P. vivax 의재조합 CSP, MSP 및 DBP 를이용한항체반응 191 여말라리아박멸지역으로선포되었으나, 1993년경기도북부지역에서근무하던군장병에서토착형말라리아가발병한이후, 급격히증가하는양상을보이고있으며, 유행지역이확대되고있다 [2, 3]. 국내에서말라리아유행지역의

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1 대한진단검사의학회지 : 제 23 권제 3 호 2003 Korean J Lab Med 2003; 23: 임상미생물학 Plasmodium vivax의재조합 Circumsporozoite 단백, Merozoite 표면단백및 Duffy 혈액형부착단백항원을이용한항체반응 서인범 마경란 임채승 1 이갑노 1 강원대학교의과대학진단검사의학교실, 고려대학교의과대학진단검사의학교실 1 Antibody Responses to the Recombinant Circumsporozite Protein, Merozoite Surface Protein, and Duffy Binding Protein Antigens of Plasmodium vivax in Korea In Bum Suh, M.D., Kyung Ran Ma, M.D., Chae Seung Lim, M.D. 1, and Kap No Lee, M.D. 1 Department of Laboratory Medicine, College of Medicine, Kangwon National University, Chuncheon; Department of Laboratory Medicine 1, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea Background : Plasmodium vivax circumsporozoite protein (CSP), merozoite surface protein (MSP) and Duffy binding protein (DBP) are functionally important conserved proteins and may have an important role in developing antigens. The aim of this study was to develop recombinant CSP, MSP, and DBP antigens, to evaluate their diagnostic usefulness, and to analyze the prevalence of seroreactivity against P. vivax in five different regions in Korea. Methods : To construct recombinant CSP, MSP, and DBP antigens from P. vivax, DNA obtained from specimens previously diagnosed as P. vivax was used. To evaluate diagnostic usefulness of recombinant CSP, MSP, and DBP antigens from P. vivax, sera from 45 patients with P. vivax and 48 normal controls including 4 patients with Plasmodium falciparum were used. For the epidemiologic study, a total of 1,014 serum samples obtained from five different regions in Korea were used. Results : The sensitivity of the IgG antibody against the P. vivax recombinant CSP, MSP, DBP antigens and the antigens mixture of these proteins were 75.6%, 62.2%, 68.9%, and 97.8%, and the specificity were 92.1%, 84.2%, 81.6%, and 97.4%, respectively. The seropositivity against P. vivax recombinant antigens was highest in Cheolwon province. The IgG seropositivity against P. vivax recombinant CSP, MSP and DBP was 2.0%, 1.2%, and 1.5%, respectively. There were no significant differences in seroreactivity against P. vivax between each recombinant protein and each five different regions in Korea. Conclusions : Newly constructed recombinant CSP, MSP and DBP were useful in the detection of antibodies against the P. vivax antigen. (Korean J Lab Med 2003; 23: 190-8) Key Words : Plasmodium vivax, Seroprevalence, Circumsporozoite protein, Duffy binding protein, Merozoite surface protein 서 론 접수 : 2003년 3월 4일접수번호 : KJCP1657 수정본접수 : 2003년 6월 5일교신저자 : 이갑노우 서울특별시구로구구로동 80 고려대학교의과대학부속구로병원진단검사의학과전화 : , Fax: kaplee@korea.ac.kr 말라리아는말라리아원충에감염된얼룩날개모기 (Anopheles mosquito) 에의하여매개되는질환이다. 전세계적으로매년 5억명정도가말라리아에감염이되며, 이중 250만명정도가사망에이르는것으로알려져있다 [1]. 한국은 1979년 WHO에의하 190

