김혜진외 10 명 : 알파 - 리포산 (Alpha-lipoic Acid) 투여가혈관평활근세포의세포증식억제및세포사멸 (Apoptosis) 에미치는효과 세포의과도한증식이중요한원인으로알려져있다. 이들질환에서는산화스트레스가증가되어있고 4), 이러한스트레스는혈관내피세포손상과면역

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계인 차
5 years ago
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1 당뇨병제 31 권제 3 호, 2007 원저 알파 - 리포산 (Alpha-lipoic Acid) 투여가혈관평활근세포의세포증식억제 및세포사멸 (Apoptosis) 에미치는효과 경북대학교의과대학내과학교실, 경북대학교자연과학대학미생물학과 1, 한양대학교자연과학대학분자생명과학부 2, 계명대학교의과대학내과학교실 3 김혜진 1, 이인규, 김영호 1, 신순영 2, 이영한 2, 김정국, 김보완, 김혜순 3, 김미경 3, 박근규 3, 류성열 3 The Effect of Alpha-lipoic Acid on the Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Rat Vascular Smooth Muscle Cells Hye-Jin Kim 1, In-Kyu Lee, Young-Ho Kim 1, Soon-Young Shin 2, Young-Han Lee 2, Jung-Guk Kim, Bo-Wan Kim, Hye-Soon Kim 3, Mi-Kyoung Kim 3, Keun-Gyu Park 3, Seong-Yeol Ryu 3 Department of Internal Medicine, Kyungpook National University, School of Medicine; Department of Microbiology 1, Kyungpook National University, College of Science and Technology; Division of Molecular and Life Sciences 2, College of Science and Technology, Hanyang University; and Department of Internal Medicine 3, Keimyung University School of Medicine Abstract Background: The proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is a hallmark of atheroscelrosis and post-angioplasty restenosis. We previously showed that alpha-lipoic acid (ALA) inhibited neointimal hyperplasia and has potential anti-atherosclerosis effect in rat carotid artery balloon injured model. Here, we investigated whether alpha-lipoic acid inhibited proliferation of cells and induced apoptosis in rat vascular smooth muscle cells. Methods: VSMCs were treated with ALA under each condition, harvested and protein was extracted. Same amount of protein was loaded into SDS-PAGE and western blot analysis was performed with various cell cycle regulation protein. To examine ALA induce apoptosis in VSMCs, FACS and DNA fragmentation assay were performed. Antioxidant effect of ALA was determined by DCF-DA staining. Results: ALA induced VSMCs cell cycle arrest and induced p21, p27 and p53 proteins. Also ALA induced PTEN expression and AMPK phosphorylation. Increased AMPK phosphorylation reduced Erk-2 phosphorylation and finally arrested cell cycle promotion. The apoptotic effect was also shown by ALA treatment. Also we confirmed that ALA reduced ROS generation in VSMCs. Conclusion: The present data suggest that ALA has anti-proliferative effect and arrests cell proliferation. Therefore, ALA may provide new strategies for the prevention of neointimal hyperplasia after angioplasty. (J Kor Diabetes Assoc 31:200~207, 2007) Key Words: Alpha lipoic acid, vascular smooth muscle cell, cell cycle, apoptosis 서론대사증후군 (metabolic syndrome) 이란인슐린의저항성이나내당능장애가고혈압, 고지혈증, 비만등과함께나타나 는경우를말하며이들환자의가장중요한사망원인은동맥경화증으로인한심혈관질환이다 1). 동맥경화증은다양한용해성매개체들, 단핵구, 내피세포, 혈관평활근세포간의상호작용에관여하는만성염증성질환이며 2,3), 혈관평활근 접수일자 : 2007 년 1 월 12 일, 통과일자 : 2007 년 4 월 25 일, 책임저자 : 이인규, 경북대학교의과대학내과학교실 200

