미생물의증식이란? 제 3 장. 항생물질의활성 시간에따른미생물의수의증가, 즉밀도의증가 (population growth) 세포내의생합성에의한세포크기의성장 (single cell growth) 항생물질의활성 (Activity) 이란? 집단이커지는것을막는것 (ability

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1 미생물의증식이란? 제 3 장. 항생물질의활성 시간에따른미생물의수의증가, 즉밀도의증가 (population growth) 세포내의생합성에의한세포크기의성장 (single cell growth) 항생물질의활성 (Activity) 이란? 집단이커지는것을막는것 (ability to inhibit growth of microbial population) 을말함 항생물질의선택성 - 일반적으로세균, 곰팡이, 원충류등여러종류의미생물에대해동시에활성을갖는항생물질은독성이강해임상적으로사용될수없다. 오히려특수한부류의미생물에대해서만활성을갖는항생물질만이선택성이있어서의약품으로이용될수있다. 44/665 항세균성항생물질 (Antibacterial Drugs) 그람양성세균에만주로유효한항생물질 그람음성세균에만주로유효한항생물질 그람양성세균및그람음성세균에유효한항생물질 그람양성세균과그람음성세균의대부분특히 rickettsia, chlamydia 에도유효한항생물질 ( 광범위항생물질, broad spectrum antibiotics). 그람양성세균과그람음성세균의일부분에유효한항생물질 ( 중범위항생물질, medium spectrum antibiotics) 항생물질의활성의평가 강도 ( 强度 ) (potency) - 최소성장억제농도 (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) 폭 ( 幅 ) (spectrum) - 항균스펙트럼 (antibacterial spectrum) 45/665

2 MIC 의정의 MIC는항생물질의 2배희석계열을사용한측정계에서대상미생물의증식을억제하는가장낮은농도로정의한다. MIC는사용한미생물의종은물론균주에따라서, 측정조건에따라서상당히달라질수있으므로반드시미생물의종과균주명, 측정조건을표시하여야한다. MIC 의측정법 ( 제 4 장에서 ) 고체배지 ( 한천평판 ) 희석법 Agar dilution method 액체배지희석법 Broth (Liquid) dilution method Micro-broth dilution Macro-broth dilution 46/665 MIC 50, MIC 90 임상분리균주에대한항균력실험에서는동일한종균주의다수에대해 MIC 를측정한다. 이때대상균주에대해얻은 MIC 값을작은것부터큰순서로배열했을때, 가장큰수치를 MIC 100, 90% 에해당하는수치를 MIC 90, 50% 에해당하는수치를 MIC 50 이라한다. Cumulative Inhibition Curve by Teicoplanin 47/665

3 Strain Ciprofloxacin Gemifloxacin S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae S. Pneumoniae Y S. Pneumoniae Ciprofloxacin Gemifloxacin Compounds Range MIC 90 Ciprofloxacin 4~64 64 Gemifloxacin 0.06~2 1 MIC MIC

4 항생물질의살균작용과정균작용 살균작용을나타내는최소농도를최소살균농도 (Minimal Bactericidal Concentration, MBC) 라하는데, MBC 가 MIC 와같거나한두단계정도높은경우, 이항생물질을살균작용을갖는다고판정한다. 50/665 Antibiogram 병원의임상검사실에서는환자의감염부위에서분리한균주를대상으로여러가지항생물질에대한감수성 내성검사를실시한다. 고체배지표면에균체를도말한후, 일정량의항생물질이함유된디스크를놓고배양하면, 표면에균이성장하고디스크주위는항생물질이확산되어나가므로, 대상균이항생물질에감수성이면균이성장하지못해저지원 (clear zone) 이생긴다. 저지원이크기에따라감수성 내성을판정한다. 이때여러가지항생물질디스크를동시에놓고시행하므로여러항생물질에대한감수성 내성정보를동시에얻을수있다. 이런결과표를 Antibiogram 이라하며, 감염증치료에사용할항생물질의선택에기초가된다. 51/665

5 52/665 Breakpoint 감수성 내성검사를할때보통 MIC 를측정하거나 Antibiogram 을이용한다. 그러나 MIC 측정법은복잡하다는단점이있고, Antibiogram 은정확도가떨어진다는단점이있다. 그래서양쪽의단점을보완한 Breakpoint 법을사용한다. Breakpoint 법에서는미리여러조건을고려하여감수성과내성을대표할수있는두단계의농도를결정한다. 두단계농도의항생물질을함유한배지에서배양을실시한후, 검사균주가높은농도에서도성장하면내성으로, 낮은농도에서는성장하고높은농도에서만성장하지못하면중간으로, 낮은농도에서도성장하지못하면감수성으로판정한다. Gentamicin 의경우, 두단계의농도는 4.0 μg / ml와 8.0 μg / ml이다. 제 4 장. 항생물질의감수성시험 항균제감수성시험의목적은감염증치료에사용할항균제의효과를예측하는것 그러나항균제치료의임상효과는세균의감수성뿐아니라항균제의약동학적특성, 환자의면역력, 감염부위등다양한인자에의해서결정. 감수성시험에서감염의원인균이특정항균제에감수성이라고해서그항균제투여로감염증이 100% 치료되는것은아니며, 감수성시험에서내성인항균제치료가 100% 실패하는것도아니다. 그러나감수성시험은항균제의임상효과를예측할수있는매우중요한단서이며, 대부분의경우감수성시험결과가임상효과와일치. 53/665

6 항균제감수성시험방법 (National Committee for Clinical Laboratory Standards: Methods for antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 4th edition; Approved standard. NCCLS publication no. M7-A4. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa. 1998). (à CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute) Dilution method: 최소억제농도 (MIC) 를측정한다 Agar dilution Broth dilution MIC: minimal inhibitory concentration à bacteriostatic MBC: minimal bactericidal concentration à bactericidal Diffusion method: clinically used, antibiotics disk 세균의항균제에대한감수성양상 ( 감수성, 중간내성및내성 ) 만을알수있다 확산법의원리로 MIC 를측정하는 Epsilomer test (Etest, AB Biodisk, Sweden) Disinfectants ( 소독제 ) and antiseptics ( 방부제 ) Little selective toxicity Toxic for microbial pathogens as well as for host cells 54/665 항균제감수성시험방법 55/665