2 P. vivax 의재조합 CSP, MSP 및 DBP 를이용한항체반응 191 여말라리아박멸지역으로선포되었으나, 1993년경기도북부지역에서근무하던군장병에서토착형말라리아가발병한이후, 급격히증가하는양상을보이고있으며, 유행지역이확대되고있다 [2, 3]. 국내에서말라리아유행지역의확대로인하여말라리아의관리가주요문제로부각되고있는데신속하고정확한진단이필수적이며, 특히말라리아유행의해결을위해서는정확한역학조사가선행되어져야하는데이러한기초자료는부족한실정이다. 최근말라리아의표적항원에대한연구가보고되고있는데, 말라리아가처음인체에침입시간세포에부착하는기능을갖는 circumsporozoite 단백 (circumsporozoite protein; 이하 CSP) [4-13] 과말라리아가증식하면서인접적혈구를침입할때관여하는 merozoite 표면단백 (merozoite surface protein; 이하 MSP)[14-23] 및 Duffy 혈액형부착단백 (Duffy binding protein; 이하 DBP)[24-26] 이있으며이러한단백이사람에서말라리아에대한면역기능을형성하는데중요한기능을한다고알려져있으며, 이러한단백질은항원으로재조합또는합성하여말라리아항체의진단및말라리아백신으로서중요역할을할것으로생각된다. 이에저자들은유전자재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원을제작하여, 말라리아진단에서의유용성을알아보고자하였고, 국내에서말라리아유행지역인위험지역과주의지역으로구분하여일반건강검진자를대상으로재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원에대한항체반응의양성율을조사, 분석하여각지역의양상과특징및국내말라리아예방에기초가되는역학자료를제공하고자하였다. 재료및방법 1. 대상검체 USA) 를이용하여추출한 DNA를 -70 에냉동보관후이용하였으며, 재조합항원의평가를위해양성대조군으로 P. vivax로확진된환자 45명, 음성대조군으로 Plasmodium falciparum 환자 4명및정상인 34명의혈청을냉동보관후이용하였다. 한국형 P. vivax의재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원에대한항체반응의역학조사를하기위하여인구 10만명당 100명이상발생하는고위험지역중철원지역과인구 10만명당 명이발생하는저위험지역중의정부시와인천지역, 안전지역인구로및안산지역을대상지역으로하였다. 2001년 6월부터 7월까지철원길병원, 인천길병원, 지방공사의정부의료원, 고려대학교의과대학부속구로병원및안산병원에서건강검진을받은환자중, 각지역에거주하고있는환자각각 146명, 249명, 216명, 181명및 222명등총 1,014명을대상으로 plain tube에채혈하여 2시간이내에혈청을분리하여 -70 에냉동보관후이용하였다. 각환자의병력, 거주기간, 말라리아진단유무및말라리아위험지역여행경력을조사하였으며연구결과, 항체양성인환자를대상으로병력을재조사하여말라리아위험지역에거주하거나여행한경력인있는경우는대상군에서제외하여다시분석하였다. 각지역별나이및성별의분포는 Table 1과같다. 2. 방법 1) 재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원의제조 (1) 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction; 이하 PCR) CSP, MSP, DBP 유전자를증폭하기위하여각유전자중, 보고된문헌검색과 Gene bank의자료를탐색하여각유전자의항원결정기를갖도록시발체를선정하였는데, CSP는 tandem repeat region (Genbank Accession No. M11926), MSP는 glutamine 반복부위 (Genbank Accession No. M60807, 631-2,409 bp), DBP는 histidine이풍부한부위 (Genbank Accession 재조합항원을제작하기위하여고려대안산병원에서 Plasmodium vivax로확진받은환자의전혈을 K 3 EDTA 시험관에채혈하여 DNA 추출킷트 (InstaGene matrix, Bio-Rad, CA, Table 1. Age and sex distribution of the patients according to different regions Age Cheolwon Inchon Euijeongbu Ansan Guro (yrs) M F M F M F M F M F Total Total ,014 Table 2. Oligonucleotide sequences of primers used for CSP, MSP and DBP gene amplification Target Sequence (5-3 ; sense, antisense) Product Restriction Size (bp) Enz CSP TCTAGAGAAAATAAGCTGAAACAACCA 651 Xbal GGA AAGCTTCTAAACTTTATCTAGGTATTC HindIII TTTCA MSP AGATCTTCCACCAACACGACTAATGGCC 1,779 BglII CC TCTAGACTAGAGCTTTTCGAGGTATTC XbaI CAG DBP TCTAGAGAGGGAAATTCTCGTAAAAAT 1,668 XbaI AAGCTTCTAATCAACTGCATCAGTAGT HindIII AGC *boldface letters: recognition site of restriction enzyme. Abbreviations: CSP, circumsporozoite protein; MSP, merozoite surface protein; DBP, Duffy binding protein.

3 192 서인범 마경란 임채승외 1 인 No. M61095, 890-2,557 bp) 가포함되며, 각유전자의결찰 (ligation) 을위한제한효소에대해작용할수있는특이염기서열이포함되도록하였다. 각시발체는 TaKaRa medicals (Shiga, Japan) 에의뢰, 제작하였다 (Table 2). 각재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원의제조를위한유전자산물을얻기위하여 PCR 반응을시행하였다. PCR은 Gene Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 를이용하여 95 에서 5분간반응시킨후, 94 1분, 56 1분, 72 1분의조건으로 5회반복시행후, 다시결합반응온도를 58 로하고나머지는같은조건으로 30회씩반복시행후, 최종연장반응을 72 에서 10분간실시하였다. 반응액은분리한 DNA 100 ng에 PCR 반응혼합액 (0.3 pmol primer, 10 mm KCl, 20 mm Tris, ph 8.8, 0.1% Triton X-100, 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 2 mm MgSO 4, 0.2 mm dntp, 1 mm MgCl 2) 이최종 50 L가되도록혼합한후, taq polymerase 5 U을첨가하였다. 