2 김혜진외 10 명 : 알파 - 리포산 (Alpha-lipoic Acid) 투여가혈관평활근세포의세포증식억제및세포사멸 (Apoptosis) 에미치는효과 세포의과도한증식이중요한원인으로알려져있다. 이들질환에서는산화스트레스가증가되어있고 4), 이러한스트레스는혈관내피세포손상과면역세포의활성을유발하여 5) 혈관평활근세포가혈관벽중막에서내막으로이동, 증식하여지방반을형성하게되며병변으로발전하게된다. 따라서혈관세포의과도한증식은비만, 당뇨병, 고혈압및고지혈증등의질환에서죽상동맥경화증의발생에중요한병태생리이다 6). 또한이러한죽상동맥경화증의치료에이용되고있는경피적관상동맥혈관성형술 (percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA) 의치료성공률은 84~92% 로괄목할만한발전을보이고있으나시술후다시혈관이막히는재협착의문제는아직도해결되지않고있다 7,8). 이러한혈관재협착의병리학적인기전으로도역시과다한혈관평활근세포의증식등으로인한신생내막의증식 (neointimal hyperplasia) 이가장중요한기전으로보고된다 2,8). 최근연구에의하면혈관재협착부위의과도하게증식한혈관평활근세포의세포사멸 (apoptosis) 을유도한경우그협착률이줄어드는것과협착이진행되는부위에서는혈관평활근세포의세포사멸이감소됨이보고되었다 9-11). 이러한사실로미루어볼때죽상동맥경화증의치료뿐만아니라혈관재협착의억제를위해서는혈관평활근세포의증식을억제함과더불어증식하는혈관평활근세포를세포사멸로유도하는약물의개발이절실하다. 알파- 리포산 (alpha-lipoic acid) 은 thiol 계열에속하는항산화제로서당뇨병환자의말초신경병증의치료제로널리사용되고있다 12,13). 최근에는알파- 리포산이중추신경계와말초조직에서 AMPK (AMP-activated protein kinase) 의활성을조절하여체내에너지대사에중요한역할이있음이밝혀져있고 14) 혈관세포에서도알파- 리포산이항동맥경화증의효과가있음이보고되고있다 15,16). 저자들은이전연구에서알파- 리포산이산화스트레스에의해활성화된전사인자 (transcriptional factor) 인 NF-κB를억제하여혈관세포부착물질 (vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1), fractalkine (CX3CL1) 및단핵구주화성인자 -1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1) 의발현을억제함으로써혈관평활근세포에서염증반응을완화하여죽상동맥경화증을예방할수있음을보고한바있다 17). 최근몇몇연구자에의하면, 여러암세포주에서알파- 리포산의처리는암세포의세포사멸을유도하며 nontransformed cell (dermal fibroblast) 에서는세포성장을저해한다고보고되었다 18,19). 하지만알파- 리포산이혈관평활근세포의세포주기조절및세포사멸을직접유발하며, 이는어떤경로를통하는지에대한연구는없는실정이다. 이제저자들은알파- 리포산투여가혈관평활근세포에서세포주기저해를통하여성장을억제하고세포사멸이증가됨을확인해보고자본연구를진행하였다. 재료및방법 1. 재료웨스턴블롯에사용한일차항체는항 Cyclin D, B, A, E, Cdk2는 Santa Cruz Biotechnology (CA) 에서구입하였으며, PCNA와 p21 항체는 BD bioscience (CA) 에서, p27, p53, PTEN, pampk, c-fos, c-jun, c-myc, perk, Erk2, 등의항체는 Cell Signalling Technology (MA) 에서구입하여사용하였다. 실험에사용된알파-리포산은 Viatris GmbH & Co. KG (Frankfurt, Germany) 로부터기증받아사용하였다. 2. 세포배양백서의혈관평활근세포는 Sprague-Dawley 백서 (280~320 g) 의흉부대동맥에서분리하여 20) 20% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT) 을포함한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco, Grand Island, NY) 에서배양하였다. 혈관평활근세포의특이성은 α-actin 단일클론항체 (Sigma, St Louis, Missouri) 로염색하여확인하였다. 본실험에는 5~6회사이로계대배양한혈관평활근세포를사용하였다. 배양된혈관평활근세포를 100 mm 조직배양접시에 80~90% 정도차게하여 0.5% FBS DMEM 배지에서 24시간동안배양하여세포들을휴지기로들어가게하였다. 3. 