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1 제 1 장제 23 장 장알균감염증 장알균 (Enterococcus) 은위장관과비뇨생식계에상재하는통성혐기성그람양성알균으로비교적독성이약하여정상인에서는질병을일으키지않으나노인이나면역저하환자, 만성기저질환자또는병원에입원중인환자에서요로감염, 창상감염, 균혈증등의각종기회감염증을유발한다. 또한장알균은페니실린과세파로스포린계등여러항균제에다제내성을나타내고, 최근 glycopeptide계인반코마이신내성장알균 (vancomycin-resistance enterococci, VRE) 이증가하면서병원내주요감염균으로대두되고있다. 병원체 장알균은 group D streptococcus로분류되었다가 1980년대에 DNA 상동성, 16S rrna 유전자염기서열분석, 단백질분석및표현형특성의차이점에기초하여 Streptococcus 균속에서분리하여장알균 (Genus Enterococcus) 속으로분류되었다. 장알균속에는 E. faecalis, E. faecium, E. durans, E. casseliflavus를포함하여약 19가지종이보고되고있으며임상적으로는 E. faecalis, E. faecium이중요하다. 형태는통성혐기성그람양성알균으로직경이 0.6~1.0 μm인구형또는난원형이며, 짧은연쇄상배열을하고있다. 거의모든자연계에생존하며토양, 음식, 물, 동물, 새, 곤충 296 감염병실험실진단제 1 부세균질환

2 에서분리된다. 동물과사람모두장관계에주로분포되어있고다음으로비뇨생식기등에상재균으로존재한다 [13]. 배양및성상으로혈액한천배지에서발육되는집락은크기가 0.75~2 mm이고회백색이며, 둥글고약간반구형형태이다. 또한 α-용혈, β-용혈, γ-용혈을생성하는데대부분 γ-용혈로비용혈성이다. 배양온도는 10~45 범위이며, 최적온도는 37 이고 60 에서도 30분간생존할수있다. 또한 ph 9.6과 6.5% NaCl에서성장이가능하고 40% bile salts 존재하에서 esculin을분해하며일부균종에서운동성이관찰된다. 대부분의장알균은 pyrrolidonyl arylamidase (pyrrolidonase [PYRase]) 을생성하여 pyrrolidonyl-β-naphthylamide (PYR) 을가수분해하며, 또한 leucine aminopeptidase (LAP) 를생성하여 leucino-β-naphthylamide를가수분해한다. 거의모든균주는당을발효하나가스는생성하지않으며대부분 glycerol teichoic acid 항원을가지며 DNA의 G+C 함량은 37~45 mol% 이다 [9]. 장알균은양혈액 5% 가함유된혈액한천배지에서잘발육한다. 임상검체에서장알균분리를위한선별배지로는 bile-esculin이함유된 Enterococcosel TM agar (BBL; Becton Dickinson Microbiology System, USA) 를이용하는데장알균은 esculin을가수분해하여흑색집락으로성장한다. 또한 Columbia colistin-nalidixic acid agar (CNA) 이나 phenylethyl alcohol agar (PEA), potassium tellurite blood agar에서도잘분리된다. Gelatin 액화양성, lactose 분해, maltose 분해, sucrose 분해, mannitol 분해, salicin 분해등의성상을나타낸다 [4~6]. 임상증상 장알균은장내상재균으로정상인에서는쉽게발병하지않으나만성질환자또는병원에장기입원환자에서기회감염증을일으킨다. 장알균에의한감염증중요도감염이가장빈번하여병원내요도감염의 16% 에달하고다음으로창상감염이흔하며분리균은혼합감염형태이다. 균혈증은병원내감염으로자주발생하는데대부분기저질환을가지고있는노인환자, 면역기능저하환자, 장기간입원으로항생제치료를받은환자에서발생하고장알균에의한심내막염의경우는세균성심내막염의 5~20% 에해당된다. 반코마이신내성장알균에의한감염증은장기간입원으로인한여러항생제치료 제 23 장장알균감염증 297

