<28B0A1C7F6BCF6C1A C0FD2DC3E0BCF6BBEAB9B020C0AFC7D8B9B0C1FA20BAD0BCAEB9FD20C6EDB6F E687770>

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3 발 간 사 최근 축 수산물의 소비가 급속히 늘어남에 따라 축산업 및 수산업도 점차 기업화, 대규모화 되고 있습니다. 이에 따라 질병 예방을 위해 사 용되는 동물용의약품과 환경으로부터 기인된 유해물질이 축 수산식품 에 잔류될 가능성이 더욱 높아가고 있습니다. 국제교역도 가속화되고 있 어 수입 축 수산식품의 안전성 관리도 더욱 강화되어야 할 시점입니다. 또한 한국인의 식생활에서도 동물성 단백질인 축 수산식품이 차지하는 비중이 날로 커짐에 따라 국민 건강 보호와 증진을 위하여 안전한 축 수산식품의 생산과 공급은 그 어느 때 보다도 중요하다 하겠습니다. 이러한 추세에 부응하기 위하여 저희 농림수산검역검사본부에서는 국내산 및 수입 축 수산물에 대하여 철저한 유해화학물질 검사를 실시하고 있습니다. 더불어 안전하고 위생적인 동물성식품의 생산기법 연구, 유해화학물질의 잔류 예방을 위한 첨단분석기술개발 등 동물성 식품의 안전성 확보를 위하여 다각적인 노력을 경주하고 있습니다. 특히 각종 유해화학물질 을 신속하고 정확하게 검출하기 위하여 초정밀 분석기기를 확보하고 전문가를 양성하는 등 세계 최고 수준의 전문성과 신뢰성을 유지하기 위하여 지속적인 연구와 노력을 기울이고 있 습니다. 이번 축 수산물 유해물질 분석법 편람 은 2009년도 우리 본부에서 펴낸 바 있는 축 산물의 유해물질 분석법 편람 - 동물약품 편 에 수산물의 잔류분석법을 추가 보완하여 최 신화 한 것으로 잔류검사 기술의 표준화와 국제화를 위하여 관련업무 담당자들간 최신 검사 기술을 공유하는데 그 취지가 있습니다. 이들 분석방법은 CODEX, 미국, EU 등에서 권장하 는 분석 지침을 최대한 준수하였습니다. 아울러 이번 편람에 수록된 잔류분석법들은 국내외 분석기법을 참고하여 일부 변형한 개량법이 포함되어 있으며 향후 보완 및 검증을 거쳐 공 정검사법으로 발전시켜 나가고자 합니다. 아무쪼록 이 편람이 축 수산물 안전관리를 담당하고 있는 저희 검역검사본부 뿐만 아니라 시 도 지자체 관련업무 담당자들에게 잔류화학물질 분석법의 기본원리와 세부방법을 익히 는데 지침서가 되길 바라며, 축 수산식품뿐 아니라 농산물의 안전성 확보에도 활용될 수 있 기를 기대합니다. 끝으로 바쁜 업무 수행 중에도 이 편람 발간을 위하여 수고하여 주신 직원 여러분께 깊이 감사드립니다. 농림수산검역검사본부장 수의학박사

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5 축산물의 잔류 동물용의약품 분석법 1 Ⅰ. 총 칙 3 II. 간 이 검 사 법 7 Ⅱ-1 식육의 잔류 항균물질 간이검사법 9 II-1-1. EEC 4-plate 법 11 II-1-2. 퀴놀론계 항균물질 간이검사법 17 II-1-3. 식품공전의 항균물질 간이검사법 19 Ⅱ-2 우유의 잔류 항균물질 간이검사법 23 II-2-1. TTC-II 법 23 II-2-2. 식품공전의 디스크법 26 Ⅱ-3 식용란의 잔류 항균물질 간이검사법 27 II-3-1. Four-plate법 27 II-3-2. 퀴놀론계 항균물질 간이검사법 30 Ⅱ-4 혈청 등 체액시료의 잔류 항균물질 간이검사법 32 II-4-1. 박층크로마토그래피 (SOS 검사) 32 II-4-2. 미생물학적 방법 (BmDA 법) 35 Ⅱ-5 신속간이검사킷트 소개 39 II-5-1. Premi Test kit 39 II-5-2. KIS (Kidney Inhibition Swab) Test kit 41 II-5-3. ROSA (Rapid One Step Assay) kit 43 II-5-4. SMART kit 45 II-5-5. SensiCheck kit 50 III. 미생물수용체법 (Charm II Receptor Assay) 55 Ⅳ. 축산물의 잔류 동물용의약품 동시 다계열 스크리닝법 65 V. 정밀정량검사법 79 Ⅴ-1 잔류 동물용의약품 확인정량검사 매뉴얼 81 Ⅴ-2 페니실린계 항균물질 분석법 89 Ⅴ-3 세팔로스포린계 항균물질 분석법 94

6 Ⅴ-4 테트라싸이클린계 동시 분석법 99 Ⅴ-5 마크로라이드계 항균물질 분석법 104 Ⅴ-6 아미노글리코사이드계 분석법 109 Ⅴ-7 설파제 및 답손, 오르메토프림, 트리메토프림 동시분석법 115 Ⅴ-8 퀴놀론계 항균물질의 동시분석법 121 Ⅴ-9 폴리에테르계 항균물질 분석법 128 Ⅴ-10 항원충제 잔류분석법 132 Ⅴ-11 구충제 (벤지미다졸계, 아버멕틴계, 레바미졸, 클로산텔 등) 분석법 137 Ⅴ-12 암페니콜계열 분석법 141 Ⅴ-13 β- agonists (클렌부테롤, 락토파민, 질파테롤)의 잔류분석법 146 Ⅴ-14 Glucocorticoids 잔류분석법 150 Ⅴ-15 NSAIDs 잔류분석법 154 Ⅴ-16 호르몬 잔류분석법 159 Ⅴ-17 DES 및 Zeranol 분석법 163 Ⅴ-18 발네물린 및 티아물린 동시 분석법 168 Ⅴ-19 린코마이신 분석법 172 Ⅴ-20 아자페론, 카라졸롤 잔류시험법 175 Ⅴ-21 퀴녹살린계 (카바독스, 올라퀸독스)의 잔류분석법 178 Ⅴ-22 니트로푸란계 잔류분석법 183 Ⅴ-23 디메트리다졸, 메트로니다졸, 로니다졸 동시 분석법 190 Ⅴ-24 클로르프로마진, 피리메타민, 콜치신 잔류분석법 194 Ⅴ-25 반코마이신 (Vancomycin) 잔류분석법 197 Ⅴ-26 티오우라실 (Thiouracil) 잔류분석법 200 Ⅴ-27 메드록시프로게스테론 아세테이트 잔류분석법 204 Ⅴ-28 유기염소계 농약 잔류분석법 207 Ⅴ-29 카바메이트계 농약 잔류분석법 211 Ⅴ-30 중금속 잔류분석법 215 Ⅴ-31 잔류성유기오염물질 (POPs) 분석법 219

7 수산물의 잔류 동물용의약품 분석법 237 I. 수산물의 잔류 동물용의약품 분석법 237 Ⅰ-1 간이시험법 239 Ⅰ-2 정밀정량검사법 244 Ⅱ. 수산물의 유해물질분석법 303 Ⅱ-1 납 잔류분석법 305 Ⅱ-2 카드뮴 잔류분석법 306 Ⅱ-3 총수은 잔류분석법 307 Ⅱ-4 메틸수은 잔류분석법 308 Ⅱ-5 벤조피렌 잔류분석법 309 Ⅱ-6 엔도설판 잔류분석법 312 Ⅱ-7 트리플루라린 잔류분석법 315 Ⅱ-8 PCBs 잔류분석법 318 참고자료 (잔류물질 실험실 운영가이드) 323

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9 축산물의 잔류 동물용의약품 분석법 - 1 -

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11 Ⅰ 총 칙 - 3 -

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13 Ⅰ. 총 칙 1. 이 편람에 등재된 시험법은 축산물위생관리법 시행규칙 별표 9의 3 <축산물위생 검사기관의 검사 업무 수행에 관한 규정 (제28조의4 관련)> 제5항, 축산물위생검사 기관은 축산물의 가공기준 및 성분규격에 정한 규정에 따라 검사를 하되, 검사결과의 신뢰성 정확성을 확보할 수 있는 범위에서 검역검사본부장이 인정하는 경우에는 다른 시험방법으로 검사할 수 있다. 에 의거하여 수입산 및 국내산 축산물 검사 방법으로 활용할 수 있음. 2. 시험에 있어 규정된 값 (규격치라 한다)과 시험에서 얻은 값 (실험치라 한다)을 비교하여 적부판정을 할 때에, 실험치는 규격치보다 한자리 수까지 더 구하여 더 구한 한자리수를 반올림해서 규격치와 비교 판정한다. 또 규격치가 a~b라고 기재된 것은 a 이상 b 이하임을 말한다. 예시> 겐타마이신의 소근육에서의 잔류허용기준 : 0.1 mg/kg 적부판정시 0.14 mg/kg 적합 0.15 mg/kg 기준 초과로 위반 3. 별도로 잔류허용기준이 정해지지 아니한 경우, 다음 각 항의 기준을 순차적으로 적용한다. 가. CODEX (국제식품규격위원회) 기준 나. 유사 식용동물의 잔류허용기준 중 해당부위의 최저기준. 즉, 기준이 정하여지지 아니한 포유류 중 반추동물, 포유류 중 비반추동물, 가금류, 어류 및 갑각류는 각각 기준이 정하여진 반추동물, 비반추동물, 가금류, 어류, 갑각류 해당 부위의 기준 중 최저기준 (단, 비반추동물 중 말은 기준이 있는 반추동물에 해당하는 기준 적용) 다. 항생물질 및 합성항균제에 대하여 축 수산물 (유, 알 포함) 및 벌꿀 (로얄젤리, 프로폴리스 포함)의 잔류기준을 0.03 mg/kg으로 일괄 적용 4. 단위는 국제단위계 (SI)의 단위를 사용한다. 1) 수치와 단위 기호를 표시할 때 그 사이를 반 칸 (컴퓨터로서는 1 바이트) 띄운다. 백분율 (%)도 한 칸 띈다. 예시> 35 mm ( ) ; 35mm ( ), 25 ( ) ; 25 C ( ) - 5 -

14 2) 자릿수가 많은 숫자를 표시할 때는 소수점을 중심으로 세 자리마다 한 칸씩 띄어서 (컴퓨터로서는 1바이트) 기록한다. 단, 4 자리인 경우에는 사이를 띄우지 않아도 된다. 3) 양의 범위를 표시하는 경우에는 수치 부분을 괄호로 묶고 공통되는 단위 기호는 뒤에 쓴다. 예시> 23.4 ± 0.1 ( ) ; 23.4 ± 0.5 ( ), ( 23.4 ± 0.5) ( ) 23.4~25.7 ( ) ; ( 최저 23.4, 최고 25.7 ) ( ) 4) 괄호를 사용할 때는 괄호 앞을 약간 (0.5~1칸, 컴퓨터에서는 1 바이트) 띄우는 것이 좋다. 단, 화합물이나 계산식 등에서는 괄호 앞을 띌 수 없다. 5) 양 ( 量 )의 기호는 이탤릭체 (사체)로 쓰며, 단위 기호는 로마자 (직립체)로 기록한다. 단, 단위의 명칭이 고유명사에서 유래한 것은 첫 글자를 대문자로 기록한다. 예시> 양 의 기호 : m ( 질량), t ( 시간 ), l ( length), 단 위 기호 : m ( meter), t ( ton), L or l ( liter) 단 위 기호 : K, Pa, Hz, N, W, F, V, Da 등 6) 농도를 표시할 때 ppm, ppb, ppt 등은 SI 단위가 아니므로 사용할 수 없으며 질량 또는 부피 단위를 확실하게 표시해야만 한다. 부피를 나타낼 때의 리터는 대문자를 사용하는 것이 혼동을 줄일 수 있다. 예시> 2 mg/l ( ) ; 2 mg/kg ( ) ; 2 p p m ( ), 2 p p b ( ), 2 p p t ( ) 5 mg/l ( ) ; 5 mg/l ( ), 5 mg/l ( ) 5mg/L ( ) 1 L ( ) ; 1L ( ) ; 1 l ( ) ; 1l ( ) ; 1l (?) -십일?, 일 리 터? 7) 가능한 한 m, kg, L 단위를 사용하도록 조정하는 것이 좋다. 예시> mg/kg ( ), μg/g ( ), ug/g ( ) ; mg/l ( ) ; μg/ml ( ), ug/ml ( ) 8) 극미량의 수치 표현에서 prefix (접두어) 로서 micro- (μ, 10-6 )를 사용할 때, u" 를 사용해서는 안 된다. 1 u"는 1 Da 이며 kg 의 atomic mas s unit 이기 때 문이다. 예시> μm ( ), um ( ) ; μg ( ), ug ( ) ; μl ( ), ul ( ) 9) 단위 기호는 복수의 경우라 해도 복수로 표시하지 않으며, 단위 기호 뒤에 마 침표 등 다른 기호나 다른 문자를 첨가해서는 안 된다. 예시> 3 kg ( ) ; 3 Kg ( ), 3 kgs ( ) 5 s ( ) ; 5s ( ) ; 5 s ec ( ) ; 5 s ec. ( ), 5 s ec s ( ) 5 min ( ) ; 5min ( ) ; 5 min. ( ), 5 mins ( ) 5 h ( ) ; 5h ( ) ; 5 h. ( ) ; 5 hr. ( ) ; 5 hrs ( ) - 6 -

15 10) 두 개 이상의 단위가 분수로 표시되는 때에는 사선, 횡선, 음의 지수, 또는 괄호 묶는 등의 방법으로 표기해야만 한다. 사선 (/) 다음에 두 개 이상의 단위가 올 때에는 반드시 괄호로 묶어 표시한다. 예시> m s, m/s, 또는 m s -1 ( ) 11) 어떤 양을 한 단위와 수치로 나타낼 때 보통 수치가 0.1과 사이에 오도록 접두어를 선택하여 표시하는 것이 좋다. 예시> mm ( ) 12.3 m ( ), μm ( ) 1.23 nm ( ) 단, 다음의 경우는 예외임. 가 넓이나 부피를 나타낼 때 헥토, 데카, 데시, 센티가 필요한 경우. 나 같은 종류의 양의 값이 실린 표나 주어진 문맥에서 그 값을 비교하거나 논의할 때 다 관례적인 특수한 분야 : 기계공학 도면에서 단위는 항상 mm 임. 12) 원소들의 기호는 한 자 또는 두 자로 되어 있다. 한 자인 경우는 반드시 대문 자이고, 두 자로 되어 있는 경우에는 첫 자는 대문자임. 예시> Na ( ), NA ( ), Pb ( ), PB ( ), Cl - ( ), cl - ( ), SO 2-4 ( ), So 2-4 ( ) 13) 장치 및 기구에서 수시로 오류를 범하는 용어 예시> Chromatograp h: 크로마토 그 래 프 ( ins trument, 기기) Chromatography : 크로마토그래피, 크로마토그래프법 (method, 시험법) Balanc e : 저울 ( ), 천칭 ( ), 천평 ( ) 14) rpm ---> r/min 15) MΩ ---> MΩ c m 2 16) 습도를 나타낼때는 상대습도 (relative humidity, RH)로 표기한다. 예시> 27 % R H ( ), 27 % ( ) - 7 -

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17 Ⅱ 간이검사법 - 9 -

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19 II. 간 이 검 사 법 Ⅱ-1 식육의 잔류 항균물질 간이검사법 II-1-1. EEC 4-plate 법 1. 원 리 이 방법은 축산물의 가공기준 및 성분규격 (농림수산검역검사본부 고시)에 정하여진 간이검사법으로서 잔류 항균물질의 검출범위를 넓힐 목적으로 Bacillus subtilis (Bs)와 Micrococcus luteus (Ml) 두 종류 균주를 사용하고 배지의 ph 조건을 6.0, 7.2, 8.0, 8.0으로 한다. 이와 동시에 ph 7.2 배지에는 설파제의 검출감도를 높일 목적으로trimethoprim (TMP)을 일정농도로 첨가하여 검사한다. 즉, ph 조건과 시험균을 조합하여 ph 6.0 Bs, ph 7.2 Bs, ph 8.0 Bs 및 ph 8.0 ml 4가지 종류의 평판을 만들고 사방1 cm의 식육이나 체액을 흡수시킨 디스크를 평판에 올려 배양하여 일정 크기 이상의 균발육 억제대가 형성되면 항균물질이 잔류하는 것으로 판정하는 방법으로 디스크법과 직접법이 있다. 신선육의 경우 필터페이퍼 디스크 (filter paper disc)에 의해 육즙 흡수가 용이하지 않아 냉동시 1일이 추가 소요되며 직접법 (사방 1 cm, 두께 2 mm 정도로 식육을 잘라 시험용 평판에 올려 검사하는 방법)을 사용하는 경우 검사시간을 단축할 수 있고 기존의 디스크법과 직접법간의 검출능의 비교 검토결과에서도 두 방법간에는 동등한 수준의 검출감도를 나타내는 것으로 확인되어 현행 EEC 4-plate법의 디스크법과 직접법을 병용하는 방법을 사용할 수 있다. 2. 시험 재료 가. 시험균 1) Bacillus subtilis (Bs) 2) Micrococcus luteus (Ml) 나. 배지 1) 계대, 증식용: Nutrient agar slant, tryptic soy broth (TSB) 2) 시험용: Merck's test agar (ph 6.0, ph 7.2, ph 8.0) 등 동등품 3) 아포 조제용: AK #2 sporulating agar (BBL) 4) 균수 측정용: plate count agar (PCA) 또는 nutrient agar 다. 표준품 : Penicillin G, sulfamethazine, streptomycin, trimethoprim

