대표나노물질을이용한위해분석방법연구 A pilot study of risk assessment strategies using representative manufactured nanomaterials 식품의약품안전처 또는 식품의약품안전평가원

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1 대표나노물질을이용한위해분석방법연구 A pilot study of risk assessment strategies using representative manufactured nanomaterials 주관연구기관 연구책임자 동아대학교 조완섭 발행년월 주관부처 사업관리기관 NDSL URL 식품의약품안전평가원 식품의약품안전처 IP/ID 이용시간 2018/05/19 15:43:37 저작권안내 1 NDSL 에서제공하는모든저작물의저작권은원저작자에게있으며, KISTI 는복제 / 배포 / 전송권을확보하고있습니다. 2 NDSL 에서제공하는콘텐츠를상업적및기타영리목적으로복제 / 배포 / 전송할경우사전에 KISTI 의허락을받아야합니다. 3 NDSL 에서제공하는콘텐츠를보도, 비평, 교육, 연구등을위하여정당한범위안에서공정한관행에합치되게인용할수있습니다. 4 NDSL 에서제공하는콘텐츠를무단복제, 전송, 배포기타저작권법에위반되는방법으로이용할경우저작권법제 136 조에따라 5 년이하의징역또는 5 천만원이하의벌금에처해질수있습니다.

2 대표나노물질을이용한위해분석방법연구 A pilot study of risk assessment strategies using representative manufactured nanomaterials 식품의약품안전처 또는 식품의약품안전평가원

3 과제번호 위해분 826 용역연구개발과제최종보고서 단위과제명 과제명 국문 영문 3) 위해분석기술과학화 대표나노물질을이용한위해분석방법연구 A pilot study of risk assessment strategies using representative manufactured nanomaterials 주관연구기관주관연구책임자 기관명 소재지 기관장 동아대학교 부산시사하구하단 2동 권오창 성명 소속및부서 전공 조완섭 생명자원과학대학의약생명공학과 수의학 총연구기간 2013 년 02 월 01 일 ~2013 년 11 월 30 일 (10 개월 ) 총연구개발비 50,000 천원 연구년차연구기간연구개발비 1 차년도 2013 년 02 월 01 일 ~2013 년 11 월 30 일 50,000 천원 2 차년도년월일 ~ 년월일천원 관계규정과모든지시사항을준수하면서이용역연구개발연구사업을성실히 수행하고자다음과같이용역연구개발과제최종보고서를제출합니다 년 11 월 4 일 주관연구책임자 : 조완섭 ( 서명또는인 ) 주관연구기관장 : 권오창 ( 직인 ) 식품의약품안전처장또는식품의약품안전평가원장귀하

4 제출문 식품의약품안전처장 / 식품의약품안전평가원장귀하 이보고서를 대표나노물질을이용한위해분석방법연구 ( 동아대학교 / 조완 섭 ) 과제의최종보고서로제출합니다 주관연구기관명 : 동아대학교 주관연구책임자 : 조완섭 I

5 목 차 Ⅰ. 총괄연구개발과제요약문 1. 국문요약문 2. 영문요약문 Ⅱ. 총괄연구개발과제연구결과제1장총괄연구개발과제의연구목적및필요성 1. 총괄연구개발과제의목표 2. 총괄연구개발과제의목표달성도 3. 총괄국내 외기술개발현황 4. 총괄연구개발과정에서수집한국외과학기술정보제2장총괄연구개발과제의연구내용및방법 1. 대표나노물질의선정 2. 대표나노물질에관한독성시험자료분석및추출 3. 나노입자의 dose metric 결정 4. 독성자료를위한위해평가 5. 대표나노물질에관한 risk profile 작성 6. 나노물질의위해분석법의활용방안제시제3장총괄연구개발과제의최종결과및고찰 1. Pubmed 분석을통한연구현황파악 2. 대표나노입자의투여경로별독성시험자료의추출및분석제4장총괄연구개발과제의연구성과 1. 총괄활용성과제5장총괄주요연구변경사항제6장총괄참고문헌 II

6 총괄연구개발과제연구결과

7 Ⅰ. 총괄연구개발과제요약문 과제명 대표나노물질을이용한위해분석방법연구 주관연구기관동아대학교주관연구책임자조완섭 연구기간 2013 년 02 월 01 일 ~2013 년 11 월 30 일연구비 ( 원 ) 50,000,000 저자 성명조완섭정지영김정은 소속생명자원과학대학의약생명공학과생명자원과학대학의약생명공학과생명자원과학대학의약생명공학과 대표나노물질의선정 - Pubmed 등의문헌검색을통해서나노물질에관한안전성평가자료를조사한결과 TiO 2 와 ZnO 나노입자가가장많이연구되고있었으며, 이미시판되고있는제품이있어서 TiO 2 와 ZnO 를대표나노물질로선정하였다. 특히 TiO 2 는독성이거의없는물질로알려져있고 ZnO 는독성이강한것으로알려져있기때문에두종의나노입자를서로비교할수있는좋은모델이될수있을것으로판단되었다. 또한 crystalline silica 에대한데이터를추출하여양성대조군물질로비교연구하였다. 대표나노물질에관한독성시험자료추출및분석 - 선정된대표나노물질에관해서노출경로별 ( 경구투여, 피하투여, 흡입투여 ) 독성시험자료를확보하였으며, 데이터를이용하여위해분석을실시하였다. 경구투여의경우 TiO 2 는매우낮은흡수율을보였으며, 그결과입자에의한독성이관찰되지않았다. ZnO 의경우는위내에서위산에의해빠른융해를보였으며, 그결과 TiO 2 보다높은흡수율과 Zn 이온에의한췌장염등의독성이관찰되었다. 그러나 ZnO 가독성을유도하는독성의농도가 268 mg/kg bw 으로매우높은농도에서만독성이유도되었다. 피하투여에의한독성자료분석에서 TiO 2 와 ZnO 모두피부의진피를투과할수없었으며표피세포에서도유효한독성이관찰되지않았다. 따라서 TiO 2 와 ZnO 에관하여 ADI 설정이필요하지않는것으로판단되었다. 추출한나노물질독성자료에서나노물질의적합한 dose metric 결정 - 흡입독성자료를이용하여나노입자의 dose metric 을용량 - 반응곡선 (dose-response curve) 에적용하였을때질량 (mass dose) 보다표면면적 (surface area dose) 가더높은상관성을보였다. 따라서흡입의경로에서는표면면적이적합한 dose metric 으로관찰되었다. 경구투여와피하투여에서는독성이있는시험이거의없었기때문에적절한 dose metric 을구하기가불가능하였다. 추출한자료를이용한위험성확인 - 위험성확인 (harzard identification): 추출한자료를바탕으로각각의독성시험결과로부터독성의종류및정도, 최대무작용량 (NOAEL) 혹은최대저작용량 (LOAEL) 을확인하였다. - 독성시험자료의평가및정리 (risk profiling): 수집한독성정로를근거로확인된독성의종류, 유전독성의유무등을요약정리하였다. 추출한독성자료를바탕으로한용량 - 반응평가 - 각개별적시험에서의용량 - 반응평가뿐만아니라추출한모든데이터를이용한전체적인용량반응평가를수행하였다. 노출평가 ( 노출평가자료가있는경우에한함 ) - 인체노출자료는없었으며, 동물시험데이터를바탕으로 ADI 설정을수행하였다. 위해분석법의제시및활용방안제시 중심단어나노물질위해분석위험성확인일일허용기준량용량반응평가 1

8 주관연구책임자의견 연구의범위 본연구는대표나노물질 2종과대조물질 1종을이용하여나노입자 의위해분석에관한연구를수행하였다. 연구의한계점 본연구를통해서얻어진자료들은보고서와논문에서추출한자료이며, 모든종류의나노입자를다루지는못하였다. 또한선정된논문에서추출한자료또한그나노입자를대표할수있다고는말하기어렵다. 인용시주의사항 본보고서를인용하고자하시는분은주관부서에연락하시기바랍 니다. 주관부서연락처 식품의약품안전처 / 식품의약품안전평가원식품위해평가과 ( ~4506) 2

9 Summary Title of Project A pilot study of risk assessment strategies using representative manufactured nanomaterials Institute Dong-A University Project Leader Wan-Seob Cho Project Period Project Budget MFDS Authors Name W an-seob Cho Jiyoung Jeong Jeongeun K im Institute Dong-A University Dong-A University Dong-A University Selection of test nanomaterials - As test nanomaterials, TiO2 and ZnO were chosen based on the number of published literatures. TiO 2 was known as a less toxic nanomaterials whilst ZnO was known as a highly toxic nanomaterials. In addition, crystalline silica was chosen for a reference particle. The extraction and analysis of the toxicity data from the published literatures - Using selected nanomaterials, the toxicity data were extracted at the different time-point as well as various exposure routes (ingestion, skin contact, and inhalation). When nanomaterials were ingested, nanomaterials showed very low absorption rate. In addition, the low solubility nanomaterial (TiO 2 ) showed poorer absorption rate than the high solubility nanomaterials (ZnO). In accordance with the absorption rate, TiO 2 showed no toxicity even at the highest dose, ZnO showed toxic effects (pancreatitis) at 268 mg/kg bw by the role of dissolved Zn ions. Topical application of both nanomaterials showed neither penetration into the dermis nor cellular changes in the epidermis. Therefore, there was no reason for setting average daily intake (ADI) of TiO 2 and ZnO for topical application. Evaluation of dose metric using extracted data -The lung toxicity data using a intratracheal instillation method were extracted and the number of polymorphonuclear leukocytes was plotted against the dose metric including mass dose and surface area dose. As a result, the surface area dose metric showed better correlation coefficient than those of mass dose metric. Therefore, the appropriate dose metric for inhalation was surface area metric. Unfortunately, the dose metric for ingestion and topical application could not be evaluated because of lack of toxicities induced by those exposure routes. Harzard identification of nanomaterials - Harzard identification: no observed adverse effect level (NOAEL) or lowest observed adverse effect levels were identified using a published literatures. -Risk profiling: Toxicity data were described in this report based on the published literatures. Evaluation of dose response relationship - Evaluation of dose response relationship was performed using grouped data as well as full individual data. Exposure assessment (just in case when the data available) - The data for human exposure assessment data were not available. Therefore, ADIs were setted using animal data. Suggestion of risk analysis and future applications. harzard Average daily dose response Key Words nanomaterials risk analysis identification intake relationship 3

10 Opinion of Principal Investigator Scope The risk analysis was performed using two representative nanomaterials and one reference particle. Limitation The data used here were limited to two test nanomaterials and one reference particle and sources were both reports and published literatures. Therefore, other types of nanomaterials were not used and the particles used in this study cannot represent all kinds of nanomaterials having same composition. Direction For Citation Please contact to the supervisory office before citation. Supervisory Office Ministry of Food and Drug Safety/Institution of Food and Drug Safety Evaluation ( ~4506) 4

11 Ⅱ. 총괄연구개발과제연구결과 제1장총괄연구개발과제의목적및필요성 1 총괄연구개발과제의목표가. 연구의배경 (1) 나노기술의발전 나노물질이란물질의표면중최소한한면이 nm 범위의크기를가지는물질을일반적으로정의하며, 벌크형태의큰물질이나노크기로이루어졌을경우다양한물리 화학적특성을가지게됨. 이러한독특한물리 화학적특성이변화되는대표적인나노물질의성질은아래와같음. - 크기 : 크기는나노물질의대표적인특성인자이며, 나노크기의물질은세포막을쉽게통과하거나유전자에변형을유발하는유전독성이있음이보고되고있음 1). - 모양 : 나노물질의모양은생체및세포와의반응에서매우중요한인자임. 예를들어서막대모양의금나노입자의경우자기장의영향에의해열을발생하며, 이를이용하여열치료 (thermal therapy) 기법을암치료에적용할수있고 2), 침상형태의긴나노물질 (high aspect ratio nanomaterials) 의경우매우강한강도를가지며다양한진단용센서로서활용할수있으나, 최근의연구결과에의하면중피종과같은암을유발할수있음이보고되었음 3). - 표면면적 : 동일한질량기준에서입자의크기가작아짐에따라서물질의전체표면면적은기하급수적으로증가함. 증가하는입자의표면면적은입자의불용성으로인해서생체와접촉하는면이됨. 따라서입자의표면면적이증가할수록생체와의반응도증가하게됨 4). - 영상효과 : quantum dot 처럼나노물질자체가형광을나타내며형광의파장을물질의크기로조절할수있는물질이있으며, 또한유기형광물질 (organic fluorescence dye) 을 silica 등으로코팅하거나나노물질의표면에붙일수있음. 형광나노물질은 photo-bleaching 이거의없기때문에형광을통해서 1) Donaldson K, Poland CA, Schins RP., Possible genotoxic mechanisms of nanoparticles: criteria for improved test strategies. Nanotoxicology. 2010, 4: ) Tietze R, Lyer S, Dürr S, Alexiou C., Nanoparticles for cancer therapy using magnetic forces. Nanomedicine (Lond) Mar;7(3): ) Poland CA, Duffin R, Kinloch I, Maynard A, Wallace WA, Seaton A, Stone V, Brown S, Macnee W, Donaldson K., Carbon nanotubes introduced into the abdominal cavity of mice show asbestos-like pathogenicity in a pilot study., Nat Nanotechnol Jul;3(7): ) Oberdörster G, Oberdörster E, Oberdörster J., Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles., Environ Health Perspect Jul;113(7):

12 나노물질을이용한질병의진단 ( 체외진단및생체진단 ) 이나생체내분포를보다효율적으로확인할수있음. - 불용성 : 일반적으로나노물질은벌크화학물질에비하여생체내조건에서매우안정적으로존재할수있으며, 이러한성질을이용해서나노물질을약물전달체로이용하거나진단및치료물질 ( 조영제, 조영제 + 항암제 ) 로활용할수있음. 그러나일부나노물질의경우강한산성 ( 세포내의리소좀혹은위산등 ) 에서이온화된다는보고도있음 5). - 표면전하 : 나노물질의표면은다양한처리가가능하며, 이에따라서표면전하의변화도변화됨. 나노물질표면전하의변화는나노물질이전하를가지는생체내물질 ( 단백질, 지질등 ) 과의반응성이증가하며, 전기적친화성으로인해서생체내투여된나노물질의경우단백질코로나를형성하거나음전하를띄는세포막과의반응이증가하게됨. 이러한나노물질의고유한물리 화학적특성으로인해서최근에개발되는나노물질의종류와생산량은기하급수적으로증가하고있음. 또한나노물질의표면특성을변형하고제어함으로써생산될수있는나노물질의종류는셀수없을정도로증가하게되어있으며, 이러한제어방법이활발히연구되고있음. 식품의약품안전처과관련된나노기술의응용분야 - 나노의약품 ( 진단조영제 - imaging agent, 항암제 - drug carrier, 진단치료제 - theragnosis agent): 현재까지미국 FDA 에허가과정에들어가있는나노물질의현황중대표적인물질은표 1 과같음. 표 1. 미국 FDA 에인허가과정에있는나노기술적용제품현황 (Bawa B, 2008) 6) 구성 이름 적용증 US FDA 단계 약물전달체 -liposome 혹은 micelles 등 Liposomal doxorubicin Myocet, Caelyx(Doxil) Breast, Ovarian, KS 1 Approved Liposomal daunorubicin Daunoxome KS 1 Approved 5) Cho WS, Duffin R, Thielbeer F, Bradley M, Megson IL, Macnee W, Poland CA, Tran CL, Donaldson K., Zeta potential and solubility to toxic ions as mechanisms of lung inflammation caused by metal/metal oxide nanoparticles., Toxicol Sci Apr;126(2): ) R. Bawa, Nanotechnol. Law Busin.2008, 5,

13 구성 이름 적용증 US FDA 단계 약물전달체 -liposome 혹은 micelles 등 Liposomal vincristine Onco-TCS NHL 2 Approved Liposomal cisplatin SPI-77 Lung Phase II Liposomal lurtotecan OSI-211 Ovarian Phase II Cationic liposomal c-raf AON LErafAON Various Phase I/II Cationic liposomal E1A pdna PLD-E1A Breast, ovarian Phase I/II Thermosensitive liposomal doxorubicin ThermoDox Breast, liver Phase I Albumin-paclitaxel Abraxane Breast Approved Albumin-methotrexate MTX-HSA Kidney Phase II Dextran-doxorubicin DOX-OXD Various Phase I PEG-L-asparaginase Oncaspar Leukemia Approved PEG-IFN2a/-IFN2b PegAsys/PegIntro n Melanoma, leukemia Phase I/II PHPMA-doxorubicin PK1 Breast, lung, colon Phase II Galactosamine-trageted PK1 PK2 Liver Phase I/II PGA-paclitaxel Xyotax Lung, ovarian Phase III Paclitaxel-containing polymeric micelles Cisplatin containing polymeric micelles Doxorubicin containing polymeric micelles SN38-containing polymeric micelles Genexol-PM Breast, lung Phase II Nanoplatin Various Phase I NK911 Various Phase I LE-SN38 Colon, colorectal Phase I 90 Yttrium-Ibritumomab tiuxetan Zevalin NHL Approved DTA-IL2 fusion protein Ontak T-cell lymphoma Approved Ozogamycin-gemtuzumab Mylotarg Leukemia Approved Doxorubicin-cBR96 SGN-15 Lung, prostate, breast Phase II 치료제-금속나노물질 Colloidal AuNP coupled to Aurimmune Solid tumors Phase II 7

14 TNF and PEG-Thiol (CYT-6091) Gold-coated silica nanoparticles AuroShell Solid tumors Phase I 조영제 Endorem Superparamagnetic iron oxides Ultrasmall superparamagnetic iron oxides 1 KS, Kaposi sarcoma 2 NHL, Non-hodgkin lymphoma Resovist Sinerem Feridex Cliavist Combidex Liver imaging ganglion tropism Approved Approved - 나노식품 : 나노기술을식품원료나포장제등에적용하는것은최근에진행되고있으며, 나노의약품에비하여상대적으로개발이활발히진행되고있지는않음. 그러나한국을중심으로한아시아국가에서는나노식품에관심이매우높음. 아직까지많은연구는진행되고있지않으나최근에는나노물질을경구투여하였을때발생하는독성이나체내분포에관한연구가비교적활발히진행되고있음 ( 표 2 참고 ). 표 2. 나노물질의경구투여에관한연구결과요약 나노물질종류시험종류독성결과참고문헌 SiO 2 90 일반복투여독성이관찰되지않음. TiO 2 90 일반복투여독성이관찰되지않음. ZnO 90일반복투여 췌장염, 빈혈성혈청생화학수치변화 Ag 90일반복투여 독성이관찰되지않음. 식약청연구용역 보고서 Fe 2 O 3 90 일반복투여독성이관찰되지않음. C 60 14일반복투여 독성이관찰되지않음. ZnO 14일반복투여 간, 췌장, 심장, 위장에병변관찰 Ag 28일반복투여 독성이관찰되지않음. Cu nanoparticle 급성독성시험 신장, 간장, 비장에병변관찰 J Toxicol Sci. 2012;37(2): Toxicol Ind Health. 2012, 28(8): Arch Toxicol. 2012, 86(4): Toxicol Lett. 2006, 25;163(2):

15 - 나노화장품 : 나노기술이적용되는대표적인화장품분야로는자외선차단제 (sunscreen) 나기능성 화장품분야가있음 ( 표 3) 표 3. 화장품분야에활용되는나노기술요약 나노물질종류 제품명 제조회사 비고 TiO 2 Applied therapeutics sunscreen Applied Therapeutics TiO 2 Babe/enfant high protection SPF50 Mustela TiO 2 Chemical-free sunscreen SPF15 Burt s bee TiO 2 Cotz SPF58 Fallene TiO 2 Dermatone SPF20 natural fomula Dermatone Laboratories TiO 2 IS clinical SPF20 moisturizing sunscreen Innovative Skincare TiO 2 Kids tear free SPF30 Banana Boat TiO 2 Physical UV defense SPF30 SkinCeuticals TiO 2 Soltan face sun defence cream- optisol Boots and Oxonica TiO 2 Spectra3 SPF50 Coppertone TiO 2 SunVex dailywear lotions SunVex Fullerene OMG serum Sircuit Cosmeceuticals Fullerene Sircuit addict version 1.0 Sircuit Cosmeceuticals Fullerene Fullerene C-60 day cream Zolens Fullerene Fullerene C-60 eye cream Zolens Fullerene Fullerene C-60 night cream Zolens ZnO Applied therapeutics sunscreens Applied therapeutics ZnO Bebe/enfant high protection SPF50 Mustela ZnO Cotz SPF58 Fallene ZnO Daily sun defens SPF20 SkinCeuticals ZnO Physical UV defense SPF30 SkinCeuticals ZnO Sport UV protection SPF45 SkinCeuticals ZnO Dermatone SPF20 natural fomula Dermatone Laboratories ZnO IS clinical SPF20 moisturizing sunscreen Innovative Skincare - 체외진단분야 : 나노기술의우수한감지 (sensing) 기능으로인해서나노기술은채외진단분야에매 우폭넓게응용되고있음. 9

16 현재까지많이알려진나노제품이외에도실험실수준에서개발되고있는나노물질의종류는헤아릴수없을정도로많을것으로예상되며, 이러한나노물질의활발한개발은가까운시기에일반대중에노출을가속화시킬것이확실함. 또한나노물질의연간생산량은매년지속적으로증가하고있으며적용분야도광범위해지고있으며주요한나노물질의 2009 년생산량은아래와같음 ( 출처 : 환경부 2010, 나노물질인벤토리구축방안연구 ). - 이산화티타늄 (TiO 2 ): 3,902 톤 / 년 코팅제, 화장품, 페인트등 - 실리카 (SiO 2 ): 4,779 톤 / 년 식품, 의약품, 화장품 - 산화아연 (ZnO): 12 톤 / 년 의약품, 화장품, 섬유, 가정용품등 - 탄소나노튜브 (CNT): 3 톤 / 년 의약품, 섬유, 가전제품등 - 은나노 (Ag): 0.3 톤 / 년 식품, 의약품, 포장재, 섬유, 스포츠등 (2) 위해평가의필요성 이미많은식품의약품안전처관련제품이인허가를받아서시장에서활용되고있으나대부분의제품의경우는 나노기술 을적용한제품으로인허가를받은것이아니라기존의화학물질의기준에따라서인허가를받은제품임. 그러나지금까지연구결과에의하면나노물질은고유한물리 화학적특성으로인해서기존의물질과는다른독성을발생시킬수있으며, 예상하지못한독성을보일수도있기때문에특별한주의가필요함이보고되고있음 ( 그림 1). 그림 1. 나노물질의물리 화학적특성과생체반응과의상관관계. 10

17 이미국제기구 (WHO, OECD, ISO) 와선진국 ( 미국, 유럽, 일본등 ) 에서는나노제품의사용에대한인체및환경에미치는영향에관한위해평가의중요성을인식하고있으며, 나노물질을기존의화학물질위해평가기술로적용할수있는지에관한조사를수행하고있음. 또한향후시장에나올가능성있는나노제품에대한규제를위한법률을마련하기위한작업을진행중에있음. - 스위스 : 나노폐기물관리지침 - 미국 : 농약법및독성물질관리법 - 독일 : 식품및사료법 우리나라는식품의약품안전처식품의약품안전평가원에서 2011 년에나노기술발전시행계획마련을통해서나노기술적용식품및의약품의안전관리를위한과학적위해평가기반마련전략을추진하고있음. 나노물질의위해평가를위해서는나노물질의물리 화학적특성정보, 나노물질의 ADME( 흡수, 분포, 대사, 배설 ) 정보, 용량 -반응관계를입증할수있는독성시험자료, 그리고실제인체에노출될수있는노출상황에관한광범위한자료가필요함. 따라서본연구는가까운미래에식품 의약품으로제품화될가능성이높고독성시험데이터가가장많은대표나노물질을선정하여위해평가에관한 pilot study 를수행하고자함. 본과제를통해서나노물질의위해평가를수행하고향후제품화될수있는제조나노물질에관한위해평가전략을마련하고자함. 나. 연구의목적 본연구는식품및의약품관련제품에적용가능하고가까운미래에제품화될가능성이높은나노물질을선정하고기존의안전성자료를이용하여위해분석에관한 pilot study 를수행함으로써나노물질에관한위해분석전략을마련하고자함. 본연구목표를위해서아래와같은연구방법론을적용하고자함. - 대표나노물질의선정 : Pubmed 등의문헌검색을통해서나노물질에관한안전성평가자료를확보하고, 식품의약품안전처에서연구용역으로수행한나노물질의안전성관련자료를수집하여독성시험자료가많고, 가까운미래에제품으로개발될가능성이높은대표나노물질을선정함. - 대표나노물질에관한독성시험자료추출및분석 : 선정된대표나노물질에관해서노출경로별독성시험자료를확보함. 대표적인노출경로로는흡입 ( 기관지내삽입투여포함 ), 경구, 경피, 및혈관내투여경로가있으며, 각각에대한자료를확보함. 대부분의나노물질을이용한안전성평가데이터는그림의형태로제시되고있기때문에본연구에서는이러한자료를수치화하는프로그램을이용하여자료를추출함. - 추출한자료를이용한위해분석수행 : 추출한자료를이용한다양한실험적인방법을이용하여위 11

18 해분석을수행할뿐만아니라잘확립된방법을이용한노출경로별일일허용노출량등을산출함. - 위해분석법의제시및활용방안제시 : 나노물질의위해분석법에제시및활용방안제시. 다. 연구의범위 선행연구결과1: 나노물질의독성을기준으로한분류법확립 - 나노물질의독성자료추출방법확립 : Grab It! XP(Datatrend Software, Raleigh, NC, USA) 프로그램을이용하여이미출판된논문에서그래프만으로제시된데이터를수치화함 ( 그림 2). 그림 2. Grab It! XP 프로그램을이용하여그래프형태의자료를수치화하는예. - 나노물질의염증데이터를처리한나노물질의표면면적농도로나누어줌으로써다양한나노물질의염증유발에서농도의효과를최소화 (normalization) 함. 나노물질의염증유발능력을투여한표면면적농도로나눈값을 SSAGI(specific surface area generated inflammation) 라고함. - SSAGI를기준으로한 Non-hierarchical clustering 분류법 : 총 84 건의나노물질의폐장염증자료를확보였으며 SSAGI 수치를이용하여 non-hierarchical clustering 방법을이용하여통계적으로나노물질의염증유발능력에따라서그룹을구분함 ( 그림 3). SSAGI unit 에기초하여분류된 3개의그룹은 low toxicity (SSAGI: 0 ~ 55), medium toxicity (SSAGI: 58 ~ 181), high toxicity (SSAGI: 207 ~ 423) 로구분할수있었으며세부적인분류결과는표 4와같음. 12

19 그림 3. 나노물질의염증유발능력을대상으로 non-hierarchical clustering 을수행. A: 총 84 개의나노물질독성자료를추출하였으며 ( 왼쪽 ), 이를처치한나노물질의표면면적농도로나눠주어 SSAGI 수치를확보 ( 오른쪽 ). B: SSAGI 수치를대상으로 non-hierarchical clustering 방법을이용한나노물질의그룹분류결과 3개의 (low toxicity, medium toxicity, high toxicity) 비교적경계가명확한분류를확보함. 표 4. 나노물질의염증유발능력 (SSAGI) 을기준으로한 non-hierarchical clustering 결과. - Non-hierarchical clustering 을이용한나노물질의분류기준에따라나노물질을그래프로표현하였 을때각그룹간의명확한연관성을확인할수있었음 ( 그림 4). 13

20 그림 4. 나노물질의염증유발능력을기준으로나노물질을분류하고, 그분류에따라서독성데이터를표현하였을때, 각그룹간의명확한연관성을확인할수있었음. 따라서각그룹에포함되는나노물질의경우에는서로비슷한정도의표면활성 (surface reactivity) 을가지며, 표면활성이결국나노물질의그룹을결정하는인자이고나노물질의표면면적농도가가장적합한농도설정기준임을알수있었음. - 그러나동일한데이터를이용하여농도기준을질량으로하였을때에는각그룹간의명확한연관성 을확인할수없었음 ( 그림 5). 그림 5. 나노물질의염증을기준으로한분류를투여한질량기준으로표현하였을때에는나노물질의그 14

21 룹간에연관성이소실됨을확인하였으며, 이를통해서폐장염증모델에서나노물질의농도설정 기준은표면면적이적합함을확인할수있었음. 선행연구결과2: 나노물질이서로다른염증을유발하는연구결과확보. - 일반적으로나노물질은폐장에투여되었을때급성으로호중구성염증을유발하고, 만성으로육아종성염증과섬유화를유발하는것으로알려짐. - 그러나나노물질은그고유한물리 화학적특성에따라서다양한독성이유발될수있음을확인하였음. 특히나노물질을폐장에투여하고 24 시간이후에염증을폐세척액을이용하여분석하였을때일반적으로나노물질에서관찰되는호중구성염증이외에 zinc oxide(zno) 나노물질이나 copper oxide(cuo) 나노물질의경우호산구성염증이유발될수있음을보고함 (Cho et al., 2010) 7) ( 그림 6). - 또한 ZnO 에의한급성호산구성염증은 ZnO 가폐포대식세포에게탐식되었을때대식세포의탐식소체내의산성조건에서급속하게녹는 ( 이온화되는 ) 현상에의해서과도한 Zn 이온이급속하게유리됨으로써생성된다는것을보고함 (Cho et al., 2011) 8). - 특히호산구성염증은알러지와관련되어있는염증세포로서 24 시간안에호산구성염증이보고된경우는매우이례적이며, 나노물질의위해평가에서매우중요하게고려해야되는사항임. 7) Cho WS, Duffin R, Poland CA, Howie SEM, MacNee W, Bardley M, Megson IL, Donaldson K. Metal oxide nanoparticles induce unique inflammatory footprints in the lung; import implications for nanoparticle testing. Environ. Health. Perspective. 2010, Dec; 118(12): ) Cho WS, Duffin R, Howie SEM, Scotton CJ, Wallace WAH, MacNee W, Bradley M, Megson IL, Donaldson K. Progressive severe lung injury by zinc oxide nanoparticles; the role of Zn2+ inside lysosomes. Particle and Fibre Toxicology, 2011 Sep 6;8(1):

22 그림 6. 금속산화물나노물질을랫드의폐장에투여후 24 시간에폐세척액을통해서폐장의염증유발에 관한타입을구분한결과. - 이러한나노물질의염증형태는단회투여후 4주이후에관찰한염증에서도매우다양하게나타남 ( 그림 7). 특히 nickel oxide 나노물질의경우헵텐 (hapten) 으로작용하여지연형과민반응 (delayed type hypersensitivity 를유발함. 나노물질에의한지연형과민반응은임상적으로매우중요한질환이며, 전통적인지연형과민반응은여러번의감작노출이필요하지만나노물질이생체내에서오랫동안존재하기때문에단회노출에의해서도동일한질환이생길수있음을보고함 (Cho et al., 201 2) 9). - 이러한만성에서의다양한염증반응은나노물질의위해평가에서중요한고려사항이되어야함. 9) Cho WS, Duffin R, Bradley M, Megson IL, MacNee W, Howie SEM, Donaldson K. NiO and Co 3 O 4 nanoparticles inducelung DTH-like responses and alveolar lipoproteinosis. European Respiratory Journal, 2012, 39(3):