7 Evaluation of Laboratory Tests MIC test on plates is the best Time consuming and costly Most detailed Disc test/etest is easiest Requires more skill to interpret Breakpoint Least skill required Technique must be exact Can be read by computer Large amounts of data 56/665 희석법 시험항균제를기초배지에 2 배수단계희석한후, 일정량의균주를접종한다. 일정온도에서일정시간배양한후, 균주의증식이관찰되지않는항균제의최소농도를 MIC 로판정한다. 한천희석법 (Agar dilution method) 기초배지로 Muller-Hinton (MH) Agar 가흔히사용된다. 균주는 Steers replicator 로접종한다. 한꺼번에균주 30 주이상에대해감수성을시험할수있다. Colony ( 집락 ) 의증식상태를눈으로확인할수있기때문에, 다른세균에의한오염을배제할수있는장점이있다. 그러나이방법은통상적인감수성시험에사용하기에는너무번거롭고, 비용이많이드는단점이있으며, 흔히연구용으로사 용된다. Inoculum size : 10 4 ~ 10 5 cfu/spot 57/665

8 액체배지희석법 (Broth dilution method) 액체배지 (Muller-Hinton broth, MHB) 를기초배지로사용한다. 항균제농도마다 1 ml 이상의액체배지를사용하면 macrobroth 희석법, 0.05 ~ 0.1 ml를사용하면 microbroth 희석법이라부른다. MIC 뿐만아니라최소살균농도 (minimal bactericidal concentration, MBC) 도측정할수있는장점이있다. 그러나집락의증식상태를눈으로확인할수없기때문에, 다른세균에의한오염을배제할수없는단점이있다. Microscan, Vitek 등자동화된장비는 microbroth 희석법으로균주의 MIC를측정하며, 많은미생물검사실에서이들자동화장비를이용해서편리하게항균제감수성시험을하고있다. 58/665 Minimum Bactericidal Concentration Inoculum size : 10 4 ~ 10 5 cfu/tube MIC mg/ml MBC Subculture onto drug-free agar mg/ml MBC is defined as the lowest concentration which induced more than 99.9 % reduction in CFU 59/665

9 살균제와정균제 일반적으로살균항생제는 MBC가 MIC보다 2-4배정도크다. 정균항생제는 MBC가 MIC보다 32배이상크다. 모든항생제는살균제나정균제로분류될수있다. 한가지항생제가어떤미생물에대해서는살균제로또다른미생물에대해서는정균제로작용할수도있다. 60/665 디스크확산법 (Kirby Bauer Method) 분리된특정균에대해감수성이있는항생제의종류를결정하는검사 세균증식이억제된지름의크기에따라항생물질의세균에대한감수성을판단한다. 기초배지로 Muller-Hinton Agar 가흔히사용 한천의표면에면봉으로시험균주의균액을고르게접종하고, 그위에항균제디스크를놓는다. 배양시간동안디스크의항균제는주위의한천으로확산하므로, 디스크바로주변의한천에는항균제가고농도로분포하지만, 디스크에서먼곳의한천에는항균제가낮은농도로분포한다. 즉, 디스크와일정거리에있는한천의항균제농도는시험균주에대한 MIC 가되며, 이 point 보다안쪽의한천에서는균주가증식을못하지만, 이 point 밖에서는균주가증식한다. 디스크확산법에서는이억제대 (Clear Zone) 의지름을측정해서균주의시험항균제에대한감수성양상을결정한다. 61/665

10 E test 확산법을이용한항균제감수성시험방법그러나일반적인디스크확산법과는달리 MIC 를측정할수있다. 쉽고간편하기때문에통상적인감수성시험에사용할수도있다. 그러나 Etest strip 의가격이상당히비싸며, 항균제당넓은면적의평판배지가필요한단점이있다. 62/665 시험항균제의선택 항균제감수성시험의목적은시험균주의특정항균제에대한내성획득여부를알아내는것이다. 따라서, 자연내성인항균제에대한감수성시험은불필요하다. 주요균종의항균제자연내성 균종자연내성항균제 Citrobacter freundii Enterobacter spp. Klebsiella pneumoniae Morganella morganii Proteus vulgaris Providencia spp. Serratia marcescens Haemophilus influenzae Pseudomonas aeruginosa Enterococcus spp. Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Bacteroides spp. Cephalothin Cephalothin Ampicillin, carbenicillin Ampicillin, cephalothin, polymyxin Ampicillin, cephalothin, polymyxin Polymyxin Ampicillin, cephalothin, polymyxin Penicillin Ampicillin, 제 1, 2 세대 cephalosporin, kanamycin Aminoglycoside, cephalosporin, clindamycin Streptomycin Aminoglycoside Aminoglycoside 63/665

11 Effects of antibiotics combination therapy Addition Synergism If two antibiotics used in combination have an antibacterial effect much greater than either drug alone Two drugs may sequentially block a microbial metabolic pathway A drug may enhance the entry of another drug into bacteria (e.g.) b-lactam drug + aminoglycosides or amphotericinb + flucytosine One drug may prevent the inactivation of a second drug by microbial enzymes (e.g.) Inhibitors of b-lactamase (clavulanic acid, sulbactam) + amoxicillin Antagonism When two drugs in combination have activity less than the sum of the two Bacteriostatic drugs (chloramphenicol, tetracyclins) + bactericidal drug (penicillins or aminoglycosides) 64/665 Indications Antimicrobial drugs used in combination To give prompt treatment for serious infections (e.g.) menigitis in children To delay the emergence of drug-resistant mutant in chronic infection by the use of another non-cross-reacting drug (e.g.) active TB To treat mixed infections following massive trauma or involving vascular structures To achieve bactericidal synergism or to provide bactericidal action (e.g.) enterococcal sepsis Disadvantages Unnecessarily high cost Indifference or antagonism Normal flora 65/665