20 라. 페트리접시 : perti-dish (87 15 mm, 녹십자 또는 이와 동일한 규격품) 마. 디스크 직경 6 mm paper disc (Schleicher & Schuell No 또는 Adventec No ), 지육 검사용 디스크 (직경 10 mm paper disc, Adventec No ) 바. 기타 균질기 (Stomacher), 캘리퍼스 또는 눈금자, 원심분리관 (50 ml), 항온수조 (50 ), 배양기 (30 ), 멸균 피펫 (10 ml), Roux bottle, 외과용 메스 (No. 22) 등 3. 시험균액의 조제 가. B. subtilis BGA 아포액 조제 1) 증류수 1 L에 해당하는 AK #2 sporulating agar (BBL) 또는 MnSO 4 H 2 O 0.05 g을 보충한 nutrient agar에 agar 5 g을 추가하여 끓인 후 Roux bottle에 250~300 ml를 분주하여 121, 15분간 고압증기 멸균한 다음 굳힌다. 2) Nutrient agar slant로 37 에서 하룻밤 배양한 종균을 멸균증류수2~3 ml로 집균한다. 3) Roux bottle 평판에 이식하여 37, 18~24시간 배양한 후 실온에 6일간 방치한다. 4) 멸균 유리구슬 (직경 4 mm)과 멸균증류수 25 ml를 넣고 조심스럽게 흔들어 집균하여 멸균 원침관에 옮긴 후 항온 수조 65, 30분간 가열한다. 5) r / min으로 10분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 일정량의 멸균 증류수를 넣어 vortex mixer로 부유시켜 원심분리한다. 이와 같이 침전물에 멸균증류수로 부유하여 원심분리하는 세척과정을 총 3회 반복한다. 6) 마지막으로 원심분리하여 상층액을 버리고 남은 침전물에 20 ml의 멸균증류수로 재부유시켜 70, 30분간 가열한다. 7) 이 아포원액을 plate count agar (PCA) 또는 nutrient agar를 이용해 나.항의 방법에 따라 아포액의 농도를 측정하여 멸균 증류수로 10 7 ~10 8 CFU/mL가 되도록 조정한 stock suspension 상태로 4 냉장보관하면서 사용한다. 8) 시험용 평판을 만들기 위하여stock suspension 1 ml을 취하여 멸균 증류수 9 ml 또는 99 ml을 가하여 CFU/mL로 희석한다 (working suspension). 나. 아포액의 농도 측정 1) 멸균증류수를 사용하여 가. 6)항의 아포원액을 10배 단계 희석하여 10-4 ~10-7 이 되는 희석용액을 만든다. 2) 희석용액의 1 ml씩을 각 희석농도별 3개의 perti-dish에 분주한다. 여기에 멸균하여 약 50 로 유지한 plate count agar 또는 nutrient agar 배지를 적당량 첨가하여 좌우로 잘 흔들어 희석균액과 배지를 고르게 혼합하여 굳힌다

21 3) 그 위에 같은 배지를 적당량 중층시켜 굳힌 후 30 배양기에서 48시간 배양한다. 4) 집락수가 30~300개 되는 희석배수의 plate를 선택하여 평균집락수를 구하고 가. 6)항 아포원액의 ml당 아포 농도를 환산한다. 예를 들어 10-6 희석 농도에서 평균 집락수가 50개일 경우, 아포 원액의 균수는 CFU/mL이다. 다. M. luteus ATCC 9341 균액 Tryptic soy broth (TSB) 20 ml에 계대 보존균을 직경2 mm 백금이로 1 loop를 접종하여 32 water bath에서 16시간 진탕배양 (약 80 r / min)한다. 이 균액 1 ml를 19 ml의 멸균증류수에 희석하여 사용하며 (이때 균농도는 약 2x10 7 CFU/mL이 된다), 이 희석균액은 4 냉장보관 하면서 약 1주일간 사용할 수 있다. 4. 시험용액의 조제 가. Penicillin G (PG) 용액 일정 단위 (unit)의 PG Na 또는 PG K 60 mg을 100 ml의 용량플라스크에 취해 멸균 증류수로 표시선까지 맞춘 다음 다시 1 000배 희석하여 1 IU/mL (또는 0.6 μg ml -1 )이 되도록 희석하여 사용한다 (PG 1 unit= 0.6 μg). 나. Sulfamethazine (SMZ) 용액 100 mg의 SMZ를 100 ml의 용량플라스크에 취해 10 ml의 methanol로 녹인 다음 멸균 증류수로 표시선까지 맞추어 혼합하고 (1 mg ml -1 ) 다시 동일한 크기의 용량플라스크에 이 용액 5 ml을 취해 희석하여 사용한다 (50 μg ml -1 ). 다. Streptomycin (SM) 용액 100 mg의 SM을 100 ml의 용량플라스크에 취해 멸균증류수로 혼합하고 (1 mg ml -1 ) 다시 동일한 크기의 용량플라스크에 이 용액5 ml을 취해 희석하여 사용한다(50 μg ml -1 ). 라. Trimethoprim (TMP) 용액 10 mg의 TMP를 100 ml의 용량플라스크에 취해 10 ml의 methanol로 녹인 다음 멸균 증류수로 표시선까지 맞추어 다시 이 용액을 10배 희석하여 사용한다 (1 mg ml -1 ). 5. 시험용 평판 조제 검사할 시료의 수와 소요될 한천평판의 수를 산출하여 필요한 배지량을 결정한 후 증류수 1 L당 Peptone 6.9 g, NaCl 5.1 g, KH 2 PO g 및 agar 13.0 g을 평량하여 삼각플라스크에 취한다. 이 배지 대신에 배지조성이 거의 동일하며 ph의 조정이 필요 없이 사용할 수 있는 제품으로 Merck사에서 시판되고 있는 Test agar, ph 6.0 (No ), ph 7.2 (No ) 및 ph 8.0 (No )를 사용할 수 있다. 증류수를 넣어 끓인 배지를 고압증기멸균한 다음4개의 삼각플라스크 또는 공병에 동일한 양을 분주한다. 멸균한 배지를 약 50 항온수조에 약 2시간 동안 방치한 후 1 N NaOH, 1 N HCl을 사용하여 ph를 조정한다 (Bs: ph 6.0, 7.2, 8.0, ml: ph 8.0). 필요한 수량의 perti-dish를 준비하여 균주명, ph, 제조일 등을 기입한다

22 가. Bacillus subtilis (Bs) 평판 1) Bs 아포액이 사용되는 Bs, ph 6.0 등 세 종류의 배지에는 아포액 working suspension ( CFU/mL)을 65, 30분간 가열한 후, 배지 100 ml당 1 ml씩을 첨가한다. 이 때 배지내 시험균의 최종농도는 Bs CFU/mL이 된다. 2) Bs, ph 7.2 평판에는 희석한 아포액을 첨가하고, 동시에 TMP 10 μg ml -1 용액도 함께 배지 100 ml 당 1 ml를 첨가한다 (0.1 μg TMP/mL agar). 3) 아포액과 TMP 첨가 후 즉시 1분간 잘 혼합하여 피펫으로 6 ml씩 perti-dish (87 15 mm)에 분주하여 고르게 편 후 굳힌다. 이때 배지두께는 약 1 mm가 된다. 4) perti-dish의 뚜껑을 살짝 열어 둔 상태로 30분간 방치한 후 사용한다. 사용하고 남은 시험용 평판은 냉장 보관하면서 2~3일간 사용할 수 있다. 특히, Bs ph 6.0 평판은 보관기간을 준수하여야 한다. 나. Micrococcus luteus (Ml) 평판 1) ml, ph 8.0 배지에는 증류수 ml당 약 CFU로 희석한 균액을 Bs 평판과 동일한 비율로 배지 100 ml 당 1 ml를 첨가한다. 이 때 배지내 시험균의 최종농도는mL CFU/mL이 된다. 2) 시험균액을 첨가한 후 약 1분간 잘 혼합하여 피펫으로 6 ml씩 perti-dish에 분주하여 뚜껑을 살짝 열어 둔 상태로30분간 방치한 후 사용한다. 사용하고 남은 시험용 평판은 냉장보관하면서 1주일 이내에 사용한다. 6. 시험용 평판 및 시료의 검사 가. 시험용 평판의 검사 시험용 평판을 검사하기 위한 항균물질과 표준용액농도는 아래의 표와 같다. 미리 준비한 항균물질 표준용액을 사용하여 각 10 μl씩 취해 시험용 평판에 올려놓은 직경 6 mm paper disc에 흡수시킨 후 32 에서 16시간 배양하여 시험균의 발육 억제대를 관찰한다. 이때 발육억제대의 크기는 디스크 바같쪽의 최소 주변 발육억제대가6~8 mm 이상이어야 한다. 시험용평판의 검사조건 시험용평판 항균물질 표준용액농도 디스크당 함량 최소주변억제대 Bs (ph 6.0) Bs (ph 7.2) Bs (ph 8.0) Ml (ph 8.0) Penicillin G-Na Sulfamethazine Streptomycin Steptomycin 1 IU/mL 50 μg ml μg ml μg ml IU 0.5 μg 0.5 μg 0.5 μg 6 mm 이상 6 mm 이상 8 mm 이상 6 mm 이상

23 나. 시료의 검사 1) 디스크법 (1) 가능한 한 외과용 메스 (No. 22)를 사용하여 무균적으로 도살된 식용동물의 근육을 절개한 후 핀셋으로 시료 당 지육 검사용 디스크 (직경 10 mm paper disc) 4개씩을 삽입하여 30~60분간 육즙을 흡수시킨다. (2) 육즙을 흡수시킨 후 디스크를 꺼내어4종류의 검사용 평판에하나씩 올려놓고 가볍게 눌러준 다음 실온에 약30분간 방치하여 32 배양기에 넣어 16시간 배양한 후 결과를 판정한다. 2) 직접법 (1) 시료를 가능한 한 무균적으로 사방 1 cm, 두께 2 mm 정도로 잘라 4 종류의 검사용 평판에 각각 올려놓고 실온에서 약 30분간 방치한 후 페트리접시를 도치하지 않고 32 배양기에 넣어 16시간 배양하여 결과를 판정한다. 7. 시험결과 판정 가. 결과판정 방법 캘리퍼스 또는 zone reader 등을 사용하여 시험균의 발육 억제대를 측정한 결과, 디스크법의 경우 디스크 직경 10 mm를 포함하여 억제대가14 mm 이상인 평판이 하나 또는 그 이상일 경우 해당시료를 양성으로 판정하며, 직접법의 경우 최소주변억제대 폭이 1 mm 이상인 평판이 하나 또는 그 이상일 때 양성으로 판정한다. 억제대 측정시 세균의 발육억제대가 분명한 곳에 발생하는 개별적인 집락은 무시하고 세균오염 등으로 인해 억제대가 불분명할 경우는 시험을 반복한다. 재시험에서도 명백한 양성이 아닐 경우에는 음성으로 판정한다. 나. 양성시료의 항균물질 계열 추정 이 시험법으로 각 항균물질의 표준용액을 각 disc 당 75 μl씩 흡수시킨 다음 배양했을 경우 다음 표에 나타낸 바와 같이4종의 평판에서 억제대가 형성되는 양상을 비교함으로써 잔류 항균물질의 계열을 어느 정도 추정할 수 있다. 그러나 잔류량이 높은 경우나 여러 항균물질이 복합적으로 잔류할 경우 추정은 거의 불가능하다. 따라서 이 시험법은 단순한 추정에 불과하고 양성인 시료에 대하여는 미생물수용체법, HPLC 등을 이용하여 확인분석이 필요하다

24 EEC 4-plate 법의 표준 항균물질에 대한 최저검출한계 (μg ml -1 ) 항 균 물 질 Bs 평판 ph 6.0 Bs 평판 ph 7.2 Bs 평판 ph 8.0 Ml 평판 ph 8.0 β-lactams Penicillin G Ampicillin Amoxicillin Cloxacillin Nafcillin Cephalexin Cephazolin Aminoglycosides Streptomycin Dihydrostreptomycin Gentamicin Neomycin Macrolides Erythromycin Spiramycin Tylosin Oleandomycin Lincomycin Tetracyclines Tetracycline Chlortetracycline Oxytetracycline Sulfonamides Sulfamethazine Sulfamerazine Sulfadimethoxine Sulfamonomethoxine Sulfaquinoxaline Sulfathiazole Polypeptides Bacitracin Polyethers Monensin Nitrofurans Furazolidone Quinolones Oxolinic acid Others Spectinomycin Chloramphenicol Trimethoprim > > >100 >100 > >100 > >100 >

25 II-1-2. 퀴놀론계 항균물질 간이검사법 1. 원리 EEC 4-plate법이 퀴놀론계 항균물질에 대한 검출감도가 떨어지는 점을 보완하기 위하여 이들 물질에 민감한 E. coli 균주를 이용하여 퀴놀론계 항균물질을 잔류허용기준 수준까지 검출할 수 있도록 한 스크리닝법이다. 2. 시험재료 가 시험균: E. coli ATCC 나. 배지: 1) 계대용: Nutrient agar 2) 증균용: Nutrient broth 3) 시험용: Test Agar (이하 TA 라고 한다), ph 6.0±0.1 (Merck사, 독일) 또는 동등 규격품 다. 지육검사용 디스크: 직경 10 mm 라. 페트리디쉬: mm 마. 기타 균질기 (stomacher), 캘리퍼스 또는 눈금자, 원심분리관 (50 ml), 항온수조 (50 ), 배양기 (30 ), 멸균 피펫 (10 ml) 등 3. 시험균액의 조제 시험균액은 20 ml nutrient broth에 계대보존 균주를 직경 1 mm 백금이로 1 회 접종하여 30 배양기에서 16~18시간 배양한 후 이 균배양액을 시험균액으로 사용한다. 4. 시험용평판 조제 검사시료수를 고려하여 소요될 시험용평판의 수를 산출하고 필요한 배지량을 결정한 후 다음과 같이 시험용평판을 만든다. 가. 공병에 조제하고자 하는 양의 증류수를 가한 후 배지병 표면 label에 표기된 해당량의 시험용배지 (TA)를 평량하여 넣고 가열판 (hot plate)에 놓아 배지를 끓인다. 나. 고압증기멸균기 (autoclave)를 사용하여 배지를 고압증기멸균 (121, 15분간)한 다음 항온수조 혹은 배양기 (약 50 )에서 약 2시간 둔다

26 다. 해당 배지 100 ml당 시험균액 0.5 ml (배지량의 0.5 %) 첨가하여 시험균액이 고르게 혼합되도록 약 1분간 잘 혼합한다. 라. 10 ml용 멸균피펫으로 시험균액 혼합 배지 8 ml씩을 취하여 해당 petri dish에 분주하여 뚜껑을 살짝 열어 둔 상태로 약 10분간 방치하여 배지를 굳힌다. 곧바로 시험용 평판을 사용하지 않을 경우 랩으로 싸서 4 냉장고에 보관한다. 조제한 시험용 평판은 4 냉장보관하면서 2~3 일내 사용한다. 5. 시료의 검사 외과용 메스를 이용하여 근육(살코기 부분)을 절개한 후 핀셋으로 지육검사용 디스크(직경 10 mm) 1 개를 삽입하여 30~60분간 육즙을 흡수시킨다. 이후 디스크를 꺼내어 시험용 평판에 올려 가볍게 눌러 고착시켜 30 배양기에 넣어 16시간 배양한 후 퀴놀론계 항균물질의 잔류여부를 판정한다. 6. 시험결과 판정 캘리퍼스 또는 눈금자를 사용하여 시험균의 발육 억제대를 측정한 결과, 디스크의 직경 10 mm를 포함하여 억제대가 12 mm 이상일 경우 해당시료를 양성으로 판정한다. 억제대 측정시 세균의 발육억제대가 분명한 곳에 발생하는 개별적인 집락은 무시하고 세균오염 등으로 인해 억제대가 불분명할 경우는 시험을 반복한다. 재시험에서도 명백한 양성이 아닐 경우에는 음성으로 판정한다. E. coli 균주에 의한 퀴놀론계 항균물질의 검출감도 (μg ml -1 ) 항균물질 검출감도 항균물질 검출감도 Ciprofloxacin 0.01 Norfloxacin 0.1 Danofloxacin 0.05 Ofloxacin 0.05 Enrofloxacin Pefloxacin

27 II-1-3. 식품공전의 항균물질 간이검사법 1. 원리 식품공전의 간이검사법은 과거 항균물질 간이검사법과 합성항균제 (설파제) 간이 검사법 으로 구분되었었으나 식품의 기준 및 규격의 개정(식약청고시 제 호)으로 하나의 시험법 으로 통합되었다. 이 방법은 B. subtilis 등 4 가지 종류의 균주와 각각의 배지를 조합하여 4종의 시험용 평판을 만들고 식육을 일정 크기로 잘라 직접 시험용 평판위에 올려 검사하거나 식육내 잔류하는 항균물질을 2 가지 종류의 추출완충액으로 추출한 다음 추출액에 디스크를 침지하여 해당 시험용 평판에 올려 배양한 후 일정 크기 이상의 억제대의 형성 여부로 잔류여부를 판정한다. 2. 시험재료 가. 시험균 1) B. megaterium ATCC ) B. subtilis ATCC ) B. cereus var. mycoides ATCC ) B. stearothermophilus ATCC 나. 배지 1) 계대, 증식용:Nutrient agar 2) 시험용:Antibiotic medium No. 2 (ph 6.55±0.05, AM #2), AM #5 (ph 7.9±0.1), AM #8 (ph 5.85±0.05), Mueller Hinton medium (ph 7.3±0.1, MH) 3) 아포 조제용 : AK #2 sporulating agar (BBL) 다. 페트리접시 : 안지름 85±1 mm, 높이 20 mm의 밑면이 평평한 것 라. 디스크 : 직경 10 mm, 펄프디스크 (흡수량 0.07~0.08 ml) 마. 시험용평판 검사용 감수성 디스크: Streptomycin (직경 6 mm, 10 μg) 바. 원통 (spider):바깥지름 6.5 mm, 안지름 5 mm인 스테인레스스틸제 사. 기타 : 배양병 (Roux bottle)

