연구보고서화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) - 실험동물을이용한고감도발암성확인기법의검증 - 임경택 김수진

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1 연구보고서화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) - 실험동물을이용한고감도발암성확인기법의검증 - 임경택 김수진

2

3 요약문 i

4 ii 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

5 요약문 iii

6 iv 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

7 요약문 v

8 vi 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

9 차례 i

10 ii 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

11 차례 iii

12 iv 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

13 표차례 v

14 vi 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

15 그림차례 vii

16 viii 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

17 Ⅰ. 서론 1 1) 연구배경

18 2 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

19 Ⅰ. 서론 3 < 표 1> 사람의다양한암검체에서잠재적인바이오마커들 β

20 4 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

21 Ⅰ. 서론 5

22 6 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) < 표 2> 이상적인종양마커의특징들

23 Ⅰ. 서론 7

24 8 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

25 Ⅱ. 연구방법 9 1) 연구개발개요 2) 연구개발세부추진일정

26 10 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) [ 그림 1] Insight Onco NGS 기술의개념및응용

27 Ⅱ. 연구방법 11 [ 그림 2] 실험동물을이용한 in vivo 검증연구흐름도

28 12 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) 1) 유전자돌연변이 ( 발암 ) 를유도하는화학물질에대한정보수집 2) 실험동물의선택, 구입및사육

29 Ⅱ. 연구방법 13 3) 발암유도화학물질의투여 4) 시험동물시료의채취 5) 조직및혈액샘플로부터 gdna 및 cfdna 추출

30 14 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) 6) Whole Exome Sequencing 분석기반유전자돌연변이서열분석 7) 유전자돌연변이특이적증폭을위한 PNA probe 기반의 Enrichment 방법확립 8) 고민감도 NGS 기술기반조직샘플에서추출한 gdna 를이용한유전자변이검출 9) 고민감도 NGS 기술기반혈액샘플에서추출한 cfdna 를이용한유전자변이검출

31 Ⅱ. 연구방법 15 1) 실험동물의골수세포를이용한생체내 ( ) 소핵시험 2) 실험동물의폐조직병리검사

32 16 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

33 Ⅲ. 연구결과 17

34 18 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) 1) 2주, 6주, 및 11주동안발암물질을투여한실험동물로부터조직및혈액샘플 [ 그림 3] 조직및혈액샘플수집에대한전체적인실험디자인

35 Ⅲ. 연구결과 19 < 표 3> 조직및혈액샘플수집일정및정보목록

36 20 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) [ 그림 4] 2 주투여한실험동물의혈액샘플기반혈장과혈구분리

37 Ⅲ. 연구결과 21 [ 그림 5] 6 주투여한실험동물의혈액샘플기반혈장과혈구분리

38 22 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) [ 그림 6] 11 주투여한실험동물의혈액샘플기반혈장과혈구분리 2) 실험동물로부터폐암관련조직육안소견

39 Ⅲ. 연구결과 23 < 표 4> 부검시조직병리소견예측내용 < 표 5> 실험동물체중변화 ( 단위 g)

40 24 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) < 표 6> 실험동물조직 ( 폐 ) 중량변화 ( 단위 g) 1) 조직샘플기반 High Pure PCR Template Preparation Kit를이용한 DNA 추출

41 [ 그림 7] DNA 추출의순서도 Ⅲ. 연구결과 25

42 26 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) 2) Nanodrop 과 PicoGreen assay를사용하여 DNA 정량및정성분석 < 표 7> Nanodrop 기반정량및정성분석

43 < 표 8> PicoGreen Assay 기반정량분석 Ⅲ. 연구결과 27

44 28 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) 3) 혈액샘플기반 Circulating Nucleic Acid Kit를이용한 cfdna 추출 [ 그림 8] 혈장을기반으로 cfdna 추출의순서도

45 Ⅲ. 연구결과 29 4) Bioanalyzer 와 PicoGreen Assay 를사용하여 cfdna 정량및정성분석 < 표 9> 대조군에대한 cfdna 의정량분석

46 30 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) < 표 10> 우레탄투여 2 주후실험군에대한 cfdna 의정량분석

47 Ⅲ. 연구결과 31 < 표 11> 우레탄투여 6 주후실험군에대한 cfdna 의정량분석

48 32 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) < 표 12> 우레탄투여 11 주후실험군에대한 cfdna 의정량분석