유세포분리법 (FACS Analysis) 세포주기분석을위해서백서의혈관평활근세포에 PDGF (50 ng/ml) 와 insulin (1 μm) 를처리하고또는 PDGF, insulin과알파- 리포산 (2 mm) 을처리하고세포주기의분석을위해서는 24시간후세포를수집하였고세포사멸의분석을위해서는 24, 48, 72시간배양한후세포를수집하고세포주기분석을시행하였다. 회수한세포는 2% FBS를포함한 PBS (Phosphate buffered saline ph 7.4) 로세척하고차가운 70% ethanol로고정시켰다. 세포는 50 μg/ml의 RNaseA와 30분반응한후 50 μg/ml의 PI (propidium iodide) 용액과 30분염색하여유세포분석기 (FACSCallbur, BD bioscience, San Jose, CA) 로 DNA 용적히스토그램을얻고 G0피크를구하여세포사멸을확인하였고, 각세포주기당세포수의백분율을구하여세포주기를분석하였다. 4. DNA 분석휴지기에들어간백서의혈관평활근세포에알파- 리포산을 2 mm로처리하여 24, 48, 72시간에회수하였다. 세포는완충액 (10 mm Tris, ph 8.0, 10 mm EDTA, 0.5% triton X-100) 에서 4 C에서 30분동안반응한후 12,000 rpm에서 10분간원심분리하였다. Nucleic acid를포함한상등액은페놀- 클로로포름을이용하여정제한후에탄올침전하였다. RNA를없애기위해 50 μg/ml의 RNaseA와함께 37 C에 201

3 당뇨병제 31 권제 3 호, 2007 서 1시간반응하였다. 결과물은 1.2% 아가로즈젤에전기영동하여확인하였다. 5. 웨스턴블롯 (Western Blot Analysis) 배양된혈관평활근세포를 100 mm 조직배양접시에 80~ 90% 정도차게하여 2 mm의알파- 리포산을처리한후시간에따라회수하였다. IPH 완충액 (5 mm Tris-HCl, ph 8.0, 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, 1% NP-40, 100 um PMSF) 에 1 μg/ml 단백질분해효소억제제, 1 mm DTT를첨가하여전체단백질을분리하였다. 각시료를시료완충액과섞어 5분간끓인후얼음위에서식혔다. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide 겔에서전기영동하여크기별로분리한후 Immobilon-P transfermembrane (Millipore, Billerica, MA) 으로전기를이용하여옮겼다. 차단완충액 (Blocking buffer) 으로차단하고각각의일차항체와반응하였다. 일차항체와반응이끝난 membrane은다시 horseradish peroxidase-conjugated 이차항체에반응시킨후 ECL plus (Amersham Biosciences, Little Chalfnot, UK) 를사용하여단백질발현을확인하였다. Membrane을항 actin 항체와다시반응시켜일정한양의단백질을사용하였는지확인하였다. 6. 세포내 ROS 생성의측정 6 well 세포배양접시에 90% 가량자랐을때 0.5% FBS DMEM 배지에서 24시간동안배양하였다. H 2O 2 (100 um) 를포함하는배지에알파- 리포산 (2 mm, 1 h) 을포함하거나하지않은조건에서한시간동안배양한후 ROS에예민한형광소식자인 40 μmol/l 2',7'-dichlorofluorecin diacetate (DCF-DA; Invitrogen) 을첨가하여 30분간배양하였다. 488 nm 파장 (wavelength) 에서자극되고 515 nm 파장 (wavelength) 에서발산되는 AxioCam MRc5 Carl Zeiss fluorescence microscopy (Thornwood, NY) 을이용하여 H 2O 2 생성을정량하였다. 7. 통계처리결과는평균 ± 표준오차로표시하였고변수의분석은 Duncan's test를사용하였다. P 값이 0.05 미만인경우에통계적으로유의하다고판정하였으며모든실험은독립적으로 3회이상실시하여통계처리하였다. 결과 1. 알파- 리포산이백서의혈관평활근세포의성장에미치는효과알파- 리포산이혈관평활근세포의성장에어떠한영향을미치는지알아보기위해백서의혈관평활근세포에알파- 리포산을 2 mm의농도로 24시간동안처리한후세포의성 Control PDGF + insulin PDGF + insulin + ALA Fig. 1. Effect of inhibiting cell proliferation on ALA treatment. Cells were treated with PDGF and insulin with or without 2 mm ALA for 24 h. Then cells were fixed, permeabilized and stained with propidium iodide. The percentage of hypodiploid cells was calculated based on a total of 10,000 cells analyzed per sample. 202

김혜진외 10 명 : 알파 - 리포산 (Alpha-lipoic Acid) 투여가혈관평활근세포의세포증식억제및세포사멸 (Apoptosis) 에미치는효과 장정도를유세포분석법을통하여확인하였다. PDGF (50 ng/ml) 와 insulin (1 μm) 으로증가한 S phase가알파- 리포산처리에의해 18.55% 에서 6.67% 까지감소됨을확인하였다 (P < 0.

