지는 유용한 약용식물이다. 가시오갈피는 다른 오갈피에 비하여 줄기 전체에 가시가 가늘게 털이 난 것처럼 많이 분포되어 있는 특 징이 있다. 이러한 가시오갈피는 다양한 한약재가 많이 거래되는 경동시장에서도 찾기가 힘들 정도로 그 생산량이 적다. 현재 일부 농가에서 소규모

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미주 강
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1 (51) Int. Cl. 6 A01H 4/00 (21) 출원번호 특 (22) 출원일자 1997년06월20일 (71) 출원인 유창연 (19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) 강원도춘천시강원대학교농생대식물응용과학부 (72) 발명자 유창연 강원도춘천시강원대학교농생대식물응용과학부 김재광 강원도춘천시강원대학교농생대자원식물개발학과 (74) 대리인 이원희 심사청구 : 있음 (54) 체세포배를 이용한 가시오갈피의 번식 방법 요약 (11) 공개번호 특 (43) 공개일자 1999년01월15일 본 발명은 가시오갈피의 조직을 배양하여 번식시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명 은 가시오갈피의 뿌리 조직을 고체 배지 및 액체 배지에서 배양하여 체세포배를 유기하고 이를 대량 증 식시킨 후 이로부터 식물체를 재분화하여 토양에 이식시키는 번식 방법에 관한 것으로서, 이는 유용한 약리효과가 있음에도 불구하고 우리나라에서 종자가 결실되지 않는 가시오갈피를 대량으로 생산하는데 널리 사용될 수 있다. 대표도 도3 명세서 도면의 간단한 설명 도 1은 가시오갈피 나무의 형태를 나타낸 것이고, 도 2는 본 발명의 방법에 의하여 가시오갈피의 뿌리 조직으로부터 형성된 체세포배를 나타낸 것이고, 도 3은 본 발명의 현탁배양 방법에 의하여 형성된 체세포배를 나타낸 것이고, 도 4는 본 발명의 체세포배를 폴리아민이 포함된 배지에서 현탁배양하여 유기된 식물체를 나타낸 것이 고, 도 5는 본 발명의 체세포배를 배양하여 얻은 재분화된 식물체를 나타낸 것이고, 도 6은 본 발명의 토양 순화 과정을 처리하여 재분화된 식물체를 토양에 이식한 다음 생존한 식물체를 나타낸 것이다. 발명의 상세한 설명 발명의 목적 발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술 본 발명은 가시오갈피의 조직을 배양하여 번식시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명 은 가시오갈피의 뿌리 조직을 고체 배지 및 액체 배지에서 배양하여 체세포배를 유기하고 이를 대량 증 식시키며 이로부터 식물체를 재분화하여 토양에 이식시키는 번식 방법에 관한 것으로서, 이는 유용한 약 리효과가 있음에도 불구하고 우리나라에서 종자가 결실되지 않는 가시오갈피를 대량으로 생산하는데 널 리 사용될 수 있다. 가시오갈피 (Eleutherococcus senticosus Max.)는 오갈피나무과에 속하는 낙엽성 관목으로, 러시아 시베 리아 동남부 지역, 일부 북해도 지방, 중국 일부지방 및 우리나라 강원도 북부와 덕유산 지역 등에 일부 자생하고 있는 것으로 알려져 있다. 가시오갈피는 수피 또는 근피가 강장, 신경통, 혈당강하, 항스트레 스, 스테미나 보강, 중풍 등에 다양한 효과가 있는 약재로 이용될 수 있는 시베리아 인삼으로도 불리워 9-1

심사청구 : 있음 (54) 체세포배를 이용한 가시오갈피의 번식 방법 요약 (11) 공개번호 특1999-002463 (43) 공개일자 1999년01월15일 본 발명은 가시오갈피의 조직을 배양하여 번식시키는 방법에 관한 것이다.

