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1 약독화두창백신개발을위한 Research Bank 구축 Establishment of Research Bank for attenuated smallpox vaccine development 주관연구기관 : ( 주) 녹십자종합연구소직인 주관연구책임자 : 최기섭직인 질병관리본부

2 목 차 Ⅰ. 연구개발결과요약문... 1 Ⅱ. 학술연구용역사업연구결과 제1 장최종연구개발목표... 3 제2 장최종연구개발내용및방법... 8 제3 장최종연구개발결과 제4 장연구결과고찰및결론 제5 장참고문헌 제장별첨

3 최종결과보고서요약문 과제명약독화두창백신개발을위한 Research Bank 구축 중심단어두창, 백신, Vero cell, Vaccinia 주관연구기관 ( 주) 녹십자종합연구소주관연구책임자최기섭 연구기간 2007년 12월 ~ 2008년 10월 천연두 ( 두창) 는두창바이러스 (variolar virus) 가원인이되는심각한바이러스감 염질환으로인류역사초기부터인간을괴롭혀왔다. 인류역사상전쟁과다른전염병으 로죽은사람들을모두합친것보다많은 5억여명이이질병으로희생된것으로추정하 고있다. 남미아즈텍문명과잉카문명이천연두의등장으로붕괴되었고미국은천연두를 전염시켜인디언들을멸망시켰다. 우리나라도 6.25 전쟁중이던 1951년한해에 4만여 명이천연두에걸렸다. 기존두창백신은효능은뛰어나나양적으로부족하며접종받은 사람에게심각한부작용을일으키는등여러가지문제점이보고되고있다. 이에전세 계적으로안전하고효능이우수한차세대두창백신연구가활발히진행중이다. 국립보건연구원에서개발중인약독화두창백신후보주의실용화연구를위하여확보된 백신후보주를 bank 화하여안정적인약독화백시니아바이러스를확보하고자하며, 이 를위해 자한다. 현재 Research Bank를확립함으로서차세대두창백신개발을위한기반을마련하고 본연구개발결과로서는다음과같이요약할수있다. 1) 백신후보주를 bank화하기위하여무혈청배지에숙주세포를 adaptation 시킨후 cell bank 화하였다. 2) 백신후보주를무혈청배지에 adaptation 된 cell에연속하여계대배양함으로서 7 x 10 5 의 titer를보이는 virus strain 을확보하였으며, 선별된백신후보주를사용하 여 research virus bank 를제작하였다. 3) Research Cell Bank와 Research Virus Bank에대한 characterization 시험으로무 균시험, 순도시험, 동정시험을하여실시하였다.

4 Summary Title of Project Key Words Establishment of research bank for attenuated smallpox vaccine development Vaccinia, Smallpox, Vaccine, Vero cell Institute Green Cross Co. Project Leader Gi-Sub Choi Project Period Smallpox is a serious, contagious, and sometimes fatal infectious disease. There is no specific treatment for smallpox disease, and the only prevention is vaccination. The pox part of smallpox is derived from the Latin word for spotted and refers to the raised bumps that appear on the face and body of an infected person. Smallpox is an acute contagious disease caused by variola virus, a member of the orthopoxvirus family. Smallpox, which is believed to have originated over 3,000 years ago in India or Egypt, is one of the most devastating diseases known to humanity. For centuries, repeated epidemics swept across continents, decimating populations and changing the course of history. The disease, for which no effective treatment was ever developed, killed as many as 30% of those infected. Between 65 80% of survivors were marked with deep pitted scars (pockmarks), most prominent on the face. In early 19th century, Smallpox vaccine was developed and eradicated smallpox on the world. But the previously developed vaccine has a lot of side effect to vaccinated human. So, the development of next generation vaccine was required with safe and efficacious properties. For economical development of vaccinia virus, we constructed research cell and virus bank. We hope to establish the basis for developing new smallpox vaccine. This study can be summarized as below 1) Vero cell bank adapted to serum-free media was constructed for adapting vaccinia virus to serum free media. 2) Research vaccinia virus bank preparation. 3) Characterization of research cell bank and virus bank.

5 제장최종연구개발목표 1 제 1 절목표 천연두 ( 두창) 는두창바이러스 (variolar virus) 가원인이되는심각한바이러스감염질환으로 인류역사초기부터인간을괴롭혀왔다. 인류역사상전쟁과다른전염병으로죽은사람들을모두 합친것보다많은 5 억여명이이질병으로희생된것으로추정하고있다. 남미아즈텍문명과잉카 문명이천연두의등장으로붕괴되었고미국은천연두를전염시켜인디언들을멸망시켰다. 우리나라 도 6.25 전쟁중이던 1951년한해에 4 만여명이천연두에걸렸다. 1796년 Edward Jenner에의해종두법이개발됨으로서천연두치료가가능하게되었으며 1966년부 터 WHO 에서실시한천연두박멸사업이전세계적으로시행되게되었다. 그결과 1977년 10월 26일 소말리아에서발견된환자를끝으로더이상의자연발생은일어나지않게되었으며 1979년 10월 26일 WHO 에의해공식적으로천연두박멸이선언되었다. 박멸선언이후지구상에존재하는모든 variolar virus 를파기하자는주장이여러차례제기되었으나인위적혹은자연적으로다시발생될 수도있다는우려로인해계속무산되어왔으며완전파기대신미국의 CDC와러시아의 Koltsovo에 있는 The Russian state Research center of Virology and Biotechnology에서만연구목적의 variolar virus 를보관하기로결정하였다. Variolar virus 는폭스바이러스 (poxviridae) 에속하며가장크고복잡한바이러스이다. 폭스바 이러스는벽돌모양이며 400X230 nm 정도크기의타원형을이루고있다. 사람에게서질병을일으키 는대부분의폭스바이러스는 Orthopoxvirus와 Parapoxvirus 이다. Orthpoxvirus는광범위한숙주 범위를갖는데이중 cowpox, monkeypox, vaccinia, variolar virus 가사람에게감염된다. 이중 vaccinia virus만이 variolar, cowpox virus 와약간다른형태를가진다. 모든척추동물에감염되 는 poxvirus는핵안쪽에공통의 nucleoprotein 항원을갖고같은 genus 들은혈청학적으로교차반 응을보인다. 결론적으로 vaccinia virus에의한면역은 variolar 에대한저항성은갖게되지만, parapox나 unclasified poxvirus 에대해서는면역력을갖지못한다[1,5].

6 (Figure 1. Variolar virus (left) and Vaccinia virus (right).) 천연두의잠복기는노출후약 7-17 일간이며, 감염성이매우높고감염된침방울을통해사람 사이에전염된다. 대면접촉, 공기를통한전염 ( 기침이나재채기), 또는오염된물질과의직접적 인접촉으로병균에노출될수있다. 천연두환자는질별발생첫주동안전염성이가장높은데, 그이유는이기간에가장많은양의바이러스가침속에들어있기때문이다. 그러나딱지가모두 떨어져나갈때까지어느정도의전염위험은항시존재한다. 초기증상으로는고열과피로, 두통, 요통을들수있다. 2,3 일후에는특유의발진이생기며특히얼굴과팔다리에심하게나타난다. 발진은납작한붉은반점으로시작되어고르게퍼져나간다. 반점은고름이생기고둘째주초반부 터는부스럼딱지로변하기시작하여딱지가굳어지면서약 3-4 주가지나면떨어진다. 천연두환자 의대다수는회복되지만발병환자의사망률은최대 30% 에이른다[6,7,8]. (Figure 2. Smallpox infected child.) 4 반세기전에지구상에서소멸된이천연두가테러전쟁때문에다시금인류를위협하기시작했 다. 특히, 2001년 9월 11일미국세계무역센터에대한자살비행기테러와그이후에진행된우편 물을통한탄저균테러등의발생으로미생물병원체를이용한생물테러에대한전세계의관심이 고조되고있다. 생물테러가가능한병원체로는탄저이외에도천연두, 보툴리늄, 리신등이있으며