또한 Proliferating cell number antigen (PCNA) 의발현도감소하였다 (Fig. 2A). Cyclin 계열의세포성장을촉진하는단백질의발현이감소하는반면, 세포성장을저해하는단백질인 p21, p27, p53 등의발현은증가하였다 (Fig. 2B). 3.

4 김혜진외 10 명 : 알파 - 리포산 (Alpha-lipoic Acid) 투여가혈관평활근세포의세포증식억제및세포사멸 (Apoptosis) 에미치는효과 장정도를유세포분석법을통하여확인하였다. PDGF (50 ng/ml) 와 insulin (1 μm) 으로증가한 S phase가알파- 리포산처리에의해 18.55% 에서 6.67% 까지감소됨을확인하였다 (P < 0.02) (Fig. 1). 2. 알파- 리포산이세포주기관련유전자의발현에미치는효과알파- 리포산이세포성장의저해에미치는영향을확인하고자, 관련단백질의발현을확인해보았다. 혈관평활근세포에 2 mm의알파- 리포산을처리하여시간별로확인해보았을때세포의성장을유도하는단백질인 cyclin D, A, B, E 의발현이감소하였고, CDK2의발현은변화없었다. 또한 Proliferating cell number antigen (PCNA) 의발현도감소하였다 (Fig. 2A). Cyclin 계열의세포성장을촉진하는단백질의발현이감소하는반면, 세포성장을저해하는단백질인 p21, p27, p53 등의발현은증가하였다 (Fig. 2B). 3. 알파- 리포산이 PTEN, pampk에미치는효과 p53과함께 tumor suppressor 유전자로잘알려진 Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome (PTEN) 의발현을확인해보았을때알파- 리포산을처리한후시간이지남에따라그발현양이늘어남을확인하였다. 또한알파- 리포산에의한 AMPK의 phosphorylation이혈관평활근세포에서도증가함을확인하였다 (Fig. 3A). 활성화된 pampk의조절을받는다고알려진 Erk의인산화를확인해보았을때그인산화정도가 AMPK가인산화됨에따라감소함을확인하였으며, c-fos의발현이증가함을확인하였다 (Fig 3B). 4. 알파- 리포산의세포사멸에미치는효과앞선결과에서 tumor suppressor 유전자로알려진 p53과 PTEN의발현양이증가하였으며이들의증가는세포사멸과중대한관계가있다고잘알려져있다. 따라서알파- 리포산 A B Fig. 2. Effects of expression of cell cycle regulate molecules on ALA treatment. Cells were seed in 60 mm dish and incubated with 2 mm of ALA for indicated time. Total protein was extracted and western blot analysis was performed with 20 μg of protein using cyclins (A), p21, p27 and p53 (B) antibodies. A B Fig. 3. Effects of expression of PTEN, pampk and signaling pathway molecule expression on ALA treatment. Cells were seed in 60 mm dish and incubated with 2 mm of ALA for indicated time. Total protein was extracted and western blot analysis was performed with 20 μg of protein using PTEN, pampk (A) and c-fos, c-jun, c-myc, p-erk and Erk2 antibodies (B). 203

당뇨병제 31 권제 3 호, 2007 에의한이들의증가가세포사멸에관계할것이라고예상하고세포사멸의정도를유세포분석법과전기영동을통해확인하였다. 알파- 리포산처리후 48시간째에 G0 phase의세포가 5.15% 에서 39.83% 로증가함을확인하였고 (P < 0.05) (Fig. 4A), 동일한결과를전기영동을통해 DNA 분절을확 인하였다 (Fig. 4B).

