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민영 공
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1 Korean Journal of Obstetrics and Gynecology Vol. 53 No. 1 January 2010 SiHa 자궁경부암세포주에서인유두종바이러스 16 형 E6/E7 sirna 에의한세포성장억제비교 가톨릭대학교의과대학산부인과학교실 1, 가톨릭의과학연구원 2 박세현 1 박병준 1 김용욱 1 노덕영 1 김태응 1 정재근 1 배수미 2 안웅식 1 Comparison of cell growth suppression in SiHa cervical carcinoma cell line by human papillomavirus type 16 E6/E7 sirnas Sae-Hyun Park, M.D. 1, Byung-Joon Park, M.D. 1, Yong-Wook Kim, M.D. 1, Duck-Yeong Ro, M.D. 1, Tae-Eung Kim, M.D. 1, Jae-Keun Jung, M.D. 1, Su-Mi Bae, Ph.D. 2, Woong-Shick Ahn, M.D., Ph.D. 1 Departments of 1 Obstetrics and Gynecology, 2 Catholic Research Institutes of Medical Science, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea Objective: Human cervical cancer is caused by the high-risk types of human papillomavirus (HPV) such as HPV16, which possess the E6 and E7 oncogenes, whose expressions are a prerequisite for cancer development. We performed this study to compare the efficacy of antitumor activity by HPV sirna which silences only E6 or both E6/E7. Methods: We transfected sirna 377 (HPV16 E6 sirna), sirna 3 (HPV16 E6 sirna), and sirna 198 (HPV16 E7 sirna) into SiHa cell line (sirna 377 silences only E6, and sirna 3 and sirna 198 silence both E6 and E7). We experimented cell counts and morphologic changes 24 and 48 hours after transfection and expressions of HPV16 E6/E7 mrna by RT-PCR. Results: sirna 377, sirna 3, and sirna 198 suppressed the cell growth. sirna 3 and sirna 198 were more potent than sirna 377 in cell growth suppression. sirna 377 knocked down the expression of E6 mrna, and both sirna 3 and sirna 198 knocked down the expression of E6/E7 mrna. Conclusion: Our results suggest that simultaneous suppression of E6 and E7 was more potent than E6-specific suppression in cancer cell growth. Key Words: Cervical cancer, Human papillomavirus, E6, E7, sirna 서 론 접수일 : 채택일 : 교신저자 : 안웅식 ahnlab1@catholic.ac.kr * 본과제는학술진흥재단협동연구지원사업 (E00071) 에의해지원되었습니다. 인유두종바이러스 (Human papillomavirus, HPV) 는자궁경부암을포함한다양한종류의암의발달과관련이있으며, 1 16 및 18 아형을포함하는고위험군 HPV 는자궁경부암환자의약 90% 이상에서발견된다고알려져있다. 2,3 HPV 의 E6와 E7 발암유전자는자궁경부암의발암