2 지는 유용한 약용식물이다. 가시오갈피는 다른 오갈피에 비하여 줄기 전체에 가시가 가늘게 털이 난 것처럼 많이 분포되어 있는 특 징이 있다. 이러한 가시오갈피는 다양한 한약재가 많이 거래되는 경동시장에서도 찾기가 힘들 정도로 그 생산량이 적다. 현재 일부 농가에서 소규모로 재배하고 있는 것을 제외하고는 가시오갈피 원료의 대 부분이 수입에 의존하고 있다. 실제로 일부 제약회사에서 (강남 제약, 동신 제약) 이를 수입하여 엘르 르-F, 엘코크라는 상품명의 가시오갈피 엑기스를 제조 판매하고 있다. 이러한 가시오갈피는 우리나라 기후와 토양에서는 그 종자가 결실되지 않기 때문에 종자를 이용한 번식 기술이 이루어지지 않아 이를 대량으로 생산하는데 많은 어려움이 있었다. 구체적으로 우리나라에서 가 시오갈피는 매우 고가로 거래되고 있는데, 건조잎 1kg 에 10만원 이상 (강원도 춘성군 물오리 재배농가 김재기, )을 호가하고 있다. 따라서 가시오갈피의 종묘를 대량 생산하는 방법이나 기술을 개발 한다면 이의 재배를 통하여 높은 농가 소득을 올릴 수 있고 가시오갈피의 원료를 국내에서 자급할 수 있 어 수입하는데 필요한 외화를 줄일 수 있다. 지금까지 가시오갈피는 우리나라에서 종자가 결실되기 않기 때문에 이를 번식시키기 위하여 다양한 시도 들이 이루어졌다. 구체적인 실생 번식기술로 외국에서 도입한 종자를 후숙 및 휴면타파 과정을 거쳐 실 험실 내에서 발아시키는 것이 성공한 예가 있으며 (박문수, 1994, 약용식물 가시오갈피 실생 번식기술 개발, 후숙과 휴면타파 과정을 거쳐 종자 발아에 성공, 35(3):86-91), 이외에도 가시오갈피의 줄기부분 을 잘라서 모래나 흙에 삽목하는 방법이 실시된 예가 있으나 삽목률이 30% 이하로 번식율이 매우 저조하 였다. 또한 외국에서 도입한 미숙배를 가진 가시오갈피 종자를 후숙과정을 거쳐 무라시지 및 스쿡 (Murashige and Skoog, MS) 배지에 배양하여 캘러스 (callus) 및 식물체를 분화시킨 결과가 (김태수, 박호기, 박분 수, 장영선, 김선, 김종호, 성충기, 1994, 가시오갈피 번식에 관한 연구 Ⅲ, 미숙배 배양에 의한 캘러스 유기 및 식물체 재분화, 한국육종학회지, 26: ) 보고되어 있다. 