3 및반코마이신장기투여환자에서주로발생하는데악성종양, 혈액질환등을치료할목적으로항암제나면역억제제를투여한경우더높은빈도로발생한다. VRE 균혈증이있는경우는사망률이 67% 로대조군에비하여 2~3배더높은것으로보고되었다. 임상검체에서분리되는균종분포에서는 E. feacalis가임상분리주의 80~90% 로가장많으며, E. faecium의경우에는 5~10% 에해당되지만상대적으로높은항생제내성을나타내면서분리빈도가급증하고있으며임상적으로도그중요성이부각되고있다. 이외 E. gallinarum, E. casseliflavus, E. durans, E. avium, E. raffinosis의분리빈도는 5% 이내이다. 검체별분리빈도에서는소변에서분리율이가장높으며, 다음으로객담, 농, 기관분비물, 담즙등이다 [4, 5]. 역학 장알균은특히장관계에장알균을보균하는환자등병원구성원의손을통해다른환자에게전파되고때론기구에의한전파도일어난다. 환자에서가장흔한감염부위는요로, 상처, 담즙관, 혈류등이다. 신생아에서는수막염혈류감염을일으키고성인에서도심내막염을일으킨다. 복강내상처, 요로감염등에서는장알균이다른균과같이배양되기때문에장알균의병원성을명확히설명하기는어렵다. 1980년대이후항생제사용이증가함에따라이들약제에내인성내성을가지는장알균이병원내감염의중요한원인균으로부각되었다. 이러한장알균감염증치료에효과적이던반코마이신에고도내성을나타내는반코마이신내성장알균이 1986년영국과프랑스에서처음으로보고되었고, 1988년미국에서분리된이래유럽, 미국이외에싱가포르, 일본, 우리나라등세계각지에서보고되고있다. 미국의경우원내감염을일으킨장알균중 VRE의비율이 1989년 0.3% 였으나 1993년에는 7.9% 로증가하였으며중환자실환자에서는 13.6% 로높게보고되고있다. 우리나라의경우 VRE는 1992년 E. durans에서처음보고되었고, 1995년에 E. faecium에서반코마이신내성이보고된이후병원내에서 VRE 분리률이지속적으로증가하고있다 [1, 8, 11]. VRE 감염증을유발하는위험인자로는제3세대세파로스포린의투여, 반코마이신의투여, 장기간의입원, 심한기저질환, 면역저하, 수술후요로또는혈관내카테터를장착하고있는경우등으로알려져있다 [10, 12]. 또한 VRE는오염된병원환경또는의료진을통하여다른환자들에게쉽게전파되는데특히병원장기입원환자, 집중치료실등고위험군으로확산가능성 298 감염병실험실진단제 1 부세균질환

4 이높다. vana, vanb형 VRE는반코마이신에고도내성을가지며또한 vana, vanb 내성유전자가다른세균으로전달이가능하기때문에이들 VRE의치료및관리는매우중요하다. 예방및관리 일반적인장알균감염증보다는반코마이신내성장알균에대한예방조치가중요하게인식되고있는데 VRE의예방을위해서는감염관리프로그램운영을권장하고있다. 즉, 반코마이신의남용을억제하기위하여사용지침을준수하고, 병원내환경의청결, 의료진의손씻기와장갑착용등을주지시키고이와관련된교육을실시하고, 중환자실등병원환경에대한정기적인 VRE 실험실감시를실시한다. 미국 CDC에서는 VRE 감염또는장착환자에대하여환자격리를권장하고있다. 환자와접촉하는의료진의수를제한하고반드시장갑을착용하도록하며, 의료기기는환자마다따로사용하며, 새로운 VRE 환자가발견되었을때는같은병실환자에대한배양검사를실시하여 VRE 정착여부를확인한다. VRE 환자가퇴원한경우에는소독후환경표면의배양검사를추천하고있다. 실험실진단 1. 검체채취및보존 장알균의검체채취및수송은일반적인방법에따른다. 분리된균부는동결건조하거나 10% glycerol 또는 10% skim milk, 피브린이제거된양또는토끼혈액이포함된 Brain infusion broth에균량을많이접종하여보관한다. 1) 장알균분리수송배지에들어있는분변및장분비물검체균을 Enterococcosel TM (BBL, Becton Dickinson Microbiology System, USA) 선택배지에도말하여 35 에서 24시간배양한후흑색집락을선별한다. 그후선별된집락을 5% 양혈액이함유된 Tripticase soy agar (TSA) 에재접종하여 35 에서 24시간배양한후성장한균주에 제 23 장장알균감염증 299