증폭된 DNA는 ethidium bromide가함유된 1% agarose gel에서전기영동하여자외선투조기로관찰하여, 각각의유전자산물을확인하였다. 확인된각유전자산물은 Gel extraction 킷트 (I.J. Bio, Inc, Ansan, Korea) 를이용하여 agarose gel로부터정제, 추출하였다. (2) 재조합 DNA의클로닝 MSP 유전자는제한효소 BglII와 XbaI으로처리하여 PA vector의 BglII와 XbaI 부위에, DBP와 CSP 유전자는 XbaI과 HindIII로처리하여 pmal vector의 XbaI과 HindIII 부위에결찰하였다. 각유전자의결찰은 T4 DNA ligase를첨가하여 16 에서 16시간반응하였다. 각각의결찰된 DNA 5 L를 100 L의형질전환된 E. coli DH5 와혼합하여얼음속에서 1시간방치한후42 에서 90초간열충격을주었다. LB배지 1 ml을첨가한후37 에서 1시간더배양하였다. 이를 12,000 g로원심분리하여 LB 200 L에부유한후, ampicillin 100 g/ml이포함된 LB 한천평판배지에도말하였으며, 37 에서 16시간배양한후얻어진집락을각각선택하여, LB 배지에서배양하여 plasmid DNA를추출하고 MSP는 BglII와 XbaI으로 DBP, CSP는 XbaI 과 HindIII로절단하여확인하였다. 이들재조합 DNA로부터단백질의발현을위하여 MSP 유전자가삽입된 plasmid는 E. coli MC1061로, DBP와 CSP 유전자가삽입된 plasmid는 E. coli Top10F 로각각형질을변환하였다. (3) 단백질발현확인재조합균주들로부터각단백질의발현을확인하기위하여 ampicillin 100 g/ml이포함된 LB 배지에 37, 150 rpm으로 16시간진탕배양하였다. 이것을다시동일한배지 500 ml이들어있는 1 L baffled flask에 1% 씩접종하고배양 2시간이지난다음각각의유도물질을첨가하여단백질발현을유도시키고 5시간추가배양후회수하였다. 유도물질은 MSP의경우 1% arabinose를 DBP, CSP의경우 0.5 M IPTG (Isopropyl-thiobeta-galactopyranoside) 를사용하였다. 발현확인을위하여각시료를 1 ml씩취하여 2 sample buffer (0.125 M Tris-HCl, ph 6.2, 4% SDS, 20% glycerol, 10% mercaptoethanol) 에혼합한후 10% SDS polyacrylamide gel에서 150 V로전기영동하였다. 전기영동이끝난후, gel은 Coomassie blue로염색하여, 단백질발현산물을확인하였다. 단백질발현산물의예상크기는 CSP 67.9 KDa, MSP 79.1 KDa 및 DBP KDa였으며확인된단백질발현산물의크기는각각 63.8 KDa, 77.2 KDa 및 97.8 KDa였다. (4) 단백질정제단백질정제과정및 P. vivax의각재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원에대한 IgG 항체진단용 ELISA 킷트와세가지항원에대한통합용 ELISA 킷트, IgG 항체진단용 ELISA 킷트및 IgM 항체진단용 ELISA 킷트는녹십자라이프사이언스 ( 주 )(Seoul, Korea) 에의뢰하여제작하였는데그과정은아래와같다. 1 MSP의정제 MSP의단백질을발현하여회수된대장균을융해완충액 (20 mm Tris, ph 8.3, 10 mm EDTA, 10 mm DTT, 10 mm PMSF) 으로부유하였다. Lysozyme (1 mg/ml) 을혼합한후얼음속에서 30분간방치하여대장균을융해시켰다. 초음파분쇄기로최대출력의 50% 에서 5분간 3회분쇄한후 4 에서 8,000 rpm, 20분간원심분리하여침전을회수하여완충액 (8 M Urea, 20 mm Tris, 2 mm DTT, ph 8.6) 으로용해시켰다. DEAEsepharose를 cm column에채운후 column buffer (8 M Urea, 20 mm Tris, 2 mm DTT, ph 8.6) 로세척하였다. 대장균용해액을 1.7 ml/min의속도로통과시킨후다시 column 완충액으로세척하고단백질의용출을위하여 column buffer에 M NaCl의농도구배를주어용출액을 5 ml씩수집하였다. 단백질은 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis법으로확인하였다. 2 DBP, CSP의정제 DBP, CSP의단백질을발현하여회수된대장균을융해완충액 (10 mm sodium phosphate, 30 mm NaCl, 10 mm mercaptoethanol, 10 mm EDTA, ph 7.2) 으로부유하였다. Lysozyme (1 mg/ml) 을혼합한후, 얼음속에서 30분간방치하여대장균을융해시켰다. 초음파분쇄기로최대출력의 50% 에서 5분간 3회분쇄한후 4 에서 8,000 rpm, 20분간원심분리하여상층액을회수하였다. 상층액에 column buffer를동량첨가한후정제에사용하였다. Amylose resin을 cm column에채운후 column buffer (10 mm sodium phosphate, 0.2 M NaCl, 10 mm mercaptoethanol, 10 mm EDTA, ph 7.2) 로 column 부피의 3배양으로세척하였다. 대장균용해액을 1 ml/min의속도로통과시킨후 column 완충액으로세척하고 10 mm maltose

4 P. vivax 의재조합 CSP, MSP 및 DBP 를이용한항체반응 193 가함유된 column buffer로단백질을용출하여 5 ml씩분획을수집하였다. 단백질은 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 법으로확인하였다. 2) ELISA에의한 CSP, MSP 및 DBP의활성측정 (1) 각지역별 P. vivax의재조합 CSP, MSP 및 DBP 통합항원에대한항체양성률측정정제된 MSP, DBP, CSP 단백질을 bovine serum albumin을표준단백질로하여 Bradford법 [27] 에의하여 595 nm에서비색정량하여각 10 g/ml이되게 50 mm carbonate buffer (ph 9.6) 에섞어 100 L를 microplate well에넣고 25 에서 16시간방치하였다. 그리고카세인으로 2시간동안봉쇄를한후이용하였다. 5개지역대상군의혈청 100 L를각 well에넣은후 37 에서 1시간동안반응시켰다. 