(72) 발명자 김종훈 서울특별시동대문구전농 3 동 67-3 이승구 서울특별시노원구중계 4 동주공 2 단지아파트 206 동 211 호 - 2 -

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지우 강
5 years ago
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2013년09월03일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12Q 1/68 ( ) G01N 27/26 ( ) C12N 15/115 ( ) B82Y 15/00 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2012 년 02 월 24 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 5 항 2012 년 02 월 24 일 (71) 출원인 고려대학교산학협력단 서울성북구안암동 5 가 1 (72) 발명자 송민정 서울특별시영등포구대림 2 동 호 19 통 1 반 임대순 서울특별시강남구개포동 140 주공아파트 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 특허법인충현 (54) 발명의명칭페로센 - 표지된압타머를이용한전기화학적센서및그제조방법 (57) 요약 본발명은금 (Au) 나노입자들이증착된다이아몬드박막전극을기반으로하여페로센 - 표지된압타머를이용하여 ph 를측정하는전기화학적센서에관한것으로서, 종래평면형금 (Au) 전극보다더넓은범위에서더높은감도로 ph 를측정할수있다. 대표도 - 도 2-1 -

2 (72) 발명자 김종훈 서울특별시동대문구전농 3 동 67-3 이승구 서울특별시노원구중계 4 동주공 2 단지아파트 206 동 211 호 - 2 -

3 특허청구의범위청구항 1 금 (Au) 나노입자들이증착된다이아몬드박막전극을기반으로하는전기화학적 ph 센서로서, 상기금 (Au) 나노입자는페로센으로표지된압타머 (aptamer) 와공유결합된것을특징으로하는전기화학적 ph 센서. 청구항 2 제1항에있어서, 상기압타머는 ss-dna(single-stranded DNA) 인것을특징으로하는전기화학적 ph 센서. 청구항 3 제2항에있어서, 상기페로센으로표지된 ss-dna는말단기가싸이올로치환되어금 (Au) 나노입자와공유결합된것을특징으로하는전기화학적 ph 센서. 청구항 4 1) 보론도핑된다이아몬드전극상에금나노입자들을증착하는단계 ; 및 2) 상기금나노입자와페로센으로표지된 ss-dna를결합시키는단계 : 를포함하는전기화학적 ph 센서의제조방법. 청구항 5 제4항에있어서, 상기금나노입자와페로센으로표지된 ss-dna의결합은상기 ss-dna의말단기를싸이올기로치환하여 Au-S 공유결합을통해이루어지는것을특징으로하는전기화학적 ph 센서의제조방법. 명세서 [0001] 기술분야본발명은전기화학적 ph 센서및그제조방법에관한것으로서, 보다구체적으로는페로센 (ferrocene)-표지된압타머 (aptamer) 를이용하여전기화학적방법으로양성자를검출함으로써 ph를측정하는센서및그제조방법에관한것이다. [0002] 배경기술다이아몬드는생체적합성뿐만아니라, 화학안정성, 열전도성, 견고성, 광학적특성이우수하다. 그러나다이아몬드자체는전기적전류전도성이없는절연체이며, 보론으로도핑을하면반도체의특성을나타낸다. 다이아몬드전극기판은높은시그널-노이즈비와장기안정성, 높은감도, 우수한재현성등으로인해, 기존의금이나백금등의전극을사용하였을때보다더낮은농도까지검출이가능하다. 그러나, 다이아몬드박막에바이오물질을고정하기위해서는아미노기 (-NH 2 ) 나카르복실기 (-COOH) 를형성하는과정이필요한데, 이와같이표 면에작용기를형성하는공정은매우복잡하고제한적이다. [0003] 페로센 (Fc) 는산화환원반응성분자로서, 중심고리원자를중심으로반대쪽에두개의싸이클로펜타디에닐고리가결합된샌드위치화합물이다. ( 도 1(c)) 이화합물은화학적으로안정하고, 쉽게작용기화될수있으며, 전기화학적으로가역적이다. Fc-dT는산화환원반응성페로센 (Fc) 기로변형된염기성뉴클레오티드로서, 도 1(d) 에보여지는바와같이올리고뉴클레오티드내부로혼입되어핵산분석을위한전기화학적프로브로사용되고있다