12 제 5 장. 항생물질의작용기전 66/665 항생물질의작용기전과선택독성의관계 항생물질이미생물세포에영향을미치기위해서는 미생물세포내로침투 미생물의증식과생명유지에필수적인세포내구조 ( 작용점, target site) 와결합 그세포내구조가담당하는대사과정을완전히억제세포차원에서항생물질의영향 정균효과 (bacteriostatic effect) 항생물질과미생물세포내구조와의결합이약하면 ( 또는가역적 ), 항생물질의효과는세포의증식을억제하는정도에머물고죽이지는못한다. 정균효과를나타내는항생물질의경우에는, 미생물세포에서그항생물질을제거하면미생물세포가다시증식할수있다. 살균효과 (bactericidal effect) 항생물질이세포내구조나효소와불가역적으로결합하여, 그들이갖는기능을완전히억제한다면항생물질은세포의증식을억제하는단계를넘어죽게만든다. 67/665

13 항생물질의작용기전과선택독성의관계 미생물의증식단계 배지중의탄소원과질소원을세포내로끌어들여물질대사와에너지대사에서의주요대사중간체 (key product) 로전환함. Monomer (amino acid, nucleotide, glucosamine, triglyceride등 ) 와보조인자 cofactor를생성함. Monomer를거대분자 (protein, nucleic acid, peptidoglyean) 로중합함. 거대분자를초거대분자 (ribosome, 세포벽, 세포막등 ) 로조립함. 항생물질은위의단계중특정한한단계또는두단계이상을방해하여세포증식을억제. 68/665 항생물질의작용기전과선택독성의관계 이세포증식억제기전을항생물질의작용기전 (Mode of Action, MOA) 이라한다. 항생물질은사람이나동물체에는독성을나타내지않고, 감염된미생물의증식만선택적으로억제할수있어야함. 항생물질작용의선택성 (selectivity) 은환경의적응과정중에서세포의필수적인기능을그대로유지하면서생긴, 세포간의구조적및생화학적차이점에근거를두고있다. 동물조직을구성하는세포인진핵세포와세균을구성하는원핵세포사이에는미묘한구조적, 생화학적차이점이있다. 69/665

14 항생물질작용의선택성에대한세포및분자수준에서설명두종류세포안으로항생물질이투과하는정도의차이세포내항생물질의농도는투과력 (penetration) 에의해결정어떤항생물질의투과력은원핵세포와진핵세포에서서로다름. Tetracycline - 이항생물질은세균유래의무세포계 (cell free system) 와동물세포유래의무세포계에서거의같은정도로단백질생합성을억제한다. 그러나살아있는세포계에서는세균세포의증식만을억제한다. 이것은세균은능동적으로 (active transport) tetracycline을끌어들여억제농도에도달할수있으나, 동물세포에서는 tetracycline이확산으로만 (simple diffusion) 들어갈수있어억제농도에도달할수없기때문이다. 70/665 항생물질작용의선택성에대한세포및분자수준에서설명 동물세포에는없고, 미생물 ( 특히세균 ) 세포에만존재하는필수조직에대한작용. Peptidoglycan으로구성된세균세포벽은세균에만존재하고, 동물세포에는존재하지않는구조 à 작용기전상다른항생물질에비해선택성이높다. 세포막은모든종류의세포에존재하며구조나기능면에서큰차이가없다. 그러나세포의종류에따라세포막에는작은차이점이존재 - 곰팡이의세포막, 동물세포의세포막 71/665

15 항생물질작용의선택성에대한세포및분자수준에서설명 두종류의세포안에서같은역할을하는분자에대한항생물질의친화력차이. 세균에존재하는주요대사과정이나구조는곰팡이나동물세포에도존재한다. 그러나이대사과정에관여하는효소의구조사이에는작은차이점이있음 - 이들효소에대한어떤특정항생물질의친화력 (affinity) 에차이. 세균세포효소에대한친화력이강하고, 동물세포효소에대한친화력이약한항생물질은작용선택성을갖게된다. 단백질생합성효소, RNA polymerase, dihydrofolate reductase의작용을억제하는항생물질은이원리에의해선택성을나타낸다. 72/665 항생물질작용의선택성에대한세포및분자수준에서설명 항세균성항생물질은그람양성, 그람음성세균에대해서로다른항균력을나타낸다. 이와같은항균력의차이점은투과력의차이점, 불활성화효소의존재여부, 작용부위의존재여부에기인한다. 대부분의항생물질은단순확산 (simple diffusion) 에의해세균세포안으로들어간다. 따라서세포안으로들어가는항생물질의양은세포벽과세포막의물리화학적성질에의해결정된다. 세포막의구조나성질은그람양성세균과그람음성세균사이에차이가없으나, 세포벽의경우는그렇지않다. 그람음성세균의세포벽에는그람양성세균의세포벽에는없는외막 (outer membrane) 이존재한다. 73/665

16 항생물질작용의선택성에대한세포및분자수준에서설명 그람음성세균에서는일반적으로이외막의존재로인해항생물질이쉽게세균세포안으로투과할수없다 à 그람음성세균은그람양성세균에비해항생물질에덜감수성어떤세균이항생물질이작용하는부위를갖고있지않다면, 이항생물질은이세균에대해서는활성을갖지못함 Mycoplasma 세균은세포벽을갖고있지않으며, 따라서세포벽생합성을억제하는 penicillin등의항생물질은이세균에작용하지않는다. 74/665 세포벽생합성을억제하는항생물질 세포벽생합성을억제하는항생물질은 Peptidoglycan 생합성을억제하는것 ( 대부분 ) 과그밖의세포벽구조의생합성을억제하는것으로구분. 세포벽생합성을억제하는항생물질의공통점살균적으로작용. 성장이중지된상태의세포에는작용을나타내지못함. 이들항생물질은세포벽이없는세균에는활성을나타내지못함. 75/665

17 Inhibition of Bacterial Cell Wall Synthesis Features of the bacterial cell-wall: Peptidoglycan ß polysaccharides + a highly cross-linked polypeptide Polysaccharides ß N-acetylglucosamine + N- acetylmuramic acid G M G M 76/665 Peptidoglycan 생합성을억제하는항생물질 N-acetylglucosamine-UDP, N-acetylmuramic -UDP(aa) 5 의두기본단위형성을억제하는것 D-cycloserine The terminal two amino acid residues of the murein precursor lipid II consist of D-alanine, which is produced by the enzyme alanine racemase; the two residues are joined by D-alanine ligase. Both enzymes are competitively inhibited by cycloserine) Fosfomycin Inactivating the enzyme UDP-N-acetylglucosamine-3- enolpyruvyltransferase, also known as MurA. 77/665