23 그림 7. 금속산화물나노물질을랫드의폐장에투여후 4 주에폐세척액을통해서폐장의염증유발에관 한타입을구분한결과. 선행연구결과3: 나노물질의독성을유발하는인자를발견- 나노물질의위해성평가에응용가능 - 나노물질의독성을유발하는인자는나노물질의물리 화학적특성에의해서결정되며, 이를이용해서나노물질의독성을예측할수있는시스템을개발할수있음. - 본연구팀에서는나노물질의세포독성 ( 적혈구용혈반응 ) 과폐장에서의염증유발능력을나노물질의표면전하 ( 제타전위, zeta potential) 와산성조건에서의용해도 ( 또는이온화정도, solubility) 를이용해서예측할수있음을보고함 (Cho et al., 2012) 10). 연구계획 대표나노물질의선정 - Pubmed 등의문헌검색을통해서나노물질에관한안전성평가자료를확보하고, 식품의약품안전처 에서연구용역으로수행한나노물질의안전성관련자료를수집하여독성시험자료가많고, 가까운 미래에제품으로개발될가능성이높은대표나노물질을선정함. - 대표나노물질로는독성이거의없는물질 1 종과독성이있는것으로알려진 1 종을선택하여서로비 10) Cho WS, Thielbeer F, Duffin R, Bradley M, Megson IL, MacNee W, Donaldson K. Zeta potential and solubility to toxic ions as mechanisms of lung inflammation caused by metal/metal-oxide nanoparticles. Toxicological Sciences, 2012 Apr 126(2):

24 교하는연구를할수있도록함. - 현재까지 pubmed 에서보고된나노물질의독성시험자료로는 TiO 2 가가장많으며, 식품의약품안전처 에서연구용역으로수행한나노물질의독성시험항목은표 5 과같음. 표 5. 현재까지식품의약품안전처의연구용역으로수행한나노물질의독성시험항목 나노물질 시험항목 ( 투여경로 ) 수행기관 금 (Au) 90일반복투여 ( 흡입 ) 생활환경시험연구원 실리카 (SiO 2 ) 면역독성평가 세종대학교, 숙명여자대학교 이산화티타늄 (TiO 2 ) 면역독성평가 세종대학교, 숙명여자대학교 퀀텀닷 (Quantum dot) 피부독성평가 고려대학교 실리카 (SiO 2 ) 피부독성평가 고려대학교 금 (Au) 14일반복투여 ( 정맥내 ) 평가원독성연구과 금 (Au) 면역활성 평가원독성연구과 금 (Au) 혈장단백질과의상호작용 평가원독성연구과 은 (Ag) 세포독성평가 연세대학교 이산화티타늄 (TiO 2 ) 유전독성평가 메드빌 Hyaluronic acid-polymer ADME( 미정맥투여 ) 충북대학교 산화아연 (ZnO) ADME( 미정맥투여 ) 충북대학교 은 (Ag) 뇌-혈관장벽투과시험 중앙대학교 금 (Au) 뇌-혈관장벽투과시험 중앙대학교 실리카 (SiO 2 ) 단회투여 ( 경구 ) 서울대병원 실리카 (SiO 2 ) 14일반복투여 ( 경구 ) 서울대병원 실리카 (SiO 2 ) 90일반복투여 ( 경구 ) 서울대병원 이산화티타늄 (TiO 2 ) 단회투여 ( 경구 ) 서울대병원 이산화티타늄 (TiO 2 ) 14일반복투여 ( 경구 ) 서울대병원 이산화티타늄 (TiO 2 ) 90일반복투여 ( 경구 ) 서울대병원 산화아연 (ZnO) 단회투여 ( 경구 ) 서울대병원 산화아연 (ZnO) 14일반복투여 ( 경구 ) 서울대병원 산화아연 (ZnO) 90일반복투여 ( 경구 ) 서울대병원 은 (Ag) 단회투여 ( 경구 ) 서울대병원 은 (Ag) 14일반복투여 ( 경구 ) 서울대병원 은 (Ag) 90일반복투여 ( 경구 ) 서울대병원 산화철 (Fe 2 O 3 ) 단회투여 ( 경구 ) 서울대병원 산화철 (Fe 2 O 3 ) 14일반복투여 ( 경구 ) 서울대병원 산화철 (Fe 2 O 3 ) 90일반복투여 ( 경구 ) 서울대병원 칼슘 (Ca) 생체동태 서울대병원 실리카 (SiO 2 ) 피하투여 고려대학교 실리카 (SiO 2 ) 생체동태 ( 미정맥투여 ) 고려대학교 산화아연 (ZnO) 생체동태 ( 미정맥투여 ) 고려대학교 산화아연 (ZnO) 90일반복투여 ( 경구 ) 고려대학교 - 따라서독성이거의없는물질로는 TiO 2 를선정하며, 독성이비교적높은것으로알려져있는대표 물질로는 ZnO 를선정함. 대표나노물질의선정은주관부서와의협의에의해서변경될수있음. 18

25 대표나노물질에관한독성시험자료추출및분석 - 선정된대표나노물질에관해서노출경로별독성시험자료를확보함. 대표적인노출경로로는흡입 ( 기관지내삽입투여포함 ), 경구, 피부, 및혈관내투여경로가있으며, 각각에대한자료를확보함 ( 표 6). 표 6. 투여경로별나노물질독성자료확보항목 투여경로 임상적용 위해평가를위한독성자료 홉입 ( 기관지내투여포함 ) 나노의약품, 작업장노출등 물리화학적특성 경구 나노의약품, 나노식품등 급성독성자료 피부 나노화장품, 나노의약품등 아급성독성자료만성독성자료 혈관내투여 나노의약품 독성동태자료 - 대부분의나노물질을이용한안전성평가데이터는그림의형태로제시되고있기때문에본연구에서 는이러한자료를수치화하는프로그램을이용하여자료를추출함. 추출한나노물질독성자료에서나노물질의적합한 dose metric 결정 - 독성데이터에서질량기준 (mass metric) 으로시험을수행한연구결과는농도를다시표면면적기준 (surface area metric) 으로변환함. - 또한표면면적기준 (surface area metric) 으로수행한연구결과는농도를다시질량기준 (mass metric) 으로변환함. - 두가지 dose metric 을용량 -반응곡선 (dose-response curve) 에적용하여가장적합한 dose metric 을결정하며, 이결과를바탕으로나노물질의위해분석수행. 추출한자료를이용한위험성확인 - 위험성확인 (harzard identification): 추출한자료를바탕으로각각의독성시험결과로부터독성의종류및정도, 최대무작용량 (NOAEL) 혹은최대저작용량 (LOAEL) 을확인함. - 독성시험자료의평가및정리 (risk profiling): 수집한독성정로를근거로확인된독성의종류, 유전독성의유무등을요약정리함. - 동물에특이적으로고려되는독성인지에관한조사. 추출한독성자료를바탕으로한용량 - 반응평가 - 각개별적시험에서의용량 - 반응평가뿐만아니라추출한모든데이터를이용한전체적인용량반응 19

26 평가를수행함. - 용량반응평가를통해서용량 -반응평가에서독성을유발하는역치농도가존재하는지에관한연구수행. - 역치농도가존재하는경우 : 자료를바탕으로나노물질의위해평가를위한안전계수또는불확실성계수를산출. - 역치농도가존재하지않는경우 : 역치농도가존재하지않는경우는투여된나노물질이유전독성이있는발암물질일경우에해당됨. 그러나아직까지나노물질을이용하여발암성시험을수행한예는없기때문에여기에해당하는나노물질을선정할수는없음. 노출평가 ( 노출평가자료가있는경우에한함 ) - 평가대상나노물질로예비선정된물질인 TiO 2 와 ZnO 에관한인체노출에관한자료 ( 노출정도, 노출빈도, 기간등 ) 가있는지를확인함. - 인체노출자료가없는경우에는가상으로미래에이루어질노출상황을예측하여노출농도, 정도, 기간을산정함. - 인체노출자료를바탕으로일일인체노출량 (average daily intake, ADI) 를결정함. - 또한고농도노출군에대하여노출량분포의 95% 상한치에상당하는노출량인 high end exposure estimate(heee) 를계산함. 위해분석법의제시및활용방안제시 - 전세계적으로나노물질의위해분석은초기단계에있기때문에본연구과제를통해서나노물질의위해분석에관한접근법을제시함으로써세계적으로위해평가선도그룹으로도약할기반마련. - 나노물질의위해분석법의활용방안제시. 2 총괄연구개발과제의목표달성도 본연구를통해서식품및의약품관련제품에적용가능하고가까운미래에제품화될가능성이높은나노물질 2종 (TiO 2, ZnO) 을선정하였음. 선정된나노물질의독성시험자료를기존문헌에서확보하여재분석및위해평가를수행하였음. 본연구의목표를위해서아래와같은목표에대하여충분한목표달성을수행하였음. - 대표나노물질의선정 : Pubmed 등의문헌검색을통해서 2만건이상의나노물질의식품, 의약품, 화장품에활용되는것에관한분석을수행하였고, 그결과 TiO 2 와 ZnO 가가장많이연구되고있으며이미시장에서도판매되고있어서두종류의물질을선정함. 20

27 - 대표나노물질에관한독성시험자료추출및분석 : 선정된대표나노물질에관해서노출경로별독성시험자료를확보함. 대표적인노출경로로는흡입 ( 기관지내삽입투여포함 ), 경구, 경피, 및혈관내투여경로가있으며, 각각에대한자료를확보함. 대부분의나노물질을이용한안전성평가데이터는그림의형태로제시되고있기때문에본연구에서는이러한자료를수치화하는프로그램을이용하여자료를추출하였음. - 추출한자료를이용한위해분석수행 : 추출한자료를이용한다양한실험적인방법을이용하여위해분석을수행할뿐만아니라잘확립된방법을이용한노출경로별일일허용노출량등을산출하였음. - 위해분석법의제시및활용방안제시 : 나노물질의위해분석법에제시및활용방안을제시함. 3 총괄국내 외기술개발현황가. 국내 외연구현황 (1) 국외연구현황 ISO는 TC229 를통해서나노물질의안전성평가표준분석및시험법마련을위한협의를진행하고있으며, 근로자및소비자의건강보호를위한노출평가등의위해평가관련시험법의표준화를위한논의를시작하였음. OECD 는 WPMN( 제조나노물질작업반 ) 을통해서제조나노물질의안전성평가및잠재적위해성평가및위해성관리를위한표준작업을추진중에있음. 미국 FDA 는나노기술적용식품 의약품등에관한관리방안지침을마련함 유럽은나노물질의안전관리를위해서 RoHS( 전기 전자제품의유해물질사용제한제도 ), REACH ( 화학물질관리제도 ) 규정에 2010 년부터나노물질을포함하였기때문에나노물질의수출입을위해서는안전성관련자료를반드시제출해야함. 유럽과학위원회 (SCENIHR) 는나노물질의인체건강과환경에관한연구에많은노력의필요성을강조하였으며 2008 년에나노물질의규제방안을수립함. 독일연방위해평가연구원 (BfR) 은나노식품, 나노화장품에대한안전관리정책을제시하였으며은나노물질에관한인체위해성에관한의견을제시함. 일본의나노기술개발관련부처로는문무과학성, 경제산업성, 후생노동성, 환경성, 농림수산성, 국토교통성등이있으며, 특히나노물질안전과관련된부처인후생노동성에서는 2007 년나노재료안전대책조사보고서를발표하였음. 21

28 (2) 국내연구현황 우리나라는각부처의소관사항에따라서나노물질에대한안전관리대책을수립하여시행중에있음. - 식품의약품안전처 : 2011 년 7월나노식품 의약품등에관한안전관리기본계획을수립함 년 희망미래 2020 정책을통해서사전예방적위해관리시스템을강화하기로하였으며각부처에분산된위해평가정보를일원화하고위해요소및안전성평가사각지대에제품에대한통합적위해평가실시를위한기구및제도마련. - 환경부 : 2010 년 3월조사연구사업중심의나노물질안전관리중기계획을수립함. - 지식경제부 : 2011 년 1월나노융합산업촉진을위한나노제품안전성종합계획을수립함. - 범부처나노안전관리종합계획 : 2011 년 1월국가위에서는환경부를주관으로하는나노안전관리종합계획을수립하였음. 선진외국및국제기구와마찬가지로우리나라에서도나노물질의위해평가에대한기초적인기준만설정된실정이며, 나노물질의독성및생체동태와관련된자료의부족으로인해서나노물질에대한위해평가를진행한예는없음. 4 총괄연구개발과정에서수집한국외과학기술정보 - 유럽을중심으로나노물질의물리화학적특성분석에서부터인체노출에관한포괄적인과제가진행되고있음. 따라서우리나라에서도나노입자의위해평가를위한기반연구를지속적으로수행하여내실을다질필요가있다고판단됨. 제2장총괄연구개발과제의내용및방법 1. 대표나노물질의선정가. 대표나노물질의선정기준 - 대표나노물질을선정하기위하여독성시험자료가많고가까운미래에제품으로개발될가능성이높은나노물질을선정하고자하였음. - 대표나노물질은독성이있는 1종과독성이없는 1종을선정하여서로를비교할수있도록선정하였음. - 대표나노물질의독성을비교하기위한 reference 입자를선정함. Reference 입자는독성이강한것으로매우잘알려져있고많은연구가수행된 crystalline silica로선정함. 22

29 2. 대표나노물질에관한독성시험자료분석및추출가. 활용범위를기반으로한독성시험자료의분석 - 대표나노물질의활용범위를식품, 의약품, 화장품으로구분하였음. - 독성시험자료의범위는식약처에서지금까지수행해온연구결과보고서와 Pubmed 를통한연구논문을대상으로하였음. - Pubmed 분석을위해서는 nanomaterials + food, nanomaterials + drug, nanomaterials + cosmetics 라는핵심단어를이용하여분석하였음. - 또한각각의종류별나노입자의활용범위를확인하기위하여 TiO 2, ZnO, SiO 2, In 2 O 3, Fe 2 O 3, Ag, Au, Al 2 O 3, CeO 2, Co 3 O 4, Fe 3 O 4, Gd 2 O 3, MgO, NiO에대하여각각의활용분야인 food, drug, cosmetics 를조합하여분석하였음. 나. 독성자료의추출범위- 물리화학적특성 - 독성자료의분석에서나노입자의물리화학적특성이반드시필요함 - 특정자료는 crystal structure/crystallinity, composition/surface coatings/surface area, purity를중심으로분석하였음. - 수치화된자료는그대로인용하여서사용하였음. - 수치화되지않고그림이나그래프로제시된자료는 Grabit TM 이라는프로그램을이용하여수치화하였음. 다. 독성자료의추출범위- 노출경로별자료 - 노출경로별로나노입자의물리화학적특성과독성자료를추출함. - 노출경로로는흡입 ( 기관지내삽입투여포함 ), 경구투여, 피하투여, 혈관내투여등을선정함. 라. 독성에대한 parameter 설정 - 독성에대한독성 parameter 를설정하기위하여여러문헌을조사한결과 polymorphonuclear leukocyte(pmn) 가가장적합하다는결론에도달함. - PMN 자료를확보하기위한방법으로는세포의절대수와상대퍼센트의두가지가있었음. - 절대수의단점은독성시험의주체혹은실험실이다양하고따라서실험방법도약간씩차이가있기때문에실험실간의변화가크다는것임. 23

30 - 그러나절대수의장점은실제적으로 PMN수를표시해줌으로써 total cell number의변화를반영해줄수있다는것임. - 상대퍼센트라는것은 PMN이폐세척액내에서차지하는비중을표시하는것임. - 상대퍼센트의장점은폐세척액을추출하는방법이나투여방법이실험실간에차이가있다고할지라도폐세척액내에서차지하는 PMN의비율은거의변화하지않기때문에실험실간의실험방법의차이에관한데이터의차이를최소화해줄수있음. - 그러나상대퍼센트의단점은 total cell number의변화를반영하기어렵다는것임. - 따라서본연구에서는실험실간의데이터의차이를줄이는것이가장중요하였기때문에상대퍼센트를이용하였음. - PMN을독성 parameter 로이용하는것은급성독성을설명할때는매우좋은 parameter 라고말할수있지만만성독성을설명하기에는부족한부분이있음. 그러나본연구에서활용한 2가지나노입자의경우에는만성독성이거의없는것으로보고되었으며 1종의 reference 입자는만성에서도 PMN을 parameter 로활용할수있다는많은보고가있기때문에본연구에서는 PMN의선정하였음. 3. 나노입자의 dose metric 결정가. 나노입자의 dose metric 선정을위한데이터의분석방법 - 나노입자의 dose metric 을선정하기위하여실험동물 ( 랫드 ) 에투여된나노입자의양을질량 (mass) 과표면면적 (surface area) 로환산함. 나. 데이터의분석방법 - 환산된 dose 를 %PMN 에대하여 xy 그래프를그림. - Linear regression 법을이용하여 correlation coefficient 를비교함. 4. 독성자료를위한위해평가가. 독성자료의위해평가를위한전략 - 나노입자의투여경로별, 시간대별독성자료를이용하여농도-반응상관관계를분석함. - 농도-반응상관관계에서독성자료를분석 : 나노입자의회복이지연되는농도를관찰함. 24

31 나. 회복이지연되는나노입자의농도에관한분석 - 회복이지연되는농도가흡입의경로로노출하였을때는어떤농도기준에몇일간노출될수있는농도인지를환산하기위하여 MPPD(multiple-Path Particle Dosimetry) model 를이용하여분석함. MPPD model 은 Applied Research Associates, Inc.(ARA) 에서개발한모델링프로그램으로서원래는 CIIT(Chemical Industry Institute of Toxicology) 와 RIVM(the Dutch National Institute for Public Health and the Enviroment) 의공동연구로개발이수행되었음. 현재는 ARA에서유지관리되고있음. - 나노입자나입자, 또는이온에대한국제적허용기준 (JECFA 등 ) 을조사하여독성이발현되는농도와비교함. - MPPD 모델을이용하여분석하였을때폐장내축적되는 fraction 이폐포와기관지, 두부로구분할수있으며, 호흡기전체에축적되는농도로도구분할수있음. - MPPD 모델을이용하여 particle 의회복이늦어지는농도인 3656 ug/rat에대하여 1 mg/m 3 농도에서그농도에도달할수있는시간을환산함. - MPPD 모델을이용하여 particle 의회복이늦어지는농도인 3656 ug/rat에대하여하루에도달하기위해필요한입자의농도 (mg/m 3 ) 를환산함. - 환산된농도를한국과미국등의작업자에대한 permissible exposure limit과비교하여현재의안전농도가타당한지에관한고찰을수행함. 5. 대표나노물질에관한 risk profile 작성 - TiO 2 에관한 risk profile 을작성함. - 리스크프로파일항목은아래와같으며문헌조사를통해서프로파일을작성함. 가. 물리화학적특성나. TiO 2 나노입자의활용다. 노출경로와한계 (1) 노출경로 (2) 한계라. TiO 2 나노입자의독성동태 (1) 흡수 (2) 분포 (3) 대사 (4) 배설 25

32 마. TiO 2 나노입자의독성 (1) 급성독성 (2) 아급성독성 (3) 아만성독성효과 (4) 만성독성효과 ( 발암성제외 ) (5) 유전독성 (6) 생식독성과발생독성바. 발암성 (1) 실험적연구 (2) 역학적조사사. 발암화의분자적메커니즘 (1) ROS의생성 (2) 염증의유도 6. 나노물질의위해분석법의활용방안제시 - 연구결과를바탕으로개발된위해분석법의활용방안을제시함. 제3장총괄연구개발과제의최종결과및고찰 1. Pubmed 분석을통한연구현황파악가. 대표나노물질의연구현황을파악하기위하여 pubmed 를통한논문의양적인수치를비교하였음. 나. 나노입자와식품, 의약품, 화장품에관한키워드의조합으로관련논문수를조사한결과나노입자와의약품에관한연구가 2만건이상으로확인되었으며, 나노입자와화장품에관한연구가그다음으로많았음. 최근에는나노입자와식품에관한연구도많이증가한것으로확인되었음 ( 그림 1). 26

33 그림 1. nanomaterials + food, nanomaterials + drug, nanomaterials + cosmetics 의조합으 로관련논문을조사한결과 drug> cosmetics> food 의순서로많은연구결과가확인되었 음. 다. 각각의나노입자종류별식품, 의약품, 화장품에관하여연구되고있는현황을파악하기위하여 TiO2, ZnO, SiO2, In2O3, Fe2O3, Ag, Au, Al2O3, CeO2, Co3O4, Fe3O4, Gd2O3, MgO, NiO에대하여각각의활용분야인 food, drug, cosmetics 를조합하여분석하였음. 분석결과 TiO 2 와 ZnO가가장많은연구가진행되고있는것을확인함. 또한 TiO 2 와 ZnO는식품, 의약품, 화장품에고루연구가진행되고있었음을확인할수있었음 ( 그림 2). 그림 2. 각각의종류별나노입자의활용범위를확인하기위하여 TiO 2, ZnO, SiO 2, In 2 O 3, 27

34 Fe 2 O 3, Ag, Au, Al 2 O 3, CeO 2, Co 3 O 4, Fe 3 O 4, Gd 2 O 3, MgO, NiO 에대하여각각의활용분 야인 food, drug, cosmetics 를조합하여분석하였을때 TiO2 와 ZnO 가가장많이, 그리고 여러분야에고루연구되고있는물질임을확인할수있었음. 라. 따라서대표나노물질로 TiO 2 와 ZnO를선정하였음. 또한선정된 TiO 2 와 ZnO는가까운미래에제품으로개발될가능성이매우높은것으로판단되었으며, 이미시장에판매되고있는제품도다수확인할수있었음. 마. 대표나노물질의독성을비교하기위한 reference 입자를선정하였음. Reference 입자는독성이강한것으로매우잘알려져있고많은연구가수행된 crystalline silica로선정함. 바. TiO 2 나노입자의활용범위 - 식품 : 식품첨가물, 설탕, 사탕, 아이스크림, 껌등의색소 ( 식품첨가물공전 ) - 화장품 : 자외선차단제 - 의약품 : 영상과치료분야에활용 - 기타 : 페인트, 코팅, 플라스틱, 종이, 잉크- 1년에대략 400 만톤의색소가사용되며그중 70% 는 TiO 2 가차지함사. TiO 2 나노입자의제품에함유된농도에관한조사 - 식품당 titanium의농도를조사한결과식품당 100 mg 이상으로검출되는제품 (hostess powdered bonette, Good and plenty candy 등 ) 도확인되었으며, 다양한식품 ( 스낵, 쿠키, 캔디등 ) 에서유효한농도의 titanium이검출됨 ( 그림 3). 28

35 그림 3. 식품당 titanium 의농도. Titanium 이성분으로표시되어있는제품의경우붉은색 으로표시함. 데이터출처 : Weir A.A., Arizona State Univ. MSc thesis, TiO 2 nanomaterials: human exposure and environmental release. - 로션, 화장품등의 personal care product 에서 titanium 의함량을분석한결과 ug/mg 의농도로검출됨 ( 그림 4). 그림 4. Personal care product 에서 titanium 의농도. 데이터출처 : Weir A.A., Arizona State Univ. MSc thesis, TiO 2 nanomaterials: human exposure and environmental release. - 페인트에서 titanium 의함량을분석한결과 ug/mg 의농도로검출됨 ( 그림 5). 29

36 그림 5. 페인트에서 titanium 의농도. 데이터출처 : Weir A.A., Arizona State Univ. MSc thesis, TiO 2 nanomaterials: human exposure and environmental release. - 우리나라에서 TiO 2 를식품첨가물로사용하고있는현황 ( 표 1) 표 1. TiO 2 입자의식품첨가물로서국내사용내역 30

37 아. ZnO 나노입자의활용범위 -식품: 아연보조제, 포장제 (UV 차단및살균능력 ) ( 식품첨가물공전 ) -화장품: 자외선차단제 -의약품: 항암제등 -기타: 페인트, 태양전지등 - 우리나라에서 ZnO 를식품첨가물로사용하고있는현황 ( 표 2) 표 2. ZnO 입자의식품첨가물로서국내사용내역 2. 대표나노입자의투여경로별독성시험자료의추출및분석가. 경구투여독성시험 - 나노입자에관한경구투여독성시험결과를조사하였음. - 단회투여독성시험에서부터 90일반복투여독성시험까지의자료를조사한결과는표 3과같음. 31

38 표 3. 나노입자의경구투여독성시험결과요약 (1) SD 랫드를이용한 TiO 2 나노입자의경구투여독성결과 - 식약처의 2009 년용역보고서에서 SD 랫드를이용하여 TiO 2 나노입자의단회, 14일, 90일반복투여독성시험을실시하였음. - 나노입자의크기는전자현미경으로관찰하였을때 21 nm이었음 ( 그림 6) - 표면면적은 BET로측정하였을때 50 ± 15 m2/g이었음 ( 그림 6) 그림 6. TiO 2 나노입자의모양및특성. 참고문헌 : 식약청연구용역보고서, 나노독 700, Seok et al., 2013, J Appl Toxicol. 33(10): TiO 2 나노입자를 90 일간반복투여하였을때의독성결과는표 4 와같음. - 시험결과 TiO 2 나노입자에관한단회및 14 일반복투여독성은최대농도 2083 mg/kg 32

39 bw으로투여하였을때에도관찰되지않았음. - 그러나 90일반복투여하였을때에는수컷 1041 mg/kg bw와암컷 520 mg/kg bw 농도에서혈액응고시간 (APTT) 의지연이유의적으로관찰되었음. 이를바탕으로 NOAEL을 520 mg/kg bw으로제시함. 표 4. TiO 2 의단회, 14 일, 13 주반복투여독성시험결과. 참고문헌 : 식약청연구용역보고서, 나노독 700, Seok et al., 2013, J Appl Toxicol. 33(10): (2) TiO 2 입자의경구투여독성시험결과 (JECFA) - 급성독성 : 랫드경구 >12000 mg/kg, 복강 > 2000 ~ 5300 mg/kg bw - 30일반복투여 : 랫드에 0, 10% TiO 2 함유사료를섭취 : 증상없음 - TiO 2 는불용성이기때문에경구투여시흡수가되지않고조직내분포도이루어지지않음 - 따라서 ADI 설정이불필요함 (3) SD 랫드를이용한 ZnO 나노입자의경구투여독성결과 - 식약처의 2009 년용역보고서에서 SD 랫드를이용하여 ZnO 나노입자의단회, 14일, 90일반복투여독성시험을실시하였음. - 나노입자의크기는전자현미경으로관찰하였을때 40 nm이었음 ( 그림 7) - 표면면적은 BET로측정하였을때 60 ± 10 m2/g이었음 ( 그림 7) 33

40 그림 7. ZnO 나노입자의크기와모양. 참고문헌 : 식약청연구용역보고서, 나노독 700, Seok et al., 2013, J Appl Toxicol. 33(10): ZnO 나노입자를 90일간반복투여하였을때의독성결과는표 5와같음. - 시험결과 ZnO 나노입자에관한단회및 14일반복투여독성은최대농도 2147 mg/kg bw으로투여하였을때에도관찰되지않았음. - 그러나 90일반복투여하였을때에는암수모두에서 536 mg/kg bw 농도에서임상증상, 체중감소, 혈액학적변화, 혈청생화학적변화, 췌장의염증이관찰되었음. 이를바탕으로 NOAEL 을 268 mg/kg bw 으로제시함. 표 5. ZnO 의단회, 14 일, 13 주반복투여독성시험결과. 참고문헌 : 식약청연구용역보고서, 나노독 700, Seok et al., 2013, J Appl Toxicol. 33(10): (4) ZnO 입자에관한외국의허용기준 (JECFA) - 급성독성 : 없음 - Zinc sulfate 마우스경구 611 mg/kg, 랫드경구 1374 mg/kg 주반복투여 : mg/kg 농도에서랫드에이상변화없음 34

41 (5) ZnO 나노입자의독성기전에관한고찰 - Zn이온의투여는랫드에서급성췌장염을유발함 (Ferahman et al., 2003; Mikszewski et al., 2003). - ZnO는위내에서위산에의해서 100% 이온화됨 ( 그림 8). - 따라서 ZnO에의한췌장염은 Zn 이온에의한것으로판단됨. - 그림 8. ZnO 의위산 (AGF, artificial gastric fluid) 과물 (DW, distilled water) 조건에서녹는 성질의비교. ZnO 는위산에서 100% 녹는다는것을유의하기바람. (6) TiO 2 와 ZnO의독성동태자료를바탕으로한독성기전고찰 - TiO 2 나노입자의경구투여에의해서체내로흡수되는 titanium 의농도는극미량이었음 ( 그림 9). - 반면에 ZnO의경우는높은농도의 zinc 이온이장기에서관찰되었음. - 따라서 TiO 2 와 ZnO의경구투여에의한독성영향은투여된나노입자의흡수와아주밀접한관련이있으며, 특히 low solubility 나노입자의경우에는흡수율이매우낮기때문에독성이거의발현되지않을것으로판단됨. 35

42 그림 9. TiO 2 와 ZnO 의 13 주경구투여이후에각장기에서관찰되는 Ti 이온과 Zn 이온의 농도비교. 자료출처 : Cho et al., Particle and Fibre Toxicology, 10:9. 나. 피하투여독성시험 - 나노입자는이미화장품에서많이이용되고있으며, 인체에지속적으로노출되고있음. - 그러나최근의연구에서는나노입자가피부를투과하여체내에흡수되기가매우어렵다고보고하고있음. - 입자의피부투과의특성 : 무기물질이정상적인피부를일반적인상황에서통과한다는것은가능성이낮음 (Senzui et al., 2010). - TiO 2 나노입자의피부투과 : 물리적으로피부가손상된상태에서는물질의흡수가될수있으나, 지금까지의연구결과에의하면 TiO 2 입자들은손상된피부와정상적인피부모두에서피하층을투과할수없음 (Senzui et al., 2010, Schulz et al., 2002, Pflucker et al., 2001, Gamer et al., 2006, Sadrieh et al., 2010, Newman et al., 2009, Leite-Silva et al., 2013). - 전자현미경으로피부를투과한나노입자를관찰하였을때에는 TiO 2 입자들이모공에들어가있지만진피와살아있는표피층은통과하지못함을관찰함. - ZnO 나노입자의피부투과 : 사람을대상으로한실험에서 ZnO는표피층을통과하지못함 (Leite-Silva et al., 2013). - 표피부위의 stratum granulosum 에일부침투하지만세포에영향을줄수있는농도는아니었음 (Leite-Silva et al., 2013). - 따라서피하투여에의한나노입자의 A DI 설정은필요하지않는것으로판단됨. 36