5 대하여 6.5% NaCl broth, 40% bile agar에서성장유무, MGP (Methyl-α-Dglucopyranoside) 산화검사와색소형성능검사등을실시하여장알균을분리한다. MGP 산화검사는 phenol red broth base에 1% MGP를첨가하여 35 에서배양하면서 1일과 2일째관찰하여황색으로변하면양성으로판독한다. 2) 장알균배양및특성장알균배양에는 Trypticase Soy-5% 양혈액한천배지, brain heart infusion-5% 양혈액한천배지나기타다른혈액배지를사용한다. E. faecalis의일부균주는토끼, 말, 사람혈액에서는 β-hemolysis를일으키나양혈액에서는 β-hemolysis를일으키지않는다. E. durans는혈액종류와관계없이 β -hemolysis를일으키며배양온도는 35~37 이고일부균주는 CO 2 농도를증가시키면더잘자란다. 배양할검체에그람음성균이있으면 BE azide, Pfizer selective enterococcus 등 azide가포함된배지가일차분리배지로좋다. 이외에최근에는감별능력이높은기질이포함된배지가일차선택배지로사용되고대변검체처럼심하게오염된검체에서 E. faecium 만을감별분리할때는 cephalexin- aztreonam-arabinose agar가사용되고있다. 카탈라제음성그람양성알균인장알균중주로사람에서분리한균의표현형적특성은표 1과같다. 3) 생화학적시험에의한균종동정장알균은 mannitol과 sorbose로부터산생성능, arabinose의가수분해등주요표현형적시험에따라동정한다 [3]. E. faecalis, E. faecium, E. casseliflavus, E. gallinarum, E. muandtii는 mannitol 로부터산을생성하고 arginine을가수분해하나 sorbose로부터산을생성하지는않는다. 비정형균주는 arginin 등분해하지못하거나 mannitol로부터산을생성하지않는다. E. casseliflavus와 E. gallinarum의비운동성변이주는 MGP로부터산생성능으로동정을하고 E. faecium과 E. mundii는산생성능이없다. E. avium은 mannitol과 sorbose, arabinose, sorbitol로부터산을생성하나 arginine을가수분해하지는않는다. E. durans, E. hirae는 arginins을가수분해하나 mannitol과 sorbose로부터산생성능은없다. 300 감염병실험실진단제 1 부세균질환

6 표 1. 장알균의균종에따른생화학적특성 특성 E. faecalis E. faecium E. casseliflavus E. gallinarum E. durans Hemolysis -/β α/- α/- β -/α/β Growth at ; % NaCl % bile agar Motility Yellow pigment Hydrolysis of ; aesculin arginine Fermentation of ; pyruvate ribose mannitol arabinose sorbitol + d raffinose - d Acid formation in MGP b ) PCR 동정 PCR에의한장알균의균종동정은표 2와같이각균종별특이 primers를이용하여수행한다. 제 23 장장알균감염증 301