7 이들병원체는치료하지않을경우높은치사율을가진다. 특히천연두는박멸이선언되었던전염 병이지만최근들어서가장위협적인생물테러예상병원체로대두되고있다. (Table 1. Riskiness and mortality of major bioterrorism pathogen) 생물테러병원체위험성치사율 천연두 WHO에는 1979년에사라진질병으로보고됨. 최근천연두백신을거의저봉하고있지않아서 30세이하청소년과예방접종효력이덜어진성인을합치면전국민절반이위험에노출될수있음. 탄저존스홉킨스대학의보고서는탄저균 100kg을공기중에살포하면최대 300만명까지사망할수있음. 대두창의치사율은 15~50%, 소두창은 1% 의치사율을보임. 두창이발생한적이없는인구집단에서는 50~90% 의치사율을보임. 피부탄저, 폐탄저, 장탄저로나뉨. 사망률은흡입에의한탄저는 100%, 피부탄저는항생제치료가가능하고, 장탄저는사망률 100% 임. 페스트 중세유럽인구의절반이상이사망했으며, 아직까지효과적인백신이개발되어있지않은상태임. 림프절페스트급성페스트는 5%, 패혈증페스트 33%, 90~100% 의치사율 보툴리눔독소증백신및예방치료제없음. 항독소투입이유일한치료법. 질병관리본부에서백신개발중. 치사율낮음. 바이러스성출혈열 ( 마버그열, 에볼라열, 라싸열) 전세계적으로백신및예방치료제가 * 자료 : ' 국방저널' 통권제241호 P23-28(2002), 대량살상무기문답백서- 국방부(2004), 질병관리본 부생물테러대응팀국회제출자료 ( ) 기존두창백신은효능은뛰어나나양적으로부족하며접종자에게심각한부작용을일으키는등 여러가지문제점이보고되고있다. 이에전세계적으로안전하고효능이우수한차세대두창백신 연구가활발히진행중이다. 현재국립보건연구원에서개발중인약독화두창백신후보주의실용 화연구를위하여확보된백신후보주를 bank화하여안정적인약독화백시니아바이러스를확보하 고자하며, 이를위해 Research Bank를확립함으로서차세대두창백신개발을위한기반을마련하 고자한다 [2].

8 나. 연구수행체계 (Figure 3. Systemic approach for vaccine development)

9 제 2 절목표달성도 - 연구성과물의활용분야 본과제를통해구축된 cell bank및 virus bank는무혈청배지에 adaptation 되었으므로, 본 bank를통하 여예방백신이만들어지면세균전에대비한군사적목적으로사용할수있으며, 민간분야에서도수의관 련분야나, 실험실종사자등의노출가능성이높은사람에게백신을접종할수있다. 또한안전하고, 백신접종시이상반응을일으킬수있는요인인혈청이배제된백신을개발하여수출할수있어대외경 제성도있다. 본연구를통한연구용 research bank는효력시험과독성시험을통해 (1) 비임상및임상시험에필요한시제품제조단계에핵심적인기술로활용될수있다. (2) 백신의국내개발을가시화함으로써차세대백신개발을앞당길수있을것이다. (3) 본연구를통하여습득된무혈청배지배양에관한기술은향후타백신의국내개발에도적용되어큰 도움이될것이다. 제 3 절국내 외기술개발현황 생물무기테러공격가능성에관한우려가크게대두되자미국정부는천연두백신접종실시계 획을발표하고우선적으로 50만명에달하는미군장병들과 3만여명의응급요원들에게백신접종 을실시하였다. 천연두백신은두창바이러스(variolar virus) 가아닌우두바이러스(vaccinia virus) 라고하는살아있는바이러스로제조된다. 천연두균에노출되고 4일이내에백신을투여할 경우질병의심각성을완화시키거나발병을예방할수도있다. 현재는소, 말과같은대동물의체 내에서직접바이러스를배양한 1 세대백신보관분으로예방접종을실시하고있는데, 실제살아있 는동물의체내에서배양한바이러스는병원성을획득할수도있으며, 기타박테리아등에백신이 감염되었을가능성도배제할수없는실정으로지금은이러한방법에의한백신생산이금지된상 태이다. 따라서현재는 2 세대백신인세포배양을통한백신개발이진행중이다. 이방법은기존에백신 제조에사용하던동물의생체내에서배양하는방법과는달리 vaccinia virus에감수성을가지는 animal cell 에서여러번바이러스를체외계대함으로서안전성및효능성을가지는백신주를확보 할수있다는장점을가지고있다 [3,4].

10 제장최종연구개발내용및방법 2 제 1 절연구내용 가 ) Viral / Cell line Research Bank 구축 약독화두창백신후보주분양 - 국립보건연구원에서내부연구사업을통하여약독화두창백신후보주를확보하고있음. - 본연구를위하여국립보건연구원에서확보하고있는약독화두창백신후보주를분양받음. 최적배지선별 - 분양받은두창백신후보주를배양하기위하여여러무혈청배지를테스트한다. 우선, VERO cell이잘자라는무혈청배지를선별한후백신후보주를감염시켜바이러스가잘증식하 는지확인한다. 바이러스가잘자라는배지를선별하고그배지에서배양된바이러스를저 장함. 연구용마스터바이러스은행 (Research master seed virus bank) 행(Research working seed virus bank) 의제작및품질평가 과연구용제조용바이러스은 - 마스터바이러스은행 (MVB, master virus bank) 은단일생산작업에서유래하며조성이균일하다는점에서마스터세포은행과유사하다. 제조용바이러스은행 (WVB, working virus bank) 는마스터바이러스은행에서직접유래한다. 세포은행과마찬가지로바이러스은행에 서중요한부분은외래성인자가없는것으로밝혀진일관된바이러스기원을사용하여임상 또는제품배치를생산하는것이다. CGMP 규정을준수하면서, 바이러스은행제조를위해세 포은행을사용하기에앞서, 품질보증시험을포함하여바이러스은행제조에사용되는세포 은행에대한시험을완료해야한다. - 각국의의약품규제기관 (national authority, 이하규제기관) 들은제조업체가허가시의품 질과동등한수준의생물의약품을지속적으로생산할수있도록생물의약품의모체가되는 세포나바이러스관리및그방법을엄밀하게작성하여제출할것을요구하고있다. - 본연구에서는차세대두창백신개발을위한기반을마련하고자 seed virus의 research bank

11 를확립하고자한다. - 따라서국립보건연구원에서두창백신후보주를분양받아 VERO cell line에서배양하여연구 용마스터바이러스은행 (Research Master seed virus bank) 을제작하고 VERO cell에서계대 배양하여연구용제조용바이러스은행 (Research working seed virus bank) 을제작한다. - 품질평가를위하여바이러스은행들의바이러스 subtype을혈청학적으로동정하고오염여부 를확인을통한 purity를결정하며계대배양에의한변이유무를확인하여 genetic stability 를검증할계획이다. < Research Master Seed Virus Bank Procedure> 나) 연구용마스터세포은행 (Research master cell bank) 의제작및품질평가 - 생물공학, 생물학적제제를생산하는데연속적으로계대배양된세포를사용함으로써얻어지 는가장큰장점중의하나는각생산로트에대하여특성이결정된공통된출발물질즉, 저 장된세포은행을갖는것이다. 일반적으로제품을계속생산하는데사용되는세포기질을공급 하기위한가장유용한방법은마스터세포은행을제조용세포은행의생산에이용하는 포은행시스템이다. 2단계세