28 3. 시험균액의 조제 가. B. megaterium 아포액 조제 보통배지에 계대보관되어 온 시험균을 37 에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2~3 ml에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 37 에서 1일간 배양 후 실온에서 6일간 아포를 형성시킨다. 멸균유리구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣어 집균한 후65 에서 30분간 가열한 후 분당 r / min으로 20분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균증류수에 부유시켜 세척을 3회 이상 반복 하고 잔사를 멸균증류수에 부유시켜 65 에서 30분간 재가열한다. 이를 멸균증류수로 10 단계 희석하여 표준한천배지로 균수를 측정한 후 아포농도를 CFU/mL가 되도록 희석하여 사용한다. 장기간 보관시에는 냉동 보관한다. 나. B. subtilis 및 B. cereus 의 아포액 조제 Nutrient agar에 계대보관되어 온 시험균을 멸균생리식염수 5 ml에 현탁시킨 후Nutrient agar 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여37 에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2~3 ml에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 37 에서 1일간 배양한 후 실온에서6일간 아포를 형성시킨다. 멸균유리구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣어 집균하여 65 에서 30분간 가열한 후 분당 r / min으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균수에 부유시켜 세척을 반복하고 잔사를 멸균수에 부유시켜 65 에서 30분간 재가열한다. 이 아포액은 MacFaland No. 1 정도 되게 멸균수로 희석 소분하여 냉장 보관하여 사용한다. 장기간 보관시에는 냉동 보관한다. 다. B. stearothermophilus 의 아포액 조제 Nutrient agar에 계대, 보관되어온 균주를 멸균생리식염수 5 ml에 현탁시킨 후 Nutrient agar 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 시험균을 55 에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2~3 ml에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 55 에서 1주일간 배양한다. 멸균유리구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣어 집균한 후 85 에서 15분간 가열한 후 분당 r/min으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균증류수에 부유시켜 세척을3회 이상 반복하고 잔사를 멸균증류수에 부유시켜 85 에서 15분간 가열한 후 아포액의 농도를 MacFaland No. 2 정도 되도록 희석 소분하여 냉장 보관한다. 장기간 보관시에는 냉동 보관한다. 4. 시험용액 및 추출완충액의 조제 가. Trimethoprim (TMP) 용액 TMP 10 mg을 용량플라스크에 달아 methanol 10 ml에 녹이고 멸균증류수를 가하여 100 ml로 한 후 다시15 μg ml -1 용액이 되도록 희석하여 B. megaterium 평판 조제시 사용한다

29 나. 추출완충액 1) 구연산 아세톤용액 0.2 M 구연산용액 (citric acid 4.2 g을 증류수에 녹여 100 ml가 되게 만든 용액)과 0.5 M KOH (KOH 2.8 g을 증류수에 녹여 100 ml가 되게 만든 용액)를 동량으로 혼합 한다 (A용액). 이미 조제한 A 용액, 아세톤과 멸균증류수의 비율이 35:35:30 (v/v/v)되게 혼합하여 추출완충액으로 한다. 2) 0.2 M phosphate buffer (ph 8.0) K 2 HPO g과 KH 2 PO g을 물에 녹여 ml까지 채운다. 5. 시험용 평판의 조제 가. B. megaterium 평판 멸균 후 약 50 로 보존된 MH 배지 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml와 TMP용액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후perti-dish에 8 ml씩 분주하여 수평으로 유지하여 응고시킨다. 나. B. subtilis 평판 멸균 후 약 50 로 보존된 AM #5 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 위의 가. 와 같이 시험용 평판을 만든다. 다. B. cereus 평판 멸균 후 약 50 로 보존된 AM #8 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 시험용 평판을 만든다. 라. B. stearothermophilus 평판 멸균 후 약 50 로 보존된 AM #2 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 시험용 평판을 만든다. 6. 시험용 평판의 검사 시험할 때마다 스트렙토마이신 감수성 디스크 (10 μg)를 이용하여 각 시험용 평판의 감도를 확인한다. 즉, B. megaterium, B. cereus, B. subtilis 및 B. stearothermophilus 평판에서 스트렙토 마이신 감수성 디스크의 저지환의 직경이 각각 20 mm 이상 되는 평판을 사용한다. 7. 시험조작 가. 직접법 시료를 가능한 한 무균적으로 사방 1 cm, 두께 2 mm 정도로 잘라 검사용 평판에 놓는다. 이것을 약 1시간 냉장으로 방치한 후perti-dish를 도치하지 않고 B. megaterium는 45, B. subtilis는 30, B. cereus는 30, B. stearothermophilus는 55 에서 16~18시간 배양한다

30 나. 디스크법 시료 10 g씩 2 개를 달아 하나에는 구연산 아세톤용액 10 ml, 다른 하나에는 0.2 M phosphate buffer (ph 8.0) 10 ml를 가하여 균질기로 균질화한 후85 에서 15분간 가열한 후 냉각하여 그 액을시험용액으로 한다. 이 시험용액에 디스크를침지한 후 검사용 평판에 놓는다. 구연산 아세톤 완충액으로 추출한 시험용액에 침지한 디스크는 B. subtilis, B. cereus 및 B. stearothermophilus 평판에 올려놓고, 0.2 M phosphate buffer로 추출한 시험 용액에 침지한 디스크는 B. megaterium 평판에 올려놓는다. 이때 구연산 아세톤 완충액과 0.2 M phosphate buffer에 침지한 디스크를 각각의 음성대조구로 한다. 각 시험균은 직접법과 동일하게 배양한다. 다. 원통 (spider)법 위의 디스크법과 동일하게 2 개의 시료에 각각의 추출완충액으로 추출하여 시험용액으로 한다. 미리 준비한 4 가지 종류의 시험용 평판 위에 원통(spider)를 올려놓고 디스크법과 같이 해당 시험용 평판의 원통에 시험용액 각각200 μl를 넣어 직접과 동일하게 각 시험용 평판을 배양한다. 8. 판정 직접법의 경우 주변 억제대 폭이 1 mm 이상인 것, 디스크법과 원통법의 경우 저지환의 직경이 각각 12 mm, 9 mm 이상인 것을 양성으로 판정한다. 양성으로 판정된 검체는 아래 표에 따라 항균물질 또는 합성항균제의 계통을 추정할 수 있다. 식품공전 간이시험법에 의한 항균물질 검출양상 B. cereus (AM #8) B. subtilis (AM #5) B. megaterium (MH) B. stearothermophilus (AM #2) 추정 물질 계통 ++ + ± ± Tetracycline계 ± Macrolide계 - ± + ++ Penicillin계 - + ± - Aminoglycoside계 ± Polyether계 ± Peptide계 - - ± - Chloramphenicol ± - ± ± Novobiocin Sulfonamide계

31 Ⅱ-2 우유의 잔류 항균물질 간이검사법 II-2-1. TTC-II 법 1. 원리 시험균주인 Streptococcus thermophilus에 의해 무색의2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)가 산화환원반응 결과 적색의 triphenyl formazan이 형성되는지를 확인하는 것으로 유 중 잔류 항균물질을 비롯한 세균발육억제물질의 간이검사법이다. 이 시험법은 잔류 설파제의 검출 감도를 높이기 위해 배지내 trimethoprim (TMP)이 첨가되며, 시료가 양성일 경우 p-aminobenzoc acid (PABA)와 penicillinase를 첨가하여 설파제와 페니실린계 항균물질의 확인이 가능하도록 개량된 방법이다. 2. 시험재료 가. 시험균 Streptococcus thermophilus ATCC 나. 배지 항균물질이 없는 10 % 멸균 탈지유 배지(skim milk : Difco 등 동등품)를 공시균주 배양용 배지로 사용한다. 다. 시약 1) Trimethoprim (TMP): Sigma 등 시약 특급 2) p-aminobenzoic acid (PABA): Sigma 등 시약 특급 3) 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride (TTC): Sigma 등 시약 특급 4) Penicillinase (1 000 unit): Sigma P0389 등 시약 특급 라. 시험기구 항온수조 혹은 배양기 (37 ), 항온수조 (82 ), 마개 있는 시험관( mm), 혼합기 (MultII-vortex mixer), 마이크로피펫 (100 μl 및 μl), 피펫 (1 ml 및 10 ml) 등 3. 시험균액의 조제 가. Streptococcus thermophilus 균주를 10 % 탈지유배지에 접종하여 37 에서 12시간 배양한다

32 나. 10 % 멸균탈지유배지를 따로 준비한다. 다. 위의 가와 나를 1:1 (v/v)의 비율로 혼합한다. 이와 같이 준비된 시험용 배양균액은 즉시 사용한다. 4. 시험 용액의 조제 가. TTC 용액 1) TTC와 멸균증류수를 1:25의 비율로 섞는다 (4 % TTC 용액). 2) TTC 용액은 7 이하의 냉암소에서 보존한다. 3) 발색되거나 시일이 너무 경과한 용액은 사용하지 않는다. 나. TMP 용액 1) 50 mg의 TMP를 100 ml 용량플라스크에 취해 methanol 10 ml에 녹이고 멸균증류수로 눈금 표시선까지 맞춘다 (500 μg ml -1 ). 2) 위의 1)을 멸균증류수로 1:9의 비율로 희석한50 μg ml -1 용액을 시험용액으로 사용한다. 3) 위의 1)을 냉장보관하면서 위의 2)의 농도로 희석하여 사용하되 2 주 이내에 사용한다. 다. PABA 용액 1) 500 mg의 PABA를 100 ml 용량플라스크에 취해 멸균증류수 약50 ml를 가하여 가온하여 녹인 다음 멸균증류수로 표시선까지 맞춘다 (5 mg ml -1 ). 2) 위의 1)를 멸균증류수로 1:9의 비율로 희석한 500 μg ml -1 용액을 시험용액으로 사용한다. 3) 위의 1)를 실온에 보관하면서 위의2)의 농도로 희석하여 사용하되2 주 이내에 사용한다. 라. Pencillinase 용액 Penicillinase (1 000 units)를 멸균증류수 1 ml로 녹여 시험용액으로 사용한다. 이 용액은 penicillin G 및 cloxacillin 10 μg ml -1 농도 이상을 불활화한다. 5. 시료의 검사 가. 스크리닝법 1) 마개 있는 멸균시험관 2 개에 유성펜으로 Zero control 및 TMP control이라 표기하고 검사할 시료 당 1 개의 시험관에 시료번호를 기입한다. 2) 검사할 시료의 멸균시험관에 우유시료를 각각 8 ml씩 취한다. 이때 대조용으로 사용할 Zero 및 TMP control 시험관에는 항균물질이 들어 있지 않는 우유 각 8 ml를 취한다. 대조용 원유시료는 사료첨가제 혹은 치료약제 등 세균발육억제물질을 투여하지 않은 원유를 채취하여 4 냉장보관하면서 사용하며 2 3 일내 사용하지 못할 경우 -20 혹은

33 -80 에 보관하고 필요시 해동하여 사용한다. 탈지우유를 검사할 경우 대조용 시료로는 항균물질이 들어 있지 않은 10 % 멸균탈지우유를 사용한다. 3) Zero control에는 멸균증류수 1 ml를 첨가하고, TMP control 및 검사할 시료의 시험관에는 용액 1 ml를 첨가하여 혼합한다. 4) (82 ± 2) 의 항온수조에서 2.5분간 가열한 후 즉시 수돗물에 담구어 (약 1분간) 37 이하로 급냉시킨다. 5) 시험용 배양균액 (1:1 희석균액)을 무균적으로 각 1 ml씩 접종하여 혼합하고 (37±0.5) 의 항온수조에서 2시간 동안 배양한다. 6) 0.3 ml의 TTC 용액을 첨가한 후 (37±0.5) 에서 30~60 분 동안 반응시킨다. TMP control 시료의 색상이 음성대조 시료의 색상과 거의 같은 시점을 반응 종료시간으로 한다. 나. 설파제 및 페니실린계 항균물질 확인시험 1) 마개 있는 멸균시험관 3 개에 유성펜으로 양성시료의 시료번호와 TMP tube, PABA tube 및 Penase tube로 기입한다. 2) 표기한 3개의 시험관에 양성시료 각 8 ml를 취한다. 이때 대조용 시료는 스크리닝법 2)와 동일하게 만들어 사용한다. 3) TMP tube (TMP 용액첨가 시험관)와 Penase tube (TMP 용액 및 pencillinase 용액첨가 시험관)에는 TMP 용액 (50 μg ml -1 )을 각각 1 ml씩 첨가하고, PABA tube (PABA 용액 첨가시험관)에는 PABA 용액 (500 μg ml -1 ) 1 ml를 첨가하여 혼합한다. 4) Penase tube에만 penicillinase 용액 100 μl를 첨가하여 혼합한다. 5) (82 ± 2) 의 항온수조에서 2.5분간 가열한 후 즉시 수돗물에(약 1분간) 담궈 37 이하로 냉각 시킨다. 6) 시험용 배양균액 (1:1 희석균액)을 무균적으로 각각 1 ml씩 접종하여 혼합하고 (37±0.5) 의 항온수조에서 2시간 동안 배양한다. 7) 300 μl의 TTC 용액을 첨가한 후 (37±0.5) 에서 30~60 분 동안 반응시킨다. TMP control 시료의 색상이 음성대조시료의 색상과 거의 같은 시점을 반응 종료시간으로 한다. 6. 시험 결과 판정 가. 스크리닝법 TMP control의 색상을 기준으로 하여 시료의 색상이 TMP control 시료의 연분홍색보다 현저히 옅을 경우 양성으로 판정하고 같거나 진하면 음성으로 판정한다. 이 때, 시료가 양성인 경우 아래의 나 의 확인시험법으로 설파제 및 페니실린계 항균물질을 확인할 수 있다

34 나. 설파제 및 페니실린계 항균물질 확인시험 TMP control의 색상을 기준으로 하여 상기 스크리닝법과 같이 판정하고 아래 표와 같이 결과를 추정할 수 있다. 페니실린계 및 설파제 양성으로 판정된 시료는 HPLC 등의 기기분석을 통하여 확인 정량한다. TTC-II 법에 의한 검사결과 판정방법 TMP tube Penase tube PABA tube 결과판정 음 성 음성 음성 음성 양 성 양성 음성 양성 (설파제) 양 성 음성 양성 양성 (페니실린계) 양 성 양성 양성 양성* * 페니실린계 및 설파제 이외의 항균물질로 추정할 수 있으나 항균물질이 복합적으로 잔류될 경우 설파제나 페니실린계 항균물질도 동시에 검출될 수 있다. II-2-2. 식품공전의 디스크법 이 시험방법은 식품공전의 식육 중 항균물질 간이검사법의 디스크법과 동일하나1차 양성 추정시료에 대하여 살균과정을 거친 후 재시험을 하는 점이 다르다. 우유시료를 충분히 혼합하여 사용하되, 분유류는 14 % 수용액으로 조제하여 사용한다. 우유시료에 디스크를 침지한 후 시험용 평판에 올려 각 시험균주별 동일한 배양조건으로 배양한 후 시험용 평판에서 디스크 주변에 발육억제대가 형성된 시료에 대하여 재시험하여 결과를 판정한다. 우유시료를 82 로 2분간 가열한 후 신속히 식혀 재시험을 실시한 결과 시험용 평판 중 발육억제대의 직경이 12 mm 이상 형성되었을 경우 항균물질 양성 으로 판정한다. 항균물질 양성인 시료는 필요에 따라 미생물수용체법, HPLC, GC 등의 기기분석을 통하여 확인, 정량을 실시한다

35 Ⅱ-3 식용란의 잔류 항균물질 간이검사법 II-3-1. Four-plate법 1. 원리 테트라싸이클린계 등 항생제와 플루오로퀴놀론계 항균물질의 간이검사를 위하여 식품 공전의 방법을 변형한 미생물학적 방법이다. Bacillus subtilis 등 시험균주 4종과 Antibiotic medium No. 8 등 각각의 배지를 조합하여 만든 4 가지 종류의 시험용 평판을 사용하여 검사한다. 식용란으로부터 항균물질을 추출하여 가열 냉각한 후 시험용액을 디스크 (직경 10 mm paper disc)에 침지시켜 시험용 평판에 올려 검사한다. 2. 시험재료 가. 시험균 1) Bacillus megaterium ATCC 9885 (이하 B. megaterium 이라 한다) 2) Bacillus subtilis ATCC 6633 (이하 B. subtilis 라 한다.) 3) Bacillus cereus. var. mycoides ATCC (이하 B. cereus 라 한다.) 4) Escherichia coli ATCC (이하 E. coli 라 한다) 나. 배지 1) 계대, 증식용:Nutrient agar 2) 시험용:Antibiotic medium No. 5 (ph 7.9±0.1, 이하 AM #5 라 한다.) Antibiotic medium No. 8 (ph 5.85±0.05, 이하 AM #8 라 한다.) Mueller Hinton medium (ph 7.3±0.1, 이하 MH 라 한다.) Test agar (ph 6.0±0.1, 이하 TA 라고 한다; Merck사, 독일) 또는 동등 규격품 3) 아포 조제용 : AK #2 sporulating agar (BBL) 다. 페트리접시 : 87x15 mm (녹십자 또는 이와 동등 규격품) 라. 디스크 : (직경 10 mm, 흡수량 0.07~0.08 ml) 또는 원통 (spider:바깥지름 6.5 mm, 안지름 5 mm인 스테인레스스틸제) 마. 시험용 평판 검사용 감수성 디스크:스트렙토마이신 감수성 디스크 (직경 6 mm, 10 μg)

36 3. 시험균액의 조제 가. B. megaterium 아포액 조제 Nutrient agar에 계대보관되어 온 시험균을 37 C에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2~3 ml에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 37 C에서 1일간 배양 후 실온에서 6일간 아포를 형성시킨다. 멸균유리구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣어 집균한 후 65 C에서 30분간 가열하고 분당 r/min으로 20분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균증류수에 부유시켜 세척을3 회 이상 반복하고 잔사를 멸균증류수에 부유시켜 65 C에서 30분간 재가열한다. 이를 멸균 증류수로 10 단계 희석하여 표준한천배지로 균수를 측정한 후 아포농도를 CFU/mL가 되도록 희석하여 사용한다. 장기간 보관시에는 냉동 보관한다. 나. B. subtilis 및 B. cereus 의 아포액 조제 Nutrient agar에 계대보관되어 온 시험균을 멸균생리식염수 5 ml에 현탁시킨 후Nutrient agar 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여37 C에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2~3 ml에 현탁시키고 아포조제용 배지 300 ml를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 37 C 에서 1일간 배양한 후 실온에서6일간 아포를 형성시킨다. 멸균유리구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣어 집균하여 65 C에서 30분간 가열한 후 분당 r/min으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균수에 부유시켜 세척을 반복하고 잔사를 멸균수에 부유시켜 65 C에서 30분간 재가열한다. 이 아포액은 MacFaland No. 1 정도 되게 멸균수로 희석 소분하여 냉장 보관하여 사용한다. 장기간 보관시에는 냉동 보관한다. 다. E. coli 시험균액 조제 20 ml nutrient broth에 계대보존 균주를 직경1 mm 백금이로 1 회 접종하여 30 배양기에서 16~18시간 배양한 후 균배양액을 시험균액으로 사용한다. 4. 시험용액 및 추출완충액의 조제 가. Trimethoprim (TMP) 용액 TMP 10 mg을 용량플라스크에 달아 methanol 10 ml에 녹이고 멸균증류수를 넣어 100 ml로 한 후 15 μg ml -1 용액이 되도록 희석하여 B. megaterium 평판 조제시 사용한다. 나. 추출완충액 0.2 M 구연산용액 (구연산 4.2 g을 물로 용해하여 100 ml이 되도록 만든 용액, 즉, 0.2 M citric acid)과 0.5 M KOH (KOH 2.8 g을 물로 용해하여 100 ml이 되도록 만든 용액)를 동량으로 혼합한다 (A용액). 이미 조제한 A용액, 아세톤과 멸균증류수의 비율이 35:35:30 (v/v/v)되게 혼합한 구연산 아세톤용액을 추출완충액으로 사용한다