18 Peptidoglycan 생합성을억제하는항생물질 두기본단위로이루어지는이중체 (dimmer) 형성단계나, 형성된이중체가성장중인 peptidoglycan 쇄에전달되는과정을억제하는것 Bacitracin, flavomycin. 쇄 (chain) 와쇄을연결하는단계인 cross-linking을억제하는것 b-lactam계항생제 (Penicillin, cephalosporin, cephamycin, carbapenem, monobactam) 78/665 Peptidoglycan synthetic pathway in E. coli with known inhibitors indicated. At least unique essential targets 79/665

19 단백질생합성을억제하는항생물질 단백질생합성을억제하는여러가지항생물질의작용기전은구체적인면에서는서로다르며그억제정도도다름. 대부분은정균적으로작용. 그러나단백질생합성에필수적인구조와불가역적결합을하는항생물질은살균적으로작용. 이들항생물질에의해단백질생합성이억제되면, DNA, RNA, 세포벽등거대분자의생합성에 2 차적영향을미치게되며, 그결과로세균의성장은억제된다. 단백질생합성을억제하는항생물질은매우다양한데, 이들항생물질은작용부위에따라다음의 4 가지로분류아미노산활성화와전달반응을억제하는것 : mupirocin, borrelidin. 30S ribosomal subunit 의기능을억제하는것 : tetracyclin, 아미노배당체계항생제 (streptomycin, gentamicin). 50S ribosomal subunit 의기능을억제하는것 : MLS 계항생제 (erythromycin, leucomycin, lincomycin, clindamycin, synercid), chloramphenicol, puromycin. Ribosome 이외의단백질합성관여인자의기능을억제하는것 : fusidic acid, kirromycin. 80/665 30S Tetracycline antibiotics (trna binding) Tetracyclines Doxycycline Chlotetracyclne Clomocucline Demeclocycline Lymecycline Meclocycline Metacycline Minocycline Oxytetracycline Penemepicycline Rolitetracycline Tetracycline Glycylcyclines Tigecycline Ampenicols (translocation) Chloramphenicol Azidamfenicol Thiamphenicol Florfenicol 50S MLS (transpeptidation) Macrolides Erythromycin Azithromycin Spiramycin Midecamycin Oleandomycin Roxithromycin Josamycin Troleandomycin Clarithromycin Miocamycin Rokitamycin Dirithromycin Flurithromycin Telithromycin Cethromycin Lincosamides Clindamycin Lincomycin Streptogramins Pristinamycin Quinupristin/dalfopristin Oxazolidinone (initiation inhibitors) Linezolid 30S and 50S Aminoglycosides -mycin (Streptomyces) Streptomycin Neomycin (Framycetin, Paromomycin, Ribostamycin) Kanamycin (Amikacin, Arbekacin, Bekanamycin, Dibekacin, Tobramycin) Spectinomycin Hygromycin B Paromomycin -micin (Micromonospora) Gentamicin# (Netilmicin, Sisomicin, Isepamicin) Verdamicin Astromicin 81/665 Other Steroid antibacterials (EF-G) Fusidic acid

20 핵산의생합성억제하는항생물질 핵산의합성을억제하는항생물질류 DNA 또는 RNA 전구체의생합성을억제하는것 전구체의중합, 즉 DNA 또는 RNA 생합성단계를억제하는것 DNA 주형의기능을억제하거나, 중합에관여하는효소의기능을억제 (1) DNA template 기능을억제하는항생물질 DNA 와복합체를형성하여 DNA 의주형기능을직접막거나, 또는 DNA 에절단과같은구조변화를일으켜주형으로작용하지못하게함. 이계열항생물질들은세균 DNA 는물론곰팡이 DNA, 동물 DNA 등여러 DNA 와결합하므로선택성이약하고, 따라서독성이매우강함. 주로항종양제로사용. Mitomycin 류, bleomycin 류, actinomycin D, daunorubicin (daunomycin), doxorubicin (adriamycin), distamycin, netropsin 등 82/665 핵산의생합성억제하는항생물질 (2) RNA polymerase 기능을억제하는항생물질 세균의 RNA polymerase는동물세포 RNA polymerase와상당히차이점이있기때문에이계열항생물질은보통선택성이강하다. 이계열항생물질은증식중인세균의 RNA 생합성을선택적으로억제하며, DNA 생합성에는영향을미치지않는다. RNA 생합성의일시적중지는세포에치명적인것이아니며, 따라서 RNA polymerase 기능을억제하는항생물질은주로정균적으로작용. 대표적인항생물질은 ansamycin류 (rifamycin류, streptovaricin류등 ) 이다. 이중 rifamycin류가가장잘알려졌으며, 특히반합성유도체인 rifampicin (rifampin) 은항결핵제등으로중요하게사용되고있다. Rifamycin류은세균 RNA polymerase와불가역적복합체를형성하여작용한다. 83/665

21 핵산의생합성억제하는항생물질 (3) 복제효소기능을억제하는항생물질 세균의 DNA polymerase 기능을선택적으로억제하는항생물질은아직보고된바없다. 세균 DNA gyrase 기능을선택적으로억제하는항생물질로 novobiocin, coumermycin류과 quinolone 항균제류가있다. Novobiocin과 coumermycin류는세균 DNA gyrase의 B subunit와결합하여효소반응을중단시킨다. Nalidixic acid, oxolinic acid, pipemidic acid 등초기 quinolone 항균제와 norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin 등다양한 fluoroquinolone 항균제는모두 DNA gyrase의 A subunit와결합하여작용한다. 84/665 세포막기능을억제하는항생물질 세포막의구조와기능은원핵세포나진핵세포간에근본적으로거의차이가없다 원핵세포와진핵세포의세포막사이에존재하는중요한차이점은 sterol 의존재여부와그종류이다. 세균의세포막에는 sterol 이없으며, 곰팡이와동물세포에존재하는 sterol 은그종류가다르다. 따라서항곰팡이성항생물질은주로 sterol 생합성억제나기능장애를작용기전으로하고있다. 세포막기능을억제하는항생물질은선택성이매우약하며, 따라서독성이매우강한것이많다. 이런것들은주로외용제로사용한다. 85/665