43 다. 폐장투여에의한독성자료분석 (TiO2) - GrabitTM 프로그램을이용하여아래의논문으로부터 intratracheal instillation 에관한염 증 PMN 자료를추출하였음. - 참고문헌리스트 1. Warheit et al., Pulmonary instillation studies with nanoscale TiO2 rods and dots in rats: toxicity is not dependent upon particle size and surface area. Toxicol Sci 91, Oberdorster et al., Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles. Environ H ealth Perspect 113, Cho et al., Metal Oxide Nanoparticles Induce Unique Inflammatory Footprints in the Lung; Important Implications for Nanoparticle Testing. Environ H ealth Perspect 118, Sayes et al., Assessing toxicity of fine and nanoparticles: comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicol Sci 97, Warheit et al., Pulmonary bioassay studies with nanoscale and fine-quartz particles in rats: toxicity is not dependent upon particle size but on surface characteristics. Toxicol Sci 95, Brown et al., Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine polystyrene particles: a role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicol Appl Pharmacol 175, (1) 폐장내투여후 24 시간의 PMN 염증의동물데이터추출은표 6과같음. - 대조군은 10개의투여군을확보하였으며해당되는동물수는 50 마리임. - TiO 2 투여군은 36개이었으며해당되는동물수는 180 마리임. - ZnO 투여군은 7개이었으며해당되는동물수는 35 마리임. - DQ12 투여군은 12개이었으며해당되는동물수는 60 마리임. 37

44 표 6. 랫드의폐장내투여후 24 시간의동물자료. (2) 폐장내투여후 24시간자료를이용한 dose-metric 비교 ( 그림 10). - PMN 자료를표면면적농도와질량농도로구분하여 xy 그래프를그리고 linear regression 을이용하여 Pearson correlation test 를수행한결과표면면적농도가질량농도보다우수한 correlation coefficient 를보였음. - 표면면적농도로하였을때 correlation coefficient 는 TiO2는 <0.0001, ZnO는 , DQ12는 이었음. - 그러나질량농도를기준으로하였을때 correlation coefficient 는 TiO2는 , ZnO는 , DQ12는 이었음. 그림 10. 나노입자의 dose metric 비교 (3) 폐장내투여후 1 주일후의 PMN 은 TiO 2 와 ZnO 의경우빠른회복을보였으나 DQ12 의 경우에는지속적인염증을보였음 ( 그림 11). 38

45 - 1주일째대조군은 6개그룹을확보하였으며해당되는동물수는 30마리임. - TiO 2 투여군은 25개이었으며해당되는동물수는 125 마리임. - ZnO 투여군은 4개이었으며해당되는동물수는 20 마리임. - DQ12 투여군은 12개이었으며해당되는동물수는 60 마리임. 그림 11. 랫드의폐장내투여후 1 주일의동물자료와 Pearson correlation test. (4) 폐장내투여후 4 주일후의 PMN 은 TiO 2 와 ZnO 의경우빠른회복을보였으나 DQ12 의 경우에는지속적인염증을보였음 ( 그림 12). 그림 12. 나노입자단회폐장내투여후 4 주일째의염증정도분석 39

46 (5) 폐장내투여후 12 주일후의 PMN 은 TiO 2 와 ZnO 의경우빠른회복을보였으나 DQ12 의 경우에는지속적인염증을보였음 ( 그림 13). 그림 13. 나노입자단회폐장내투여후 12 주일째의염증정도분석 (6) TiO 2 나노입자의폐장내투여후시간대별 PMN을분석. - TiO 2 나노입자의폐장내투여후시간대별 PMN을분석하였을때투여농도에대한 %PMN은시간대별로유의성있는 correlation coefficient 를보였음 ( 그림 14). - 이는비록 TiO 2 나노입자의투여후시간이지남에따라서염증이회복이되지만고농도로투여할수록회복이늦어진다는것을의미함. 그림 14. TiO 2 나노입자의폐장내투여후시간대별 PMN 을분석하였을때투여농도에대 한 %PMN 은시간대별로유의성있는 correlation coefficient 를보였음. 40

47 (7) 그림 14를농도별로분석하였을때 TiO 2 투여후회복이매우느려지는농도를확인할수있었음. - 본연구에서는이농도지점을 particle overload 가진행되는지점으로설정하였으며, 이에해당하는표면면적농도는 446 cm2/rat 이었고질량농도는 3656 ug/rat 이었음 ( 그림 15). - Particle overload 가진행되는농도는 overload 가걸리기전의농도에비해서생체내에서배설이크게지연되며 (overload T1/2= 300d, before overload T1/2= 70d), 이는생체가입자에의해서생리학적인활동성이크게떨어진다는것을의미함 (Oberdorster G, 1995 Regulatory Toxicology and Pharmacology). - 그림 15. TiO 2 에대한시간에따른회복을지연시키는지점인 particle overload 가시작되는 지점을확인하였음. (8) MPPD 모델을이용하여 3656 ug/rat 농도가실제흡입을했을때의농도로어떻게환산될수있는지를조사하였음. - MPPD 모델에입자에대한데이터를입력하고노출에대한정보를사람과동일하게 8시간 / 일로설정하였음. - 흡입시나리오에서파티클의침착되는부위와질량은그림 16과같음. 41

48 그림 16. MPPD 모델을이용한 10 nm 입자 1 mg/m3 농도에서폐장에침착되는농도와구 획별침착되는입자의량. (9) MPPD 모델을이용한농도의변환 - MPPD 모델을이용하여 8시간 / 일로 1 mg/m3의농도로 TiO 2 를노출하였을때 3656 ug/rat까지도달하는시간은표 7과같음. 폐장전체를기준으로 TiO 2 가 3656 ug/rat에도달하는기간은 10 nm의경우 4.6일, 50 nm의경우 7.9일, 500 nm의경우 26.1 일이소요됨. - 폐장의폐포에침착되는것을기준으로 TiO 2 가 3656 ug/rat에도달하는기간은 10 nm의경우 20일, 50 nm의경우 13.2 일, 500 nm의경우 55.4 일이소요됨. - 하루에 3656 ug/rat에도달하는데필요한나노입자의농도는폐장전체를기준으로 10 nm의경우 4.6 mg/m3, 50 nm의경우 7.9 mg/m3, 500 nm의경우 26.1 mg/m3이었음. - 하루에 3656 ug/rat에도달하는데필요한나노입자의농도는폐포에침착되는양을기준으로할때 10 nm의경우 20.9 mg/m3, 50 nm의경우 13.2 mg/m3, 500 nm의경우 55.4 mg/m3이었음. 42

49 표 7. MPPD 모델을이용한 3656 ug/rat 까지도달하는시간과농도의환산. (10) TiO 2 의 particle overload 에도달하는농도를환산한결과를제외국의 TiO 2 나노입자에대한흡입노출허용량과비교함 ( 표 8). - 외국에서도나노크기의 TiO 2 의허용한계치는마이크론크기의 TiO 2 보다훨씬엄격하게관리하고있음. 표 7에서도확인한바와같이입자의크기가작아질수록폐장에침착되는양이증가하기때문에우리나라에서도이를바탕으로하는위해평가가반드시진행되어야할것으로판단됨. - 현재국내에서는나노 TiO 2 에대한허용한계치는설정되어있지않고마이크론크기의 TiO 2 에대하여흡입의허용한계치는 10 mg/m3 임. 표 8. 마이크론크기의 TiO 2 와나노크기의 TiO 2 에대한허용한계치의설정 (11) ZnO 의시간대별독성자료를분석한결과 ZnO 는 24 시간이후에지속적으로염증이정 상의수준으로회복되었으며, 12 주에는완벽하게회복되었음 ( 그림 17). 43

50 그림 17. ZnO 나노입자의폐장내투여후 %PMN 의변화추이. ZnO 에의한염증은시간이 갈수록완벽하게회복되는것을확인할수있음. (12) ZnO의빠른회복은 ZnO 입자의폐장내에서빠른용해와도관련이있음. 즉 ZnO는폐장의대식세포에탐식되어산성조건의리소좀에서빠르게용해됨으로써급성염증은강하게유도하지만빠르게배출되어만성에서는독성을유발하지않음. (13) DQ12의시간대별염증을분석한결과, DQ12는시간이지나도염증이정상으로회복되지않고지속적인 PMN의축적을유도함 ( 그림 18). - 유도된염증은시간대별로모두유의성있는 correlation coefficient 를보였음. - 이는 DQ12에의한염증의농도의존적인경향이만성에서도지속된다는것을의미하며 PMN의유도가 DQ12에의한것임을의미하기도함. 그림 18. DQ12 의시간대별 %PMN 의패턴변화. 44

51 (14) 흡입투여경로에의한위해성평가의요약 - TiO 2 와 ZnO는투여후정상으로회복되지만 Crystalline silica 는정상으로회복되지않음 - TiO 2 의경우입자의 overload 가유도되는농도가존재하며, overload 농도이상에서는회복이느리고지속적인염증이유발될수있음 - 입자의 overload 가유도되는농도를우리나라의 TiO 2 작업자노출허용기준인 10 mg/m 3 에비하여안전한농도로관찰되지만, 나노입자에관해서는조금더엄격한노출허용기준의설정이필요할것으로판단됨 - ZnO의경우입자의녹는성질에의해서빠른회복과입자의제거가유도될수있음 - Crystalline silica 에비하여 TiO 2 와 ZnO의위해성은지속가능하지않는것으로판단됨 45

52 5. 대표나노물질에관한 risk profile 작성 - TiO 2 에관한 risk profile 요약본. - 분자량 끓는점 녹는점 비중 79.9g/mol 2972 C 1843 C 25 C 에서 4.26g/cm 3 가. 물리화학적특성 - 연소성이없는무취의백색가루 - 거의녹지않는물질로알려져있음 - 페인트등의백색착색제로활용 - 구조결정형에따라 anatase, rutile, brookite로분류됨 나. TiO 2 나노입자의활용 - 페인트, 코팅, 플라스틱, 종이, 잉크, 의약, 약학, 식품, 화장품, 치약등에활용가능 활용분야 활용사례 활용분야에이용되는 TiO 2 의특성 식품 전지분유 밝은색을가지고있어합성착색료로 화장품 의학 선크림 합금임플란트 영상과치료에이용하기위하여연구중 이용하여색을하얗게보이게함 산업 반도체의광촉매제, 산업폐기물의정화, 태양전지스스로청소가되는유리창문이나옷감, 습기가차지않는자동차유리 높은안정성과부식이되지않고, 광촉매성이있음 광촉매성질 다. 노출경로와한계 (1) 노출경로 - 정상적인음식섭취에의해서도티타늄은 μg/day 의농도로섭취되며, 정상적인동물의조직에서도매우낮은농도로검출됨 - 가장흔한노출경로는작업장에서의흡입노출과피하노출 - TiO 2 는자외선차단제등에이용되므로피하노출이가장많이일어나는물질이며, TiO 2 나노물질은치약, 식품, 영양보조를통해노출될수있으므로경구노출이두번째로우려되는경로임 46

53 (2) 한계해당기관 한계설정대상 한계 미국정부기관 마이크론크기의 TiO 2 안전성에관한 10mg/m 3, 산업안전위생담당자회의 노출한계역치 (8시간/ 일, 40/ 주 ) 마이크론크기의 TiO 2 의허용한계 15mg/m 3 미국 NIOSH 일본 NEDO 1) 에서발간한 TiO 2 나노입자의위해평가 보고서 TiO 2 나노입자에관한권장 O.3mg/m 3 노출한계치 1.2mg/m 3 TiO 2 나노입자의허용가능한 (8시간/ 일, 노출한계 40시간 / 주 ) 1.2mg/m 3 P25 2) TiO 2 의 NOAEL (8시간/ 일, 5일 / 주 ) - 미국 FDA에서는 TiO 2 를식품의색소첨가제로사람체중당 1% 미만의농도로노출되는것을허용하고있으나, 나노입자에대한특이적인허가가아니므로 TiO 2 나노입자에관한노출한계를설정하는것이필요할것으로판단된다. 1) NEDO : New Energy and Industrial Technology Development Organization 2) 현재사용되고있는 TiO 2 광촉매중효율과상업적빈도가가장높은 Degussa 사의제품이며구성은 80% anatase + 20% rutile로이루어져있으며, 20-30nm 의입자크기를가지고있음 라. TiO 2 나노입자의독성동태 (1) 흡수흡입, 기관지내삽입, 구강흡입의경로를통해 TiO 2 나노입자를노출하였을때, 나노입자는혈중으로흡수되어전신순환을통해서전신장기로이동하거나후각신경을타고뇌로이동하는것이가능하며, 폐장이외의기관이나장기로의이동하는비율은매우낮은것으로보고되었다. 흡수경로 위장관흡수 연구사례마이크론크기 (fine TiO 2, 500nm) 의 TiO 2 를랫드에경구투여했을때, 전신순환과다른장기로의이동이관찰됨 25, 80, 155nm 의 TiO 2 를단회경구투여했을때, 체내로흡수되는것을관찰됨 TiO 2 나노입자를 13주반복경구투여했을때, TiO 2 나노 47

54 입자가가체내로거의흡수되지않는다는보고가있음물리적으로피부가손상된상태에서는물질의흡수가될 수있으나, 지금까지의연구결과에의하면 TiO 2 입자들 피하흡수 은손상된피부와정상적인피부모두에서피하층을투 과할수없다고함 대부분의연구 (in vitro 실험을포함 ) 에서 TiO 2 나노입자 가살아있는조직을통과할수없다는결과를냄 20nm TiO 2 나노입자가랫드의폐장에노출되었을때, 흡입 간질조직으로이동하고일부는전신순환을하는것으로 보고됨 사람에대한흡입노출을통한흡수데이터는현재없음 TiO 2 나노입자를기관지내삽입방법을통해폐장에투 여한뒤, 42 일째에나노입자가간질조직으로이동한것 이관찰됨 폐를통한흡수 기관지내 흡입에의한노출보다더높은비율의 TiO 2 나노입자가 삽입 간질조직으로이동 기관지내삽입후 28 일째에다른조직으로의이동관찰 결과 TiO 2 나노입자의혈관내이동과간장이나신장과 같은다른장기로의이동이매우제한적으로관찰됨 다양한크기의 TiO 2 나노입자 (80nm rutile, 155nm 구강흡입 anatase) 를구강흡입을유도했을때, 호흡부분의후각신 경을타고뇌로입자가전이되는것을관찰함 (2) 분포 TiO 2 나노입자의초기흡수후에입자들은전신순환을거쳐서모든장기와조직으로이동할수있다. 다양한연구에의해서 TiO 2 나노입자가정맥이나복강내투여했을경우에다른장기로분포되며대부분간에서축적된다는것이보고되었으며비강내투여의경우뇌로이동한다는것이보고되었다. 연구사례 TiO 2 나노입자를임신한 mouse 에피하노 출 결과자손의유전자발현과생식기및두개골신경계에영향을미친다는것이보고되었으며, 흡입노출에서나노입자가태반혈관장벽을통과할수있다는것이보고됨 48

55 나노크기의 TiO 2 를 3주간암컷 Wistar 랫드에흡입노출한뒤에 3, 28, 90일간의회복기간을줌 cytochalasin D와 chlorpromazine 과 Fcγ receptorⅡ(fcγrⅡ) 항체를이용한 uptake inhibition 연구단회기관지내삽입방법과 12주흡입투여를통하여랫드의폐에서 TiO 2 마이크로입자와나노입자 (12, 21, 230, 250 nm) 의폐장 내분포를연구마우스에서 3 nm의 TiO 2 나노입자를 13.2mg/kg 의농도로기관지내삽입방법을통하여주 1회총 4주동안투여 나노입자가주로폐포대식세포에서발견되었으며, 폐포 1형상피세포에서훨씬적은양이존재한다는것이보고됨마이크론크기의 TiO 2 입자는액틴의존적탐식작용과 macropinocytosis 작용, 그리고 clathrin에의해서세포내유입이이루어짐입자의간질로이동은입자의크기와투여용량, 투여횟수와관련이있음 TiO 2 나노입자가뇌-혈관장벽을통해통과할수있음후각신경을통해중추신경계로이동할수 비강내주입된 TiO 2 나노입자 기관지내주입법 ; 80nm rutile, 155nm anatase; 30 일 있다는것과해마가주대상부위가되는 잠재적인뇌병변을일으킴 주로나노입자로정의되는 155 nm anatase 모노아민자극성신경전달물질에서노출된지 2, 10, 20, 30일에 CD 암컷마우스에비강내주입된 TiO 2 나노입자 (25nm, 80nm, 155nm; 50mg/kg BW으로격일투여 ) 정맥으로 TiO 2 나노입자 (70/30 anatase/rutile; 20-30nm) 를혈청단백질에분산하여 5 mg/kg BW의농도로투여한뒤에 TiO 2 나노입자의조직함량을투여후 1, 14, 28일후에측정 TiO 2 입자에의해야기 80nm 와 155nm TiO 2 노출후, 뇌에서 TiO 2 나노입자의축적으로인해도파민, DOPAC, HVA와 5-HIAA 가감소되는동안노르에피네프린과 5-HT 의함량은상당히증가 TiO 2 나노입자의농도 : 간 ( 전실험기간동안간에서높은농도로검출 )> 비장 > 폐 > 신장 투여후 1일째에가장높은잔존량을보임 첫날부터 14일, 28일까지비장에서 TiO 2 나노입자수치는점점감소하였고, 폐, 신장에서는 14일쯤에대조군과유사한농도로 2 주간의급성독성연구에서마우스의복강 내에각각다른농도 (0, 324, 648, 972, 1296, 검출비장, 간, 신장, 폐순으로검출되었으며일 부나노입자들은신장으로부터뇨를통해 49

56 1944, 2593 mg/kg BW) 로 TiO 2 나노입자를 투여하고노출후 1, 2, 7, 14일에 TiO 2 나노입자 (80nm, 100nm, anatase) 의장기분포를측정 5 nm anatase TiO 2 나노입자를 5, 10, 50, 100, and 150 mg/kg BW의농도로마우스복강내로 14일동안반복투여후조직내분포를연구 배출됨장기에서 TiO 2 나노입자들의분포는간 > 신장 > 비장 > 폐 > 뇌 > 심장의순서로나타남 (3) 대사 지금까지 TiO 2 나노입자의대사와관련된보고는없었다. (4) 배설 - 전신순환계에서 TiO 2 나노입자들은신장을통해서뇨로배출되거나담즙을통해서변으로배출되는 2가지잠재적방식에의해배설된다. - 나노입자가흡입되는경우입자는기관지에침착되고폐포대식세포에의해탐식되어호기시에가래의형태로제거되며폐포에침착된나노입자는대부분은말단에서대식세포에탐식되어 mucociliary escalator 를통해서가래로배설된다. - TiO 2 나노입자가간질로더많이이동하기때문에폐포에서대식세포의탐식작용을통해서마이크로입자가나노입자보다잘제거가된다. 마. TiO 2 나노입자의독성 TiO 2 나노입자는폐의염증반응과상대적으로고농도에서폐세포의증식을유발하면서독성효과를나타내었다. TiO 2 나노입자는 TiO 2 마이크로입자와비교해서폐장의염증효과를더크게유발하는것으로나타났다. (1) 급성독성 노출경로 연구사례 결과 랫드에 5일간하루에 6시간씩 폐세척액에서의총세포수, 호중구수, 총 흡입노출 0,2,10, or 50mg/ml 의농도로 에어로졸형태로노출시켰고, 단백질함량, 독성관련효소의활성이농 도의존적으로증가 노출후 3 일과 16 일에부검을 전신독성을나타내는지표에서는변화가 50

57 실시 관찰되지않음폐세척액에서총세포수, 폐포대식세포의 마우스를이용나노, 마이크로크기의 TiO 2 입자를이용 710nm, 100nm 의 TiO 2 입자를 15-16mg/m3 의농도로 4-12 시간노출 21nm 의 P-25 입자 (80/20 anatase/rutile) 를 6mg/m3의농도로 24시간동안노출랫드에 5,21,50nm 의 TiO 2 나노입자를 0.5, 5, 50mg/kg BW의농도로단회투여후일주일후에염증의정도를분석랫드에투여이후시간의경과에따라분석 수가증가하였으나노출후 3주이후에회복됨어깨근육의동맥에서미세혈관의기능장애 ( 확장반응의실패 ) 를유발염증의활성화와신경의작용때문에말초혈관에영향을미침 basal tone의증가와확장기까지관상동맥의저하된반응성이관찰됨농도의존적으로염증병변을유발 5nm의 TiO 2 입자가다른사이즈의입자들보다더강한염증을유발 TiO 2 나노입자는노출된지 24시간에폐의염증작용이더큼노출된후일주일이경과했을때보다 24시간에폐의염증작용이더큼염증작용은국소적으로분포되어있음농도의존적이며시간이경과함에따라회 기관지내 투여 복됨랫드에비특이적인면역반응과특이적면역반응의감소를유도하였으며세포의구조에손상과폐포대식세포의기능장애를 5, 200 nm의 TiO 2 나노입자를 , 50 mg/kg의농도로랫드에노출 TDI를이용한마우스천식모델이용, 15 nm의 anatase 유발대식세포의탐식작용은 TiO 2 나노입자의저농도에노출이되었을때증가하였으며고농도에노출되었을때감소 TiO 2 나노입자의노출은대식세포의화학주성효과및 Fc receptor 와세포표면에서 MHC-class II의발현을저하 TiO 2 나노입자를투여한마우스는주로호중구와대식세포로구성된염증을유발하 51

58 TiO 2 나노입자를이용하여 0.3% TDI 혹은대조군인 acetone-olive oil(aoo) 를 1일과 8일째에양쪽귀에투여하여감작시킨다음, 14일째에 TiO 2 나노입자를 0.8 mg/kg BW의농도로 40ul 를구강인두쪽으로투여. 하루가지난후 (15일째 ) 마우스는구강인두의경로로 0.01% TDI (20ul) 를투여하여 challenge 반응을유도. 16일째되는날에기도과민반응성 (AHR), 폐세척액분석, 조직병리학적분석, 혈청생화학적분석 ( 혈청 는동시에 2배높은기도과민반응성을보였으며3배증가된염증세포의증가조직병리학적분석결과폐장의부종과상피세포의손상및염증의병변이관찰 급성피 부감작 IgE) 을수행 성시험 TiO 2 나노입자 (129.4 nm in 법 ( 토끼 ) 국소림 H 2 O; 80/20 anatase/rutile; 0%, 5%, 25%, 50%, 100% 피부자극성및감작성이없음 프절시 TiO 2 NPs) 를 3 일반복투여 험법 ( 마우스 ) 급성피부, 안구, 질의점막자극성시험 마우스를 TiO 2 나노입자 ( 크기는제시되지않았음 ; 1000, 2150, 4640, and mg/kg BW) 에 1, 24, 48 시간마다노출 감작성이없음 20 nm 의 TiO 2 나노입자를 단기적인독성을유발 피부노출 14, 28, 42, 56 mg/kg 의농도 주로생화학적수준에서변화가관찰되었 로랫드에 14 일동안노출 으나조직병리학적변화는유도하지않았 52

59 음 -GST 의활성감소 -LDH 와 LPO 의활성증가 nm 의 TiO 2 나노입자 -SGPT, SGOT, BUN 과 creatinine 의증가 (175, 550, 1750, 5000 mg/kg; 매우낮은독성이관찰되었으며토끼에서 80/20 anatase/rutile) 를토끼 는단기적인가역성안구결막의충혈이보 에 48 시간간격으로 14 일간 고됨 경구투여 반복투여 노출된지 2주후, 뚜렷한독성은관찰되지않았음 25, 80, 155 nm 의 TiO 2 입자 암컷마우스에서는 25nm 와 80nm 그룹에 를 5 g/kg BW 의농도로마 서높은혈청생화학적수치의증가 (ALT, 우스에단회경구투여 AST, LDH, and BUN) 가관찰됨 간과신장의조직병리학적분석결과유의 적인변화가관찰됨 간, 신장, 심근에심각한손상을야기했고, 혈당과혈중지질의불균형을유발 TiO 2 나노입자의농도가증가함에따라간 복강내투여 고농도로 TiO 2 나노입자 (anatase, 5 nm; 5, 10, 50, 100, 150 mg/kg BW) 를마우스에 14일반복투여 기능의지표들을크게증가되는반면에신장기능의지표는감소되었고심근기능의지표인 AST, 크레아틴키나아제 (CK), LDH와 alpha- hydroxybutyrate dehydrogenase 의활성은증가하였으며 Triglycerides, glucose 와고밀도 lipoprotein cholesterol 의함량은현저하게감소 TiO 2 나노입자를 0, 324, 648, 972, 1296, 1944, 2592 mg/kg 의농도로복강내투여하고 마우스의복강내투여를통해 TiO 2 나노입자의 LD 50 값은 150 mg/kg BW 임상증상으로는투여군에서소극적인행동, 식욕감퇴, 떨림과무기력과같은급성독성효과의징후를보임 53

60 투여군의혈청에서는 ALT 와 AST 의약한 감소를관찰할수있었으며조직병리학적 24 시간, 48 시간, 7 일, 14 일에 부검하여관찰 검사에서는나노입자들이비장에축적되었고, 폐장에서는 thrombosis 가관찰되었으며폐포중격의비후와간세포의괴사, 아 포토시스, 간섬유증, 신장사구체의종창과 5 nm 의 TiO 2 나노입자를 5, 간질성폐렴들의증상이관찰됨 10, 50, 100, 150 mg/kg BW 염증반응과간손상이연관되어있을것임 의농도로 14 일동안복강내 을제시 반복투여 복강으로부터다른장기로이동한뒤에뉴 신경세포의독성에관한연구 런을필라멘트모양으로변형시키거나염 증세포들로변화하도록유발 TiO 2 나노입자는마이크로입자와는다르게 적혈구를이용한용혈시험 적혈구의비정상적인침강, 응집과투여 In vitro 연구 적혈구를이용한용혈시험 ( 사람적혈구이용, 37 1시간반응 ) TIO 2 나노입자 (5, 10, 25, 100 nm; anatase) 를마우스의대식세포 (Ana-1 and MH-S 의존적용혈이일어남 TiO 2 마이크로입자에의해야기되는용혈이 TiO 2 나노입자보다 73배높음낮은독성효과를유발 cells) 에처리폐섬유아세포에 TiO 2 나노입자 (25 nm, 80 nm; 0, 10, 20, 40, 80 mg/l; 24h) 를처리 폐섬유아세포사이의간극결합과세포내신호전달을억제 (2) 아급성독성 TiO 2 나노입자는조직손상의정도를각각다르게유도하면서혈액을따라순환하고간, 신장과같은폐조직외로도달할수있으며혈관-뇌장벽을통해통과할수있고산화적스트레스반응을통해손상을유도할수있다. 54

61 연구사례 40 nm의 silicon dioxide (SiO 2 ) 가코팅된 rutile TiO 2 나노입자를 10 mg/m 3 의농도로 1일 2시간총 4일간반복흡입노출하거나 4 주간반복노출 결과 폐장의 호중구 증가와 폐 조직에서 TNF-α의발현과 chemokine(cxcl1) 의 발현이증가 10 mg/kg BW에서백혈구수 (1일과 7일 째 ) 와 LDH 활성 (1, 7, 14, 28 일째 ), malodialdehyde(mda)(1, 7, 14 일째 ), 총 랫드기관지내로 TiO 2 나노입자를 1, 10 mg/kg BW 의농도로투여 단백질 (1, 7 일째 ) 의수치가대조군에비하 여매우증가 조직병리학적검사에서 10 mg/kg BW 를 TiO 2 나노입자 (20 nm) 와마이크로입자 (250 nm) 의기관지내주입 3 nm의 TiO 2 나노입자를 13.2 mg/kg BW의농도로주 1회, 총 4주동안마우스의기관지내에주입 TiO 2 나노입자를주 2회, 6주동안 1.0, 0.5, 0.1 mg/ml의농도로 ApoE-/- 마우스의기관지내에주입마우스에 28 nm의 rutile TiO 2 나노입자를 2, 10, 50, 250 μg의농도로 ovalbumin(ova) 에결합하여복강내주입. 마우스들은 OVA, OVA+TiO 2 나노입자, OVA+AlOH 3 를각각처리하였고최종적으로 OVA 단백질을에어로졸로노출 (challenge) 투여한랫드의폐에서는폐장의염증의뚜렷한증가랫드와마우스에서 TiO 2 나노입자에대해서폐세척액의총단백질의증가, LDH 활성및 acid-glucosidase 의증가투여후 28일에주입한 TiO 2 나노입자가폐손상을유발. 폐포모세혈관장벽의투과성의변화지질혈증을유발하였으며동맥경화증의발생과경화반파열을가속화 TiO 2 나노입자는혈청에서 OVA-specific IgE와 IgG1의높은수치와호산구및호중구와림프구의증가, 그리고 Th2 면역반응을유발 OVA-specific IgE의수치는표준보조제인 AlOH 3 보다 TiO 2 나노입자에서더높게유발되었으나두물질은호산구수치와염증유발인자의수치에서는비슷하게관찰됨 55

62 (3) 아만성독성효과 연구사례 21 nm P-25 TiO 2 나노입자를 6 시간 / 일, 5 일 / 주의간격으로 13 주동안 5.0, 2.0, 10 결과폐장에존재하는 TiO 2 의함량은모든동물종에서농도의존적으로증가하였으며노출마지막시점에서최대로증가. 그러나동물종간의상당한차이가있었음 mg/m 3 의농도로암컷랫드, 마우스, 햄스터 에각각흡입노출 TiO 2 나노입자의잔존량이폐에서동등 하다는조건하에랫드는마우스보다더 심각한염증반응을보였으며점차적으로 입자의크기와표면결정구조에따라 TiO 2 의마이크로입자와나노입자의영햐을연구 하기위하여랫드의기관지내로 TiO 2 나노 상피세포와섬유모세포의증식이관찰 입자의표면면적은 30 배의차이가있었 으나폐장에유발된염증은크기에의한 입자 (25, 100 nm) 를 1, 5 mg/kg BW 의농 차이가관찰되지않았음 도로 24시간 1주, 3주에부검하여관찰 TiO 2 마이크로입자와나노입자 (rutile) 를 5, 50, 500 μg을마우스의기관지내에주입 CD 암컷마우스에다양한시간대에 25, 80, 155 nm의 TiO 2 입자를 50 mg/kg의농도로비강내단회노출시킨후 2, 10, 20, 30일에부검 급성에서마이크로입자와나노입자모두가장높은농도에서폐세척액의총단백질량과 IL-6의감소를유도급성기 (24 시간 ) 와아만성 (3 개월 ) 기에도유사한결과가입자의크기에관계없이유발마우스의뇌에서 TiO 2 나노입자가 10일후 25 nm 그룹에서축적된양이증가하였고노출후 20일째에그함량이서서히감소하였으며, 노출후 30일째에는 20일째와같이지속됨뇌에서 TiO 2 나노입자의축적으로인해 80 nm와 155 nm TiO 2 투여군에서는 NE 와 5-HT 의수치가크게증가하였으나 DA, DOPAC, HVA, 5-HIAA 의수치는감소 노출된 TiO 2 나노입자는비점막을통해 56

