니다. 제어소프트웨어인터페이스, BaseSpace 의 Run( 실행 ) 탭또는 SAV( 시퀀싱분석뷰어 ) 소프트웨어를사용하는네트워크컴퓨터에서실행진행상태와통계를모니터링합니다. 30 페이지의시퀀싱분석뷰어를참조하십시오. 실행이진행되는동안제어소프트웨어에서이차분석을위해 BaseSpace 또는지정된아웃풋위치로 base calls(bcl) 파일을자동전송합니다. 애플리케이션에따라여러분석방법을사용할수있습니다. 자세한내용은 BaseSpace 도움말 (help.basespace.illumina.com) 을참조하십시오. 시퀀싱실행시간 리드사이클수 시퀀싱실행시간은수행하는주기수에따라달라집니다. 최대실행길이는리드당 150 주기 (2 x 150) 와두인덱스리드각각에대해 8 주기로진행되는페어드엔드런입니다. 예상시간과기타시스템사양은 Illumina 웹사이트의 NextSeq 550 사양페이지를참조하십시오. 시퀀싱실행시리드에서수행된주기수는분석한주기수보다하나가더많습니다. 예를들어페어드엔드런이 150 주기인경우 151 주기리드가두번실행되어총 302 주기 (= 2 x 151) 가됩니다. 실행이끝날때 2 x 150 주기가분석됩니다. 계산을위상화및사전위상화하려면별도의주기가필요합니다. 18 문서번호 v02 KOR

25 시퀀싱작업흐름 Illumina BaseSpace 또는 BaseSpace Onsite 를사용하는구성 : BaseSpace Prep(BaseSpace 준비 ) 탭에서실행을설정합니다. BaseSpace 도움말 (help.basespace.illumina.com) 을참조하십시오. 새시약카트리지준비 : 해동한후검사합니다. 새플로우셀준비 : 온도를실온에맞추고포장을풀어검사합니다. 라이브러리를 Denaturation 및희석합니다 ( 일부라이브러리유형에는적용되지않음 ). NextSeq 시스템용라이브러리 Denaturation 및희석 ( 문서번호 ) 을참조하십시오. 시퀀싱작업흐름 라이브러리희석액을 10 번저장소의시약카트리지에장착합니다. 소프트웨어인터페이스에서 Sequence( 시퀀스 ) 를선택하여실행설정단계를시작합니다. 플로우셀을장착합니다. 폐시약용기를비우고다시장착합니다. 완충제카트리지와시약카트리지를장착합니다. 실행매개변수와자동검사결과를검토합니다. Start( 시작 ) 를선택합니다. 제어소프트웨어인터페이스, BaseSpace 의 Run( 실행 ) 탭또는시퀀싱분석뷰어를사용하는네트워크컴퓨터에서실행을모니터링합니다. 시퀀싱이완료되면기기세척이자동으로시작됩니다. NextSeq 550 시스템안내서 19

26 시퀀싱 시약카트리지준비 1 시약카트리지를 -25 ~-15 인보관소에서꺼냅니다. 2 해동될때까지실온의수조에넣어녹입니다 ( 최대 60 분 ). 카트리지를완전히담그지마십시오. 3 작업대에서가볍게두드려바닥에들어간물을빼낸다음, 바닥을말립니다. 참고 [ 다른방법 ] 시약을 2 ~8 에서하룻밤동안해동합니다. 18 시간이상시약을해동해야합니다. 이온도에서는시약이최대 1 주일동안안정적인상태를유지합니다. 4 카트리지를 5 번뒤집어시약을혼합합니다. 5 29, 30, 31, 32 위치의시약이해동되었는지확인합니다. 6 작업대에서가볍게두드려공기방울을제거합니다. 경고이시약에는생식계에영향을미칠수있는독성지방족아마이드인포름아마이드가들어있습니다. 흡입, 섭취하거나피부또는눈에접촉할경우인체에상해를입을수있습니다. 보안경, 장갑, 실험실가운등의보호장비를착용하십시오. 사용한시약은화학폐기물로취급하고현지정부안전표준에따라폐기하시기바랍니다. 환경, 건강및안전정보는 support.illumina.com/sds.html 에서본키트에관한 SDS 를참조하십시오. 20 문서번호 v02 KOR

27 플로우셀준비 1 2 ~8 의보관소에서새플로우셀패키지를꺼냅니다. 2 포장을벗긴플로우셀패키지를실온에서 30 분간따로둡니다. 참고알루미늄포장을그대로둘경우플로우셀은최대 12 시간동안실온상태를유지할수있습니다. 플로우셀을반복적으로얼렸다녹이지마십시오. 3 알루미늄포장에서플로우셀을꺼냅니다. 플로우셀준비 그림 10 알루미늄포장에서꺼내기 4 투명한개폐형플라스틱포장을열고플로우셀을꺼냅니다. 그림 11 개폐형포장에서꺼내기 5 보풀없는알코올천으로플로우셀의유리표면을깨끗하게닦습니다. 보풀없는실험실용티슈로유리의물기를제거합니다. NextSeq 550 시스템안내서 21

28 시퀀싱 시퀀싱용라이브러리준비 라이브러리용량과장착농도는실행중인 NCS 버전에따라달라집니다. 제어소프트웨어버전라이브러리용량라이브러리농도 NCS v1.3 이상 1.3ml 1.8pM NCS v1.2 이하 3ml 3pM 라이브러리 Denaturation 및희석 라이브러리를장착용량 1.3ml 와장착농도 1.8pM 으로 Denaturation 및희석합니다. 실제로, 장착농도는라이브러리준비및정량화방법에따라다를수있습니다. 지침은 NextSeq 시스템 Denaturation 및희석라이브러리안내서 ( 문서번호 ) 를참조하십시오. 시약카트리지에라이브러리장착 1 보풀이적게이는티슈를사용하여 Load Library Here( 여기에라이브러리장착 ) 라는라벨이붙은 10 번저장소의알루미늄포장지를깨끗하게닦습니다. 2 깨끗한 1ml 피펫팁으로포장지에구멍을뚫습니다. 3 준비된 1.8pM 라이브러리 1.3ml 를 Load Library Here( 여기에라이브러리장착 ) 라는라벨이붙은 10 번저장소에장착합니다. 라이브러리를공급할때알루미늄포장지를건드리지않도록하십시오. 그림 12 라이브러리장착 22 문서번호 v02 KOR

29 시퀀싱실행설정 1 Home( 홈 ) 화면에서 Experiment( 실험 ) 를선택한다음 Sequence( 시퀀스 ) 를선택합니다. Sequence( 시퀀스 ) 명령을선택하면이미지생성부분도어가열리고, 이전실행의소모품이해제되며, 일련의 Run Setup( 실행설정 ) 화면이열립니다. 잠시지연되는것은정상적인동작입니다. 기기가 BaseSpace 용으로구성된경우 BaseSpace 에로그인하라는메시지가표시됩니다. 기기가독립실행형모드용으로구성된경우다음단계는플로우셀을장착하는것입니다. BaseSpace 에로그인 1 BaseSpace 사용자이름및암호를입력합니다. 2 Next( 다음 ) 를선택합니다. 시퀀싱실행설정 플로우셀장착 1 이전실행에서사용한플로우셀을제거합니다. 2 플로우셀을배열핀위에배열하고플로우셀을대에놓습니다. 그림 13 플로우셀장착 3 Load( 장착 ) 를선택합니다. 도어가자동으로닫힌다음플로우셀 ID 가화면에표시되고센서가작동됩니다. 4 Next( 다음 ) 를선택합니다. 폐시약용기비우기 1 폐시약용기를제거하고해당표준에따라내용물을폐기합니다. NextSeq 550 시스템안내서 23

30 시퀀싱 그림 14 폐시약용기제거 참고용기를제거할때에는다른한손으로아래쪽을받쳐줍니다. 경고이시약에는생식계에영향을미칠수있는독성지방족아마이드인포름아마이드가들어있습니다. 흡입, 섭취하거나피부또는눈에접촉할경우인체에상해를입을수있습니다. 보안경, 장갑, 실험실가운등의보호장비를착용하십시오. 사용한시약은화학폐기물로취급하고현지정부안전표준에따라폐기하시기바랍니다. 환경, 건강및안전정보는 support.illumina.com/sds.html 에서본키트에관한 SDS 를참조하십시오. 2 빈폐시약용기를완충제부분에멈출때까지밀어넣습니다. 딸깍소리가나면용기가제대로장착된것입니다. 그림 15 비어있는폐시약용기장착 완충제카트리지장착 1 위쪽부분에서사용된완충제카트리지를제거합니다. 2 새완충제카트리지를완충제부분에멈출때까지밀어넣습니다. 딸깍소리가들리면카트리지가제자리에장착된것이며, 완충제카트리지 ID 가화면에표시되고센서가작동됩니다. 24 문서번호 v02 KOR

31 그림 16 완충제카트리지장착 시퀀싱실행설정 3 완충제부분도어를닫고 Next( 다음 ) 를선택합니다. 시약카트리지장착 1 시약부분에서사용한시약카트리지를제거합니다. 해당표준에따라사용하지않은내용물을폐기합니다. 경고이시약에는생식계에영향을미칠수있는독성지방족아마이드인포름아마이드가들어있습니다. 흡입, 섭취하거나피부또는눈에접촉할경우인체에상해를입을수있습니다. 보안경, 장갑, 실험실가운등의보호장비를착용하십시오. 사용한시약은화학폐기물로취급하고현지정부안전표준에따라폐기하시기바랍니다. 환경, 건강및안전정보는 support.illumina.com/sds.html 에서본키트에관한 SDS 를참조하십시오. 참고사용되지않은시약을안전하게폐기할수있도록위치 6 번의저장소를꺼낼수있습니다. 자세한내용은 25 페이지의위치 6 번에서사용한저장소제거를참조하십시오. 2 시약카트리지를시약부분에끝까지밀어넣은다음시약부분도어를닫습니다. 그림 17 시약카트리지장착 3 Load( 장착 ) 를선택합니다. 카트리지가제자리로자동이동 ( 최대 30 초 ) 하며시약카트리지 ID 가화면에표시되고센서가작동됩니다. 4 Next( 다음 ) 를선택합니다. 위치 6 번에서사용한저장소제거 1 사용한시약카트리지를기기에서꺼낸다음, 위치 6 번옆의슬롯을덮고있는보호용고무커버를제거합니다. NextSeq 550 시스템안내서 25