22 세포막기능을억제하는항생물질 이부류에속하는항생물질은 세포막구조를파괴하여세포내용물을유출되게하는것 : polymyxin, colistin, circulin, amphotericinb와 nystatin 등 polyene계항생물질특정한이온을세포안또는세포밖으로이동시켜비정상농도로되게하는것 : gramicidin류, alamethacin, cyclodepsipeptide 류 (valinomycin, enniantin류 ), macrotetrolide류, sideromycin류 86/665 대사길항성항생물질 세포내에서일어나는정상적인대사를방해함으로써작용을나타내는항생물질 천연대사체와구조적으로비슷한것 ( 대사유도체 ) 정상적으로천연대사체를인식하는효소와반응하여, 이효소가천연대사체에이용되지못하게한다. 억제정도는천연대사체에대한대사유도체의농도비율에의해결정된다. 즉상경적 (competitive) 이다. 87/665

23 대사길항성항생물질 이계열에속하는항생물질에는정보관련중합체 (DNA, RNA, 단백질 ) 에천연 monomer 대신들어가서정보내용을변화시켜항균활성을나타내는것과필수대사중간체의형성을억제하여활성을나타내는것이있다. 천연 monomer 대신들어가활성을나타내는것 : fluorophenylalanine, selenomethionine, 5-bromouracil. 대사중간체또는필수조요소 (cofactor) 의합성을억제하는것 : Purine, pyrimidine nucleotide 합성억제제 : hadacidin, alanosine, azaserine, DON, showdomycin Peptidoglycan 합성억제제 : D-cycloserine Folic acid 합성억제제 : sulfonamide Dihydrofolic reductase 억제제 : trimethoprim 88/665 제 6 장. 항생물질에대한세균의내성기전 Antibiotic resistance continues to plague antimicrobial chemotherapy of infectious diseases Keith. Poole. J Antimicrob Chemother 2005; 56: Antibiotic resistance has resulted in a continuous need for new therapeutic alternatives Carl Erik Nord. Clin Microbiol Infect 2004;10 (Supp 4) There is a need to re-invigorate antimicrobial development, which has been downgraded by major pharmaceutical houses David Livermore. Lancet Infect Dis 2005; 5: /665

24 Resistance By the end of the 1950 s, 50% or more of all Staphylococcus aureus strains were resistant to PCN. In 1975, MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus). In 1988, VRE (Vancomycin resistant enterococci). In 2002, VRSA (Vancomycin resistant Staphylococcus aureus). Today, 70% of all nosocomial infections are resistant to one or more antibiotics. 90/665 Resistance 91/665

25 Drugs developed to counteract resistance mechanisms Year 1940 Relevant resistance at appearance time Penicillinase-(+) S. aureus Tetracycline resistance Gentamicin resistance Antimicrobials developed Stable penicillins: methicillin, oxacillin, cloxacillin, 1 st gen. cephalosporins: cephalotin, cephalexin, Doxycycline, minocycline, tigecycline Tobramycin, amikacin, isepamicin 1960 Nalidixic acid Norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin 1980 Methicillin resistant S. aureus TEM-1 ß-lactamase producing E. coli AmpC hiperproducing gram-(-) rods ESBL producing Enterobacteriaceae Synercid, linezolid, daptomycin, tigecycline ß-lactamase inhibitors: clavulanic, sulbactam, tazobactam 2 nd / 3 rd gen. cephalosporins: cefotaxime, ceftazidime, 4 th gen. cephalosporins: cefepime Carbapenems: imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, panipenem,... Carbapenems: imipenem, meropenem, ertapenem doripenem, panipenem, Penicillin/Macrolide R S. pneumoniae Telithromycin Vancomycin resistant enterococci Synercid, linezolid, daptomycin, oritavancin, telavancin 92/665 Resistance to Antibiotics 93/665

26 항생물질에대한세균의내성기전 내성의정의 어떤항생물질에감수성인세균에서유래한균주가항생물질의최소억제농도에서증식이억제되지않고증식하였을때내성화 (resistant) 되었다고하며, 그상태를내성 (resistance) 이라한다. 물론이내성균주도보다높은농도의항생물질에의해서는증식이억제될수있다. 따라서내성의개념에는 1 특정한세균균주 2 특정한항생물질 3 특정한농도가적용되어야한다. 임상적으로는혈장또는조직중에도달할수있는항생물질농도이상에서세균이증식할수있을때내성이라한다. 94/665 약물내성 DNA 의전이방법 Plasmid transfer 세균접합 (bacterial conjugation) 에의한다. 가장중요함. Transduction Phage 에의한형질도입. Transformation Free DNA에의한형질전환. 95/665

27 Limitation of Drug Resistance How to limit emergence of drug resistance by maintaining sufficiently high levels of the drug in the tissues to inhibit both the original population and first-step mutants by simultaneously administering two drugs that do not give cross-resistance, each of which delays the emergence of mutants resistant to the other drug by avoiding exposure of microorganisms to a particularly valuable drug by limiting its use, especially in the hospitals 96/665 내성관련용어정의 Multi-drug resistance ( 다제약제내성 ) 어떤세균이화학구조가서로다르며작용기전이서로다른두종류이상의항생물질에대해동시에내성을가지는것 Cross resistance ( 교차내성 ) 화학구조가같은계열에속하며, 따라서작용기전이거의같은항생물질이임상적으로다수이용되고있음 어떤세균이이중한가지항생물질에대해내성화되면, 이세균은같은계열의다른항생물질에대해서도내성을갖게되는경우가있는데, 이현상을교차내성이라고함 교차내성을나타내는세균에의한감염증을치료하기위해, 제 2 의항생물질을선택할때에는작용기전이다른항생물질중에서선택해야한다. Selection Pressure of Antibiotic Use 97/665