63 흡수된후에마우스의뇌로이동하고침 착되었을가능성이있음투여 24시간후다양한크기의 TiO 2 나 노입자는 피하층을통과하여피부의깊 숙한곳으로침투할수없다고판단하였 으나 30 일동안 in vivo 실험으로돼지의 귀에나노입자를국소적으로노출시킨 돼지의귀와 BALB/c hairless mice 의피부 를이용한실험 후에는 4, 60 nm의 TiO 2 나노입자들이각질층을통해통과할수있었고표피의깊숙한층으로도들어갈수있었음 hairless 마우스에진피노출 (400μg/cm 2 ) 한 이후 60 일에는 TiO 2 나노입자가피부를 통과할뿐아니라다른조직까지도달할 수있었으며, 몇몇의주요장기에는다양 한병리학적인병변을유발마우스의뇌에서미량원소, 효소및신경 전달물질계의항상성에대해장애를유 발. 또한뇌에서 Ca, Mg, Na, K, Fe, Zn 의함량에상당한변화가있었음 TiO2 나노입자는 Na+/K+-ATPase, Ca2+ ICR 마우스에 5 nm anatase TiO 2 나노입자 -ATPase, Ca2+/Mg2+-ATPase, 를 0, 5, 10, 50 mg/kg BW 의농도로 60 일간 경구투여 acetylcholine esterase, nitric oxide synthase(nos) 의활성도상당히억제 NE, DOPAC, 5-HT 와같은모노아민자 극성신경전달물질의함량과그대사산물 5-HIAA 는상당히감소하였지만, 아세틸콜린, 글루타메이트, NO의함량은크게증가 57

64 (4) 만성독성효과 ( 발암성제외 ) 기존의연구결과들에의하면 TiO 2 의만성독성이미약함을제시하고있다. 연구사례 결과폐렴발생률의증가와편평상피화생, 지속된폐의 반응, 폐세포의증식, 대식세포기능의상실, 폐포상 TiO 2 마이크로입자를돼지나랫 피의화생, 점진적인섬유증식병변및폐포중격에 드에만성흡입노출 서대식세포의축적과같은폐의병리학적변화를유 TiO 2 입자 (20, 250 nm) 를 Fischer 344 랫드에 23.5±2.9mg/m 3 의농도로 12주간흡입노출 5 6 nm의 TiO 2 나노입자를 ICR마우스들에게 2.5, 5, 10 mg/kg의농도로 90일동안반복투여 도 TiO 2 나노입자도유사한결과를보여줌마이크로입자와비교하였을때나노입자에서폐의염증이나손상이더욱크게일어남만성의비장손상이관찰마우스의혈액성분들중에서혈구, 혈소판, 헤모글로빈, 면역글로불린과림프구일부 (such as CD3, CD4, CD8, Bcell, and natural killer cell) 는크게감소되었다. 또한 NF-κB, TNF-α, MMIF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, IL-1β, 교차반응단백질, transforming growth factor-β(tgf-β), interferonγ, Bax, CYP1A1 발현의수치는상당히증가하였으며, Bcl-2 와 heat shock protein 70(Hsp70) 발현의수치는감소 (5) 유전독성 TiO 2 나노입자의유전독성은시험별로차이가있다. 초기의연구에서 TiO 2 는기준시험법에 서유전독성이없다고보고하였다. 그러나최근에 in vivo 와 in vitro 연구를통해서 TiO 2 나노 입자의유전독성이검토되어왔음 ( 가 ) in vivo 유전독성연구 TiO 2 나노입자가염증을일으키는사이토카인의발현과 toll like receptor 의 mrna발현, HPRT의유전자돌연변이, γ-h2ax foci 의유도, DNA 결손과 PCE를증가시켰으며 HO-1, NF-κB와 Hsp70 의발현이증가하는것또한관찰되었다. 그러나어떤연구에서는또한 TiO 2 58

65 나노입자가유전독성이없다고보고하기도하였다. 연구사례 TiO 2 나노입자를 6mg/m 3 의농도로 4시간동안노출 18 nm anatase TiO 2 나노입자를 100 mg/kg 의농도로단회노출한뒤에 15 개월후에폐장을분석음수를통해서 TiO 2 (21nm, P-25) 를마우스에노출 500 mg/kg BW의 TiO 2 나노입자를노출 결과노출한뒤에 24시간후에랫드의심근에서 P38과트로포닌의인산화가증가랫드의폐포 2형상피세포에서 HPRT 돌연변이의빈도가증가일반적인염증이유발 DNA의단일나선및이중나선의절단과염색체의손상을유도하였으며 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine, γ-h2ax foci, micronuclei 와 DNA결손을유도 NF-α, MMIF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TiO 2 나노입자 (5-6nm; 2.5, 5, 10 mg/kg) 90 일반복투여 IL-18, IL-1β, 교차반응단백질, TGF-β, IFN-γ 와 CYP1A1 의발현과 Hsp70 에서의 감소를유발하면서 NF-κB를활성화폐장에서 NF-kB의증가와염증사이토카인 TiO 2 나노입자 (2.5, 5, 10 mg/kg; 90일 ) 를기관지내주입법으로투여마우스에복강의경로로 TiO 2 나노입자를 45일간반복투여 C57BL/6Bom Tac dames 신생마우스에 TiO 2 (surface coated UV-Titan; 1시간 / 일 ; 42 mg UV-Titan/m 3 ) 를노출 TiO 2 나노입자 (UV-Titan) 를출생전암컷마우스에노출 C57BL/6J mice에 4시간 / 일로 0.8, 7.2, 28.5 mg/cm 3 의농도로 5일동안반복흡입 의증가가관찰되었으며, hemeoxygenase-1(ho-1) 발현의증가와 NF-kB억제인자의감소와 Hsp70 발현이관찰됨비장조직에서울혈을유발하면서축적되며림프절의증식과비장세포의아포토시스를유발 UV-Titan 노출은교미시기의마우스나그들의자손에있어 DNA나선의절단을유도 하지않았음생식세포에서 expanded simple tandem repeat(estr) loci 돌연변이를유도하지않았음 TiO 2 나노입자 (74% anatase; 26% brookite) 는폐장상피세포에서 DNA의손상을유발하지않았으며골수세포를이용한소핵시험 59

66 TiO 2 나노입자 (1,2, and, 5g/kg BW) 의구강투여 2년간 TiO 2 나노입자 (10.4mg/ m3 ) 를랫드에흡입 에서음성으로관찰됨소핵시험을수행한결과음성으로관찰됨폐장에서 DNA 부가체의형성이관찰되지않았음 ( 나 ) in vitro 유전독성연구 많은세포와동물실험에서마이크론크기와나노크기의 TiO 2 입자의유전독성을조사하기위해수행되었으나시험결과들은서로달랐다. 세포주를이용한실험에서는호흡계와순환계유래세포에서유전독성이나타난반면에을보였다. 종합적으로보면많은연구들이다른관점에서연구된것보다 TiO 2 나노입자의유전독성이더큰것으로나타내고있다. 연구사례 TiO 2 나노입자를높은농도 (30μg/ml) 로인간유래망막상피세포 (ARPE-19) 에처리구형의 anatase 와 rutile TiO 2 나노입자 ( nm) 를 A549 세포에노출 TiO 2 나노입자를랫드의폐포대식세포인 NR8383 세포에처리 rutile TiO 2 나노입자 (30.6nm; 20μg/ml) 를 μg/ml 로인간양막상피 (WISH) 세포에처리 human lymphoblastoid 세포에 0, 26, 65나 130μg/ml 의 TiO 2 나노입자 (7-8 nm) 를 6, 24, 48시간동안처리 Human monoblastoid cell line(u937) 에 mg/ml로 24, 48시간동안노출사람림프구를이용사람상피세포를이용 Comet assay와 DNA laddering technique 으로식물세포와사람림프구에서 TiO 2 나노입 결과소포체의형태로핵주위에서관찰 DNA에대한단일나선의절단과산화스트 레스를야기할수있음세포외 ROS, HO-1 그리고 NOS mrna 발 현과 TNF-α의증가를유발카탈라아제의활성과 GSH 수준에서유의적인감소를보이는반면, olive tail moment(otm) 는 14배가증가함. 또한세포외 ROS 생성을 1.87 배증가시켰으며, G 2 M 기를 7.3% 증가시킴소핵 / 이핵이되는세포의빈도를약 2.5 배증가시켰으며 (130μg/ml), tail moment 를약 5배증가시켰으며 (65μg/ml) HRPT 돌연변이 빈도를약 2.5배증가시킴 (130μg/ml) TiO 2 나노입자 (<100 nm) 가세포자멸사적변 화와괴사적변화모두를일으킴 TiO 2 나노입자가소핵형성과 DNA 절단을 유의적으로증가산화적 DNA 손상과소핵형성이 ROS와연 관이있음 TiO 2 나노입자가높은농도에서는 DNA 손상을감소시켰지만낮은농도 (0.25 mm) 에서 60

67 는유전독성을일으키는반면마이크론크기 자의유전독성을측정 Anatase, rutile, SiO2 코팅처리된여러종류의 TiO 2 입자의유전독성을평가사람폐상피세포 (NCI-H292) 와인간급성단핵구성백혈병세포 (THP-1) 에폴리에틸렌글리콜 (PEG) 로코팅한 TiO 2 나노입자 (P25; 의 TiO 2 입자는항상 1.25 mm이나그이상의농도에서유전독성이유도됨 anatase TiO 2 나노입자와 rutile 마이크론입자가 SiO 2 로코팅된 TiO 2 rutile 나노입자보다더효과적으로유전자의손상을유발세포독성과스트레스관련유전자의발현이유의적으로감소되 25nm; 80/20 anatase/rutile) 를처리사람간암 HepG2 세포에서두가지타입의 TiO 2 나노입자 (<25nm anatase: TiO 2 -An) 와 (<100nm rutile: TiO2-Ru) 에대한유전독성을 Comet assay로측정 1.0μg/cm 2 의 TiO 2 입자를 SHE 세포에 시간동안처리 Chinese hamster ovary K-1(CHO-K1) 세포를이용한실험 CHO 세포 (0, 10, 20, 40μg/cm 2 ) 를이용한만성시험 (60일 ) TiO 2 나노입자 (aeroxide P % 73-85% anatase, 14-17% rutile, 2-13% amorphous) 를 인간피부섬유아세포에처리 TiO 2 나노입자 (28nm; 90/10: anatase/rutile) 를 A549 세포 (0, 2.5, 5, 10, 15, 20, 40μg/ml; 24h) 에처리 TiO 2 나노입자 (10 nm anatase; 0-200μg/ml; 24h) 를 TK6 세포에처리 CHO 세포를이용한생체내포유류염색체 이상시험표면처리한 rutile TiO 2 나노입자 (7±2 nm 50±10 nm) 를 Caco-2 세포에처리 TiO 2 -An이지속적으로유전자의손상을유발마이크론크기의 TiO 2 입자를처리한 SHE 세포에서소핵형성이증가하지않은반면에나노입자는유의적으로소핵을유도 TiO 2 입자의소핵유도가유의적으로증가 TiO 2 나노입자 (100% anatase, 25 nm) 에의한세포독성과유전독성이나타나지않았음농도의존적으로 (10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000μg/ml) 세포독성과유전독성을유도 ROS 생성이나 γ-h2ax 발현의증가를유도하지않음유전독성을일으키지않음음성의결과를보임유전독성을유도하지않았음 61

68 (6) 생식독성과발생독성 TiO 2 나노입자가태반을통해태아의조직으로이동하는것이가능하다는실험적증거가있을지라도, 사람이 TiO 2 입자에노출되면생식독성과발생독성을유도하는지아닌지는아직까지정립되어있지않다. 많지않은생체내 외시험에서는 TiO 2 나노입자에노출되면생식독성과발생독성이분명히일어날것이라주장한다. 연구사례 결과새끼의생식기와두개골의신경계에손상을줌 쥐의태아에 TiO 2 나노입자 (25 와 70nm; 16mg/kg) 를 3, 7, 10, 그리고 14 일동안피하노출 임신한쥐에피하투여 (100μl 의 TiO 2 suspended at 1μl/μl) 지름이각각 70 과 35nm 인실리카와 TiO 2 나노입자를임신한쥐에정맥투여 에너지 - 분산형 X-ray 분광기를이용해서태아때노 출된 6 주령수컷쥐의고환과뇌에서 TiO 2 나노입자를발견했는데, 이는 TiO 2 나노입자가혈액고환장벽과혈액뇌장벽 (BBB) 모두관통할수있다는것을의미 수컷태아 ( 배아 16 일령 ) 와새끼 ( 생후 2, 7, 14, 그리고 21 일 ) 의뇌조직에서뇌발달, 세포사, 산화스트레스에반응하는관련유전자의발현과주산기동안뇌의미토콘드리아활동성에변화가있음 임신합병증을일으킬수있음 TiO 2 나노입자가디젤배기가스나카본블랙나노입 생체외시험에서쥐의고환레이디히세포에대한 TiO 2 나노입자의영향에대해조사 자보다레이디히세포에더많은세포독성을가지고 있음 TiO 2 나노입자는레이디히세포로흡수가되고, 생존 능력, 증식과유전자발현에영향을미침 TiO 2 나노입자는태반, 태아의간과태아의뇌에서발견됨 TiO 2 를처리한쥐는 TiO 2 를처리하지않은대조군보다작은자궁과작은태아를가짐 바. 발암성 (1) 실험적연구 연구사례 높은농도의마이크론크기의 TiO 2 입자 (<2.5um; 250mg/m 3 ; 2년 ) 와 TiO 2 나노입자 (<100nm; 10mg/m 3 ;2년 ) 를쥐에게노출 직업상 TiO 2 가노출되었을때인체건강상의위험성을평가하기위해서설치류 ( 랫드 ) 의 결과기도암을발생같은질량농도일때, TiO 2 나노입자가마이크론크기의 TiO 2 입자보다랫드에서발암가능성이더많은것으로보임랫드를기반으로추정한 working lifetime 에서폐암의 0.1% 초과위험과관련된 TiO 2 나노입자의공기중농 62

69 도는약 0.07 에서 0.3mg/m 3 정보를바탕으로폐선량측정방법을사용하여추론 암컷랫드에다른농도의친수성 TiO 2 나노입자나 anatase 나노입자 (21-25nm; 1/week for 30weeks) 를기관내투여 암컷랫드에 TiO 2 입자 ( 입자 대략의직업적노출범위 : 마이크론크기의 TiO 2 입자 는 mg/m 3, TiO 2 나노입자는 mg/m 3 이러한위험분석은각각 0.3 과 2.4mg/m 3 의 TiO 2 나노 입자와마이크론크기의 TiO 2 입자에대한권장노출한계치의개발을형성하는기초가됨친수성 TiO 2 나노입자나 anatase 나노입자를투여받은 랫드에서폐암의발병정도 ( %; 선종 / 암종과편평세포상피종 / 편평세포암종이복합적 ) 는대조군 (0%) 보다유의적으로높았음 anatase 나노입자역시유의적으로높은폐암발병정도 ( %) 를유도했다. TiO 2 친수성나노입자그룹의양성과악성종양의발생정도 (6.7%) 는유의적이지않았음 크기는설명되어있지않음 ; 11.3mg/m 3 ; 24 개월, 그후에 6 개월동안관찰 ) 를기관내투 cystic keratinizing eplitheliomas 의발병정도 (11.7%) 와편평세포암종의발병정도 (4.8%) 는대조군그룹 (0.5%) 보다유의적으로높았음 여 0, 1.0, 2.0, 이나 5.0% 의운모 5.0% 만큼의높은식이농도에서운모로코팅된 TiO 2 가독로코팅된 TiO 2 가포함된식이성학적으로나발암성의효과를생산한다는증거를발견하를 130주동안랫드에먹임지못함 피부발암에민감한 C-Ha-ras pro-oncogene transgenic(hras128) 랫 피부발암연구 (2) 역학적조사 드와그들의야생형형제들을 10 주동안일주일에 2 번씩등피부를면도해서 UV-B 광선에노출시켰으며, 면도한부분은랫드가사망할때까지일주일에두번 100mg/ml 의 TiO 2 나노입자를발라주었음. 실험결과종양발생정도는 UV-B 대조군과차이가없었음 두단계의피부화학발암모델을이용하여실리콘오일에현탁된실 리콘이코팅된 TiO 2 나노입자 (35nm; 8 주와 40 주동안일주일에 5 번 ) 와 Pentalan 408 에현탁된코팅되지않은 TiO 2 나노입자 (20nm; 28 주나 40 주동안일주일에두번 ) 의촉진효과에대한연구한결과, 실리콘으로코팅된 TiO 2 나노입자와코팅되지않은 TiO 2 나노입자는건강하거나손상된피부모두관통하지못하는것으로분석됨 지금까지의 TiO 2 입자에노출된작업자를대상으로한역학적조사는작업적노출과폐암의 위험성증가사이의연관성을발견할수없었다. 마이크론크기의 TiO 2 입자에노출된작업자 에대한역학적연구는직업적노출과암에대한위험성증가사이의연관성을찾아내지못했 63

70 다. 안타깝게도 TiO 2 나노입자단독으로유도되는건강상의부작용에대한역학적연구는존재하지않는다. 동물발암성연구에서는 TiO 2 나노입자를흡입또는기관지를통해투여했을때종양을생성할수있음과동일한질량단위일때, 마이크론크기의 TiO 2 입자보다더많은발암성을가지고있다는것을보여준다. 사. 발암화의분자적메커니즘 (1) ROS의생성 - 폐에 TiO 2 의축적은 ROS와상피증식을형성하게하여만성염증으로이어지고, 결국은돌연변이와종양을형성하게한다. - 폐조직에서미토콘드리아기능장애의결과로생성된 ROS는 TiO 2 나노입자 (Wistar rat; 1,5,10,25 와 50μg/ml;< 25nm;1 시간 ) 와관련있다. - HaCaT 세포를이용한연구에서는 TiO 2 나노입자 (anatase, rutile과 anatase/rutile; 4, 10, 21, 25와 60nm; 200μg/ml) 가 UV-A 광선아래에서 ROS 생성과세포손상을유도할수있다는것을보여줬다. 세포의생존능력또한용량의존적으로감소하였다. UVA 광선이조사된 100nm 이하의 TiO 2 는 ROS 매개를통하여 Fas와 Bax의활성을증가시켜세포자멸사적인세포사를유도한다. - 장기연구 ( 기관지투여 ; 2.5, 5와 10mg/kg) 에서는 15일과 75일에 TiO2 나노입자 (5-6nm) 가폐에서산화적손상을일으키고 (Nrf2), HO-1과 glutamate-cystine ligase catalytic subunit(gclc) 의발현을높이며 90일째부터는감소하기시작한다. - ROS-매개산화스트레스, p53, Bax와 caspase-3 의활성과같은산화적 DNA 손상은 human embryonic kidney(hek) 293 세포에서 TiO 2 나노입자 (anatase; 25nm; 50, 100 과 200μ g/ml; 24, 48, 72시간 ) 에의해유도된세포자멸자의기계적경로에관여한다는것을찾아냈다. 이러한증가는용량의존적패턴을보였다. 또한신경세포인 PC12 세포에서 anatase TiO2 나노입자 (20nm; 25,50,100,200μg/ml) 에의해유도된 G2/M 세포주기의중단과세포자멸사에 p53 과 JNK 활성이관여한다는것을보여주었다. - TiO 2 나노입자 (anatase; 30nm; 50μg/ml) 의결정크기는 OH의생성에큰영향을미치지만, OH의생성에관한최적의크기는두결정형태 (anatase과 rutile) 사이에차이점을보였다. CHO 세포에서 OH의생성과세포독성사이에중요한관련이있음이관찰되었다. 64

71 (2) 염증의유도 - TiO 2 나노입자 (anatase; 20nm; rutile, 80nm; mg/kg) 는마우스의폐모델에서사이토카인의인터루킨-1계 (IL-1α) 신호를받으며 TiO 2 나노입자에의한 IL-1R 신호는석면의신호와유사하다. - 쥐에위내투여한 TiO 2 나노입자 (5-6nm; 2.5,5,10mg/kg; 90일동안매일 ) 가야기하는신장염에서 IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 과 IL-18 의발현이증가함을보여주었으며, TiO 2 나노입자는 NF-κB를활성화시키고 Hsp70 발현을감소시켰다. - TiO 2 나노입자노출 ( 복강내투여 ; 40mg/kg BW) 된지 4시간후에폐포세척액에서호중구의유입, 단백질수준과기관지폐포세포의 ROS 활동성이증가하는것을볼수있었다. - anatase 와 rutile TiO 2 나노입자 (<100nm, anatase/rutile 99.5% 미량금속기반 ; mg/ml) 의혼합물이비만세포 (RBL-2H3 세포 ) 에서히스타민분비를유도한다는것을나타냈다. - 비만세포가 TiO 2 나노입자에노출되면 ROS 생산을유도하고 PLC 활성화를자극하여막 L 형 Ca2+ 채널을활성화시켰다. 세포밖의 Ca2+ [Ca2+]i 의유입이일어나고, IP3-IP3 수용체경로와결합되었을때활면소포체에존재하는 Ca2+ 의방출과그이후히스타민분비를유발했다. TiO 2 나노입자가유발하는발암의정확한메커니즘은불명확하다. 많지않은데이터는발암유전자의세포신호변화뿐만아니라 ROS, 산화스트레스가상대적으로높은농도의 TiO 2 나노입자의발암성에중요한역할을할것이라는것을보여준다. 추가연구들은가능한너무많은용량의영향과혼란을피하기위하여직업과관련된낮은투여농도가필요하다. 아. 요약일반적으로마이크론크기의 TiO 2 입자는낮은독성을가진물질로간주되었다. TiO 2 나노입자를마이크론크기의 TiO 2 입자와비교했을때그들의생물학적특성에변화를줄것이라생각되는다른물리화학적특징을가졌다. 현재그들의독성에대한이해는인간노출에대한추정을필요로하는제한된실험동물이나세포배양연구의수에따라달라진다. 역학적연구는지금까지 TiO 2 입자의직업적노출과암의위험성증가사이에연관성을발견할수없었다. TiO 2 나노입자의물리화학적특성은그들의생물학적이용도와독성에많은영향을미친다. 정보의대부분은 TiO 2 anatase 나노입자가세포독성이나유전독성이있다는것을의미한다. 그 65

72 러나이러한결과들은 TiO 2 anatase 나노입자만을이용한연구를바탕으로한다. 직업적노출에서 TiO 2 나노입자의흡입은일반적으로인체로들어가는주요한경로이다. 폐염증반응과폐암은 TiO 2 나노입자에노출되는동안실험동물에서대부분관찰되는중요한부작용이다. 일부흡입연구의경우와같이현실적인용량만을사용할때에도염증성반응은여전히눈에띄는영향을보인다. TiO 2 나노입자는폐나계통순환을통해위장관으로흡수되고간, 신장, 비장과같은다른기관에분포하거나심지어뇌에국소적인영향을미치기도한다. 그러나현재전이비율은불확실하다. 몇가지증거가 TiO 2 나노입자가인체의피부에침투할수없는것으로나타났다. TiO 2 나노입자가혈액-뇌장벽, 혈액-고환장벽, 혈액-태반장벽을침투할가능성을보여준다. 그러나전이비율이낮은것으로나타났고조직부위에서입자의전위에대한전신반응과관련된증거는부족하다. 많은연구들이 TiO 2 나노입자의유전독성을조사하기위하여생체내 외시험을수행했으나, 결과들은상반되고투여된용량들 (employed doses) 은높았다. 몇가지생체내 외시험을통해서실험동물이나세포배양에서특정한생식독성이나발생독성들이관찰되었다. TiO 2 나노입자에사람이노출되었을때생식독성과발생독성이발생하는지의여부는불명확하다. 동물실험은지속적인노출후에기관이나조직에 TiO 2 나노입자가축적될수있음을나타낸다. 전신장기에서 TiO 2 나노입자의축적에대한반응은추가적인연구에서평가될필요성이있다. 게다가 TiO 2 나노입자가유도하는 ROS의생성과세포신호전달경로의변화는상대적으로높은농도의 TiO 2 나노입자에의한발암원인에서중요한역할을할것이다. 그러나이러한연구들은너무많은입자가문제되지않는보통의직업과관련된용량이나환경노출조건에서반복해야한다. 그럼에도불구하고 TiO 2 나노입자가마이크론크기의 TiO 2 입자보다더큰독성을나타낸다는결과는현재이용할수있다. 이러한정보들은무시할수없고, 작업자의건강을보호하기위한예방수칙의개발은반드시필요하다. 66

73 TiO 2 나노입자에대한 risk profile 전문 - 이산화티타늄 (TiO 2 ) 의특성전통적으로이산화티타늄 (TiO 2 ) 는거의녹지않고독성이낮은입자로알려져있다 [6,7]. 이러한이유때문에많은나노입자의연구에서 TiO 2 를 음성대조군 으로사용하고있다 [8]. 그러나마이크론크기의 TiO 2 (fine TiO 2 ) 를이용하여 2년간흡입독성시험을수행하였을때 TiO 2 는폐암을유발하는것으로보고되었다 [9]. 이데이터를바탕으로국제암연구소 (IARC) 는 TiO 2 를 Group 2B 발암물질 ( 사람에발암가능성이있음 ) 로분류하였다 [10]. 그러나 fine TiO 2 의발암효과는 TiO 2 가가지는특별한발암성때문이아니라과도한노출에의한것이아닌지에관해서많은논란이되고있다 [7]. TiO 2 나노입자는마이크론크기의 TiO 2 입자보다훨씬강한촉매작용을하기때문에산업과소비재에많이사용되고있다. 이러한강한촉매작용은나노입자의크기가작아지는것에의해서생기는특성이며, 이러한표면의강한활성은 TiO 2 나노입자가생체내에노출되었을때예기치못한안전성의문제를유발할수있음을예상할수있다 [11, 12]. 여러가지나노물질중에서 TiO 2 나노입자에관한연구논문의수는상대적으로많으며, 이는많은연구자들이 TiO 2 나노입자의안전성에관해서우려하고있다는것을의미한다. 다양한투여경로를적용한다양한동물모델이수행되었으며, 여기에는흡입, 피하투여, 기관지내삽입, 경구투여, 위내삽입, 복강내투여, 혈관내투여등이포함된다. TiO 2 나노입자에관한안전성연구결과나노입자가마이크론입자들보다독성이더강하다는것이보고되었다 [8, 13, 14]. 그러나랫드를이용한기관지내삽입방법으로다양한크기의 TiO 2 나노입자의염증유발능력을평가하였을때입자가유발하는염증이질량기준 (mass metric) 보다는표면면적기준 (surface area metric) 이더적합하다는결과를보고하였다 [15, 16]. 이러한연구결과는나노물질의투여농도기준을설정하는데중요한연구결과이지만, 폐장의급성염증모델에한정되어서검증이되었고, 다른투여경로에관해서는연구결과가거의보고되고있지않다. TiO 2 나노입자의광범위한활용은결국나노입자가사람과환경에노출되는가능성이커진다는것을의미하며, 결과적으로사람과동물, 가축등에건강위해성을가질수있음을의미한다 [17]. 따라서본보고서에서는 TiO 2 나노입자의위험성확인관점에서지금까지이루어진다양한독성시험결과에관해서기술하고, 나아가서다양한독성시험자료를추출하는기법을이용하여 TiO 2 나노입자의위해평가를수행하고자한다. 비록나노입자의정의가 100 nm이하의입자로규정하고있지만본연구에서는 100 nm 이상의입자에대해서도데이터를추출하였고, 이를이용해서입자의농도설정기준에관해서비교하는연구를동시에수행하였다. 67

74 물리화학적특성 (physicochemical property) 티타늄은흙에서 9번째많은원소이며대략 4400 mg/kg의농도로존재하고, 지구상에서매우광범위하게분포하고있다. 티타늄은산소나다른원소에친화력이매우크기때문에자연적으로 Ti 자체로만으로는존재하지않고산화되어관찰되며가장흔한산화는 +4 이며, 이외에도 +3, +2 도존재한다. 산업에서가장많이사용되는티타늄계열의물질은 Ti, TiO 2, TiCl 4 이며 TiO 2, titanic acid anhydride, titania, titanic anhydride, Ti white가 Ti가산화된형태로존재하는형태이다. TiO 2 는연소성이없는무취의백색가루로서분자량이 79.9 g/mol, 끓는점이 2972, 녹는점이 1843, 비중은 25 에서 4.26 g/cm3이다. TiO 2 는거의녹지않는물질로알려져있으며, 페인트등의백색착색제로활용되고있다. 구조결정형에서 TiO 2 는 anatase, rutile, brookite 가있으며, anatase가화학적으로더반응성이높다고알려져있다 [18, 19]. 예를들어 anatase 형태의 TiO 2 는 rutile 형태보다 UV 조사이후에활성산소 (ROS) 를더많이생성하며, 이는 anatase가 rutile 보다독성이강함을의미한다 [20, 21]. 그러나 anatase가생성하는활성산소는정상적인빛조건에서는생성되지않고반드시 UV에조사되었을경우에생성된다는특징이있다. 일반적으로입자상물질의독성에영향을미치는인자로는모양, 크기, 표면특성, 그리고화학적구성성분이있다. 지금까지마이크론크기의 rutile 형태의 fine TiO 2 는화학적으로안전하며독성이없는것으로알려져왔으나나노기술의발전에따라서입자의크기가나노크기로만들어짐에따라서급격하게증가한표면면적과작은크기로인해서많은과학자들은 TiO2나노입자의안전성및인체위해성에관하여우려하게되었다 [22, 23]. 또한 TiO 2 나노입자의표면의특성을코팅등을이용하여변화시키게되면입자의반응성이변화하게되고이는안전성과도상관성이있음이보고되었다 [24, 25]. TiO 2 나노입자의활용 TiO 2 는밝은색과높은반사율을가지고있기때문에백색의페인트등의색소로활용된다. 세계적으로 1년에대략 4백만톤의색소가사용되는데, 그중 70% 는 TiO 2 가차지하고있으며 [26, 27] 나노물질중에서 5위안에드는생산량을가지고있다 [28]. TiO 2 는페인트, 코팅, 플라스틱, 종이, 잉크, 의약, 약학, 식품, 화장품, 치약등에활용될수있다 [29-31]. 더나아가서는전지분유의색을하얗게보이게하기위해서도사용되고있다. 화장품에서 TiO 2 나노입자는선크림에많이활용되고있다 [32]. 또한신체에적용하는다양한합금임플란트의구성성분으로도활용되고있다 [33, 34]. 68