12 - 마스터세포은행이처음으로만들어지며, 제조용세포은행은마스터세포은행용기를하나또는 그이상사용하여만들어지며제조과정에쓰이는세포를직접제공한다. 필요시마다마스터 세포은행에서추가로제조용세포은행을만든다. 새로만들어지는제조용세포은행은특성결 정과시험을통해적절히품질관리되어야한다. - 오염된세포은행이생산에사용되는것을막고오염으로세포은행을다시제조해야할 때걸 리는시간또는제품공급에있어서의차질등의손실을피하는것이중요하다. 어떠한세포은 행시험방법도모든잠재적인오염물질을검출할수는없으므로오염이없음을보증하고신뢰 할만한세포기질을제공하기위해서는세포은행을만드는동안에오염예방원칙을적용하는 것이중요하다. - 본연구에서는백신개발에사용할마스터세포은행 (Master cell bank) 을갖추기위한기반 을마련하고자무혈청배지를이용한연구용마스터세포은행 제조용세포은행 (Research working cell bank) 을제작한다. (Research master cell bank) 과 - 제작된연구용마스터세포은행의특성을결정하고외부오염물질을확인하는시험을수행하 여세포은행의품질을검증한다. 차세대두창백신후보주및세포주에대한 QualityControl - 오염되지않은마스터바이러스은행과세포은행을생산에사용하기위하여각각 QC test를 실시하여품질을보장하는것이생물학제제에는매우중요하다. - 마스터세포은행적격성평가실험에는외래성인자와내인성바이러스가없음을증명하는시 험과확인시험이포함된다. 외래성인자시험은비숙주성미생물, 마이코플라스마, 박테리오 파지, 바이러스실험을포함할수있다. 체내및체외바이러스시험과적절한종특이적실 험( 예, 마우스항체생산(MAP) 실험) 을실시하여외래성바이러스가없음을증명해야한다. 세포은행확인시험을통해, 세포의특징과제조과정에서이들특징의안정성을확립해야한 다. 세포동위효소발현세포표현형및유전형측면에서세포은행특성을분석하고, 이때 유전자전달벡터의존재또는유전자삽입물의발현이포함될수있다. 제한효소매핑이나 핵산서열분석을포함한적합한기법으로세포은행을분석하여, 벡터카피수와벡터의물리 적상태( 벡터완전성및통합) 를평가한다. 또한생산된유전자제품의질과양을평가한다. - 마스터바이러스은행의평가는마스터세포은행과유사하며, 일반적인외래성인자실험( 예, 세균, 진균, 마이코플라즈마, 바이러스) 과생산세포주특이적개체( 복제가능바이러스포

13 함) 실험을포함해야한다. 마스터바이러스은행확인시험을통해바이러스의특징과제조 과정에서이들특징의안정성을확립해야한다. - 특히본연구에사용하는무혈청배지에서의 Vero cell line 품질테스트를위해서그외에도 In vivo / In vitro 외래성바이러스시험, PERT 법등을시험항목에넣어야한다. 본연구는연구용마스터바이러스은행 / 연구용마스터세포은행을제작하는과정이므로위의 모든항목을다테스트할필요는없으며중요한몇가지항목위주로진행하고자한다. 실제마스 터세포및바이러스은행제조에들어갈경우 GLP level의외부전문기관에의뢰하여모든항목 시험을진행하는것이실제백신제품화의과정이다. 따라서추후에백신개발과정에들어가게되 면마스터바이러스은행과마스터세포은행을제작하는데본연구에서제작되고품질테스트된 연구용마스터바이러스은행 / 연구용마스터세포은행이사용되어질수있으리라기대한다. 다) 세포배양을이용한바이러스대량배양확립 차세대두창백신개발에사용할안정적이고검증된충분한양의바이러스를제작하기위하여 cell factory와 bioreactor 를이용하여바이러스대량배양을수행한다. Scale-up을수행하기전에 최적의배지를선별하는과정이필수적이다. T-Flask 에서의배지최적화 - 대부분의세포주들의경우에는배지에혈청을첨가해주어야하지만, 1950년대에합성배지로 자연배지를부분적으로대체할수있다고보고된이후로혈청공급없이세포배양을하려는 시도가있었고, 현재는다양한무혈청배지가개발되어상용화되어있다. 혈청배지가세포증 식에더용이한장점이있으나가격이고가이고혈청내에포함되어있는단백질및펩티드때 문에세포배양후얻어지는제품의분리정제공정이매우복잡해지며마이코플라스마또는바 이러스등에의한오염의가능성을증가시키는단점이있다. 이러한문제점을극복하기위해 무혈청배지가개발되어왔으며, 무혈청배지는그구성물질의조성을분명히알수있어배 지조성이표준화되며실험의재현성을높이고정제가용이하며가격이비교적저렴한장점이 있다. 무혈청배지를이용한적절한배양조건을선택하기위해서는배양할세포주의기원, 어떠한 배양용기를이용하여배양할것인지, 그리고사용세포주의특성등을고려해야한다[9,10]. 본연구를수행하기위하여우선 한두창백신후보주가잘배양되는지확인해야한다 [11]. VERO cell이잘적응하는무혈청배지를선택하여야하며또

14 Cell factory를이용한scale-up - Cell factory를이용한배양법은매우간단하면서도한번배양으로약 2 L 정도의배양액을 얻을수있으므로바이러스를대량배양하는데매우효과적인방법이다. 배지는 T-flask에서 선별한무혈청배지를사용한다. Cell factory는 1 단에 T-175 flask의 3.6배표면적크기이 고재질은 T-flask 와거의비슷하여세포배양에어려운점은없다[12]. 제 2 절연구방법 가 ) Viral / Cell line Research Bank 구축 약독화두창백신후보주분양 - 국립보건연구원에서는 variola virus의면역에사용되는 vaccinia virus를 VERO 세포에감염시 켜 CPE를확인하고상층액을다시세포에감염시키는방법으로여러차례계대하여약독화시 킨두창백신후보주를확보함. - 약독화된 vaccinia virus는 Korean-Copenhagen strain으로본연구를위해이백신후보주를분양받음. 연구용마스터바이러스은행 (Research master seed virus bank) 과제조용바이러스은행 (Research working seed virus bank) 의제작 - 분양받은 Korean-Copenhagen strain을감수성을가지는 Vero cell 에접종한다. T-75 플라스크 에 80~90% 배양된 Vero cell에 2 ml의바이러스를 2시간동안접종한후상층액을걷어내고 15 ml의무혈청배지를채워 2 일간관찰한다. Vero cell 에세포변성효과 (CPE) 가나타난것을확 인한후상층액을모아 1500 rpm에서 5 분간원심분리한다. Cell debris가가라앉으면바이러스 가포함된상층액을모아 0.22 um로 filtration을하여 1 ml씩분주하여연구용마스터바이러 스은행이라라벨하여 -70 o C 초저온냉동고에보관한다. - 연구용마스터바이러스은행에서 1 vial을해동하여상기와동일한방법으로계대배양하고상층액을모아제조용바이러스은행을제조보관함. 연구용마스터세포은행 (Research master cell bank) 과연구용제조용세포은행 (Research working cell bank) 의제작