49 Ⅲ. 연구결과 33 [ 그림 9] 대조군에대한 cfdna 의정성분석

50 34 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) [ 그림 10] 우레탄투여 2 주후실험군에대한 cfdna 의정성분석

51 Ⅲ. 연구결과 35 [ 그림 11] 우레탄투여 6 주후실험군에대한 cfdna 의정성분석

52 36 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) [ 그림 12] 우레탄투여 11 주후실험군에대한 cfdna 의정성분석

53 Ⅲ. 연구결과 37 [ 그림 13] 전체엑솜염기서열분석 (Whole Exome Sequencing) 순서도

54 38 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) 1) 샘플 QC [ 그림 14] 전체엑솜염기서열 (Whole Exome Sequencing) 분석을위한샘플 QC

55 Ⅲ. 연구결과 39 2) Exome Sequencing Library 제작및 QC [ 그림 15] DNA Fragmentation 에대한 QC

56 40 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) [ 그림 16] Adapter ligation 에대한 QC [ 그림 17] Exome capture 에대한 QC

57 Ⅲ. 연구결과 41 3) HiSeq2000 system을이용하여유전자돌연변이 sequencing [ 그림 18] 데이터분석 pipeline(1)

58 42 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) < 표 13> 전체엑솜염기서열분석 (Whole exome sequencing) 결과

59 Ⅲ. 연구결과 43 4) Whole Exome Sequencing 결과분석 [ 그림 19] 데이터분석 pipeline(2)

60 44 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) < 표 14> 선별된폐암관련표적 (target) 유전자들 < 표 15> 폐암관련유전자의돌연변이부위분석

61 Ⅲ. 연구결과 45 1) 표적 (Target) 유전자선정 2) 유전자변이검출용 PNA probe 설계및합성

62 46 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) [ 그림 20] Cdkn2a 유전자돌연변이에대한 PNA 탐침자디자인 [ 그림 21] Vegfa 유전자돌연변이에대한 PNA 탐침자디자인

63 Ⅲ. 연구결과 47 3) 특이도와민감도를향상시킬수있는최적의 Enrichment PNA probe 선정 [ 그림 22] Cdkn2a 과 Vegfa 유전자변이에대한최적의 enrichment PNA 탐침자들

64 48 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) 1) 유전자변이를정확히검출가능한 Mutant Enrichment PCR 조건확립 [ 그림 23] Cdkn2a 유전자의 Amplicon primer 서열 [ 그림 24] Vegfa 유전자의 Amplicon primer 서열

65 Ⅲ. 연구결과 49 [ 그림 25] Cdkn2a 유전자의 RT-PCR 결과 [ 그림 26] Vegfa 유전자의 RT-PCR 결과

66 50 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) [ 그림 27] Cdkn2a 및 Vegfa 유전자에대한전기영동결과

67 Ⅲ. 연구결과 51 [ 그림 28] RT-PCR 조건 [ 그림 29] Cdkn2a 유전자에대한 Reduction Test

68 52 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) [ 그림 30] Vegfa 유전자에대한 Reduction Test

69 Ⅲ. 연구결과 53 2) 조직샘플을기반으로유전자변이존재여부확인 < 표 16> 조직샘플기반 Cdkn2a 유전자변이분석

70 54 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) < 표 17> 조직샘플기반 Vegfa 유전자변이분석

71 Ⅲ. 연구결과 55 3) 정확한변이검출을위한다양한변이비율별분석민감도 test < 표 18> 돌연변이포함정도에따른검출한계시료군조합

72 56 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) [ 그림 31] NGS 순서도

73 Ⅲ. 연구결과 57 [ 그림 32] Cdkn2a 유전자 p.h18p(a>c) 변이에대한극미량검출한계결과

74 58 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) [ 그림 33] Vegfa 유전자 p.p5l(c>t) 변이에대한극미량검출한계결과

75 Ⅲ. 연구결과 59 [ 그림 34] PNA 탐침자기반 mutation enrichment 를사용한저비율변이의증폭률분석

76 60 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) 4) 조직샘플에서 PNA 탐침자기반 NGS 와일반 NGS 의분석민감도비교 < 표 19> 조직샘플기반 Cdkn2a 유전자 p.h18p(a>c) 변이에대한일반적인 NGS 와 PNA 탐침자기반 NGS 의민감도분석