37 5. 시험용 평판의 조제 가. B. megaterium 평판 멸균 후 약 50 C로 가온 보존된 MH 배지 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml와 TMP 용액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 perti-dish에 8 ml씩 분주하여 수평으로 유지하여 응고시킨다. 나. B. subtilis 평판 멸균 후 약 50 C로 가온 보존된 AM #5 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다. 다. B. cereus 평판 멸균 후 약 50 C로 가온 보존된 AM #8 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다. 라. E. coli 평판 멸균 후 약 50 로 가온 보존된 TA 배지에 100 ml 당 조제된 시험균액 0.5 ml (배지량의 0.5 %)를 가하여 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다. 6. 시험용 평판 및 시료의 검사 가. 시험용 평판의 검사 스트렙토마이신 감수성 디스크 (10 μg)를 이용하여 각 시험용 평판의 감도를 확인한다. B. megaterium, B. cereus, B. subtilis 평판에서 스트렙토마이신 감수성 디스크의 저지환의 직경이 각각 20 mm 이상인지를 확인한다. 나. 시료의 검사 검체 10 g (식용란의 경우 5개를 혼합한 전란액 10 g)을 시료균질백 (stomacher bag)에 취하여 구연산 아세톤완충액 10 ml를 가한다. 시료균질백 4~6 개를 포개어 균질기 (stomacher)에 고정한 후 2분간 균질화한다. 85 항온수조에서 15분간 가열하여 얼음에 냉각한 후 형성되는 맑은 추출액을 시험용액으로 한다. 이 시험용액에 디스크를 침지한 후 검사용 평판에 놓는다. 시험용 평판위에 시료추출액을 흡수시킨 디스크를 올려 가볍게 눌러 고착시킨 후 B. subtilis, B. cereus 및 E. coli 평판은 30 배양기에서, B. megaterium 평판은 45 배양기에서 16~18시간 배양한 후 항균물질의 잔류여부를 판정한다. 7. 시험결과 판정 캘리퍼스 또는 눈금자를 사용하여 시험균의 발육억제대를 측정한 결과, 디스크의 직경 10 mm를 포함하여 억제대가 12 mm 이상일 경우 해당시료를 양성으로 판정한다. 억제대

38 측정시 세균의 발육억제대가 분명한 곳에 발생하는 개별적인 집락은 무시하고 세균오염 등으로 인해 억제대가 불분명할 경우는 시험을 반복한다. 재시험에서도 명백한 양성이 아닐 경우에는 음성으로 판정한다. II-3-2. 퀴놀론계 항균물질 간이검사법 1. 시험재료 가. 시험균: E. coli ATCC 나. 배지: 1) 계대용: Nutrient agar 2) 증균용: Nutrient broth 3) 시험용: Test agar (이하 TA 라고 한다), ph 6.0±0.1 (Merck사, 독일) 또는 동등 규격품 다. 시약 1) Acetone: HPLC grade 2) Citric acid (C 6 H 8 O 7, MW ): 시약 특급 3) Potasium hydroxide (KOH, MW 56.11): 시약 특급 라. 지육검사용 디스크: 직경 10 mm 마. 페트리디쉬: 87x15 mm 바. 기타 기구 균질기 (stomacher), 캘리퍼스 또는 눈금자, 원심분리 시험관 (50 ml), 항온수조 (50 ), 배양기 (30 ), 멸균 피펫 (10 ml) 등 2. 시험균액의 조제 시험균액은 20 ml nutrient broth에 계대보존 균주를 직경 1 mm 백금이로 1 회 접종하여 30 배양기에서 16~18시간 배양한 후 균배양액을 시험균액으로 사용한다. 3. 추출완충용액 조제 0.2 M 구연산용액 (구연산 4.2 g을 증류수로 용해하여 100 ml로 만든 용액)과 0.5 M KOH 2.8 g을 증류수로 용해하여 100 ml로 만든 용액)을 동량으로 혼합한 용액, 아세톤 (acetone)과 증류수의 비율이 35:35:30 (v/v/v)되게 혼합하여 만든 구연산 아세톤용액을 추출완충액으로 한다

39 4. 시험용 평판의 조제 검사시료수를 고려하여 소요될 시험용 평판의 수를 산출하고 필요한 배지량을 결정한 후 다음과 같이 시험용 평판을 만든다. 가. 공병에 조제하고자 하는 량의 증류수를 가한 후 해당량의 시험용 배지 (TA)를 평량하여 넣고 가열판 (hot plate) 위에 놓아 배지를 끓이면서, 주기적으로 흔들어 준다. 나. 고압증기멸균기 (autoclave)를 사용하여 배지를 고압증기멸균 (121, 15분간)한 다음 약 50 항온수조 혹은 배양기에서 약 2시간 둔다. 다. 해당 배지 100 ml 당 시험균액 0.5 ml (배지량의 0.5 %) 첨가하여 시험균액이 고르게 혼합되도록 약 1분간 잘 혼합한다. 라. 10 ml용 멸균피펫으로 시험균액 혼합 배지 8 ml씩을 취하여 해당 petrii- dish에 분주하여 뚜껑을 살짝 열어 둔 상태로 약 10분간 방치하여 배지를 굳힌다. 마. 이것을 시험용 평판으로 사용하며, 곧바로 시험용 평판을 사용하지 않을 경우 랩으로 싸서 4 냉장고에 보관한다. 조제한 시험용 평판은 4 냉장보관하면서 2~3 일내 사용한다. 5. 시료의 전처리 및 검사 가. 시료의 전처리 시료균질백 (stomacher bag)에 전란액 시료10 g씩 취한 후 구연산 아세톤용액 10 ml씩 가한다. 시료균질백 4~6개를 포개어 균질기 (stomacher)에 고정한 후 2분간 균질화 한다. 85 항온수조에서 15분간 가열하여 얼음물에 식힌 후 형성되는 맑은 추출액을 시험 용액으로 한다. 나. 시료의 검사 시험용평판위에 시료추출액을 흡수시킨 디스크를 올려 가볍게 눌러 고착시켜 30 배양기에 넣어 16~18시간 배양한 후 플루오로퀴놀론계 항균물질의 잔류여부를 판정한다. 6. 시험결과 판정 캘리퍼스 또는 눈금자를 사용하여 시험균의 발육억제대를 측정한 결과, 디스크의 직경 10 mm를 포함하여 억제대가 12 mm 이상일 경우 해당시료를 양성으로 판정한다. 억제대 측정시 세균의 발육억제대가 분명한 곳에 발생하는 개별적인 집락은 무시하고 세균오염 등으로 인해 억제대가 불분명할 경우는 시험을 반복한다. 재시험에서도 명백한 양성이 아닐 경우에는 음성으로 판정한다

40 Ⅱ-4 혈청 등 체액시료의 잔류 항균물질 간이검사법 가축의 혈청, 뇨, 담즙 등 체액시료에서 항균물질을 검출하기 위한 간이검사법으로서 식육 중 잔류물질 검사요령 (농식품부고시)에 의거하여 축주가 잔류의심축군의 시료를 채취하여 의뢰할 경우 검사하는 출하 전 생체잔류검사시 사용한다. 설파제 간이검사를 위하여 TLC법 (Su1fa On-Site, SOS), 항균물질의 간이검사를 위하여 미생물학적 방법 (BmDA법, EEC 4-plate법), 형광면역분석법, 미생물수용체법 등을 이용할 수 있다. II-4-1. 박층크로마토그래피 (SOS 검사) 박층크로마토그라프법 (TLC)은 paper chromatography에서 한 단계 발전한 방법으로 일반적 으로 Silica gel G, alumina 등을 흡착시킨 TLC plate를 사용하여 표준용액과 전처리한 시료를 점적하여 이동상용매에 전개시킨 후 형광을 띄도록 발색시켜 자외선등(ultraviolet lamp)하에서 잔류물질의 검출여부를 검사하는 방법이다. TLC법을 이용한 대표적인 검사키트가 SOS (Sulfa On Sites) 로서 돼지의 혈청을 포함해 오줌 및 사료에서 sulfamethazine을 검사하도록 개발된 방법으로 저농도 0.4 μg ml -1 과 고농도 1.3 μg ml -1 의 sulfamethazine 농도를 대조로 사용하여 결과를 판정한다. 측정원리는 시료를 점적하여 건조시킨 후 이동상 용매가 들어있는 전개조에 TLC plate를 담가두면 이동상 용매가 lane의 흡착제를 따라 위쪽으로 이동하면서 이동상에 용해성이 있는 점적된 화합물도 동시에 이동상을 따라 위쪽으로 이동하게 된다. 일반적으로 동일한 화합물의 경우 이동거리는 같지만 각각의 화합물마다 이동상에 대한 용해도(solubility)가 다르기 때문에 각각의 화합물마다 이동거리가 달라진다. 이동상이 plate상의 적절한 위치까지 이동하였을 때 plate를 이동상에서 꺼내고 온풍으로 이동상용매를 증발시킨 다음lane에 남아있는 화합물과 결합하는 발색제를 plate에 분무하면 자외선등하에서 형광을 관찰할 수 있게 된다. 형광강도는 lane에 남아있는 fluorescing 화합물의 양에 의해서 결정된다. 시료의 검사결과는 분석물질의 이동거리 (Rf값)와 표준용액의 형광강도 (밝기정도)와 비교 하여 판정한다. 시료의 형광띠가 sulfamethazine 표준품의 것보다 높거나 낮은 위치에 형성되면 sulfamethazine이 아닌 다른 설파제일 수 있다. 형광강도는 시료가 표준용액과 같은 화합물 이면서 더 높은 농도라면 표준용액의 band와 같은 높이에서 보다 밝은 형광을 띠게 된다. SOS 검사키트는 본래 sulfamethazine의 검사 목적으로 판매되고 있지만sulfamethazine 이외에 대부분 설파제도 이 키트에서 검출된다. Sulfamethazine과 이동상에 대한 용해도가 비슷한 설파제인 경우 거의 동일선상에 위치하게 된다. 특히, sulfamerazine, sulfamonomethoxine,

41 sulfadiazine, sulfamethoxpyridazine 등의 경우 sulfamethazine의 Rf값과 거의 일치하며, sulfadi -methoxine, sulfaquinoxaline, sulfachlorpyridazine, sulfamethoxazole 등은 sulfamethazine에 비해 형광띠가 높게 위치하는 반면sulfathiazole과 sulfisomidine 등은 훨씬 낮게 위치한다. 형광강도에 있어서는 sulfamethazine과 동일한 농도일 경우 거의 유사한 형광강도를 나타낸다. 출하전 생체잔류검사나 규제검사 혹은 수출돈육의 원료돈 (예비)검사시 SOS 검사키트를 이용하여 설파제를 검사할 경우 근육 중 설파제의잔류위반을 막기 위해서는sulfamethazine의 체내동태학인 체조직간의 잔류비율을 고려할 때 뇨에서는 1.3 μg ml -1 미만, 혈청에서는 0.4 μg ml -1 미만 수준이어야 한다. 1. 시료의 준비 오줌시료는 전처리 없이 그대로 사용하며, 혈청시료는 혈청 1 ml에 methanol 2 ml를 가하여 가볍게 혼합하여 r/min에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 사용한다. 2. 시험방법 가. 전개조의 준비 1) 1차 전개조 (methanol 용액)에 바닥에서 약 0.6 cm 되도록 methanol을 채우고 뚜껑을 덮는다. 2) 2차 전개조 (ethyl acetate 용액)에도 바닥에서 약 0.6 cm 되도록 ethyl acetate를 채우고 뚜껑을 덮는다. 나. TLC plate의 준비 1) TLC plate를 깨끗한 작업대에 평평하게 장치한다. TLC plate의 넓이에 맞게 만들어 나온 라벨을 spotting area의 반대쪽 가장자리에 붙인다. 2) 연필로 X자 칸을 제외한 1~3, 4~7 lane에 시료번호를 기입한다. 3) 눈금자를 사용해 spotting area 상단으로부터 2 cm가 되는 부위에 연필로 표시를 한다. 다. 시료 및 표준용액의 점적 1) Micropipette 또는 capillary pipette를 사용하여 오줌시료 20 μl 또는 혈청시료 20 μl (3 회)를 취한다. 2) TLC plate 각 lane의 spotting area 중앙부위에 피펫을 약간 비스듬히 위치시킨 후 서서히 시험용액을 점적한다. 3) LS lane에는 저농도 설파메타진 표준용액 (LS sufametazine 0.4 ppm) 20 μl를 점적하고 HS lane에는 고농도 설파메타진 표준용액(HS sulfametazine 1.3 ppm) 20 μl를 점적한다

42 4) TLC plate에 라벨이 붙은 부위를 잡고 45 로 기울인 후 blow dryer로 모든 시료와 표준용액의 점적이 마를 때까지 건조시킨다. 라. TLC plate의 전개 1) 1차 전개조 (methanol 용매)내 전개 (1) Methanol 전개조의 뚜껑을 열고 TLC plate를 조심스럽게 전개조 안에 장치한 후 뚜껑을 덮는다. 이때 이동상용매인 methanol은 spotting area의 시료와 표준용액이 점적된 부위에 닿지 않아야 한다. (2) 이동상 용매에 적셔진 부위가 spotting area의 상단에 닿자마자 전개조의 뚜껑을 열고 라벨된 윗부분을 잡고 TLC plate를 꺼낸 후 뚜껑을 덮는다. (3) TLC plate를 45 각도로 기울이고 blow dryer로 spotting area가 마를 때까지 건조시킨다. 2) 2차 전개조 (ethyl acetate 용매)내 전개 (1) Ethyl acetate 전개조의 뚜껑을 열고 TLC plate를 조심스럽게 전개조 안에 장치한 후 뚜껑을 덮는다. (2) Spotting area의 상단에서 2 cm 표시 부분까지 전개되면 TLC plate 상단부위를 잡고 TLC plate를 꺼낸다. (3) TLC plate를 45 각도로 기울이고 blow dryer로 모든 lanes이 마를 때까지 건조시킨다. (4) 가능한 한 fume hood하에서 fluorescamine 용액 (acetone에 0.03~0.05 %의 농도로 녹인 용액) 시약병의 뚜껑을 제거하고 spray pump를 장치한 후 TLC plate의 라벨부위를 잡아 약 10~15 cm 정도 떨어지게 위치시켜 45 각도로 기울여 TLC plate 전개부위의 평판 표면에 조심스럽게 3~4회 균일하게 분무한다. (5) TLC plate를 developing process가 일어나도록 하기 위해 어두운 곳에 10~15분간 방치한다. (6) UV light을 켜고 viewing port를 통해 주의 깊게 TLC plate를 관찰한다. 형광띠는 약간 곡선 또는 타원형으로 HS띠가 LS띠보다 현저하게 밝게 나타난다. 3. 판 정 SOS 검사법에 의한 결과 판정은 전개한 후 발색시킨 TLC plate를 UV하에서 형광강도와 Rf값을 구하여 판정한다. 형광띠 (band)의 위치가 Rf 값으로 0.80~0.95 범위이고 형광강도 (밝기정도)가 설파메타진을 기준으로 뇨 중 1.3 ppm (고농도) 이상이거나 혈청 중 0.4 ppm (저농도)이상일 때 양성으로 판정한다

43 SOS 킷트에 의한 설파제의 검출양상 (Rf값 기준) Rf value 설 파 제 0.8 미만 Sulfisomidine (0.68~0.71), Sulfathiazole (0.73~0.74) 0.8~0.95 Sulfamethizole (0.81~0.83), Sulfadiazine (0.84~0.86), Sulfamethoxipyridazine (0.85~0.86), Sulfapyridine (0.87~0.89), Sulfamethazine (0.86~0.89), Sulfamerazine (0.87~0.89), Sulfamonomethoxine (0.87~0.91), Sulfadimethoxine & Sulfaquinoxaline (0.89~0.92), Sulfachlorpyridazine (0.92~0.94), Sulfamethoxazole & Sulfisoxazole (0.92~0.94) II-4-2. 미생물학적 방법 (BmDA 법) 1. 시험재료 가. 시험균: Bacillus megaterium ATCC 9885 나. 배지 1) 계대보존용: Tryptic soy agar (TSA, Difco) 2) 증균 및 아포 조제용: AK #2 sporulating agar (BBL) 3) 시험용: PM indicator agar (Difco) 4) 아포조제 첨가용: Agar (Difco) 5) 균수측정용: Plate count agar (Difco) 다. 시험용 기구 1) Filter paper disc - 시험평판 검사용: 감수성시험용 neomycin disc (5 mcg, Difco) - 지육검사용: 직경 10 mm (Adventec No ) 2) perti-dish (87 15 mm, 녹십자 등 규격품) 3) 캘리퍼스 또는 플라스틱 눈금자 4) Roux bottle, 멸균유리구슬 (4 mm), 멸균원심분리관 (50 ml), 원심분리기 ( r/min 및 swinging bucket head용), 균질기, 혼합기, 항온수조, 배양기 (45 ), 초음파세척기 등