32 시퀀싱 그림 18 제거가능한위치 6 번 A B 보호용고무커버위치 6번 2 투명한플라스틱탭을누른다음왼쪽으로밀어저장소를꺼냅니다. 3 해당표준에따라저장소를폐기합니다. 실행매개변수지정 Run Setup( 실행설정 ) 화면의단계는다음과같은시스템구성에따라달라집니다. } BaseSpace or BaseSpace Onsite(BaseSpace 또는 BaseSpace Onsite) Run Setup( 실행설정 ) 화면에 BaseSpace Prep(BaseSpace 준비 ) 탭을사용하여설정한실행이열거됩니다. 의도된실행이 Run Setup( 실행설정 ) 화면에표시되지않으면해당실행이 BaseSpace 에서시퀀스용으로표시되었는지확인합니다. } Standalone( 독립실행형 ) Run Setup( 실행설정 ) 화면에실행매개변수를정의하는필드가포함됩니다. 사용가능한실행선택 (BaseSpace 구성 ) 1 사용가능한실행목록에서실행이름을선택합니다. 위쪽 / 아래쪽화살표를사용하여목록을스크롤하거나 Search( 검색 ) 필드에실행이름을입력합니다. 2 Next( 다음 ) 를선택합니다. 3 실행매개변수를확인합니다. } Run Name( 실행이름 ) BaseSpace 에서할당된실행이름입니다. } Library ID( 라이브러리 ID) BaseSpace 에서할당된라이브러리풀의이름입니다. } Recipe( 레시피 ) 레시피이름입니다 ( 실행에사용된시약카트리지에따라 NextSeq High 또는 NextSeq Mid). } Read Type( 리드유형 ) Single Read( 단일리드 ) 또는 Paired End( 페어드엔드 ) 입니다. } Read Length( 리드길이 ) 각리드의주기수입니다. } [ 선택사항 ] Custom Primers(Custom 프라이머, 해당되는경우 ) 4 [ 선택사항 ] 실행매개변수를변경하려면 Edit( 편집 ) 아이콘을선택합니다. 작업을마치면 Save ( 저장 ) 를선택합니다. } Run parameters( 실행매개변수 ) 리드수또는리드당주기수를변경합니다. } Custom primers(custom 프라이머 ) Custom 프라이머에대한설정을변경합니다. 자세한내용은 NextSeq Custom 프라이머안내서 ( 문서번호 ) 를참조하십시오. } Purge consumables for this run( 이실행에대한소모품제거 ) 현재실행후에소모품을자동으로제거하려면이설정을변경합니다. 5 Next( 다음 ) 를선택합니다. 26 문서번호 v02 KOR

33 실행매개변수입력 ( 독립실행형구성 ) 1 원하는실행이름을입력합니다. 2 [ 선택사항 ] 원하는라이브러리 ID 를입력합니다. 3 Recipe( 레시피 ) 드롭다운목록에서레시피를선택합니다. 호환되는레시피만표시됩니다. 4 리드유형 (Single Read( 단일리드 ) 또는 Paired End( 페어드엔드 )) 을선택합니다. 5 시퀀싱실행에서각리드의주기수를입력합니다. } Read 1( 리드 1) 최대 151 주기값을입력합니다. } Read 2( 리드 2) 최대 151 주기값을입력합니다. 이값은일반적으로리드 1 과같은주기수입니다. } Index 1( 인덱스 1) 인덱스 1(i7) 프라이머에필요한주기수를입력합니다. } Index 2( 인덱스 2) 인덱스 2(i5) 프라이머에필요한주기수를입력합니다. 제어소프트웨어는다음과같은조건을사용하여입력사항을확인합니다. } 총주기수가허용되는최대주기를초과하지않음 } 리드 1 주기수가템플레이트생성에사용되는 5 주기보다큼 } 인덱스리드주기수가리드 1 과리드 2 주기수를초과하지않음 6 [ 선택사항 ] Custom 프라이머를사용하는경우사용된프라이머에대한체크박스를선택합니다. 자세한내용은 NextSeq Custom 프라이머안내서 ( 문서번호 ) 를참조하십시오. } Read 1( 리드 1) 리드 1 의 Custom 프라이머 } Read 2( 리드 2) 리드 2 의 Custom 프라이머 } Index 1( 인덱스 1) 인덱스 1 의 Custom 프라이머 } Index 2( 인덱스 2) 인덱스 2 의 Custom 프라이머 시퀀싱실행설정 자동검사검토 7 [ 선택사항 ] 실행매개변수를변경하려면 Edit( 편집 ) 아이콘을선택합니다. 작업을마치면 Save ( 저장 ) 를선택합니다. } Output folder location( 아웃풋폴더위치 ) 현재실행의아웃풋폴더위치를변경합니다. Browse( 찾아보기 ) 를선택하여네트워크위치를지정합니다. } Purge consumables for this run( 이실행에대한소모품제거 ) 현재실행후에소모품을자동으로제거하려면이설정을변경합니다. } Use run monitoring for this run( 이실행에대해실행모니터링사용 ) BaseSpace 에서실행모니터링을사용하려면이설정을변경합니다. 8 Next( 다음 ) 를선택합니다. 소프트웨어에서시스템을자동으로검사합니다. 검사도중화면에다음과같은표시기가나타납니다. } 회색확인표시 검사가아직수행되지않았습니다. } 진행률아이콘 검사가진행중입니다. } 녹색확인표시 검사를통과했습니다. } 빨간색 X 검사를통과하지못했습니다. 검사를통과하지못한모든항목에대한조치를취해야계속진행할수있습니다. 53 페이지의자동검사오류해결을참조하십시오. 진행중인자동검사를중지하려면오른쪽하단모서리에있는 작하려면다. 아이콘을선택합니다. 검사를다시시 아이콘을선택합니다. 검사가처음으로미완료되었거나실패하면검사가다시시작됩니 범주내의각개별검사결과를확인하려면아이콘을선택하여범주를확대합니다. NextSeq 550 시스템안내서 27

34 시퀀싱 실행시작 자동검사가완료되면 Start( 시작 ) 를선택합니다. 시퀀싱실행이시작됩니다. 검사가성공적으로완료된후에실행이자동으로시작되도록시스템을구성하려면 14 페이지의실행설정옵션지정을참조하십시오. 28 문서번호 v02 KOR

35 실행진행률모니터링 1 메트릭이화면에표시되면실행진행률, 인텐시티및 quality score를모니터링합니다. 그림 19 시퀀싱실행진행률및메트릭 실행진행률모니터링 A Run progress( 실행진행률 ) 현재단계와각리드에대해완료된주기수를표시합니다. 진행률표시줄은각단계의실행률에비례하지않습니다. 오른쪽상단모서리의남은시간을통해실제시간을확인할수있습니다. B Q-Score(Q-점수 ) quality score(q-점수 ) 분포를표시합니다. 72페이지의 quality score 평가를참조하십시오. C Intensity( 인텐시티 ) 90 번째백분위수로각타일의클러스터인텐시티값이표시됩니다. 그래프색상은각염기를나타냅니다. 즉 A는빨간색, C는녹색, G는파란색, T는검은색입니다. 색상은 SAV( 시퀀싱분석소프트웨어 ) 에서사용되는염기표시기와일치합니다. D Cluster Density( 클러스터밀도 )(K/mm²) 실행에서감지된클러스터수를나타냅니다. E Clusters Passing Filter( 필터통과클러스터 )(%) 필터를통과한클러스터의백분율을표시합니다. 72페이지의필터통과클러스터를참조하십시오. F Estimated Yield( 추정수율 )(Gb) 실행에대한예상염기수를표시합니다. G Flow cell image( 플로우셀이미지 ) 각레인쌍의현재프로세스를표시합니다. 다른레인쌍이화학반응단계에있을때레인쌍하나의이미지가생성됩니다. 참고 Home( 홈 ) 을선택한후에는실행메트릭을보기위해돌아갈수없습니다. 그러나 BaseSpace 에서실행메트릭에액세스하거나, 독립실행형컴퓨터에서 SAV( 시퀀싱분석뷰어 ) 를사용하여실행메트릭을볼수는있습니다. 실행메트릭주기 실행중여러시점에실행메트릭이표시됩니다. } 클러스터생성단계에서는어떤메트릭도나타나지않습니다. } 처음 5 주기는템플레이트생성용으로예약됩니다. } 25 주기후에클러스터밀도, 필터통과클러스터, 수율및 quality score 등의실행메트릭이표시됩니다. NextSeq 550 시스템안내서 29

36 시퀀싱 데이터전송 선택한분석구성에따라데이터전송상태를나타내는아이콘이실행중에화면에표시됩니다. 상태 연결됨 Illumina BaseSpace BaseSpace Onsite 독립실행형기기 연결되었으며데이터를전송하는중 연결끊김 시퀀싱분석뷰어 실행중에데이터전송이중단된경우데이터가기기컴퓨터에일시적으로저장됩니다. 연결이복원되면데이터전송이자동으로다시시작됩니다. 실행이끝날때까지연결이복원되지않은경우에는후속실행을시작하기전에기기컴퓨터에서데이터를수동으로제거하십시오. 복사실행서비스 NextSeq System Software Suite 에는복사실행서비스가포함되어있습니다. RTA v2 가이서비스에원본위치의파일을대상위치로복사하도록요청하면서비스에서수신한순서대로복사요청을처리합니다. 예외가발생하면복사큐의파일수에따라파일복사가요청됩니다. 시퀀싱분석뷰어소프트웨어는실행중에생성되는시퀀싱메트릭을표시합니다. 메트릭은 RTA 에서생성된후 InterOp 파일에기록되는데이터를기반으로도면, 그래프및표형식으로표시됩니다. 실행이진행되면메트릭이업데이트됩니다. 실행중에언제든지 Refresh( 새로고침 ) 를선택하여업데이트된메트릭을확인할수있습니다. 자세한내용은 SAV( 시퀀싱분석뷰어 ) 사용자안내서 ( 파트번호 ) 를참조하십시오. 시퀀싱분석뷰어는기기컴퓨터에설치된소프트웨어에포함되어있습니다. 기기와동일한네트워크에연결된또다른컴퓨터에시퀀싱분석뷰어를설치하여원격으로실행메트릭을모니터링할수도있습니다. 30 문서번호 v02 KOR

37 자동실행후세척 세척이후 시퀀싱실행이완료되면소프트웨어가완충제카트리지에제공된세척액과시약카트리지에제공된 NaOCl 을사용하여자동실행후세척을시작합니다. 자동실행후세척은약 90 분이소요됩니다. 세척이완료되면 Home( 홈 ) 버튼이활성화됩니다. 시퀀싱결과는세척하는동안화면에계속표시됩니다. 세척이후에는 sipper 를아래쪽위치에그대로둬시스템에공기가유입되지않도록합니다. 다음실행을수행할때까지카트리지를제자리에둡니다. 자동실행후세척 NextSeq 550 시스템안내서 31

38 32 문서번호 v02 KOR

39 4 장스캐닝스캐닝 4 장 소개 34 스캔작업흐름 35 DMAP 폴더다운로드 36 어댑터에 BeadChip 장착 37 스캔설정 38 스캔진행률모니터링 40 NextSeq 550 시스템안내서 33