2 대한산부회지제 53 권제 1 호, 2010 및표현형유지에주요한역할을한다. 4 E6 단백질은종양억제단백질인 p53 의발현을불활성화시키고, E7 단백질은세포주기조절단백질인 prb (retinoblastoma protein) 를인산화시켜전사인자인 E2F 를방출시켜 cyclin E 등의단백질발현을유도한다. 5-8 따라서 HPV 의발암유전자인 E6와 E7의발현을억제하고자하는연구가지속적으로이루어지고있다. 식물과동물의전사후유전자억제기전의하나로 RNA 간섭작용 (RNA interference, RNAi) 이밝혀진이래로 21~22 개의 nucleotide 로이루어진 sirna (small interfering RNA) 를이용하여염기서열특이적인방법으로 mrna 를붕괴시키는연구가많이진행되고있다. 특히 sirna 가포유류의세포에서 RNA 간섭작용을보인다는것이밝혀진이래유전자의기능을밝혀내거나치료를위해서수많은연구가진행되어왔다. 9,10 Jiang 과 Milner 는 HPV16 양성인세포주에서 E6와 E7의 sirna 의투여가각각의유전자발현을저해했다고보고하였다. 11 그이후많은 sirna를이용한 HPV 연구가있어왔는데최근 Yamato 등은 HPV18 양성인세포주에서 E6만을특이적으로억제한것이 E6와 E7을동시에억제하는것보다더강력한항암효과를유도하였다고보고하였다. 12 그러나 HPV16 에대하여서는 E6 유전자만을억제하는것과 E6와 E7 유전자를동시에억제하는것에대한비교연구는아직없다. 이에본연구는이미다른연구자 의실험에서 HPV16 E6와 E7 유전자에대한 RNA 간섭작용이입증된 sirna 만을이용하여 E6 유전자만을억제하는것과 E6와 E7 유전자를동시에억제하는것을같은조건에서비교함으로써보다효율적인방법을알아보고자하였다. 연구대상및방법 1. 세포주및세포배양본연구에사용한자궁경부암세포주는야생형 p53 유전자를가지고있으며, HPV16 양성인 SiHa 세포주를서울대학교세포주은행에서분양받아사용하였다. 세포주의세포배양액은 Dulbecco's modified eagles medium (DMEM) (Gibco, Rockville, MD, USA) 에 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco), 0.37% sodium bicarbonate (Sigma, Spruce St. Louis, USA), 20 mm의 HEPES, 그리고 streptomycin/penicillin (Gibco) 을첨가하여사용하였다. 세포주는 37, CO 2 배양기에서배양하였다. 2. sirna 제작본연구에사용한 21 nt의 sirna 는다른연구자들의연구 에서효과가증명된 3종류 - sirna 377 (HPV16 E6 sirna), sirna 3 (HPV16 E6 sirna), sirna 198 (HPV16 E7 sirna)- 이며, sirna oligomer 는화학적합성을주문의뢰하였다 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) (Table 1). 3. 세포주에 sirna 이입 (Transfection) sirna 이입하루전에 SiHa 세포주를 cells/3 ml 로 6 well plate 에분주하였다. 이입하기전에 sirna duplex-lipofectamine complex를다음과같이준비하였다. 120 pmole의 sirna와 lipofectamine 5 μl를각각 250 μl의 Opti-MEM 배지로희석하였고, 희석된각각의 Table 1. Oligomer sequences used for gene silencing Name Position Primer sequence Size (bp) sirna 3 HPV16 E6 nt sense 5'-GAAUGUGUGUACUGCAAGCdTdT-3 21 antisense 5'-GCUUGCAGUACACACAUUCdTdT-3' sirna 198 HPV16 E7 nt sense 5'-GCACACACGUAGACAUUCGdTdT-3' 21 antisense 5'-CGAAUGUCUACGUGUGUGCdTdT-3' sirna 377 HPV16 E6 nt sense 5'-UACAACAAACCGUUGUGUGdTdT-3' 21 antisense 5'-CACACAACGGUUUGUUGUAdTdT-3'

3 박세현외 7 인. 자궁경부암세포주에서 E6 와 E7 sirna 에의한성장억제 용액을섞고 20분동안실온에서반응시켰다. 그후 6 well plate 에 500 μl의 sirna duplex-lipofectamine complex 를 well 당 500 μl씩넣고, 4시간후에배지를교환하였다. 이때사용된 sirna 의최종농도는각 50 nm이었고, 이입후 24, 48시간동안배양시켰다. 4. sirna 이입후세포성장저해확인및세포형태변화관찰세포성장저해정도는이입 24, 48시간후에각 well 을 PBS 완충용액 (Gibco) 으로한번세척한후 0.05% Trypsin- EDTA (Gibco) 로세포를떼어낸후 0.04% Trypan Blue (Sigma) 로염색한후 Hemocytometer (Tiefe Depth. Profondeur, Marienfeld, Germany) 를이용하여세포수를확인하였다. 