15 - ATCC에서 Vero cell line (CCL-81) 을분양받아질소탱크에저장한다. 10% FBS가포함된 EMEM 배지 9 ml에저장되어있던세포주 1 vial 을녹여첨가한다 rpm에서 5분간원심분리하여 상층액을버린후새로운배지로세포를풀어 T-75 플라스크에넣고 15ml 배지를첨가하여 37 o C, 5% CO 2 배양기에서배양한다. 몇계대후세포가안정적으로자라면선별한무혈청배지 에적응시킨다. 적응후, 무혈청배지에서 5 계대이상자라게되면플라스크여러개로계대 하여배양한다. 플라스크에세포가 monolayer하게자라면떼어서한튜브에넣고원심분리하여 가라앉힌다. 배지로세포를 suspension 한후, 1 ml씩분주하여질소탱크에저장하고연구용마 스터세포은행으로라벨링하여기록한다. - 마스터세포은행에서 1 vial을꺼내어녹인후 15 ml 튜브에넣고원심분리한다. 상층액을걷 어내고새로운배지를넣어세포를풀어준후 T-175 플라스크에서배양한다. 세포가자라면 계대배양하여세포를늘리고같은계대수의세포를한꺼번에모아저장한다. 이것을연구용 제조용세포은행으로라벨링하여기록한다. 차세대두창백신후보주virus 및cell line 에대한Quality Control 나) 연구용마스터바이러스은행 (Research master seed virus bank) 과제조용바이러스은행 (Research working seed virus bank) 의품질분석 연구용마스터바이러스은행의품질분석을위해기본적으로다음과같은시험들을수행한다. 이것을바탕으로하여향후에마스터바이러스은행을제조하는데이용할계획임. 1 확인시험 마스터바이러스은행 (Master seed virus bank) 확인시험을통해바이러스의특징을규명하며 제조과정에서이들특징의안정성을확립하여야한다. 2 무균시험 무균시험법은사용하는바이러스균주가미생물 ( 세균및진균) 에오염되어있는지확인하는시 험법이다. 약전일반시험법에따라수행하며일반적으로멤브레인필터법또는직접법에따라시험 하며이에적합하여야한다. 배지는따로규정이없는한액상치오글리콜산배지 I 및대두카제인소 화액체배지를쓴다. 멤브레인필터법은멤브레인필터로검체를여과하고씻은다음그필터를배지 에넣거나여과기에배지를넣어배양하는방법이며, 직접법은검체의전부또는일부를직접배지 에넣어배양하는방법이다.

16 3 마이코플라스마부정시험 마이코플라스마부정시험법에따르며, 이에적합하여야한다. 배지는마이코플라스마부정시험용 한천배지 ( 평판배지) 또는마이코플라스마부정시험용액체배지 I, II 를사용한다. 여과전에바이러 스검체를채취하고직접도말배양법및증균배양법에따르거나또는멤브레인필터법에따른다. 최근에는마이코플라즈마오염정도를손쉽게확인할수있는 kit 가많이개발되었다. 4 감염력시험 백신후보주를적당한등배간격으로희석하여 도의바이러스감염력을가지고있는지확인하는시험법이다. VERO cell에감염시켜관찰한후연구에사용할정 다) 연구용마스터세포은행 (Research master cell bank) 과제조용세포은행 (working cell bank) 의품질분석 세포은행으로만들어진세포기질의특성결정과시험은생물공학제제및생물학제제를관리하는 데필수적인요소이다. 마스터세포은행의특성결정을통하여다른세포주로부터혼입된세포, 외래 성미생물, 내인성인자및분자오염원과관련하여세포기질을평가할수있다. 이러한시험의목 적은세포기질의확인, 순도및제조목적상적합성을입증하기위한것이다. 1 확인시험 세포은행으로제조된세포를확인하기위하여적절한시험을수행하여야한다. 확인시험에는표 현형 (phenotype) 또는유전형 (genotype) 적인특성이이용될수있다. 일반적으로확인시험은마 스터세포은행에대해실시하며각각의제조용세포은행에대해서는추가적으로몇가지제한된확인 시험을실시한다. VERO cell line 의경우, 동종효소(isoenzyme) 분석으로충분하며기원종을확인 하기위해서는핵형분석 도사용할수있다. (banding cytogenetics) 이나종특이적항혈청의이용을포함한다른기술 2 순도시험 세포개발과세포은행제조의핵심은마스터세포은행과제조용세포은행이생물학적으로순수한 가, 즉외래성미생물과외래성세포오염원으로부터오염되지않았는가를평가하는것이다. 개개 의마스터세포은행과제조용세포은행용기에대하여미생물의존재를시험하여야한다. 이를위하 여약전또는생물학적제제기준및시험방법등에기술되어있는미생물한도시험 (microbial

17 limits) 이나무균시험 (microbial sterility) 과같은현행시험방법들이적절한것으로인정된다. 또한마스터세포은행과제조용세포은행에대해마이코플라스마부정시험을실시하여야하며, 현재 적절한방법으로한천및부로스배지시험방법 (agar and broth media procedures) 과세포배양시 험방법 (indicator cell culture procedures) 이있다. 오염가능성이있는바이러스를검출하기위 하여, 세포기질에대한바이러스시험은세포주의배양내력에근거하여적절한검색법과특이성이 높은시험법을사용하여광범위하게바이러스를검출할수있도록설계하여야하며, 레트로바이러 스존재를검사하기위해감염성시험, 투과형전자현미경시험또는역전사효소시험등을사용할 수있다. 3 전자현미경관찰시험 무혈청배지에서배양하는 Vero cell의경우 Virus-like particle 또는외부미생물입자들이 세포주안에포함되지않음을증명하기위하여전자현미경관찰을수행한다. 일반적으로바이러스를 확인하기위하여투과전자현미경을이용한다. 라) 세포배양을이용한바이러스대량배양확립 T-Flask 에서의배지최적화 - 질소탱크에저장되어있는 Vero cell (Research working cell bank) 을 1 vial 꺼내어 10 % FBS가들어있는 EMEM배지에서배양하여 2~3 passage 계대한다. VERO cell을배양하기위한 최적의무혈청배지를찾기위하여여러가지무혈청배지들로 adaptation 한다. Adaptation하 는방법에는 Direct adaptation과 serial adaptation 방법이있으며, 세포의배지적응정도에 따라판단하여결정한다. 무혈청배지에 VERO cell을완전적응시켜몇계대이상배양한후 5.0E+06 cells/ml per vial 의농도로세포를얼려저장한다. Cell factory를이용한scale-up - 무혈청배지에적응시킨 VERO cell을 T-175 플라스크 5개에배양하여세포가 monolayer하게 자라면 Trypsin-EDTA로세포를떼어 10단 cell factory 로옮겨배양한다. 3~4일후세포가 80~90% 정도자라면, 초저온냉동고에저장되어있는연구용제조용바이러스 (research working seed virus) 를 titer 계산하여감염시키고 2~3일배양한후 harvest 한다. 이때배지는 무혈청배지를사용한다. 제 3 장최종연구개발결과