인산염완충액으로 5회세척하고정제된유전자재조합 MSP, DBP, CSP 단편항원에 horse radish peroxidase가결합된접합체액을 37, 30분간반응시키고세척후, trimethylbenzidine (TMB) 을첨가하여발색시키고 1.6 N 황산용액으로반응을정지시킨후 96 well plate autoreader를사용하여 450 nm에서흡광도를 655 nm에서보정하여측정하였다. 판정은말초혈액도말검사와 PCR검사에서 P. vivax로확진된 45명의환자와음성대조군 38명의흡광도를측정한결과를이용하여, 흡광도값이음성대조군평균에 0.200을더하여그이상일경우양성으로판정하였다. 정량하여각 10 g/ml이되게 50 mm carbonate buffer (ph 9.6) 에섞어 100 L를 microplate well에넣고 25 에서 16시간방치하였다. 그리고 casein으로 2시간동안봉쇄를한후이용하였다. 5개지역의혈청 10 L를인산염-카제인완충액 100 L로희석하여각 well에넣은후 37 에서 1시간동안반응시켰다. 인산염완충액으로 5회세척하고 goat anti-human IgG와 horse radish peroxidase 접합체액을 37, 30분간반응시키고세척후, trimethylbenzidine (TMB) 을첨가하여발색시키고 1.6 N 황산용액으로반응을정지시킨후 96 well plate autoreader를사용하여 450 nm에서흡광도를 655 nm에서보정하여측정하였다. 판정은말초혈액도말검사와 PCR 검사에서 P. vivax로확진된 45명의환자와음성대조군 38명의흡광도를측정한결과를이용하여, 흡광도값이음성대조군의 3배이상일경우양성으로판정하였다. (4) P. vivax에대한항체양성의판정 P. vivax에대한항체양성의기준은 P. vivax의재조합 CSP, MSP 및 DBP 통합항원에대한항체가 2회측정시모두양성이고, P. vivax의재조합 CSP, MSP 및 DBP 통합항원에대한 IgG 또는 IgM 항체가양성이고, IgG 항체가양성일경우에는재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원에대한 IgG 항체가양성일경우를항체양성으로정하였으며그외에는항체반응음성으로분류하여분석하였다. (2) 각지역별 P. vivax의재조합 CSP, MSP 및 DBP 통합항원에대한 IgG, IgM 항체양성률측정 Goat anti-human IgG 또는 IgM을 50 mm carbonate buffer (ph 9.6) 에섞어 100 L를 microplate well에넣고 25 에서 16시간방치하였다. 그리고 casein으로 2시간동안봉쇄를한후이용하였다. 5개지역의혈청 10 L를인산염-카제인완충액 100 L로희석하여각 well에넣은후 37 에서 1시간동안반응시켰다. 인산염완충액으로 5회세척하고, 정제된유전자재조합 MSP, DBP, CSP 단편항원에 horse radish peroxidase가결합된접합체액을 37, 30분간반응시키고세척후, trimethylbenzidine (TMB) 을첨가하여발색시키고 1.6 N 황산용액으로반응을정지시킨후 96 well plate autoreader를사용하여 450 nm에서흡광도를 655 nm에서보정하여측정하였다. 판정은말초혈액도말검사와 PCR검사에서 P. vivax로확진된 45명의환자와음성대조군 34명의흡광도를측정한결과를이용하여, 흡광도값이음성대조군평균에 0.200을더하여그이상일경우양성으로판정하였다. (3) 각지역별 P. vivax의재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원에대한 IgG 항체양성률측정정제된 MSP, DBP, CSP 단백질을 bovine serum albumin을표준단백질로하여 Bradford법 [27] 에의하여 595 nm에서비색 결과 1. P. vivax의재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원의평가고려대안산병원에서 P. vivax로확진된 45명의환자와 P. falciparum으로확진된 4명의환자를포함한 38명의음성대조군을대상으로재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원에대한 IgG 항체, 3종류의각재조합단백을통합한항원에대하여각각 IgG, IgM 및 IgG와 IgM 혼합항체를측정하여각각의민감도및특이도를구한결과, 각재조합항원에대한 IgG 항체의민감도는 CSP 75.6%, MSP 62.2% 및 DBP 68.9%, 특이도는 CSP 92.1%, MSP 84.2%, DBP 81.6% 로민감도와특이도는재조합 CSP에서가장높게나타났으며, 민감도에비해특이도가높은결과를얻었다. 세가지재조합통합항원에대해서민감도는 IgG 97.8%, IgM 95.6% 및 IgG와 IgM 혼합항체 97.8% 였고, 특이도는 IgG 97.4%, IgM 92.1%, IgG와 IgM 혼합항체 94.7% 로특이도에비해민감도가높았으며 IgG가 IgM 보다민감도및특이도에서더우수하였다 (Table 3). 2. P. vivax에대한항체의흡광도분포 P. vivax에대한항체양성의판정을정한기준에따라양성군

5 194 서인범 마경란 임채승외 1 인 Table 3. Sensitivity and specificity of recombinant CSP, MSP and DBP antigens against P. vivax antibody by ELISA (n=83) Antigens Sensitivity (%) Specificity (%) Recombinant CSP (IgG) Recombinant MSP (IgG) Recombinant DBP (IgG) Recombinant CSP, MSP and DBP (IgG) Recombinant CSP, MSP and DBP (IgM) Recombinant CSP, MSP and DBP (IgG+IgM) Abbreviations: See Table 2. Table 4. Distribution of absorbance values of the sera from humans against P. vivax by ELISA and cut-off value Antigens Positive Negative Mean SD Mean SD Cut-off value Recombinant CSP (IgG) Recombinant MSP (IgG) Recombinant DBP (IgG) Recombinant CSP, MSP and DBP (IgG) Recombinant CSP, MSP and DBP (IgM) Recombinant