7 표 2. 주요장알균의균종동정에사용되는 primer 균종표적유전자 Primer (5 3 ) 산물크기 (bp) E. faecalis ddl E. faecalis ATCAAGTACAGTTAGTCT ACGATTCAAAGCTAACTG E. faecium ddl E. faecium GCAAGGCTTCTTAGAGA CATCGTGTAAGCTAACTTC E. gallinarum vanc1 E. casseliflavus vanc2 GGTATCCAAGGAAACCTC CTTCCGCCATCATAGCT CTCCTACGATTCTCTTG CGAGCAAGACCTTTAAG ) 상품화킷트와분자생물학적방법에의한동정장알균동정에는여러가지수동, 반자동, 자동시스템이있다. 장알균동정에는 API 20S, API rapid ID32 STREP systems (biomerieux, Hazelwood, Mo.), Crystal Gram-Posive and Crystal Rapid Gram-positive 동정시스템 (Becton Dickinson Microbiology Systems) 과 Vitek (biomerieux) 의 Gram positive identification card 와 MicroScan Walk Away system (Dade Microscan, West Sacramento, Calif.) 의 Gram-Positive Identification panel이이용되고있다. 일부동정시스템은 80% 정도가일치하고있으나정확도는균종분포에따라차이가있다. 분자생물학적방법으로는 DNA-DNA hybridization과 16S rrna 유전자염기서열분석등이있는데주로특정실험실에서분류학적목적으로많이사용하고있다. 분자생물학적방법은 SDS-PAGE 에의한 whole- cell protein (WCP) profile 분석, vibrational spectroscopic analysis, RAPD, 16S rrna fragment length polymorphism analysis, 16S rrna의 broad-range PCR, 23S rrna 유전자의 domain V의 sequencing, trna나 rrna intergenic spacers, D-Ala:D-Ala ligases (ddl), 반코마이신내성유전자분석등이다. 특히 WCP-profile의 SDS-PAGE 분석은종특이적이고장알균의정형, 비정형균을구별할수있어균종동정에추천되고, 16S rrna 유전자의염기서열분석은모든장알균에적용이되며 GenBank를통해비교가가능하다 [9, 13]. 302 감염병실험실진단제 1 부세균질환

8 6) 분자형별분석항생제내성을가진장알균의확산과병원내집단발생연구와특히 VRE의감염관리및역학조사를위한발생증가의관점에서분자생물학적형별분석은매우중요하다. 형별분석에최근분자생물학적기법을적용함으로서장알균의변별력을향상시키고역학적인관점에서중요한자료를제공함으로서환자중직 간접적으로접촉하여외부에서획득되는균주의증명이가능하여병원내전파나병원간확산을확인할수있다. 장알균형별분석에는 plasmid profile과 genomic DNA restriction enzyme analysis 과최근에는 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) 이나 counter-clamped homogeneous electric field electrophoresis에의한 chromosomal DNA restriction profile 등이사용되고있다. 이외에도장알균간에유전적연관성을보기위해 multilocus enzyme electrophoresis, ribotyping, RAPD PCR, repetitive-element sequence PCR 등이이용되고있다. 또한 PCR 산물의염기사열분석, RFLP가추가로쓰이고있다. 이들방법중현재 PFGE가가장신뢰성이높고변별력이좋은것으로알려지고있으나고가장비를갖춰야하고실험실간전기영동조건등이다를경우실험실간 PFGE 패턴비교가어렵다는것이제한점이다. 7) 항생제내성장알균에서주요문제는항균제내성이높고 E. faecium은 E. faecalis 보다높은내성을나타낸다 [6]. (1) 자연내성장알균은세파로스포린, penicillinase-resistant penicillin, monobactam에자연내성이다. 많은아미노글리코사이드의저도내성을, fluoroquinolone에중간내성에서내성을보이고페니실린과암피실린에대해서는 streptococci 보다 10~1000배정도감수성이낮다. 장알균은 β-lactam ( 암피실린 ) 에저해되나죽지는않는다. 장알균이본래내성인 aminoglycoside, aztreonam, cephalosporins, clindamycin, methicillin, trimethoprim-sulfamethoxazol 의표준농도에대해서는시험할필요가없다. 이들은시험관내에서활성이있어도임상적으로는유효하지않으므로감수성으로보고해서는안된다. 제 23 장장알균감염증 303