18 국립보건원으로부터분양받은 vaccinia virus clone #6 와 #7을무혈청배지에서배양하기위하여 host cell line으로 vero cell을사용하여 adaptation 연구를수행하였다. 무혈청배지에 adaptation된 clone을 대상을각각 research virus bank 를만들었으며, stock된 cell line과 virus를대상으로 characterization 시험을수행하였다. 1) 백신후보주의무혈청배지 adaptation 국립보건원에서분양받은 vaccinia virus clone #6 과 #7를무혈청배지에 adaptation하는연구를수행 하였다. 본연구의목적은 vaccine의생산을위한기초연구로써연구단계에서부터생산을염두에둔 process 를확립하여야하므로동물유래물질의사용을최소화하여야한다. Host cell의배양및 virus의 propagation에사용되는 serum은 vaccine의제품화시에잔존물질이인체에잠재적으로유해한효과를 미칠수있으므로, 새로개발되는백신들은무혈청배지에 adaptation된 host cell과 virus clone으로생 산되고있다. 따라서, 본연구에서는무혈청배지에 adaptation된 vero cell 을숙주세포로사용하고, 국 립보건원에서 attenuation을수행한 vaccinia virus clone #6 와 #7에대하여 serum free medium에서높은 virus titer 를얻기위한연구를수행하였다. (1) 실험재료 두창백신후보주는국립보건원에서 vero cell line에 100번이상의 passage를거쳐서 attenuation을수행한 KOR-Copenhagen vaccinia virus strain 을사용하였다. 총두가지의두창백 신후보주(#6, #7) 를분양받았으며, table 2에서나타낸 serum-free media에서 adaptation을연구 를실시하였으며뿐만아니라다양한 supplement를첨가하여최적의 vaccinia virus 배양조건에 대해서연구하였다. (2) 실험방법 ( 가) 세포배양 1 37 o C 수조에서배지를미리항온한다. 2 배양배지를제거한다. 3 D-PBS (Mg 2+,Ca 2+ - free) 로세포층을씻어낸다. 4 o 0.25% Trypsin- EDTA (37 C ) 를 T25 flask의경우 1 ml, T75 or T175 flask의경우 2 ml 넣어 1~2 분정도세포가떨어지도록둔다. 5 세포가바닥에서완전히떨어지도록손바닥으로플라스크옆면을몇번쳐준다. 6 Serum-free 배지에서세포를유지하는경우에는동량의 TNS(trypsin neutralization solution) 로 trypsin 을중화시킨다음키우는배지를넣어세포를현탁한다. ( 필요시에는 300 x g, 5 min 원 심하여 trypsin 성분을제거한다.) 7 새로운플라스크에적절한세포밀도가형성되도록세포현탁액을취하여 (1:4 or 1:8) 넣고

19 새로운배지를첨가하여배양한다. Table 2. Medium and supplement used in this study. Items Co. Cat# Provero-1 Lonza BE02-030Q VP-SFM Gibco Medium Opti-pro Gibco MEM (powder) Gibco EMEM Gibco L-Glutamine Lonza E MEM AA Sigma M5550 (50x) Supplement Soy acid hyrolysate Sigma S1674 (150 g/l = 100x) Sodium pyruvate Sigma P4562 (2.2 g/l = 100x) Fetal bovine serum Lonza ( 나) Vaccinia virus 접종 1 T-175 flask에서기존의배양배지를제거한후에 DPBS로 washing 해준다. 2 계산된 MOI 0.1로 vaccinia virus infection 한다 o C incubator (5% CO 2 ) 에서 2시간동안 incubation 한다. 4 2 시간후에, Serum free 배지를 35 ml 첨가한다. 이때, 배지내에 supplement 첨가한다 o C, 5% CO2에서약 48~72 hr incubation 하면서 cell 을관찰한다. 6 Cell이바닥에서약90% 이상떨어졌을때, Harvest 한다. ( 다) Vaccinia Virus 회수 1 세포가플라스크바닥에서 80 ~ 90 % 정도떨어지면, freezing (- 70 o C) & thawing (37 o C) 을 2 번반복한다. 2 3 배양액을멸균된 tube 에모은후, 2000 rpm 에서약 5 분간원심분리한다. 원심분리한상층액을다시멸균된 tube 에모은다. ( 라) Vaccinia Virus Plaque assay

20 1 Vero cell을 6-well plate에 well당 5.0E + 05 cells/ml의농도로 2 ml씩 seeding 한다. ( 즉 1.0E+06 cells/well) 시간후에세포가 dish 바닥을거의메워자라면, 바이러스용액을준비한다. 3 바이러스용액을 EMEM + 1% FBS 배지에 10-1 ~10-8 까지계단희석을하여접종액을준비한다. 4 6-well 에서배지를걷어낸후, DPBS로 2번 washing 한다. 5 DPBS가 well 에남아있지않도록완전히걷어낸후, 희석한바이러스용액을희석배수대로 0.2 ml / well 씩넣어준다. 6 세포전체에골고루퍼지도록잘흔들어주고, 37 C incubator에 90 분간배양한다. o 7 8 배양하는동안 15~20 분마다한번씩흔들어서골고루퍼지도록한다. o 2x MEM ( + 2% FBS) 는 37 C 항온기에, 1% Agarose (Seaplaque agarose) 는 52 o C 항온기에미리넣 어온도를맞춘다 분후에, well 에서바이러스용액을제거한후, 2X MEM과 1% Agarose를 1 : 1로섞어 2 ml / well 씩분주한다. Final Conc. = 0.5% Seaplaque agarose + 1x MEM + 1% FBS 10 Agar의농도가약하므로잠시식힌후 plate를 37 C incubator 에넣고배양한다 일후에, agar 를제거한후, staining solution으로 1 시간염색한다. 12 Staining solution 제거한후, PBS로 washing 한다. o 상온에서말린뒤, plaque를 count 한다. 아래의식으로 titer 를계산한다. P1+P2+ Pn PFU/ml = Dilution x x N V P = number of plaques counted in all well at this dilution N = number of well V = volume inoculated in the well (in milliliters) Calculated Titer PFU/mL

21 (3) 실험결과 ( 가) Vaccinia virus #6를대상으로한배지최적화결과 국립보건원으로부터분양받은 vaccinia virus clone 6번을무혈청배지에 adaptation시키기위한 연구를수행하였다. 배지는 commercial 배지인 Provero-1을기본으로하여 supplement solution인 soy hydrate와 amino acid complex로이루어진 MEM 을첨가하여배양을하였다. Table 3과같이 Provero-1 만을사용한배지에서는 passage 1에서 7.8 x 10 6 의 titer 를보였으며, passage 2에서가 장높은 8.7 x 10 6 의 titier 를보였다. 그러나, passage가증가함에따라 titer가계속감소하여 passage 5 에서는 4.0 x 10 5 을나타내었으므로 provero-1만을사용한배지는 vaccinia virus의 propagation 에적합하지않은것으로판단하였다. 일반적으로 virus가 serum free media에 adaptation 되는과정에서 passage 초기의 titer 보다 2~3단계의 titer가감소를하고이후에 virus가 serum free media에적응을하게되면titer 가상승하게된다. Provero-1에 supplement solution을첨가하여 serum free media adaptation 연구를수행하였으며, soy hydrate와 MEM supplement를각각 1x와 2x 가되도록첨가하였다. Provero-1에 soy hydrate 1x 와 MEM 2x 를첨가하였을때, passage 7에서 virus titer는 1.0 x 10 7 까지상승하였으므로 serum free media에 adaptation 된것으로판단하였다. Adaptation을수행하는 passage를줄이기위하여 soy hydrate 를배지에서제외한후실험을실시하였다. Provero-1 배지에 MEM을 2x로첨가하였을 때 virus titer는 1.8 x 107에서시작하여 Passage 4에서 1.0 x 107 까지증가하였다. 이상의결과 를바탕으로하여, clone #6를 adaptation시키기위한 serum free media는 Provero-1에 MEM을 2x 로첨가한배지로선정하였다. (Table 3. Virus titer of vaccinia virus #6 clone. 4.0 x 10 7 pfu/ml ) Provero-1 Provero-1 + soy 1x + MEM 2x Provero-1+ MEM 2x Passage x x x 10 7 Passage x x x 10 6 Passage x x x 10 6 Passage x x x 10 7 Passage x x10 6 x Passage 6 x 6.0 x Passage 7-1.0x10 7 -