75 현재 TiO 2 나노입자는높은안정성과부식이되지않고광촉매성이있기때문에반도체의광촉매제나물이나산업폐기물의정화에활용되거나태양전지에이용되고있다 [36, 37]. 또한산업적으로광촉매성질을이용한스스로청소가되는유리창문 (self-cleaning window) 이나옷감 (self-cleaning textile), 그리고습기가차지않는자동차유리 (anti-fogging car mirrors) 에도활용된다 [39]. 의학분야에서는 TiO 2 나노입자는영상과치료에활용하기위해서연구가되고있다 [37]. 노출경로와한계티타늄은정상적인동물의조직에서도매우낮은농도로검출되지만 [42], 티타늄이인체와동물에서필수성분이라는증거는없다. 먹는물에서도티타늄복합체는낮은농도로검출되며정상적인음식섭취에의해서도티타늄은 μg/day의농도로섭취된다. TiO 2 입자는다양한크기로만들어지며사람에노출되는경로는대부분작업장이나소비과정에서이루어진다. TiO 2 나노입자의노출형태는에어로졸, 용액, 혹은이멀젼으로구분할수있으며가장흔한노출경로로는작업장에서의흡입노출과피하노출이될수있다. 지금까지피하에노출될수있는나노물질의종류는 150 개정도로보고되었으며, 그중에서 TiO 2 는자외선차단제등에사용되고있기때문에피하노출이가장많이일어나는물질이다 [2]. 그이외에도 TiO 2 나노물질은치약, 식품, 영양보조제로노출될수있기때문에경구노출이두번째로우려되는경로이다. 최근의연구에의하면사탕, 껌종류의제품에서매우높은양의 TiO 2 나노입자가검출되었다 [44]. 나노의학에서는 TiO 2 나노입자를이용한의약품을혈관내혹은경피의경로로주입할가능성이매우높다 [45]. TiO 2 나노입자가페인트등에섞여있는경우에는떨어져서다시호흡되거나피하에노출되지않는다면훨씬안전한것으로알려져있다 [46]. 미국 FDA에서는 TiO 2 를식품의색소첨가제로사람체중당 1% 미만의농도로노출되는것을허용하고있다. 또한 FDA는 TiO 2 나노입자를식품포장용제제로활용할수있도록하였다 [47]. 그러나 FDA의허가는나노입자에특이적인허가가아니기때문에 TiO 2 나노입자에관한노출한계를설정하는것이필요할것으로판단된다. 미국정부기관산업안전위생담당자회의 (The American Conference of Governmental Industrial Hygienists) 에서는마이크론크기의 TiO 2 (fine TiO 2 ) 의안전성에관한노출한계역치 (Threshold Limit Value) 를 10 mg/m3, 8시간 / 일, 40시간 / 주노출로결정하였다 [48]. 또한마이크론크기의 TiO 2 (fine TiO2) 의허용한계 [Permissible Exposure Limit(PEL)-Time Weighted Average(TWA)] 는 15 mg/m3으로결정되었다 [49] 년 11월에미국 NIOSH에서는 TiO 2 나노입자에관하여권장노출한계치로 0.3 mg/m3을설정하였으며, 이는마이크론크기의 TiO 2 69

76 (fine TiO 2 ) 에비하여 10배낮은농도이다. 일본의 NEDO(New Energy and Industrial Technology Development Organization) 에서발간한 TiO 2 나노입자의위해평가 보고서에따르면 TiO 2 나노입자의허용가능한노출한계를 1.2 mg/m3 (8시간/ 일, 40시간 / 주 ) 로결정하였다 [51]. 또한 NEDO의보고서에의하면 P25 TiO 2 ( 현재사용되고있는 TiO2 광촉매중효율과상업적빈도가가장높은 Degussa 사의제품이며구성은 80% antase + 20% rutile로되어있고 nm의입자크기를가지고있음 ) 에대하여 NOAEL을 1.2 mg/m3 (8시간/ 일, 5일 / 주 ) 로판단된다고하였다. 작업자에대한 TiO 2 의노출은생산과정에서주로일어나지만, 그이외에도혼합, 포장, 청소하는과정에서도충분한양으로노출될수있다 [52]. 호서대학교의유일재교수팀에서는한국의노동환경에서 TiO 2 의작업자노출을평가하였으며, 그결과 TiO 2 나노입자의작업장농도는 mg/m3이었다 [53]. 또한작업장에서 TiO 2 나노입자의입자수기준은 particles/cm3 이며, 크기분포는 nm 이었다. 작업장에서이러한나노입자의노출을줄이는효과적인방법으로는적절한환기, 필터링, 그리고적절한우수작업장기준을갖추는것이다 [54]. 결론적으로 TiO 2 나노입자의노출은호흡기노출이일차적인경로이며소비자들도 TiO 2 나노입자를함유한다양한스프레이제품을통해서노출이가능하다. 식품을통한경구적노출도가능하며화장품이나자외선차단제등을통한피하노출도가능하다. 혈관내노출은의약품으로적용할때가능할수있으나, 아직개발된제품은없는실정이다. 또한더많은노출정보에관한연구가이루어져야될것이며, TiO 2 나노입자의합성, 제품, 소비자노출, 환경노출, 소각등의생애전주기에관해서거동에관한연구가진행되어야한다고판단된다. TiO 2 나노입자의독성동태 독성동태 (toxicokinetics) 는물질이생체내에들어오는비율과이후의운명에관하여연구하는 분야이며, 여기에는흡수, 분포, 대사, 배설이관련되어있다. 흡수나노입자가노출된부위에서혈액이나림프액으로이동하고전신순환을거쳐서대상장기로이동하는과정은독성동태에서매우중요한단계이다. 이때노출경로는흡수율을결정하는가장중요한요소이며, 대표적으로경구, 흡입, 혈관내, 복강내, 경피, 및피하노출을예로들수있다. 70

77 위장관흡수위장관계통은 TiO 2 나노입자의중요한흡수경로가될수있으며, 이는 TiO 2 나노입자가약물전달체, 식품, 음료수와물등에사용될가능성이매우높기때문이다 [55, 56]. 나노의학에서위장관계통의흡수는의약품의경구흡수율을증가시키거나백신의흡수율을증가시키기위해서개발되고있다 [57]. 마이크론크기의 TiO 2 (fine TiO 2, 500 nm) 를랫드에경구투여하였을때전신순환과다른장기로의이동이관찰되었다 [58]. TiO 2 입자의위장관내흡수의경로는 payers patch 로예상되는데, 이는 TiO2 입자들이림프절에상대적으로높은농도로존재하기때문이다. 다른연구에서는 25, 80, 155 nm의 TiO 2 를단회경구투여하였을때체내로흡수되는것을관찰하였다 [59]. 반면다른연구에서는 TiO 2 나노입자를 13주반복으로경구투여하였을때 TiO 2 나노입자가채내고거의흡수가되지않는다는것도보고되었다 [60]. TiO 2 나노 입자를 경구투여했을경우나노입자들이림프조직을통해서흡수가되는것으로제시되고 있으나, 더많은연구가필요하다. 또한대부분의경구투여독성시험에서투여농도가비현실 적으로매우높은수준이기때문에사람에노출되는것에관한정도와가능성은예측하기어 렵다. 피하흡수 TiO 2 나노입자는화장품과자외선차단제로사용되며제품으로도판매되고있기때문에피하흡수는매우관심이높은분야이다. 사람의외피는단단한층인피하층을가지고있기때문에무기물파티클이쉽게통과할수없는구조로되어있다. 이론적으로는옥탄올 / 물분배계수 (octanol-water partition coefficient) 가적절하고분자량이적은물질만이사람피부의피하층을쉽게통과할수있다. 따라서무기물질이정상적인피부를일반적인상황에서통과한다는것은매우가능성이낮은일이다 [60]. 따라서비록화장품과자외선차단제가 TiO 2 를함유하고있더라도정상적인피부를통과하기어렵다는점은매우의미가있는결과이다. 그러나물리적으로피부가손상된상태에서는물질의흡수가될수있으나, 지금까지의연구결과에의하면 TiO 2 입자들은손상된피부와정상적인피부모두에서피하층을투과할수없다고한다 [60-65]. 전자현미경으로피부를투과한나노입자를관찰하였을때에는 TiO 2 입자들이모공에들어가있지만진피와살아있는표피층은통과하지못하였다. 또다른연구에서는 TiO 2 나노입자를 oil-in-water 이멀젼으로만들어투여하였을때 TiO 2 나노입자가털이있는피부를모공을통하여통과하였다는결과를보고하였다 [69]. 그러나투과한나노입자의운명에관해서는연구가되지못하였으며각연구에따라서결과는약간씩다르기때문에더많은연구가 71

78 필요하다. in vitro 실험에서도유사한결과가보고되었다는데, 예를들면돼지의피부를이용하여정상, 손상된피부, 자외선노출된피부, 손상된자외선노출된피부에 TiO 2 나노입자 (20 nm) 를노출하였을때 TiO 2 나노입자는모든피부에서피하조직의최상단에존재한다고보고하였다 [73]. 또한정상적인사람의피부조직에서도 TiO 2 나노입자는각질층을뚫고피하층으로침투하지못한다는것을보고하였다 [74]. 그러나하나의연구결과에서 TiO 2 나노입자가피하조직을통과한다고보고하였으나, 그결과는흡수된나노입자의다른장기에분포하는결과가없었기때문에완전한연구가아니라할수있다. 전체적으로대부분의연구결과는 TiO 2 나노입자가살아있는조직을통과할수없다고한다. 폐를통한흡수폐를통한흡수연구는다양한노출방법에따라서약간다를수있으며, 대표적인노출방법으로는흡입, 기관지내삽입, 구강흡입방법이있다. 흡입은나노입자를입자상으로분산시켜서흡입하도록하는방법이며몸전체가노출되는 whole body chamber 와코만노출시키는 nose-only 방법이있다. 기관지내삽입방법은동물을마취후에기관지내에삽관을통해서주사기를통하여나노입자를식염수등에녹여서투여하는방법이다. 구강흡입방법은 intranasal 혹은 oro-pharyngeal exposure 라고도하며실험동물을마취후에입속에식염수등에녹인나노입자를넣고흡입하도록하여폐장으로들어가도록하는방법이다. 흡입에의한노출흡입은 TiO 2 나노입자의대표적인노출경로이며작업장에서주로발생할수있다. 다수의연구들이흡입후 TiO 2 나노입자의독성동태와세포독성, 유전독성을연구하였다. 사람에대한흡입노출을통한흡수데이터는현재없으며실험동물을이용한연구결과에따르면 20 nm TiO 2 나노입자가랫드의폐장에노출되었을때간질조직으로이동하고일부는전신순환을하는것으로보고되었다 [77]. 기관지내삽입에의한노출기관지내삽입방법의장점은정확한양의나노입자를폐장에전달할수있다는것이며, 노출방법이흡입에비하여간단하다는것이다. 그러나기관지내삽입방법은생리적으로정상적인폐장에노출되는방법이아니기때문에노출된나노입자의분포, 제거, 잔류에관한데이터가 72

79 흡입에비하여매우다를수있고, 또한고농도의물질을한꺼번에노출하기때문에흡입에의한저농도반복노출과는다른결과를유발할수있다는것을고려하여야한다. 비록흡입의방법이가장이상적인방법이지만기관지내삽입법은나노입자의위해평가에충분히활용할수있는데이터를생산할수있다 [78]. TiO 2 (21 nm) 나노입자를폐장에기관지내삽입방법으로노출하였을때 42일에간질조직으로이동한것을관찰하였으며, 흡입에의한노출보다기관지내삽입에의한노출이더높은비율의 TiO 2 입자가간질조직으로이동됨을관찰하였다 [15, 16, 78]. 또다른연구에서기관지내삽입후 28일에다른조직으로의이동을관찰하였을때 TiO2 나노입자의혈관내이동과간장이나신장과같은다른장기로의이동이매우제한적으로관찰되었다 [79]. 구강흡입에의한노출흡입은코로대부분이루어지며, 이는비강흡입이라고한다. 비강은호흡부분과코부분의두가지부분으로나눌수있다. 호흡부분에는섬모가있는위중층원주상피 (ciliated pseudostratified columnar epithelium) 로상피가구성되어있으며점막고유층에는혈관이매우잘발달되어있다. 반면에코부분은후각상피세포로구성되어있으며다양한샘조직과신경조직이발달되어있어서후각을느끼는중추로서작용할수있다. 다양한크기의 TiO 2 입자 (80 nm rutile, 155 nm anatase) 를구강흡입을유도하였을때호흡부분의후각신경을타고뇌로입자가전이되는것을관찰하였다 [80, 81]. 결론적으로흡입, 기관지내삽입, 구강흡입의경로를통해서 TiO 2 나노입자를노출하였을때나노입자는혈중으로흡수되어전신순환을통해서전신장기로이동하거나후각신경을타고뇌로이동할수있다. 그러나폐장이외의기관이나장기로의이동하는비율은매우낮은것으로보고되었다. 분포 TiO 2 나노입자의초기흡수이후에입자들은전신순환을거쳐서모든장기와조직으로기본적으로이동할수있다. 나노입자가전신순환으로들어오면, 입자들은혈장단백질성분과결합하고 [82], 혈액성분들 ( 적혈구, 백혈구, 혈소판 ) 과반응하게된다. 먼저혈장성분과의결합은나노입자의거동 ( 분포, 대사, 배설 ) 에중요한영향을미치게된다 [55]. 일반적으로는혈장단백질과나노입자의결합은나노입자의유해한표면특성을표현되지않게하는작용을하여독성을줄이는역할을한다. 이러한단백성분과입자의결합을단백질코로나 (protein corona) 형 73

80 성이라고하며투여되는부위의단백질성분과입자의표면특성과단백질결합의특이성에의해서입자의생체동태와독성은영향을받게된다 [83]. 또한나노입자의단백질과결합하는성질은동맥경화모델인 ApoE knockout 마우스에서입자를반복적으로폐장에노출하였을때혈관내의동맥경화가증가한다고보고되었다 [84]. 또한일반적으로 TiO 2 의노출은대식세포등에의한탐식을유발하지만일부의경우에는비탐식적방법으로세포내에침투하기도한다. 예를들어 TiO 2 (20 30 nm, anatase 99.9%; 5 μg/ml) 는탐식기능이없는적혈구세포안으로침투하기도한다 [85]. 적혈구세포안으로침투한 TiO 2 의경우는적혈구가탐식의기능이없기때문에탐식 (phagocytosis or endocytosis) 작용이외의기전으로세포안으로침투한다는것을의미한다. 탐식작용이외의기전으로세포안으로침투하는기전으로는분산 (diffusion) 이나부착에의한작용 (adhesive interactions) 이제시되고있다 [55, 86]. Wick 등은나노입자가태반-혈관장벽을넘어가는지, 그리고그러한과정이입자크기에따라결정되는지알아보기위하여 ex vivo에서인간의태반관류모델을사용하였다 [87]. 형광폴리스티렌입자들은나노입자모델로서사용되었으며, 그결과 240nm 이하의직경을가진형광폴리스티렌입자가태반에의해흡수되는것을발견하였다. Shimizu 연구팀과 [88] Takeda 연구팀은 [89] TiO 2 나노입자를임신한 mouse의피하에노출하였으며, 그결과 TiO 2 나노입자의피하노출이자손의유전자발현과생식기및두개골신경계에영향을미친다는것을보고하였다. 또한 TiO 2 나노입자의흡입노출에서나노입자가태반혈관장벽을통과할수있다는것도보고하였다 [88-90]. 나노입자는노출된부위에서다른장기로비교적쉽게이동할수있다. 사람에서흡입된입자들은 2μm두께의공기혈관장벽인폐포에서일어날수있다. 독일의 Kreyling 박사연구팀은 nm 범위의 TiO 2 나노입자들이공기혈관장벽을지나다른장기로이동할수있다는것을보고하였다 [91]. TiO 2 나노입자들이혈액으로이동할때, 일반적으로그나노입자들은간이나림프계에서일차적으로위치하다가, 다른장기나조직으로 2차적으로분포되거나체외로배출되게된다. 나노크기의 TiO 2 를 3주간암컷 Wistar 랫드에흡입노출한뒤에 3, 28, 90일간의회복기간을주었을때나노입자가주로폐포대식세포에서발견된다는것과폐포 1형상피세포 (type-i pneumocyte) 에서훨씬적은양이존재한다는것을보고하였다 [92]. 이실험에서입자가많이함유한세포들이거의모세혈관내에서는관찰되지않았으며, 이는입자들이혈관으로거의이동하지않는다는것을의미한다고판단하였다. 나노입자의크기및물리화학적특성이폐장의염증에미치는영향을분석하기위하여 TiO 2 나노입자와폐포대식세포를이용하여연구하였다 [93]. 랫드의폐포대식세포 (NR8383) 에 74

81 TiO 2 나노입자 [(25nm; 80/20; anatase/rutile) 와마이크로입자 (250nm)] 를 10, 20, 40, 80μg/cm2 의농도로처리하고 1, 4, 24 시간이후에변화를관찰하였다. 그결과폐포대식세포는빠르게 TiO 2 나노입자와마이크로입자를탐식하였다. cytochalasin D와 chlorpromazine 과 Fcγ receptorⅡ(fcγrⅡ) 항체를이용한 uptake inhibition 연구에서는마이크론크기의 TiO 2 입자는액틴의존적탐식작용과 macropinocytosis 작용, 그리고 clathrin 에의해서세포내유입이이루어지지만나노크기의 TiO 2 는 FcγⅡR항체에의해좌우된다는것을보고하였다. 따라서이연구결과는 TiO 2 나노입자와마이크로입자가다른메커니즘으로폐포대식세포에흡수된다는것을제시한다. 단회기관지내삽입방법과 12주흡입투여를통하여랫드의폐에서 TiO 2 마이크로입자와나노입자 (12, 21, 230, 250 nm) 의폐장내분포를연구하였을때, 입자의간질로이동은입자의크기와투여용량, 투여횟수와관련이있음을보고하였다 [94]. 또한, 단회기관지내삽입과아만성흡입연구결과동등한질량에서 TiO 2 나노입자 (20nm) 가 TiO 2 마이크로입자 (250nm) 에비해보다많은양이간질로이동할수있음을보여주었다. 기관의절개하여배양한실험에서마이크로크기에비해서 TiO 2 나노입자 (21nm; 5mg/ml; 1h) 가상피로보다빠르게그리고대부분상피아래의공간으로이동한다는것을보고하였다. 마우스에서 3 nm의 TiO 2 나노입자를 13.2mg/kg 의농도로기관지내삽입방법을통하여주 1회총 4주동안투여하였을때 TiO 2 나노입자가뇌-혈관장벽을통해통과할수있음을보고하였다 [79]. 또다른연구에서는비강내주입된 TiO 2 나노입자들이후각신경을통해중추신경계로이동할수있다는것과해마가주대상부위가되는잠재적인뇌병변을일으킨다는것을보고하였다 [80]. 이러한영향은주로나노입자로정의되는 155 nm anatase TiO 2 입자에의해야기되었다. 같은연구팀의또다른연구 ( 기관지내주입법 ; 80nm rutile, 155nm anatase; 30일 ) 에서도비슷한연구결과를발표하였다 [81]. 비강내주입된 TiO 2 나노입자 (25nm, 80nm, 155nm; 50mg/kg BW으로격일투여 ) 의영향은모노아민자극성신경전달물질 [norepinephrine (NE), dopamine (DA), 5-hydroxytryptamine (5-HT), 5-hydroxyindole acetic acid (5-HIAA), 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC), and homovanillic(hva)] 에서노출된지 2, 10, 20, 30일에 CD 암컷마우스에의해규명되었다 [62]. 80nm 와 155nm TiO 2 노출후, 뇌에서 TiO 2 나노입자의축적으로인해도파민, DOPAC, HVA와 5-HIAA 가감소되는동안노르에피네프린과 5-HT 의함량은상당히증가되었다. 이는비강내주입된 TiO 2 나노입자가비점막에의한흡수및뇌에서모노아민자극성신경전달물질의대사와방출에의한영향에이어마우스의뇌로 75

82 전위되고, 침착될수있다는것을의미한다. 그러나이러한결과를뒷받침할수있는후속연 구가반드시필요하다. 정맥으로 TiO 2 나노입자 (70/30 anatase/rutile; 20-30nm) 를혈청단백질에분산하여 5 mg/kg BW 의농도로투여한뒤에 TiO 2 나노입자의조직함량을투여후 1, 14, 28 일후에측정하였다 [13]. TiO 2 나노입자의농도는간에서제일높았고, 그다음으로비장, 폐, 신장의순서로높았 다. 그리고 투여후 1 일째에가장높은잔존량을보였다. TiO 2 나노입자는전실험기간동안 간에서높은농도로검출되었다. 첫날부터 14일, 28일까지비장에서 TiO 2 나노입자수치는점점감소하였고, 폐, 신장에서는 14일쯤에대조군과유사한농도로검출되었다. 이연구는 TiO 2 나노입자가혈액으로부터빠르게제거되어폐, 비장, 신장, 간으로이동하며, 노출후 1, 14, 28일에혈구와혈장, 뇌, 림프절에서 TiO 2 나노입자는거의검출되지않았다. 그러나 TiO 2 나노입자는간과비장에서는지속적으로존재하였으며, 이는간및비장에입자가축적될수있음을의미한다. 그러나이러한연구들은고농도의나노입자가혈관내에투여됨으로써혈관내피세포의손상을입었을수있으며, 혈관내피벽의손상으로인해서장기분포에영향을미칠수있다는사실을고려하여야한다. 2주간의급성독성연구에서 [96], 마우스의복강내에각각다른농도 (0, 324, 648, 972, 1296, 1944, 2593 mg/kg BW) 로 TiO 2 나노입자를투여하고노출후 1, 2, 7, 14일에 TiO 2 나노입자 (80nm, 100nm, anatase) 의장기분포를측정하였다. 시험결과비장에서가장높은농도의 TiO 2 가검출되었으며그다음으로간, 신장, 폐순으로검출되었다. 일부나노입자들은신장으 로부터뇨를 통해배출되었다. 이러한결과는비록복강내투여에서비현실적인고농도를 사용한것이결과에영향을미친것일수도있지만, 복강내투여후 TiO 2 나노입자가다른조직이나장기로이동되고축적될수있다는것을보여준다. 5 nm anatase TiO 2 나노입자를 5, 10, 50, 100, and 150 mg/kg BW의농도로마우스복강내로 14일동안반복투여후조직내분포를연구한결과, 장기에서 TiO 2 나노입자들의분포는간 > 신장 > 비장 > 폐 > 뇌 > 심장의순서로나타남을보고하였다 [97]. 50 mg/kg의농도에서간에서 TiO 2 나노입자의함량은 TiO 2 마이크로입자보다높았다. 또한복강으로주입한나노입자는뇌손상과산화적스트레스를유발하면서뇌로이동한다는것을보고하였다 [98]. 그러나이러한손상과의관련성은고농도의투여가원인이라고분석하였다. 결론적으로다양한연구에의해서 TiO 2 나노입자가정맥이나복강내투여했을경우에다른 76

83 장기로분포되며대부분간에서축적된다는것이보고되었으며비강내투여의경우뇌로이동한다는것이보고되었다. 그러나이러한연구들은예측되는노출 ( 직업적, 의학적, 소비자 ) 보다더높은고농도를사용했기때문에보다정확한평가를위해서는더많은연구가필요하다고판단된다. 대사 지금까지 TiO 2 나노입자의대사와관련된보고는없었다. 배설 다른무기물나노입자와유사하게, 전신순환계에서 TiO 2 나노입자들은신장을통해서뇨로배출되거나담즙을통해서변으로배출되는 2가지잠재적방식에의해서배설된다. The International Program on Chemical Safety 의연구결과에따르면대부분섭취된 TiO 2 는뇨를통해배출되었다고보고하였다 [99]. 간에서담관을통한입자의제거는약물학에서잘알려져있는사실이며, TiO 2 나노입자도이와같은방식으로제거된다 [100]. 또한, 장상피에서흡수되지않은나노입자변을통해서배설될것이라추측된다. 나노입자가흡입되는경우입자는기관지에침착되고폐포대식세포에의해탐식되어호기시에가래의형태로제거되기도하지만때로는삼킴작용에의해서소화관으로넘어갈수도있다. 폐포에침착된나노입자는간질, 림프절, 또는폐의모세혈관으로이동할수도있지만대부분은말단에서대식세포에탐식되어 mucociliary escalator 를통해서가래로배설된다. TiO 2 마이크로입자와 TiO 2 나노입자를폐장에투여하고제거되는양상을분석하였을때폐포에서대식세포의탐식작용을통한제거는마이크로입자가나노입자보다잘일어나며, 그이유는 TiO 2 나노입자가간질로더많이이동하기때문이라고보고하였다 [16]. 유사한결과가흡입시험에서도보고되었는데, 폐장에투여된 TiO 2 나노입자는간질로쉽게이동하기때문에폐포대식세포에의한제거가상대적으로낮았다고보고하였다 [101]. 이결과는폐포대식세포에의해 24시간이내 TiO 2 나노입자가 % 의흡수율을가진다는데이터분석에기반을두고있다. 폐의말단으로부터흡수된나노입자가대식세포에의해확실하게제거되지않는것은잠재적으로전신적인부작용의위험을증가시키면서 TiO 2 나노입자의생체내지속성을야기하고간질과혈관내로이동하는비율을증가시킬수있다 [101]. TiO 2 나노입자를저농도 (0.8mg/kg), 중농도 (4mg/kg), 고농도 (20mg/kg) 로랫드의기관지내에투여하고 Hydrogen-1 nuclear magnetic resonance 77

84 spectroscopy(1h-nmr) 를이용하여소변대사산물을분석하였을때중요한대사산물 (acetate, valin, dimethylamine, taurine, hippurate, and 2-oxoglutarate) 이낮은농도의그룹에서관찰되었다 [102]. 이러한보상적변화는 7일이내에회복되었고, 혈청생화학적검사결과간이나신장에손상이없었다. 이는분산된나노입자가폐에서간또는신장으로이동할수있기때문에 TiO 2 나노입자의저농도투여가대사기능에일시적인영향을줄수있음을의미한다. 그러나이와대조적으로높은농도의 TiO 2 나노입자는뭉치는성질로인해서전신장기로이동이감소되었기때문으로판단된다. 결론적으로 TiO 2 나노입자의흡수, 분포, 대사, 배설은노출의경로, 입자의크기, 뭉침정도, 표면코팅등을포함하는다양한물리화학적특성에의해서영향을받을수있다. TiO 2 나노입자의독성동력학적연구 (toxicokinetics) 에서가장흔히규명된노출경로는폐장노출, 흡입, 피부, 경구투여이다. TiO 2 나노입자들은폐와소화관을통해체내로흡수될수있으며나노입자의이동을정량화하는추가적인연구가전체적인위해성을평가하는데필수적이다. TiO 2 나노입자는정상상태에서인간의온전한피부를통과할수있다는근거는없다. 정맥이나복강내로주입된 TiO 2 나노입자는간이나비장, 신장, 폐, 림프절, 뇌와같은다른장기로이동할수있다. TiO 2 나노입자는혈관-뇌장벽과혈관-태반장벽을통과할수도있지만이러한결과들은매우높은농도의 TiO 2 나노입자에의해유발되었다는것을고려하여야한다. TiO 2 나노입자의제거는신장을통한뇨나담즙을통한변을통해서일반적으로일어난다. 흡수된 TiO 2 나노입자대부분은빠르게배출될수도있지만모든입자가완벽하게배출될수있는것을아니기때문에나노입자의축적가능성을고려하여야한다. 축적이되는주요장기는간으로판단되며장기간의연구를수행한다면 TiO 2 나노입자가간으로부터완벽히제거될수도있다고판단된다. 따라서이에관한추가적인연구가필요하다고생각되며추가적으로낮은농도에의한영향도반드시연구되어야할분야이다. TiO 2 나노입자의독성나노입자의독성은일반적으로급성, 아급성, 아만성, 만성노출로구분한다. 급성독성은최대 2 주동안수행하며아급성독성은 4주투여하며, 아만성독성은 13주동안투여한다. 그리고만성독성연구는 4개월이상투여하며, 이러한기준에따라서아래의독성결과들을분류하였다. 급성독성 사람에대한 TiO 2 나노입자의급성독성자료는현재까지는없다. 급성독성연구는흡입 78

85 (inhalation), 기관지내투여 (intra-tracheal instillation), 피부 (dermal), 경구 (oral), 복강내 (intraperitoneal), 세포독성실험의순서로기술하였다. 흡입독성연구에서랫드에 5일간하루에 6시간씩 0, 2, 10, or 50 mg/ m3의농도로 TiO 2 나노입자를에어로졸의형태로흡입노출하였고노출후 3일과 16일에부검을실시하였다 [103]. 시험결과폐장의염증의마커인폐세척액 (BALF) 에서의총세포수, 호중구수, 총단백질함량, 독성관련효소의활성이농도의존적으로증가하였다. 전신적독성을나타내는지표에서는변화가관찰되지않았다. 마우스를이용한 TiO 2 나노입자의흡입노출연구결과폐세척액에서총세포수, 폐포대식세포의수가증가하였다. 그러나노출후 3주이후에는회복되었다. 이러한흡입독성연구는 TiO 2 의함량이충분한양으로투여되었을때랫드와마우스모두에서폐장의염증을유발할수있음을의미한다. 또다른연구에서나노또는마이크로입자 TiO 2 를흡입노출하였을때어깨근육의동맥에서미세혈관의기능장애 ( 확장반응의실패 ) 를유발한다고보고하였다 [105]. 동일한질량기준으로투여하였을경우에, 나노크기의 TiO 2 입자는마이크로입자보다 6-7배더높은증상을유발하였다. 그러나입자표면면적을기준으로분석하였을경우에는독성에있어차이가관찰되지않았다. 같은연구그룹에서행한최근한연구는 710 nm의 TiO 2 입자와 100 nm의나노입자를 mg/m3의농도로 4 12시간흡입노출하였을경우에말초혈관의영향은염증의활성화와신경의작용 (neurogenic effect) 때문이라고보고하였다 [106]. 또다른연구에서도 21 nm의 P-25 입자 (80/20 anatase/rutile) 를 6mg/m3의농도로 24시간동안노출하였을때 basal tone의증가와확장기까지관상동맥의저하된반응성이관찰되었다 [107]. 또한이연구는매우폐장에염증이나손상을유발하지않은매우낮은농도에서미세혈관의기능장애를보고한것이기때문에아주중요한결과라할수있다. 또한최근의다양한연구에의해서입자의흡입과심혈관계질환의연관성이보고되고있기때문에이러한결과는매우흥미로운사실이다. 입자의형태를가진물질의노출은심장박동수, 심장박동수의변동성, 혈압, 혈액응고성과같은많은심혈관계의지표에대해상당한변화를가져올수있다 [108]. 랫드에 5, 21, 50 nm의 TiO 2 나노입자에 0.5, 5, 50 mg/kg BW의농도로기관지내로단회투여하고일주일후에염증의정도를분석하였다 [109]. 시험결과 TiO 2 나노입자의노출이랫드에서농도의존적으로염증병변을유발한다는것을보고하였으며, 동일한질량기준에서 5 nm TiO 2 나노입자에의해유발된폐의독성효과는 21 nm 및 50 nm TiO 2 입자들보다더강한염증을유발하였다. 랫드에 TiO 2 나노입자를기관지내로투여한이후에폐의염증을시간의경과에따라분석하였다. 시험결과 TiO 2 나노입자는노출후일주일이경과했을때보다 24 79