또한광학현미경을이용하여세포형태학적변화를관찰하였다. 5. sirna 에의한 E6, E7 유전자발현저해효과이입 24, 48시간후에각 well 을 PBS 완충용액으로한번세척한후에 TRI reagent (Invitrogen) 를이용하여 total RNA 를추출하였다. 추출된 RNA 는 Nano-drop 을이용하여정량한후 RNA gel 에전기영동하여 band 를확인하였다. 40 ng total RNA 를 RTase (Invitrogen) 를사용하여 cdna 를합성한후, HPV16 E6, E7 유전자의 primer 를이용하여 PCR을실시하였다. cdna 합성은 37 50분, 70 15분으로수행하였다. PCR 을위한 oligonucleotide primer의염기서열 (5ˊ 3ˊ) 은 Table 2와같이합성하여사용하였다. Primer 합성은주문의뢰 ( 바이오니아, 충북, 한국 ) 를하였다. 6. sirna 에의한 p53 단백질발현에대한효과이입 24, 48시간후에각 well 을 PBS 완충용액으로한번세척한후에 lysis 완충액 (50 mm Tris-Cl, ph 7.4, 150 mm NaCl, 0.5% (v/v) Triton X-100, 0.5% NP-40, 1 mm EDTA ph 8.0, 1 mm EGTA ph 8.0) 을이용하여단백질을추출하였다. 추출된단백질은 Bradford 방법으로정량을실시하였고, 40 μg의단백질을 SDS-PAGE 샘플버퍼 (150 mm Tris (ph 8.0), 100 mm NaCl, 1% (v/v) Triton X-100) 를첨가하여 5분동안끓인후얼음에서식혀준비하였다. SDS-PAGE gel 에서 30 ma/gel 로 3시간동안전기영동하고, Hybond-ECL membrane (Amersham, Uppsala, Sweden) 으로옮겼다 (250 ma, 2시간 30분 ). p53 의단백질에대한항체 (Santa Cruz Biotechnology, California, USA) 를사용하여상온에서 4시간반응시키고, horseradish peroxidase 가결합된 2차항체 (Jackson Immunoresearch, Bar Harbor, MA, USA) 를 1/5,000으로농도로희석하여 1시간동안반응시켰으며, 각단계마다 TBS-T (Tris buffered saline with 0.1% Tween-20) 완충용액으로세번씩의세척과정을반복했다. ECL 형광시약 (Amersham) 으로반응시킨후, 필름 (Kodak) 에약 1분동안노출시킨후현상하였다. 결과 1. sirna 이입후세포성장저해효과각각의 sirna 에의한세포성장저해효과를확인한결과, sirna 3, sirna 198, sirna 377은 sirna 이입 24, 48시간후 universal sirna 를이입시킨대조군에비해각각 6.2%, 41.0%; 29.2%, 35.0%; 30.65, 19.1% 의세포성장저해효과를확인할수있었다 (Fig. 1). 특히이입 48 Table 2. Primer sequences used for RT-PCR Type Primer sequence Length (bp) HPV16 E6 F 5'-GAG AAC TGC AAT GTT TCA GGA C-3' 396, 214 R 5'-CCA CCG ACC CCT TAT ATT ATG G-3' HPV16 E7 F 5'-GCA ACC AGA GAC AAC TGA TCT CTA C-3' 200 R 5'-GGT CTT CCA AAG TAC GAA TGT CTA CG-3'

대한산부회지 제53권 제1호, 2010 Fig. 1. Effects of sirna on growth inhibition in SiHa cervical cancer cell line in vitro. Cells were transfected with universal sirna, sirna 3, sirna 198 and sirna 377 at 50 nm.

RT-PCR analysis for and β-actin mrna. Cells sirna, sirna 377, sirna nm.

Cells were transfected with universal sirna, sirna 377, sirna 3 and sirna 198 at 50 nm. Immunoblot analysis using specific p53 antibody was performed after 24 and 48 hours.

2. sirna-mediated morphological and numerical changes in SiHa cervical cancer cell line in vitro. Cells were transfected with universal sirna, sirna 3, sirna 198 and sirna 377 at 50 nm.