22 (Figure 4. Plaque assay of vaccinia clone #6 propagated in Provero-1.) ( 나) Vaccinia virus #7을대상으로한배지최적화결과 Vaccinia virus #7을 serum free media에 adaptation 시키기위해서 clone #6에사용하였던배지 조성을적용하였다. 그러나, #7은 provero-1만을사용한배지에서 passage 1부터 virus titer가매 우 낮아 측정 범위를 벗어났다. 이후에 table 4에 기술한 것과 같이 여러 배지와 다양한 supplement를적용하여실험을하였지만최고 virus titer는 10 4 정도로낮았기때문에 EMEM 배지를 사용한연구를더수행하였다. (Table 4. Result of vaccinia virus #7 titer. 2.8 x 10 7 pfu/ml) P P+S+M P+S+M+SP V V+S+M V+S+M+SP O O+S+M+SP P1 x 8.0 x 10 2 x 3.9 x x x x x 10 4 P2 - x x x x 1.2 x x x 10 4 P x x x 10 4 P x 3.4 x x 10 4 P x 3.6 x 10 4 P x Cf) * P : Provero-1, * P+S+M : Provero-1 + Soy hydrolysate + MEM 2x * O : Opti-Pro

23 * O+S+M : Opti-pro + Soy hydrolysate + MEM 2x * P+S+M+SP : Provero-1 + Soy hydrolysate + MEM 2x + Sodium pyruvate * O+S+M+SP : Opti-pro + Soy hydrolysate+ MEM 2x + Sodium pyruvate *V:VP-SFM * V+S+M : VP-SPM + Soy hydrolysate+ MEM 2x * V+S+M+SP : VP-SPM + Soy hydrolysate+ MEM 2x + Sodium pyruvate *x:titer 가나오지않음, *-: 실험을더이상수행하지않음 Clone #7을 serum free media에 adaptation 시키기위해서 EMEM-SF배지에서배양하면서여러가지 supplement 를적용하였다(table 5). EMEM-SF 배지에서는 passage 5에서 CPE 가보이지않았고, plaque assay 결과 plaque 가보이지않았으므로, 더이상실험이불가능하였다. EMEM-SF + Supplement mixture를첨가한배지에서는 passage 5까지는 titer가증가하지않았으나 passage 7에서 7 x 10 5 으로증가하였다. 이러한결과를바탕으로하여 EMEM-SF 배지에 supplement complex를첨가한배지를 #7의 serum free media 로선정하였다. Passage 7 을 scale-up 하여 Research working cell bank vials을만들었으며 Titer는약 7.0 x 10 5 이고약 750 vials 을제조하였다. Passage 6의 vaccinia virus(3.0 x 10 5 pfu/ml) 를 DMEM/F-12 배지에서키워본결과 titer가감소한것을확인할수있었다. 그러므로 Vaccinia 후보주 clone #7의무혈청배지로의적응화는 EMEM-SF + Supplement mixture 배지가가장적합하다. (Table 5. Result of vaccinia virus #7 titer propagated in EMEM-SF medium and supplement solution. 2.8 x 10 7 pfu/ml) EMEM-SF EMEM-SF+ Soy + MEM2x + Pyruvate DMEM/F12 + Soy + MEM2x + Pyruvate P1 2.0 x x P2 1.5 x x P3 2.0 x x P4 1.0 x x P5 x 1.4 x P6-3.0 x 10 5 EMEM-SF + supplement p6 P7-7.0 x x 10 5 P8-7.0 x x 10 4 cf) EMEM-SF 배지를사용하고 supplement Mixtur로서 Soy hydrolysate(1x) + Sodium Pyruvate(1x) + MEM AA (2x) 를사용하였다. X : titer가나오지않음 - : 실험을수행하지않음

24 2) Cell factory를이용한scale-up 무혈청배지의선별을위한시험을수행한후대량의 vaccinia virus를얻기위하여 cell factory 를이용한배양을실시하였다. T-175에서배양한 cell을 cell factory에 scale-up 하여배양하였으며, cell이 confluent하게성장한후 virus를 MOI 0.1 에맞추어감염시켰다. Taget 후보주인 #7 clone은 T175에서수행한 adaptation 시험과동일한 titer 를보였으며, cell factory에서얻어진 virus를사용하여 virus bank 를제조하였다. (Figure 5. Cultivation of vero-cell on serum free media in T-175 and cell factory-2) Virus의 propagation을무혈청배지에서수행하기위해서는 host cell line을먼저무혈청배지 에 adaptation 시켜야한다. 본연구에서는선행연구를통해서, 무혈청배지에 adaptation 된 vero cell-line 을확립하였으며, 본 vero cell line은 5 L bioreactor에서 microcarrier를활용 한 culture에서도그안정성이확인된 cell line 이다. 상기에서기술한 cell line을 vaccinia virus의 adaptation을위한 host cell line으로사용하 였다. T175에서 adaptation된 vaccinia virus clone을 cell factory 2개에서배양된 vero cell line에 infection 하였을때도 #7이 7 x 10 5 titer 를보였다.

25 제 3 절연구용 cell bank 및 virus bank의특성분석 무혈청배지에적응된 vero cell과 vaccinia virus clone을사용하여연구용 cell bank 및 virus bank를 구축하였으며, master cell bank와 working cell bank 에대해서확인시험, 순도시험, 무균시험등을수행하 였다. 또한, master virus bank와 working virus bank 에대해서확인시험, 무균시험, 감염력, mycoplasma 부정시험을실시하였다. 1. Cell bank 특성분석 가. Master Cell & Working cell 확인시험 Animal cell 배양시에다른세포의오염이발생하는경우가발생하므로, cell bank에대한확인시험은 cell bank characterization 의필수항목이다. 몇몇경우에있어서정상적으로성장한세포에서도타세 포의오염여부를육안으로관찰할수있는경우가있으나, 대부분의경우타세포의오염여부를육안으 로확인하기는사실상불가능하다. 그러므로, 핵형분석, DNA fingerprinting법또는동종효소분석법을 사용한확인시험이필요하다. 핵형분석시험이나 DNA fingerprinting 법은비용이많이들고, 시간이오래 걸리며, 대조군을사용한시험이힘들기때문에, 이중동종효소분석법이가장일반적으로많이사용된 다. 동종효소는종에따라독특한전기영동 pattern을보이는데다른종류의세포가오염되었을경 우다른전기영동양상을보이는동종효소가나타나고이로써오염여부를판단하는시험방법이다. (1) 실험재료및방법 ( 가) 검액처리 1 Cell Harvest 2 수확 T-175 플라스크에 confluent 하게세포가자라면배지를제거한다. 3 DPBS 를이용해서세척하고제거한다 o C Pre-warming된트립신용액 2 ml을 T-175 플라스크에넣는다 약 20~30 초간접촉한후에플라스크벽면을때려세포를배양면에서떼어낸다. 세포가떨어지면 10 % FBS 가포함된배지를이용하여트립신활동을중화시킨다. 세포를15 ml 원심튜브에넣고 1300 rpm 에서 5 분간원심분리한다. ( 이과정의목적은원심분리하여세포와트립신을분리하는것이다. 원심분리후상등액은제거한다. ) 8 DPBS 10 ml을첨가하여 suspension 한다 다시 1500 rpm 에서 5 분간원심분리한다. 상등액은최대한제거하여버리고 cell pellet 만을세포용해에이용한다. ( 세포의용해에 stabilizer 를사용하므로완벽하게상등액을제거할것) ( 나) Cell lysis 1 Cell pellet 과동량의cell extraction buffer로 suspension

