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J. Fd Hyg. Safety Vol. 24, No. 3, pp. 262~266 (2009) Journal of Food Hygiene and Safety Available online at http://www.foodhygiene.or.

1 J. Fd Hyg. Safety Vol. 24, No. 3, pp. 262~266 (2009) Journal of Food Hygiene and Safety Available online at 기능성음료의곰팡이제어를위한천연항균제활성평가 이희석 연지혜 하상도 박철수 우문제 이상훈 김진수 이찬 * 중앙대학교식품공학과, 광동제약 Evaluation of Antifungal Activity of Natural Antimicrobials in Fuctional Beverage Hee-Seok Lee, Ji-Hye Yeon, Sang-Do Ha, Chul-Soo Park, Moon-Jae Woo, Sang-Hun Lee, Jin-Soo Kim, and Chan Lee* Department of Food Science and Technology, Chung-Ang University, Kwang-Dong Pharmaceutical Co., Ltd. (Received May 22, 2009/Revised June 0, 2009/Accepted June 25, 2009) ABSTRACT - Antifungal activity of seven natural antimicrobials, such as ε-polylysine, extract of Yucca shidigera, TLS (vitamin B derivative), BMB-FS, chitooligosaccharide, KDSP 00, and KDSP 002 were investigated for their applications in functional beverage. Five fungi including Aspergillus niger, Penicillium citrinum, Rhizopus oryzae, Fusarium moniliforme, and Mucor rouxii were applied as test fungi and mininum inhibitory concentrations (MICs) of antimicrobials were examined. TLS exhibited the strongst antifungal activity among tested antimicrobials and the growth of all fungi was inibited at 00 ppm. The antifungal activity of BMB-FS appeared different. The growth of Fusarium moniliforme was inhibited by BMB-FS at 00 ppm, but it exhibit antifungal activity on P. citrinum, and M. rouxii at 000ppm. MICs of TLS appeared to be 60 ppm for four test fungi except A. niger (00 ppm). These results indicate the possible usage of TLS and BMB-FS as natural antimicrobials in functional beverage. Key words: Natural antimicrobials, antifungal activity, fungi, functional beverage, minimal inhibitory concentrations (MICs) 식품산업의발전과식생활의간편화로각종가공식품이나인스턴트식품의섭취가늘어나고있으며, 가공식품의상품성과가치를높이기위해산업체에서 nitrite, sorbic acid, sodium metabisulfite와염소제등의식품첨가물를사용하는경우가많이보고되고있다 ). 식품첨가물을사용하는방법이외에도, 가공식품의저장기간연장을위하여가열, 초고압, 방사선, pulse electric fields 등물리적방법과알코올, 염소, 과산화수소, 천연물등화학적방법이식품보존방법으로사용되고있다. 식품에널리사용되는식품첨가물의 70% 이상이화학적으로합성된물질이라는사실은대부분의소비자들에게안전성에대해부정적인견해를갖게한다. 그렇지만보 2-4) 존료를첨가하여저장기간을연장한식품의시장은계속확대되고있으며, 음료시장에서도보존료의사용량은계속증가하고있다 5). 음료에는대부분합성보존료가첨가 *Correspondence to: Chan Lee, Department of Food Science and Technology, Chung-Ang University, Anseong , Korea Tel: , Fax: chanlee@cau.ac.kr 되며, 이들의안전성에대한논의가끊이지않고있다. 따라서안전한천연보존제의개발과이용에대한소비자들의요구가증대되고있으며, 다양한천연항균물질식품보존제연구가활발히진행되고있다. 천연항균물질들의 6-9) 연구는합성보존료의대체라는의미와소비자기피현상을유발시키지않으면서각종가공식품의저장성향상과안전성확보라는측면에서특히중요하다. 식품산업에사용되는천연항균물질로는, 동물이나식물에천연적으로존재하는특정단백질및효소류, 갑각류의키틴질에서추출한키토산, 유기산, 식물의정유 (essential oil) 및미생물에서유래된 nisin, ε-polylysine, natamycin 등이있다. 0) 최근고농도의비타민을함유한기능성음료의판매가증가하고있다. 기능성음료는일반적으로낮은 ph와높은당함량을나타내고있으며, 이같은특성으로일반세균보다곰팡이에의해오염될가능성이매우높다. 이연구에서는천연항균물질을사용하여곰팡이의생육을억제하여기능성음료의저장성을향상시키고자하며, 항균력을비교평가하여현장에응용가능한정보를제공하고자한다. 262