4 [0004] [0005] 또한압타머는표적분자에특이적으로결합하는올리고핵산또는펩티드분자로서, 통상 RNA, 한가닥 DNA(ss- DNA), 또는합성뉴클레오티드와이들의결합체등을들수있다. [James W (2000) aptamers. In: Meyers RA (ed) Encyclopedia of Analytical Chemistry, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, pp 4848] 이중에서 DNA 압타머는한가닥사슬로된올리고뉴클레오티드를포함한다. DNA에서발견되는 4개의염기는아데닌 (A), 사이토신 (C), 구아닌 (G) 및티민 (T) 이다. 도 1(a) 에보여지는것처럼, 사이토신은산성조건에서프로토네이티드된사이토신 (C + ) 과 3중수소결합을통하여 C-C + 염기쌍 (base pair) 을형성하고, 이에따라 ss-dna는 2개의평행한듀플렉스를형성하면서 i-motif라는 4중구조를갖게된다. 많은연구자들이 Fc-표지된올리고뉴클레오티드를이용하여전기화학적 DNA 센서를개발해왔다. 타겟물질은이들센서에있는표면제한적이고산화환원종으로표지된압타머와특이적으로결합하여압타머프로브의배향에변화를일으킨다. 이러한배향의변화는표지된산화환원종과전극사이의거리를변화시키고, 이에따라효과적인전자전달을용이하게하고, 전기화학적시그널을증대시킨다. [Lu Y, Li X, Zhang L, Yu P, Su L, Mao L (2008) aptamer-based electrochemical sensors with aptamer-complementary DNA oligonucleotides as probe. Anal Chem 80:1883] 발명의내용 [0006] 해결하려는과제 본발명의목적은다이아몬드박막전극을기반으로페로센 - 표지된압타머를이용하여 ph 를측정하는전기화학 적센서및그제조방법을제공하는것이다. [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] 과제의해결수단상기기술적과제를해결하기위하여, 본발명은금 (Au) 나노입자들이증착된다이아몬드박막전극을기반으로하는전기화학적 ph 센서로서, 상기금 (Au) 나노입자는페로센으로표지된압타머 (aptamer) 와공유결합된것을특징으로하는전기화학적 ph 센서를제공한다. 본발명의일실시예에따르면, 상기압타머는페로센으로표지된 ss-dna(single-stranded DNA) 인것이바람직하다. 이때, 페로센으로표지된 ss-dna는말단기가싸이올로치환되어금 (Au) 나노입자와공유결합된것이특징이다. 본발명의일실시예에따른전기화학적 ph 센서의 ph 감지범위는 ph 4.8 내지 8.3이며, 감도는약 μa /ph 이다. 또한본발명은 1) 보론도핑된다이아몬드전극상에금나노입자들을증착하는단계 ; 및 2) 상기금나노입자와페로센으로표지된 ss-dna를결합시키는단계 : 를포함하는전기화학적 ph 센서의제조방법을제공한다. 본발명의일실시예에의하면, 금나노입자와페로센으로표지된 ss-dna의결합은상기 ss-dna의말단기를싸이올기로치환하여 Au-S 공유결합을형성함으로써이루어질수있다. [0012] 발명의효과본발명에서사용된금나노입자는다이아몬드박막표면처리의어려움을해소하고, 전극면적을개선하는효과뿐만아니라, 화학반응에의해생성된전자전달의매개체역할을통해전기화학센서의성능을개선시켰다. 본발명에따른센서는 ph 4.8 ~ 8.3의선형범위와약 ma/ph의감도를나타내었으며, 이러한결과는종래평면금 (Au) 박막전극을이용하여개발한 ph 센서 ( 약 0.07 ma /ph의감도, ph 5.6 ~ 7.1의선형범위 ) 에비하여약 2.8배감도가향상된것이고, 선형범위도더넓어진것으로서본발명에따른 ph 센서가매우우수한성능을나타냄을확인할수있다. 도면의간단한설명 - 4 -