그러나, 가시오갈피를 번식시키 기 위한 조직배양에 관한 연구는 국내 및 국외에서 거의 이루어지지 않았고, 연구소, 대학, 농원 등에서 가시오갈피의 번식 (삽목 및 조직배양)에 관한 연구가 조금씩 이루어지고는 있으나 만족할 만한 결과는 얻지 못하고 있다. 이에 본 발명자들은 종자를 얻기 어려운 가시오갈피를 번식시키기 위한 연구를 수행한 결과, 체세포배를 이용하면 이를 대량 번식시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 발명이 이루고자하는 기술적 과제 본 발명은 가시오갈피의 뿌리 조직을 배양하여 체세포배를 유기하고, 이로부터 식물체를 재분화시키는 가시오갈피의 번식 방법을 제공함에 그 목적이 있다. 발명의 구성 및 작용 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가시오갈피의 어린 뿌리 조직을 식물생장 조절물질을 첨가한 고체 배지 또는 액체 배지에 배양하여 그의 체세포배를 유기하고, 체세포배 중에서 캘러스를 취 하여 체세포배를 대량 증식시킨 후 체세포배의 단계를 단일화시키고 이를 이용하여 식물체를 재분화시킨 다음 토양 순화 처리과정을 거쳐 이를 토양에 이식시킴에 의하여 가시오갈피를 대량으로 번식시킨다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 우리나라에 분포되어 있는 가시오갈피로부터 그의 체세포 조직 (줄기, 잎, 뿌리 포함)을 얻고 이를 조직 배양하여 우리나라 기후 및 토양에서 종자를 얻기 어려운 가시오갈피를 대량 번식시킬 수 있 는 방법으로, 이는 기존의 연구에서와 같이 외국에서 도입한 미숙 종자를 이용하여 조직배양하거나 식물 체를 유기한 방법과는 구별이 된다. 체세포배는 이를 배양하면 식물체가 될 수 있는 식물 체세포 조직으로부터 생성된 배를 일컫는 것으로 서, 가시오갈피의 여러 조직 부위 중 단지 어린 뿌리 조직만이 체세포배를 형성한다. 우선 체세포배를 얻기 위하여, 가시오갈피의 어린 뿌리 조직을 식물생장 조절물질 등을 포함하는 무라시 지 및 스쿡 (Murashige Skoog, MS) 배지에 배양하여 식물 체세포배를 유기한다 (표 1 참조). 이 때 식 물생장 조절물질로는 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)를 사용하는 것이 바람직하고, 그의 농도 는 mg/l 인 것이 바람직하다. [표 1] 9-2