44 2. 시험균액 조제 가. 아포액 조제 증균 및 아포조제용 사면배지에 계대보존한 시험균을37 에서 2일간 배양한 후 멸균유리 구슬과 2 3 ml 멸균증류수를 넣고 사면배지의 균을 집균한다. 미리 증균 및 아포조제용 배지에 agar를 0.5 % 추가하여 만든 배지를 roux bottle에 250~300 ml씩 분주하여 고압 증기멸균한 후 굳힌 평판에 시험균 부유액을 접종하여 고르게 편 다음37 에서 18~24시간 배양하고 배양기에서 roux bottle을 꺼내 실온에 6일간 방치한다. Roux bottle에 멸균유리 구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣고 조심스럽게 흔들어 집균하여 멸균원침관에 옮긴 후 65 항온수조에서 30분간 가열한다 r/min으로 20분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 침전물에 다시 일정량의 멸균증류수로 부유시켜 원심분리하여 상층액을 버리는 과정을 3회 반복한 후 침전물을 멸균증류수 20 ml에 재부유시킨다. 나. 아포액의 정제 멸균한 200~300 ml 공병에 3 M 인산염완충액 (ph 7.1, KH 2 PO g과 K 2 HPO g을 증류수로 녹여 1 L가 되도록 한 후 여과 멸균한 완충액: A용액) 34.1 ml와 polyethyleneglycol (B 용액) 11.8 g를 합하여 혼합하고 멸균증류수로 100 ml가 되도록 하여 멸균균질기통에 넣고 r/min, 5분간 균질화하여 혼합액을 버린 후 이 과정을 동일한 방법으로 한 번 더 반복한다. 멸균한 100 ml 실린더에 동량의 A용액과 B를 합하고 25 ml의 아포액을 넣어 멸균증류수로 100 ml가 되도록 하여 혼합한 다음 전량을 멸균 균질기통에 넣어 r/min으로 5분간 균질화 한다. 4 개의 멸균 원심분리관에 동량으로 분주하여 swinging bucket head로 구성된 원심분리기를 사용하여 실온에서 r/min (1 500 g)으로 2분간 원심분리한다. 멸균된 10 ml용 피펫으로 원심분리관 윗부분의 아포액층을 주의깊게 취한 다음 5, ~ r/min으로 20분간 원심분리한다. 원심분리 후 상층액을 제거한 다음 멸균유리구슬과 멸균증류수를 가하여 하부의 butt (아포층)를 부유시킨다. 아포부유액을 멸균 원심분리관에 취하여 동일한 원심분리조건 으로 총 5회 세척한다. 최종 원심세척한 다음 침전된 각 butt를 여과멸균한 50 % ethanol 20 ml에 재 부유시켜 모든 아포정제액을 합한 후 plate count agar로 균수를 측정한다. 정제한 아포액을 50 % ethanol로 CFU/mL 농도가 되도록 희석하여 냉장보관하면서 6 개월 정도 사용한다. 3. 시험용 평판의 조제 및 균주 도말 가. 시험용 평판 하나의 시험용 배지를 만들어 약 50 로 식힌 후 perti-dish에 8 ml씩 분주하여 평판을 만들어 사용한다

45 나. 시험균액 도말 멸균면봉으로 시험균액을 흡수시켜 바이알벽에 한 번 비틀어 여분의 아포액을 제거한 후 왼손으로 시험용 평판을 45 각도로 잡고 오른손으로 면봉을 시험용 평판의 중앙 부위에서 측면쪽으로 아포를 도말한다. 시계반대방향으로 시험용 평판을 90 각도로 돌려 동일하게 도말하고 동일한 방법으로 돌리면서 2회 더 도말한다. 이렇게 하면 시험용 평판은 한바퀴 돌려진 상태가 되며 각 표면에는 두 번씩 도말된 상태가 된다. 한번 사용한 면봉은 버리고 새로운 면봉을 사용한다. 4. 시험용 평판 및 시료 검사 가. 시험용 평판 검사 하나의 평판에4~6개의 시료를 검사함과 아울러 항생제 감수성시험용 네오마이신 디스크를 평판의 중심부에 올려 시험용 평판의검출능을 비롯한 시험조건이 적절한지의 여부를 점검한다. PM indicator agar를 시험용배지로 하는 이 방법의 경우 감수성시험용 네오마이신 디스크의 발육 억제대 직경은 14~20 mm 수준이어야 적합하다. 나. 시료 검사 핀셋으로 디스크를 취하여 오줌 또는 혈청시료에 디스크의 약1/3이 잠기게 하여 흡수시킨 후 시험용 평판 위에 올려놓고 가볍게 눌러 부착시킨다. 시험용 평판을 거꾸로 도치시켜 (44~45) 에서 3.5~4시간 배양한 후 결과를 판정한다. 이 때 배양기에는 비이커에 물을 담아두어 시험용 평판의 건조를 방지한다. 5. 시험 결과 판정 시험결과 시험균 발육억제대가 형성되지 않으면 음성으로 판정하고 직경 12 mm 이상의 발육억제대가 형성되면 항균물질 양성으로 판정한다. 식육 중 잔류물질 검사요령(농식품부고시)에 의거 규제검사를 실시하는 경우 이 시험법이나 TLC법 등의 간이검사법에 의해 양성시료에 대해서는 근육시료에서 미생물 수용체 분석법, HPLC 등으로 확인 정량분석을 실시한다

46 BmDA법에 의한 항균물질의 검출감도 항균물질 검출한계 (LOD, μg ml -1 ) 항균물질 검출한계 (LOD, μg ml -1 ) Sulfamethazine 1.0 Spiramycin 0.1 Sulfamerazine 1.0 Tylosin 0.25 Sulfadiazine 1.0 Chlortetracycline 0.5 Sulfamonomethoxine 0.5 Oxytetracycline 1.0 Sulfaquinoxaline 0.5 Tetracycline 1.0 Sulfathiazole 1.0 Bacitracin 0.5 Sulfisoxazole 1.0 Virginiamycin 0.25 Sulfisomidine 1.0 Monensin 10.0 Sulfadimethoxine 0.5 Salinomycin 10.0 Sulfachlorpyridazine 1.0 Novobiocin 2.5 Sulfamethoxypyridazine 0.5 Chloramphenicol 2.5 Penicillin G 0.05 Furazolidone 0.5 Ampicillin 0.05 Oxolinic acid 2.5 Amoxicillin 0.05 Enrofloxacin 0.5 Cloxacillin 0.25 Carbadox 10.0 Gentamicin 1.0 Olaquindox >100 Neomycin 2.5 Ormethoprim 2.5 Streptomycin 1.0 Trimethoprim 0.25 Hygromycin B 5.0 Thiamphenicol 10.0 Erythromycin 0.05 Amprolium >1000 Oleandomycin 0.25 Clopidol >

47 Ⅱ-5 신속간이검사킷트 소개 아래에 소개된 신속간이검사킷트는 농림수산검역검사본부에서 검증이 완료된 공인 킷트가 아니며, 국내에서 판매중인 킷트를 소개한 것이다. 검사물질별로 잔류허용기준 이하를 검출할 수 있는 방법을 적용하고, 킷트별 결과 판정은 제조회사의 결과판정 요령에 따른다. 만약 결과에 대하여 의문이 있다고 인정될 때에는 규정한 방법에 의하여 시험하고 판정하여야 한다. II-5-1. Premi Test kit 1. 원리 네덜란드 DSM사에서 개발한 미생물학적 간이검사킷트로서 고온균인 B. stearothermophilus 균주를 이용하여 이 균의 성장억제 여부를 확인함으로써 근육, 신장 등의 축산물에서 항생제 등의 잔류 여부를 검사할 수 있다. 결과 판독까지 4시간 정도 소요되며, 색깔 변화만으로 양성/음성 반응을 판단할 수 있다. 동물에 사용되는 여러 종류의 항균물질을 축산물에서 광범위하게 검출할 수 있으나, 엔로플록사신을 비롯한 퀴놀론계 항균물질에는 검출감도가 떨어지는 경향이 있다. 이 킷트는 우리나라에서 잔류위반 발생률이 높은 설파제, 테트라싸이 클린계 등 잔류항생제의 검출을 위하여 적용할 수 있다. 2. 시험재료 1) Premi Test Kit (Test ampoule) : 25 ampoules/box 2) Starter Kit (간이 Incubator) 3. 시험방법 1) 2 cm 3 정도 근육을 채취하여 식육압착기 (meat press)에 넣고 250 μl 정도 육즙을 낸다. 2) 검사용 킷트에 육즙 100 μl를 정확히 주입한다. 3) 앰플을 실온에서 20 분 정도 둔다. 신장즙의 경우, 80 에서 약 10분간 inactivation 시킨다

48 4) 육즙을 증류수로 두번 정도 세척하고 남은 물을 튜브에서 조심스럽게 빼낸다. 5) 앰플을 호일로 덮고, starter kit (간이 Incubator)를 이용하여 64 에서 약 3시간 배양한다. 6) 음성대조의 색상과 비교 하여 결과 판독한다 (노랑색-녹색 음성, 파랑색-보라색 양성). Premi Test kit를 이용한 항균물질 신속간이검사법 양 성 음 성 제조사 (DSM, 네덜란드)가 제시하는 Premi kit의 검출능 (단위 : ng/g)

49 II-5-2. KIS (Kidney Inhibition Swab) Test kit 1. 원리 미국 Charm Sciences사에서 개발한 미생물학적 간이검사킷트로서B. stearothermophilus 균주를 이용하여 냉장 또는 냉동상태의 신장에서 항생제 등 잔류물질을 간이검사할 수 있다. 조직을 절개하여 면봉으로 swab한 후 incubator에서 배양하여 색의 변화로 음성과 양성을 판별한다. 항균물질이 잔류하는 경우 배지내 미생물 증식이 억제되어 처음의 보라색이 그대로 유지되는 반면, 항균물질이 잔류하지 않는 경우 미생물이 증식하면서 배지의 색이 노란색으로 바뀐다. 2. 시험재료 1) Kidney Inhibition Swab : 100 tests/box 2) KIS Test Incubator : 4, 8, 또는 20 tests/incubator 3. 시험방법 1) 신장 부위에 면봉을 삽입한 후, 15 분 정도 방치하여 신장액이 충분히 스며들도록 한다. 소와 돼지 신장의 경우1-2 cm 깊이로 원형으로 절개하여 신장피질 부위에서 면봉팁을 돌리고 움직여 30 초간 흡수시킨다 (80 μl이상). 2) 몸통부위 (Swab device)를 위아래로 움직여 vial 상층부위 희석완충액 (dilution buffer)가 담겨진 부위 윗부분에 면봉이 약 1/3정도 잠기도록 한 후, 2분간 정치한다. 3) 2 분후, 몸통부위를 약 5회 위아래로 움직여 면봉 끝부분이vial 바닥부분으로 관통하여 희석완충액이 들어가도록 밀어 넣은 후 후진시킨다. 4) 65 에서 약 2시간 45분간 배양한 후, 결과를 판독한다. 5) 노랑색이나 녹색이면 음성, 파랑색이나 보라색이면 양성으로 판정한다. 제조사가 제시하는 KIS 킷트의 검출능 Antibiotics 검출감도 (ppm) MRL* (ppm) Antibiotics 검출감도 (ppm) MRL (ppm) Tetacyclines CTC/OTC/TC β-lactams Oxytertracycline 2.0 합으로 1.2 Penicillin G Sulfonamides Macrolides 총설파제 Sulfamethazine Tylosin Sulfadimethoxine 0.1 * 국내 닭고기의 잔류허용기준

50 KIS TM Test kit를 이용한 신장내 항균물질 신속간이검사법 신장 부위에 면봉을 삽입한 후, 15 분정도 방치하여 신장액이 충분히 스며들도록 한다. 몸통부위를 위아래로 움직여 vial 상층부위 배지가 담겨진 부위에 닿도록한 후, 2분간 정치한다. 2 분후, 몸통부위를 위아래로 움직이는 작업을 반복한 후, vial 바닥까지 면봉이 닿도록한다. 65 에서 약 3시간 배양한 후, 결과를 판독한다

51 II-5-3. ROSA (Rapid One Step Assay) kit 1. 원리 면역크로마토그래피법을 이용한 잔류물질 검사방법으로 항원으로 작용하는 잔류 물질과 이들에 대한 항체, 즉, 항원 항체 반응을 이용하여 표지물질로서 색깔을 지닌 작은 입자(40 nm 정도의 collidal gold particle)를 사용하여 항원항체반응 결과를 판정한다. 지금까지 면역크로마토그래피법을 이용한 검사법은 주로 사람의 질병 및 임신진단 목적으로 개발되어 왔으나 1996년에 우유내 progesterone을 반정량적으로 측정할 수 있는 신속검사법이 개발되었으며, 소의 오줌에서 sulfamethazine을 검출할 수 있는 방법도 개발되었다. 면역크로마토그래피 키트의 각 구성에 대한 모식도 면역크로마토그래피 키트는 모든 구성성분이 이미 작은 킷트 내에 포함되어 있어 시료를 킷트에 적용하는 것만이 검사자가 해야 할 유일한 과정으로, 사용이 간편하고 검사 소요시간이 10 분 이내로 매우 신속하게 검사할 수 있는 장점을 가지고 있다. 이러한 특징으로 목장 및 도축장에서도 다양한 검사 목적으로 사용할 수 있으며 발색체를 이용하므로 스크리닝 검사는 물론 반정량 검사에도 응용할 수 있다. 면역크로마토그래피법은 개개의 잔류 항균물질을 검출할 경우 특이성이나 검출 감도가 높고 신속하게 다량의 시료를 검사할 수 있는 장점 때문에 검사 킷트 형태로 이용되고 있다. 2. 시험재료 1) ROSA Enroflox Kit : 식육 100 tests/box 2) ROSA Incubator : 2, 4, 또는 8 tests/incubator 3) ROSA Reader : Optional

52 3. 시험방법 가. 시료 전처리 1) 50 ml 원심관에 20 ml 눈금까지 MSU buffer를 넣은 후 30 ml 눈금까지 근육조직 조각 (10 g)을 가한다. 추출완충액은 킷트에 포함된 추출완충액 조제용 1병을 1 L의 water에 녹인다. 조제한 추출완충액은 (0~7) 에서 2 개월간 보관하면서 사용할 수 있다. 2) Maxim food processor 안으로 근육조직과 MSU buffer를 부어 45 초간 균질화 한다. 1)과 2)과정 대신에 15 ml 시험관에 MSU 추출완충액 (extraction buffer) 2 ml를 첨가한 후 식육압착기 (meat press)에 근육 시료 약 (1-2) g을 넣고 압축하여 눈금 3 ml까지 맞추면 같은 결과가 된다. 3) 처음 사용한 50 ml 원심관에 균질화한 시료를 옮겨 r/min (1700 G)으로 10분간 원심분리한다. 4) 상층액 0.3 ml와 Enroflox 희석완충액 (dilution buffer) 0.3 ml를 가하여 혼합한다. 5) 조제한 추출완충액은 (0~7) 에서 보관한다. 나. 시험조작 미리 ROSA Strip incubator에 전원을 연결하여 온도를 (56±1) 로 맞추어 놓는다. 온도가 55 가 되면 녹색으로 나타난다. 1) 검사용 킷트 (test strip)의 평평한 면이 위쪽으로 향하도록 Strip incubator에 올려 놓고 라벨의 가장자리 시료패드 (sample pad) 부분의 tape를 벗긴다. 2) 시료패드 (sample pad)의 스펀지에 스며들도록 시료 희석용액300 μl를 수직으로 서서히 주입한다. 3) Sample pad 부분의 라벨을 눌러서 다시 밀봉하고 Strip incubator의 뚜껑을 닫고 잠근 후 적어도 8분간 배양후 strip을 꺼낸다. 8 분 후에 노란불이 깜박이기 시작하며 이후 2 분 이내에 꺼낸다. 4. 결과 판정 가. 육안으로 판정할 때 1) Incubator에서 sample pad 부분을 닿지 않도록 주의하여 strip을 꺼낸다. 2) Test line (T)과 control line (C)을 비교하기 위하여 수직을 잡는다. 3) T line이 C line보다 같거나 더 어두울 때는 음성으로 판정한다. 4) T line이 없거나 C line보다 밝을 때는 양성으로 판정한다

53 나. ROSA reader로 판독할 때 1) Reader 안에 test strip을 넣는다. 약 10 초 후에 Reader의 MRL channel에서 결과가 표시된다. 2) 음성 판정일 때 reader의 수치는 zero 또는 음성 수치가 표시되며, 결과는 Neg 또는 Not found 로 명시된다. 3) 양성 판정일 때 reader의 수치는 positive 수치가 표시되며, 결과는 positive 로 명시된다. 다. 양성으로 의심되는 시료의 확인 실험 양성으로 의심되는 시료의 경우에는 음성과 양성을 다시 한번 수행한다. 1) Negative control을 검사한 결과 negative의 결과가 나와야 한다. 2) Positive control을 결과한 결과 positive의 결과가 나와야 한다. 3) 실험을 재수행하여 시료가 양성으로 판정되면 시료는 양성으로 판정한다. CSI ROSA READER Version 1.07 Unit Serial Number 1299 Date: 17 OCT2003 Time: 13:59:29 Operator: 1 Channel: SLBL Lot: 063 Sample: 46-1 Limit: < 0 Strip Reading: Result: NEGATIVE II-5-4. SMART kit 1. 원리 3M에서 생산하고 있는 간이검사킷트로 면역크로마토그래피법을 이용한 잔류물질 검사 방법으로 항원으로 작용하는 잔류 물질과 이들에 대한 항체, 즉, 항원 항체 반응을 결과를 판정한여 식육내 잔류항균물질을 각 항생제 계열별로 10분 이내 신속 검사할수 있는 킷트이다. 식육에서 퀴놀론계 항생제를 검출할수 있는 2 Quinolones kit와 퀴놀론계, 설파제, 테트라싸이클린계, 베타-락탐계 4종의 항생제를 동시에 검출할 수 있는 Combination kit가 있다. 현재는 혈액이 많이 함유되지 않은 닭고기에서만 적용이 가능하다

54 면역크로마토그래피 키트의 각 구성에 대한 모식도 2. 시험재료 1) 2 Quinolone Kit : 100 tests/box 2) Combination Kit : 100 tests/box 3) Incubator (Heating block) : 3 tests/incubator 4) 3M Smart kit Reader : Optional 3. 시험방법 시료 전처리

55 500 μl r/min 150μL 150 μl 4. 결과 판정 가. 육안으로 판정할 때 1) Test line이 Control line보다 같거나 더 어두울 때는 음성으로 판정한다. 2) Test line이 없거나 Control line보다 밝을 때는 양성으로 판정한다

56 나. Reader로 판독할 때 1) Reader 안에 test strip을 넣는다. 약 10 초 후에 Reader의 MRL channel에서 결과가 표시된다. 2) 음성 판정일 때 reader의 수치는 zero 또는 음성 수치가 표시되며, 결과는 Neg 또는 Not found 로 명시된다. 3) 양성 판정일 때 reader의 수치는 positive 수치가 표시되며, 결과는 positive 로 명시된다. 다. 양성으로 의심되는 시료의 확인 실험 양성으로 의심되는 시료의 경우에는 음성과 양성을 다시 한번 수행한다. 1) Negative control을 검사한 결과 negative의 결과가 나와야 한다. 2) Positive control을 결과한 결과 positive의 결과가 나와야 한다. 3) 실험을 재수행하여 시료가 양성으로 판정되면 시료는 양성으로 판정한다