86 시간에폐의염증작용이더크다는것을보여주었다 [110]. 이연구에서 TiO 2 나노입자의염증작용은국소적으로분포되었고, 농도의존적이며시간이경과함에따라회복되었다. TiO 2 나노입자가면역기능에미치는영향이수행되었다 [111]. TiO 2 나노입자 ( 기관지내주입 ) 에노출된랫드의폐포대식세포의면역기능을측정하였고, 5, 200 nm의 TiO 2 나노입자를 , 50 mg/kg의농도로노출된랫드에비특이적인면역반응과특이적면역반응의감소를유도하였으며세포의구조에손상과폐포대식세포의기능장애를유발한다고보고하였다. 대식세포의탐식작용은 TiO 2 나노입자의저농도에노출이되었을때증가하였으며고농도에노출되었을때감소하였다. TiO 2 나노입자의노출은대식세포의화학주성효과및 Fc receptor 와세포표면에서 MHC-class II의발현을저하시켰다. 이러한변화는폐포대식세포에의한 nitric oxide(no) 와 tumor necrosis factor-α(tnf-α) 발현에의해서유발된다. TiO 2 나노입자의투여량을증가시킬때, 폐포대식세포에의해분비되는 NO와 TNF-α의양은점진적으로증가되었다. TiO 2 나노입자는마이크로입자보다더많은 NO와 TNF-α의생산을유도하였다. 또한 TiO 2 나노입자의독성은입자의표면면적과결정구조가중요한영향을미친다고보고하였다 [112]. TiO 2 나노입자가천식에치는영향을평가하기위하여 15 nm의 anatase TiO 2 를 toluene diisocyanate (TDI) 를이용한마우스천식모델에서나노입자의영향을평가하였다. 0.3% TDI 혹은대조군인 acetone-olive oil(aoo) 를 1일과 8일째에양쪽귀에투여하여감작시킨다음, 14일째되는날에 TiO 2 나노입자를 0.8 mg/kg BW의농도로 40 ul를구강인두쪽으로투여하였다. 하루가지난후 (15일째 ) 마우스는구강인두의경로로 0.01% TDI (20ul) 를투여하여 challenge 반응을유도하였다. 16일째되는날에기도과민반응성 (AHR), 폐세척액분석, 조직병리학적분석, 혈청생화학적분석 ( 혈청 IgE) 을수행하였다. TiO 2 나노입자를투여한마우스는주로호중구와대식세포로구성된염증을유발하는동시에 2배높은기도과민반응성을보였으며3배증가된염증세포의증가를보였다. 조직병리학적분석결과폐장의부종과상피세포의손상및염증의병변이관찰되었다. 이러한연구는 TiO 2 나노입자가기도의과민반응을유발할수있음을의미하며 TiO 2 나노입자의노출에의해서천식이더악화될수있음을의미한다. 토끼를이용한급성피부감작성시험과마우스 (CBA/JHsd mice) 의국소림프절시험법을통해서 TiO 2 나노입자 (129.4 nm in H2O; 80/20 anatase/rutile; 0%, 5%, 25%, 50%, 100% TiO 2 NPs, 3일반복투여 ) 는피부자극성및감작성이없다는것을보고하였다 [114]. 또다른연구에서는급성피부, 안구, 질의점막자극성시험을통해 TiO 2 나노입자 ( 크기는제시되지않았음 ; 1000, 2150, 4640, and mg/kg BW) 에 1, 24, 48 시간마다노출된마우스에서감작성 80

87 이없다는것이보고되었다 [115]. 20 nm의 TiO 2 나노입자를 14, 28, 42, 56 mg/kg의농도로 14일동안피부에노출하였을때 Wistar 랫드에단기적인독성을유발하였으며주로생화학적수준 (catalase 와 glutathione S-transferase(GST) 의활성감소 ; lactate dehydrogenase(ldh) 와 lipid peroxidation(lpo) 의활성증가 ; serum glutamic pyruvic transaminase(sgpt), serum glutamic oxaloacetic transaminase(sgot), blood urea nitroget(bun) 과 creatinine 의증가 ) 에서변화가관찰되었다 [116]. 그러나이러한변화들은조직병리학적변화는유도하지않았다. 이연구에서저자들은 TiO 2 나노입자에대한피부의단기노출이랫드에서신장과간장의독성을유발할수있을것으로판단하였다. 피부를통한흡수의경로는모낭을통한흡수가가능하며노출의농도가실제사용되는것보다훨씬높으며, 시험모델이사람이피부로노출되는것과는다르다는것을고려하여야한다 nm의 TiO 2 나노입자를경구투여 (175, 550, 1750, 5000 mg/kg; 80/20 anatase/rutile; 48시간간격으로 14일간반복투여 ) 하였을때매우낮은독성이관찰되었으며토끼에서는단기적인가역성안구결막의충혈이보고되었다 [114]. 마우스를이용한실험에서 25, 80, 155 nm의 TiO 2 입자를 5 g/kg BW의농도로단회경구투여하였다. 노출된지 2주후, TiO 2 입자에서뚜렷한독성은관찰되지않았으며암컷마우스에서는 25nm 와 80nm 그룹에서높은혈청생화학적수치의증가 (alanine amino trasferase(alt), aspartate aminotransferase(ast), LDH, and BUN) 가관찰되었으며간과신장의조직병리학적분석결과유의적인변화가관찰되었다. 25 and 80 nm의 TiO 2 나노입자를처리한개체에서는심근장애를나타내는혈청 LDH의변화가관찰되었지만조직병리학적분석결과심장, 폐, 고환 ( 난소 ), 비장에유의적인변화는관찰되지않았다. 이러한경구투여독성연구는생화학적변화들의변화가관찰되었지만전신적인독성반응은관찰되지않았다. 복강내투여경로를이용한연구는나노의학분야에서 TiO 2 나노입자사용의효과를알아보기위하여이루어진다. 마우스에고농도로 TiO 2 나노입자 (anatase, 5 nm; 5, 10, 50, 100, 150 mg/kg BW; 14일반복투여 ) 를복강내투여하였으며간, 신장, 심근에심각한손상을야기했고, 혈당과혈중지질의불균형을유발하였다. 또한 TiO 2 나노입자의농도가증가함에따라 ALT, leucine acid peptide, pseudocholinesterase, total protein, albumin 수치와같은간기능의지표들을크게증가하였으며, 반면에요산, BUN 등의신장기능의지표는감소되었고심근기능의지표인 AST, 크레아틴키나아제 (CK), LDH와 alpha- hydroxybutyrate dehydrogenase 의활성은증가하였다. Triglycerides, glucose 와고밀도 lipoprotein cholesterol 의함량은현저하게감 81

88 소하였다. 이연구에서장기축적되는 TiO 2 나노입자의양의차이는장기의친화도와염증반응의정도와밀접하게관계되어있다고제시하였다. 또한마우스의복강내투여를통해 TiO 2 나노입자의 LD 50 값은 150 mg/kg BW라고보고하였다. 50 nm의 TiO 2 나노입자를 0, 324, 648, 972, 1296, 1944, 2592 mg/kg의농도로복강내투여하고 24시간, 48시간, 7일, 14일에부검하여관찰하였다. 임상증상으로는투여군에서소극적인행동, 식욕감퇴, 떨림과무기력과같은급성독성효과의징후를보였다. 혈청에서는투여군에서 ALT와 AST의약한감소를관찰할수있었으며조직병리학적검사에서는나노입자들이비장에축적되며병변을유발한다는것을확인할수있었다. 투여군의폐장에서 thrombosis가관찰되었으며폐포중격의비후와간세포의괴사, 아포토시스, 간섬유증, 신장사구체의종창과간질성폐렴들의증상이관찰되었다. 5 nm의 TiO 2 나노입자를 5, 10, 50, 100, 150 mg/kg BW의농도로 14일동안복강내투여를반복한결과염증반응과간손상이연관되어있을것임을제시하였다 [117]. 이연구에서염증의정도는 real-time PCR과 ELISA 분석을통해서 NF-kB, macrophage migration inhibitory factor(mmif), TNF-α, IL-6, IL-1β, cross-reaction protein, IL-4, IL-10 의분석으로증명되었다. 나노입자에의한신경세포의독성에관한연구에서는복강내투여한 TiO 2 나노입자가복강으로부터다른장기로이동한뒤에뉴런을필라멘트모양으로변형시키거나염증세포들로변화하도록유발한다는것을보고하였다 [98]. 산화적스트레스와뇌의손상은지질과산화와같은연쇄반응과항산화능력및항산화효소의활성감소와 NO의과도한방출, 글루타민산환원, 그리고아세틸콜린가수분해효소활성의저하를유발한다. TiO 2 나노입자의복강내투여는급성으로전신적영향을미친다음에간, 신장, 심장, 뇌에병리학적, 생화학적효과를유발한다. In vitro 연구는급성독성효과를예측할수있는지표로사용될수있기때문에이에관하여일부를기술하였다. 적혈구를이용한용혈시험에서 TiO 2 나노입자는마이크로입자와는다르게적혈구의비정상적인침강, 응집과투여의존적용혈이일어난다는것을보고하였다 [119]. 다른연구에서는 TiO 2 마이크로입자에의해야기되는용혈이 ( 사람적혈구이용, 37 1시간반응 ) TiO 2 나노입자보다 73배높다는것을보여주었다 [120]. 그러나 in vivo 조건에서혈장이적혈구의용혈을방지할수있기때문에혈장에의해용혈이발생하지않았다. 마우스의대식세포 (Ana-1 and MH-S cells) 를이용한연구에서는 TiO 2 나노입자 (5, 10, 25, 100 nm; anatase) 가 MH-S세포에서낮은독성효과를유발하였다는것을확인하였으며또다른연구에서는 TiO 2 나노입자 (25 nm, 80 nm; 0, 10, 20, 40, 80 mg/l; 24h) 가폐섬유아세포사이의간극결합과세포내신호전달을억제한다는것을보고하였다 [122]. 다수의 in vitro 연구에서는 82

89 순환계의세포에서 TiO 2 나노입자가독성을유발한다고보고되었다. 요약하면, TiO 2 나노입자의급성독성효과는흔히랫드와마우스를이용하여다양한노출경로를바탕으로연구되어져왔다. 호흡기를대상으로하는연구의수는다른노출경로보다많다. 연구결과 TiO 2 나노입자에의한폐장의호흡노출은국소적증상과전신적증상을모두유발하였으며질환을가지고있는경우에는그증상을악화시킨다. 폐를통해투여된 TiO 2 나노입자는같은질량농도에서비슷한화학적성질의마이크로입자보다염증을더많이일으키지만입자표면면적이동일할때나노입자에의한폐의염증반응은마이크로입자의염증반응과유사하였다. 다른노출경로로부터확보된독성정보들도매우중요하다. 예를들면 TiO 2 나노입자가폐또는소화관을통해전신순환계로흡수될수있고, 이어서간, 신장, 비장, 뇌와같은다른장기들로분포될수있다. 장기에서 TiO 2 나노입자의분포와축적은장기손상과염증반응을유발할수있지만, 대부분의연구는직업적인환경에서는비현실적인너무높은투여량을적용한경우이기때문에해석에주의기필요하다. 또한혈관계에미칠수있는 TiO 2 나노입자의영향은다양한 in vitro 연구에서보고되었다. 아급성독성효과 40 nm의 silicon dioxide (SiO2) 가코팅된 rutile TiO 2 나노입자를 10 mg/m3의농도로 1일 2시간총 4일간반복흡입노출하거나 4주간반복노출하였을때폐장의호중구증가와폐조직에서 TNF-α의발현과 chemokine(cxcl1) 의발현이증가하였다 [123]. 그러나본연구의결과는 TiO 2 표면에코팅된 SiO2에의한것일가능성이높다. 다른이들은 TiO 2 나노입자를흡입노출한뒤에아주미약한정도의폐장의독성을유발하였다고보고하였다 [92]. 또다른연구에서랫드기관지내로 TiO 2 나노입자를 1, 10 mg/kg BW의농도로투여하였을때 10 mg/kg BW에서백혈구수 (1일과 7일째 ) 와 LDH 활성 (1, 7, 14, 28일째 ), malodialdehyde(mda)(1, 7, 14일째 ), 총단백질 (1, 7일째 ) 의수치가대조군에비하여매우증가하였다 [124]. 조직병리학적검사에서 10 mg/kg BW를투여한랫드의폐에서는폐장의염증의뚜렷한증가를보였다. TiO 2 나노입자 (20 nm) 와마이크로입자 (250 nm) 의기관지내주입에서용량-반응관계를조사하였을때랫드와마우스에서 TiO 2 나노입자에대해서폐세척액의총단백질의증가, LDH 활성및 acid-glucosidase 의증가가관찰되었다 [125]. 이연구에서는 TiO 2 83

90 입자의염증을유발하는농도기준은질량보다는표면면적이더적합하다고보고하였다. 3 nm 의 TiO 2 나노입자를 13.2 mg/kg BW의농도로주 1회, 총 4주동안마우스의기관지내에주입한다음염증을평가하였을때투여후 28일에주입한 TiO 2 나노입자가폐손상을유발할수있고폐포모세혈관장벽의투과성을변화시킬수있다고보고하였다 [79]. TiO 2 나노입자는조직손상의정도를각각다르게유도하면서혈액을따라순환하고간, 신장과같은폐조직외로도달할수있으며혈관-뇌장벽을통해통과할수있고산화적스트레스반응을통해손상을유도할수있다. 반면에 TiO 2 나노입자를주 2회, 6주동안 1.0, 0.5, 0.1 mg/ml의농도로 ApoE-/- 마우스의기관지내에주입하였을때지질혈증을유발하였으며동맥경화증의발생과경화반파열을가속화시켰다 [126]. 또다른연구에서는마우스에 28 nm의 rutile TiO 2 나노입자를 2, 10, 50, 250 μg의농도로 ovalbumin(ova) 에결합하여복강내주입하고나노입자가면역보조효과를나타내는지규명하였다 [127]. 이연구에서마우스들은 OVA, OVA+TiO2 나노입자, OVA+AlOH3 를각각처리하였고최종적으로 OVA 단백질을에어로졸로노출하였다 (challenge). 시험결과 TiO 2 나노입자는혈청에서 OVA-specific IgE와 IgG1의높은수치와호산구및호중구와림프구의증가, 그리고 Th2 면역반응을유발하였다. OVA-specific IgE의수치는표준보조제인 AlOH3 보다 TiO 2 나노입자에서더높게유발되었다. 그러나두물질은호산구수치와염증유발인자의수치에서는비슷하게관찰되었다. TiO 2 나노입자를 0.16, 0.4, 1 g/kg의농도로 Wistar랫드에경구투여한이후에독성과 1H-NMR 을이용한대사체분석을수행하였다 [128]. TiO 2 나노입자가처리된랫드의뇨에서대사체의특징은 taurine, citrate, hippurate, histidine, trimethylamine-n-oxide(tmao), citrulline, alpha-ketoglutarate, phenyl-acetylglycine(pag) 과 acetate 의증가였다. Lactate, betaine, methionine, threonine, pyruvate, 3-D-hydroxybutyrate(3-D-HB), choline 과 leucine 의수치감소도관찰되었다. 혈청의대사체분석은 TiO2 나노입자처리후, glutamine, pyruvate, glutamate, acetoacetate, glutathine과 methionine 의감소와마찬가지로 TMAO, choline, creatine, phosphocholine 과 3-D-HB 의증가를보여주었다. AST, CK와 LDH는감소되었고, TiO 2 나노입자가처리된랫드는심장조직에서미토콘드리아의종창이관찰되었다. 이러한결과들은 TiO 2 나노입자가에너지와아미노산대사의방해를나타내고, 소화관의정상미생물총의변화는나노입자에의해서손상된간과심장과관련되어있다고보고하였다. NMR을기반으로한이러한대사체적접근은나노물질의생화학적효과를연구하기위해신뢰할수있고확실한방법이될수있다. 이러한연구결과들은직업적인노출에의한 TiO 2 나노입자의독성은천식, 심장병과같은건강문제를내재한다는것을의미한다. 그러나이연구들은실험동 84

91 물에서수행된연구이기때문에작업장에서 TiO 2 나노입자의위해성을정량화하기위해서는 작업장에서의역학적인조사가필요하다. 역학적연구부분은다른장에서논의될것이다. 아만성독성효과 21 nm P-25 TiO 2 나노입자를 6시간 / 일, 5일 / 주의간격으로 13주동안 5.0, 2.0, 10 mg/m3의농도로암컷랫드, 마우스, 햄스터에각각흡입노출하고폐와림프절의 TiO 2 나노입자잔존량과폐의염증을조사하였다 [129]. 폐장에존재하는 TiO 2 의함량은모든동물종에서농도의존적으로증가하였으며노출마지막시점에서최대로증가하였다. 그러나 TiO 2 나노입자에의한폐의반응들은동물종간의상당한차이가있었다. TiO 2 나노입자의잔존량이폐에서동등하다는조건하에랫드는마우스보다더심각한염증반응을보였으며점차적으로상피세포와섬유모세포의증식이관찰되었다. 폐로부터나노입자의 clearance 는 10 mg/m3 TiO 2 나노입자에노출된마우스와랫드에서감소되었으며햄스터에서는모든농도에서변화가 clearance 에변화가관찰되지않았다. 입자의크기와표면결정구조에따라 TiO 2 의마이크로입자와나노입자의영햐을연구하기위하여랫드의기관지내로 TiO 2 나노입자 (25, 100 nm) 를 1, 5 mg/kg BW의농도로 24시간 1 주, 3주에부검하여관찰한결과입자의표면면적은 30배의차이가있었으나폐장에유발된염증은크기에의한차이가관찰되지않았다 [130]. 따라서이연구에서는 TiO 2 입자의독성효과가입자의크기와표면면적에의해결정되지않으며, 입자표면의성질에의해결정될것이라고제시하였다. TiO 2 마이크로입자와나노입자 (rutile) 를 5, 50, 500 μg을마우스의기관지내에주입하고염증을분석한결과급성에서마이크로입자와나노입자모두가장높은농도에서폐세척액의총단백질량과 IL-6의감소를유도한다고보고하였다 [131]. 급성기 (24 시간 ) 와아만성 (3 개월 ) 기에도유사한결과가입자의크기에관계없이유발되었다. 이러한결과는비슷한구성의 TiO 2 마이크로입자와비교했을때 TiO 2 나노입자의세포독성효과가차이가없음을의미한다. 이러한연구결과는 TiO 2 나노입자의분산도가낮기때문일수있다 [16]. 실제로이들연구에서랫드에노출된각각입자의용액상에서의크기는크게다르지않았다. CD 암컷마우스에다양한시간대에 25, 80, 155 nm의 TiO 2 입자를 50 mg/kg의농도로단회노출시킨후 2, 10, 20, 30일에부검하여모노아민자극성신경전달물질에서비강내로주입된 TiO 2 나노입자의영향을규명하였다 [132]. 이연구에서마우스의뇌에서나노입자의함량을분석하기위해 ICP-MS를사용하였다. NE, DA, 5-HT, 5-HIAA, DOPAC, HVA와같은모노 85

92 아민자극성신경전달물질들은전기화학적시료검출장치와액체크로마토그래피 (RP-HPLC) 에의해분석하였으며, 그결과마우스의뇌에서 TiO 2 나노입자가 10일후 25 nm 그룹에서축적된양이증가하였다 ( ± ng/g). 또한노출후 20일째에그함량이서서히감소하였다 (654.7 ± ng/g). 노출후 30일째에 TiO 2 나노입자함량은 20일째와같이지속되었다. 뇌에서 TiO 2 나노입자의축적으로인해 80 nm와 155 nm TiO 2 투여군에서는 NE와 5-HT 의수치가크게증가하였으나 DA, DOPAC, HVA, 5-HIAA 의수치는감소되었다. 노출된 TiO 2 나노입자는비점막을통해흡수된후에마우스의뇌로이동하고침착되었을가능성이있으며뇌의모노아민자극성신경전달물질의대사와방출에영향을미칠수있다. 돼지의귀와 BALB/c hairless mice의피부를이용한실험에서 TiO 2 나노입자는잠재적인독성효과와투과성을연구하였다 [133]. 시험결과, 투여 24시간후다양한크기의 TiO 2 나노입자는피하층을통과하여피부의깊숙한곳으로침투할수없다고판단하였다. 그러나 30일동안 in vivo 실험으로돼지의귀에나노입자를국소적으로노출시킨후에는 4, 60 nm의 TiO 2 나노입자들이각질층을통해통과할수있었고표피의깊숙한층으로도들어갈수있었다. 또한 hairless 마우스에진피노출 (400μg/cm2) 한이후 60일에는 TiO 2 나노입자가피부를통과할뿐아니라다른조직까지도달할수있었으며, 몇몇의주요장기에는다양한병리학적인병변을유발하기도하였다. ICR 마우스에 5 nm anatase TiO 2 나노입자를 0, 5, 10, 50 mg/kg BW의농도로 60일간경구투여한뒤에신경계기능에미치는영향을연구하였다 [134]. Y-maze테스트는 TiO 2 나노입자의노출이공간지각능력을크게악화시킬수있다는것을보여주었다. TiO 2 나노입자는또한마우스의뇌에서미량원소, 효소및신경전달물질계의항상성에대해장애를유발하였다. 또한그들은뇌에서 Ca, Mg, Na, K, Fe, Zn의함량에상당한변화가있었다는것을알아냈다. TiO2나노입자는 Na+/K+-ATPase, Ca2+-ATPase, Ca2+/Mg2+-ATPase, acetylcholine esterase, nitric oxide synthase(nos) 의활성도상당히억제시켰다. NE, DOPAC, 5-HT와같은모노아민자극성신경전달물질의함량과그대사산물 5-HIAA 는상당히감소하였지만, 아세틸콜린, 글루타메이트, NO의함량은크게증가하였다. 만성독성효과 ( 발암성제외 ) 작업환경에서는 TiO 2 나노입자의잠재적만성독성효과를급성효과보다더중요하게고려하 86

93 여야한다. 기존의연구결과들에의하면 TiO 2 의만성독성이미약함을제시하고있다. TiO 2 마이크로입자에돼지나랫드에만성흡입노출하였을때폐렴발생률의증가와편평상피화생 [135], 지속된폐의반응 [136], 폐세포의증식, 대식세포기능의상실 [137], 폐포상피의화생, 점진적인섬유증식병변 [138] 및폐포중격에서대식세포의축적과같은폐의병리학적변화를유도하였다. TiO 2 나노입자도유사한결과를보여주었다. TiO 2 입자 (20, 250 nm) 를 Fischer 344 랫드에 23.5±2.9mg/m3 의농도로 12주간흡입노출하였을때염증과폐손상을보고하였으며마이크로입자와비교하였을때나노입자에서더욱크게나타난폐의염증이나손상과같은결과는나노입자의잔류를증가시키면서입자의더큰특이적표면면적에의해설명될수있다고판단하였다 [15]. 5 6 nm의 TiO 2 나노입자를 ICR마우스들에게 2.5, 5, 10 mg/kg의농도로 90일동안반복투여하였을때만성의비장손상이관찰되었다 [139]. 또한마우스의혈액성분들중에서혈구, 혈소판, 헤모글로빈, 면역글로불린과림프구일부 (such as CD3, CD4, CD8, Bcell, and natural killer cell) 는크게감소되었다. 또한 NF-κB, TNF-α, MMIF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, IL-1β, 교차반응단백질, transforming growth factor-β(tgf-β), interferon-γ, Bax, CYP1A1 발현의수치는상당히증가하였으며, Bcl-2 와 heat shock protein 70(Hsp70) 발현의수치는감소하였다. 따라서 TiO 2 나노입자의저농도에장기간노출되는것은염증을일으키는사이토카인과아포토시스와관련된사이토카인발현의변화및면역력의감소가원인이되면서비장의손상을유발할수있다. 결론적으로 TiO 2 나노입자는폐의염증반응과상대적으로고농도에서폐세포의증식을유발하면서독성효과를나타내었다. TiO 2 나노입자는 TiO 2 마이크로입자와비교해서폐장의염증효과를더크게유발하는것으로나타났다. 천식반응에서 TiO 2 나노입자의천식을증가시키는반응은추가적인연구가필요하다고판단된다. 독성연구의대부분은흡입독성에초점을맞추고있지만소비자측면에서 TiO 2 나노입자를함유한자외선차단제사용의증가를볼때원칙적으로실제로노출되는경로에초점을맞추어서연구가진행되어져야할것이다. 다양한조건을가진모든전형의독성연구에서폐를노출경로로한연구가가장많으며이는환경적및직업적인노출과관련되어있기때문이다. 이러한연구의대부분은산화적스트레스와염증을지표인자로설정하였으며이러한독성기전에관한자료는나노입자의독성을예측하는것에서특이성과정확성을증가시키는데도움이될것으로판단된다. 87

94 유전독성 TiO 2 나노입자의유전독성은시험별로차이가있다 [140]. 초기의연구에서 TiO 2 는기준시험법에서유전독성이없다고보고하였다 [141]. 그러나최근에 in vivo와 in vitro연구를통해서 TiO 2 나노입자의유전독성이검토되어왔으며테스트시스템으로는랫드나마우스골수세포를이용한 in vivo연구와 micronucleus (MN) test, Ames test, 포유류세포유전자돌연변이, DNA절단, 염색체상변화, 세포변형을포함하는 in vitro 연구를이용하였다. 이러한유전독성의종말점은 TiO 2 나노입자의위해성식별에유용한데이터를제공할수있다. in vivo 유전독성연구 TiO 2 나노입자의유전독성을규명하기위해상당수의 in vivo 연구가수행되어왔다. IL-1R 과 IL-1α 가결손된 mouse에서 TiO 2 나노입자의흡입이강하게억제되었던폐장의염증을유발하는것을보고하였다 [142]. 이연구결과는 TiO 2 나노입자에의해야기된염증이 IL-1α에의해영향을받는다고판단하였으며 TiO 2 나노입자에의한 IL-1R 의신호는석면과유사하였다. TiO 2 나노입자를 6mg/m3의농도로 4시간동안노출한뒤에 24시간후에랫드의심근에서 P38과트로포닌의인산화가증가하는것을확인하였다 [143]. 이러한흡입연구는 TiO 2 나노입자가심장과폐모두에서특정한유전자발현에영향을미친다는것을의미한다. 18 nm anatase TiO 2 나노입자를 100 mg/kg의농도로단회노출한뒤에 15 개월후에폐장을분석한결과랫드의폐포 2형상피세포에서 hypoxanthine phoshoribosyltransferase(hprt) 돌연변이의빈도가증가하였다 [144]. TiO 2 나노입자는유전독성과염색체이상을유발하였으며 in vivo에서음수를통해서 TiO 2 (21nm, P-25) 를마우스에노출하였을때일반적인염증이유발되었다 [32]. TiO 2 나노입자는 500 mg/kg BW에서 DNA의단일나선및이중나선의절단과염색체의손상을유도하였으며 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine, γ-h2ax foci, micronuclei 와 DNA결손을유도하였다. γ-h2ax foci 의형성은 DNA 이중나선의절단을의미하는결과이다. in vivo에서마우스에 TiO 2 나노입자가유도하는유전독성효과는염증및산화적스트레스와관련하여이차적인유전독성의메커니즘에의해발생될것이라고제시하였다. RT-PCR과 ELISA 분석은경구투여된 TiO 2 나노입자 (anatase; 5nm; 5, 10, 50 mg/kg; 60일반복투여 ) 가마우스들의 mrna와 Toll-like receptor-2(tlr2), TLR-4, IκB kinases (IKK-α, IKK-β), NF-κB, NF-κBP52, NF-κBP65, TNF-α와 NF-κB-inducible kinase(nik) 의발현을크게증가시켰고, IκB와 IL-2의발현을감소시켰다는것을보고하였다 [145]. 이러한간손상의신호전달은 TLRs의활성화 NIK IκB kinase NF-κB TNF-α 염증 아포토시스 간손상의과정에 88

95 의해발생될것으로예측된다. 마우스의신장손상과관련해분자수준의메커니즘에초점을둔경구투여연구는 TiO 2 나노입자 (5-6nm; 2.5, 5, 10 mg/kg; 90일반복투여 ) 가 TNF-α, MMIF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-18, IL-1β, 교차반응단백질, TGF-β, IFN-γ와 CYP1A1 의발현과 Hsp70 에서의감소를유발하면서 NF-κB를활성화시킨다는것을보고하였다 [146]. 이연구에서 TiO 2 나노입자는신장의염증, 세포괴사와기능장애를유발하면서신장에서축적된다는것을보여주었다. TiO 2 나노입자 (2.5, 5, 10 mg/kg; 90일 ) 를기관지내주입법으로투여하였을때폐장에서 NF-kB의증가와염증사이토카인의증가가관찰되었다 [147]. 또한 hemeoxygenase-1(ho-1) 발현의증가와 NF-kB억제인자의감소와 Hsp70 발현이관찰되었으며, 이는발생된폐장의염증이산화적스트레스와사이토카인의발현과밀접하게관련되어있다는것을의미한다. TiO 2 나노입자는실질적으로 caspase-3 과 caspase-9 를활성화하였으며 Bcl-2, Bax 및사이토크롬c의유전자및단백질수치들을감소시키고마우스비장에서 ROS의축적을촉진시켰다 [148]. 이연구에서마우스들은복강의경로로 TiO 2 나노입자를 45일간반복투여하였다. TiO 2 나노입자는비장조직에서울혈을유발하면서축적되며림프절의증식과비장세포의아포토시스를유발한다. 따라서 TiO 2 나노입자들은마우스의비장세포에서미토콘드리아와연관된신호전달경로를통해아포토시스를유발한다는것을의미한다. in utero 유전독성시험과관련하여 TiO 2 (surface coated UV-Titan; 1시간 / 일 ; 42 mg UV-Titan/m3) 에노출된 C57BL/6Bom Tac dames 신생마우스에서 DNA microarrays 를통해간의유전자발현을분석하였다 [149]. UV-Titan 노출은교미시기의마우스나그들의자손에있어 DNA나선의절단을유도하지않았으며비록암컷마우스에서 retinoic acid 신호전달과관련하여유전자의발현에변화가있었지만, 그변화는새로합성된간의 transcriptional profiling 에의해나타난것이었다. 유전자발현분석결과명확한연관성은관찰되지않았으나이러한변화들이염증의이차적인반응에의해서유발되었을것이라고판단된다. 흡입독성연구에서 C57BL/6BomTac 암컷마우스들 (UV-Titan; 20 nm; 1시간 / 일, 11일반복노출 ; 42.4 ± 2.9 mg surface-coated nanotio2/m3; 최후흡입노출후 5일에부검실시 ) 에서 TiO 2 나노입자의노출은급성단계의마커 (serum amyloid A-1(Saa1), serum amyloid A-3(Saa3), CXC chemokines, CC chemokines, 사이토카인, TNF) 와관련된 mrna 발현을증가시켰다 [150]. 또한 Saa1과 Saa3의단백질분석을통해 Saa3의폐조직에서선택적인증가를관찰하였으며 mir-1과 mir-449a 의증가와 mir-135b 의 60배정도의증가를유도하였다. 결과적으로표면을특정한물질로코팅한 TiO 2 나노입자의흡입은급성기단백질, 염증, 면역반응과관련된유전자의발현을증가시킨다고판단된다. 89