2 Evaluation of Antifungal Activity of Natural Antimicrobials in Fuctional Beverage 263 재료및방법 사용균주및배양사용된균주는 Aspergillus niger KCCM 240, Penicillium citrinum KCCM 69, Rhizopus oryzae KCCM 272, Fusarium moniliforme KCCM 403, Mucor rouxii KCCM 6046, 5종류의곰팡이로서한국종균협회 (Korea Culture Center of Microorganisms, KCCM) 에서분양받았다. 이곰팡이균주를 0% tartaric acid을이용하여 ph 3.5로보정된Potato Dextrose Agar (PDA, Difco, Detroit, MI, USA) 에접종하여 25 C에서 7일간전배양한뒤포자 o 를분리하였다. 분리된포자를 Potato Dextrose broth (PDB, Difco, Detroit, MI, USA ) 에접종하고 (0 5 CFU/mL) 25 o C, 50 rpm의조건으로 7일동안배양하였다. 곰팡이생장저해활성조사및최소저해농도 (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) 설정광동제약 ( 주 ) 에서제조하여시중에유통되는기능성음료 ( 주원료 : 액상과당 7%, 사과과즙 3%, 비타민 C 0.5%, 타우린 0.0%, 구연산 0.%, 정제수 ) 00 ml에천연항균제 (ε-polylysine( 폴리리신, 액상, 신승하이켐, 대한민국 ), 유카추출물 (Yucca(Yucca shidigera) extract, 분말, 데져트킹, 미국 ), TLS (Vitamin B 유도체, 분말, 신코, 일본 ), 복합황금추출물 (BMB-FS, 액상, 테코스, 대한민국 ), 키토올리고당 (Chitooligosaccharide, 분말, 혜전대학, 대한민국 ), KDSP 00( 폴리리신, 유카추출물, 3: 혼합 ) 과 KDSP 002 ( 폴리리신, 유카추출물, :3 혼합 )) 들을각각 00, 500,,000, 2,000 ppm의농도로첨가한후, PDB에서배양된 5 종류의곰팡이들의포자를 cheese cloth를통해분리한뒤, 0 5 CFU/mL씩접종하였다. 접종된시료들을 25 o C, 50 rpm 조건에서 7일간배양한뒤, Whatman filter paper No.4 (Whatman International, Maidstone, United Kingdom) 를사용하여균사체를분리하였다. 분리된균사체를건조하여건조균체량변화를조사하였으며, 건조균체량은 ++ : >.0 g/l, + : <.0 g/l, - : ND (Not Detected) 으로표시하였다. 대조군으로 0.05% 의안식향산나트륨 (Sodium benzoate) 를첨가하여항균력을비교하였으며조사된천연항균물질중활성이뛰어난물질을선별하여농도에따른활성의변화를통해최소저해농도를설정하였다. 결과및고찰 곰팡이생장저해활성조사및최소저해농도 (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) 설정낮은 ph(3.0 ± 0.) 와높은당농도 (2 ± 0.%) 특성을보이는기능성음료에서일반적으로부패혹은식중독세균은성장이불가능하며그에따른품질손상가능성은매 우적은편이다. 하지만곰팡이의경우일반세균이자라기에불가능한환경에서도성장이가능하며오염되면제품의상품성가치를떨어뜨리게된다. 조사된곰팡이 5종에대한천연항균제들의항균력은 Table 과같다. 7가지의천연항균물질중 A. niger, P. citrinum, R. oryzae, F. moniliforme, M. rouxii 모든곰팡이에대하여항균활성을보인물질은 vitamin B 유도체인 TLS이었으며, 00 ppm 이상의농도에서항균효과를나타냈다. 황금추출물인 BMB- FS는 F. moniliforme을상대로 00 ppm이상의농도에서성장저해활성을보였으나 BMB-FS는 P. citrinum와 M. rouxii 에대해서는상대적으로약한항균활성을나타내었다. 이추출물을,000 ppm이상의농도를처리해야만균사체성장이저해되기시작하였고, M. rouxii는 2,000 ppm에서성장을하지않았다. 조와김 (200) 은 BMB-FS가 500 ppm 이상에서 Bacillus cereus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus의성장을저해한다고보고하였으며 ), 이와서 (2005) 의연구에서도 BMB-FS은 Staphylococcus aureus, Shigella sonnei, Shi. flexneri, Salmonella typhimurium, Sal. enteritidis에대해서성장저해활성을나타냈다 2). 일반세균과달리곰팡이의성장을억제하기위해서는고농도의 BMB-FS가필요한것으로판단되었다. A. niger에대해서는 TLS만이강한항균력을나타내었으며 00 ppm에서도그효과가있는것으로관찰되었다. 키토올리고당의경우에는,000 ppm이상첨가되어야곰팡이들의균체량이감소되는 ( g/l이하 ) 것을볼수있었다 (Table ). 