구체적으로 우리나라에서 가 시오갈피는 매우 고가로 거래되고 있는데, 건조잎 1kg 에 10만원 이상 (강원도 춘성군 물오리 재배농가 김재기, 243-0618)을 호가하고 있다.

3 무라시지 및 수쿡 배지 (1 MS)의 무기염류 농도 매크로영양분 NH 4 NO mg/l KNO 3 CaCl 2 2H 2 O MgSO 7H 2 O KH 2 PO mg/l 440 mg/l 370 mg/l 170 mg/l 미크로영양분 Na 2 EDTA mg/l FeSO 4 7H 2 O MnSO 4 4H 2 O ZnSO 4 4H 2 O H 3 BO 3 KI NaMoO 4 2H 2 O CuSO 4 5H 2 O CoCl 2 6H 2 O mg/l 22.3 mg/l 8.6 mg/l 6.2 mg/l 0.83 mg/l mg/l mg/l mg/l 비타민 글리신 (glycine) 2.0 mg/l 니코틴산 (nicotinic acid) 0.5 mg/l 피리독신 (pyridoxine) 0.5 mg/l 티아민 (thiamine) 1.0 mg/l 미오-이노시톨 mg/l (myo-inositol) 당 설탕 (sugar) 30 g/l *1/4 MS 배지는 매크로영양분과 미크로영양분의 농도를 1/4로 줄인 농도 *비타민과 설탕의 농도는 1 MS 조성과 같은 농도 또한 체세포배를 대량으로 얻기 위하여, 이중에서 체세포배 캘러스를 취하여 체세포배를 대량으로 증식 시킨다. 이 때 상기 표 1 에서 나타난 MS 배지의 조성에서 염의 농도가 1/4 농도로 감소된 MS 배지를 사용하면 체세포배를 더욱 효과적으로 증식시킬 수 있다 (도 3 참조). 또한, 상기 체세포배를 인공 종자로 사용하기 위하여 글로불라 (globular), 하트 (heart), 톨페도 (torpedo), 코틸레돈 (cotyledon), 클럼프 (clump) 등의 여러 단계로 존재하는 체세포배를 생장 조절물 질을 가하여 균일한 단계로 단일화시킨다. 이 때 사용되는 생장 조절물질로는 ABA (abscisic acid) 가 포함되며, ABA 농도는 mg/ml 인 것이 바람직하다. 또한, 그 외에도 체세포배의 단계를 균일화하기 위하여, 설탕 농도를 높여주거나 (Komatsuda et al., 1992 : Plant cell, tissue and organ culture 28 : ), 상기 생장 조절물질 이외에 질산암모늄 (3,4-15 mm)을 가하거나 (Tremblay L. and Tremblay F. M., 1991, Plant science, 79 : ), 오옥신 (auxin) 농도가 낮거나 없는 배지를 사용하는 방법을 이용할 수 있다. 또한, 상기 현탁배양에서 얻은 체세포배를 완전한 식물체로 분화시키기 위하여 체세포배를 생장 조절물 질이 첨가되지 않은 고체 배지 또는 액체 배지로 옮긴다. 이 때 식물체가 분화되는데 필요한 배지에 폴 리아민 (polyamine)을 첨가하면 상기 체세포배가 식물체로 재분화되는 비율이 증가한다 (도 4 참조). 이 때 폴리아민으로 스퍼민 (spermine)과 스퍼미딘 (spermidine) 등을 사용할 수 있다. 상기에서 얻은 체세포배를 MS 배지 등을 이용하여 이식한 경우 식물체가 재분화되어 완전한 식물체로 유기된다 (도 5 참조). 또한 상기에서 재분화된 식물체를 토양에 이식하기 위하여, 다양한 토양을 이용하여 순화 과정을 거쳐 이를 이식하고 가시오갈피의 생존율을 조사한다. 이 때 순화 과정은 광조건하에서 수행되고, 온도에서 일 정도 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 토양으로는 버미큘라이트 (vermiculite) 및 버미큘라이트 : 펄라이트 (perlite) 토양을 사용하는 것이 어린 묘목을 유기하는데 적합하다. 이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 실시예 1 뿌리 조직으로부터 체세포배 유기 조직배양 재료는 가시오갈피의 잎, 어린 뿌리, 줄기 조직을 사용하여 식물 생장 조절물질인 2,4-D, IAA (indole-3-acetic acid), TDZ (Thidiazuron), 키네틴 (Kinetin)의 농도를 달리한 MS 고체 배지에 치상하 였다. 배지는 MS 배지를 기본으로 하여 3%의 설탕 (sucrose)을 완전히 용해시킨 다음 식물생장 조절물 질을 처리하여 사용하였다. 이 때 생장 조절물질을 첨가한 다음 ph 5.7로 조절하고 한천 (agar)을 0.8% 9-3