40 스캐닝 소개 NextSeq 550 에서스캔을수행하려면다음과같은실행컴포넌트가필요합니다. } 혼성화및염색된 BeadChip } 재사용가능한 BeadChip 어댑터 } 사용중인 BeadChip 용 DMAP( 디코드맵 ) 파일 } 사용중인 BeadChip 용매니페스트파일 } 사용중인 BeadChip 용클러스터파일 스캔중에아웃풋파일이생성되면지정된아웃풋폴더로전송되도록큐에대기됩니다. BlueFuse Multi 소프트웨어를사용해분석을수행합니다. 분석을수행하려면 GTC(genotype calls) 파일형식의사용가능한스캔데이터가필요합니다. 기본값으로 NextSeq 550 은정규화된데이터및관련 genotype calls 를 GTC 파일의형식으로생성합니다. 원하는경우추가인텐시티데이터 (IDAT) 파일을생성하도록기기를구성할수있습니다. 자세한내용은 65 페이지의 BeadChip 스캔구성을참조하십시오. Decode File Client DMAP 폴더에는 BeadChip 에서비드위치를식별하고각비드와연관된신호를정량화하는정보가포함되어있습니다. DMAP 폴더는각 BeadChip 바코드에대해고유합니다. Decode File Client 유틸리티를사용하면표준 HTTP 프로토콜을이용해 Illumina 서버에서 DMAP 폴더를직접다운로드할수있습니다. Decode File Client 에액세스하려면 Illumina 웹사이트의 Decode File Client 지원페이지 (support.illumina.com/array/array_software/decode_file_client/downloads.html) 로이동하십시오. DMAP 폴더의네트워크위치에액세스할수있는컴퓨터에 Decode File Client 를설치합니다. 자세한내용은 36 페이지의 DMAP 폴더다운로드를참조하십시오. 매니페스트파일및클러스터파일 각 BeadChip 에서소프트웨어가매니페스트파일과클러스터파일에액세스할수있어야합니다. 각매니페스트파일과클러스터파일은 BeadChip 유형에고유합니다. 파일이름에 NS550 이포함된클러스트파일을사용해야합니다. 이러한파일은 NextSeq 시스템과호환됩니다. } 매니페스트파일 매니페스트파일은 BeadChip 의 SNP 또는프로브내용을설명합니다. 매니페스트파일은 *.bpm 파일형식을사용합니다. } 클러스터파일 클러스터파일은 Illumina 유전자형배열의클러스터위치를설명하며, genotype calls 를만들기위해데이터를분석할때사용됩니다. 클러스터파일은 *.egt 파일형식을사용합니다. 파일의위치는 BeadChip Scan Configuration(BeadChip 스캔구성 ) 화면에서지정합니다. NCS Home( 홈 ) 화면에서 Manage Instrument( 기기관리 ), System Configuration( 시스템구성 ) 을선택한다음, BeadChip Scan Configuration(BeadChip 스캔구성 ) 을선택합니다. NextSeq 550 기기가설치된경우 Illumina 담당자가이러한파일을다운로드하고제어소프트웨어에서해당경로를지정합니다. 손실되었거나새버전을사용할수있는경우를제외하고는이러한파일을변경할필요가없습니다. 자세한내용은 59 페이지의매니페스트파일및클러스터파일교체를참조하십시오. 34 문서번호 v02 KOR

41 스캔작업흐름 DMAP 정보를다운로드한후지정된 DMAP 폴더위치에저장합니다. BeadChip 을 BeadChip 어댑터에장착합니다. 스캔작업흐름 BeadChip 어댑터를기기에장착합니다. 스캔매개변수인 DMAP 폴더위치와아웃풋위치를지정합니다. 자동검사결과를검토합니다. Start( 시작 ) 를선택합니다. 제어소프트웨어인터페이스에서스캔을모니터링합니다. NextSeq 550 시스템안내서 35

42 스캐닝 DMAP 폴더다운로드 Decode File Client 를사용하여계정별로또는 BeadChip( 기본값보기 ) 별로 DMAP 폴더에액세스할수있습니다. 계정별 DMAP 폴더액세스 1 Decode File Client 의메인탭에서다운로드옵션을선택합니다. } AutoPilot } 아직다운로드하지않은모든 BeadChip } 모든 BeadChip } 구매주문별 BeadChip } 바코드별 BeadChip 2 필요한정보를입력합니다. 3 다운로드할 DMAP 폴더를찾습니다. 4 다운로드대상위치에여유공간이충분히있는지확인합니다. 5 다운로드를시작합니다. Download Status and Log( 다운로드상태및로그 ) 탭에서다운로드상태를확인합니다. 6 DMAP 폴더를지정된 DMAP 폴더위치에저장합니다. BeadChip 별 DMAP 폴더액세스 1 다음과같은옵션중두가지를사용하여 BeadChip 을식별합니다. } BeadChip 바코드 } BeadChips 박스 ID } 구매주문번호 } 판매주문번호 2 다운로드할 DMAP 폴더를찾습니다. 3 다운로드대상위치에여유공간이충분히있는지확인합니다. 4 다운로드를시작합니다. Download Status and Log( 다운로드상태및로그 ) 탭에서다운로드상태를확인합니다. 5 DMAP 폴더를지정된 DMAP 폴더위치에저장합니다. 36 문서번호 v02 KOR

43 어댑터에 BeadChip 장착 1 어댑터고정클립을누릅니다. 클립이뒤로약간기울어지면서열립니다. 2 BeadChip 가장자리를잡은상태에서바코드가고정클립근처에오도록 BeadChip 을놓고어댑터의오목한선반에장착합니다. 그림 20 어댑터에 BeadChip 장착 어댑터에 BeadChip 장착 3 BeadChip 양쪽의구멍을이용해 BeadChip 이어댑터의오목한선반에장착되었는지확인합니다. 그림 21 BeadChip 장착및고정 4 고정클립을살짝풀어서 BeadChip 을고정합니다. 5 옆에서 BeadChip 을보고 BeadChip 이어댑터에평평하게놓였는지검사합니다. 필요한경우 BeadChip 을재배치합니다. 그림 22 BeadChip 위치검사 A 올바른위치 클립을풀었을때 BeadChip 이어댑터에평평하게놓여있습니다. B 잘못된위치 클립을풀었을때 BeadChip 이평평하게놓여있지않습니다. NextSeq 550 시스템안내서 37

44 스캐닝 스캔설정 1 Home( 홈 ) 화면에서 Experiment( 실험 ) 를선택한다음, Scan( 스캔 ) 을선택합니다. Scan( 스캔 ) 명령을선택하면이미지생성부분도어가열리고, 이전실행 ( 있는경우 ) 의소모품이해제되며, 일련의 Scan Setup( 스캔설정 ) 화면이열립니다. 잠시지연되는것은정상적인동작입니다. 시퀀싱소모품분리 스캔을설정할때사용된시퀀싱소모품이있는경우다음단계를진행하기전에시약카트리지와완충제카트리지를분리하라는메시지가표시됩니다. 1 메시지가표시되면사용된시퀀싱소모품을이전시퀀싱실행에서제거합니다. a 시약부분에서시약카트리지를제거합니다. 해당표준에따라사용하지않은내용물을폐기합니다. b 완충제부분에서사용된완충제카트리지를제거합니다. 경고이시약에는생식계에영향을미칠수있는독성지방족아마이드인포름아마이드가들어있습니다. 흡입, 섭취하거나피부또는눈에접촉할경우인체에상해를입을수있습니다. 보안경, 장갑, 실험실가운등의보호장비를착용하십시오. 사용한시약은화학폐기물로취급하고현지정부안전표준에따라폐기하시기바랍니다. 환경, 건강및안전정보는 support.illumina.com/sds.html 에서본키트에관한 SDS 를참조하십시오. 2 시약부분과완충제부분도어를닫습니다. BeadChip 어댑터장착 1 배열핀을사용하여 BeadChip 어댑터를대에배치합니다. 그림 23 BeadChip 어댑터장착 2 Load( 장착 ) 를선택합니다. 도어가자동으로닫힌다음 BeadChip ID 가화면에표시되고센서가작동됩니다. 잠시지연되는것은정상적인동작입니다. BeadChip 바코드를읽을수없는경우바코드를직접입력할수있는대화상자가표시됩니다. 58 페이지의소프트웨어가 BeadChip 바코드를읽을수없음을참조하십시오. 3 Next( 다음 ) 를선택합니다. 38 문서번호 v02 KOR

45 스캔설정 1 Scan Setup( 스캔설정 ) 화면에서다음과같은정보를확인합니다. } 바코드 BeadChip 이장착되면소프트웨어가 BeadChip 바코드를읽습니다. 바코드를수동으로입력한경우추가로변경할수있도록 Edit( 편집 ) 버튼이나타납니다. } 유형 BeadChip 유형필드는 BeadChip 바코드에따라자동으로채워집니다. } DMAP 위치 DMAP 폴더위치는 BeadChip Scan Configuration(BeadChip 스캔구성 ) 화면에서지정됩니다. 현재스캔위치만변경하려면 Browse( 찾아보기 ) 를선택하고올바른위치를지정합니다. } 아웃풋위치 아웃풋위치는 BeadChip Scan Configuration(BeadChip 스캔구성 ) 화면에서지정됩니다. 현재스캔위치만변경하려면 Browse( 찾아보기 ) 를선택하고원하는위치를지정합니다. 2 Next( 다음 ) 를선택합니다. 스캔설정 자동검사검토 스캔시작 소프트웨어에서시스템을자동으로검사합니다. 검사도중화면에다음과같은표시기가나타납니다. } 회색확인표시 검사가아직수행되지않았습니다. } 진행률아이콘 검사가진행중입니다. } 녹색확인표시 검사를통과했습니다. } 빨간색 X 검사를통과하지못했습니다. 검사를통과하지못한모든항목에대한조치를취해야계속진행할수있습니다. 53 페이지의자동검사오류해결을참조하십시오. 진행중인자동검사를중지하려면오른쪽하단모서리에있는 작하려면다. 아이콘을선택합니다. 검사를다시시 아이콘을선택합니다. 검사가처음으로미완료되었거나실패하면검사가다시시작됩니 범주내의각개별검사결과를확인하려면아이콘을선택하여범주를확대합니다. 자동검사가완료되면 Start( 시작 ) 를선택합니다. 스캔이시작됩니다. 검사가성공적으로완료된후에스캔이자동으로시작되도록시스템을구성하려면 14 페이지의실행설정옵션지정을참조하십시오. NextSeq 550 시스템안내서 39

46 스캐닝 스캔진행률모니터링 1 BeadChip 이미지를사용하여스캔진행률을모니터링합니다. 이미지의각색상은스캐닝상태를나타냅니다. } 밝은회색 스캔되지않음 } 어두운회색 스캔되었으나등록되지않음 } 녹색 성공적으로스캔및등록됨 } 빨간색 스캔및등록에실패함등록에실패한경우실패한섹션이포함된샘플을다시스캔할수있습니다. 58 페이지의 BeadChip 스캔실패를참조하십시오. 2 BeadChip 이미지를선택하면선택한샘플의전체보기와상세보기사이를전환할수있습니다. } 전체보기는 BeadChip 의샘플과각샘플내의섹션을보여줍니다. } 상세보기는선택한샘플내의각섹션을보여줍니다. 그림 24 BeadChip 이미지 : 전체보기및상세보기 참고스캔종료는최종명령입니다. 스캔이완료되기전에스캔을종료하면스캔데이터가저장되지않습니다. 데이터전송 스캔이완료되면데이터가스캐닝아웃풋폴더로전송되도록큐에대기됩니다. 데이터가기기컴퓨터에임시로기록됩니다. 후속스캔이시작되면임시폴더가기기컴퓨터에서자동으로삭제됩니다. 데이터전송에필요한시간은사용자의네트워크연결에따라다릅니다. 후속스캔을시작하기전에데이터가아웃풋폴더에기록되었는지확인합니다. 이를확인하려면 GTC 파일이바코드폴더에있는지확인합니다. 자세한내용은 80 페이지의스캐닝아웃풋폴더구조를참조하십시오. 연결이중단된경우연결이복원되면데이터전송이자동으로다시시작됩니다. 각파일에는데이터가아웃풋폴더로전송되도록큐에대기된지 1 시간후에만료되는타이머가있습니다. 타이머가만료되거나전송이완료되기전에기기가재부팅되면데이터가아웃풋폴더에기록되지않습니다. 40 문서번호 v02 KOR