지 (2006) 는키토산이 Candida albicans와 Trichophyton rubrum에대해 50, 00 ng/ml의농도에서생육억제를나타낸반면, 키토올리고당은 00 ng/ml 이하의농도에서는생육억제활성을나타내지못했다고보고하였다. P. citrinum는 TLS와 BMB-FS 이외에유카추출물 3) 과키토올리고당을 2,000 ppm 첨가될경우 g/l 이하의균체량으로생육이저해되는것으로나타났다 (Table ). Jin 등 (2006) 은유카잎 MeOH추출물을.0% 함유한 PDA에 Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici, Botrytis cinerea 를배양시, 각균에대해 34.0%, 62.0%, 4.0% 의생육억제활성을나타냈다고보고하였다 4). P. citrinum와 M. rouxii 을상대로항균활성을보였던 BMB-FS경우 R. oryzae에대해서는항균활성을나타내지않았지만 TLS와함께키토올리고당이항균활성을보였으며그농도가,000 ppm 이상이였다 (Table ). F. moniliform의경우조사된 5종류곰팡이중가장다양한천연항균제로부터균사체성장의저해를보였다. TLS, BMB-FS뿐만아니라첨가농도가,000 ppm이상일경우유카추출물, 키토올리고당그리고 KDSP 002가항균활성을보였으며, 키토올리고당을 2,000 ppm 첨가할경우균체의성장을찾아볼수없었다 (Table ). 마지막으로 M. rouxii의경우 TLS와 BMB-FS

3 264 Hee-Seok Lee, Ji-Hye Yeon, Sang-Do Ha, Chul-Soo Park, Moon-Jae Woo, Sang-Hun Lee, Jin-Soo Kim, and Chan Lee Table. Antifungal activity of natural antimicrobials Strains Aspergillus niger KCCM 240 Penicillium citrinum KCCM 69 Rhizopus oryzae KCCM 272 Fusarium moniliforme KCCM 403 Mucor rouxii KCCM 6046 Concentration of natural antimicrobials (ppm) ,000 2,000 KDSP 키토올리고당 BMB-FS 유카추출물 KDSP 키토올리고당 BMB-FS KDSP 키토올리고당 BMB-FS 유카추출물 KDSP KDSP 키토올리고당 BMB-FS KDSP 키토올리고당 BMB-FS * 0.05% 안식향산나트륨 : - ++ : >.0 g/l, + : <.0 g/l, - : ND (Not Detected). 이외에 KDSP 00이항균활성을나타내었으며,,000 ppm 이상일경우균체량이 g/l 이하로조사되었다 (Table ). 대조군으로안식향산나트륨을 0.05% 첨가한시료에서는 5종류모든곰팡이의균체성장을살펴볼수없었다. 실험에사용된 7종류의천연물질중 vitamin B 유도체인 TLS가조사대상곰팡이에대한항균활성이가장뛰어났으며, TLS의최소저해농도를알아보기위하여 00 ml 의비타민음료에 TLS를각각 0, 20, 40, 60, 80 ppm에해당하는양을첨가하여농도의변화에따른항균활성을살펴보았다. 그결과, 5종류의곰팡이모두 TLS가 40 ppm 이하로첨가되었을경우에는성장에저해를나타내지않았으며, 60 ppm 이상첨가되었을경우균체의성장에저해가있는것으로나타났다 ( g/l). 80 ppm 이상의첨가농도에서는 A. niger를제외한 4종류의곰팡이는생육이불

4 Evaluation of Antifungal Activity of Natural Antimicrobials in Fuctional Beverage 265 Table 2. Minimum Inhibitory Concentrations (MICs) of TLS Strains Concentration of TLS (ppm) Aspergillus niger KCCM Penicillium citrinum KCCM 69 Rhizopus oryzae KCCM 272 Fusarium moniliforme KCCM 403 Mucor rouxii KCCM : >.0 g/l, + : <.0 g/l, - : ND (Not Detected). 가능하였다 (Table 2). 이결과를바탕으로천연항균물질인 TLS의 5종류의곰팡이에대한균체성장최소저해농도는 60 ppm으로나타났다. A. niger의경우최소 00 ppm 이상을첨가해야균체의성장을억제할수있었다결과를종합해볼때, 균주에따라저항성의차이는나타났지만조사한 7가지의천연항균물질중 TLS, BMB-FS 등이항균활성을나타내는것으로분석되었으며, 곰팡이의성장을가장강력히저해하는물질은 TLS로나타났다. 식품부패균에대한높은항균활성을이용하여면류, 소스류등에널리사용되고있는 ε-polylysine 경우곰팡 5, 6) 이에대한생장저해활성은거의나타내지못하였다. 5 종류의곰팡이중 A. niger가천연항균물질에대한저항성이가장크게나타났으며, F. moniliform의경우다른곰팡이들에비해천연항균물질에민감한반응을보였다. 일반적으로미생물에의한변패를방지하여저장성을향상시키기위해보존료를단독으로사용하지않고하나이상의보존료를병용사용하여상승효과를보는방법이사 용되고있다. 연구결과를바탕으로곰팡이생장저해활성을보인천연항균물질들을조합하여최적의비율을결정하면기능성음료의보존성향상에도움이될수있을것으로판단된다. 