A. Cells were treated with 2 mm ALA for 24 and 48 h and then fixed, permeabilized and stained with propidium iodide.

5 당뇨병제 31 권제 3 호, 2007 에의한이들의증가가세포사멸에관계할것이라고예상하고세포사멸의정도를유세포분석법과전기영동을통해확인하였다. 알파- 리포산처리후 48시간째에 G0 phase의세포가 5.15% 에서 39.83% 로증가함을확인하였고 (P < 0.05) (Fig. 4A), 동일한결과를전기영동을통해 DNA 분절을확 인하였다 (Fig. 4B). 따라서혈관평활근세포에대한알파 - 리 포산의처리는세포증식의억제뿐만아니라세포사멸을유 도하는것을확인하였다. A Control ALA 24 h ALA 48 h B ALA h Fig. 4. Apoptosis of vascular smooth muscle cells (VSMCs) after treatment with alpha-lipoic acid (ALA). A. Cells were treated with 2 mm ALA for 24 and 48 h and then fixed, permeabilized and stained with propidium iodide. The percentage of hypodiploid cells was calculated based on a total of 10,000 cells analyzed per sample. B. Cells were treated with 2 mm ALA for 24, 48 and 72 h. Cells were harvested and chromosmal DNA was extracted. DNA ladders reflecting the presence of DNA fragments were viewed on ethidium-bromide-stained gel. A B Fig. 5. Effect of ALA on ROS production in response to H2O2. A. VSMCs were treated with ALA with or without H2O2 for 1 h. Then cells were processed for fluorescence microscopic examination using the oxidant-sensitive probes 2',7'-dichlorofluorescein diacetate. VSMCs were randomly chosen and fluorescence was quantified using the NIH Image program. The magnification was 100. B. Data are expressed as mean ± SEM of three separate measurements. Statistical significance was determined as * P, P < compared with basal condition and P < compared with H 2O

6 김혜진외 10 명 : 알파 - 리포산 (Alpha-lipoic Acid) 투여가혈관평활근세포의세포증식억제및세포사멸 (Apoptosis) 에미치는효과 5. 알파- 리포산의항산화효과알파- 리포산의항산화효과를확인하기위해 DCF-DA 염색을통해세포내의 ROS 발현을측정하였다. 알파- 리포산의처리는대조군에비해 ROS 생성을감소시켰고, H 2O 2 에의해증가한 ROS의생성또한저해시켰다 (Fig. 5). 고찰당뇨병환자의말초신경병증치료제로사용되고있는알파- 리포산은미토콘드리아에서탈수소효소반응을매개하여에너지를생성하는데조효소로서필수적인역할을한다 12,21). 저자들은이전연구에서알파- 리포산의항산화작용은혈관평활근세포에서 NF-κB 의활성도를억제하고염증반응을매개하는 VCAM-1, MCP-1 및 fractalkine의발현을억제함으로서혈관성형술후신생내막의과증식 (neointimal hyperplasia) 을방지할수있음을보고한바있다 17,22,23). 이에더하여, 본연구를통해알파- 리포산이기존에알려진항산화효과뿐만아니라혈관평활근세포에서세포증식을억제하고혈관평활근세포의세포사멸을유발함을확인하였기에죽상동맥경화증의치료뿐만아니라혈관성형술후에발생하는혈관재협착의예방에유용하게사용될가능성이있음을보고하는바이다. 혈관평활근세포에서의알파- 리포산은혈관평활근세포의성장을저해하였고, 이에따른세포주기조절단백질인 Cyclin D, B, A, E의발현이감소함을확인하였으며, 반면, p21, p27, p53의발현들은증가함을확인하여이들을통한세포주기조절이이루어짐을확인하였다. 이미알파- 리포산처리에의한 AMPK의인산화는베타세포나지방세포에서확인된바있었으나 24,25), 아직혈관평활근세포에서의그활성은알려져있지않았다. 본연구를통해혈관평활근세포에서 AMPK의인산화를확인하였으며그조절을받는 Erk-2의인산화가저해됨에따라서알파- 리포산에의한세포주기조절이 AMPK를통함을시사하고있다. 또한여러암세포주에서알파- 리포산에의한세포사멸이보고되고있는데 18,19), 혈관평활근세포에서의알파- 리포산에의한세포사멸을확인하여암세포주에서와동일한효과를보임을확인하였다. 본연구진은최근에 AMPK를활성화시키는 metformin 이나 rosiglitazone 등이 PGC-1 발현을통해 ROS의생성을억제하고 22), 결국죽상동맥경화증의원인이되는 chemokine 들의발현을억제함을보고하였다. 