57 제조사가 제시하는 SMART Quinolones Kit의 검출능 Quinolone Detection level (ng/g) 1 Norfloxacin 50 2 Enrofloxacin 50 3 Danofloxacin 50 4 Oxolinic acid Ciprofloxacin 50 6 Flumequine Nalidixic acid 70 8 Ofloxacin 70 9 Lomefloxacin Sparfloxacin Enoxacin Orbifloxacin Marbofloxacin Pefloxacin 50 제조사가 제시하는 SMART Combination Kit의 검출능 Beta-lactam β-lactam Detection level (ng/g) 1 Amoxicillin 30 2 Ampicillin 20 3 Penicillin G 20 4 Cloxacillin 170 Sulfonamides Sulfa Detection level (ng/g) 1 Sulfathiazole Sulfachlopyridazine Sulfamethoxypyridazine Sulfamethoxazole Sulfamonomethoxine Sulfachlopyrazine Sulfadimethoxine Sulfadiazine Sulfamerazine Sulfamethazine Sulfaquinoxaline Sulfadoxine Sulfisoxazole Sulfapenazole

58 Quinolones Quinolone Detection level (ng/g) 1 Norfloxacin 50 2 Enrofloxacin 50 3 Danofloxacin Oxolinic acid Ciprofloxacin 50 6 Lomefloxacin 50 7 Enoxacin 60 8 Pefloxacin 50 Tetracyclines Tetra Detection level (ng/g) 1 Tetracycline Oxytetracycline Chlotetracycline methacycline Doxycycline Rolitetracycline 100 II-5-5. SensiCheck kit 1. 원리 국내 IR Lab에서 생산하고 있는 면역크로마토그래피법을 이용한 간이검사킷트로 식육, 유, 알 및 물고기내 퀴놀론계, 테트라싸이클린계, 베타-락탐계 항생제를 계열별로 검출할 수 있다. 2. 시험방법 가. 시료 전처리 1) 식육 (1) 식육 시료 (냉장, 냉동)를 3 ~ 5 g 준비한다 (냉동시료의 경우, 미리 해동하여 진행한다). (2) 마늘다지기를 이용하여 200 μl 이상 압착 추출한다. (3) 육즙 100 μl를 취하여 1.5 ml Micro tube에 옮기고, 제공된 Meat Dilution Buffer 100 μl를 추가한다. (4) Vortex Mixer를 이용하여 20초간 혼합한 후, 검사 시료로 사용한다

59 2) 우유 원유, 균질유, 액상화한 분유는 전처리 없이 시험에 바로 사용한다. 3) 식용란 (1) 검사할 계란의 난백과 난황을 믹서기를 사용하여30초간 잘 혼합한다(계란 5개 정도를 사용하여 용기의 50 % 정도가 되게 한다). (2) 전란액 300 μl를 취하여 1.5 ml Micro tube에 옮기고, 제공된 Egg Dilution Buffer 600 μl를 추가한다. (3) Vortex Mixer를 이용하여 20초간 혼합한 후, 검사 시료로 사용한다. 4) 수산물 (1) 수산물 시료를 3~5 g 준비한다 (2) 마늘다지기를 이용하여 200 μl 이상 압착 추출한다. 추출액 100 μl를 취하여 1.5 ml Micro tube에 옮기고, 제공된 Meat Dilution Buffer 200 μl를 추가한다. (3) Vortex Mixer를 이용하여 20초간 혼합한 후, 검사 시료로 사용한다. 나. 시험 조작 모든 반응은 실온에서 진행한다. 1) 준비된 시료 150 μl를 Test kit의 시료 부위에 떨어뜨린 후 5분간 상온에서 반응한다. 2) 만약 5분 후 결과가 나오지 않는다면 추가 반응시간을 5분 가량 늘린다 3. 결과 판정 검출선 (T)과 대조선 (C)의 진하기 정도를 비교하여 결과를 판단한다. 가. 육안으로 판정할 때 1) T line을 C line과 비교하여 검출선의 진하기가 대조선과 유사하거나 진한 경우에는 음성으로 판정한다

60 2) T line의 진하기가 C line의 1/2 이하일 경우 의양성으로 판정한다. 나. SensiCheck reader로 판독할 때 1) 반응 후, 리더기에 스캔하여 측정값을 기록한다. 2) 음양성 표준 시료의 측정값을 기준으로 의양성 여부를 판정한다. 다. 의양성 시료의 확인실험 의양성 시료의 경우에는 음성과 양성을 다시 한 번 수행한다. 1) Negative Control을 검사한 결과 Negative의 결과가 나와야 한다. 2) Positive Control을 검사한 결과 Positive의 결과가 나와야 한다. 3) 실험을 재수행하여 시료가 양성으로 판정되면 시료는 양성으로 판정한다. 제조사가 제시하는 SensiCheck Kit Quinolones 검출능

61 제조사가 제시하는 SensiCheck Kit β-lactams 검출능 제조사가 제시하는 SensiCheck Kit Tetracyclines 검출능

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63 Ⅲ 미생물수용체법

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65 III. 미생물수용체법 (Charm II Receptor Assay) 1. 원리 미생물수용체법의 측정원리는 효소면역분석법과 동일한 형태로 항균물질의 수용체를 지니고 있는 미생물세포 또는 미생물세포에 결합하는 특이항체와 시료 중의 항균물질이 결합하는 원리를 이용한다. 시판 킷트로는 미국 charm sciences사에서 개발한 charm II assay와 국내 (주)인투젠에서 개발한 TAB (Test for AntiBiotics)이 있다. 방사성동위원소인 [ 14 C] 또는 [ 3 H]로 표지된 항균물질(tracer)이 이용되며, 미생물의 수용체나 항체에[ 14 C] 또는 [ 3 H]이 표지된 항균물질을 연속적으로 혹은 경쟁적으로 반응시켜 결합된 표지항균물질의 방사능을 측정하여 시료 중의 잔류 항균물질을 계열별로 정성 혹은 정량적으로 분석한다. 즉 항균물질의 수용체를 지니고 있는 미생물세포 또는 특이항체에 잔류물질이 들어있는 시료가 첨가되면 시료내 잔류 항균물질은 미생물 세포에 존재하는 수용체와 결합하게 되며, 시료에 항균물질이 잔류되어 이미 결합되면 [ 14 C] 또는 [ 3 H]가 표지된 항균물질이 첨가되더라도 수용체에 결합을 방해하는 결과가 된다. 따라서 [ 14 C] 또는 [ 3 H]로 표지된 항균물질이 수용체에 적게 결합하면 할수록 시료 중에는 항균물질이 많이 잔류하는 결과가 된다. 이러한 세포 수용체와 결합된 [ 14 C] 또는 [ 3 H] 량을 방사성동위원소 측정장치 (scintillation counter)로 측정하며, 일정수준까지 시료에 항균물질이 많이 잔류되어 있을수록 측정값(count per minute, cpm)은 적어진다. 미생물수용체법을 이용해 식육에서 검사 가능한 항균물질은 베타-락탐계, 마크로 라이드계, 설파제, 아미노글라이코사이드계, 테트라사이클린계, 클로람페니콜 등이며, 특정 항균 단일물질을 검사하는 것이 아니라 계열별 항균물질을 검사할 수 있다. 적용범위는 쇠고기, 돼지고기, 닭고기 및 어육(연어) 등의 근육 조직 뿐만 아니라 신장, 간 등과 같은 다른 조직에도 이용될 수 있다. 2. 시험재료 1) Charm II kit tablet reagents: Aminoglycosides, Amphenicols, β-lactams, Macrolides, Sulfonamides, Tetracyclines 등 2) Zero & Positive control standard 3) Scintillation fluid : Optifluor r 또는 동등품 4) Analyzer (Scintillation counter)

66 5) Borosilicate glass test tube 6) Heating block : 35, 65, 80 7) Centrifuge : G 8) Centrifuge tube : 50 ml 9) Micropipette & Pipette tip : 100 μl, 1000 μl 10) Cotton swab 등 3. 첨가시료 조제 및 control point 설정 가. 항균물질 첨가시료 (fortified sample)의 조제 이 항균물질 첨가시료는 설파제, 베타-락탐계 및 테트라싸이클린계 항균물질을 제외한 마크로라이드계, 아미노글리코사이드계 항균물질 및 클로람페니콜의 control point를 설정하기 위하여 조제한다. 1) 항균물질이 오염되지 않은 시료를 확보하여 축종별6개의 작은 크기로 자른 식육시료 10 g씩을 50 ml 원심분리관에 취한다. 2) 냉장 보관중인 복합 항균물질 표준품 1 개를 꺼내 실온이 되도록 한 후 증류수 10 ml를 가하여 잘 녹인 다음 얼음이나 냉장고에 15분간 방치한다. 3) 축종별 6개의 식육시료에 10 ml로 녹인 복합항균 물질 표준품 0.5 ml를 첨가한 후 실온에서 약 30분간 방치한다. 설파메타진 첨가시료 조제시 1 ml를 사용한다. 4) MSU extraction buffer를 원심분리관의 40 ml 눈금 표시선까지 채운다. 이하 4. 전처리 방법 가. 2) 라) 단계부터는 검사시료와 동일하게 처리하여 항균물질 계열별 시험방법에 따라 cpm 값을 구한다. 나. Control point 설정 Control point란 시료 중에 당해 계열 항균물질의 잔류여부를 판정하는 기준값으로서 음성시료 (negative)인지 양성추정시료 (suspect)인지를 결정하는 기준이 된다. 시료의 검사 결과 control point보다 수치가 크면 검사시료는 음성임을 의미하며, control point의 수치와 같거나 적으면 검사시료는 양성추정시료를 의미한다. 양성추정시료는 가능한 positive control 및 negative control과 함께 재시험할 것을 권장한다. Control point는 설파제, 베타-락탐계 및 테트라싸이클린계 항균물질을 제외하고 나머지 계열의 항균물질은 항균물질 계열별 6개의 항균물질 음성시료를 택하여 복합 항균물질 표준품을 첨가하여 설정한다. 이들 세가지 계열의 항균물질은 6개의 음성대조 (negative control)를 사용하여 측정한 cpm의 평균값에서 항균물질 계열별 일정비율을 감하여 설정하고, 베타-락탐계 항균물질 등 나머지 계열의 항균물질은 첨가시료를 만들어 설정 한다

67 1) 설파제, 베타 - 락탐계 및 테트라싸이클린계 항균물질 (1) 6개의 음성대조시료 (negative control)를 조제하여 이들 계열의 항균물질 시험 방법에 따라 cpm값을 측정한다. 음성대조시료는 tissue performance negative concentrate 2 ml과 MSU extraction buffer 6 ml로 희석하여 사용한다. (2) 항균물질 계열별 cpm 값의 평균을 구한다. (3) 평균값에서 평균의 40 % (베타-락탐계는 30 %)를 감하여 control point를 설정한다. 2) 마크로라이드계, 아미노글리코사이드계 항균물질 및 클로람페니콜 (1) 6개의 첨가시료에 대한 cpm 값의 평균을 구한다. (2) 평균값에 평균의 20 % (마크로라이드계는 40 %)를 더하여 control point를 설정한다. 복합 항균물질 표준품 (MultII-antimicrobial concentrate standard)의 농도 구 분 조직내 첨가 농도 Performance monitoring 항균물질 증류수 10 ml로 녹인 표준품의 농도 (ng/ml) 조직내 농도 (ng/g) 추출액내 농도 (ng/ml) 용액내 농도 (ng/ml) Penicillin G Erythromycin Sulfamethazine * Streptomycin Chloretracycline Chloramphenicol 전처리 방법 - Food Processor 가. 식육 1) 전처리시 주의사항 (1) 식육 중 지방층은 방해물질로 작용할 수 있으므로 추출과정에 들어가기 전에 과도한 지방층은 제거한다. (2) 시료는 가능한 당일에 추출하도록 하고 추출액은 측정과정에 들어가기 직전에 바로 실온에 도달될 수 있도록 유지한다. (3) 시료는 가급적 신선육을 사용하고 냉동시료는 추출 직전까지 냉동 보관된 것을 사용 한다

68 2) 전처리방법 (1) 50 ml 원심분리관에 시료번호를 기입한다. (2) MSU extraction buffer를 원심분리관의 30 ml 표시선까지 채운다. (3) 작은 크기로 자른 시료 10 g을 취해 눈금표시선 40 ml까지 채운다. (4) 상기 시료 및 완충액을 믹서기에 넣는다. (5) 30 ~ 60 초간 균질화한다. (6) 균질화된 시료용액을 다시 동일한 원심분리관에 옮긴다. (7) 원심분리관을 80, 항온블록에서 45분간 방치한다. (8) 얼음물 (ice water bath)에 10분간 식힌다. (9) g 속도로 10분간 원심분리한다 (IEC 원심분리기 경우 7 번 사용). (10) 지방입자가 혼입되지 않도록 주의하여 상층액을 새로운 원심분리관에 따른다. (11) ph indicator strip을 사용하여 ph를 측정한다. (12) 만일 ph가 적절하지 않으면 M 2 buffer 300 μl를 가하여 잘 혼합한 다음 재측정한다. 만약 ph 7.5가 아니면 M 2 buffer를 추가로 몇 방울 가하여 잘 섞은 다음 다시 ph를 측정한다. 나. 우유 각 우유 (원유) 시료는 50 ml 시험관에 3/4을 채워 5분간 원심분리한 후 지방층 아래 부분에 있는 탈지층(skim portion)을 취하여 검사시료로서 사용한다. 7 가지 계열의 항균 물질을 검사하기 위해서는 탈지우유가 최소한 약 30 ml 이상 필요하다. 계열이 다른 항균물질을 동시에 시험할 수 있는데 이 경우 모든 계열의 원심분리시간을 5 분으로 하며 control point도 동일한 조건으로 설정되어야 한다. 다. 식용란 신선한 알을 사용하여 시험당일 시료를 추출한다. 표준항균물질 첨가 시료는 다음의 4) 단계에서 복합항균표준용액 0.5 ml를 가하여 조제한다. 1) 50 ml 원심분리관에 시료번호를 기입한다. 2) 다른 깨끗한 용기에 알을 깨트린다. 3) 설압자 (spatula)로 난백과 난황의 색상이 균일해질 때까지 혼합한다. 4) 50 ml 원심 분리관에 10 ml의 알혼합액을 넣는다. 5) 끓는 물에 6 분 동안 가열한다. 6) 믹서기 (Maxim food processor)안에 알 응고물을 넣는다

69 7) 원심분리관에 MSU extraction buffer를 30 ml 넣는다. 8) 원심분리관에 가한 MSU extraction buffer를 믹서기에 넣는다. 9) 30 ~ 60 초간 균질화한다. 10) 균질화된 시료용액을 다시 동일한 원심분리관에 옮긴다. 11) g 속도 (IEC 원심분리기 No 7)로 10분간 원심분리한다. 12) 원심분리한 불투명한 상층액을 따로 취하여 시험용액으로 한다. 5. 계열별 시험방법 Charm II test 정제시약 키트를 사용한 항균물질 계열별 시험방법은 시험과정에 따라sequantial assay와 competitive assay로 구분되지만 일반적으로 먼저 binding reagent를 녹인 후 전처리한 시료추출액, positive control 혹은 negative control 시료를 첨가하고 방사성 동위원소가 표지된 항균물질 (tracer)를 첨가하여 반응시키는 일련의 절차를 밟는다. 각 계열별 시험방법을 요약하면 다음과 같다. 가. 식육 1) Beta-lactam Sequential Assay Green 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 시료추출액 2 ml, 10 초간 혼합 55, 2분간 Yellow시약 (marked P->), 10 초간 혼합 55, 2분간 3분간 원심 즉시 상층액 제거 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml 마개를 씌우고 10 초간 혼합 14 C 측정 2) Macrolide Sequential Assay White 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 시료추출액 4 ml, 10 초간 혼합 55, 2분간 Green 시약 (marked E->), 10 초간 혼합 55, 2분간 3분간 원심 즉시 상층액 제거 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml 마개를 씌우고 10 초간 혼합 14 C 측정 3) Sulfonamide Sequential Assay White 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 시료추출액 4 ml, 10 초간 혼합 Pink 시약 (marked Sm->), 10 초간 혼합 35, 2분간 3분간 원심 즉시 상층액 제거 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml 마개를 씌우고 10 초간 혼합 3 H 측정 4) Streptomycin Sequential Assay White 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 시료추출액 2 ml, 10 초간 혼합 35, 2분간 Green 시약 (marked ST->), 10 초간 혼합 35, 2분간 3분간 원심 즉시 상층액 제거 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml 마개를 씌우고 10 초간 혼합 3 H 측정

70 5) Tetracycline Competitive Assay White 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 시료추출액 4 ml Orange시약 (marked T->) 10 초간 혼합 35, 5분간 5분간 원심 즉시 상층액 제거 water* 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml 마개를 씌우고 10 초간 혼합 1분간 정치 후 3 H 측정 * 위 과정에서 다량의 heme을 함유하여 붉은색을 띄는 쇠고기 신선육 (fresh red beef tissue)의 경우 water 대신에 10 % L-ascorbic acid 용액 300 μl을 사용할 것을 권장한다. 6) Aminoglycoside Sequential Assay White 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 시료추출액 4 ml, 10 초간 혼합 Yellow 시약 (marked G->) 10 초간 혼합 35, 5분간 5분간 원심 즉시 상층액 제거 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml 마개를 씌우고 10 초간 혼합 3 H 측정 7) Chloramphenicol Assay White 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 시료추출액 1 ml Green시약 (marked C->), 10 초간 혼합 first charcoal black 시약, 10 초간 혼합 ice water bath (0-4 ), 3분간 second charcoal black 시약, 10 초간 혼합 3분간 원심 상층액을 버리지 않으며 상층액 300 μl를 새로운 시험관에 취함 scintillation fluid 3 ml 마개를 씌우고 10 초간 혼합 3 H 측정 나. 우유 우유에서의 항균물질 계열별 시험방법은 다음의 competitive assay (CA)나 sequential assay (SA)에 따라 검사할 수 있으나 control point는 수행하려는 방법에 따라 설정되어야 한다. 이를테면, 베타 - 락탐계 항균물질의 검사를 SA법으로 수행할 경우 control point는 SA법으로 설정하여야 한다. 1) Competitive Assay (1) Beta-lactams Green 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 우유 5 ml (우유 온도 4 유지) yellow 시약, 즉시 15 회 혼합 85, 3분간 3분간 원심, 즉시 우유 제거 (필요시 면봉으로 fat ring 제거) fat ring 제거 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml, 마개 씌우고 10 초간 혼합 14 C 측정 (2) Macrolides White 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 우유 5 ml (우유 온도 4 유지) Green 시약 (Reagent E), 즉시 15 초간 혼합 65, 3분간 3분간 원심, 즉시 우유 제거 (필요시 면봉으로 fat ring 제거) fat ring 제거, 2개 이상 면봉으로 건조 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml, 마개 씌우고 10 초간 혼합 14 C 측정