28 One-step resistance MIC 보다몇배높은농도의항생물질을함유한고체배지위에세균을 10 9 cfu 이상의많은수를도말한뒤배양하면내성균주를분리할수있다. 이때분리된내성균주는분리에사용한항생물질농도뿐만아니라, 그보다훨씬높은농도에서도성장할수있다. 이런경우를일단계내성이라한다. Multi-step resistance 내성관련용어정의 그러나 penicillin 과같은항생물질에대한내성균주는이런방법으로분리할수없다. Penicillin 내성균주를분리하기위해서는훈련법 (training) 을쓴다. 즉 MIC 보다조금낮은농도 (½X MIC) 의 penicillin 을함유한액체배지에서세균을배양한후, 그것을 MIC 보다 2 배높은농도의고체배지에도말한후, 배양하여살아나온집락을취한다. 이균주를다음에는 MIC 농도에서액내배양하고, 이어 MIC 의 4 배농도고체배지에도말, 배양하여살아나온집락을취한다. 이와같은조작을여러번반복하면내성도가상당히높은균주를선발할수있다. 이와같은점진적내성을다단계내성이라한다. 98/665 내성의생화학적기전 항생물질이세균의증식을억제하기위해서는, 항생물질이세균세포내로투과되어, 생명에필수적인세포구조와반응하여, 그구조가갖는기능을억제하여야한다. 세균은위의단계중어떤단계를차단한다면, 세균세포는그항생물질에대해내성을갖게된다. 세균이항생물질에대해내성을갖게되는주요생화학적기전은다음과같다. 항생물질의불활성화세포내항생물질표적구조의변화항생물질에대한미생물투과력의변화세포외로의항생제유출항생물질에의해억제되는효소의생산증가세균은이들중한가지또는여러가지기전의복합에의하여항생제에내성이된다 99/665

29 내성의생화학적기전 [1] 효소에의한항생물질의불활성화 이기전에의해내성을갖는균주는해당항생물질을불활성화시키는효소를생산한다. β-lactam 계항생제를불활성화하는효소 β-lactamase 는 β-lactam 환을가수분해함으로써, 이구조에의하여항균력을발휘하는약제를불활성화한다. 그러나세균이 β- lactamase 를생성한다해서모든 β-lactam 항생제에내성이되는것은아니다. 그예로, β-lactamase 를생성하는 Staphylococcus aureus 는이효소가분해하는 penicillin, ampicillin, piperacillin 등에는내성이지만, 이효소에안정한 methicillin, oxacillin, nafcillin 등에는감수성이다. 이는 β-lactamase 에따라서가수분해할수있는기질 ( 항생제 ) 의범위가다르기때문이다. 100/665 [1] 효소에의한항생물질의불활성화 b-lactamase 는 b-lactam ring 을가수분해해서항균제를불활성화한다. 101/665

30 [1] 효소에의한항생물질의불활성화 It is frightening to realize that one single base change in a gene encoding a bacterial b- lactamase may render useless $ 100 million (now more than $ 600 million) worth of pharmaceutical research effort (Science 264: 376, 1994) 102/665 [1] 효소에의한항생물질의불활성화 103/665 Aminoglycoside 를불활성화하는효소 Enterococcus 는저농도의 aminoglycoside 에자연내성인데, 이는세포막의특성때문에이항생제가세포내로투과되는양이적기때문이다. 그러나 aminoglycoside 를 penicillin, vancomycin 등과병합해서사용하면이세균의치료에좋은효과를볼수있는데, 이는 penicillin 이나 vancomycin 이 aminoglycoside 의세포내로의침투를도와주기때문이다. 이병합요법은 Enterococcus 에의한패혈증등중증감염증의치료에널리사용되어왔다 그러나최근분리되는 Enterococcus 중에는이병합요법에내성인세균이많은데, 이는이들내성세균이 aminoglycoside 변형효소 (aminoglycoside modifying enzyme) 를생성함으로써, 고농도의 aminoglycoside 에내성이되었기때문이다. Chloramphenicol acetyltransferase (CAT) 는 chloramphenicol 을불활성화하며, Enterobacteriaceae 와 Haemophilus influenzae 는흔히이효소의생성에의하여 chloramphenicol 에내성이된다.

31 [1] 효소에의한항생물질의불활성화 Aminoglycoside 를불활성화하는효소 104/665 내성균주가생산하는효소들 Peptidase : peptide결합을가수분해하는것으로 β-lactamase가대표할수있다. 여러내성균주가기질특이성, 구조등이서로다른 β-lactamase를생산하고있다. Acetyltransferase : 활성기능에관여하는 -NH 2 기나 OH 기에 acetyl 을전달결합시켜항생물질의입체구조를변화시킴으로해서항생물질을불활성화시킨다. Chloramphenicol의 OH 기나 aminoglycoside계항생물질에있는 -NH 2 기를 acetyl화하여불활성화시킴으로써내성화되는것 Phosphoryltransferase : 활성기능에관여하는 OH 기에인산기를결합시켜, 항생물질의입체구조를변화시킴으로해서항생물질을불활성화시킨다. Aminoglycoside계항생물질에대한내성균주에서예를볼수있다. Adenyltransferase : 활성기능에관여하는 OH 기에 adenyl기를결합시켜, 항생물질의입체구조를변화시킴으로해서항생물질을불활성시킨다. Aminoglycoside계항생물질에대한내성균주에서예를볼수있다. 105/665

32 [2] 항생물질표적구조의변화 β-lactam 항생제의표적은 penicillin-binding protein (PBP) S. aureus는 β-lactam 항생제와의친화도가낮은새로운 PBP (PBP 2 or PBP2a, meca gene) 를생성해서 methicillin에내성이된다. S. pneumoniae는기존의 PBP 변성에의해서 β- lactam 항생제에대한내성을획득한다. Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae 등그람음성세균중에도이러한기전에의하여 β- lactam 항생제에대한내성을획득한세균이있다. 106/665 [2] 항생물질표적구조의변화 A particular nightmare is that methicillinresistant Staphylococcus aureus (MRSA), a common cause of hospital infections, will acquire resistance to vancomycin. If the vancomycin resistance gene got into MRSA, that could be potentially disastrous. (Science 264: 365 (1994) 107/665

33 [2] 항생물질표적구조의변화 Vancomycin-resistant Enterococcus (VRE) 또한표적물질의변성에의하여 vancomycin에대한내성을획득한한예이다. Vancomycin은 peptidoglycan 전구체의 N-terminal D-Ala- D-Ala와결합하여서 PBP가이부위에결합하지못하게하며, 그결과로세균은 peptidoglycan 중합에의한세포벽합성을못하게된다. 그러나 VRE의 N-terminal은 D-Ala-D-Lac 등으로변화되어서 vancomycin과의친화도가 1/1,000 이하로감소되며, 이로인하여 vancomycin에대한내성을획득하는것으로알려졌다. 108/665 Transference of vana gene from E. faecalis to S. aureus 109/665