47 5 장관리관리 5 장 소개 42 수동세척수행 43 소프트웨어업데이트 46 기기종료 48 NextSeq 550 시스템안내서 41

48 관리 소개 예방관리 관리절차에는수동기기세척과시스템소프트웨어업데이트 ( 해당하는경우 ) 가포함됩니다. } 기기세척 시퀀싱실행후에항상자동실행후세척을수행하면기기성능이유지됩니다. 그러나특정조건에서는정기적으로수동세척을수행해야합니다. 43 페이지의수동세척수행을참조하십시오. } 소프트웨어업데이트 업데이트된시스템소프트웨어버전을사용할수있는경우 BaseSpace 에연결하여자동으로업데이트를설치하거나, Illumina 웹사이트에서설치프로그램을다운로드한후수동으로업데이트를설치할수있습니다. 46 페이지의소프트웨어업데이트를참조하십시오. Illumina 에서는매년예방관리서비스를예약할것을권장합니다. 서비스계약기간이지난경우해당지역계정관리자나 Illumina 기술지원부서에연락해유료예방관리서비스를요청하십시오. 42 문서번호 v02 KOR

49 수동세척수행 수동세척은 Home( 홈 ) 화면에서시작합니다. Wash( 세척 ) 옵션에는 Quick Wash( 빠른세척 ) 와 Manual Post-Run Wash( 수동실행후세척 ) 이있습니다. 세척유형 빠른세척 시간 : 20 분 설명 일반실험실용순수와트윈 20 을혼합한사용자공급세척액 ( 완충제세척카트리지 ) 으로시스템을세척합니다. 시약카트리지와완충제카트리지가장착된상태에서기기가유휴상태인경우 14 일마다세척을수행해야합니다. 기기가건조된상태인경우 7 일마다세척을수행해야합니다 ( 시약카트리지와완충제카트리지가제거된경우 ). 종료한후에세척을수행해야합니다. 수동세척수행 수동실행후세척 시간 : 90 분 일반실험실용순수와트윈 20 을혼합한사용자공급세척액 ( 완충제세척카트리지 ) 과 0.12% 차아염소산나트륨 ( 시약세척카트리지 ) 으로시스템을세척합니다. 자동실행후세척이수행되지않는경우세척을수행해야합니다. 수동세척을수행하려면기기와함께제공된시약세척카트리지및완충제세척카트리지와사용한플로우셀이필요합니다. 사용한플로우셀은기기세척에최대 20 번사용할수있습니다. 그림 25 시약세척카트리지와완충제세척카트리지 수동실행후세척준비 사용자공급소모품 용량및설명 NaOCl 1ml(0.12% 로희석 ) 시약세척카트리지에장착 ( 위치 28 번 ) 100% 트윈 20 일반실험실용순수 125ml 의 0.05% 트윈 20 세척액을만드는데사용완충제세척카트리지에장착 ( 가운데저장소 ) 참고항상 24 시간이내에준비된새 NaOCl 희석액을사용하십시오. 용량이 1ml 보다많은경우다음 24 시간이내에사용하려면남은희석액을 2 ~8 로보관하고, 그렇지않으면남은 NaOCl 희석액을폐기합니다. 1 미량원심분리기튜브에다음과같은용량을섞어 1ml 의 0.12% NaOCl 을만듭니다. } 5% NaOCl(24µl) } 일반실험실용순수 (976µl) NextSeq 550 시스템안내서 43

50 관리 2 튜브를뒤집어용액을혼합합니다. 3 1ml 의 0.12% NaOCl 을시약세척카트리지에추가합니다. 올바른저장소는사전충전카트리지의위치 28 번에해당합니다. 그림 26 NaOCl 장착 빠른세척준비 4 다음과같은용량을섞어 0.05% 의트윈 20 세척액을만듭니다. } 100% 트윈 20(62µl) } 일반실험실용순수 (125ml) 5 완충제세척카트리지의가운데저장소에세척액 125ml 를추가합니다. 6 Perform Wash( 세척수행 ) 를선택한다음, Manual Post-Run Wash( 수동실행후세척 ) 를선택합니다. 사용자공급소모품 100% 트윈 20 일반실험실용순수 용량및설명 40ml 의 0.05% 트윈 20 세척액을만드는데사용완충제세척카트리지에장착 ( 가운데저장소 ) 1 다음과같은용량을섞어 0.05% 의트윈 20 세척액을만듭니다. } 100% 트윈 20(20µl) } 일반실험실용순수 (40ml) 2 완충제세척카트리지의가운데저장소에세척액 40ml 를추가합니다. 3 Perform Wash( 세척수행 ) 를선택한다음 Quick Wash( 빠른세척 ) 를선택합니다. 사용한플로우셀및세척카트리지장착 1 사용한플로우셀이없는경우사용한플로우셀을장착합니다. Load( 장착 ) 를선택하고 Next( 다음 ) 를선택합니다. 2 폐시약용기를제거하고해당표준에따라내용물을폐기합니다. 경고이시약에는생식계에영향을미칠수있는독성지방족아마이드인포름아마이드가들어있습니다. 흡입, 섭취하거나피부또는눈에접촉할경우인체에상해를입을수있습니다. 보안경, 장갑, 실험실가운등의보호장비를착용하십시오. 사용한시약은화학폐기물로취급하고현지정부안전표준에따라폐기하시기바랍니다. 환경, 건강및안전정보는 support.illumina.com/sds.html 에서본키트에관한 SDS 를참조하십시오. 3 빈폐시약용기를완충제부분에멈출때까지밀어넣습니다. 4 이전실행에서사용한완충제카트리지가있으면제거합니다. 44 문서번호 v02 KOR

51 세척시작 5 세척액이포함된완충제세척카트리지를장착합니다. 6 이전실행에서사용한시약카트리지가있으면제거합니다. 7 시약세척카트리지를장착합니다. 8 Next( 다음 ) 를선택합니다. 세척전검사가자동으로시작됩니다. 1 Start( 시작 ) 를선택합니다. 2 세척이완료되면 Home( 홈 ) 을선택합니다. 수동세척수행 세척이후 세척이후에는 sipper 를아래쪽위치에그대로둬시스템에공기가유입되지않도록합니다. 다음실행을수행할때까지카트리지를제자리에둡니다. NextSeq 550 시스템안내서 45

52 관리 소프트웨어업데이트 소프트웨어업데이트는 System Suite 라고하는소프트웨어번들에패키징되어있는데, 여기에포함된소프트웨어는다음과같습니다. } NCS(NextSeq 제어소프트웨어 ) } NextSeq 레시피 } RTA v2 } NSS(NextSeq 서비스소프트웨어 ) } SAV( 시퀀싱분석뷰어 ) } BaseSpace Broker 인터넷에연결하여자동으로, 또는네트워크나 USB 위치에서수동으로소프트웨어를업데이트할수있습니다. } Automatic updates( 자동업데이트 ) 기기가인터넷에액세스된네트워크에연결되어있으면업 데이트를사용할수있을때 Home( 홈 ) 화면의 Manage Instrument( 기기관리 ) 버튼에경보아이콘이나타납니다. } Manual updates( 수동업데이트 ) Illumina 웹사이트의 NextSeq 550 지원페이지에서 System Suite 설치프로그램을다운로드합니다. 자동소프트웨어업데이트 1 Manage Instrument( 기기관리 ) 를선택합니다. 2 Software Update( 소프트웨어업데이트 ) 를선택합니다. 3 Install the update already downloaded from BaseSpace(BaseSpace 에서이미다운로드한업데이트설치 ) 를선택합니다. 4 Update( 업데이트 ) 를선택하여업데이트를시작합니다. 명령을확인하는대화상자가열립니다. 5 다음과같은설치마법사의메시지를따릅니다. a 라이선스계약에동의합니다. b 릴리스정보를검토합니다. c 업데이트에포함된소프트웨어목록을검토합니다. 업데이트가완료되면제어소프트웨어가자동으로다시시작됩니다. 참고펌웨어업데이트가포함된경우에는펌웨어가업데이트된후시스템을자동으로다시시작해야합니다. 수동소프트웨어업데이트 1 Illumina 웹사이트에서 System Suite 설치프로그램을다운로드하여네트워크위치에저장합니다. 또는소프트웨어설치파일을휴대용 USB 드라이브에복사합니다. 2 Manage Instrument( 기기관리 ) 를선택합니다. 3 Software Update( 소프트웨어업데이트 ) 를선택합니다. 4 Manually install the update from the following location( 다음위치에서수동으로업데이트설치 ) 을선택합니다. 5 Browse( 찾아보기 ) 를선택하여소프트웨어설치파일의위치를지정한다음, Update( 업데이트 ) 를선택합니다. 46 문서번호 v02 KOR

53 6 다음과같은설치마법사의메시지를따릅니다. a 라이선스계약에동의합니다. b 릴리스정보를검토합니다. c 업데이트에포함된소프트웨어목록을검토합니다. 업데이트가완료되면제어소프트웨어가자동으로다시시작됩니다. 참고펌웨어업데이트가포함된경우에는펌웨어가업데이트된후시스템을자동으로다시시작해야합니다. 소프트웨어업데이트 NextSeq 550 시스템안내서 47

54 관리 기기종료 1 Manage Instrument( 기기관리 ) 를선택합니다. 2 System Power Options( 시스템전원옵션 ) 를선택합니다. 3 Shut Down( 종료 ) 을선택합니다. Shut Down( 종료 ) 명령을선택하면안전하게소프트웨어가종료되고기기의전원이꺼집니다. 60 초이상기다렸다가기기를다시켭니다. 주의기기를재배치하지마십시오. 기기를잘못이동하면광학배열에영향을미치며데이터무결성이손상될수있습니다. 기기를다시배치해야할경우 Illumina 담당자에게문의하십시오. 48 문서번호 v02 KOR

55 부록 A 문제해결문제해결 부록 A 소개 50 문제해결파일 51 자동검사오류해결 53 폐시약용기가가득참 55 재혼성화작업흐름 56 BeadChip 및스캔오류 58 Custom 레시피및레시피폴더 60 시스템검사 61 RAID 오류메시지 63 시스템설정구성 64 NextSeq 550 시스템안내서 49

56 문제해결 소개 기술관련문의사항이있는경우 Illumina 웹사이트의 NextSeq 550 지원페이지를방문하시기바랍니다. 지원페이지에서설명서, 다운로드, 자주묻는질문과답변에액세스할수있습니다. MyIllumina 계정에로그인하여지원게시판에액세스하십시오. 실행품질이나성능문제는 Illumina 기술지원부서에문의하시기바랍니다. 85 페이지의기술지원을참조하십시오. 문제를수월하게해결할수있도록 BaseSpace 의실행요약링크를 Illumina 기술지원부서와공유하는것이좋습니다. 50 문서번호 v02 KOR