CSP, MSP and DBP (IgG+IgM) Abbreviations: See Table 2. Table 5. Seroprevalence to the antigens mixture of recombinant CSP, MSP and DBP of P. vivax by ELISA (positive rate, %) Age (yrs) Cheolwon Inchon Euijeongbu Ansan Guro 20 2/14 (14.3) 0/9 (0) 0/17 (0) 0/10 (0) 0/5 (0) /32 (0) 0/13 (0) 0/36 (0) 2/33 (6.0) 1/32 (3.1) /28 (7.1) 0/25 (0) 0/37 (0) 0/56 (0) 0/44 (0) /24 (4.2) 2/77 (2.6) 0/58 (0) 0/58 (0) 0/47 (0) /15 (13.3) 2/61 (3.3) 1/32 (3.1) 1/39 (2.6) 1/31 (3.2) /18 (11.1) 4/40 (10.0) 1/27 (3.7) 1/24 (4.2) 0/13 (0) 71 1/15 (6.7) 3/24 (12.5) 0/9 (0) 0/2 (0) 0/9 (0) Total 10/146 (6.8) 11/249 (4.4) 2/216 (0.9) 4/222 (1.8) 2/181 (1.1) 에대한 IgG, IgM 항체양성률을검사한결과, IgM 항체양성은 3명에서나타났으며, 모두철원지역의대상군이었으며, 흡광도는각각 3.060, 2.127, (cut off value: 0.25) 로높았고, 모두 IgG 항체도양성이었다. IgG 항체반응양성률은 36명에서나타났으나, 재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원각각에대한 IgG 항체반응이모두음성인 7명을제외하면 29명에서양성을보였다. 이들은모두 P. vivax의재조합 CSP, MSP 및 DBP 통합항원에대한항체반응이양성이었다. 지역별로는재조합 CSP, MSP 및 DBP 통합항원에대한항체양성률과같이철원지역 (6.8%) 과인천지역 (4.4%) 이의정부 (0.9%), 안산 (1.8%), 구로 (1.1%) 지역에비해유의하게높은항체양성률을가지고있었다 (Table 5). 과음성군을분류하여각각의 ELISA 항체검사에의한양성군과음성군에서의흡광도및 cut-off 값은 Table 4와같다. 나이에따른각항원에대한음성군에서의항체가는나이가들수록증가하는양상을보였다. 3. 각지역별 P. vivax 의재조합 CSP, MSP 및 DBP 통합항원에대한항체반응 국내 5개지역, 총 1,014명을대상으로 P. vivax의재조합 CSP, MSP 및 DBP 통합항원에대한항체반응검사를한결과, 3.4% (34/1,014) 의양성률을보였으며, 지역별로는철원지역 (6.8%) 과인천지역 (4.4%) 이의정부 (0.9%), 안산 (1.8%), 구로 (1.1%) 지역에비해유의하게높은항체양성률을가지고있었다. 나이별항체양성률은전체적으로통계학적유의한차이는없었으나, 철원과인천지역의경우 50세이상의대상군에서 50 세이하보다더높은항체양성률을보였다. 성별항체양성률은철원지역의경우, 남자에서높은항체양성률을보였다 (Table 5). 4. 각지역별 P. vivax 의재조합 CSP, MSP 및 DBP 통합항원에대한 IgG, IgM 항체반응 각지역별 P. vivax 의재조합 CSP, MSP 및 DBP 통합항원 5. 각지역별 P. vivax 의재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원에대한 IgG 항체반응 총 1,014명을대상으로 P. vivax의재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원에대한 IgG 항체양성률을측정한결과, 각각 20명 (2.0%), 12명 (1.2%), 15명 (1.5%) 에서양성을보였다. P. vivax 의재조합 CSP, MSP 및 DBP 통합항원에대한 IgG 항체양성환자에서각각의재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원에대한 IgG 항체양성률은 69.0%, 44.8% 및 51.7% 였으며, 지역에따른각재조합항원에대한항체양성률의차이는보이지않았다. 6. P. vivax 항체양성자의병력조사 총 1,014명에대해 P. vivax 항체반응을검사한결과, 29명이 P. vivax 항체양성이었으며, Wright-Giemsa 염색을이용한박층도말검사와후층도말검사상말라리아는발견되지않았다. 이들의병력을조사한결과, 재조합 CSP, MSP 및 DBP 통합항원에대한 IgM 항체양성이었던철원지역의 3명은말라리아에감염되었던병력이있었다. 그외에 IgG 항체양성이었던철원지역의 7명은말라리아의병력은없었으며, 류마토이드관절염의병력이있는 1명외에는특이사항이없었다. 인천지역의 IgG 항체양성이었던 11명중, 3명은강화지역에거주또는방문한과

6 P. vivax 의재조합 CSP, MSP 및 DBP 를이용한항체반응 195 거력이있었으며, 그외에 8명중, 1명은류마토이드관절염환자였고, 말라리아병력자는없었다. 의정부지역의항체양성이었던 2명은각각간경화, 당뇨병환자였다. 안산지역의항체양성이었던 4명중, 2명은경기도파주, 강화지역에서군복부를한경력이있었으며, 2명은류마토이드관절염환자였다. 구로지역의항체양성이었던 2명은특이사항이없었다. 각지역별항체양성군에대하여환자의병력을재조사하여다른지역에서의여행및거주경력이있는환자를대상군에서제외한결과각지역별항체양성률은말라리아고위험지역인철원지역에서 6.8% 로가장높았으며인천, 의정부, 안산및구로지역이각각 3.3%, 0.9%, 0.9% 및 1.1% 였다. 고찰말라리아는세계에서단일질병으로서가장많은사망자를일으키는질병이다. 그러나효과적인백신이개발되지않고있으며기존약제에대하여내성을보이는균주가출현하여급속히확산하고있어말라리아의감염관리에어려움을겪고있다. 효과적인백신개발을위한노력이계속되고있으나현재세계보건기구가권고하는효과적인관리수단중제일핵심이되는것은빠른진단과적절한치료이다 [28]. 이방법을성공적으로수행하기위해서는신속하고정확한진단법의도입이선행되어야한다. 국내에서는오래전부터삼일열말라리아가전국적으로유행하였으나, 1960년대에법정전염병으로규제되고항말라리아사업을시행하면서감소추세를보여 1970년대후반에는토착형말라리아가거의박멸되었다. 특히, 1984년 2예가보고된이후, 토착형말라리아의발생은보고된바가없다. 반면, 1980년대이후해외취업및여행을위하여말라리아위험지역으로의여행이증가함에따라아프리카, 중동, 남미, 동남아시아등지에서삼일열말라리아나열대열말라리아에이환되어귀국한후발병하는수입성말라리아는증가되는양상을보였다. 