0 mg/l 니코틴산 (nicotinic acid) 0.5 mg/l 피리독신 (pyridoxine) 0.5 mg/l 티아민 (thiamine) 1.0 mg/l 미오-이노시톨 100.

4 첨가하였다. 각각의 배지는 10ml씩 시험관에 분주하였으며 이를 121, 1.5 기압 이상의 조건으로 15 분간 고압멸균하고 고체 배지로 응고시켜 사용하였다. 이 때 체세포배 캘러스를 형성시키기 위하여 온실에서 재배한 우리나라 가시오갈피의 잎, 뿌리, 줄기 조 직을 사용하는데, 재료들은 온실에서 채취하여 증류수로 2회 세척한 다음 70% 에탄올에 30초 정도 담가 두었다가 멸균수로 세척하고 무균상에서 NaOCl % 용액에 10분 동안 처리하였다. 처리한 재료는 다시 멸균수에 5회 세척한 다음 5mm 5mm 크기로 절단하여 각 실험에 사용되는 배지에 치상하였다. 잎과 줄기 조직을 배양하였을 때에는 체세포배 캘러스는 전혀 형성되지 않고 비체세포배 캘러스가 간헐 적으로 형성됨을 관찰할 수 있었다. 뿌리 조직을 배양했을 때는 2,4-D 4mg/l 첨가된 배지에서는 체세포 배 캘러스가 형성되었고 형성율이 50%로 나타났다. 따라서 본 발명에서는 체세포배 유기에는 뿌리 조직 이 적합하고 2,4-D 가 배지에 첨가되어야 한다는 것을 확인하였다 (도 2 참조). [표 2] 생장 조절물질의 조성에 따른 체세포배 캘러스 형성율 생장조절물질 배양 60일 후 (mg/l) 체세포배 형성수 체세포배 캘러스 형성율 (%) 비체세포배 캘러스 형성율 (%) 2,4-D IAA TDZ 키네틴 실시예 2 체세포배 캘러스의 증식 실시예 1에서 유기된 가시오갈피의 체세포배 캘러스의 증식을 위하여 MS 배지는 염 농도 (salt strength)를 달리하여 3%의 설탕 (sucrose)을 완전히 용해시킨 다음 ph 를 5.7로 조절하고 한천 (agar) 을 0.8% 첨가하여 준비하였다. 이를 121, 1.5 기압 이상의 조건으로 15 분간 고압멸균하고 각각의 배 지를 30 ml씩 페트리 디쉬에 분주하여 고체 배지로 응고시켜 사용하였다. 배양 60일이 경과한 다음 체 세포배 캘러스와 체세포배가 증식한 결과는 표 3에 나타난 바와 같다. [표 3] 기본 MS 배지의 염 농도에 따른 체세포배 증식율과 식물체 재분화율 염강도 농도 배양 60 일 후 체세포배 형성수 체세포배 캘러스 증식율 식물체 재분화율(%) (%) 1/4 MS 배지 a /2 MS 배지 b MS 배지 a : MS 배지의 무기 염류의 농도를 1/4 농도로 줄인 배지 b : MS 배지의 무기 염류의 농도를 1/2 농도로 줄인 배지 그 결과, 염 강도가 낮은 1/4 MS 배지에서 체세포배의 형성율 및 체세포배 캘러스의 증식율이 가장 양호 하였다. 염 농도가 기본인 MS 배지에서는 어뢰형배 형성 및 식물체 재분화의 비율이 높았다. 따라서 가시오갈피의 체세포배를 증식시키기 위하여는 1/4 MS 배지를 사용하는 것이, 식물체 분화를 위하여는 MS 배지를 사용하는 것이 효과적임을 알 수 있었다. 실시예 3 체세포배의 생성 및 증식 증식된 체세포배 캘러스를 이용하여 체세포배를 생성하고 증식시키기 위하여 MS 배지를 기본으로 하여 3%의 설탕 (sucrose)을 완전히 용해시킨 다음 식물생장 조절물질을 처리하였다. 생장조절물질 첨가한 다음 ph 5.7로 조절하고 아가를 0.8% 첨가하였다. 이를 121, 1.5 기압 이상의 조건으로 15분간 고압 멸균하고 각각의 배지는 30 ml씩 페트리 디쉬에 분주하여 고체 배지로 응고시켜 사용하였다. 생장 조절 물질의 조성을 달리한 MS 배지에 배양한 결과는 표 4과 같다. [표 4] 생장 조절물질의 조성에 따른 체세포배 형성수 및 재분화된 식물체수 생장조절물질 (mg/l) 배양 30일 후 9-4

처리한 재료는 다시 멸균수에 5회 세척한 다음 5mm 5mm 크기로 절단하여 각 실험에 사용되는 배지에 치상하였다. 잎과 줄기 조직을 배양하였을 때에는 체세포배 캘러스는 전혀 형성되지 않고 비체세포배 캘러스가 간헐 적으로 형성됨을 관찰할 수 있었다.