57 문제해결파일 Illumina 기술지원담당자는문제를해결하기위해실행별파일또는스캔별파일의복사본을요청할수있습니다. 일반적으로문제해결에사용되는파일은다음과같습니다. 시퀀싱실행파일문제해결 주요파일폴더설명 문제해결파일 실행정보파일 (RunInfo.xml) 루트폴더다음과같은정보를포함합니다. 실행이름 실행의주기수 각리드의주기수 리드가인덱스리드인지여부 플로우셀의스와스 (swath) 및타일수 실행매개변수파일 (RunParameters.xml) 루트폴더 실행매개변수및실행컴포넌트에대한정보를포함합니다. 정보에는 RFID, 일련번호, 파트번호및유효기간이포함됩니다. RTA 구성파일 (RTAConfiguration.xml) Data\Intensities 실행에대한 RTA 구성설정을포함합니다. RTAConfiguration.xml 파일은실행이시작될때생성됩니다. InterOp 파일 (*.bin) InterOp 시퀀싱분석뷰어에사용되는이진보고파일입니다. InterOp 파일은실행과정에걸쳐업데이트됩니다. 로그파일 로그 로그파일은주기마다동안기기에서수행되는각단계를설명하고, 실행에사용되는소프트웨어및펌웨어버전이표시됩니다. [InstrumentName]_ CurrentHardware.csv 라는파일에는기기컴포넌트의일련번호가표시됩니다. 오류로그파일 (*ErrorLog*.txt) 글로벌로그파일 (*GlobalLog*.tsv) 레인로그파일 (*LaneLog*.txt) RTA 로그 RTA 오류의로그입니다. 오류로그파일은오류가발생할때마다업데이트됩니다. RTA 로그모든 RTA 이벤트의로그입니다. 글로벌로그파일은실행과정에서업데이트됩니다. RTA 로그 RTA 처리이벤트의로그입니다. 레인로그파일은실행과정에서업데이트됩니다. RTA 오류 RTA 오류를해결하려면먼저 RTALogs 폴더에저장된 RTA 오류로그를확인합니다. 실행이성공한경우에는이파일이없습니다. Illumina 기술지원부서에문제를보고할때이오류로그를포함해야합니다. NextSeq 550 시스템안내서 51

58 문제해결 배열스캔파일문제해결 주요파일폴더설명 스캔매개변수파일 (ScanParameters.xml) 루트폴더 스캔매개변수에대한정보를포함합니다. 정보에는스캔날짜, BeadChip 바코드, 클러스터파일위치및매니페스트파일위치가포함됩니다. 로그파일 로그 로그파일은스캔하는동안기기에서수행된각단계를설명합 니다. 메트릭파일 [Barcode] 메트릭은샘플메트릭및섹션메트릭으로제공됩니다. [barcode]_sample_metrics.csv 각샘플과채널 ( 빨간색, 녹색 ) 에대해 Percent Off Image, Percent Outlier, P05, P50, P95, Avg FWHM Avg, FWHM Stddev 및 Min Registration Score가열거됩니다. [barcode]_section_metrics.csv 각섹션과타일에대해 Laser Z-position, Through Focus Z-position, Red FWHM, Green FWHM, Red Avg Pixel Intensity, Green Avg Pixel Intensity, Red Registration Score 및 Green Registration Score가열거됩니다. 재스캔파일 [Barcode] [barcode]_rescan.flowcell 재스캔하기위해조정된타일 위치가열거되며, 여기에는증가된타일간중첩부분이포함됩 니다. 52 문서번호 v02 KOR

59 자동검사오류해결 시퀀싱실행검사 자동검사중에오류가발생하는경우다음권장조치를통해오류를해결합니다. 시퀀싱과배열스캔은자동검사가각기다릅니다. 실행전검사에실패하면시약카트리지 RFID 가잠기지않고후속실행에사용될수있습니다. 그러나 RFID 는알루미늄포장지에구멍이뚫리면잠깁니다. 시스템검사 권장조치 자동검사오류해결 도어닫힘부분도어가닫혀있는지확인합니다. 소모품장착 소모품센서는등록되지않습니다. 각소모품이제대로장착되어있는지확인합니다. Run Setup( 실행설정 ) 화면에서 Back( 뒤로 ) 을선택하여장착단계로돌아가실행설정을반복합니다. 필수소프트웨어소프트웨어의중요컴포넌트가누락되어있습니다. 수동소프트웨어업데이트를수행하여모든소프트웨어컴포넌트를복원합니다. 기기디스크공간 네트워크연결 기기하드드라이브의디스크공간이부족하여실행을수행할수없습니다. 이전실행의데이터가전송되지않았을수있습니다. 기기하드드라이브에서실행데이터를지웁니다. 네트워크연결이중단되었습니다. 네트워크상태와물리적네트워크연결을확인합니다. 네트워크디스크공간 BaseSpace 계정또는네트워크서버가가득찼습니다. 온도 권장조치 온도 Illumina 기술지원부서에문의합니다. 온도센서 Illumina 기술지원부서에문의합니다. 팬 Illumina 기술지원부서에문의합니다. 이미지생성시스템 권장조치 이미지생성제한 Illumina 기술지원부서에문의합니다. Z 단계및해결 Illumina 기술지원부서에문의합니다. 비트오류율 Illumina 기술지원부서에문의합니다. 플로우셀등록플로우셀이제대로장착되지않았을수있습니다. Run Setup( 실행설정 ) 화면에서 Back( 뒤로 ) 을선택하여플로우셀단계로돌아갑니다. 이미지생성부분도어가열립니다. 플로우셀을분리했다가다시장착하여제대로장착되었는지확인합니다. NextSeq 550 시스템안내서 53

60 문제해결 시약공급 권장조치 밸브응답 Illumina 기술지원부서에문의합니다. 펌프 Illumina 기술지원부서에문의합니다. 완충제장치 Illumina 기술지원부서에문의합니다. 폐시약비우기폐시약용기를비우고빈용기를다시장착합니다. 배열스캔검사 시스템검사 권장조치 도어닫힘부분도어가닫혀있는지확인합니다. 소모품장착 소모품센서는등록되지않습니다. 각소모품이제대로장착되어있는지확인합니다. Run Setup( 실행설정 ) 화면에서 Back( 뒤로 ) 을선택하여장착단계로돌아가실행설정을반복합니다. 필수소프트웨어소프트웨어의중요컴포넌트가누락되어있습니다. 수동소프트웨어업데이트를수행하여모든소프트웨어컴포넌트를복원합니다. 인풋파일확인 기기디스크공간 네트워크연결 클러스터파일과매니페스트파일의경로가올바른지, 파일이있는지확인합니다. 기기하드드라이브의디스크공간이부족하여실행을수행할수없습니다. 이전실행의데이터가전송되지않았을수있습니다. 기기하드드라이브에서실행데이터를지웁니다. 네트워크연결이중단되었습니다. 네트워크상태와물리적네트워크연결을확인합니다. 네트워크디스크공간 BaseSpace 계정또는네트워크서버가가득찼습니다. 이미지생성시스템 권장조치 이미지생성제한 Illumina 기술지원부서에문의합니다. Z 단계및해결 Illumina 기술지원부서에문의합니다. 비트오류율 Illumina 기술지원부서에문의합니다. 자동중앙정렬 BeadChip 어댑터를분리합니다. BeadChip 이어댑터에장착되었는지확인하고어댑터를다시장착하십시오. 54 문서번호 v02 KOR

61 폐시약용기가가득참 항상폐시약용기를비운다음실행을시작합니다. 폐시약용기를비우지않고실행을시작할경우용기가가득차면시스템센서가소프트웨어에서실행을일시중지하도록트리거합니다. 클러스터링, 페어드엔드재합성또는자동실행후세척중에는시스템센서가실행을일시중지할수없습니다. 실행이일시중지되면대화상자가열리면서 Sipper 를올리고가득찬용기를비울수있는옵션이포함된대화상자가열립니다. 폐시약용기비우기 1 Raise Sippers(Sipper 올리기 ) 를선택합니다. 2 폐시약용기를꺼내서내용물을적절히폐기합니다. 3 빈용기를완충제부분에다시장착합니다. 4 Continue( 계속 ) 를선택합니다. 실행이자동으로다시시작됩니다. 폐시약용기가가득참 NextSeq 550 시스템안내서 55

62 문제해결 재혼성화작업흐름 처음일부주기동안생성된메트릭이 2500 보다낮은인텐시티를보일경우재혼성화실행이필요할수있습니다. 일부낮은다이버시티라이브러리는 1000 보다낮은인텐시티를보일수있습니다. 이러한수치는예상된것이며재혼성화로해결할수없습니다. 참고 End Run( 실행종료 ) 명령은최종명령입니다. 실행을다시시작할수없고, 실행소모품을다시사용할수없으며, 실행의시퀀싱데이터가저장되지않습니다. 실행을종료하면실행이끝나기전에다음과같은단계가수행됩니다. } 플로우셀이안전상태가됩니다. } 나중에실행할수있도록플로우셀 RFID 의잠금을해제합니다. } 플로우셀에재혼성화유효기간을지정합니다. } 완료된주기에대한실행로그를기록합니다. 지연되는것은정상적인동작입니다. } 자동실행후세척을건너뜁니다. 재혼성화실행을시작하면실행을수행하기위해다음과같은단계가수행됩니다. } 고유한실행이름에따라실행폴더를만듭니다. } 플로우셀재혼성화날짜가만료되지않았는지확인합니다. } 시약을프라이밍합니다. 지연되는것은정상적인동작입니다. } 클러스터링단계를건너뜁니다. } 이전리드 1 프라이머를제거합니다. } 새로운리드 1 프라이머를혼성화합니다. } 리드 1 까지계속하고지정된실행매개변수에따라나머지실행부분을계속합니다. 재혼성화실행을끝내는시점 필수소모품 현재실행종료 다음과같은시점에실행을끝낼경우에만나중에재혼성화를수행할수있습니다. } 5 주기후 템플레이트등록후에인텐시티가나타납니다. 이를위해서는시퀀싱의처음 5 주기가필요합니다. 1 주기후에실행을끝내도안전하지만 5 주기후에종료하는것이좋습니다. 클러스터생성중에는실행을끝내지마십시오. } 리드 1 또는인덱스 1 리드 페어드엔드재합성이시작되기전에실행을끝냅니다. 페어드엔드재합성이시작된후에는차후재혼성화용으로플로우셀을저장할수없습니다. 재혼성화를실행하려면실행중지시기에관계없이새로운 NextSeq 시약카트리지와완충제카트리지가필요합니다. 1 End Run( 실행종료 ) 을선택합니다. 명령을확인하라는메시지가표시되면 Yes( 예 ) 를선택합니다. 2 플로우셀을저장할지묻는메시지가표시되면 Yes( 예 ) 를선택합니다. 재혼성화유효기간을적어둡니다. 3 재혼성화실행을설정할준비가될때까지저장된플로우셀을꺼내 2 ~8 상태에서보관합니다. 참고플로우셀은건조제없이뚜껑달린플라스틱케이스에담아 2 ~8 로최대 7 일동안보관할수있습니다. 최상의결과를얻으려면저장된플로우셀을 3 일이내에재혼성화하십시오. 56 문서번호 v02 KOR