그후, 1993년경기도파주에서말라리아가 1예보고 [2] 된이후, 1994년 20예, 1995년 107예, 1996년 357예, 1997년 1,724예, 1998년 3,932예, 1999년 3,621예, 2000년 4,142예로급속히증가되고있다 [29]. 말라리아재유행의초기인 1993년과 1994년에는주로강화, 김포, 파주, 연천, 철원등의휴전선에근무하였던군인이나이곳거주민에서국한되어발생하였다. 1996년에는연천중부지방과철원에서환자의증가율이높아지다가 1998년에는비무장지대 10 km 밖의경기도북부와강원도서북부지역뿐아니라고양, 동두천, 포천지역에서환자발생이증가되어말라리아유행지역이확산되는양상을보였다 [30]. 현재국내말라리아의유행지역은말라리아가인구 10만명당 100인이상발생한시, 군을위험지역, 인구 10만명당 10인이상발생한시, 군은주의지역으로분류하는데위험지역은 1999년 36개지역에서 2000년 40개지역으로분류하고있으며, 주의지역은 1999년 46개지역에서 2000년 54개지역으로증가되 고있다. 위험지역은경기도김포시, 연천군, 파주시, 포천군, 인천강화군, 옹진군, 강원도고성군, 철원군, 화천군등으로분류되어있다. 본연구에서는위험지역으로분류되고있는강원도철원군, 주의지역으로분류되고있는인천시, 1999년주의지역에서 2000년제외된의정부시, 안전지역으로분류되고있는서울시구로지역및안산지역의주민을대상으로말라리아항체유무를측정하였으며그결과위험지역으로분류되고있는강원도철원군지역에서다른지역에비하여유의하게말라리아항체양성율이증가되어있는결과를보여국내말라리아유행지역의빈도와일치되는결과를얻었다. 말라리아진단에가장보편적으로사용된방법은말초혈액도말검사이다. 말초혈액도말검사는특이도가매우우수하며, 감염된원충의종을감별할수있다는장점이있으나많은시간과노력이요구되는동시에숙련된검사자를필요로한다 [31, 32]. 이런단점을보완하기위하여현장에서사용할목적으로세계보건기구주도하에말라리아감염자의혈액에서말라리아항원을빠른시간내에검출하는신속진단법이개발되었다. 현재신속진단법의검출대상항원은 histidine-rich protein (HRP-II), plasmodium lactate dehydrogenase (pldh), pan-malaria 등 [33, 34] 이며장점은특별한장비없이현장에서간편하게검사할수있고결과판독이쉽다. 그러나 HRP-II 항원을이용한신속진단법은열대열말라리아만을진단할수있으며, 초기에만들어진제품은류마티스인자를가지는환자에서위양성을보인다. pldh 항원을이용한신속진단법 (OptiMal) 은원충수가 0.01% 이하일경우는진단율이크게떨어지는단점이있다 [35]. 열대열말라리아와삼일열말라리아를감별진단할수있도록개발된신속진단법 (ICT Malaria P.f/P.v) 은기존의 HRP II 항원과 pan-malaria 항원을혼합하여사용하는것이나삼일열말라리아진단시민감도는좋으나특이도가떨어지는단점이있으며정량적분석을할수없고 [36] 말라리아가유행하는후진국에서사용하기에는고비용이다 [37]. 말초혈액도말검사와신속진단법외에실험실내에서이루어지고있는보조진단방법으로간접면역형광항체법, 효소면역법, 중합효소연쇄반응, 그리고 DNA나 RNA를이용한교잡반응방법등 [38-41] 이사용되고있다. 혈청을이용한효소면역법은많은시료를동시에검사할수있다는장점이있어여러감염질환의진단에이용되고있다. 효소면역법에서항원의이용및백신의개발을위한합성및재조합단백항원에대한연구가보고되고있는데, 그중 sporozoite를둘러싸고있는단백인 CSP는주요후보백신단백의하나로생각되어지는데, 동물및인간을모델로항-CSP 항체에의해특이 T 세포가전이되어말라리아로부터보호되며 [42-44], 이는다량의방사선이조사된 sporozoite에의해 CSP 특이항체및 T 세포가형성되며 [45], 살아있는 sporozoite 투여시이환되지않는다 [46]. 최근재조합및합성 CSP 항원에대해연구되면서반복부위에대한항체개발에관심이모아졌다. 본연구에서재조합 CSP의생성을위해사용한부위도이러한반복부위가포함되도록하였

7 196 서인범 마경란 임채승외 1 인 다. MSP는말라리아가증식하면서인접적혈구를침입할때관여하는것으로알려져있으며, 특히두개의상피성장인자양부위 (epidermal growth factor-like regions) 가포함되어있는 MSP 의 C 말단부위는강한면역력을갖는것으로알려져있다 [47]. DBP는적혈구에침입시필수적인역할을하는말라리아생성부착물질 (parasite-produced adhesion molecule)[48-50] 로서 Plasmodium knowlesi DBP 또는 EBA-175와같은단백질을포함하고있으며 [51] 말라리아에감염된적혈구의세포부착에도관련이있고, 기능적으로보존된 cysteine 및 histidine이풍부한영역을포함하고있어, 효과적인면역반응의표적으로보고 [52] 되고있다. 이를토대로본연구에서는재조합 CSP, MSP, DBP 를생성하기위하여항원결정기를갖도록시발체 (Table 2) 를선정하였는데, CSP는 tandem repeat region (Genbank Accession No. M11926), MSP는 glutamine 반복부위 (Genbank Accession No. M60807, 631-2,409 bp), DBP는 histidine이풍부한부위 (Genbank Accession No. M61095, 890-2,557 bp) 가포함되도록하였으며, 각단백항원의항체반응을검사하여, 그유용성을확인하였다. 본연구에서제작한재조합항원을혼합하여통합항원에대한항체검사를시행한결과민감도및특이도는각각 97.8% 및 94.7% 로우수한결과를보여한국에서삼일열말라리아에대한선별검사에유용하다고판단되었다. 본연구에서의각각의재조합항원을이용한항체양성률을각지역별로검사하였는데, 본검사결과에서나타난 P. vivax IgG 항체양성반응의가능성은크게세가지로생각할수있다. 첫번째, 항체양성자가과거에말라리아에노출되어이때만들어진항체가현재까지존재할가능성, 두번째말라리아의잠복기가지속되어항체는생성이되었으나증세가없고혈중으로말라리아가출현되지않은경우, 세번째로혈중에존재하는어떤항체가사용되는항원과항원결정기를공유하여교차반응을일으킬가능성이다. 첫번째의경우는환자의병력을통하여확인이가능하였지만, 두번째와세번째의경우는현재의검사법으로는확인이불가능하였는데이는각양성으로나온환자에대한추적조사가필요할것으로생각된다. 위양성의가능성으로 Grobusch 등 [37] 은말라리아 HRP-II를이용한초기진단방법에서류마티스인자를갖는환자에서위양성을규명한바있다. 