4 대한산부회지 제53권 제1호, 2010 Fig. 1. Effects of sirna on growth inhibition in SiHa cervical cancer cell line in vitro. Cells were transfected with universal sirna, sirna 3, sirna 198 and sirna 377 at 50 nm. Cells were trypsinized for direct cell counting after 24 and 48 hours. Cell growth inhibitions were compared with the universal sirna control by t-test. *P<0.05, **P<0.01. Fig. 3. RT-PCR analysis for and β-actin mrna. Cells sirna, sirna 377, sirna nm. RNA was extracted for expressions of the HPV16 E6, E7 were transfected with universal 3 and sirna 198 at 50 and 100 RT-PCR after 48 hours. Fig. 4. Effects of sirna on p53 expressions in SiHa cell line. Cells were transfected with universal sirna, sirna 377, sirna 3 and sirna 198 at 50 nm. Immunoblot analysis using specific p53 antibody was performed after 24 and 48 hours. The cells were collected and the extracts (40 µg) were run on 10% SDS-PAGE. sirna 198, sirna 377을 이입시킨 세포주에서 세포막의 blebbing 현상 등 세포의 형태학적 변화와 더불어 세포수 가 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 2). 3. HPV16 E6, E7 sirna의 유전자 발현 저해 효과 확인 Fig. 2. sirna-mediated morphological and numerical changes in SiHa cervical cancer cell line in vitro. Cells were transfected with universal sirna, sirna 3, sirna 198 and sirna 377 at 50 nm. Typical photographs were shown after 48 hours ( 400 for all photographs). 각각의 sirna에 의한 E6 또는 E7의 유전자 발현 저해 효과를 확인한 결과, sirna 3, sirna 198, sirna 377은 sirna 이입 48시간 후에 universal sirna를 이입시킨 대 조군에 비해 각각 E6 또는 E7의 발현이 저해되는 것을 확 시간 후 sirna 3과 sirna 198이 sirna 377에 비해 세포 인할 수 있었다 (Fig. 3). E6의 2종류의 밴드는 각각 E6 성장 저해 효과가 뚜렷하게 나타났다. * full transcript와 E6 splicer I (E6 I)을 나타낸다. sirna 의 종류에 따라 각기 유전자 발현 양상이 서로 다름을 확 2. sirna 이입 후 세포형태 변화 관찰 인하였는데, sirna 377은 E6 유전자 발현만을 저해하였 고, sirna 3과 sirna 198은 E6 유전자와 E7 유전자 발현 sirna 3, sirna 198, sirna 377은 sirna 이입 48시 을 동시에 저해하였다. 특히 sirna 3의 경우 이입 후 24 간 후에 광학현미경을 이용하여 세포형태 변화를 관찰하였 시간째부터 E6 full transcript와 E6 splicer I (E6 I)을 동 다. universal sirna를 이입시킨 대조군에 비해 sirna 3, 시에 저해하는 것으로 나타났다. *