71 (3) Novobiocin White 시약 (Reagent B) water 300 μl, 10 초간 혼합 우유 5 ml (우유온도 4 유지) Blue 시약 (Reagent N), 즉시 15 초간 혼합 65, 3분간 3분간 원심, 즉시 우유 제거 (필요시 면봉으로 fat ring 제거) fat ring 제거, 2개 이상 면봉으로 건조 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml, 마개 씌우고 10 초간 혼합 3 H 측정 (4) Sulfonamides White 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 우유 5 ml (우유 온도 4 유지) Pink 시약, 즉시 15 회 혼합 85, 3분간 3분간 원심, 즉시 우유 제거 (필요시 면봉으로 fat ring 제거) fat ring 제거, 2개 이상 면봉으로 건조 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml, 마개 씌우고 10 초간 혼합 3 H 측정 Control point: 6 개 첨가시료 (SMZ 10 ppb)의 평균값에 평균의 23 %를 더하여 설정한다. (5) Aminoglycosides White 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 우유 5 ml (우유온도 4 유지) Green 시약 (St->), 즉시 15 초간 혼합 35, 3분간 3분간 원심, 즉시 우유 제거 (필요시 면봉으로 fat ring 제거) fat ring 제거, 2개 이상 면봉으로 건조 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml, 마개 씌우고 10 초간 혼합 3 H 측정 Control point: 6 개 첨가시료 (GM 30 ppb)의 평균값에 평균의 15 %를 더하여 설정한다. (6) Tetracyclines White 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 우유 5 ml (우유온도 4 유지) Orange 시약, 즉시 20 초간 혼합 35, 3분간 5분간 원심, 즉시 우유 제거(필요시 면봉으로 fat ring 제거) fat ring 제거, 2개이상 면봉으로 건조 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml, 마개 씌우고 10 초간 혼합 3 H 측정 Control point : 6 개 첨가시료 (OTC 100 ppb)의 평균값에 평균의 23 %를 더하여 설정한다. (7) Chloramphenicol White 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 우유 1 ml (우유온도 4 유지) Green 시약, 즉시 10 회 혼합 Black 시약, 즉시 10회 혼합 Ice bath (얼음 50 %, 2 ), 3분간 5분간 원심 우유를 버리지 않으며, 지방을 피해 우유 300 μl를 새로운 시험관에 취함 scintillation fluid 3 ml, 마개 씌우고 10 초간 혼합 3 H 측정 2) Sequential Assay (1) Beta-lactams Green 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 우유 5 ml (우유 온도 4 유지) 65, 2분간 yellow 시약, 즉시 10회 혼합 65, 2분간 3분간 원심, 즉시 우유 제거 (필요시 면봉으로 fat ring 제거) fat ring 제거 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml, 마개 씌우고 10 초간 혼합 14 C 측정 Control point : 음성대조시료 (zero control) 평균값에서 평균의 20 %를 감하여 설정한다

72 (2) Macrolides White 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 우유 5 ml (우유 온도 4 유지) 65, 2분간 Green 시약 (Reagent E), 즉시 10 초간 혼합 65, 2분간 3분간 원심, 즉시 우유 제거 (필요시 면봉으로 fat ring 제거) fat ring 제거, 2개 이상 면봉으로 건조 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml, 마개 씌우고 10 초간 혼합 14 C 측정 (3) Sulfonamides White 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 우유 5 ml (우유 온도 4 유지) 65, 2분간 Pink 시약, 즉시 10회 혼합 65, 2분간 3분간 원심, 즉시 우유 제거 (필요시 면봉으로 fat ring 제거) fat ring 제거, 2개 이상 면봉으로 건조 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml, 마개 씌우고 10 초간 혼합 3 H 측정 (4) Aminoglycosides White 시약 water 300 μl, 10 초간 혼합 우유 5 ml (우유온도 4 유지) 35, 2분간 Green 시약 (St->), 즉시 10 초간 혼합 35, 2분간 3분간 원침, 즉시 우유 제거 (필요시 면봉으로 fat ring 제거) fat ring 제거, 2개 이상 면봉으로 건조 water 300 μl, 10 초간 혼합 scintillation fluid 3 ml, 마개 씌우고 10 초간 혼합 3 H 측정 다. 식용란 앞의 계열별 시험방법 중 알의 전처리 방법에 따라 추출한 시험용액을 이용하여 식육의 계열별 시험방법과 동일하게 시험한다. 6. 양성추정시료의 확인시험 가. 양성추정시료 (suspect sample)는 가능한 positive control 및 negative control와 함께 실험을 반복한다. 나. 재시험 결과 시료의 cpm 수치가 control point보다 같거나 낮고, control 결과가 예상되는 범위 내에 있을 경우 양성으로 판정한다. 이때 이 시료의 항균물질 잔류농도는 positive control 시료로 첨가한 항균물질의 농도와 같거나 높다고 볼 수 있다. 다. 돈육시료에 있어서 chlortetracycline (CTC)이나 oxytetracycline (OTC)이 잔류되어 테트라싸이클린계 항균물질로 추정된 시료인 경우 시료추출액과 음성대조시료를 1:1 (3 ml+3 ml)로 희석하여 시험한 결과 양성이면 조직내 잔류농도가 50 ng/g 이상, 1:3 (2 ml+ 6 ml)로 희석하여 시험한 결과 양성이면 100 ng/g 이상으로 추정할 수 있다

73 Ⅳ 축산물의 잔류 동물용의약품 동시 다계열 스크리닝법

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75 Ⅳ. 축산물의 잔류 동물용의약품 동시 다계열 스크리닝법 1. 원리 다계열의 동물용의약품을 동시분석하기 위하여 추출 및 정제과정에서 대상 성분의 손실이 적은 간단한 전처리 과정을 적용하였으며, 시료에 2 mm A mmonium Formate가 포함된 acetonitrile/water (4:1, v/v)로 추출한 후 Dispersive SPE (C18)로 정제한 후 LC-IT-ToF/MS로 분석한다. 2. 분석기기 이온트랩-시간비행형 질량분석기 (LC-IT-ToF/MS) 3. 표준품 및 시약 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : Antiprotozoals, benzimidazoles, cephalosporines, ionophores, macrolides, penicillins, quinolones, sulfonamides, tetracyclines 등 110종 2) Acetonitrile : LC-MS grade 3) Methanol : LC-MS grade 4) Formic acid : LC-MS grade 5) A mmonium formate : A.C.S 6) C18 충전제 : 입자크기 37~55 μm, 공극크기 125 A 또는 이와 동등한 것 7) 증류수 : 18 MΩㆍcm 2 이상 나. 기 구 1) 15 ml, 50 ml centrifuge tube 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, μl 4) 마이크로필터 : 0.2 μm filter Whatman, Mini-UniPrepTM PVDF Syringeless filter 100 Units - Cat. No. UN203NPEAQU 5) 원심분리기 6) 정밀저울 (Chemical balance) ± g 정밀도

76 7) 일반저울 : ± 0.1g 정밀도 8) Vortex mixer 9) Multi-mixer TAITEC, Vial Mixer, VIX ) Ultrasonic bath 4. 표준용액, 시험용액 및 첨가시료의 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 각각의 표준품 10 mg (역가 100 %)을 정밀히 달아 100 ml 용량플라스크에 취하여 Methanol에 녹여 표시선 까지 채운 다음 잘 혼합한다 (100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution): 각 물질별 잔류허용기준을 기준으로 하여validation level (VL)을 정하고, stock solution을 증류수를 이용하여 각 물질별로 VL의 10배가 되도록 혼합하여 표준용액으로 사용한다. 나. 시험용액 1) 0.1 % formic acid in water (0.1 % FA in water) 증류수 ml에 formic acid 1 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 2) 0.1 % formic acid in acetonitrile (0.1 % FA in MeCN) Acetonitrile ml에 formic acid 1 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 3) 0.2 M ammonium formate (0.2 M AF) 증류수 100 ml에 ammonium formate 1.25g을 넣고 용해하여 사용한다. 다. 첨가시료 (Spiked sample) 균질화한 음성대조시료 2 g에 VL 5배 농도의 희석표준용액을 200μL 첨가하여 각각의 표준물질이 VL 농도가 되도록 spike sample을 조제하여 매 실험 마다 3개 이상 시험한다. 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 시료 2 g에 0.2 M ammonium formate 0.1 ml과 water 2 ml을 첨가하여 균질화 한후, 추출액 acetonitrile 8 ml을 첨가한다. 2) multi-mixer로 15분간 강하게 진탕 혼합한 후 r/min으로 10분간 원심분리한다. 3) 상층액을 분리하여 C 18 분말 500 mg을 분산시킨 후, hexane 10 ml을 첨가하여 1분간 진탕 혼합한다

77 4) r/min으로 5분간 원심분리 하고, hexane층 아래 추출액중 5 ml만을 취해 눈금이 표시된 새로운 튜브로 옮긴후, 40 하에서 1 ml이 되도록 질소 농축한다. 5) 추출액 1 ml중 0.5 ml을 취하여 0.2 μm PVDF syringeless filter로 여과후 분석을 실시한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 Column Acquity BEH C 18 (2.1x50 mm, 1.7 μm) 또는 동등품 Mobile phase A : 0.1 % formic acid in water B : 0.1 % formic acid in MeCN A와 B의 gradient Column temperature Injection volume 40 5 μl Mobile phase gradient program Time (min) A (%) B (%) Flow rate (min/ml) ) 질량분석기 분석조건 - Ionization : Electrospray ionization (ESI) positive/negative ion switching mode - Capillary voltage : Positive +4.5 kv, Negative -3.5 kv - Detector voltage : 1.52 kv - Interface temp. : Nebulizing gas : N 2, 1.5 L/min - Drying gas : N 2, 15 L/min - Cooling gas : Argon - Ion accumulation time : 30 msec - Mass range : m/z ToF calibration : External mass calibration using sodium trifluoroacetate 다. 질량정확도 (Mass Accuracy) 표준용액을 이용하여 각 물질별 정성 이온을 선별하고, 시료 내 검출된 mass값의 차를 질량 정확도 ( Mass, ppm)로 나타낸다. (시료내 검출된 물질의 mass값-표준용액의 mass값) 표준용액의 mass값 10 6 = 질량정확도 (ppm)

78 라. CC α 및 CC β 산출 Decision limits (CC α )의 산출은 사용금지약물의 경우 MRPL의 1.0, 1.5, 및 2, MRL 설정물질의 경우 MRL의 0.5, 1, 1.5 로 각각 6개 이상의 음성대조시료에 첨가하여 분석한 후 X축을 농도, Y축을 signal로 검량선 (calibration line)을 작성한다. 그 다음 원래 검량선의 upper error line (signal SD of signal based on within-lab reproducibility CV)과 lower error line (signal-1.64 SD of signal based on within-lab reproducibility CV)을 추가로 작성하여 MRL 농도의 upper error line 지점에서 X축과 평행으로 원래 검량선과 만나는 지점의 농도가 CC α 가 된다. 또다른 방법으로 정성분석법의 경우에 한하여는MRL 농도로 첨가한 fortified sample을 20반복 시험한 결과의 SD로부터 산출 할 수 있다. 산출공식은 CC α =MRL+1.64 SD of measured concentration based on within-lab reproducibility at MRL) 이다. Dection capability (CC β )의 설정 절차는 CC α 를 설정할 때돠 같이 사용금지약물의 경우 MRPL의1.0, 1.5, 및 2, MRL 설정 물질의 경우 MRL의 1.0, 1.5, 및 2 로 첨가한 농도군별 6반복 fortified sample을 이용하여 분석한 후 작성한 본래의 검량선, upper error line 및 lower error line으로부터 설정할 수 있다. 즉, MRL 농도의 upper error line 지점에서 X축과 평행으로 lower error line과 만나는 지점의 농도가 CC β 가 된다. 또 다른 방법으로 정성분석법의 경우에 한하여는 이미 결정된 CC α 농도로 첨가한 fortified sample을 20반봅 시험한 결과의 SD로부터 산출 할 수 있다. 산출공식은 CC β =CC α SD of measured concentration based on within-lab reproducibility at CC α )이다. 마. 조직표준곡선 작성 Blank를 포함하여 각 물질별 VL (validation level) 농도의 0.5, 1, 2, 3, 4 6단계로 조직표준곡선 (matrix standard curve)를 작성하며, LC-ToF/MS로 분석하여 얻은 크로마토 그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다. 6. 시험결과 분석 시료의 분석용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 각각에서 얻은 크로마토 그램으로부터 물질별 머무름시간과 질량값을 비교한다. 표준용액 및 시료내 분석물질의 질량값 차를 확인하고 정성이온의 평균면적을 구한 다음 표준곡선 좌표의Y 축에 동일한 값을 표시하고 이 값과 표준 곡선상 만나는 점에서 수직으로 X 축과 만나는 점이 이용해 시료의 농도를 계산한다

79 Fig. 1. Total ion chromatograms (A) and extracted ion chromatograms (B) of 110 veterinary drugs on bovine muscle at validation level

80 Veterinary drugs and performance characteristics as determined in this method. With the exception of VL, RT and CCβ, the parameters are expressed as the range of the average parameters for the three tested matrices (muscle, kidney and liver) at the three concentrations (0.5, 1.0 and 2 times VL). CCβ is given as the range for the three tested matrices and 1.0 times VL Table 1. Validation results of 17 sulfonamides Compound Chemical Formula Calculated m/z Measured Ion RT a VL b MRL Mass c Accuracy d Repeat. e Repro. f CCβ g r 2 h (min) (μg/kg) (μg/kg) (ppm) (%) (%) (%) (μg/kg) Sulfisomidine C12H14N4O2S [M+H] Sulfadiazine C10H10N4O2S [M+H] s Sulfathiazole C9H9N3O2S [M+H] s Sulfamerazine C11H12N4O2S [M+H] s Sulfamethazine C12H14N4O2S [M+H] s Sulfamethoxypyridazine C11H12N4O3S [M+H] s Sulfamonomethoxine C11H12N4O3S [M+H] s Sulfachlorpyridazine C10H9ClN4O2S [M+H] s Sulfadoxine C12H14N4O4S [M+H] s Sulfamethoxazole C10H11N3O3S [M+H] s Sulfisoxazole C11H13N3O3S [M+H] s Sulfachlorpyrazine C10H9ClN4O2S [M+H] s Sulfaquinoxaline C14H12N4O2S [M+H] s Sulfadimethoxine C12H14N4O4S [M+H] s Sulfaphenazole C15H14N4O2S [M+H] s Dapsone C12H12N2O2S [M+H] Trimethoprim C14H18N4O [M+H]

81 Table 2. Validation results of 6 tetracyclines and 14 quinolones Compound Chemical Formula Calculated m/z Measured Ion RT a VL b MRL Mass c Accuracy d Repeat. e Repro. f CCβ g r 2 h (min) (μg/kg) (μg/kg) (ppm) (%) (%) (%) (μg/kg) Minocycline C23H27N3O [M+2H] Domeclocycline C21H21ClN2O [M+H] Oxytetracycline C22H24N2O [M+H] s Tetracycline C22H24N2O [M+H] s Chlortetracycline C22H23ClN2O [M+H] s Doxycycline C22H24N2O [M+H] Marbofloxacin C17H19FN4O [M+H] Norfloxacin C16H18FN3O [M+H] Ofloxacin C18H20FN3O [M+H] Pefloxacin C17H20FN3O [M+H] Enrofloxacin C19H22FN3O [M+H] s Ciprofloxacin C17H18FN3O [M+H] s Danofloxacin C19H20FN3O [M+H] Orbifloxacin C19H20F3N3O [M+H] Difloxacin C21H19F2N3O [M+H] Oxolinic acid C13H11NO [M+H] Nalidixic acid C12H12N2O [M+H] Flumequine C14H12FNO [M+H] Sarafloxacin C20H17F2N3O [M+H] Piromidic acid C14H16N4O [M+H]

82 Table 3. Validation results of 13 β-lactams Compound Chemical Formula Calculated m/z Measured Ion RT a VL b MRL Mass c Accuracy d Repeat. e Repro. f CCβ g r 2 h (min) (μg/kg) (μg/kg) (ppm) (%) (%) (%) (μg/kg) Ampicillin C16H19N3O4S [M-H] Penicillin G C16H18N2O4S [M+H] Penicillin V C16H18N2O5S [M-H] Oxacillin C19H19N3O5S [M-H] Cloxacillin C19H18ClN3O5S [M-H] Nafcillin C21H22N2O5S [M-H] Dicloxacillin C19H17Cl2N3O5S [M-H] Piperacillin C23H27N5O7S [M-H] Ceftiofur C19H17N5O7S [M+H] Desfuroylceftiofur C19H17N5O7S [M+H] Cefquinome C23H24N6O5S [M+2H] Cephalexin C16H17N3O4S [M+H] Cefadroxil C16H17N3O5S [M+H]

83 Table 4. Validation results of 10 macrolides and 14 benzimidazoles Compound Chemical Formula Calculated m/z Measured Ion RT a VL b MRL Mass c Accuracy d Repeat. e Repro. f CCβ g r 2 h (min) (μg/kg) (μg/kg) (ppm) (%) (%) (%) (μg/kg) Erythromycin C37H67NO [M+H] Oleandomycin C35H61NO [M+H] Tilmicosin C46H80N2O [M+2H] Roxithromycin C41H76N2O [M+2H] Spiramycin C43H74N2O [M+2H] Josamycin C42H69NO [M+H] Tiamulin C41H79N3O [M+2H] Valnemulin C31H52N2O5S [M+H] Lincomycin C18H34N2O6S [M+H] Tulathromycin C41H79N3O [M+3H] Thiabendazole C10H7N3S [M+H] hydroxy thiabendazole C10H7N3OS [M+H] Oxibendazole C12H15N3O [M+H] Triclabendazole C14H9Cl3N2OS [M+H] Albendazole C12H15N3O2S [M+H] Aminoalbendazole sulfone C10H13N3O2S [M+H] Mebendazole C16H13N3O [M+H] Flubendazole C16H12FN3O [M+H] Aminoflubendazole C14H10FN3O [M+H] Febantel C20H22N4O6S [M+H] s Fenbendazole C15H13N3O2S [M+H] s Oxfendazole C15H13N3O3S [M+H] s Oxfendazole sulfone C15H13N3O4S [M+H]