또한 PDTC (Pyrrolidinedithiocarbamate) 26) 나 EUK ) 같은항산화물질이혈관평활근세포의세포자살을유도함이보고되었다. PDTC의경우 pro-apoptotic factor로알려진 Nur77을활성화시킨다고보고되었으나아직어떠한기전이관여하는지는밝혀지 지않았다. 다만 EUK-134의경우세포내의산화적인스트레스를감소시킴으로서세포주기를억제한다고보고되었다. 이러한결과들은본연구에서 AMPK를활성화시키며, ROS의생성을저해하는알파- 리포산에의한세포주기의억제또는세포자살유도는이전의연구결과와일맥상통하며그기전에대한실마리를제공하고있다. 알려진바에의하면알파- 리포산은 c-fos의발현의저해를통해 AP-1 조절을함으로써암세포의성장을억제하는것으로보고되었다 28). 하지만본연구에서는알파- 리포산의처리에의해이미알려진바와는달리 c-fos의발현이증가하였다. 이는혈관평활근세포에서의알파- 리포산에의한 c-fos의발현이다른영향을의미한다고볼수있으며이에대한앞으로의연구가진행되어야할것으로사료된다. 본연구에서는세포성장의저해나세포사멸을유도를위해서암세포주에서보다높은농도의알파- 리포산을투여하였다. 이는현재까지 ALADIN I, II 연구에서 29) 사람에게안전성이입증된농도, 즉경구로하루 1,800 mg을사용한경우보다본연구에서사용된용량은높은용량으로사료된다. 하지만최근관상동맥의재협착을방지하기위해 sirolimus 나 paclitaxel과같은약물용출스탠트 (drug-eluting stent) 가국소적으로필요한부위에만고농의약물을전달하여좋은성적을보이고있는점을감안한다면이러한방법으로알파- 리포산을투여하면, 실험에서사용한정도의용량을비교적안전하게인체에서도사용할수있을것이다. 이상의결과를요약하면, 알파-리포산은혈관평활근세포에서세포의증식을저해하며, 이는 cyclin 단백질과 p21, p27, p53의발현을통함을확인하였다. 또한알파- 리포산은혈관평활근세포에서 AMPK의인산화를유도하였으며, Erk 의인산화를저해하였다. 또한지속적인알파- 리포산의처리는혈관평활근세포의자살을유도함을확인하였다. 본연구는이미당뇨병성신경병증의약제로사용되고있는알파 -리포산의죽상동맥경화및혈관재협착의치료제로서의가능성을제시하고있다. 요약연구배경 : 혈관평활근세포의과도한증식은동맥경화증의치료의방법으로쓰이는경피적관상동맥혈관성형술후의혈관재협착의가장중요한원인으로알려져있다. 본연구진은강력한항산화제인알파- 리포산이풍선확장술모델에서혈관재협착을억제함으로써죽상동맥경화증의치료제로서의가능성을제시한바있다. 이에세포단위에서의알파- 리포산에의한세포증식의억제를관찰함으로써그기전을규명하고자하였다. 방법 : 알파- 리포산을 2 mm의농도에서 24시간처리하였을때 PDGF와 insulin 에의해증가되었던세포주기증식 205

7 당뇨병제 31 권제 3 호, 2007 이감소됨을백서의혈관평활근세포에서유세포분석법을통해서확인하였다. 그기전을밝히기위해서세포주기조절에관여하는 cyclins과 p21, p27, p53의발현은웨스턴블롯을통해확인하였다. PTEN의발현과 AMPK의인산화도역시웨스턴블롯으로확인하였다. 알파-리포산에의한세포사멸은유세포분석과 DNA 분절분석법으로확인하였다. 알파- 리포산에의한 ROS생성의저해는 DCF-DA 염색을통해확인하였다. 결과 : 백서의혈관평활근세포에알파- 리포산을 2 mm의농도에서 24시간처리하였을경우세포의성장이저해됨을확인하였으며, cyclin계열의단백질들의발현이줄어들며, p21, p27, p53과같은세포성장을저해하는단백질들의발현은증가하였다. AMPK의인산화가증가함을확인하였으며, 이에따른 Erk의인산화도감소함을확인하였으며 48시간이상을처리하였을경우혈관평활근세포의세포사멸이유도됨도확인하였다. 알파- 리포산에의한 ROS의생성도감소함을보였다. 결론 : 본연구결과는강력한항산화제로알려진알파- 리포산이백서의혈관평활근세포에서세포성장의저해와세포사멸을유도함을알수있었다. 알파- 리포산에의한세포성장의저해를세포단위에서확인할수있었으며, 이는알파- 리포산이풍선확장술이후의혈관재협착을예방할가능성있는치료제로사료되는바이다. 감사의글이논문은 2005년도경북대학교학술진흥연구비에의하여연구되었음. 참고문헌 1. Mensah GA, Mokdad AH, Ford E, Narayan KM, Giles WH, Vinicor F, Deedwania PC: Obesity, metabolic syndrome, and type 2 diabetes: emerging epidemics and their cardiovascular implications. Cardiol Clin 22: , Liu MW, Roubin GS, King III SB: Restenosis after coronary angioplasty. Potential biologic determinants and role of intimal hyperplasia. Circulation 79: , Ardissino D, Di Somma S, Kubica J, Barberis P, Merlini PA, Eleuteri E, De Servi S, Bramucci E, Specchia G, Montemartini C: Influence of elastic recoil on restenosis after successful coronary angioplasty in unstable angina pectoris. Am J Cardiol 71:659-63, Kunsch C, Medford RM: Oxidative stress as a regulator of gene expression in the vasculature. Circ Res 85:753-66, Barks JL, McQuillan JJ, Iademarco MF: TNF-alpha and IL-4 synergistically increase vascular cell adhesion molecule-1 expression in cultured vascular smooth muscle cells. J Immunol 159: , Ross R: The pathogenesis of atherosclerosis; a perspective for the 1990s. Nature 362:801-9, 이수훈, 김두일, 김진우, 차광수, 이성윤, 김상곤, 조길현, 오주현, 김원, 김무현, 김영대, 안태운, 정명호, 김동수, 강정채식익균, 김종석 : 관상동맥스텐트재협착치료를위한 커팅벌룬 혈관성형술후혈관조영술상성적및재발성재협착의예측인자. 