말라리아환자에서임상적인잠복기는간세포내에서원충이증가되어혈액에방출되기까지의기간에해당하며, 잠복기가 10일에서 16일인즉시형과수개월에서 1년후에증상이나타나는지연형의두가지형태가있는것으로알려져있다. 이는 P. vivax나 P. ovale 의경우간세포내에서휴면기 (hypnozoite) 의시기를거칠수있어수개월후에발병할수있기때문이다 [30]. 위양성반응에대한정확한분석을하기위해서는위양성자로판명된환자에대하여병력조사와함께교차반응에대한면밀한조사가이루어져야할것으로판단된다. 현실적으로위양성에대한확인검사는할수없었지만양성대조군과음성대조군을대상으로평가한본재조합항원의높은민감도와특이도를고려해볼때, 각지역별거 주자에대한항체양성률을조사한결과는그의의가있다고생각되며, 지역간의각재조합항원에따른항체양성률의비교는항원에따른유의한차이는보이지않았지만, CSP 항원에서높은양성률을보여국내에서말라리아진단시약의발전및백신개발에중점적으로연구가되어야할것으로판단된다. 본말라리아항체검사법은삼일열말라리아에대한보조진단법으로사용하기에유용한검사로생각되고특히자동화와대량검체처리가가능한장점이있어수혈용혈액등대량선별검사에유용하리라생각된다. 보다구체적인유용성평가를위해서는치료후양성반응의기간, 감염강도에따른반응의정도, 삼일열말라리아이외에인체에감염될수있는다른종간의교차반응등에대한연구가필요하다고판단된다. 요약배경 : Plasmodium vivax의표적항원인 circumsporozoite 단백 (CSP), merozoite 표면단백 (MSP) 및 Duffy 혈액형부착단백 (DBP) 항원이 P. vivax에대한면역기능과관련성이밝혀지면서표적항원이말라리아의진단및백신개발에중요역할을할것으로기대된다. 본연구는 P. vivax의유전자재조합 CSP, MSP, DBP 항원을제작하여, 이들재조합항원을이용하여말라리아항체진단에서유용성을알아보고자하였으며, 국내의말라리아위험지역및일반지역에서의항체반응양상을측정하여국내말라리아예방의기초가되는역학자료를제공하고자하였다. 방법 : P. vivax의각 CSP, MSP, DBP 항원을제작하기위해고대안산병원에서 P. vivax로진단받은환자의전혈을이용하여각항원포함부위를증폭하여확인한후, 결찰, 클로닝, 단백질발현및정제과정을거친후, 각발현된재조합항원을이용하여말라리아양성, 음성대조군에서항체를측정하여각재조합항원의유용성을평가하였다. 국내 5개지역총 1,014 명의건강검진환자를대상으로, 1) 각각의재조합항원을통합 (CSP, MSP, DBP) 하여이에대한항체반응 (polyclonal, monoclonal IgG 및 IgM) 과 2) 재조합항원각각에대한 IgG 항체반응을측정하였다. 결과 : 1. 각재조합 P. vivax의 CSP, MSP, DBP 항원및통합항원에대한 IgG 항체검사의민감도는각각 75.6%, 62.2%, 68.9% 및 97.8% 였고, 특이도는각각 92.1%, 84.2%, 81.6% 및 97.8% 였다. 2. 국내 5개지역, 총 1,014명을대상으로 P. vivax의재조합 CSP, MSP 및 DBP 통합항원에대한항체반응검사를한결과, 말라리아고위험지역인철원지역이높은항체양성률을보였다. 3. P. vivax의재조합 CSP, MSP 및 DBP 항원에대한 IgG 항체반응을측정한결과, 양성률은 CSP 항원 (2.0%) 에대해서가장높았으며, 항원에따른지역별차이는보이지않았다. 결론 : 본연구에서재조합한 P. vivax의 CSP, MSP, DBP 항원은말라리아의진단에유용할것으로생각되며, 국내 5개지

8 P. vivax 의재조합 CSP, MSP 및 DBP 를이용한항체반응 197 역에서의항체반응양상을분석하여국내말라리아예방에도움이되는역학자료를마련하였다. 참고문헌 1. Kwiatkowski D and Marsh K. Development of a malaria vaccine. Lancet 1997; 350: 채인호, 임건일, 윤성노, 오원일, 김선주, 채종일. 외국경력이없는남자환자에서발병한삼일열말라리아1 예. 기생충 1994; 32: 고원규. 말라리아- 국내발생을중심으로. 대한의사협회지 2000; 43: Lim CS, Kim YK, Lee KN, Kim SH, Hoffman KJ, Song KJ, et al. The analysis of circumsporozoite-protein gene sequences from South Korean isolates of Plasmodium vivax. Ann Trop Med Parasitol 2001; 95: Gonzalez JM, Hurtado S, Arevalo-Herrera M, Herrera S. Variants of the Plasmodium vivax circumsporozoite protein (VK210 and VK247) in Colombian isolates. Mem Inst Oswaldo Cruz 2001; 96: Thomas BE, Sridevi K, Chopra N, Haq W, Rao DN. Inducing a cellmediated immune response against peptides of the Plasmodium vivax circumsporozoite protein. Ann Trop Med Parasitol 2001; 95: Thomas BE, Manocha M, Haq W, Adak T, Pillai CR, Rao DN. Modulation of the humoral response to repeat and non-repeat sequences of the circumsporozoite protein of Plasmodium vivax using novel adjuvant and delivery systems. Ann Trop Med Parasitol 2001; 95: van Bemmelen MX, Beghdadi-Rais C, Desponds C, Vargas E, Herrera S, Reymond CD, et al. Expression and one-step purification of Plasmodium proteins in dictyostelium. Mol Biochem Parasitol 2000; 111: Arevalo-Herrera M, Roggero MA, Gonzalez JM, Vergara J, Corradin G, Lopez JA, et al. Mapping and comparison of the B-cell epitopes recognized on the Plasmodium vivax circumsporozoite protein by immune Colombians and immunized Aotus monkeys. Ann Trop Med