63 수동세척수행 1 Home( 홈 ) 화면에서 Perform Wash( 세척수행 ) 를선택합니다. 2 Wash Selection( 세척선택 ) 화면에서 Manual Post-Run Wash( 수동실행후세척 ) 를선택합니다. 43 페이지의수동세척수행을참조하십시오. 참고중지된실행에서시약카트리지와완충제카트리지를제거하지않은경우수동세척에사용할수있습니다. 그렇지않은경우에는시약세척카트리지와완충제세척카트리지를사용하여수동세척을수행하십시오. BaseSpace Prep(BaseSpace 준비 ) 탭에서새실행설정 1 기기가 BaseSpace 또는 BaseSpace Onsite 용으로구성된경우원래실행과동일한매개변수를사용하여 Prep( 준비 ) 탭에서새실행을설정합니다. 팁 Pools( 풀 ) 탭을클릭하고해당풀 ID 를선택하여이전실행설정을그대로적용한다음새실행에고유한이름을지정하십시오. 재혼성화작업흐름 기기에서실행설정 1 새시약카트리지를준비합니다. 2 저장된플로우셀을보관한경우실온에도달할때까지둡니다 (15~30 분 ). 3 저장된플로우셀을세척하여장착합니다. 4 폐기물용기를꺼내서내용물을적절히폐기한다음빈용기를다시장착합니다. 5 새완충제카트리지와시약카트리지를장착합니다. 6 Run Setup( 실행설정 ) 화면의다음과같은옵션중에서선택합니다. } BaseSpace or BaseSpace Onsite(BaseSpace 또는 BaseSpace Onsite) Run( 실행 ) 을선택하고실행매개변수를확인합니다. } Standalone( 독립실행형 ) 실행의이름을입력하고원래실행과동일한매개변수를지정합니다. 7 Next( 다음 ) 를선택하여실행전검사를진행하고실행을시작합니다. NextSeq 550 시스템안내서 57

64 문제해결 BeadChip 및스캔오류 소프트웨어가 BeadChip 바코드를읽을수없음 바코드오류대화상자가나타나면다음과같은옵션중에서선택합니다. } Rescan( 재스캔 ) 을선택합니다. 소프트웨어가바코드를다시읽으려고합니다. } 이미지와같이텍스트필드를선택하고숫자바코드를입력합니다. BeadChip 에따라바코드숫자는최대 12 자릿수로이루어집니다. Save( 저장 ) 를선택합니다. 바코드이미지는아웃풋폴더에저장됩니다. } Cancel( 취소 ) 을선택합니다. BeadChip 어댑터를분리할수있게이미지생성부분도어가열립니다. BeadChip 스캔실패 스캔한후에이미지가등록됩니다. 등록하면스캔한이미지의위치가비드맵또는 DMAP 폴더에제공된정보와상호연관되어비드가식별됩니다. 등록에실패한섹션은 BeadChip 이미지에서빨간색으로표시됩니다. 그림 27 실패한섹션을표시하는 BeadChip 스캔이완료되고스캔데이터가아웃풋폴더에기록되면 Rescan( 재스캔 ) 버튼이활성화됩니다. Rescan( 재스캔 ) 을선택하면소프트웨어가다음과같은단계를수행합니다. } 증가된타일간중첩부분을사용하여실패한섹션이포함된샘플을재스캔합니다. } 원본아웃풋폴더에아웃풋파일을생성합니다. } 실패한섹션에대한이전아웃풋파일을덮어씁니다. } 백그라운드에서각각의재스캔작업에대한스캔카운터가 1 씩증가됩니다. 소프트웨어가아웃풋폴더의이름을변경하지는않습니다. 재스캔또는새스캔시작 1 Rescan( 재스캔 ) 을선택하여실패한섹션이포함된샘플을스캔합니다. 2 스캔에계속실패하면스캔을종료합니다. 3 BeadChip 과어댑터를제거하고 BeadChip 에먼지나잔여물이있는지검사합니다. 캔공기또는기타압축먼지제거방법을사용하여잔여물을제거합니다. 58 문서번호 v02 KOR

65 4 BeadChip 을다시장착하고새스캔을시작합니다. 새스캔이시작되면소프트웨어가다음단계를수행합니다. } 전체 BeadChip 을스캔합니다. } 새아웃풋폴더에아웃풋파일을생성합니다. } 마지막재스캔작업의스캔수에따라스캔카운터가 1 씩증가됩니다. 매니페스트파일및클러스터파일교체 1 사용중인 BeadChip 의 Illumina 지원페이지 (support.illumina.com) 로이동하여 Downloads ( 다운로드 ) 탭을클릭합니다. 2 교체하거나업데이트할파일을다운로드해서원하는네트워크위치에복사합니다. 참고 NextSeq 550 시스템과호환되는매니페스트파일및클러스터파일을선택해야합니다. 호환되는파일은파일이름에 NS550 이포함되어있습니다. 3 위치가변경된경우에만 BeadChip Scan Configuration(BeadChip 스캔구성 ) 화면에서다음과같이위치를업데이트합니다. BeadChip 및스캔오류 a NCS Home(NCS 홈 ) 화면에서 Manage Instrument( 기기관리 ) 를선택합니다. b System Configuration( 시스템구성 ) 을선택합니다. c BeadChip Scan Configuration(BeadChip 스캔구성 ) 을선택합니다. 4 Browse( 찾아보기 ) 를선택한다음, 교체하거나업데이트한파일의위치를지정합니다. NextSeq 550 시스템안내서 59

66 문제해결 Custom 레시피및레시피폴더 원본레시피를수정하지마십시오. 항상새이름을지정하여원본레시피의복사본을만드십시오. 원본레시피를수정하면이후업데이트시소프트웨어업데이트프로그램이더이상레시피를인식하지못하기때문에최신버전이설치되지않습니다. 사용자지정레시피를해당레시피폴더에저장합니다. 레시피폴더는다음과같이구성됩니다. Custom( 사용자지정 ) High( 높음 ) High Output 키트에이용되는사용자지정레시피입니다. Mid( 중간 ) Mid Output 키트에이용되는사용자지정레시피입니다. High( 높음 ) High Output 키트에이용되는원본레시피입니다. Mid( 중간 ) Mid Output 키트에이용되는원본레시피입니다. Wash( 세척 ) 수동세척레시피를포함합니다. 60 문서번호 v02 KOR

67 시스템검사 정상작동시또는기기관리시에는시스템검사를수행할필요가없습니다. 그러나 Illumina 기술지원담당자가문제를해결하기위해귀하에게시스템검사를수행하도록요청할수도있습니다. 참고기기세척이예정된경우시스템검사를시작하기전에세척을수행합니다. 시스템검사가자동으로시작되면제어소프트웨어가닫히고 NSS(NextSeq 서비스소프트웨어 ) 가실행됩니다. 서비스소프트웨어가실행되고고급장착옵션을사용하도록구성된 Load( 장착 ) 화면이열립니다. 시스템검사 그림 28 사용가능한시스템검사 시스템검사수행 Select( 선택 ) 화면에서비활성체크박스는 Illumina 현장담당자의지원이필요한테스트임을나타냅니다. 1 Manage Instrument( 기기관리 ) 화면에서 System Check( 시스템검사 ) 를선택합니다. 제어소프트웨어를닫으라는메시지가표시되면 Yes( 예 ) 를선택합니다. 2 다음과같이소모품을장착합니다. a 사용한플로우셀이아직기기에없는경우사용한플로우셀을장착합니다. b 폐시약용기를비우고빈시약용기를기기에다시장착합니다. c 가운데저장소에 120ml 의일반실험실용순수가포함된완충제세척카트리지를장착합니다. d 시약세척카트리지를장착합니다. 시약세척카트리지가비어있고깨끗한지확인합니다. 3 Load( 장착 ) 를선택합니다. 플로우셀과시약세척카트리지가제자리로이동됩니다. Next( 다음 ) 를선택합니다. 4 Next( 다음 ) 를선택합니다. 시스템검사가시작됩니다. 5 [ 선택사항 ] 시스템검사가완료되면검사이름옆의 View( 보기 ) 를선택하여각검사와연관된값을확인합니다. 6 Next( 다음 ) 를선택합니다. 시스템검사보고서가열립니다. 7 Save( 저장 ) 를선택하여보고서를 zip 파일로저장합니다. 파일을저장할네트워크위치를지정합니다. 8 작업을마치면 Exit( 종료 ) 를선택합니다. NextSeq 550 시스템안내서 61

68 문제해결 9 서비스소프트웨어를닫고제어소프트웨어를다시시작하라는메시지가표시되면 Yes( 예 ) 를선택합니다. 제어소프트웨어가자동으로다시시작됩니다. 동작검사 시스템검사 설명 BSM FCLM 및 FAM 대테스트 BSM(Bottle Straw Mechanism) 의게인및거리를검사하여모듈이제대로작동하는지확인합니다. FCLM(Flow Cell Load Mechanism) 과 FAM(Fluid Automation Module) 의게인및거리를검사하여모듈이제대로작동하는지확인합니다. XY- 대와 6 개의 Z- 대 ( 카메라당 1 개 ) 에대한이동제한및성능을검사합니다. 광학검사 시스템검사 플로우셀등록 설명 광학평면에서의플로우셀기울기를측정하고, 카메라기능을테스트하며, 이미지생성모듈을테스트하고, 플로우셀이올바른이미지생성위치에등록되었는지확인합니다. 플루이딕검사 시스템검사밸브응답압력감소플로우속도 설명 밸브및펌프이동의정확성을검사하고펌프시린지이동범위를테스트합니다. 밀봉된플루이딕시스템의누수율을검사하여플로우셀이시퀀싱위치에올바르게장착되었는지확인합니다. 시약라인에서공기가있는지감지하는데사용되는방울센서의기능을검사합니다. 플로우속도를측정하여폐색또는누수를확인합니다. 열검사 시스템검사 팬 열프로브 설명 PPM( 분당펄스수 ) 단위의시스템팬속도를검사하여팬이제대로작동하는지확인합니다. 작동하지않는팬은음수값을반환합니다. 각열센서의평균온도를검사합니다. 작동하지않는열센서는음수값을반환합니다. 62 문서번호 v02 KOR

69 RAID 오류메시지 NextSeq 컴퓨터에는하드드라이브 2 개가탑재되어있습니다. 하드드라이브하나를시작하는데실패하면 RAID 오류메시지가생성되고 Illumina 기술지원부서에문의하라는내용이시스템에서표시됩니다. 일반적으로하드드라이브를교체해야합니다. 실행설정단계와정상적인작동을계속할수있습니다. 이메시지의목적은정상적인기기작동이중단되는상황이발생하지않도록서비스를미리예약하는데있습니다. 계속하려면 Acknowledge( 확인 ) 를선택한다음 Close( 닫기 ) 를선택합니다. RAID 오류메시지 NextSeq 550 시스템안내서 63