요 기능성음료의저장성을향상시키고자, 7종류의천연항균물질 (ε-polylysine, 유카추출물, TLS(Vitamin B 유도체 ), BMB-FS( 황금추출물 ), 키토올리고당, KDSP 00, KDSP 002) 의곰팡이성장저해활성을비교평가하였다. Aspergillus niger, Penicillium citrinum, Rhizopus oryzae, Fusarium moniliforme, Mucor rouxii, 5 종류의곰팡이를상대로활성을살펴보았으며, 성장저해활성이가장뛰어난물질의최소저해농도를조사하였다. 모든곰팡이에대하여성장저해활성을보인물질은 vitamin B 유도체인 TLS 이었으며, 00 ppm 이상의농도에서는균사체가성장하지못 약 하였다. 황금추출물 BMB-FS의경우 F. moniliforme을상대로 00 ppm이상의모든농도에서성장저해활성을보였으며 P. citrinum와 M. rouxii의경우,000 ppm이상의농도가되어야균체성장을저해하는것으로나타났다. 가장뛰어난활성을보여준 TLS의최소저해농도 (MIC) 는 A. niger를제외한 4가지곰팡이에대하여 60 ppm으로나타났으며, A. niger에대한 MIC는 00 ppm으로분석되었다. 이같은결과는기능성음료의저장기간을연장시키는데중요한정보를제공하며, 천연보존료연구에도움이될것이라생각된다. 참고문헌. Park, S.K., Lee, T.S. and Park, S.K. : Estimation of daily dietary intake of food red colors. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 34, (2005). 2. Sibel, R. : Natural antimicrobials for the minimal processing of foods. Bibel, R(Ed.). Woodhead Publishing Limited, Cambridge, UK (2003). 3. Davidson, P.M. and Post, L.S. : Naturally occurring and miscellaneous food antimicrobials. In Antimicrobials in foods. Branen, A.L. Davidson, P.M., Eds, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 37 (983). 4. Lewis, R.J. : Their regulatory status their use by the food industry.in Food additives handbook, Robert, W. D. (Ed.), Nostrand Reinhold, New York. p (989). 5. 곽종명, 허정림, 허탁 : 음료수용포장용기의환경영향, 한국공업화확회지, 2(), (998). 6. 이영철, 오세욱, 홍희도 : 식용가능한약용식물추출물의항균특성, 한국식품과학회지, 34, (2002). 7. Beuchat, L.R. and Golden, D.A. : Antimicrobials occuring naturally in food, Food Technol., 43, (989). 8. Kim, H.Y., Lee, Y.J., Kim, S.H., Hong, K.H., Kwon, Y.K., Lee, J.Y., Ha, S.C., Cho, H.Y., Chang, I.S., Lee, C.W. and Kim, K.S. : Studies on the development of natural preservatives from natural products, Korean J. Food Sci. Technol., 3, (999).

5 266 Hee-Seok Lee, Ji-Hye Yeon, Sang-Do Ha, Chul-Soo Park, Moon-Jae Woo, Sang-Hun Lee, Jin-Soo Kim, and Chan Lee 9. Lee Y.C, Oh S.W, Hong H.D. Antimicrobial characteristics of edible medicinal herbs extracts, Korean J. Food Sci. Technol., 34, (2002). 0. 김용석, 신동화 : 천연휘발성항균물질의연구현황과식품가공에의이용, 한국식품과학회지, 35, (2003).. 조성환, 김영록 : 황금추출물의항균활성. 한국식품영양과학회지, 35(5), (200). 2. 이종기, 서진종 : 황금탕및황금추출물의식중독세균에대한생육억제효과. 한국식품영양과학회지, 34(0), (2005). 3. 지희윤 : 키토산의 Candida albicans 와 Trichophyton rubrum 에대한항진균작용과 Apoptosis 유도작용, 한국균학회지, 34(2), 9-2 (2006). 4. Jin, Y.L., Jung, W.J., Kuk, J.H., Kim, J.B., and Park, R.D. : Antifungal and Antioxidative Activities of Yucca smallina Fern, Agr. Chem. Biotechnol., 49(4), (2006). 5. Shima, S., Matsuoka, H., Iwamoto, T. and Sakai, H : Antimicrobial action of a ε-poly-l-lysine, J. Antibiot., 37(), (984). 6. Heo, C.Y. and Cho, S.H. : Antimicrobial Activity of Polylysine Produced by Streptomyces sp, J. Agriculture and Life Sci., 36(), (2002).

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