5 재분화된 식물체수 2,4-D BA TDZ 그 결과, 생장조절물질인 2,4-D 처리한 다음 식물체 재분화는 전혀 이루어지지 않은 반면, 2,4-D 를 0.1, 1 mg/l 농도로 처리한 경우 체세포 형성율이 매우 양호하게 나타냈다. 그리고, BA (benzyl adenine)를 저농도 BA 0.01mg/l 로 처리한 경우, 체세포배 형성 및 식물체 재분화가 동시에 나타났다. 또한 TDZ 를 처리한 경우 재분화된 식물체가 생성되었고 TDZ 를 고농도인 1mg/l 로 처리한 경우에는 100%의 식물체 재분화율이 나타났다 (도 3 참조 ). 실시예 4 현탁배양을 통한 체세포배 캘러스의 증식 고체 배지에서 형성된 체세포배를 액체배지를 이용하여 현탁배양 시켰다. 현탁배양으로 체세포배 캘러 스를 증식시키기 위하여 MS 배지를 기본으로 하여 3%의 설탕 (sucrose)를 완전히 용해시킨 다음 식물 생 장 조절 물질을 처리하였다. 이 때 생장 조절 물질 첨가한 다음 ph 를 5.7로 조절하였으며 각각의 배지 는 50ml씩 250ml 필라스크에 분주하고 이를 121, 1.5기압 이상의 조건으로 15분간 고압멸균하여 사용 하였다. 생장조절물질의 종류 및 조성을 달리하여 액체 MS 배지에 배양한 결과는 표 5 와 같다. [표 5] 생장 조절물질의 조성에 따른 단계별 체세포배 형성수 생장조절물질 (mg/l) 배양 30일 후 단계별 체세포배 형성수 글로불라 하트 톨페도 코틸레돈 클럼프 합계 (Globular) (Heart) (Torpedo) (Cotyledon) (Clump) 2,4-D IAA 그 결과, 전반적으로 생장 조절 물질로서 IAA 보다 2,4-D 를 처리한 군에서 단계별 체세포배가 더 잘 형 성되었으며 2,4-D 농도가 1mg/l 인 경우에서 가장 많은 체세포배 507개가 형성되었다. 그리고, 체세포 배는 단계별로 형성되었으며 또한 2,4-D 농도 1mg/l에서 어뢰형배가 186개로 가장 많은 형성되었다. IAA 를 1mg/l 농도로 처리한 경우 형성된 체세포 수는 171개였으나 2,4-D 를 1mg/l 농도로 처리한 경우 507개의 체세포배가 형성되었다. 따라서 2,4-D 가 첨가된 배지에서 체세포배가 3배 더 많이 형성되는 것을 발견하였고 액체배지에서 체세포배가 형성되는데도 2,4-D 농도 1mg/l, 2mg/l가 적합하였다. 이러 한 결과는 액체배지를 사용하여 500ml, 1l, 2l 등의 큰 용기를 사용하여 체세포배를 형성시켜 대량 사용 하는 경우 및 생물반응기와 같은 대용량의 용기를 사용하는 경우에서 유용한 실험의 기초 자료 및 실제 자료가 될 것이다. 실시예 5 폴리아민 처리에 의한 식물체 재분화 현탁배양에서 형성된 체세포배로부터 식물체를 얻으려면 생장 조절 물질이 첨가되지 않은 MS 고체 배지 또는 기본 액체배지를 사용하여야 하는데, 본 실시예에서는 체세포배를 분화시키기 위해 MS 배지를 기본 으로 하여 3%의 설탕 (sucrose) 을 완전히 용해시킨 다음 스퍼민 (spermidine)과 스퍼미딘 (spermidine) 을 농도를 달리하여 처리하였다. 이 때 ph 를 5,7로 조절하고 각각의 배지는 50ml씩 250ml 플라스크에 분주하였으며, 이를 121, 1.5기압 이상의 조건으로 15분간 고압멸균하여 사용하였다. 체세포배를 기 본배지와 기본배지에 폴리아민 종류인 스퍼민과 스퍼미딘의 조성을 달리한 액체 MS 배지에 배양한 결과 는 표 6에 나타난 바와 같다. [표 6] 9-5

또한 TDZ 를 처리한 경우 재분화된 식물체가 생성되었고 TDZ 를 고농도인 1mg/l 로 처리한 경우에는 100%의 식물체 재분화율이 나타났다 (도 3 참조 ). 실시예 4 현탁배양을 통한 체세포배 캘러스의 증식 고체 배지에서 형성된 체세포배를 액체배지를 이용하여 현탁배양 시켰다.