96 그러나모든연구들이유전독성이있다고보고하지는않았다. 암컷마우스의생식생식세포에서나노입자의영향을규명하는연구에서 TiO 2 나노입자 (UV-Titan) 를출생전암컷마우스에노출하였을때생식세포에서 expanded simple tandem repeat(estr) loci 돌연변이를유도하지않았다. 이연구에서임신한 C57BL/6 마우스들은 8-18일의임신기간동안전신흡입에의해서나노입자가 (UV-Titan L181; ~42.4mg/m3) 노출되었다. F2 자손들이수집되었고 F1 마우스들 (192 UV-Titan-exposed F2 offspring and 164F2 controls) 의총가계도로부터 ESTR 생식세포돌연변이비율을 F2 자손세대에서추정하였다. 측정에서양성의기준종말점은 polychromatic erythrocyte(pce) micronuclei, γ-h2ax foci 형성, DNA손상, HPRT 돌연변이빈도와 mrna 발현이었다. 시험결과, 일부의종말점에대해서는양성으로관찰되었으나 PCE micronuclei 와 ESTR 돌연변이검사에서는음성으로판정되었다. C57BL/6J mice에 4시간 / 일로 0.8, 7.2, 28.5 mg/cm3의농도로 5일동안반복흡입하였을때 TiO 2 나노입자 (74% anatase; 26% brookite) 는폐장상피세포에서 DNA의손상을유발하지않았으며골수세포를이용한소핵시험에서음성으로관찰되었다 [152]. 또한 TiO 2 나노입자 (1,2, and, 5g/kg BW) 의구강투여한후에소핵시험을수행한결과음성으로관찰되었다 [115]. 또한 2년간 TiO 2 나노입자 (10.4mg/ m3 ) 를랫드에흡입하였을때폐장에서 DNA 부가체의형성이관찰되지않았다 [153]. 생식계를포함한다양한장기에대한 in vivo 유전독성시험을수행한결과 TiO 2 나노입자가염증을일으키는사이토카인의발현과 toll like receptor 의 mrna발현, HPRT의유전자돌연변이, γ-h2ax foci의유도, DNA 결손과 PCE를증가시켰으며 HO-1, NF-κB와 Hsp70의발현이증가하는것또한관찰되었다. 그러나어떤연구에서는또한 TiO 2 나노입자가유전독성이없다고보고하기도하였다. 결과에서이러한차이가있는것은아마사용된 TiO 2 나노입자의물리화학적특성이나연구원들이이용한노출측정법의차이때문일것으로판단된다. In vitro studies TiO 2 나노입자의유전독성을측정하기위하여많은 in vitro 시험이수행되었다. 또한 TiO 2 나노입자는높은농도 (30μg/ml) 로인간유래망막상피세포 (ARPE-19) 에처리하였을때소포체의형태로핵주위에서관찰되었다 [154]. 지금까지수행된대부분의연구들은 TiO 2 나노입자의크기, 표면코팅, 결정형구조, 농도반응성, 세포주간의차이및탐험적연구에따라수행되었다. 90

97 최근의연구에서구형의 anatase 와 rutile TiO 2 나노입자 ( nm) 를 A549 세포에노출하였을때 DNA에대한단일나선의절단과산화스트레스를야기할수있다고보고하였다 [155]. TiO2에의한 DNA 손상은나노입자가유전자의손상수복과정 ( 뉴클레오티드절단수복과염기절단수복 ) 을저해함으로써유발한다는것을확인하였다. TiO 2 나노입자를랫드의폐포대식세포인 NR8383 세포에처리하였을때세포외 ROS, HO-1 그리고 NOS mrna 발현과 TNF-α 의증가를유발한다는것을보고하였다 [93]. 최근의연구에서는 TiO 2 나노입자가인간양막상피 (WISH) 세포에서세포독성과유전독성에영향을미친다는것을보여주었다 [156]. 이연구에서는세포에 rutile TiO 2 나노입자 (30.6nm; 20μg/ml) 를 μg/ml 로처리했을때카탈라아제의활성과 GSH 수준에서유의적인감소를보이는반면, olive tail moment(otm) 는 14배가증가하였다. 또한세포외 ROS 생성을 1.87 배증가시켰으며, G2M 기를 7.3% 증가시켰다. 인간폐섬유아세포가인간폐포상피세포 (BEAS-2B) 보다 TiO 2 나노입자에의해유도되는세포독성과유전독성에대해더민감하다고보고되었다 [157]. 이연구에서는 TiO 2 나노입자는인간폐섬유아세포에서산화스트레스와 DNA-부가체형성 (8-OHdG) 을유도하였지만 DNA 절단은유도하지않았다. 햄스터유래폐섬유아세포 (V79세포 ) 를이용한연구에서표면처리를하지않은 anatase TiO 2 (30-50nm) 나노입자와 5산화바나듐 (V2O5) 을처리한 anatase TiO 2 나노입자의세포독성과유전독성을비교하였다 [58]. 시험결과 V2O5를처리한 TiO2 나노입자는자유라디칼을생산하므로 V2O5를처리하지않은입자보다포유류세포에더많은 DNA 손상을일으킬수있었다. 또한 V2O5를처리한 TiO 2 나노입자는무세포환경과유세포환경모두에서라디칼을형성하였다. 실제로 V2O5로코팅하여표면을처리한 TiO 2 나노입자는화력발전소의배기가스에서산화질소의제거나생체내임플란트의강도를증가시키기위해산업적으로이용되고있다. cytokinesis block micronucleus assay, Comet assay, 그리고 HPRT gene mutation assay 를이용하여배양된 human lymphoblastoid 세포에서 TiO 2 나노입자의유전독성을발견하였다 [30]. 세포에 0, 26, 65나 130μg/ml 의 TiO 2 나노입자 (7-8 nm) 를 6, 24, 48시간동안처리하였을때 TiO 2 나노입자는소핵 / 이핵이되는세포의빈도를약 2.5 배증가시켰으며 (130μg/ml), tail moment 를약 5배증가시켰으며 (65μg/ml) HRPT 돌연변이빈도를약 2.5 배증가시켰다 (130μ g/ml). TiO2 anatase 나노입자와마이크론크기의 rutile 입자는 THP-1 세포와같은대식세포에서높은 IL-1β의생성을유발하였다 [159]. Human monoblastoid cell line(u937) 을이용한연구에서는 mg/ml로 24, 48시간동안노출시켰을때, TiO 2 나노입자 (<100 nm) 가세포자멸사적변화와괴사적변화모두를일으킨다는것을보고하였다 [160]. 나노입자에의해유도된세포자멸사를입증하기위한 in vitro 시험에서는 TiO 2 나노입자가 RAW264.7 대식세포에서 91

98 DNA의분절화를유도한다는것을확인하였다 [161]. 배양된인간림프구에서 TiO 2 나노입자는 sub-g1 세포의비율을증가시키는반면에, caspase-9 와 caspase-3 를활성화시키고, caspase-3-mediated PARP cleavage 를유도하였다 [162]. 세포자멸사에관한경시적분석을통해 TiO 2 나노입자가 caspase-8/bid 를활성화시켜세포자멸사를유발한다는것이확인되었다. TiO 2 나노입자가유도하는세포자멸사는사람림프구에서 p38/jnk 경로와 caspase-8 의존 Bid 경로에의해매개되었다. 그러나 BEAS-2B 세포를이용한연구에서는 TiO 2 나노입자가미토콘드리아 caspase 8/t-Bid 경로에비의존적인미토콘드리아세포자멸사경로를통해세포자멸사를야기한다고보고되었다 [163]. 이러한결과들은 TiO 2 나노입자가세포주특이적으로반응한다는것을의미한다. 사람림프구를이용한또다른연구에서는 TiO 2 나노입자가소핵형성과 DNA 절단을유의적으로증가시킨다고보고하였다 [164]. TiO 2 나노입자를처리한세포에서 ROS의생성이관찰되었으며 N-acetylcyteine(NAC) 의첨가에의해서 DNA 손상수준이저해되었다. 또한 NAC에의해서 TiO2에의해증가한세포의 ROS 생성도억제되었다 [165]. 사람상피세포를이용한시험에서는산화적 DNA 손상과소핵형성이 ROS와연관이있다고보고하였다 [28]. Comet assay 와 DNA laddering technique 으로식물세포와사람림프구에서 TiO 2 나노입자의유전독성을측정하였을때 TiO 2 나노입자가높은농도에서는 DNA 손상을감소시켰지만낮은농도 (0.25 mm) 에서는유전독성을일으킨다는것을보고하였다 [166]. 이와는대조적으로마이크론크기의 TiO 2 입자는항상 1.25 mm이나그이상의농도에서유전독성이유도되었다. 이연구에서는 TiO 2 나노입자가식물과사람림프구에잠재적인유전독성을지닌것으로결론지었으며이러한결과들은 TiO 2 나노입자의유전독성효과가림프구에서생성된 ROS를통해서일어날수있다는것을의미한다. Anatase, rutile, SiO 2 코팅처리된여러종류의 TiO 2 입자의유전독성을평가하였을때 anatase TiO 2 나노입자와 rutile 마이크론입자가 SiO 2 로코팅된 TiO 2 rutile 나노입자보다더효과적으로유전자의손상을유발하였다 [167]. 유전독성에서나노크기의 rutile의낮은활동성은입자표면의코팅때문인것으로판단되었다 [168]. 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 로코팅한 TiO 2 나노입자 (P25; 25nm; 80/20 anatase/rutile) 는사람폐상피세포 (NCI-H292) 와인간급성단핵구성백혈병세포 (THP-1) 에서세포독성과스트레스관련유전자의발현이유의적으로감소되었다. 사람간암 HepG2 세포에서두가지타입의 TiO2 나노입자 (<25nm anatase: TiO 2 -An) 와 (<100nm rutile: TiO 2 -Ru) 에대한유전독성을 Comet assay로측정하였을때 TiO 2 -An이지속적으로유전자의손상을유발하였다 [21]. 두가지타입의 TiO 2 모두 p53 의 mrna 발현이일시 92

99 적으로증가하였고, 그에따라 DNA 손상반응유전자 (mdm2, gadd45α, 그리고 p21) 들이억제되었다. Caco-2 세포를이용한최근의 fpg-comet assay 실험에서는순수한 anatase TiO 2 나노입자보다 anatase/rutile TiO 2 나노입자가세포독성과약간의 DNA 손상을유의적으로유도한다는것이밝혀졌다 [169]. 또한 anatase/rutile TiO 2 나노입자는농도기준을표면면적으로하였을때유의적인상관성이있었다. BEAS-2B 세포에서광활성을유도하지않은 TiO 2 나노입자의산화적손상을조사하였을때 TiO 2 나노입자 (anatase; 10 nm, 20 nm) 가산화적 DNA 손상, LPO, 그리고소핵형성을유도하였다 [170]. 그러나마이크론크기의 TiO 2 (anatase; >200 nm) 입자를처리한것은영향을주지않았다. TiO 2 나노입자를장기간노출에의해매개되는세포변화에대해조사한결과, TiO 2 나노입자가연한천 (soft agar) 에서세포생존과성장을증가시킬뿐만아니라다핵세포와소핵의수도증가시킨다는것을보고하였다 [171]. 마이크론 (> 200 nm) 과나노크기의 TiO 2 입자 ( 20 nm) 에대한영향을평가하기위하여 1.0μg/cm2 의 TiO 2 입자를 SHE 세포에 시간동안처리한결과, 마이크론크기의 TiO 2 입자를처리한 SHE 세포에서소핵형성이증가 하지않은반면에 나노입자는유의적으로소핵을유도하였다 [172]. 그러나같은세포주를이 용한다른연구에서는금속산화물나노입자에의해유도되는세포독성과유전독성이마이크론크기의입자보다항상높은것은아니라고보고하였다 [173]. Chinese hamster ovary K-1(CHO-K1) 세포를이용한실험에서 TiO 2 입자의소핵유도가유의적으로증가하였다 [140]. Di Virgilio et al. 또한동일한세포를이용하여 TiO 2 입자에관한유사한결과를보고하였다 [174]. 반면에 CHO 세포 (0, 10, 20, 40μg/cm2) 를이용한만성시험 (60일 ) 에서는 TiO 2 나노입자 (100% anatase, 25 nm) 에의한세포독성과유전독성이나타나지않았으며, 그기전으로 superoxide dismutase(sod) 의증가에의한적응과 ROS의해독화을제시하였다 [175]. 최근의연구에서 γ-h2ax 의발현에대한테스트를이용하여 TiO 2 나노입자 (aeroxide P % 73-85% anatase, 14-17% rutile, 2-13% amorphous) 가인간피부섬유아세포세포주에서농도의존적으로 (10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000μg/ml) 세포독성과유전독성을유도한다고보고하였다 [176]. 다른연구에서는인간피부섬유아세포를이용하여 ATM/Chk2와 ATR/Chk1 에의해조절되는 DNA 손상반응경로와 TiO 2 나노입자의상관관계를연구하였다 [177]. 연구결과 TiO 2 나노입자에노출된후 H2AX, ATM과 Chk2의인산화반응이증가되었으며전반적인 DNA 합성비율과복제단위발생의빈도를저해하였다. 종합적으로, 이러한결과들은 TiO 2 나노입자의노출이 ATM/Chk2 DNA 손상반응경로를활성화한다는것을의미한다. TiO 2 나노입자와 ICR 마우스의간 DNA의상호작용을연구한결과, 많은양의 anatase TiO 2 93

100 나노입자의투여에의해서마우스의간무게가유의적으로증가하였다 [178]. 이러한결과는 anatase TiO 2 나노입자가간 DNA에축적되고, DNA의형태를변화시킬수있다는것을의미한다. 또한높은농도의 anatase TiO 2 나노입자의투여는간조직 DNA의절단을유도하였다. 그러나이러한양성의결과이외에도 TiO 2 나노입자가유전독성이없다는많은연구결과도보고되고있다. 최근의연구에서 TiO 2 나노입자 (28nm; 90/10: anatase/rutile) 는 A549 세포 (0, 2.5, 5, 10, 15, 20, 40μg/ml; 24h) 에서 ROS 생성이나 γ-h2ax 발현의증가를유도하지않는다고보고하였다 [179]. 또한 TiO 2 나노입자에의한호흡기계의급성독성에서 Grp78 과 Hsp70 를바이오마커로활용할수있는지에관한연구에서 TiO 2 나노입자가 A549 세포내에충분히존재하였고 ROS를유도하였지만 Grp78 과 Hsp70 의전사와단백질발현수준에는영향을주지않았기때문에 TiO 2 나노입자는급성독성학적영향을평가하는데 Grp78 과 Hsp70 는적합한바이오마커가아니라고결론지었다 [180]. 최근의연구에서는 TiO 2 나노입자 (10 nm anatase; 0-200μg/ml; 24h) 가 Ames test 와 Comet assay 의조건아래에서 thymidine kinase heterozygote(tk6) 세포주에유전독성을일으키지않는다고보고하였다 [181]. 또한 Chinese hamster ovary 세포 (CHO) 를이용한생체내포유류염색체이상시험에서도 TiO 2 나노입자는음성이었다 [144]. 배양된랫드의간상피세포에서 MN assay 를이용한실험에서도유사한음성결과를얻었다 [182]. 그러한결과들은마이크론크기와나노크기의 TiO 2 입자 (5, 10, 20μg/cm2) 모두가직접적으로염색체이상을유발할가능성이없다는것을보여준다. 표면처리한 rutile TiO 2 나노입자 (7±2 nm 50±10 nm) 를 Caco-2 세포에처리하였을때유전독성을유도하지않았다 [183]. 반면에 TiO 2 나노입자는 NF-κB를통한사이토카인의생성으로염증을유발하기도하지만이것은세포주에따라서전혀다른결과를유도하기도하기때문에 NF-κB 이외에도다른인자들이 TiO 2 나노입자의염증에관여한다고보고하였다 [184]. 또한 TiO 2 나노입자는내피세포에서플라스미노겐활성화인자억제제 -1의발현을조절하는데아무런영향을주지않았다 [185]. TiO 2 나노입자는 pro-mmp-2 와 pro-mmp-9 를활성화하지않았으며조직에서 TIMP-1과 TIMP-2에도영향을주지않았다. 요약하면, 많은세포와동물실험에서마이크론크기와나노크기의 TiO 2 입자의유전독성을조사하기위해수행되었으나시험결과들은서로달랐다. 이러한상충된결과를보이는이유는명확하지않지만다른세포주의사용, 노출량, 결정형구조, 입자의확산과나노입자의크기의차이때문이라고생각된다. 세포주를이용한실험에서는호흡계와순환계유래세포에서유전독성이나타난반면에을보였다. 종합적으로보면많은연구들이다른관점에서연구된것보다 TiO 2 나노입자의유전독성이더큰것으로나타내고있다. 그러므로 TiO 2 나노입자를잠재 94

101 적인위험물질로취급해야한다. TiO 2 나노입자가유전독성을발생시키는조건을결정하기위해서는더많은연구들이필요하다 [32]. TiO 2 나노입자가유도하는직, 간접적인 DNA 손상을포함한유전독성의가능한메커니즘은산화스트레스경로와 / 나염증반응을통한메커니즘이다. Table 1과 2에는이논문에서언급된유전독성연구가요약되어있다. 생식독성과발생독성 TiO 2 나노입자가태반을통해태아의조직으로이동하는것이가능하다는실험적증거가있을지라도, 사람이 TiO 2 입자에노출되면생식독성과발생독성을유도하는지아닌지는아직까지정립되어있지않다. zebra fish [187] 와 abalone embryo [113] 과같이다른종에 TiO 2 입자를노출시켰을때는생식을방해하고부화를저해하며, 기형을발생시켰다. 그러나 zebra fish의경우에는조금달랐다 [188]. 포유동물에서많지않은동물데이터로 TiO 2 나노입자의생식독성과발생독성을정의하는것이가능하다. 생체내시험에서쥐의태아에 TiO 2 나노입자 (25와 70nm; 16mg/kg) 를 3, 7, 10, 그리고 14일동안피하노출시켰을때, 새끼의생식기와두개골의신경계에손상준다는것을밝혀냈다 [189]. 이연구에서는에너지-분산형 X-ray 분광기를이용해서태아때노출된 6주령수컷쥐의고환과뇌에서 TiO2 나노입자를발견했는데, 이는 TiO 2 나노입자가혈액고환장벽과혈액뇌장벽 (BBB) 모두관통할수있다는것을의미한다. 피하투여 (100μl 의 TiO 2 suspended at 1μl/μl) 한임신한쥐의수컷태아 ( 배아 16일령 ) 와새끼 ( 생후 2, 7, 14, 그리고 21일 ) 의뇌조직에서뇌발달, 세포사, 산화스트레스에반응하는관련유전자의발현과주산기동안뇌의미토콘드리아활동성에변화가있다고보고했다 [88]. 피하노출이현실적이지않을지라도, 이연구는임신기간동안모계의 TiO 2 나노입자노출에태아의신경계가특별히민감하다는것을보여준다. 또한임신한지8-18 일된 C57BL/6BomTac 쥐에표면이코팅된 TiO 2 나노입자 (UV-Titan; 97nm) 를호흡 (42mg/m3) 을통해노출 (1h/day) 시켜신경행동의변화를기록했다 [90]. 지름이각각 70과 35nm 인실리카와 TiO 2 나노입자를임신한쥐에정맥투여했을때, 임신합병증을일으킬수있다고보고했다 [190]. TiO 2 나노입자는태반, 태아의간과태아의뇌에서발견되었다. TiO 2 를처리한쥐는 TiO 2 를처리하지않은대조군보다작은자궁과작은태아를가졌다. 생체외시험에서쥐의고환레이디히세포에대한 TiO 2 나노입자의영향에대해조사했고, TiO 2 나노입자가디젤배기가스나카본블랙나노입자보다레이디히세포에더많은세포독성 을가지고있다는것을발견했다 [191]. TiO 2 나노입자는레이디히세포로흡수가되고, 생존능 95

102 력, 증식과유전자발현에영향을미친다. 요약하자면, 많지않은생체내 외시험에서는 TiO 2 나노입자에노출되면생식독성과발생독 성이분명히일어날것이라주장한다. 앞으로이러한독성결과들의근본적이메커니즘을분명 히하기위한연구가행해져야할것이다. 발암성 실험적연구 동물실험연구는높은농도의마이크론크기의 TiO 2 입자 (<2.5um; 250mg/m3; 2년 ) 와 TiO 2 나노입자 (<100nm; 10mg/m3 ;2년 ) 가 TiO 2 에노출된쥐에게기도암을발생시킨다는것을보여준다 [43, 192]. 만성폐흡입시험에서는높은농도의 TiO 2 나노입자가기관지폐포선종과 cystic keratinizing squamous cell carcinoma 와 [9] 폐포 / 세기관지선종을야기한다는것이밝혀졌다 [193]. TiO 2 나노입자 (15-40nm) 의발암성을조사한결과, 2년동안 (6개월의휴지기를가짐 ) 약 10mg/m3 의농도에서 TiO 2 나노입자가랫드에서종양을형성한다는것을밝혀냈다 [194]. 같은질량농도일때, TiO 2 나노입자가마이크론크기의 TiO 2 입자보다랫드에서발암가능성이더많은것으로보인다. 이러한발암가능성의차이는마이크론크기의 TiO 2 입자와 TiO 2 나노입자의노출에따른위험을평가할때별개로연구해야하는필요성과직업적노출에서각크기범위에따라별개로연구해야할필요성을제시한다 [43]. 직업상 TiO 2 가노출되었을때인체건강상의위험성을평가하기위해서설치류의정보를바 탕으로폐선량측정방법을사용하여추론했다. 랫드를기반으로추정한 working lifetime 에서 폐암의 0.1% 초과위험과관련된 TiO 2 나노입자의공기중농도는약 0.07 에서 0.3mg/m3 이었 다. 유사한모델을이용해서직업상노출된사람의수명을추정하여랫드의역치를추론했고 마이크론크기의 TiO 2 입자는 mg/m3 에서 TiO 2 나노입자는 mg/m3 라는대략의직업적노출범위를찾았다. 이러한위험분석은각각 0.3 과 2.4mg/m3 의 TiO 2 나노입자와마이크론크기의 TiO 2 입자에대한권장노출한계치의개발을형성하는기초가된다. 인간역학정보의부족으로인해이러한동물실험정보를이용한추정모델들은 TiO 2 나노입자에직업적노출에대한위험평가를예측하는데여전히유용하다. 96

103 기관내투여연구에서암컷랫드에다른농도의친수성 TiO 2 나노입자나 anatase 나노입자 (21-25nm; 1/week for 30weeks) 를투여했다 [195]. 친수성 TiO 2 나노입자나 anatase 나노입자를투여받은랫드에서폐암의발병정도 ( %; 선종 / 암종과편평세포상피종 / 편평세포암종이복합적 ) 는대조군 (0%) 보다유의적으로높았다. anatase 나노입자역시유의적으로높은폐암발병정도 ( %) 를유도했다. TiO 2 친수성나노입자그룹의양성과악성종양의발생정도 (6.7%) 는유의적이지않았다. TiO 2 입자 ( 입자크기는설명되어있지않음 ; 11.3mg/m3; 24개월, 그후에 6개월동안관찰 ) 를처리한암컷랫드를이용한또다른연구에서는 cystic keratinizing eplitheliomas 의발병정도 (11.7%) 와편평세포암종의발병정도 (4.8%) 는대조군그룹 (0.5%) 보다유의적으로높았다 [196]. 0, 1.0, 2.0, 이나 5.0% 의운모로코팅된 TiO 2 가포함된식이를 130 주동안랫드에먹여운모로코팅된 TiO2가식이로섭취했을때의독성과발암성연구를하였다 [197]. 그들은 5.0% 만큼의높은식이농도에서운모로코팅된 TiO 2 가독성학적으로나발암성의효과를생산한다는증거를발견하지못했다. 피부암과관련하여 TiO 2 나노입자 (rutile, 20nm) 의촉진 / 발암성효과를조사하기위하여두단계의피부모델을이용하였다 [71]. 피부발암에민감한 C-Ha-ras pro-oncogene transgenic(hras128) 랫드와그들의야생형형제들을 10주동안일주일에 2번씩등피부를면도해서 UV-B 광선에노출시켰다. 면도한부분은랫드가사망할때까지일주일에두번 100mg/ml 의 TiO 2 나노입자를발라주었다. 종양발생정도는 UV-B 대조군과차이가없었다. 그들은 TiO 2 나노입자가표피를관통하여아래에있는피부조직으로가는것이불가능하기때문에피부발암을야기하지않는다고주장했다. 두단계의피부화학발암모델을이용하여실리콘오일에현탁된실리콘이코팅된 TiO 2 나노입자 (35nm; 8주와 40주동안일주일에 5번 ) 와 Pentalan 408 에현탁된코팅되지않은 TiO 2 나노입자 (20nm; 28주나 40주동안일주일에두번 ) 의촉진효과에대한연구는같은결론에도달했다. 실리콘으로코팅된 TiO 2 나노입자와코팅되지않은 TiO 2 나노입자는건강하거나손상된피부모두관통하지못하는것으로분석되었다. 또한 TiO 2 나노입자가정상의피부조직을관통할수없기때문에그들이피부발암을일으키지않는다고주장했다 [65]. 그러나저자는앞으로선크림에포함된 TiO 2 나노입자의안전성을평가하는연구들은특히햇볕으로인한화상과 UV 아래노출과같이현실적인조건아래에서이루어져야한다고주장했다. 폐연구는기관내와흡입시험의 TiO 2 나노입자의발암성을뒷받침한다. 그러나위내나피부노출과같은노출방식에서는 TiO 2 나노입자의발암성이나타나지않았다. 97

104 역학적조사 지금까지의 TiO 2 입자에노출된작업자를대상으로한역학적조사는작업적노출과폐암의위험성증가사이의연관성을발견할수없었다. 게다가대부분은 TiO 2 나노입자의잠재적인직업적발암성을평가하기위한중요한문제로대표되는 TiO 2 입자의크기와폐암위험성사이의관계를조사하고자연구를설계하지않았다 [32]. 알려진 ( 입자크기는밝혀지지않음 ) 역학적조사의결과는 TiO 2 의노출과폐암의위험성사이에유의적인연관성이없고 [198, 199], 암으로인한표준화사망비와호흡용량의감소로평가되었다 [200]. 전체적으로이러한역학적연구들은마이크론크기의 TiO 2 입자 ( 전체적인먼지나 ) 에대한직업적노출에적용되며, 증가하는암의위험성과는연관성이없다. 안타깝게도 TiO 2 나노입자단독으로유도되는건강상의부작용에대한역학적연구는존재하지않는다. TiO 2 에대한인체역학연구가부족한것이생산과이용이적고상대적으로짧은역사를가진주된이유이다. 게다가나노입자가생체내 외시험모두에서커다란덩어리를형성하기때문에제조된나노입자에대한믿을만한위험예측은쉽지않다 [51]. 실험적증거는입자의크기에따라 TiO 2 의 ph와등전점이일정하지않아표면적이감소할때 TiO 2 나노입자의덩어리가증가한다는것을뒷받침해준다 [201]. 증가된표면적과생물학적환경의상호작용은산화스트레스를유도한다 [8]. 현탁액에서 TiO 2 나노입자가 100nm 이상의덩어리를형성하기쉬울지라도이런덩어리들은안정하지않고체액과조직에서분리되기때문에가치가없다. 그러나분리되는정도는아직모른다. 작업자의 TiO 2 나노입자에대한건강영향을평가하기위해서는앞으로잘설계된역학적연구들을필요로한다. 동물실험들 ( 이논문에서언급된것들 ) 은직업적세팅에서평가될수있는잠재적위험요소로표시하고있다. 잠재적위험요소의예는작업자의건강과상호노출의아래에있다. 요약하자면, 역학적연구는위에서명시된 TiO 2 입자의발암성효과와관련된생체내동물실험정보와마찬가지로이용가능하다. 마이크론크기의 TiO 2 입자에노출된작업자에대한역학적연구는직업적노출과암에대한위험성증가사이의연관성을찾아내지못했다. 인체실험에이용할수있는 TiO 2 나노입자의단독노출에대한정보는여전히부족하다. 동물발 암성연구에서는 TiO 2 나노입자를흡입또는기관지를통해투여했을때종양을생성할수 있음과동일한질량단위일때, 마이크론크기의 TiO 2 입자보다더많은발암성을가지고있다는것을보여준다. 종양은우선적으로선종과편평상피암종을포함한다. 위에서설명한연구를바탕으로, 세계보건기구 (WHO)/IARC에의해 TiO 2 나노입자가 2B 화합물그룹으로써평가되었다 [202]. 동물실험에서이용할수있는 TiO 2 나노입자에대한발암성정보들은그들의건 98

105 강과환경안전에대한심각한문제점을일게한다. 따라서시중에서이용가능한 TiO 2 나노 입자모두는그들의생산과응용에적절하게관리되어야하고평가되어야한다. 이단계에서 TiO 2 나노입자의위험특성은인체노출과용량 - 반응분석 정보가불완전하거나부족함에 의해저해된다. 발암화의분자적메커니즘 많은연구는마이크론크기의 TiO 2 입자와 TiO 2 나노입자가동물모델에서의종양형성과마찬가지로다양한배양세포주에서세포독성및유전독성을유발하는것을보여주고있다 [171]. 위에서설명한것처럼몇몇의생체내 외시험에서 DNA 나선절단, 돌연변이, 염색체손상과세포변화가관찰되었다. 그러나 TiO 2 나노입자가유도하는발암화의메커니즘은명확하지않다. TiO 2 나노입자에의해유도되는 ROS형성, 염증의유도와세포신호전달의변화와같은최근의증거들은그들이발암화원인으로중요한역할을할수있음을나타낸다. ROS 수준과 ROS 제거물질과항산화효소의감소는다양한암과연관된것으로평가되었다 [203]. ROS는하이드록실라디칼 ( OH), 과산화물음이온 (O2- ), 일중항산소 (1O2), 과산화수소 (H2O2), 지질과산화물및차아염소산 (HClO) 과같이산소분자가부분적으로불완전한형태의그룹으로구성되어있다 [204]. ROS의축적은매우높은반응성의퍼옥시니트리트음이온, O2 and NO 의반응에의해형성된강력한산화제와같은반응성질소종의생산을동반할것이다 [205]. 내인성이나외인성의피해에따른 ROS의누적된생산은산화스트레스라정의된다. 산화스트레스는다양한암세포에서발견되며세포의산화, 환원불균형을유도한다. ROS는활성화된유전자의유전적변화의결과로비선택적 DNA 손상을유도할수있다. 세포의 DNA에산화손상은돌연변이로이어질수있다. DNA의돌연변이는각종암의개시에관여한다. 그러므로 ROS 생산에의해유도되는산화스트레스는 TiO 2 나노입자의발암화단계의개시와진행에중요한역할을할것이다. TiO 2 나노입자노출로인한신호구성요소의변화로이어지는 ROS의생산과염증유도는이논문에서검토된다. ROS 의생성 동물의폐에불용성입자의축적은폐종양의발달과관련된기작이라는가설이있다 [43]. 폐에 TiO 2 의축적은 ROS 와상피증식을형성하게하여만성염증으로이어지고, 결국은돌연 변이와종양을형성하게한다. 몇몇연구는 DNA 손상에서자유라디칼을포함 [28, 157] 하고, 99