5 [0013] 도 1 은 (a) 사이토신과헤미프로토네이티드 (hemiprotonated) C-C+ 염기쌍의구조, (b) i-motif 구조, (c) 페로 센및 (d) Fc-dT 의모식도이다. 도 2는본발명의실시예에따른 Fc-표지된압타머를가진전기화학적센서의개요도와다른 ph에서측정된 SWV(strategy and square-wave voltammograms) 그래프이다. 도 3은 BDD 전극상에서다음과같은여러가지전압하에측정된금 (Au)-나노입자전극 SEM 이미지이다 : (a) -0.1 V, (b) -0.2 V, (c) -0.3 V, (d) -0.4 V, (e) -0.5 V and (f) -0.6 V. ( 스캐일바 : 2 μm ) 도 4는 Au-NP/BDD 전극과평면 Au 전극에서의양성자검출을위한 SWV 피크전류의교정곡선이다. [0014] [0015] 발명을실시하기위한구체적인내용이하본발명을보다구체적으로설명한다. 본발명은다이아몬드박막전극을기반으로페로센-표지된압타머를이용하여 ph를측정하는전기화학적센서에관한것이다. 본발명에서는압타머로사이토신 (cytosine) 이풍부한한가닥사슬 DNA(single-stranded DNA; ss-dna) 를사용하여샘플의 ph값에따라시그널변화를측정하였다. 일반적으로사이토신 (C) 은산성조건 에서프로토네이티드사이토신 (C + ) 과 3 중수소결합을통하여 C-C + 염기쌍 (base pair) 을형성하면서 ss-dna 는 i- motif 라는 4 중구조를갖게된다.( 도 1) 페로센은좋은산화화학종으로서, 이런구조에서압타머에표지된페로 센과전극간의거리가가까워지면효과적인전자전달이이루어지게된다. [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] 도 2는전기화학적 ph 센서의원리를보여준다. Fc-표지된 ss-dna의구조는 ph 값에따라변한다. 일반적으로사이토신은 3중수소결합을통해양성자화된사이토신과결합한다. 염기성 ph에서, DNA는 DNA의사이토신잔기가양성자화되지않기때문에스트레치된 (stretched) 랜덤구조를갖는다. 이구조에서는 Fc 부분과전극표면사이의거리가멀기때문에효과적인전자이동이어렵다. 그러나낮은 ph에서는 Fc 부분과전극표면쪽으로더가까이오기때문에, 사이토신이기는부분적으로양성자화되고, DNA는촘촘하게접힌형태가된다. 따라서낮은 ph에서전자이동이효과적으로이루어지고, 피크곡선의증가한다. 이러한원리에기초하여, SWV에서피크전류를측정함으로써 ph값을결정할수있다. 본발명에따른금 (Au) 나노입자들이증착된다이아몬드박막전극을기반으로하는전기화학적 ph 센서에서금 (Au) 나노입자는페로센으로표지된압타머 (aptamer) 와공유결합된것이특징이다. 예를들어, 압타머는페로센으로표지된 ss-dna(single-stranded DNA) 인것일수있으며, 이때, 페로센으로표지된 ss-dna는말단기가싸이올로치환되어금 (Au) 나노입자와공유결합을이루도록구성한다. 본발명의일실시예에따른전기화학적 ph 센서의 ph 감지범위는 ph 4.8 내지 8.3이며, 감도는약 μa /ph 로서매우우수하다. 또한본발명은 1) 보론도핑된다이아몬드전극상에금나노입자들을증착하는단계 ; 및 2) 상기금나노입자와페로센으로표지된 ss-dna를결합시키는단계 : 를포함하는전기화학적 ph 센서의제조방법을제공한다. 본발명의일실시예에의하면, 금나노입자와페로센으로표지된 ss-dna의결합은상기 ss-dna의말단기를싸이올기로치환하여 Au-S 공유결합을형성함으로써이루어질수있다. [0022] 이하실시예를통해본발명을보다구체적으로상세히설명한다. 그러나이는본발명의이해를돕기위한예 시적인목적으로기술된것으로서, 본발명의범위가이에한정되는것은아니다. [0023] [0024] [0025] 실시예 : 전기화학적 ph 센서의제조 BDD 박막전극을제조하기위하여, 핫필라멘트화학기상증착 (HFCVD) 시스템을사용했다. 열적으로산화된실리콘 (Si) 와이퍼는정전기적자기정렬법에의해다이아몬드나노결정씨드로밀도있게코팅하였다. 그다음이다이아몬드씨드로코팅된기판상에도핑된다이아몬드필름을성장시켰다. Au-NPs/BDD 을제조하기위해, 2.0 mm HAuCl 4 와 0.5 M H 2 SO 4 를포함하는혼합액중에서 600초동안 -0.5 V의 일정한전압하에금나노입자를 BDD 전극상에전기화학적으로증착시켰다. Fc-ss-DNA 는 Au-NPs/BDD 전극상에 - 5 -

이때, 금박막층과실리콘기판사이의접착력을향상시키기위해, 금 (Au) 박막 ( 박막두께 : 2000 A) 을증착하기전에, 200 A 티타늄 (Ti) 층을실리콘기판상에하부층으로증착했다. [0028] [0029] 실험예 : ph 측정결과 도 3 는여러가지다른전압에서 BDD 전극상에위치한금 (Au)- 나노입자전극의 SEM 이미지를보여준다.