70 문제해결 시스템설정구성 시스템은설치중에구성됩니다. 그렇지만변경해야하거나시스템을다시구성해야할경우시스템구성옵션을사용하십시오. } Network Configuration( 네트워크구성 ) IP 주소설정, DNS( 도메인이름서버 ) 주소, 컴퓨터이름및도메인이름에대한옵션을제공합니다. } BaseSpace Configuration(BaseSpace 구성 ) 기본값 BaseSpace 로그인및기기상태보고관련설정, BaseSpace 에서의실행모니터링, 독립실행형모드, BaseSpace, BaseSpace Onsite 등의분석방법에대한옵션을제공합니다. } BeadChip Scan Configuration(BeadChip 스캔구성 ) 기본값 DMAP 폴더위치, 아웃풋폴더위치, 저장된이미지의파일형식및아웃풋파일유형을지정하는옵션을제공합니다. 네트워크구성설정 1 Manage Instrument( 기기관리 ) 화면에서 System Configuration( 시스템구성 ) 을선택합니다. 2 Network Configuration( 네트워크구성 ) 을선택합니다. 3 Obtain an IP address automatically( 자동으로 IP 주소받기 ) 를선택하여 DHCP 서버에서 IP 주소를받습니다. 참고 DHCP(Dynamic Host Configuration Protocol) 는네트워크구성매개변수를동적으로배포하기위해 IP 네트워크에서사용하는표준네트워크프로토콜입니다. 또는 Use the following IP address( 다음 IP 주소사용 ) 를선택하여다음과같이기기를다른서버에수동으로연결합니다. 네트워크관리자에게시설에해당하는주소를문의합니다. } IP 주소를입력합니다. IP 주소는점으로구분된일련의숫자 4 개입니다 ( 예 : ). } IP 네트워크의하위분류인서브넷마스크를입력합니다. } 인터넷에연결된네트워크의라우터인기본값게이트웨이를입력합니다. 4 Obtain a DNS address automatically( 자동으로 DNS 주소받기 ) 를선택하여기기를 IP 주소와연결된도메인이름서버에연결합니다. 또는 Obtain a DNS address automatically( 자동으로 DNS 주소받기 ) 를선택하여다음과같이기기를도메인이름서버에수동으로연결합니다. } 기본설정 DNS 주소를입력합니다. DNS 주소는도메인이름을 IP 주소로전환하는데사용되는서버이름입니다. } 대체 DNS 주소를입력합니다. 대체주소는기본설정 DNS 에서특정도메인이름을 IP 주소로전환할수없는경우에사용됩니다. 5 Save( 저장 ) 를선택하여 Computer( 컴퓨터 ) 화면으로이동합니다. 참고기기컴퓨터이름은제조시기기컴퓨터에할당되는이름입니다. 컴퓨터이름을변경하면연결에영향을미쳐네트워크관리자의도움이필요할수있습니다. 6 다음과같이기기컴퓨터를도메인또는작업그룹에연결합니다. } 인터넷에연결된기기 Member of domain( 도메인구성원 ) 을선택하고시설의인터넷연결과관련된도메인이름을입력합니다. 도메인을변경하려면관리자의사용자이름과암호가필요합니다. } 인터넷에연결되지않은기기 Member of work group( 작업그룹구성원 ) 을선택하고작업그룹이름을입력합니다. 시설에고유한작업그룹이름을사용합니다. 7 Save( 저장 ) 를선택합니다. 64 문서번호 v02 KOR

71 BaseSpace 구성설정 1 Manage Instrument( 기기관리 ) 화면에서 System Configuration( 시스템구성 ) 을선택합니다. 2 BaseSpace Configuration(BaseSpace 구성 ) 을선택합니다. 3 다음옵션중에서선택하여후속분석을위해데이터를전송할위치를지정합니다. } 시퀀싱데이터를 Illumina BaseSpace 로보내려면 BaseSpace 를선택합니다. [ 선택사항 ] Output Folder( 아웃풋폴더 ) 체크박스를선택하고 Browse( 찾아보기 ) 를선택한후 BaseSpace 외에 BCL 파일을저장할두번째네트워크위치를지정합니다. } BaseSpace Onsite 를선택합니다. Server Name( 서버이름 ) 필드에 BaseSpace Onsite 서버의전체경로를입력합니다. [ 선택사항 ] Output Folder( 아웃풋폴더 ) 체크박스를선택하고 Browse( 찾아보기 ) 를선택한후 BaseSpace Onsite 서버외에 BCL 파일을저장할두번째네트워크위치를지정합니다. } 데이터를네트워크위치에만저장하려면 Standalone instrument( 독립실행형기기 ) 를선택합니다. Browse( 찾아보기 ) 를선택하여기본설정네트워크위치를지정합니다. 제어소프트웨어가아웃풋폴더이름을자동으로생성합니다. } [ 선택사항 ] BaseSpace 에서시각화도구를사용하여실행을모니터링하려면 Use Run Monitoring( 실행모니터링사용 ) 을선택합니다. BaseSpace 에로그인해야하고인터넷에연결되어있어야합니다. 4 Save( 저장 ) 를클릭하여 BaseSpace 화면으로이동합니다. 5 BaseSpace 또는 BaseSpace Onsite 를선택한경우다음과같이 BaseSpace 매개변수를설정합니다. } BaseSpace 에기기를등록하려면 BaseSpace 사용자이름과암호를입력합니다. } Use default login and bypass the BaseSpace login screen( 기본로그인을사용하고 BaseSpace 로그인화면무시 ) 을선택하여등록된사용자이름과암호를기본값로그인으로설정합니다. 이설정을사용하면실행설정중에 BaseSpace 화면을건너뜁니다. 6 BaseSpace 를선택한경우 Send instrument health information to Illumina(Illumina 에기기상태정보보내기 ) 를선택하여로그파일을 Illumina 에보냅니다. BaseSpace Onsite 에서는이옵션을사용할수없습니다. 7 Save( 저장 ) 를선택합니다. 시스템설정구성 BeadChip 스캔구성 1 Manage Instrument( 기기관리 ) 화면에서 System Configuration( 시스템구성 ) 을선택합니다. 2 BeadChip Scan Configuration(BeadChip 스캔구성 ) 을선택합니다. 3 기본값 DMAP 폴더위치를지정하려면 Browse( 찾아보기 ) 를선택하고내부네트워크의기본설정폴더위치를지정합니다. 참고매번스캔하기전에 DMAP 내용을다운로드하여이위치로복사합니다. DMAP 내용은각 BeadChip 에필요하며 BeadChip 바코드마다고유합니다. 4 기본값아웃풋위치를지정하려면 Browse( 찾아보기 ) 를선택하고내부네트워크의기본설정위치를지정합니다. 5 저장된이미지의이미지파일형식을선택합니다. 기본값이미지형식은 JPG 입니다. 6 스캔데이터의아웃풋파일형식을선택합니다. 기본값아웃풋파일형식은 GTC 전용입니다. 7 Save( 저장 ) 를선택합니다. NextSeq 550 시스템안내서 65

72 문제해결 8 Scan Map( 스캔맵 ) 화면에서각 BeadChip 유형에대한매니페스트파일과클러스터파일의전체경로를지정합니다. 각파일유형에서 Browse( 찾아보기 ) 를선택하고이러한파일이포함된폴더위치를지정합니다. 66 문서번호 v02 KOR

73 부록 B 실시간분석실시간분석 부록 B 실시간분석개요 68 실시간분석작업흐름 70 NextSeq 550 시스템안내서 67

74 실시간분석 실시간분석개요 NextSeq 550 에서는 RTA v2 라는 RTA( 실시간분석 ) 소프트웨어구현을사용합니다. RTA v2 는기기컴퓨터에서실행되고이미지에서인텐시티를추출하며 base calls 를수행하고 base calls 에 quality score 를지정합니다. RTA v2 와제어소프트웨어는웹 HTTP 인터페이스와공유메모리파일을통해통신합니다. RTA v2 가종료된경우처리가다시시작되지않고실행데이터가저장되지않습니다. 참고역다중화성능이계산되지않습니다. 따라서 SAV( 시퀀싱분석뷰어 ) 의 Index( 인덱스 ) 탭이채워지지않습니다. RTA v2 인풋 RTA v2 에는다음과같은처리인풋이필요합니다. } 로컬시스템메모리에포함된타일이미지 } 실행시작시자동으로생성되고실행이름, 주기수, 리드의인덱스여부및플로우셀의타일수를제공하는 RunInfo.xml } XML 형식의소프트웨어구성파일인 RTA.exe.config RTA v2 는옵션아웃풋폴더의지정여부및 RunInfo.xml 위치에대한명령을제어소프트웨어로부터수신합니다. RTA v2 아웃풋파일 각채널에대한이미지가메모리에서타일로전달됩니다. 타일은카메라의시야로정의되는플로우셀의작은이미지생성구역입니다. 이러한이미지에서이소프트웨어는 quality score 가매겨진 base calls 파일과필터파일세트로아웃풋을생성합니다. 다른모든파일은아웃풋파일을지원합니다. 파일유형 base calls 파일필터파일클러스터위치파일 base calls 인덱스파일 설명 분석된각타일은레인및주기별로집계되는 base calls(*.bcl) 파일에포함됩니다. 집계된 base calls 파일에는해당레인의모든클러스터에대한 base calls 와관련 quality score 가포함됩니다. 각타일은레인당하나의필터 (*.filter) 파일로집계되는필터정보를생성합니다. 필터파일은클러스터가필터를통과했는지여부를지정합니다. 클러스터위치 (*.locs) 파일에는타일의모든클러스터에대한 X, Y 좌표가포함됩니다. 템플레이트생성중에레인당하나의클러스터위치파일이생성됩니다. 원래타일정보를보존하기위해레인당하나의 base calls 인덱스 (*.bci) 파일이생성됩니다. 인덱스파일에는각타일의타일번호와해당타일의클러스터수로구성된값쌍이포함됩니다. 아웃풋파일은 BaseSpace 에서다운스트림을분석하는데사용됩니다. 또는 FASTQ 변환용 bcl2fastq 변환소프트웨어와타사분석솔루션을사용할수있습니다. NextSeq 파일을사용하려면 bcl2fastq v2.0 이상이필요합니다. 최신버전의 bcl2fastq 를다운로드하려면 Illumina 웹사이트에서 NextSeq 다운로드페이지를방문하십시오. 68 문서번호 v02 KOR

75 오류처리 RTA v2 는 quality score 가매겨진실행의실시간메트릭을 InterOp 파일로제공합니다. InterOp 파일은타일, 주기및리드수준메트릭을포함하는이진아웃풋으로, SAV( 시퀀싱분석뷰어 ) 에서실시간메트릭을보는데필요합니다. 최신버전의 SAV 를다운로드하려면 Illumina 웹사이트에서 SAV 다운로드페이지를방문하십시오. RTA v2 는로그파일을만들어 RTALogs 폴더에기록합니다. 오류는 *.tsv 파일형식의오류파일에기록됩니다. 처리종료시다음과같은로그및오류파일이최종아웃풋대상위치로전송됩니다. } *GlobalLog*.tsv 는중요한실행이벤트를요약합니다. } *LaneNLog*.tsv 는각레인에대한처리이벤트를열거합니다. } *Error*.tsv 는실행중에발생한오류를열거합니다. } *WarningLog*.tsv 는실행중에발생한경고를열거합니다. 실시간분석개요 NextSeq 550 시스템안내서 69