순환기학회지 33: , 2003, 8. Bhoday J, De Silva S, Xu Q: The molecular mechanism of vascular restenosis: Which genes are crucial?. Curr Vasc Pharmacol 4:269-75, Durand E, Mallat Z, Addad F, Vilde F, Desnos M, Guent C, Tedqui A, Lafont A: Time course of apoptosis and cell proliferation and their relationship to arterial remodeling and restenosis after angioplasty in an atherosclerotic rabbit model. J Am Coll Cardiol 39: O'Sullivana M, Scotta SD, McCarthya N, Figga N, Shapirob LM, Kirkpatrickc P, Bennetta MR: Differential cyclin E expression in human in-stent stenosis smooth muscle cells identifies targets for selective anti-restenosis therapy. Cardiovascular Res 60:673-83, Marc-AndreR, Anik D, Patrick L, Normand V, Janos GF, Karine L, Alexey VP, Marie-Josee H: Apoptosis of endothelial cells triggers a caspase-dependent anti-apoptotic paracrine loop active on vascular smooth muscle cells. FASEB J 18:705-7, Biewnga GP, Haenen GR, Bast A: The pharmacology of the antioxidant lipoic acid. Gen Pharmacy 3:315-31, Lester Pr, Eric H, Hans JT: Alpha lipoic acid as a biological antioxidant. Free Radic Biol Med 19:227-50, Kim MS. Park JY, Namkoomg C, Jang PG, Ryu JW, Song HS, Yun JY, Namgoong IS, Ha JH, Park IS, Lee IK, Benoit V, Youn JH, Lee HK, Lee KU: Anti-obesity effects of alpha-lipoic acid mediated by 206

8 김혜진외 10 명 : 알파 - 리포산 (Alpha-lipoic Acid) 투여가혈관평활근세포의세포증식억제및세포사멸 (Apoptosis) 에미치는효과 suppression of hypothalamic AMP-activated protein kinase. Nature medicine 10:727-33, Lee WJ, Lee IK, Kim HS, Kim YM, Koh EH, Won JC, Han SM, Kim MS, Jo IH, Oh GT, Par IS, Youn JH, Park SW, Lee KU, Park JY: Alpha-lipoic acid prevents endothelial dysfunction in obese rats via activation of AMP-activated protein kinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol 25: , Yi X, Maeda N: Alpha lipoic acid prevents the increase in atherosclerosis induced by diabetes in apolipoprotein E-deficient mice fed high-fat/low cholesterol diet. Diabetes 55: , Lee KM, Park KG, Kim YD, Lee HJ, Kim HT, Cho WH, Kim HS, Han SW, Koh GY, Park JY, Lee KU, Kim JG, Lee IK: Alpha-lipoic acid inhibits fractalkine expression and prevents neointimal hyperplasia after balloon injury in rat carotid artery. Atherosclerosis 189:106-13, Karyn M, James C, Kosta S, Susan P, Douglas F: Alpha-lipoic acid induces p27kip-dependent