6 Au-S 상호작용에의해고정되었다. 이전극을실온에서 12 시간동안 10 μg/ml ss-dna 를포함하는 0.01M PBS (ph 7.4) 중에담갔다가, PBS 로헹구었다. 본발명에사용된페로센 - 표지된 ss-dna 는 Bioneer Co. 에서합성하였 으며, 이 DNA 의서열은다음과같았다 : [0026] (5 ) (Fc-dT)TTAATCCCAATCCCAATCCCAATCCC(Thiol) (3 ). [0027] 한편본발명에따른페로센 - 표지된압타머를이용한전기화학적 ph 센서와성능을비교하기위해, RF 스퍼터링 에의해금전극을제조했다. 이때, 금박막층과실리콘기판사이의접착력을향상시키기위해, 금 (Au) 박막 ( 박막두께 : 2000 A) 을증착하기전에, 200 A 티타늄 (Ti) 층을실리콘기판상에하부층으로증착했다. [0028] [0029] 실험예 : ph 측정결과 도 3 는여러가지다른전압에서 BDD 전극상에위치한금 (Au)- 나노입자전극의 SEM 이미지를보여준다. 금 (Au) 나노클러스터는 600 초동안 2 mm HAuCl 4 과 0.5 M H 2 SO 4 용액을이용하여전기화학적으로증착되었다 V 까지 네거티브전압이가해졌을때, 금 (Au)-나노입자는더밀도가높아졌다. ( 도 3(a-e)) 그러나 -0.6 V 보다더큰전압이가해졌을때는금 (Au)-나노입자의밀도가감소했다. ( 도 3(f)). 이러한결과로부터, -0.5 V 가적절한전압으로선택되었다. ( 도 3(e)) 이전압에서금나노클러스트는전극표면상에평균직경 80 nm로균일하게분포되었다. [0030] 도 4 는 Au-NPs/BDD 전극과평면형 Au 전극에대한피크전류 (i p ) 대 ph 의교정곡선을나타낸다. Au-NPs/BDD 전 극은 ph 4.8 ~ 8.3 범위에서선형적관계를나타내며, 관계식은이다. 8.3 이상의 ph에서, 피크전류는더작은값으로거의유지되었다. 이것은 Fc-표지된 DNA가스트레치된구조를갖기때문에효과적인전자전달이어렵다는것을의미한다. 반면낮은 ph에서접힌 DNA 구조가형성되기때문에, 페로센부분이전극표면에더가까워지고, 이에따라낮은 ph에서피크전류가더증가한다. [0031] 최대전류는 ph 4.8 에서관찰되었다. 피크전류의접힌 DNA 의형성은 ph 가이값이하로감소되어도거의변화 가없었다. 평면형 Au 전극에대해, i p 와 ph 의관계는 ph 5.3 ~ 7.0 범위에서선형적이다. ( ). 이결과는종래보고된감도가 0.07 μa /ph이고, ph 5.6 ~ 7.1 범위에서전기화학적반응을보여주었던 i-dna 기반의전기화학적양성자센서의경우 [Xu X, Li B, Xie X, Li X, Shen L, Shao Y (2010) An i-dna based electrochemical sensor for proton detection. Talanta 82:1122] 와선형범위가유사하면서도감도는현저하게높다. [0032] 상기검출결과로부터, 낮은전자전달저항, 넓은전위윈도우, 넓은표면적및효과적인전자전달등의 BDD 전극과 Au-NPs 의시너지효과로인해본발명에따른전기화학센서가평면형 Au 보다더넓은범위에서더높은 감도를나타낸다는것을확인할수있다

7 도면 도면 1 도면 2-7 -

8 도면 3 도면 4 서열목록 <110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Elctrochemical ph sensor using ferrocene-tagged aptamer and - 8 -

9 fabrication method thereof <130> HPC-3080 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> single strand DNA <400> 1 ttaatcccaa tcccaatccc aatccc

(72) 발명자 김종훈 경기수원시영통구봉영로 1517 번길 76, 633 동 1906 호 ( 영통동, 동보신명아파트 ) 이승구 서울노원구한글비석로 14 길 8, 206 동 211 호 ( 중계동, 주공 2 단지아파트 ) - 2 -

(72) 발명자 김종훈 경기수원시영통구봉영로 1517 번길 76, 633 동 1906 호 ( 영통동, 동보신명아파트 ) 이승구 서울노원구한글비석로 14 길 8, 206 동 211 호 ( 중계동, 주공 2 단지아파트 ) - 2 - (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) G01N 27/30 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01) (21) 출원번호 10-2012-0006761 (22) 출원일자 2012 년 01 월 20 일 심사청구일자 2012 년 01 월 20 일 (65) 공개번호 10-2013-0085737