9 (2) 아미노글리코사이드에내성세포벽에활성이있는항생제 ( 페니실린이나반코마이신 ) 와아미노글리코사이드 ( 스트렙토마이신또는겐타마이신 ) 과의병합치료는심내막염과같은증증감염증치료에중요하다. 장알균이아미노글리코사이드에본래저도내성 (MIC < 500 μg / ml ) 을나타내지만세포벽에활성이있는항생제와병합사용하면감수성이상승한다. 그러나아미노글리코사이드에고도내성 (MIC > 500 μg / ml ) 균주는이런상승작용을기대할수없어장알균에의한중증감염증치료효과를예측하기위해서는겐타마이신과스트렙토마이신고농도에대한감수성시험이요구된다. (3) 반코마이신내성반코마이신에내성을나타내는장알균빈도가증가하면서장알균은반코마이신과아미노글리코사이드에대한감수성상승효과는없다. 반코마이신내성은대부분 E. faecium에흔하지만 E, faecalis에서도내성은일어난다. 반코마이신내성형중 VanA 형은반코마이신과테이코플라닌에고도내성을나타내고 VanB형은반코마이신에유도내성이나테이코플라닌에감수성이다. 반코마이신에중등도내성을보이는 VanC는 E. gallinarum (VanC-1), E. casseliflavus (VanC-2/VanC-3) 가있다. VanD 형은반코마이신에중등도내성, 테이코플라닌에는저도또는감수성을보인다. 테이코플라닌은반코마이신과유사성이높은글리코펩타이드계열로유럽에서는환자치료로사용하나미국에서는사용하지않는다. 반코마이신과테이코플라닌은펩티드글리칸전구체의 pentapeptide의 D-alanyl-D-alanine (D-Ala-D-Ala) 그룹과결합함으로서그람양성세균의세포벽합성을억제한다. vana, vanb vand는 D-Ala-D-Lac 을암호화하고반면 vanc와 vand는 D-Ala-D-Ser 을암호화한다. (4) β-lactamase 생성과 β-lactams 내성 enterococcal β-lactamase을암호화하는유전자가장알균에서는구성적으로발현되고있으나 S. aureus에서는유도적으로발현되고있다. 장알균은소량을생산하기때문에일상적인감수성시험에서페니실린과암피실린에감수성으로나타난다. 따라서 β-lactamase를검출하려면접종량을많이하거나 chromogenic cephalosporin 시험등으로검출하여야한다. 겐타마아신고도내성은보통 β-lactamase 생산을동반하고이들특성을암호화하는유전자는 conjugative plasmid에있고다른장알균으로전이가가능하다. (5) Trimethoprim-sulfamethoxazol (TMP-SMZ) 내성장알균은보통 in vitro에서 TMP-SMZ에감수성을보이나감염치료에는효과적이 304 감염병실험실진단제 1 부세균질환