6 폴리아민 처리에 의한 식물체 재분화 생장조절물질 (mg/l) 배양 6주 후 재분화된 식물체 수 대조군 스퍼민 스퍼미딘 그 결과, 폴리아민을 처리하지 않은 50 ml 기본 액체 MS 배지 첨가 250 ml 플라스크에서는 359개의 식물 체가 재분화되었으나, 스퍼민 5mg/l 또는 스퍼미딘 5 mg/l를 처리한 플라스크에서는 1100개 이상의 식물 체가 분화되어 기본 액체배지만 사용한 경우 보다 4배 이상의 식물체가 재분화되었다. 스퍼민 또는 스 퍼미딘 10mg, 20mg을 처리한 경우에도 900개 이상의 식물체가 재분화되어 이를 처리하지 않은 경우보다 2.7배 이상의 식물체가 재분화되었다. 따라서 본 발명은 현탁배양으로 얻은 가시오갈피의 체세포배를 4 배 이상의 식물체로 재분화시키는 획기적인 결과로서 국내 및 국외에서 처음 보고되는 것이다 (도 4 참 조). 실시예 6 체세포배의 단일화 현탁배양에 의하여 형성되는 체세포배로 인공종자를 만들기 위하여 글로불라 (globular), 하트 (heart), 톨페도 (torpedo) 등의 여러 단계의 체세포가 형성되는 것을 균일한 단계의 체세포로 단일화 시켜야 한 다. 따라서, 본 실시예에서 MS 배지를 기본으로 하여 3%의 설탕 (sucrose)를 완전히 용해시킨 다음 ABA 농도를 달리하여 처리하였다. 이 때 배지는 ph 를 5.7로 조절하고 각각의 배지는 50ml씩 250ml 플라스 크에 분주하며 이를 121, 1.5기압 이상의 조건으로 15 분간 고압멸균하여 사용하였다. 체세포배를 ABA 조성을 달리한 액체 MS 배지에 배양한 결과는 표 7에 나타난 바와 같다. [표 7] ABA 처리에 의한 단계별 체세포배 형성수 생장조절물질 (mg/l) 배양 30일 후 단계별 체세포배 형성수 하트 톨페도 코틸레돈 크럼프 ABA 그 결과, ABA 를 저농도인 0.01mg/l 로 처리한 경우 거의 모든 체세포배가 식물체로 분화되어 체세포배 상태로 남아있는 비율이 낮았으나, ABA 를 0.01, 0.1, 0.5mg/l 농도로 증가시켜 처리한 경우 거의 모든 체세포배가 톨페도 상태의 어뢰형배로 균일화되는 결과를 나타냈다. 따라서 체세포배를 단일화 시키기 위하여 ABA 를 0.5mg/l 농도로 처리하는 것이 가장 적합함을 확인하였다. 이러한 결과는 가시오갈피의 체세포배를 균일화하는 과정에 매우 귀중한 자료로 사용될 것이다. 실시예 7 토양순화 처리에 의한 식물체 재분화 체세포 배의 조직배양을 통하여 성장한 재분화 식물체를 토양에 이식한 다음 그의 생존율을 조사하기 위 하여, 식물체를 세척한 다음 상토, 훈탄, 버미큘라이트(vermiculite), 펄라이트 (perlite), 버미큘라이 트와 펄라이트를 1:1 로 혼합된 토양으로 이식하였다. 이를 이식한 다음 23, 16시간 광조건하에서 순 화를 거쳤다. 20일 간의 순화과정을 거쳐 온실로 옮겼고 생존한 식물체를 조사하였다. [표 8] 토양순화 처리에 의한 재분화된 식물체의 생존율 토양 재분화된 식물체의 생존율 ( % ) 상토 50.0 훈탄 50.0 버미큘라이트(Vermiculite) 78.6 펄라이트 (Perlite) 50.0 버미큘라이트 + 펄라이트 82.1 그 결과, 버미큘라이트 : 펄라이트를 1:1 로 혼합한 토양에서 82.1% 의 재분화된 식물체가 순화되어 어 9-6

스퍼민 또는 스 퍼미딘 10mg, 20mg을 처리한 경우에도 900개 이상의 식물체가 재분화되어 이를 처리하지 않은 경우보다 2.7배 이상의 식물체가 재분화되었다. 따라서 본 발명은 현탁배양으로 얻은 가시오갈피의 체세포배를 4 배 이상의 식물체로 재분화시키는 획기적인 결과로서 국내 및 국외에서 처음 보고되는 것이다 (도 4 참 조).