Parasitol 1998; 92: Udhayakumar V, Saekhou A, Fang S, Jue D, Wohlhueter RM, Lal AA. Immunogenicity of Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax circumsporozoite protein repeat multiple antigen constructs (MAC). Vaccine 1998; 16: Bilsborough J, Baumgart K, Bathurst I, Barr P, Good MF. Fine epitope specificity of antibodies to region II of the Plasmodium vivax circumsporozoite protein correlates with ability to bind recombinant protein and sporozoites. Acta Trop 1997; 65: David PH, del Portillo HA, Mendis KN. Plasmodium vivax malaria: parasite biology defines potential targets for vaccine development. Biol Cell 1988; 64: Escalante AA, Barrio E, Ayala FJ. Evolutionary origin of human and primate malarias: evidence from the circumsporozoite protein gene. Mol Biol Evol 1995; 12: Dutta S, Ware LA, Barbosa A, Ockenhouse CF, Lanar DE. Purification, characterization, and immunogenicity of a disulfide crosslinked Plasmodium vivax vaccine candidate antigen, merozoite surface protein 1, expressed in Escherichia coli. Infect Immun 2001; 69: Lim CS, Kim SH, Kwon SI, Song JW, Song KJ, Lee KN. Analysis of Plasmodium vivax merozoite surface protein-1 gene sequences from resurgent Korean isolates. Am J Trop Med Hyg 2000; 62: Figtree M, Pasay CJ, Slade R, Cheng Q, Cloonan N, Walker J, et al. Plasmodium vivax synonymous substitution frequencies, evolution and population structure deduced from diversity in AMA 1 and MSP 1 genes. Mol Biochem Parasitol 2000; 108: Collins WE, Kaslow DC, Sullivan JS, Morris CL, Galland GG, Yang C, et al. Testing the efficacy of a recombinant merozoite surface protein (MSP-1) of Plasmodium vivax in Saimiri boliviensis monkeys. Am J Trop Med Hyg 1999; 60: Galinski MR, Corredor-Medina C, Povoa M, Crosby J, Ingravallo P, Barnwell JW. Plasmodium vivax merozoite surface protein-3 contains coiled-coil motifs in an alanine-rich central domain. Mol Biochem Parasitol 1999; 101: Barnwell JW, Galinski MR, DeSimone SG, Perler F, Ingravallo P. Plasmodium vivax, P. cynomolgi, and P. knowlesi: identification of homologue proteins associated with the surface of merozoites. Exp Parasitol 1999; 91: Putaporntip C, Jongwutiwes S, Tanabe K, Thaithong S. Interallelic recombination in the merozoite surface protein 1 (MSP-1) gene of Plasmodium vivax from Thai isolates. Mol Biochem Parasitol 1997; 84: Yang C, Collins WE, Xiao L, Patterson PS, Reed RC, Hunter RL, et al. Influence of adjuvants on murine immune responses against the C-terminal 19 kda fragment of Plasmodium vivax merozoite surface protein-1 (MSP-1). Parasite Immunol 1996; 18: Kolakovich KA, Ssengoba A, Wojcik K, Tsuboi T, al-yaman F, Alpers M, et al. Plasmodium vivax: favored gene frequencies of the merozoite surface protein-1 and the multiplicity of infection in a malaria endemic region. Exp Parasitol 1996; 83: Mancilla LI, Levitus G, Kirchgatter K, Mertens F, Herrera S, del Portillo HA. Plasmodium vivax: dimorphic DNA sequences from the MSP-1 gene code for regions that are immunogenic in natural infections. Exp Parasitol 1994; 79: Michon P, Woolley I, Wood EM, Kastens W, Zimmerman PA, Adams

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