106 ROS에의한 p53 매개 DNA 손상점검점의활성화 [164], 세포내에증가된 ROS가증가된 G2M 기를정지또는지연되게하고 [156, 171], 돌연변이화유도를포함하는세포에서파생된산화제 [11], 그리고 HO-1과 NOS mrna의발현과 TNF-α 방출과연결된세포밖의 ROS가증가된것 [93] 들을포함하여명백하게보고된것을인용했다. 그외에폐조직에서미토콘드리아기능장애의결과로생성된 ROS는 TiO 2 나노입자 (Wistar rat; 1,5,10,25 와 50μg/ml;<25nm;1 시간 ) 와관련있다. [206] ROS에의한미토콘드리아 DNA의손상이 human HaCaT keratinocytes 에서 TiO2 나노입자 ( 20nm) 가유도하는세포독성과유전독성효과를유발하는행동인지아닌지조사했다 [207]. 그들은 TiO 2 나노입자에노출된것에따라서 HaCaT 세포에서미토콘드리아의 공동결실 을유도한다는것을보여주었다. 그들은 TiO 2 나노입자에대한 ROS-매개 ( 대조군의 16.7 배증가 ; 4시간 ; 5와 50μg/ml) 세포독성및유전독성의가능성을제안했다. 또한엔도사이토시스에의해 TiO 2 나노입자가세포로들어간다는것을밝혔다. HaCaT 세포를이용한또다른연구에서는 TiO 2 나노입자 (anatase, rutile과 anatase/rutile; 4, 10, 21, 25와 60nm; 200μ g/ml) 가 UV-A 광선아래에서 ROS 생성과세포손상을유도할수있다는것을보여줬다 [20]. SOD의감소와 MDA 수준이증가한 HaCat 세포에서산화스트레스의결과로 ROS가유도된다. 세포의생존능력또한용량의존적으로감소하였다. UVA 광선아래에서 TiO 2 나노입자에의한세포생존능력의감소와 ROS 생성의증가역시기록되었다 [208]. 배양한 HaCat 세포를이용한최근연구에서도유사한효과가관찰되었다 [209]. 또한 UVA 광선이조사된 100nm 이하의 TiO 2 는 ROS 매개를통하여세포사멸사수용체인 Fas와초기세포사멸단백질은 Bax의활성을증가시켜세포자멸사적인세포사를유도한다 [201]. 이외에도장기연구 ( 기관지투여 ; 2.5, 5와 10mg/kg) 에서는 15일과 75일에 TiO 2 나노입자 (5-6nm) 가폐에서산화적손상을일으키고 (Nrf2), HO-1과 glutamate-cystine ligase catalytic subunit(gclc) 의발현을높이며 90일째부터는감소하기시작한다는것을발견했다 [211]. 그들은 Nrf2 발현의유도가마우스의폐에서 TiO2 나노입자에의해유도된산화스트레스에대한세포내적응반응이라고주장했다. PC12 세포를이용한또다른연구에서는 TiO 2 나노입자 (1, 10, 50과 100μg/ml; 6, 12, 24와 48시간 ) 는용량과시간의존적으로세포자멸사로이끄는 ROS 의생성을야기한다는것을밝혔다 [212]. ROS-매개산화스트레스, p53, Bax와 caspase-3 의활성과같은산화적 DNA 손상은 human embryonic kidney(hek) 293 세포에서 TiO 2 나노입자 (anatase; 25nm; 50, 100 과 200μg/ml; 24, 48, 72시간 ) 에의해유도된세포자멸자의기계적경로에관여한다는것을찾아냈다 [213]. 이러한증가는용량의존적패턴을보였다. 또한신경세포인 PC12 세포에서 anatase TiO 2 나노입자 (20nm; 25,50,100,200μg/ml) 에의해유도된 G2/M 100

107 세포주기의중단과세포자멸사에 p53 과 JNK 활성이관여한다는것을보여주었다 [214]. 수지상세포를이용한연구에서는 TiO 2 나노입자가 ROS 생성을증대시킨다는것또한밝혀냈다 [215]. TiO 2 나노입자 ( 위내노출 ; 30일연속 ) 는 ROS의유의적인증가와함께산화스트레스를통하여마우스의비장에서독성을발휘한다 [216]. 이이후 p38-nrf-2 신호경로를통해강한 LPO와 HO-1의유의적인발현을주도했다. TiO 2 나노입자 (anatase; 30nm; 50μg/ml) 의결정크기는 OH의생성에큰영향을미치지만, OH의생성에관한최적의크기는두결정형태 (anatase 과 rutile) 사이에차이점을보였다 [217]. CHO 세포에서 OH의생성과세포독성사이에중요한관련이있음이관찰되었다. TiO 2 나노입자 (rutile;40-70nm, 단축 ; nm, 장축 ;40-55g/100g) 가목표세포에서 ROS생성을통해양성종양세포를악성종양으로변환시킬수있는잠재력을가지고있다는것을보여주었다 [218]. 그러나최근의논문에서는세포내에서 TiO 2 나노입자가생성한 ROS와분자적효과와관련된이러한연구외에 TiO 2 나노입자가 ROS 생성없이 DNA 손상을일으킬수있다는것을증명하였다 [219]. 그들의연구는 γ-h2ax 의인산화를기반으로한 A549 세포에서두가지다른크기를가진 TiO 2 나노입자의유전독성을조사했다. 유동혈구계산분석은 TiO2 나노입자에의한 γ-h2ax 의생성이세포주기단계와독립적이며, 많은양의 TiO 2 나노입자를포함한세포는 γ-h2ax 보다더의미있다는것을보여주었다. 염증의유도 이전에다른부문에서언급된대부분의연구들은 TiO 2 나노입자노출로인한염증성효과를보고했다. 이러한연구중일부에대한염증과관련된분자사건의세부내용은여기에서논의될것이다. 사이토카인은염증의작용제또는길항제와같은분자적 event 에관련된면역계의구성성분이다. TiO 2 나노입자 (anatase; 20nm; rutile, 80nm; mg/kg) 는마우스의폐모델에서사이토카인의인터루킨-1계 (IL-1α) 신호를받는다 [142]. TiO2 나노입자에의한 IL-1R 신호는석면의신호와유사하다. IL-1β의생산은카텝신B 활성과 TiO 2 나노입자의특성에비의존적인 ROS 생성에의존적이다 [159]. 또다른연구에서는쥐에위내투여한 TiO 2 나노입자 (5-6nm; 2.5,5,10mg/kg; 90일동안매일 ) 가야기하는신장염에서 IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 과 IL-18 의발현이증가함을보여주었다 [146]. 게다가 TiO 2 나노입자는 TNF-α, MMIF, 교차반응단백질, TGF-β, IFN-γ와 CYP1A1 발현의증가를주도하는 NF-κB를활성화시키고 Hsp70 발현을감소시킨다. 노출된후의쥐 ( 복강내투여 ; 40mg/kg BW) 기관지폐포세척액 101

108 (BALF) 에서 IL-1β, TNF-α, 대식세포염증단백질 (MIP)-2와같은초기염증매개자와폐조직에서 TNF-α와 IL-1β 의 mrna 발현수준이높아졌다. TiO 2 나노입자노출된지 4시간후에폐포세척액에서호중구의유입, 단백질수준과기관지폐포세포의 ROS 활동성이증가하는것을볼수있었다. 게다가 TiO 2 나노입자노출은폐조직과폐포대식세포에서 c-src 와 p38 mitogen-activated protein kinase(mapk) 와같은염증성신호분자의상당한활성화의결과를보여준다. 폐조직에서NF-κB 경로의활성화는 TiO 2 나노입자가심근에서 p38 과트로포닌 1의인산화를증가시킨다는것을보여주었다 [143]. 여기에서많은다른분자적구성물과사이토카인의신호를포함하는 event 와관련된 TiO 2 나노입자에의한염증의유도를볼수있다. 또한이러한증거는다음의참조에서볼수있다 [145,154,160,162,180]. 최근의연구는 TiO 2 입자가유도하는신호전달의변화가암의원인에중요한역할을할수있다는것을나타낸다. 인간의호중구에대한 TiO 2 나노입자의영향을생체외시험을통해조사했다 [221]. 역학적실험에서는 TiO 2 나노입자 (0-100μg/ml) 를처리하고 24시간후에세포괴사가없음을드러냈다. 그러나 TiO 2 나노입자가 p38 MAPK와세포외신호조절키나아제 -1/2 (Erk-1/2) 라는 2가지주요효소를포함한 tyrosine phosphorylation event를현저히그리고빠르게유도했다. 호중구에의해유도된상층액은 24시간후에수집되었고, 항체배열분석 (antibody array assay) 을이용하여다른 36가지의분석물 ( 사이토카인, 케모카인 ) 의존재를시험하였다. TiO 2 나노입자를처리한것은가장많이증가한 IL-8( 대조군과비교하여거의 16배 ) 을포함하여 13가지분석물의생산이증가 (36%) 했다. 이러한결과들은생체외시험에서 TiO 2 나노입자가발암물질의특성중하나로대표되는주요호중구의호전적특성을발휘한다는것을나타낸다. anatase 와 rutile TiO 2 나노입자 (<100nm, anatase/rutile 99.5% 미량금속기반 ; mg/ml) 의혼합물이비만세포 (RBL-2H3 세포 ) 에서히스타민분비를유도한다는것을나타냈다 [118]. 비만세포가 TiO 2 나노입자에노출되면 ROS 생산을유도하고 PLC 활성화를자극하여막 L형 Ca2+ 채널을활성화시켰다. 세포밖의 Ca2+ [Ca2+]i 의유입이일어나고, IP3-IP3 수용체경로와결합되었을때활면소포체에존재하는 Ca2+ 의방출과그이후히스타민분비를유발했다. 그들은 TiO 2 나노입자가직접적으로염증성매개자를유발해서알러젠에의한고전적인면역-자극을우회한다고말했다. 이러한결과들은 TiO 2 나노입자에노출된조직에서또는 IgE 항체-기반의과민반응없이히스타민의비만세포의탈과립이현저하게증가될수있다고주장한다. 결론적으로, 연구결과들은생체내 외시험모두에의해마이크론크기와나노크기의 TiO 2 102

109 입자모두가 ROS 생성하는것을입증한다고결론짓기에충분한것같다. ROS에유도된신호와 p38 의인산화와 G2M 기의세포주기중단뿐만아니라사이토카인의 IL-1계, Bax, caspase3 과9, NF-κB, p53 의활성화가일반적인결과물인것같다. ROS와염증성사이토카인의생성을주도하는염증의유도에관해영향을미치는역할을할것으로보인다. 또한, 실험데이터는 ROS 생성과산화스트레스가 TiO 2 나노입자가유도하는유전독성및발암성에중요할수있다고주장했다. TiO 2 나노입자가유발하는발암의정확한메커니즘은불명확하다. 많지않은데이터는발암유전자의세포신호변화뿐만아니라 ROS, 산화스트레스가상대적으로높은농도의 TiO 2 나노입자의발암성에중요한역할을할것이라는것을보여준다. 추가연구들은가능한너무많은용량의영향과혼란을피하기위하여직업과관련된낮은투여농도가필요하다. 요약 일반적으로마이크론크기의 TiO 2 입자는낮은독성을가진물질로간주되었다. TiO 2 나노입자를마이크론크기의 TiO 2 입자와비교했을때그들의생물학적특성에변화를줄것이라생각되는다른물리화학적특징을가졌다. TiO 2 나노입자의다양한노출경로에대해완전한위험평가를하기위해서는추가적인정보가필요하다. 현재까지미국국립산업안전보건연구원 (NIOSH) 이권장하는허용노출한계외에 TiO 2 나노입자에대한직업적또는환경노출기준은다른규제기관에의해설정되지않았다. 현재그들의독성에대한이해는인간노출에대한추정을필요로하는제한된실험동물이나세포배양연구의수에따라달라진다. 역학적연구는지금까지 TiO 2 입자의직업적노출과암의위험성증가사이에연관성을발견할수없었다. TiO 2 나노입자의물리화학적특성은그들의생물학적이용도와독성에많은영향을미친다. 정보의대부분은 TiO 2 anatase 나노입자가세포독성이나유전독성이있다는것을의미한다. 그러나이러한결과들은 TiO 2 anatase 나노입자만을이용한연구를바탕으로한다. 직업적노출에서 TiO 2 나노입자의흡입은일반적으로인체로들어가는주요한경로이다. 폐염증반응과폐암은 TiO 2 나노입자에노출되는동안실험동물에서대부분관찰되는중요한부작용이다. 일부흡입연구의경우와같이현실적인용량만을사용할때에도염증성반응은여전히눈에띄는영향을보인다. TiO 2 나노입자는폐나계통순환을통해위장관으로흡수되고간, 신장, 비장과같은다른기관에분포하거나심지어뇌에국소적인영향을미치기도한다. 그러나현재전이비율은불확실하다. 몇가지증거가 TiO 2 나노입자가인체의피부에침투할수없는것으로나타났다. TiO 2 나노입자가혈액-뇌장벽, 혈액-고환장벽, 혈액-태반장벽을침투할가 103

110 능성을보여준다. 그러나전이비율이낮은것으로나타났고조직부위에서입자의전위에대한전신반응과관련된증거는부족하다. 많은연구들이 TiO 2 나노입자의유전독성을조사하기위하여생체내 외시험을수행했으나, 결과들은상반되고투여된용량들 (employed doses) 은높았다. 몇가지생체내 외시험을통해서실험동물이나세포배양에서특정한생식독성이나발생독성들이관찰되었다. TiO 2 나노입자에사람이노출되었을때생식독성과발생독성이발생하는지의여부는불명확하다. 동물실험은지속적인노출후에기관이나조직에 TiO 2 나노입자가축적될수있음을나타낸다. 전신장기에서 TiO 2 나노입자의축적에대한반응은추가적인연구에서평가될필요성이있다. 게다가 TiO 2 나노입자가유도하는 ROS의생성과세포신호전달경로의변화는상대적으로높은농도의 TiO 2 나노입자에의한발암원인에서중요한역할을할것이다. 그러나이러한연구들은너무많은입자가문제되지않는보통의직업과관련된용량이나환경노출조건에서반복해야한다. 그럼에도불구하고 TiO 2 나노입자가마이크론크기의 TiO 2 입자보다더큰독성을나타낸다는결과는현재이용할수있다. 이러한정보들은무시할수없고, 작업자의건강을보호하기위한예방수칙의개달은반드시필요하다. 요약하자면, TiO 2 나노입자가최근몇년동안광범위하게연구되어있지만, 여전히위험평가및관리를뒷받침하기위해서건강에미칠수있는영향에관하여설명해야할것들이많이남아있다. 첫째, 노동자와소비자의안전을보장하기위해서모든상업적인 TiO 2 나노입자에대한위험관리체계를마련해서노출위험평가를관리하는것이시급하다. 이것은또한약물전달이용 ( 응용 ) 을위한 TiO 2 나노미립자의생물안전성평가를포함한다. 둘째, TiO 2 나노입자와관련된앞으로의모든연구는생물학적시스템에전달되는크기분포, 결정형구조, 표면적, 표면코팅등과같은입자의물리화학적특성을규정해야한다. 다른연구와데이터를효율적으로비교하는것이가능하고, 적절한선량결정에도움이될것이다. 셋째, 특히마이크론크기와나노크기의 TiO 2 입자의독성과발암성을비교하는장기동물실험이필요하다. 이러한연구는노출용량과경로에관련하여직업적과소비자모두를목적으로해야한다. 넷째, 인체내의다른노출경로를통한 TiO 2 나노입자의흡수, 분포, 대사, 축적과배설을포함하는세부적인독성동태연구는필수적이다. 또한앞으로의연구들은노출된기관과별개의조직반응평가와 TiO 2 나노입자노출과독성효과를반영하는바이오마커에초점을맞춰야할것이다. 마지막으로, TiO 2 나노입자가야기하는암의분자적메커니즘은불명확하다. 많지않은데이터 104

111 는 ROS 생성과특정암과관련된유전자의신호변화는 TiO 2 나노입자의발암성과관련이있 다는것을보여준다. 그러므로앞으로의연구는 TiO 2 나노입자의발암성에대한분자적메커 니즘을규명할필요성이있다. 105

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129 Table 1 Genotoxicity of TiO2 NPs in vivo studies Ref. No. [32] Crystalline structure Exposure Mode Dose Test type Result P25 (75% anatase, 25% rutile) Drink water (C57Bl/6Jmice) [115] Nano-TiO 2 intragastric administration [142] (20 nm), rutile(80 nm) Inhalation (C57BL/6J mice) [145] Anatase Inhalation (ICR mice) [146] Anatase [147] Anatase Intragastric administration (ICR mice) Intratracheal instillation (ICR mice) 60, 120, 300, and 600 μg/ml 100,1000, and 5000 mg/kg Comet assay (+) Micronuclei assay (PCE) (+) γ-h2ax assay (+) Immunostaining assay (+) RT-PCR(TNF-α, IFN-γ, IL8) (+) RT-PCR(TGF-β, IL-10, IL-4) ( ) Micronuclei assay (PCE) 200 μg/ml ELISA assay (IL-1α, IL-1β, IL-6, and TNF) (+) 0, 5,10, and 50 mg/kg 0, 2.5, 5, 10 mg/kg 0, 2.5, 5, 10 mg/kg RT-PCR (IKK1, IKK2, NF-κB, NF-κBP52, NF-κBP65, TNF-α, and NIK) ELISA (IKK1, IKK2, NF-κB, NF-κBP52, NF-κBP65, TNF-α, and NIK) mrna expression (NF-κB, TNF-α, Hsp70, IL-1α, MIF, INF-γ, TGF-β, CRP, CYP1A, IL-4,6,8,10,18) ELISA (NF-κB, TNF-α, Hsp70, IL-1α, MIF, INF-γ, TGF-β, CRP, CYP1A, IL-4,6,8,10,18) RT-PCR (NF-κB, IκB, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL- 18, IL-6, IL-1α, COX-2, HO-1, CYP1A1 and HSP-70) ( ) (+) (+) (+) (+) (+) 123

130 ELISA (NF-κB, IκB, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, IL-6, IL-1α, COX-2, HO-1, (+) CYP1A1 and HSP-70) [148] Anatase,100% Intraperitoneal injection 0, 5, 50, 150 RT-PCR (caspase-3, caspase-9, Bax, Bcl-2, and (ICR mice) mg/kg cytochrome c) (+) ELISA (caspase-3, caspase-9, Bax, Bcl-2, and cytochrome c) (+) [149] UV-Titanium Inhalation (rutile,17nm) (C57BL/6BomTac mice) 42 mg/m3 DNA strand breaks ( ) DNA microarrays (Cyp26b1, Ttr, and Ugt3a2) (+) RT-PCR (Cyp26b1, Ttr, and Ugt3a2) ( ) [150] P20 (coated with Inhalation Gene Expression Analysis (Copine5, Saa1, and 42.4 mg/m3 polyalcohol) (C57BL/6BomTac mice) Saa3) ( ) DNA microarray ( ) PCR (cxcl-5, cxcl1, ccl2, ccl22, ccl7, ccr4, and TNF) (+) UV-Titanium (coated [151] with polyalcohol, Inhalation (C57BL/6J mice) 42.4 mg/m3 Expanded simple tandem repeat (ESTR) assays ( ) 20.6nm) [152] TiO 2 (97%) Inhalation (C57BL/6J mice) 0, 0.8, 7.2, 28.5 mg/m3 Micronuclei assay (PCE) ( ) Comet assay ( ) [153] P25 (15 nm, ultrafine) Inhalation (Wistar rats) 10.4 mg/m3 DNA adduct (+) [178] Anatase Intraperitioneal injection 0, 5, 10, 50, 100 (ICR mice) and 150 mg/kg DNA damage (+) (+) Positive; ( Negative. 124

131 Table 2 Genotoxicity of TiO 2 NPs in vivo studies Ref. No. Crystalline structure Exposure M ode Dose Test type Result [21] Anatase HepG2 cells 0, 1, 10, 100 and 250 μg/ml of TiO 2 NPs Comet assay (+) Fpg-Comet (+) Upregulated mrna expression (p53) (+) Rutile Comet assay (±) Fpg-Comet (±) [28] Anatase, 99.7% A431 cells [30] TiO 2 NPs (99% pure) Human lymph- oblastoid cells μg/ml (10 times) 130 μg/ml Upregulated mrna expression (p53, mdm2, p21 and gadd45α (+) Comet assay (+) Cytokinesis-block micronucleus (CB 소핵 ) assays HPRT mutation assay (+) Comet assay (+) [93] Anatase/Rutile, 80/20 NR8383 rat lung alveolar 0, 10, 20, 40, 80 macrophages μg/cm2 qrt-pcr (HO-1) (+) Immunocytochemistry (NF-κB) (+) [114] Rutile CHO cells 0,25, 50, 100 μg/ml Mammalian chromosome aberration test (+) [155] Spherical (anatase & rutile) A549 cells 100 μg/ml Single strand breaks Comet assay (+) HPLC-MS/MS (+) 8-oxodCuo (+) [156] P30.6 WISH cells μg/ml Olive tail moment ( ) ROS generation (+) Cell cycle arrest (+) [157] Anatase (< 100 nm) IMR90 cells BEAS-2B cells 0,2,5,10,50 μg/cm2 Olive tail moment ( ) DNA breaks ( ) [158] V2O5 treated TiO2 anatase V79 cells 0,1,5,10,15,25 μg/cm2 Micronucleus test (+) DNA damage (+) [159] Spherical (anatase) Spicular (rutile) THP-1 cells 0,20, 100, 500 μg/ml ROS (+) [160] Anatase, 99% U937 cells mg/ml DNA fragmentation (+) (+) 125

132 [161] Anatase/rutile, 80/20 RAW264.7 cells [162] P25 (70-85% Anatase, 30-15% rutile) Human perip- heral blood lymphocytes 0,1, 5, 10, 40 or 80 μg/cm2 DNA fragmentation (+) ELISA (CDDE) 0, 20, 50, 100 μg/ml Flow cytometry of apoptosis (+) Western blot (cleaved caspase-8, -3, Bid, and cleaved PARP (+) SiRNA transfection (+) [163] Anatase BEAS 2B cells 0, 5, 50, 100 μg/ml PCR (Caspase 3 and PARP) (+) SiRNA knockoutt Bid expression Western blot (bcl-2, bax, t-bid, caspase 9, cytochrome C and p53) (+) [164] [165] P-25 (70 5% Anatase, 30 5% rutile) P-25 (75% Anatase, 25% rutile) Human perip- heral blood lymphocytes 0, 20, 50, 100 μg/ml Comet assay (+) Western-blot(p53, p63, phospho-p53, Chk1, phospho-chk1 Chk2, phospho-chk2, phospho-fkhr, phospho-fkhrl1) HaCaT cells 200 μg/ml Flow cytometry of apoptosis (+) mrna expression (Keratin 6) (+) [166] TiO2 NPs Human lymphocytes 0,2,4,6,8,10 mm Comet assay (+) DNA ladder assay (+) [167] Rutile (>95%, <5% SiO2 coating) BEAS 2B cells μg/cm2 Comet assay ( ) CB소핵 assay (+) anatase (99.7%) Comet assay (+) CB소핵 assay ( ) [168] PEG-TiO2 NPs (P25 80% NCI-H292, HeLa and anatase, 20% rutile) HepG2 cells 75 μg/ml RT-PCR (CSF-2) ( ) RT-PCR (IL6, HMOX-1) (+) [169] Anatase, anatase/rutile Caco-2 cells 20, 80 μg/cm2 Fpg-comet assay (+) [170] Anatase (10/20) BEAS-2B cells 0, 5, 10 μg/ml Micronucleus test (+) Comet assay (+) [171] P15 NIH 3T3 cells and human fibroblast HFW cells 10 μg/ml Micronucleus assay (+) ( ) (+) (+) 126

133 ROS (+) 50 μg/ml Colony forming assay (+) μg/ml Western blot (ERK, MEK) (+) [172] Ultrafine ( 20 nm) SHE cells 0,0.5, 1, 5, 10 μg/cm2 Micronucleus assay (+) Kinetochore staining (+) DNA fragmentation (+) DNA ladder assay ( ) [173] P25 anatase SHE cells 0,10, 25, 50 μg/cm2 Comet assay (+) [174] TiO2 NPs Chinese ham- ster ovary-k1 0.5, 1 μg/ml Sister chromatid exchange (SCE) (+) (CHO-K1) cells Micronucleus assay (+) [175] Chinese ham- ster ovary-k1 Comet assay ( ) (CHO-K1) cells Gene mutation assay (Hprt) ( ) [176] P25(99.5% purity, 73 5% Human neonatal foreskin anatase/14 7% rutile and 0, 10, 25, 50, 100, 250, 2 3% amorphous) fibroblast cells 500, 1000 DNA damage μg/ml (+) Immunofluorescent (γ-h2ax) (+) [177] Anatase (15 nm, 100%) Human dermal fibroblasts 0, 1, 3, 10 μg/ml DNA damage (ATM/Chk2) (+) [179] P28 (anatase 90%, rutile 10%) A549 cells 0, 5, 15 μg/ml ROS ( ) DNA double strand breaks (γ-h2ax) ( ) [180] P25 A549 cells μg/ml mrna expression (Grp78 and Hsp70) ( ) Western blot (Grp78 and Hsp70) ( ) [181] TiO2 NPs TA-100 cells 200 μg/ml Comet assay ( ) [182] P25, UV-titan M60 Rat liver epithelial cells 0, 5, 10, 20 μg/ml Micronucleus assay ( ) [183] Surface treated rutile TiO2 Caco-2 cells 100 μg/ml Gene expression analysis ( ) (+) positive; ( negative; (±) uncertain. 127

134 나노물질에관한위해관리사례연구 1. 국내사례국내에서는나노물질에관한위해관리를위해서다양한부처에서각부처의역할에맞는부분에대해서위해관리를수행함과동시에범부처적인협의체를구성하여공통되고일관된정책을수행하도록진행하고있음. 식약처의사례 1) 나노물질안전성평가연구사업운영 2) 나노물질위해평가연구사업운영 3) 나노식의약품등안전관리기본계획수립 (2011 년 7월 ) 4) 나노제품에관한지속적인모니터링수행 5) 식 의약품안전관리기본계획수정 보완 (2012 년 2013 년 ): 최신연구, 국내 외동향등을평가하여 3개년계획을지속수정 시행 6) 화장품표시 광고가이드라인등마련 (2011 년 년 ) - 나노물질함유화장품표시등에대한가이드라인마련 (2011 년 ) - 허위 과대나노광고에대한관리 감독실시 (2011 년 2013 년 ) - 나노식품안전성평가를위한산업계가이드라인을자율평가지침형태로마련 배포 (2012 년 - 나노식품의분류체계마련 (2012 년 년 ) 환경부의사례 1) 나노기술백서발간 (2007 년 12월 ) 2) 나노기술용어정의 ( 진행중 ) 3) 나노물질안전관리중기계획수립 (2013 년 ) 교과부의사례 1) 나노안전성백서발간 (2014 년 ) 고용부의사례 1) 노출위험이큰나노물질의작업장유해성, 위험성평가수행 (2012 년부터 ) 2) 나노물질취급근로자의유해성및위험성평가를수행 (2012 년 2016 년 ) 지경부의사례 128

135 1) 노노소재별생산현장과가공용도별작업장노출등을평가할수있는장비, 기기와측정방법에관한표준화 (2012 년부터 ) 2) 나노제품안전성평가시스템개발 (2012 년 ): 나노소재의안전성평가기술개발, 나노소재및제품에대한독성평가및표준화기술개발, 나노제품표준개발등을수행함. 3) 나노소재, 제품안전인증을위한나노제품안전성센터구축, 운영 (2012 년부터 ): 인정된시험, 검사기관중에서나노안전확인대상제품의시험, 검사기관을지정하여운영함. 범부처활동 1) 나노안전관리종합계획 ( 안 ) 발간 (2011 년 ) - 교과부, 지경부, 식약처, 환경부 2) OECD WPMN 참여 : OECD WPMN SG8의나노물질노출평가사업에 co-sponsor 로참여하여은나노, MWCNT, TiO2에대한사례조사를추진중에있음. 3) OECD, ISO의나노물질시험법제정및표준화참여 2. 외국사례미국의사례 1) EPA: 특수나노물질 ( 다중벽탄소나노튜브 ) 에대한사전신고제시행 (2011 년 6월 ) 2) FDA: 나노기술, 제품에대한산업계가이던스 ( 안 ) 발표 (2011 년 6월 ) 유럽의사례 1) 나노물질안전관리제도화를위한 REACH 적용 (2008 년 12월 ) 2) 나노화장품표시, 신고제시행 (2013 년 1월 ) 3) 환경, 건강, 안전 (EHS) 분야연구예산 2배로증액 (2007 년예산 : 5천만유로 ) 129

136 나노물질에관한리스크커뮤니케이션사례연구국내사례연구 1. 부처간협력체계강화 : 나노물질안전성정책협의회 운영활성화 (2012 년 2016 년, 5개부처공동 ) 2. 관계부처공동 나노안전성백서 제작 발간 (2014 년교과부 ) 3. 정기적나노국민인식도조사실시 (2011 년 년, 교과부, 환경부, 식약처 ) 4. 대국민나노인식증진을위한교육 홍보자료발간 - 대국민인식제고를위한교육 홍보자료발간 (2011 년 년, 관계부처공동 ) - 나노물질취급작업장안전보건가이드개발 보급 (2012 년, 고용부 ) 5. 작업장나노물질안전보건관리지침 ( 가이드 ) 개발 보급 - 나노기술안전성관련해외규제동향보고서발간추진 (2014 년, 지경부 ) 나노소재제품관련안전거버넌스의각국대응전략, 나노물질위해성국제표준설정, 규제조치및안전거버넌스강화를위한사회안전망구축현황등 6. 나노소재제품기업에대한안전성정보지원체계마련 (2012 년, 지경부 ) - 주요국가의나노안전성규제대응을위한안전증명자료제공 기업이나노소재제품수출시물질정보 DB(MSDS) 등의자료지원 형태, 크기등물성정보, 사용된소재의임상실험결과, 노출허용범위등 7. 이해관계자소통강화를위한포럼구성 운영 - 나노안전관리등을포럼구성 운영 (2011 년 2013 년, 환경부, 식약청 ) 외국사례연구외국의경우다양한홈페이지를통해서전문가그룹간의정보의교환과교육이진행되고있었으며, 또한알기쉬운홈페이지를통해서대국민홍보및교육을하고있음. 전문가를대상으로하는의사소통 1. Safenano 1) Safenano 는유럽의나노기술및나노물질의위험성과위해성에관하여연구되고있는현황들을제시하는홈페이지임. 2) 홈페이지주소는 이며과학적지식을제공하는 knowledgebase, 나노물질의위해성에관한컨설팅을수행하는 services, 연구현황및공동연구에관해논의하는 research 부분으로구분되어있음 ( 그림참고 ). 130

137 2. Nano-safety 1) 웹사이트주소는 이며미국에기반을둔나노안전성관련신뢰성 있는정보를제공하는곳임 ( 사진참고 ) 3. Nanosafety cluster 1) 유럽의나노안전성관련프로젝트를수행하는현황과국제적공동연구에관한정보를제공함 ( 그림참고 ). 2) 홈페이지주소는 131

138 4. Nano.gov 1) Nano.gov 는미국에기반을둔홈페이지로서나노물질에관한환경, 건강, 안전성이슈에관한정보를제공하며정부의정책적인방향에관한많은정보를가지고있음 ( 그림참고 ). 2) 홈페이지주소는 일반인및어린이를대상으로하는교육및홍보 1. Nano&me 1) Nano&me는일반인및어린이를대상으로일반국민에게친숙한구성과설명으로나노기술의안전성에관한교육및홍보를하는홈페이지임. 132

139 2) 홈페이지는영국에기반을두고있으며주소는 임. 3) 다양한콘텐츠가비전문가가쉽게이해할수있도록설명되어있음 ( 그림참고 ). 133