5 박세현외 7 인. 자궁경부암세포주에서 E6 와 E7 sirna 에의한성장억제 4. HPV16 E6, E7 sirna 의 p53 단백질발현효과확인각각의 sirna 에의한 p53 의유전자발현효과를확인한결과, sirna 3, sirna 198, sirna 377 모두 sirna 이입후 24시간과 48시간후에 universal sirna 를이입시킨대조군에비해 p53 의발현이증가되는것을확인할수있었다 (Fig. 4). 고찰대부분의자궁경부암이고위험군 HPV 와관련되어있고 16 E6와 E7 발암유전자를발현한다. 많은연구에서이들발암유전자의발현이악성을나타내는데있어필수적이라는것이증명되었다. 4 그러므로 E6와 E7이자궁경부암의유전자치료에있어이상적인목표물로여겨지고있다. 이두가지암단백질은암화과정에서서로다른역할을하는데그들의협력이악성변형에서필수적이다. 4,17 E7은일차적으로변형을일으키고 E6는생체내에서암진행을맡고있다. 18,19 E7은 Rb의 pocket protein' family 를포함하는수많은세포주기조절단백질에직접결합하여비활성화시킨다. 7,8 그것에의해 G1/S 이행과 DNA 합성에요구되어진유전자를 upregulation 한다. E7에의해유도된이상증식과반응하여숙주세포는 c-myc, Bak, p53 같은 proapoptotic 유전자의발현을유도하는데 20 E6가이들단백질과결합하여세포사를막는다. 21,22 이러한악성변형에관련된 E6와 E7 유전자의작용을억제하는것이자궁경부암의치료에있어주요목표가될수있다. 대표적인고위험군인 HPV16 과 HPV18 의 E6와 E7 유전자를억제하기위한여러가지시도들이있어왔다. 최근 sirna 를이용한 RNA 간섭작용이포유류의수많은유전자를억제시키는것이보고되면서 9,10 유전자의기능을연구하기위해 sirna 가이용되어왔다. sirna 를이용한그와같은연구외에도또하나의 sirna 의잠재적인적용분야는유전자치료이다. Antisense oligo-dna 와 ribozyme 이유전자치료를위하여이용되었고이들이발암유전자의발현을억제시켰다고보고되었으나 그효과가살아있는세포에서는대부분제한적이었다. sirna 의이점은 antisense oligo-dna 와 ribozyme 에비하여 높은효율로세포내로들어가고낮은농도에서유전자억제를하는점이다. sirna 의임상적인적용을위해서는첫째로 HPV sirna 의표적서열을정하는것이필요하다. HPV 는인간의유전자와서열의상동성이없기때문에 E6 와 E7 sirna 를만드는것은최소한의 off-target 효과를보일수있다. Jiang 과 Milner 11 가 HPV16 양성인세포주에서 sirna 에의한 E6와 E7의억제를보고한이래로 sirna 에의한 E6와 E7의발현억제가 HPV16 양성인자궁경부암세포의성장을억제하였다는보고들이있어왔다. 13 본연구에서는 HPV16 양성인 SiHa 자궁경부암세포주를사용하였다. SiHa 세포주는염색체내에 single copy 의 HPV 유전자를포함하고야생형 p53 과 Rb뿐만아니라 E6와 E7 단백질을표현한다. 26,27 그러나 SiHa 세포내에서생성되는 E6와 E7에단백질의양이너무적어이에대한직접적인정량을위한유용한항체가없다고알려져있어본연구에서는간접적으로 p53 단백질의발현을보았다. 11 Jiang 과 Milner 11 의연구에서 HPV16 양성인세포주에서 E6 유전자의억제는 p53 단백질의세포내침착을일으켰으며 E7 유전자의억제는세포사를일으켰다. 이에그들은 E7 유전자가치료의표적이된다고제안하였다. 그러나 Butz 등은 HPV16 과 HPV18 양성인세포주들에서 E6 유전자에대한 sirna 적용으로세포사를일으켰다. 15 그들은 E6에대한 sirna 는세포내 E6 유전자의작용을효과적으로억제하는아주좋은방법이며 E6는 HPV 양성인종양및이형증의치료에가장유망한표적이라고결론지었다. Sima 등은 E6와 E7 유전자의발현을억제하는 HPV16 E7 shrna (short hairpin RNA) 를이용하여 HPV16 양성인세포주에서두드러진세포사를유도하여그효과를증명하였다. 28 Yoshinouchi 등 13 과 Tang 등 14 도 sirna 를이용하여 HPV16 E6와 E7 유전자발현의억제에따른효과를증명하였다. 그러나 HPV16 에서 E6와 E7 유전자의동시억제와한유전자만의억제에대한비교연구는아직없다. HPV18 에서의비교연구로는 Yamato 등이 E6만을특이적으로억제한것이 E6와 E7을동시에억제하는것보다더강력한항암효과를유도하였다고보고하였다. 12 우리는다른연구자들의연구에서자궁경부암세포주에 sirna 를이입하였을때성장억제가확인된세종류의 sirna 를같은조건하에서효과를비교하였다. Butz 등