26 (15분이상으로 cell lysis 시간이필요하면 ice 상태에서할것) 2 세포가완전히 lysis 되지않았다면 pipetting 한다.--> crude extract ( 거품이생기지않도록주의할것) 3 Crude extract를 3400 rpm, 4 o C 에서10 분간원심분리하여상등액을모은다. ( 다) 방법 1 Kit 내에포함된 stabilizer (cat # R-578) 를 1 ml 의탈이온수에녹인다. 2 상기과정에서얻은상등액에동량의 stabilizer 를첨가한다. ( 라) 예비활성측정 1 0.1M SAB buffer 2.5 ml에 enzyme reagent 을녹인다. 2 3 녹인 enzyme reagent는상온에보관시 30 분, 얼음에보관시 3 시간안에시험을마쳐야한다. 1.5 ml tube 12 개를준비하여검체와맹검으로구분하여각기질 (6 종) 에맞게표시한후각기 질을 100 ul 씩분주한다. 4 준비된 Eppendorf tube를 37 C o 수조에서약 23 min 배양한다 5 6 정확히10min 뒤에 Quench-A-zyme 시약을넣은후즉시혼합한다. 맹검에대하여 565 nm 에서 5 종기질의흡광도값을측정한다. 측정은 30 내에이루어지도록한다. 7 측정후효소의활성도를확인하여다음의범위에들지않으면범위에들도록시료를준비한다. ( 농도가묽은경우는농축하고농도가진하면효소안정제로희석한다) Enzyme NP(Nucleoside phosphorylase) G6PD(Glucose-6-phosphate Dehydrogenase) MD(Malate Dehydrogenase) MPI (Mannose Phosphate Isomerase) PEPB(Peptidase B ; Leu-gly-gly) AST(Aspartate Aminotransferase) LD (Lactate Dehydrogenase) 최대활성 최소활성 A565 IU/L A565 IU/L ( 마) 전기영동 1 라벨의검체의이름을쓴다. 2 전기영동필름에라벨을붙인다. 3 플라스틱커버를필름으로부터제거한다. 4 Well 에표준액과비교액및검체를넣는다. 팁으로인하여젤에손상이가지않도록주의하며 검체는 1ul 넣도록한다.

27 5 아가로즈겔필름을전기영동장치에넣는다 Volts에서 25 분간실시한다. ( 정확하게시간을지킬것) 7 반응시약은사용하기직전에 0.5 ml의 DPBS 에녹여둔다. 8 전기영동이끝난아가로즈의물기를제거한다. 9 8번과정을하는동안 enzyme reagent를 500 ul 의멸균이온수로녹인다. 10 Enzyme reagent를 3 회에걸쳐잘발라준다. 11 필름을미리가온한배양접시에넣고, 37 o C에서 20 분간반응한다 ml의 DPBS 에겔을넣고교반기를이용해서반응시약을잘씻어낸다. 13 겔을드라이어로말린다. 단겔이녹지않도록 65 C 를초과해서는안된다. o (2) 실험결과 동종효소분석법으로분석한결과그림과같은결과를얻었으며, malate dehydrogenase, mannose phosphate isomerase 및 aspartate aminotransferase 모두에서 authentic sample과동일 한 pattern 을보였다. (Figure 6. Cell line characterization by specific enzyme identification using Innovative Chemistry Authentikit. MD : malate dehydrogenase, MPI : mannose phosphate isomerase, AST : aspartate aminotransferase) 표준품과대조군의전기영동에서의이동거리와시료의이동거리의비율로판정을한결과동일

28 한 cell 에서유래한동종효소임을확인하였다. 이러한결과를바탕으로하여, 본연구에서구축 한 master 및 working cell bank 가 vero cell line 임을확인하였다. 나. Master cell bank & Working cell 무균시험 Cell bank 에타균이오염되었는지를확인하는시험으로서, cell bank와 virus bank 뿐만아니 라일반적인생물학적제제의시험항목에는반드시포함되어야하는필수항목이다. 본연구에서 는대한약전의무균시험법에따라아래표와같은시험을실시하였으며, master cell bank와 working cell bank 모두에서균의성장이없는것을확인하였다(table 6). ( Table 6. Sterility test of master cell bank and working cell bank ) FTM medium SCDM medium RMCB 균성장없었음균성장없었음 RWCB 균성장없었음균성장없었음 양성대조군 Clostridium sporognesis (ATCC #11437) Bacillus subtilis (ATCC #6633) Candida albicans (ATCC #310231) Aspergillus niger (ATCC #16404) 음성대조군 D.W : 균성장없었음 D.W : 균성장없었음 다. Master cell & Working cell 마이코플라즈마부정시험 가장작고간단한원핵생물의한종류인마이코플라스마 ( Mycoplasma) 는제한적인생합성기능 을가지고있기때문에필요한많은영양분의공급을숙제세포에의존한다. 마이코플라즈마는배 양배지내에있는영양분들을소비해버리기때문에, 오염된세포는성장속도가저하되고유전자 발현을포함한세포내여러반응들이변하게된다. 따라서배양중인세포에서마이코플라즈마의오 염여부를확인하는것이중요하다. 오염의확인은배양법과형광염색법으로가능하다. 이중배양법 은고체와액체배지를이용하여마이코플라즈마를적당한수로키워서검체의오염여부를확인하 는시험법이다. 그러나, 마이코플라즈만의특성상지금까지알려진확인방법들은시간이오래걸 리거나결과의해석이명확하지않은등의단점들을가지고있다. 본실험에서는 Cambrex사의 Mycoplasma detection용제품인 MycoAlert (R) ( 제품번호: LT07-11) MycoAlert (R) Assay Controls Set ( 제품번호: LT07-518) 제품을사용하였다.

29 (1) 실험재료및방법 ( 가) 사용하기전에시약들을상온에미리꺼내둔다. ( 나) MycoAlert Assay Buffer를이용해서 MycoAlert Reagent와MycoAlert Substrate 를녹인다. 녹인후, 상온에서 15 분동안방치한다. 이때, MycoAlert Assay Controls Set을같이 준비한다. ( 다) 실험샘플을준비한다. 세포배양액을 2 ml 채취해서 1500 rpm에서 5분간 centrifuge 수행한다. ( 라) 원심분리후, 100 ul의상층액을luminometer cuvette/tube 로옮긴다. 이때, 음성대조 (Negative Control) 와양성대조(Positive Control) 를함께준비한다. ( 마) 실험에사용한 Luminometerfmf 1 second intergrated readingd 으로맞춘다. ( 바) 실험샘플, 음성대조, 그리고양성대조가들어있는각각의 luminometer cuvette/tube에 100 ul 의 MycoAlert Reagent 를첨가한후, 5 분동안상온에서반응시킨다. ( 사) 5 분동안의반응이끝나면, 각 cuvette/tube를차례로 luminometer 에넣고 [Reading A] 값을 측정한다. ( 아) 각 cuvette/tube에 100 ul의 MycoAlert Substrate 를첨가한후, 10 분동안상온에서반응시킨 다. ( 자) 10 분동안의반응이끝나면, 각cuvette/tube를차례로 luminometer 에넣고 [Reading B] 값을 측정한다. ( 차) 아래의식으로계산한다. Reading B/ Reading A > 1 : Reading B/ Reading A < 1 : 양성 음성 ( 카) 측정한 Reading A와 Reading B 값의비율 (Reading B/ Reading A) 은실험샘플이 mycoplasma에 오염되었는지확인하기위해서이용된다. 이비율이 1 이하면음성(Negative), 1 이상이면양성 (Positive) 으로판정한다. (2) 실험결과 아래표에 mycoplasma detection kit 를이용한시험결과를나타내었다. Mater Cell bank와 Working cell bank의분석결과 reading B와 reading A 값의비율이각각 0.22와 0.21 의수치를보였으며, 이값은음성 판정기준인 1 보다낮으므로본연구에서구축한 master vero cell bank와 working vero cell bank는 mycoplasma 에오염되지않았음을확인할수있었다 (table 7).