77 Ⅲ. 연구결과 61 < 표 20> 조직샘플기반 Vegfa 유전자 p.p5l(c>t) 변이에대한일반적인 NGS 와 PNA 탐침자기반 NGS 의민감도분석

78 62 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) 1) 혈액샘플에서 PNA 탐침자기반 NGS와일반 NGS의분석민감도비교 < 표 21> 혈액샘플기반 Cdkn2a 유전자 p.h18p(a>c) 변이에대한일반적인 NGS 와 PNA 탐침자기반 NGS 의민감도분석

79 Ⅲ. 연구결과 63 < 표 22> 혈액샘플기반 Vegfa 유전자 p.p5l(c>t) 변이에대한일반적인 NGS 와 PNA 탐침자기반 NGS 의민감도분석

80 64 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) 2) 조직과혈액내변이유전자의일치도분석 < 표 23> Cdkn2a 유전자 p.h18p(a>c) 변이에대한 2 주및 6 주차조직과혈액내변이일치도분석

81 Ⅲ. 연구결과 65 < 표 24> Vegfa 유전자 p.p5l(c>t) 변이에대한 2 주및 6 주차조직과혈액내변이일치도분석 < 표 25> Cdkn2a 유전자 p.h18p(a>c) 변이에대한 11 주차조직과혈액내변이일치도분석

82 66 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) < 표 26> Vegfa 유전자 p.p5l(c>t) 변이에대한 11 주차조직과혈액내변이일치도분석

83 Ⅲ. 연구결과 67

84 68 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

85 Ⅲ. 연구결과 69 < 표 27> Urethane 에대한마우스골수세포소핵시험결과

86 70 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) < 표 28> 조직병리학적소견 ( 군별요약 ) 1

87 Ⅲ. 연구결과 71 < 표 29> 조직병리학적소견 ( 개체별, 수컷 )

88 72 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) (A) Control #1004, Test #1102 (B) Control #1005, Test #1204 (C) Control #1006, Test #1302 [ 그림 35] 실험동물의폐조직에대한조직병리검사조직 (A; 2 주, B; 6 주, C; 11 주, 군간대표예, 50 배, 200 배사진 )

89 Ⅳ. 고찰 73

90 74 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

91 Ⅳ. 고찰 75

92 76 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

93 Ⅳ. 고찰 77

94 78 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

95 Ⅳ. 고찰 79

96 80 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) < 표 30> 폐암조기확인을위해최근에사용되는바이오마커들 μ μ

97 Ⅳ. 고찰 81 1) Carcinoembryonic antigen 2) CYFRA ) Squamous cell carcinoma antigen

98 82 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) 4) Neuron-specific enolase 5) Progastrin-releasing peptide

99 Ⅳ. 고찰 83 6) Tumor M2-pyruvate kinase 7) C-reactive protein 8) Epidermal growth factor receptor

100 84 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) 9) 기타 10) 혈액 DNA

101 Ⅳ. 고찰 85 11) DNA를대상으로하는폐암바이오마커

102 86 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) < 표 31> 폐암조기확인을위한잠재적유전자기반의바이오마커들 12) 유전학적변화

103 Ⅳ. 고찰 87 13) 유전자과메틸화

104 88 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) β β

105 Ⅳ. 고찰 89

106 90 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

107 Ⅳ. 고찰 91 < 표 32> 폐암조기확인을위한잠재적단백질기반의바이오마커들 μ μ α

108 92 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

109 Ⅳ. 고찰 93

110 94 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

111 Ⅳ. 고찰 95 < 표 33> 마우스폐암관련 pathway 에관련된유전자바이오마커들

112 96 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II) [ 그림 36] PI3K-AKT 신호전달 pathway

113 Ⅳ. 고찰 97

114 98 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

115 Ⅳ. 고찰 99

116 100 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

117 참고문헌 101

118 102 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

119 참고문헌 103

120 104 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

121 참고문헌 105

122 106 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

123 참고문헌 107

124 108 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

125 참고문헌 109

126 110 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

127 Abstract 111

128 112 화학물질노출에의한유전자돌연변이 ( 발암 ) 의조기확인 (II)

129

130

131 (2016- 연구원-1256) 발행일 : 2016년 11월 발행인 : 산업안전보건연구원원 장김장호 연구책임자 : 화학물질독성연구실연구위원임경택 발행처 : 안전보건공단산업안전보건연구원 주 소 : (44429) 울산광역시중구종가로 400 전 화 : (042) F A X : (042) Homepage :

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