7 린 묘목으로 생성되었으며 버미큘라이트의 토양에서도 78.6% 의 재분화된 식물체의 생존율이 나타났다. 그리고, 펄라이트의 토양에서는 50.0% 의 생존율을 나타났지만 상토, 훈탄의 토양보다는 양호하게 묘목 을 형성하였다. 따라서, 기내에서 재분화된 식물체는 토양순화 과정을 거쳐 어린 묘목으로 유지될 수 있음을 확인하였다. 발명의 효과 본 발명에서는 가시오갈피를 조직 배양함으로써 체세포배를 유기하고 이로부터 식물체를 재분화시켜 토 양에 효과적으로 이식함으로써, 종자가 맺히기 않고 삽목이 잘 되지 않아 번식에 많은 어려움이 있는 가 시오갈피의 종묘를 대량으로 생산할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 방법은 6주 만에 250ml 플라스크 1 개에서 1000개 이상의 식물체를 얻을 수 있어 가시오갈피를 빠른 시간내에 대량 번식시키는데 적합한 획 기적인 방법이다. (57) 청구의 범위 청구항 1 가시오갈피의 조직을 배양하여 체세포배를 유기하고, 체세포배 중 체세포배 캘러스를 취하여 체세포배를 대량 증식시킨 다음, 체세포배의 단계를 단일화시켜 식물체를 재분화시키고 이를 토양에 이식시키는 가 시오갈피의 번식 방법. 청구항 2 제 1항에 있어서, 가시오갈피의 조직은 어린 뿌리 조직인 것을 특징으로 하는 번식방법. 청구항 3 제 1항에 있어서, 체세포배를 식물 생장조절물질이 포함된 고체 배지 또는 액체 배지를 이용하여 유기하 는 번식방법 청구항 4 제 3항에 있어서, 배지에 식물생장 조절물질은 mg/l 농도 범위의 2,4-D 인 것을 특징으로 하 는 번식방법. 청구항 5 제 1항에 있어서, 체세포배를 증식시키는데 염의 농도가 MS 배지의 1/4 농도인 MS 배지를 사용하는 번식 방법 청구항 6 제 1항에 있어서, 체세포배의 단계는 생장 조절물질을 처리한 배지를 사용하여 단일화시키는 번식방법 청구항 7 제 6항에 있어서, 생장조절물질은 ABA 를 포함하는 번식방법 청구항 8 제 1항에 있어서, 폴리아민을 포함하는 배지를 사용하여 식물체를 재분화시는 번식방법. 청구항 9 제 8항에 있어서, 폴리아민은 스퍼민 및 스퍼미딘을 포함하는 번식방법. 청구항 10 제 1항에 있어서, 토양 순화 과정을 광조건하 온도에서 시간 동안 처리하여 토양에 이식하는 번식방법. 도면 9-7

구체적으로 본 발명의 방법은 6주 만에 250ml 플라스크 1 개에서 1000개 이상의 식물체를 얻을 수 있어 가시오갈피를 빠른 시간내에 대량 번식시키는데 적합한 획 기적인 방법이다.

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9 도면4 도면5 도면6 9-9

특허청구의 범위 청구항 1 구제역이나 에이아이(AI) 감염에 의해 살 처분된 가축 매몰지의 붕괴나 침출수 유출에 의한 제2차 오염을 방 지하기 위한 방제방법에 있어서, 매몰지 내부에 고화제(Firming agent) 및 첨가물질이 주입되도록 통로를 형성하기 위한 천공단

특허청구의 범위 청구항 1 구제역이나 에이아이(AI) 감염에 의해 살 처분된 가축 매몰지의 붕괴나 침출수 유출에 의한 제2차 오염을 방 지하기 위한 방제방법에 있어서, 매몰지 내부에 고화제(Firming agent) 및 첨가물질이 주입되도록 통로를 형성하기 위한 천공단 (19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) (51) 국제특허분류(Int. Cl.) B09B 1/00 (2006.01) C09K 17/00 (2006.01) E02D 31/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2011-0016170 (22) 출원일자 2011년02월23일 심사청구일자 전체 청구항 수 : 총 9 항 2011년02월23일 (11)