34 [3] 항생물질투과력의변화 항생물질은다른화합물과마찬가지로수동확산 (simple diffusion) 이나특수한능동수송 (active transport) 에의해세포내로들어간다. 항생물질이수동확산에의해세포내로들어가는경우에는, 영양소로작용하는화합물질은정상적으로세포내로들어가고항생물질은못들어가게하는돌연변이가일어나기매우어렵다. 그러나특수한능동수송에의해세포내로들어가는경우에는특수능동수송에관여하는특수운반단백질 specific carrier protein (permease) 의변화에의해내성을얻을수있다. 그예를 fosfomycin, D-cycloserine에대한내성에서볼수있다. 또한그람음성세균에서는세포외막에있는 porin 단백질이많은화합물의투과에관여하고있으며, 이특수단백질의발현과구조변화에의해투과력이감소되어내성을얻을수있다. 110/665 [3] 항생물질투과력의변화 Porin은세포외막의단백이며, 그람음성세균에만존재한다. Porin은영양물질을받아들이고, 대사산물을내보내는통로로생각되는데, 항생제대부분은이구조를통해서세포내로들어간다. E. coli의외막에는여러종류의 porin이있지만, 항생제는주로 OmpF와 OmpC를투과한다. 항생제의 porin 투과도는항생제분자의전하 (charge), 소수성 (hydrophobicity) 및분자량에따라결정된다. 음성 ( 陰性 ) 전하의분자는양성 ( 陽性 ) 혹은양성 ( 兩性, zwitterion) 전하의분자에비하여 porin을통과하는속도가느리다. 111/665

35 [3] 항생물질투과력의변화 또한소수성분자는친수성 (hydrophilic) 분자에비해서, 분자량이큰항생제는분자량이작은항생제에비해서 porin 을잘투과하지못한다. Methicillin 은소수성이기때문에 porin 을잘투과하지못하며, 따라서그람음성세균에대한항균력이없다. 큰측쇄 (side chain) 를갖고있는 mezlocillin, cefoperazone 등은분자량이커서 porin 을잘투과하지못한다. Imipenem 은양성 ( 兩性 ) 전하를갖고있고, 친수성이며, 분자량이 299 로비교적작기때문에, β-lactam 항생제중 porin 구조를가장잘투과한다 112/665 [3] 항생물질투과력의변화 Gram (+) Gram (-) Mycobacterium 박테리아의세포막구조. 세포외막의 porin 단백은항균제가세포내로들어가는통로이다. 항균제는 porin 단백을소실한세균의세포내로침투할수없으므로, porin 소실변이주는항균제에내성이된다. 113/665

36 [3] 항생물질투과력의변화 다른그람음성세균도 E. coli 와유사한 porin 을갖고있다. 그러나 Pseudomonas aeruginosa 의 porin 은다르다. Imipenem 에감수성인 P. aeruginosa 의외막에는 D2 단백이있지만, 이항생제에내성인세균에는 D2 단백이없으며, 그외의단백은차이가없다. 따라서 P. aeruginosa 에서는 D2 단백이 imipenem 을특이적으로통과시키는것으로생각된다. 그러나 porin 이완전히없는세균은영양물질을받아들일수없기때문에존재할수없으며, 소량의 porin 만있어도항생제는이를투과하므로, porin 의소실만으로항생제에고도내성이되기는어렵다. 다만다른내성기전과상승적으로작용하여서내성정도를높일수는있다. Aminoglycoside, quinolone 등에대한내성도 porin 구조의소실에의해서획득하는것으로알려졌다. 114/665 [4] 세포밖으로의항생제유출 세포내로유입된항생제를능동적으로세포외로유출시킴이러한내성기전은 ribosome의단백생성을저해하는 tetracycline 이나, macrolide에내성인세균과 DNA gyrase의활성을억제하는 quinolone에내성인세균에서볼수있다. Pseudomonas aeruginosa 세포외막의 OprK 단백은세포내의독성성분을세포외로유출하는기능이있는데, 이단백을다량발현하는변이주는능동적유출에의해서 ciprofloxacin, nalidixic acid, tetracycline, chloramphenicol 등의여러항생제에내성이된다. 이와같이능동적인유출에의해서여러가지항생제에대한내성을획득하는기전에는다제내성펌프 (multi-drug resistance pump, MDR pump) 가관련되어있다. 115/665

37 [4] 세포밖으로의항생제유출 MDR 펌프는 Staphylococcus aureus 등의그람양성세균, E. coli, Pseudomonas aeruginosa 등의그람음성세균뿐아니라, 진균인 Candida albicans, 원충인 Plasmodium falciparum 등도갖고있다. S. aureus의 MDR 펌프로는 NorA, QacA, QacB 등이알려졌다. QacA 단백을다량발현하는균주는 chlorhexidine에, NorA를다량발현하는균주는 quinolone에내성이다. E. coli의 MDR 펌프로는 EmrAB 등이알려졌는데, 이단백을다량발현하는균주는 nalidixic acid와 thiolactomycin에내성이다. 116/665 [4] 세포밖으로의항생제유출 일부세균은세포내로유입된항균제를능동적으로유출한다. 117/665