cell cycle arrest in non-transformed cell lines and apoptosis in tumor cell lines. J Cell Physiol 194:325-40, Simbula G, Columbano A, Ledda-Columbano GM, Sanna L, Deidda M, Diana A, Pibiri M: Increased ROS generation and p53 activation in alpha-lipoic acid-induced apoptosis of hepatoma cells. Apoptosis 12:113-23, Ahn JD, Morishita R, Kaneda Y, Lee SJ, Kwon KY, Choi SY, Lee KU, Park JY, Moon IJ, Park JG, Yoshizumi M, Ouchi Y, Lee IK. Inhibitory effects of novel AP-1 decoy oligodeoxynucleotides on vascular smooth muscle cell proliferation in vitro and neointimal formation in vivo. Circ Res 90: , 조호찬, 이상준, 김미정, 김혜순, 윤태승, 김성재, 김상현, 허승호, 문교철, 배재훈, 이인규 : 폐경후여성제2 형당뇨병환자에서 α-lipoic Acid 투여가혈관내피세포기능에미치는영향. 당뇨병 26:242-52, Kim HJ, Park KG, Yoo EK, Kim YH, Kim HS, Kim HT, Park JY, Lee KU, Jang WG, Kim BW, Lee IK: Effects of PGC-1alpha on TNF-alpha-Induced MCP-1 and VCAM-1 Expression and NF-kappaB Activation in Human Aortic Smooth Muscle and Endothelial Cells. Antioxid Redox Signal in press 23. 신동우, 이동욱, 이상준, 김혜순, 강효경, 안종덕, 이인 규 : 백서 혈관평활근세포에서 alpha lipoic acid가 PAI-1 발현, 세포의증식, 주유능및신생내막형성억제 에미치는효과. J Kor Diabetes Asso 25:446-59, ED Targonsky, F Dai, V Koshkin, GT Karaman, AV Gyulkhandanyan, Y Zhang, CB Chan, MB Wheeler: Alpha-lipoic acid regulates AMP-activated protein kinase and inhibits insulin secretion from beta cells. Diabetologia 49: , Kola B, Boscaro M, Rutter GA, Grossman AB, Korbonits M: Expanding role of AMPK in endocrionology. TRENDS Endocrionl Metab 17:205-15, Tokumitsu W, Masao Y, Masahiro A, Masato E, Kenji T, Masayoshi H, Koichiro N, Yi-Qiang L, Yumiko O, Katsuya I, Noriko S, Kim SB, Takashi N, Naohide Y, Junya A, Yasuyoshi O: Induction of nuclear orphan receptor NGFI-B gene and apoptosis in rat vascular smooth muscle cells treated with pyrrolidinedithiocarbamate. Arterioscler Thromb Vasc Biol 21: , Stephen W, Stephen B: Induction of apoptosis in fetal pulmonary arterial smooth muscle cells by a combined superoxide dismutase/catalase mimetic. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 285:L305-12, Mizuno M. and Packer L: Effects of α-lipoic Acid and Dihydrolipoic Acid on Expression of Proto-oncogene c-fos. Biochem Biophys Res Commun. 200: , Ziegler D, Hanefeld M, Ruhnau KJ, Hasche H,Lobisch M, Schutte K, Kerum G, Malessa R: Treatment of symptomatic diabetic polyneuropathy with the antioxidant α-lipoic acid. Diabetes Care 22: ,

Pharmacotherapeutics Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee Univ

Pharmacotherapeutics Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee Univ Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee University College of Medicine & Hospital E mail : ycell2@yahoo.co.kr Abstract