6 대한산부회지제 53 권제 1 호, 2010 의연구에서 HPV16 양성인 SiHa 세포주에서 p53 단백질을증가시키고세포사를유도하였으며 HPV 음성인 MCF-7 유방암세포주및 H1299 폐암세포주에는영향을미치지않았다고밝혀진 sirna 377 (HPV16 E6 sirna) 를 E6 유전자에특이적으로작용하는 sirna 로사용하였다. Yoshinouchi 등 13 의연구에서 SiHa 세포주에서 E6와 E7 mrna 를감소시켰으며 p53 의핵내침착을일으켰다고밝혀진 sirna 3 (HPV16 E6 sirna) 를 E6 sirna 이면서 E6 와 E7 유전자에동시에작용하는 sirna 로사용하였다. Tang 등 14 의연구에서 HPV16 양성인 CaSKi 와 SiHa 세포주에서 E6와 E7 유전자의발현을억제하였다고밝혀진 sirna 198 (HPV16 E7 sirna) 를 E7 sirna 이면서 E6와 E7 유전자에동시에작용하는 sirna 로사용하였다. 우리는 E6 유전자에특이적으로작용하는 sirna 377 과 E6와 E7 유전자에동시에작용하는 sirna 3과 sirna 198 을 SiHa 세포주에이입시켰다. sirna 377, sirna 3, sirna 198 모두세포성장저해효과를보였으며 E6 유전자에특이적으로작용하는 sirna 377 에비해 E6와 E7 유전자에동시에작용하는 sirna 3과 sirna 198 의세포성장억제효과가더크게나타났다 (Fig. 1, 2). 이와같은결과는 Yamato 등 12 이 HPV18 양성인세포주에서 E6만을특이적으로억제하는것이 E6와 E7을동시에억제하는것보다더강력한항암효과를유도하였다고보고한것과는다른양상의결과이다. 본연구는 HPV18 이아닌 HPV16 에대한실험이므로그결과의차이는 HPV 아형간의차이에서기인할수도있으며향후추가적인연구가필요할것이다. 또한각각의 sirna 를이입한후 E6, E7의유전자발현및 p53 단백질발현의변화를비교한결과 E6 만을특이적으로저해하는 sirna 377 의경우 E7 유전자의발현저해는관찰되지않았으며, p53 의발현은가장높게나타났다. E6와 E7을동시에저해하는것으로알려진 sirna 3과 sirna 198 의경우 E6와 E7의유전자발현의저해와동시에 p53 발현의증가를관찰할수있었다 (Fig. 3, 4). 특히 E6 유전자의 full transcript, splicer E6 * I와 E7유전자를완전히억제한 sirna 3의경우, p53 발현이 sirna 377 에비해적음에도불구하고세포성장저해효과가가장큰것으로나타났다 (Fig. 3). 이는자궁경부암세포주의효과적인세포성장저해는 E6 발현저해와 p53 발현증가와 E7의발현저해에의한 prb 의조절에의해이루어짐을추측할수있으며, 향후 sirna 3를이용한 prb 의 phosphorylation 조절에관한연구를진행할예정이다. 또한 E6 유전자는 alternative splicing 이일어나는것으로알려져있으며, E6 * I과 E6 * II의각각의 splicer 의다른기능에대한연구가많이진행되고있다. 특히 Kösel 등의연구결과에의하면정량 PCR 결과 high-grade cervical intraepithelial lesions 에서 E6 * I의발현이증가하는것으로보고되고있다 29. 본연구결과에서는 E6 * I splicer 만관찰할수있었으며, 이입후, 24시간째부터 splicer E6 * I을저해하는 sirna 3의경우세포성장저해효과가가장크게나타났다. 그러나세포성장저해효과와 splicer E6 * I의저해와의연관성을추후연구를지속해야할것으로사료된다. 최근 HPV 백신이개발됨에따라자궁경부암을예방하는데있어서는큰진전을이루었으나아직효과적인치료방법은없는상태이다. sirna 를이용하여 HPV 및자궁경부암을치료하기위한여러연구들이있어왔는데 sirna 의효율적인 HPV 유전자표적설정이필요하다. 본연구에서는다른연구자의실험에서효과가증명된 sirna 만을이용하였는데향후우리스스로찾아내고검증한다른종류의 sirna 를비교하는연구가이번연구를뒷받침할수있을것이다. 본연구에서는 HPV16 의 E6 유전자만을억제하는것보다 E6와 E7 유전자를동시에억제하는것이더큰세포성장억제를보였다. 이러한결과는향후 HPV 양성인자궁경부암연구에있어보다유용한표적을설정하는데도움이될것이다