30 (Table 7. Result of mycoplasma detection assay using MycoAlert(R) for master and working vero-cell bank ) Sample Reading A Reading B Reading B/ ReadningA Negative Control Positive Control Master Cell Working Cell Vaccinia virus bank 특성분석 가. Master Virus & Working Virus 확인시험- 전자현미경관찰 Vero cell 에감염된 vaccinia virus의형태를관찰하기위하여 SEM 사진을촬영하였다. Vaccinia virus 로 vero cell을감염시킨후전자현미경관찰을위하여 cell pellet 을얻었으며, 전처리후에전자현미경 으로배율을조정하며관찰하였다. 본연구에서얻은 vaccinia virus particle 은그림 (c) 에서보이는것 처럼 vaccinia virus 의전형적인형태인도넛모양을보였다. 이것으로 master virus bank 및 working virus bank 가 vaccinia virus 임을확인하였다. (Figure 7. Electron microscopic picture of vaccinia virus particle in Vero cell)

31 나. Master Virus & Working Virus 무균시험 Cell bank 에타균이오염되었는지를확인하는시험으로서, cell bank와 virus bank 뿐만아니라일반 적인생물학적제제의시험항목에는반드시포함되어야하는필수항목이다. 본연구에서는대한약전의 무균시험법에따라아래표와같은시험을실시하였으며, master virus bank와 working virus bank 모두에 서균의성장이없는것을확인하였다 (table 8). ( Table 8. Sterility test of master cell bank and working cell bank. ) FTM medium SCDM medium RMCB 균성장없었음균성장없었음 RWCB 균성장없었음균성장없었음 양성대조군 Clostridium sporognesis (ATCC #11437) Bacillus subtilis (ATCC #6633) Candida albicans (ATCC #310231) Aspergillus niger (ATCC #16404) 음성대조군 D.W : 균성장없었음 D.W : 균성장없었음 다. Master Virus & Working Virus 마이코플라즈마부정시험 아래표에 mycoplasma detection kit 를이용한시험결과를나타내었다. Mater virus bank와 working virusl bank의분석결과 reading B와 reading A 값의비율이각각 0.22와 0.21 의수치를보였으며, 이값 은음성판정기준인 1 보다낮으므로본연구에서구축한 master vero cell bank와 working vero cell bank는 mycoplasma 에오염되지않았음을확인할수있었다(table 7). (Table 7. Result of mycoplasma detection assay using MycoAlert(R) for master and working virusl bank ) Sample Reading A Reading B Reading B/ ReadningA Negative Control Positive Control Master Cell Working Cell

32 라. Master Virus & Working Virus 감염력시험 본연구에서구축한 virus bank의감염력을시험하기위하여 vero cell에 virus titer를 MOI 0.5~ 까지변경하여감염시키고, infection 후 1일부터 4 일까지세포의변화를관찰하였다. 그림에서보는바 와같이MOI 0.1에서가장좋은propagation efficiency 를보였다. (Figure 8. Microscopic picture of infectivity experiment fo vaccinia virus against vero cell line. Cell line: Cell line : Vero ( p 108), Medium : EMEM Serum-Free, Supplement Soy acid Hydrolysate + MEM-AA + Sodium Pyruvate) 제장연구결과고찰및결론 4 본연구에서구축된 vero cell과 vaccinia virus bank는무혈청배지에서 adaptation 되었으며, vaccinia virus의경우무혈청배지에서의 propagation 과관련된문헌은거의보고되고있지않다. 또한, #6 clone 과 #7 clone의경우 mother virus cell에서연속계대를통하여동일한방법으로얻 은 atternuated virus 이기는하지만, #7은 natural mutation을통해서 20 kda이 deletion된 virus 로서본연구에서도 #6에비하여무혈청배지에서의 adaptation 이용이하지않았으며, #6와는다른 배지를통해서무혈청배지에서의 virus propagation 이이루어졌다. 이것으로 #6 와 #7은 vero cell 에침투되는 penetration efficiency 뿐만아니라, cell 내부에서 propagation 된후에 release되 는 mechanism 에도차이가있는것으로사료된다. 그러나, 다른연구에서확인된바에의하면 #6에

33 비해 #7 의독성이낮기때문에백신개발의후보주로서는 #7 이더좋을것으로판단된다[13]. 본연구결과무혈청배지에 adaptation 된 Master Cell Bank와 Working Cell Bank, Master Seed Virus Bank와 Working Seed Virus Bank 를제조하였으며, 향후백신개발을위한비임상시험의역가및독성시험용으로사용할수있을것이다.

34 제 5 장참고문헌 1) Janie Parrino, MD, and Barney S. Graham, MD,., Smallpox vaccines : Past, present, and future.(2006). J Allergy clin immunol. 118 (6) : ) Greenberg RN, Kennedy JS, Clanton DJ, Plummer EA, Hague L, Cruz J., Safety and immunogenicity of new cell-cultured smallpox vaccine compared with calf-lymph derived vaccine.(2005), Lancet 365 : ) Monath TP, Caldwell JR, Mundt W, Fusco J, Johnson CS, Buller M., ACAM2000 clonal Vero cell culture vaccinia virus (New york city board of health strain). (2004), Int J Infect Dis 8 (suppl 2) : S1-44 4) Weltzin R, Liu J, Pugachev KV, Myers GA, Coughlin B, Blum PS., Clonal vaccinia virus grown in cell cultures as a new smallpox vaccine. (2003). Mat Med (9) : ) Sung-Han Kim, Sang-Gu Yeo, Jae-Hyun Cho, Hong-Bin Kim, Nam-Joong Kim, Myoung-don Oh, Kang-Won Choe, Yungmee Jee, and Haewol Cho, Cell-mediated immune responsesto smallpox vaccination. (2006). Clinical and vaccine immunology (13) : ) Isabelle Leparc-Goffart, Bertrand Poirier, Daniel Garin, Marie-Helene Tissier, Florence Fuchs, Jean-Marc Crnace, Standardization of a neutralizing anti-vaccinia antibodies titration method; an essential step for titration of vaccinia immunoglobulins and smallpox vaccines evaluation. (2005). Journal of clinical virology(32): ) El-Ad B, Roth Y, Winder A, Tochner Z, Lublin-Tennenbaum T, Katz E et al. The persistence of neutralizing antibodies after revaccination against smallpox. (1990). Journal of infectious diseases. (161): ) Katz JB, The effect of the virus-serum incubation period upon vaccinia virus serum neutralization titers. (1987). J Biol Stand. (15): ) Leparc-Goffart, Poirier B, El Zaouk A, Tissier M-H, Fuchs F., New generation of cell culture assay for smallpox vaccine potency. (2003). J Clin Microbiol. (41): ) Joklik, W.K., The purification of four strains of poxvirus.(1962). Virology. (18): ) Sampath, G., Reddy, S.V., Rao, M.L., Rao, Y.U., Palaniappan, C., An immunogenicity study of a newly introduced purified vero cell rabies vaccine(abhayrab) manufactured in India. (2005). Vaccine(23): ) Sun, M.B., Jiang, Y.J., Li, W.D., Li, P.Z., Li, G.L., Jiang, S.D. Liao, G.Y., A novel process for production fo hepatitis A virus in Vero cells grown on microcarriers in bioreactor. (2004). World J. Gastroenterol. (10): ) Kutinova L, Ludvikova V, Simonova V, Otavova M, Krystofova J, Hainz P, Press M, Kunke D, Vonka V., Search for optimal parent for recombinant vaccinia virus vaccines. Study of three vaccinia virus vaccinial strains and several virus lines derived from them(1995). Vaccine. (13):