38 [5] 항생물질에의해저해되는효소의생산증가 5-methyltryptophan 이나 trimethoprim 과같은대사길항제에대해내성인세균에서흔히나타남. 이경우내성균주에서는 tryptophan 이나 folic acid reductase 가다량생산된다. 한편 D-cycloserine 에내성인균주에서는 D-alanyl-D-alanine synthetase 의생산이증가된다. 어떤특정항생물질에대해내성을갖는미생물균주는서로다른 2-3 가지의내성기전에의해내성을획득하는경우도있다. 예로 streptomycin 에대해내성인균주중에는불활성화효소의생산함과동시에작용표적부위의변화를일으키거나, 투과력의변화에의해고도의내성을얻은것도있다. 한편두항생물질이같은표적부위에작용한다면교차내성이자주일어난다. 118/665 Antibiotic Resistance: Action and Reaction Response Anti-infective agent Discovery (introduction) Resistance 1 st reported Mechanisms of resistance Organisms Penicillin G 1940 (1943) 1940 Penicillinase S. aureus Streptomycin 1944 (1947) 1947 S12 ribosomal mutations M. tuberculosis Tetracycline 1948 (1952) 1952 Eflfux Shigella dysenterie Erythromycin 1952 (1955) S rrna methylation S. aureus Vancomycin 1956 (1972) 1988, 2004 D-Ala-D-Ala replacement E. faecalis, S. aureus Methicillin 1959( 1961) 1961 MecA (PPP2a) S. aureus Gentamicin 1963 (1967) 1969 Modifying enzymes S. aureus Nalidixic ac (1964) 1966 Topoisomerase mutations E. coli Cefotaxime 1975 (1981) 1981, 1983 AmpC ß-lactamases, ESBL Enterobacteriaceae Imipenem 1976 (1987) 1986 Adquired carbapenemases P. aeruginosa, S. marcescens Linezolid 1979 (2000) S RNA mutations S. aureus, E. faecalis Daptomycin 1980 (2004) 2005? S. aureus, E. faecalis 119/665

39 120/665 내성의유전적측면 [1] 돌연변이에의한내성균주화와항생물질에의한선택 항생물질에대한내성과관련된유전정보 ( 작용표적부위 (target site), 또는투과에관련된유전자 ) 가자연돌연변이에의해변화할수있는확률은다른유전정보가변할수있는확률과같다고볼수있다 ~ 의낮은빈도로항생물질내성관련유전정보가변화하여결과적으로감수성균주가내성균주로바뀐다. 감수성균주에비해내성균주의수는매우적지만, 만약해당항생물질이주위에있다면감수성균주는전부사멸되거나증식이억제되고, 오직내성균주만이살아남아증식하여전체를차지한다. 이런항생물질의작용을내성균주의선택 (selection of resistant mutants) 이라하고, 이전체현상을돌연변이 - 선택 (mutation and selection) 이라한다. 항생물질이내성을야기시키는돌연변이원 (mutagen) 으로작용하지않고오직선택물질 (selection agent) 로작용한다는것은실험적으로증명할수있다. [2] 내성의세포간전달 내성의유전적측면 내성균주에존재하는내성관련유전정보가감수성균주에전달되어내성균주를만들수있다. 임상적으로중요한균주사이에서내성의확산은주로내성관련유전정보의세포간전달에의해이루어진다. 세균의항생제에대한내성은크게자연내성 (intrinsic resistance) 과획득내성 (acquired resistance) 으로구분된다. 자연내성은균속 (genus) 혹은균종 (species) 에따라특이하며, 항생제의항균범위는자연내성에의해서결정된다. Vancomycin 은그람양성세균에대해서는항균력이강하지만, 그람음성세균에대한항균력은없는데, 이는 vancomycin 의분자가크고, 소수성 (hydrophobic) 이어서그람음성세균의외막을투과할수없기때문이다. 획득내성은세균의염색체유전자변이 (mutation) 나, plasmid 혹은 transposon 에매개되는내성유전자의획득에의해서생기며, 일부균주만이갖는다. Enterococcus faecalis 대부분은 vancomycin 에감수성이지만, 일부균주는 vana 혹은 vanb 유전자의획득에의하여이항생제에내성이다. 121/665

40 [2] 내성의세포간전달 내성의유전적측면 내성유전자는염색체혹은 plasmid 에존재한다. 염색체 DNA 는안정적인데반하여, plasmid DNA 는균종내, 균종간, 심지어는균속간을손쉽게이동한다. 또한 plasmid 는여러가지내성유전자를동시에지닐수있기때문에 (R-factor), 여러가지항생제에대한내성을한꺼번에전달할수있다. 내성유전자의전달방법은접합 (conjugation), 형질도입 (transduction, bacteriophage 에의한내성유전자전달 ), 형질전환 (transformation, 균종간 DNA 의직접전달 ) 등다양하다. 이중 conjugation 은가장흔한내성전달기전이며, 그매개체는 plasmid 혹은 transposon 이다. Transposon 은내성유전자를지니고세균사이를자유롭게이동하기때문에, conjugative transposon 혹은 'jumping gene' 이라고도불린다. 122/665 [2] 내성의세포간전달 내성의유전적측면 일부세균은항생제에노출되면항생제에대한내성정도가강해지는데, 이를유도내성 (induction) 이라한다. 세균의내성은유도성에따라서구성형 (constitutive) 과유도성 (inducible) 으로나눌수있다. E. coli 의염색체성 AmpC 형 β-lactamase 는효소생성량이작고, 항생제자극에의해서유도되지않으므로 (constitutive), 이세균은새로운내성유전자를획득하지않는한 ampicillin 과협범위 cephalosporin 에감수성이다 Enterobacter 는 E. coli 와유사한염색체성 AmpC 형 β-lactamase 를생성한다. Enterobacter 는 ampicillin 이나협범위 cephalosporin 에노출되면유도에의해서 β-lactamase 를다량생성하므로 (inducible), 이들항생제에내성이다. 그러나이들항생제에노출된 Enterobacter 중일부균주는염색체유전자의변이에의해서탈억제 (derepressed) 균주가된다. 탈억제균주는항생제자극과는상관없이 β-lactamase 를계속다량생성하므로, 역시이들항생제에내성이다. 123/665

41 내성의유전적측면 (Science 264, (1994)) 124/665 항생제내성균발생에대한대책 항균제의올바른사용으로현존하는항균제수명의연장환자의병원균을가능한한빨리제거하는것이항생제내성균의발생을감소시킬수있다. 각항생제의약동학적, 약력학적특성을잘숙지하여올바른처방을해야한다. 바이러스성질환에는항생제를투여하지않는다. 정확한원인균의진단을통해항생제를처방한다. 새로운항균제의개발예방접종질병을제어하는다른방법의사용 125/665

42 Antimicrobial consumption and impact on resistance The use of antimicrobial agents fuels antimicrobial resistance A higher antimicrobial resistance is expected to occur in those scenarios with higher selection density (hospitals) The increment of antimicrobial consumption leads to the increase of antimicrobial resistance Conversely, the decrease of antimicrobial use leads to the decrease of antimicrobial resistance Unexpected results might be observed when correlates antimicrobial consumption and antimicrobial resistance 126/665