7 박세현외 7 인. 자궁경부암세포주에서 E6 와 E7 sirna 에의한성장억제 참고문헌 1. zur Hausen H. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nat Rev Cancer 2002; 2: Fen J, Yoshinouchi M, Nakamura K, Kodama J, Nasu Y, Yamato K, et al. Eradication of HPV post-surgical treatments, its correlation with specific types, types of surgery and the physical status. Oncol Rep 2004; 12: Bosch FX, Manos MM, Muñoz N, Sherman M, Jansen AM, Peto J, et al. Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. International biological study on cervical cancer (IBSCC) Study Group. J Natl Cancer Inst 1995; 87: zur Hausen H. Molecular pathogenesis of cancer of the cervix and its causation by specific human papillomavirus types. Curr Top Microbiol Immunol 1994; 186: Huibregtse JM, Scheffner M, Howley PM. Localization of the E6-AP regions that direct human papillomavirus E6 binding, association with p53, and ubiquitination of associated proteins. 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8 대한산부회지제 53 권제 1 호, 2010 = 국문초록 = 목적 : 인유두종바이러스 (Human papillomavirus, HPV) 는자궁경부암과밀접한관계가있는것으로알려져있으며, 특히인유두종바이러스 16형은고위험군바이러스로분류된다. 인유두종바이러스 16형의암유전자 E6와 E7의발현저해에따른자궁경부암세포주내의발암유전자특이적변화를확인하고자하였다. 연구방법 : 인유두종바이러스 16형을발현하는자궁경부암 SiHa 세포주에서 E6 유전자에특이적으로작용하는인유두종바이러스 16형 E6 sirna (sirna 377) 와 E6와 E7 유전자에동시에작용하는인유두종바이러스 16형 E6 sirna (sirna 3) 와인유두종바이러스 16형 E7 sirna (sirna 198) 를사용하였다. 각각의 sirna 를 SiHa 세포주에이입 (transfection) 시킨후, 24시간과 48시간후에세포수및세포형태의변화를관찰하였다. 또한 E6와 E7에대한 RT-PCR을실시하여인유두종바이러스 16형 E6, E7 sirna의유전자발현저해정도를확인하였다. 결과 : 3종류의 sirna 모두세포성장저해효과를나타내었으며, sirna 377에비해 sirna 3와 sirna 198의세포성장억제효과가더크게나타났다. sirna 377은 E6 mrna 만의발현을감소시켰고 sirna 3과 sirna 198은 E6와 E7 mrna 의발현을동시에감소시켰다. 결론 : 인유두종바이러스 16형이감염된자궁경부암 SiHa 세포주에서 E6 유전자만의억제보다는 E6와 E7 유전자를동시에억제하는것이더큰세포성장억제를보였다. 중심단어 : 자궁경부암, 인유두종바이러스, E6, E7, sirna

Can032.hwp

Can032.hwp Chromosomal Alterations in Hepatocellular Carcinoma Cell Lines Detected by Comparative Genomic Hybridization Sang Jin Park 1, Mahn Joon Ha, Ph.D. 1, Hugh Chul Kim, M.D. 2 and Hyon Ju Kim, M.D. 1 1 Laboratory