10 지않은데이는장알균이생체내에서는 exogeneous folate을이용하여이들약제의억제를피할수있기때문이다. 8) 항생제감수성검사장알균중특히 VRE의항생제내성양상을확인하기위하여글리코펩타이드계항생제에대해서는최소억제농도 (MIC) 측정법을실시하고, 페니실린계등기타항생제에대해서는원판확산법으로검사한다. 항생제감수성검사의모든과정은 Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards (CLSI/NCCLS) 지침 [7, 14] 에따라수행한다 ( 감염병실험실검사 2003, 일반시험법 pp 191~216 참조 ). (1) 반코마이신내성장알균선별배양장알균에서반코마이신내성이증가하면서 VRE의선별분리의중요성이증가하고있으며 VRE 확산방지에는 VRE의조기진단이매우중요하다. 대변이나직장채변과같은검체에서 VRE 분리율을증가시키기위한선별증균배지로는 6 μg / ml반코마이신을첨가한 Enterococcosel broth (BE azide medium:becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) 를많이사용하고있다. 증균전후분변검체로부터 VRE 분리는 supplemented Columbia colistin-nalidixic acid broth에서증균후 6 ug/ ml반코마이신이포함된 Enterococcosel agar에서배양하는것이좋다. 역학적연구로환경에서 VRE 분리가필요한경우에는미리축축하게한면봉으로검체를채취하여증균배지나한천배지에접종하여 VRE를분리한다. E. faecalis와 E. faecium에서 VanA와 VanB 내성은내성유전자의이동이가능하고고도내성을나타내므로실험실에서 VRE를보고할경우의심되는 VRE 분리주의정확한진단이중요하다. (2) 반코마이신과테이코플라닌감수성시험반코마이신과테이코플라닌을각각 μg / ml에서 512 μg / ml까지의농도로 2배연속희석하여각농도를함유하는 Müller-Hinton agar (Bacto, Difco) 를제조한다. 0.5 McFarland 의 VRE균부유액을 10배희석한후항생제각농도별플레이트에 2 μl씩접종한후 35 에서 24시간배양후균성장의여부를관찰하여최소억제농도를결정한다. 제 23 장장알균감염증 305

11 (3) 기타항생제내성양상장알균의글리코펩타이드계이외의항생제에대한감수성을조사하기위하여암피실린, 클로람페니콜, 시프로플로삭신, 에리스로마이신, 리팜핀, 테트라사이클린등과아미노글리코사이드고도내성을확인하기위하여겐타마이신 (GM, 120 μg / ml ), 스트렙토마이신 (S, 300 μg / ml ) disc (BBL Sensi Disc ) 를사용한다. VRE는반코마이신에대한 MIC, 내성유전자형종류및유도능에따라 vana, vanb, vanc, VanD, VanE 및 vang 형으로분류된다. vanc VRE 중 E. gallinarum은 vanc-1, E. casseliflavus는 vanc-2로세분화된다. 표 2. 글리코펩타이드내성장알균의표현형적특성 특성 표현형 VanA VanB VanC VanD VanE VanG Vancomycin 64-1, , MIC ( μg / ml ) Teicoplanin MIC ( μg / ml ) 내성발현 획득내성 획득내성 자연내성 획득내성 획득내성 내성유전자 vana vanb vanc1, C2 vand vane vang 분리되는균종 E. faecalis E. faecalis E. asseliflavus E. faecium E. faecalis E. faecalis E. faecium E. faecium E. gallinarum E. asseliflavus E. gallinarum E. avium E. hirae E. durans (4) VRE 유전자형확인시험반코마이신내성장알균의 vana, vanb, vanc1, vanc2, vand, vane 등의반코마이신내성유전자형은 PCR 법으로검출확인한다. van 유전자각각의특징을확인하기위한 primer 제작은 GenBank의 M97297, AE016954, AF175293의염기서열을기초로 primer 는 vana (5 -atggcaagtcaggtgaagatgg, 3 -tccacctcgccaacaactaacg, 399 bp), vanb (5 -gatgcggaagataccgtggct, 3 -catcgccgtccccgaatttcaaa, 298 bp), vand (5 - tgcagccaagtatccggtaa, 3 -taaggcgcttgcatataccg, 461 bp) 를사용한다 [2, 3]. 306 감염병실험실진단제 1 부세균질환

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<B8F1C2F72E687770> 제1장 제17장 성홍열 및 사슬알균 감염증 사슬알균 (Streptococci)은 증식 중의 특징적으로 쌍 또는 사슬모양의 그람양성 알균 으로 catalase 음성, 통성혐기성균이며, 보통 한천배지에서는 발육이 어렵고 혈액이나 혈청 등을 첨가한 배지에서 잘 발육한다. 포도당이나 다른 탄수화물을 분해하나 포도당 을 분해하여 가스를 생성하지 않는다. 이들은 최소