76 실시간분석 실시간분석작업흐름 템플레이트생성클러스터위치를매핑합니다. 등록및인텐시티추출 플로우셀에서각클러스터의위치를기록하고각클러스터의인텐시티값을결정합니다. 위상화수정위상화및사전위상화의효과를수정합니다. base calls 모든클러스터의 base calls 를결정합니다. quality score 평가모든 base calls 에 quality score 를지정합니다. 템플레이트생성 RTA 작업흐름의첫번째단계는 X/Y 좌표를이용하여타일에서각클러스터의위치를정의하는템플레이트를생성하는것입니다. 템플레이트를생성하려면실행의처음 5 주기에서가져온이미지데이터가필요합니다. 타일의마지막템플레이트주기에대한이미지가생성된후템플레이트가생성됩니다. 참고템플레이트생성중에클러스터를감지하려면처음 5 주기에 G 이외의염기가하나이상있어야합니다. 인덱스시퀀스의경우 RTA v2 에서는처음 2 주기에 G 이외의염기가하나이상필요합니다. 템플레이트는등록및인텐시티추출의후속단계에대한참조로사용됩니다. 전체플로우셀의클러스터위치는레인당하나의클러스터위치 (*.locs) 파일에기록됩니다. 등록및인텐시티추출 위상화수정 템플레이트가생성된후등록및인텐시티추출이시작됩니다. } 등록은템플레이트에대한이미지생성의모든후속주기에서생성되는이미지를배열합니다. } 인텐시티추출에서는지정된이미지의템플레이트에서각클러스터에대한인텐시티값이결정됩니다. 주기내이미지등록에실패할경우그주기의해당타일에대한 base calls 가생성되지않습니다. SAV ( 시퀀싱분석뷰어 ) 소프트웨어를사용하여섬네일이미지를검사하고등록에실패한이미지를확인하십시오. 시퀀싱반응이진행되는동안클러스터내의각 DNA 가닥이주기당 1 염기씩연장됩니다. 가닥이현재결합주기단계를벗어나게되면위상화및사전위상화가발생합니다. } 염기가뒤로처질때위상화가일어납니다. } 염기가앞서나갈때사전위상화가일어납니다. 70 문서번호 v02 KOR

77 그림 29 위상화및사전위상화 A 위상화중인염기가있는리드 B 사전위상화중인염기가있는리드 실시간분석작업흐름 base calls RTA v2 에서는위상화및사전위상화의효과를수정함으로써전체실행과정의모든주기에서데이터품질을극대화합니다. base calls 에따라특정주기에서지정된타일의모든클러스터에대한염기 (A, C, G, T) 가결정됩니다. NextSeq 550 에서는두가지이미지 ( 빨간색채널에서 1 개, 녹색채널에서 1 개 ) 만으로네가지 DNA 염기에대한데이터를인코딩하는 2 채널시퀀싱을사용합니다. 다른이미지와비교하기위해하나의이미지에서인텐시티를추출하면각각뉴클레오티드에해당하는고유한모집단네개가생성됩니다. base calls 과정에서는각클러스터가속한모집단을결정합니다. 그림 30 클러스터인텐시티시각화 표 1 2 채널시퀀싱의 base calls 염기빨간색채널녹색채널결과 A 1( 켜짐 ) 1( 켜짐 ) 빨간색채널과녹색채널에모두인텐시티가표시된 클러스터입니다. C 1( 켜짐 ) 0( 꺼짐 ) 빨간색채널에만인텐시티가표시된클러스터입니다. G 0( 꺼짐 ) 0( 꺼짐 ) 알려진클러스터위치에표시된인텐시티가없는클러 스터입니다. T 0( 꺼짐 ) 1( 켜짐 ) 녹색채널에만인텐시티가표시된클러스터입니다. NextSeq 550 시스템안내서 71

78 실시간분석 필터통과클러스터 실행중에 RTA v2 는원시데이터를필터링하여데이터품질임계값을충족하지않는리드를제거합니다. 중첩되고품질이낮은클러스터가제거됩니다. 2 채널분석의경우 RTA v2 는모집단기반시스템을사용하여 base calls 의 chastity 를결정합니다. 처음 25 주기에 chastity 가 0.63 미만인 base calls 가 1 개이하인경우클러스터가필터를통과 (PF) 합니다. 필터를통과하지않는클러스터는 base calls 되지않습니다. 인덱싱고려사항 base calls 인덱스리드에대한처리방법은다른리드중의 base calls 와다릅니다. 인덱스리드는처음 2 주기중하나에있는 G 이외의염기 1 개이상을사용하여시작해야합니다. 인덱스리드가 G 의 2 base calls 로시작되면신호인텐시티가생성되지않습니다. 역다중화성능을보장하려면처음 2 주기중하나에신호가있어야합니다. 역다중화성능을높이려면모든주기에대해 1 개이상의채널 ( 가급적양쪽채널 ) 에신호를제공하는인덱스시퀀스를선택하십시오. 주기에서 G 염기만생성하는인덱스조합을피하려면다음지침을따르십시오. } 빨간색채널 A 또는 C } 녹색채널 A 또는 T quality score 평가 이 base calls 프로세스는로우플렉스샘플을분석할때정확도를보장합니다. quality score(q- 점수 ) 는잘못된 base calls 가능성에대한예측값입니다. Q- 점수가높을수록 base calls 의품질이더높고 base calls 가정확할확률이더높습니다. Q- 점수는사소한오류가능성을전달하는간단한방식입니다. quality score 는 Q(X) 로나타내며, 여기서 X 가점수입니다. 다음표에는 quality score 와오류가능성간의관계가나와있습니다. Q-점수 Q(X) 오류가능성 Q (1/10,000) Q (1/1,000) Q (1/100) Q10 0.1(1/10) 참고 quality score 는수정된버전의 Phred 알고리즘을기초로평가됩니다. quality score 평가에서는각 base calls 에대한예측값세트를계산한다음, 예측값을사용하여품질표에서 Q- 점수를조회합니다. 품질표는시퀀싱플랫폼및화학반응버전의특정구성에따라생성되는실행에대해가장정확한품질예측을제공하도록만들어졌습니다. Q- 점수가결정되면 base calls(*.bcl) 파일에결과가기록됩니다. 72 문서번호 v02 KOR

79 부록 C 아웃풋파일및폴더아웃풋파일및폴더 부록 C 시퀀싱출력파일 74 아웃풋폴더구조시퀀싱 78 스캐닝아웃풋파일 79 스캐닝아웃풋폴더구조 80 NextSeq 550 시스템안내서 73

80 아웃풋파일및폴더 시퀀싱출력파일 파일유형 base calls 파일 base calls 인덱스파일 파일설명, 위치및이름 분석된각타일은주기마다레인당하나의파일로집계되는 base calls 파일에포함됩니다. 집계된파일에는해당레인의모든클러스터에대한 base calls 와인코딩된 quality score 가포함됩니다. Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] 레인당하나의폴더에파일이저장됩니다. [Cycle].bcl.bgzf, 여기서 [Cycle] 은 4 자리주기번호를나타냅니다. base calls 파일은블록 gzip 으로압축됩니다. 레인당하나의이진인덱스파일에각타일의값쌍 ( 타일번호와타일의클러스터수 ) 으로원래타일정보가나열됩니다. base calls 인덱스파일은해당레인에대해 base calls 파일이처음생성될때만들어집니다. Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] 레인당하나의폴더에파일이저장됩니다. s_[lane].bci 클러스터위치파일필터파일 InterOp 파일 RTA 구성파일실행정보파일섬네일파일 각타일의모든클러스터에대한 XY 좌표가레인당하나의클러스터위치파일에집계됩니다. 템플레이트가생성되면클러스터위치파일이생깁니다. Data\Intensities\L00[X] 레인당하나의폴더에파일이저장됩니다. s_[lane].locs 필터파일은클러스터가필터를통과했는지여부를지정합니다. 필터정보는레인및리드당하나의필터파일에집계됩니다. 필터파일은데이터의 25 개주기를사용하여 26 주기에생성됩니다. Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] 레인당하나의폴더에파일이저장됩니다. s_[lane].filter SAV( 시퀀싱분석뷰어 ) 에서사용되는이진보고파일입니다. InterOp 파일은실행과정에걸쳐업데이트됩니다. InterOp 폴더 실행을시작할때만들어지는 RTA 구성파일에는실행관련설정이열거됩니다. [ 루트폴더 ], RTAConfiguration.xml 실행명, 각리드의주기수, 리드가인덱스리드인지여부및플로우셀에서의스와스 (swath) 및타일수가열거됩니다. 실행정보파일은실행을시작할때만들어집니다. [ 루트폴더 ], RunInfo.xml 이미지생성중모든주기에전체카메라에서타일 1, 6, 12 의상단 / 하단표면에대한각색상채널 ( 빨간색, 녹색 ) 의섬네일이미지가만들어집니다. Thumbnail_Images\L00[X]\C[X.1] 레인당폴더 1 개와주기당하위폴더 1 개에파일이저장됩니다. s_[lane]_[tile]_[channel].jpg 파일이름에서타일은표면, 스와스 (swath), 카메라, 타일을나타내는 5 자리숫자로표시됩니다. 자세한내용은 76 페이지의타일번호매기기및 77 페이지의섬네일이미지이름지정을참조하십시오. 74 문서번호 v02 KOR

81 플로우셀타일 타일은카메라의시야로정의되는플로우셀의작은이미지생성구역입니다. 전체타일수는플로우셀에서이미지가생성되는레인, 스와스 (swath) 및표면수와이미지를수집하기위해카메라가함께작동하는방식에따라달라집니다. } 높은아웃풋의플로우셀은총타일수가 864 개입니다. } 중간아웃풋의플로우셀은총타일수가 288 개입니다. 표 2 플로우셀타일 플로우셀부분 높은아웃풋 중간아웃풋 설명 시퀀싱출력파일 레인 4 4 레인은전용주입구포트와배출구포트가있는물 리적채널입니다. 표면 2 2 플로우셀은상단과하단의두표면에서이미지가생성됩니다. 타일하나의상단표면에서이미지가생성되고같은타일의하단표면에서이미지가생성된후다음타일로이동합니다. 레인당스와스 (swath) 3 1 스와스 (swath) 는레인에있는타일의열입니다. 카메라세그먼트 3 3 기기에서카메라 6대를사용하여레인당 3개의세 그먼트에플로우셀의이미지를생성합니다. 카메라세그먼트별스와스 (swath) 당타일 이미지가생성된총타일수 타일은카메라에서하나의이미지로포착되는플로 우셀의구역입니다 총타일수는레인수 표면수 스와스 (swath) 수 카메라세그먼트수 세그먼트별스와스 (swath) 당타일수와같습니다. 레인번호매기기 레인 1 과 3( 레인쌍 A) 은동시에이미지가생성됩니다. 레인 2 와 4( 레인쌍 B) 는레인쌍 A 의이미지생성이완료되면이미지가생성됩니다. 그림 31 레인번호매기기 A 레인쌍 A 레인 1 과 3 B 레인쌍 B 레인 2 와 4 NextSeq 550 시스템안내서 75

82 아웃풋파일및폴더 스와스 (swath) 번호매기기 각레인은세개의스와스 (swath) 에서이미지가생성됩니다. 스와스 (swath) 에서는높은아웃풋의플로우셀에대해 1~3 번의번호가매겨집니다. 그림 32 스와스 (swath) 번호매기기 카메라번호매기기 NextSeq 550 에서는카메라 6 대를사용하여플로우셀의이미지를생성합니다. 카메라에는 1~6 번의번호가매겨집니다. 카메라 1~3 은레인 1 의이미지를, 카메라 4~6 은레인 3 의이미지를생성합니다. 레인 1 과 3 의이미지가생성되고나면이미지생성모듈이 X 축으로이동하여레인 2 와 4 의이미지를생성합니다. 그림 33 카메라및세그먼트번호매기기 ( 높은아웃풋의플로우셀표시 ) 타일번호매기기 각카메라세그먼트의각스와스 (swath) 에는타일 12 개가있습니다. 타일에는스와스 (swath) 번호또는카메라세그먼트와상관없이 01~12 의두자리번호가매겨집니다. 그림 34 타일번호매기기 76 문서번호 v02 KOR