84 Table 5. Validation results of 5 ionophores and 14 coccidiostats Compound Chemical Formula Calculated m/z Measured Ion RT a VL b MRL Mass c Accuracy d Repeat. e Repro. f CCβ g r 2 h (min) (μg/kg) (μg/kg) (ppm) (%) (%) (%) (μg/kg) Lasalocid C34H54O [M+Na] Monesin C36H62O [M+Na] Narasin C43H72O [M+Na] Salinomycin C42H70O [M+Na] Semduramicin C45H76O [M+Na] Clopidol C7H7Cl2NO [M+H] Decoquinate C24H35NO [M+H] Diaveridine C13H16N4O [M+H] Dicyclanil C8H10N [M+H] Diclazuril C17H9Cl3N4O [M-H] Ethopabate C12H15NO [M+H] Imidocarb C19H20N6O [M+H] Nicarbazin C19H18N6O [M-H] Robenidine C15H13Cl2N [M+H] Toltrazuril C18H14F3N3O [M-H] Toltrazuril sulfone C18H14F3N3O6S [M-H] Toltrazuril sulfoxide C18H14F3N3O5S [M-H] Dinitolmide C8H7N3O [M-H]

85 Table 6. Validation results of 8 NSAIDs and Others Compound Chemical Formula Calculated m/z Measured Ion RT a VL b MRL Mass c Accuracy d Repeat. e Repro. f CCβ g r 2 h (min) (μg/kg) (μg/kg) (ppm) (%) (%) (%) (μg/kg) Niclosamide C13H8Cl2N2O [M-H] Morantel C12H16N2S [M+H] Pyrantel c11h12n2s [M+H] Florfenicol C12H14Cl2FNO4S [M-H] Thiamphenicol C12H15Cl2NO5S [M-H] Azaperone C19H22FN3O [M+H] Closantel C22H14Cl2I2N2O [M-H] Clorsulon C8H8Cl3N3O4S [M-H] Flunixin C14H11F3N2O [M-H] Meloxicam C14H13N3O4S [M-H] Tolfenamic acid C14H12ClNO [M-H] Phenylbutazone C19H20N2O [M+H] Oxyphenbutazone C19H20N2O [M-H] Diclofenac C14H11Cl2NO [M-H] Paracetamol C8H9NO [M+H] Ketoprofen C16H14O [M-H] a RT : retention time in minutes as determined in chromatograms of analyte standard solutions. b VL : validation level is the concentration spiked to samples (muscle, kidney and liver) in g/kg, validation was carried out 0.5, 1.0 and 2 times VL. c Mass : mass measurement error relative to the calculated exact mass of the analyte. d Accuracy : the recovery of the spiked analyte concentration expressed as a percentage. e Repeat : Repeatability expressed as the relative standard deviation in twenty analyses performed on 1 day. f Repro : Within-lab reproducibility expressed as the relative standard deviation in the three series of twenty analyses on 3 days performed by different analysts. g CCβ : detection capability calculated from the within-lab reproducibility at the validation level 1.0 times VL. h R2 : squared linear regression coefficient. 6 calibration points (0.5, 1.0, 2.0, 3.0 and 2.0 times VL including blank) was performed. 77

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87 Ⅴ 정밀정량검사법

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89 V. 정밀정량검사법 Ⅴ-1 잔류 동물용의약품 확인정량검사 매뉴얼 음성대조시료 1개, 회수율 점검용 첨가시료 3개시료 (기준설정물질의 경우 MRL 1.0, 불검출 기준의 경우 정량한계 1.0 ), 미지시료 (unknown sample) 2개 이상을 포함하여 최소 6개의 점검시료를 제공하여 분석결과를 보고하 여야 한다. 1. 표준용액, 시험용액 및 첨가시료의 조제 1) 표준용액 (1) 표준원액 (Stock solution) : 100 ml 용량플라스크에 사용할 용매를 소량 넣은 후 표준품 10 mg (역가 100 %)를 정확히 달아 용량플라스크에 넣은 후 표시선까지 용매를 채우고 잘 혼합한다 (100 μg ml -1 ). 표준품의 형태가 분석대상물질과 함께 염 (salt)의 형태로 되어 있거나, 다른 물질과 화학적으로 결합되어 있는 경우, 분석 대상물질만의 양으로 환산하여 조제한다. 예 시 제조 회사 제품 번호 Lot 번호 분자식 분자량 CAS number Apramycin sulfate Sigma A H2502 순도 (%) 표준품 (mg) 용매 (ml) C 21 H 41 N 5 O 11 H 2 SO 원물질 분자식 원물질 분자량 CAS number C 21 H 41 N 5 O 제조 회사 제품 번호 Lot 번호 분자식 분자량 CAS number Spectinomycin hydrochloride USP G0C310 순도 (%) 표준품 (mg) 용매 (ml) C 14 H 24 N 2 O 7 2HCl 5H 2 O 원물질 분자식 원물질 분자량 CAS number C 14 H 24 N 2 O

90 Apramycin sulfate 100 μg ml -1 농도의 표준원액 조제 = 10 mg (시약 분자량/원물질 분자량) (100 %/순도) = 10 (637.66/539.28) (100/95) = 12.4 mg/100 ml Spectinomycin hydrochloride 100 μg ml -1 농도의 표준원액 조제 = 10 mg (100 %/순도) = 10 (100/65) = 15.4 mg/100 ml 일부 표준품의 경우에는 분자량 등을 보정한 값을 순도로 표기함. 이런 제품의 경우, 순도 보정만으로 역가를 환산하면 됨. (2) 표준용액 (Working solution) : 가능한 표준원액 (stock solution)과 동일한 용매로 희석하여 조제한다. 혼합 표준용액의 경우, 각 물질별 표준원액 (stock solution)에 희석배율을 적용한 후 혼합하여 표준용액으로 사용한다. 예 시 항원충제 혼합 표준용액 조제 각 물질별 잔류허용기준을 기준으로 하여validation level (VL)을 정하고, 표준원액 (stock solution)을 증류수를 이용하여 각 물질별로VL의 10배가 되도록 혼합하여 표준용액 조제(VL 10 ) Compounds MRL (ng g -1 ) VL (ng g -1 ) Stock (ng g -1 ) Stock Volume (ml) 1st Working (ng g -1 ) Amprolium Clopidol Decoquinate Diaveridine Diclazuril Dicyclanil Ethopabate m-phenetidine Halofuginone Imidocarb Nicarbazin Robenidine Roxarsone Totrazuril Toltrazuril sulfone Toltrazuril sulfoxide Zoalene Water 91.8 VL

91 2) 회수율 시험 (Recovery) 균질화한 음성대조시료에 희석 표준용액을 음성대조시료 부피 (volume)의 0.1~0.2 %가 되게 첨가하며, 기준설정물질의 경우 MRL 1.0, 불검출 기준의 경우 LOQ 1.0 농도로 첨가시료 (spike sample)을 조제하여 매 실험 마다 3개 이상 시험한다. 회수율에 의한 정확도 (accuracy) 및 정밀도 (precision) 권장기준은 <별표 1>과 같다. <별표 1> Accuracy as Determined by Recovery & Precision Performance Factors Concentration Acceptable Recovery Range CV (Within Laboratory Repeatability) 1 μg/kg % 35 % 1 μg/kg, 10 μg/kg % 30 % 10 μg/kg, 100 μg/kg % 20 % 100 μg/kg % 15 % 1) 정확도는 평균 분석농도를 설정농도로 나눈 값에 100을 곱하여 산출한다. 정확도 = (평균분석농도/설정농도) 100 2) 정밀도는 변이계수 (Coefficient of variation, CV)를 구하여 산출한다. 변이계수는 표준편차를 평균분석농도로 나눈 값에 100을 곱하여 산출한다. 변이계수 (Coefficient of variation, CV) = (표준편차/평균분석농도) 검량선 작성 검량선은 표준용액을 이용하거나, 분석대상 시료와 동일 또는 유사한 매질의 음성시료 추출 정제액에 표준용액을 첨가하여 (matrix matched) 작성한다. 가능한 분석하고자 하는 농도가 검량선의 중심에 오게 하며, 기기의 측정값 (peak height/peak area)이 등간격이 되도록 5~6단계로 한다. 이때 표준용액 조제 시 사용한 용매를 reagent blank로, 음성시료 추출 정제 액을 matrix blank로 하여 포함시키되, 그 값을 검량선에 포함시키지 않는다 (즉, y=ax+b가 되게 한다). 가능한 최저검량농도 (lowest calibrated level)는 잔류허용기준의 1/2 이하로 한다. 조직표준곡선 (Matrix matched calibration curve 또는 tissue standard calibration curve)은 분석물질의 정량시 매질 효과 (matrix effect)에 의한 방해요소로부터, 분석대상화합물의 선택성을 확보하기 위하여, 음성대조시료를 시험법에 따라 추출 정제 후 분석물질을 첨가하여 분석한 후 작성하는 검량선을 말하며, 국제식품규격위원회에서는 r2 0.98를 권장한다

92 예 시 매질 효과 (matrix effect) 1 상승효과 (enhancement) : Closantel in pig liver Area Height Spike Area Recovery (%) Reagent STD Matrix matched STD Ratio (%) 억제효과 (inhibition) : Thiabendazole in pig liver Area Height Spike Area Recovery (%) Reagent STD Matrix matched STD Ratio (%) 예 시 항원충제 혼합 표준용액 제조 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 VL 10 표준용액을 각각 0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 의 농도로 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여X축을 농도 (μg, ng), Y축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다. 3. 검출한계 (LOD) 및 정량한계 (LOQ) 검출한계 (LOD) 란 어느 주어진 시험법으로 시료에 대한 잔류분석 전 과정을 실시한 후 분석대상물질의 유무를 확인할 수 있는 최소 검출농도를 말한다. 즉, 한 시료에서 반드시 정량성이 있는 것은 아니지만 검출해낼 수 있는 분석물질의 최소농도를 의미한다. 해당 품목의 표준곡선 y-절편에 표준곡선의 선형회귀분석으로부터 얻은 표준편차의 3배를 더하여 산출 하거나 이와 동등한 수준의 합리적인 신뢰도를 갖는 방법으로 산출한다

93 정량한계 (LOQ) 란 어느 주어진 시험법으로 시료에 대한 잔류분석 전 과정을 실시한 후 분석대상물질을 합리적인 신뢰성을 가지고 정량할 수 있는 최소 검출농도를 말한다. 즉, 한 시료에서 수용할 수 있는 정밀도를 가지고 정량적 측정결과를 산출해낼 수 있는 최소농도를 의미한다. 해당 품목의 표준곡선y-절편에 표준곡선의 선형회귀분석으로부터 얻은 표준편차의 10배를 더하여 산출하거나 이와 동등한 수준의 합리적인 신뢰도를 갖는 방법으로 산출한다. 예 시> Sulfamethazine 조직표준곡선에서의 검출한계 및 정량한계 산출 : 음성대조시료 (blank sample)를 포함하여 VL (10 ng g -1 )의 농도의 0.25, 0.5, 1, 2, 5 총 6단계로 조직표준곡선 작성 1 6단계 농도로 한번만 주입하여 조직표준곡선 작성시 A (Conc.) B (Area) 기울기 (slope) = SLOPE (B1:B6,A1:A6) y절편 (Intercept) = INTERCEPT (B1:B6,A1:A6) 표준오차 = STEYX (B1:B6,A1:A6) LOD 0.52 = 3 y값의 표준오차/기울기 LOQ 1.73 = 3.3 LOD 2 6단계 농도로 세번씩 주입하여 조직표준곡선 작성시 A (Conc.) B (1st Inj.) C (2nd Inj.) D (3rd Inj.) 기울기평균 = AVERAGE (B7:D7) y절편 표준편차 = STDEV (B8:D8) LOD =3.3 y절편 표준편차/기울기 평균 7 기울기 LOQ y절편 =10 y절편 표준편차/기울기 평균

94 검출한계 (LOD) 및 정량한계 (LOQ) 외에 기기상의 검출한계 (IDL) 및 분석법의 정량한계 (PQL 혹은 RL) 으로 검출한계를 정의하기도 한다. 기기상의 검출한계 (Instrumental detection limit, IDL) 는 검량선 작성시 분석기기 상의 최저 검출량 (amount)으로 ng, pg 등의 절대량으로 표현한다. 예 시> 표준용액 1 μg/ml 농도 1 μl를 기기에 주입하여 얻은 값의 신호/잡음비 (signal to noise ratio, S/N ratio)가 2.5~5 이며, 이 값을 최저 검출량으로 하고자 할 경우 기기상의 검출한계는 1 ng 임. 분석법의 정량한계 (Practical quantitation limit, PQL 혹은 Reporting limit, RL) 는 실제 분석 전체과정을 통해 정량 가능한 최저 농도로 다음의 식으로 구할 수 있다. 기기상의 검출한계 (ng) 기기 주입 전 최종 부피 (ml) 1 = μg/g 기기 내 주입량 (μl) 시료 중량 (g) 4. 분석물질의 최종확인 질량분석시 분석물질의 최종확인을 위해서는 최소 2개의 MS/MS transition product ion이 있어야 하고 <별표 2>, 머무름 시간 (retention time, tr) (Relative Retention Time, RRT의 허용범위는 GC의 경우 2 % LC의 경우 5 %) 및 시료 내 상대이온강도 (relative ion intensity)가 허용범위 <별표 3> 내에서 표준용액 및 첨가시료 (spike sample)에서의 분석물질 양상과 일치하여야 한다. <별표 2> Relationship between nature of MS information and IPs earned MS technique Number of ions IPs LC-MS N n LC-MS/MS 1 precursor, 2 products 4 GC-MS/MS 1 precursor, 2 products 4 LC-MS/MS 2 precursor, each with 1 product 5 GC-MS/MS 2 precursor, each with 1 product 5 잔류허용기준이 설정된 물질의 경우 획득점수 (identification points, IPs)가 3이상이어야 하고, 불검출 물질의 경우 4이상이어야 한다

95 <별표 3> Maximum permitted tolerance for various relative ion intensities Relative intensity 1 EI-GC-MS 2 LC-MS, LC-MS n, CI-GC-MS 2 > 50 % ± 10 % ± 20 % > 20 %, 50 % ± 15 % ± 25 % > 10 %, 20 % ± 20 % ± 30 % 10 % ± 50 % ± 50 % 1 Relative intensity (in % of base peak) 2 Tolerance relative to relative intensity (in % of peak intensity) 예시> 시료내 항원충제 약물의 최종확인 결과, - Clopidol의 경우 1개의 precursor ion 과 2개의 product ion이 있어 특이이온 획득점수가4로써 기준치 (잔류허용기준이 설정된 물질의 경우 3)를 만족하고 있으며, 분석 물질을 세 번 실험한 결과 머무름 시간 및 상대이온강도가 허용범위 내에서 표준용액 및 첨가시료에서의 분석물질 양상과 일치하였다. - Diclazuril의 경우 2개의 precursor ion 과 precursor ion별로 각 2개의 product ion이 있어 특이이온 획득점수가 5로써 기준치 (잔류허용기준이 설정된 물질의 경우3)를 만족 하고 있으며, 분석물질을 세 번 실험한 결과 머무름 시간 및 상대이온강도가 허용범위 내에서 표준용액 및 첨가시료에서의 분석물질 양상과 일치하였다. 물질별 특이이온의 획득점수 Compound Precursor Ion (m/z) Product Ion (m/z) 특이이온 획득점수 Clopidol Diclazuril

96 물질별 시료내 머무름시간 비교 Compound STD Spiked muscle Sample 1 st Sample 2 nd Sample 3 rd CAC Criteria Clopidol ±2.5% (0.658~0.692) Diclazuril ±2.5% (2.179~2.291) 물질별 시료내 상대이온강도 비교 Compound STD Spiked muscle Sample 1 st Sample 2 nd Sample 3 rd CAC Criteria Amprolium ±25% (22~36) Clopidol ±20% (76~114) Diclazuril ±30% (10~18) Toltrazuril sulfone ±50% (0.5~2)

97 Ⅴ-2 페니실린계 항균물질 분석법 Penicillin은 β-lactam 고리와 thiazolidone 고리가 짝을 이루어 기본구조인 penam 핵을 이루고 있으며, 이 핵을 근간으로 하여 penicillinase에 의해 파괴되지 않는 penicillin, 천연 페니실린보다 항균범위가 넓은 penicillin, 위산에 의하여 파괴되지 않거나 위장에서 잘 흡수되는 penicillin 등 많은 종류의 반합성 penicillin이 개발된 이후 질병의 치료와 예방 목적으로 널리 사용되고 있다. 페니실린계 항균물질의 직접적인 독성은 동물과 사람에서 알레르기 반응을 유발하는 것이다. 현재 페니실린계 항균물질은 비교적 널리 사용되고 있고 식품에 잔류할 때는 사람에 알레르기 반응 등 인체에 유해하게 작용할 수 있기 때문에 세계적으로 엄격히 규제하고 있다. 우리나라 에서도 축산물에서의 페니실린계열의 잔류허용기준은 amoxicillin이 쇠고기에서 10 ng/g, ampicillin은 쇠고기와 돼지고기에서10 ng/g, benzilpenicillin (Penicillin G)은 쇠고기, 돼지고기, 닭고기에서 각각 50 ng/g, 유에서 4 ng/ml로 설정하고 있다. Amoxicillin과 ampicillin에 대해서는 각 품목별 기준을 세분화하고, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin, nafcillin 등에 대해서는 잔류허용기준 설정을 추진 중에 있다. 1. 원리 균질화한 시료를 증류수와 메탄올로 추출한 후 원심분리하여 얻어진 상층액을 여과한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프-질량분석기 LC-MS/MS (Triple-quadrupole mass spectrometer) 3. 표준품, 시약 및 기구 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : Ampicillin, Amoxicillin, Penicillin G, Penicillin V, Oxacillin, Nafcillin, Cloxacillin, Dicloxacillin 등 8종 물질 2) Acetonitrile : HPLC grade 3) Methanol : HPLC grade 4) Formic acid : HPLC grade 5) 증류수 : 18 MΩㆍcm 2 이상

98 나. 기 구 1) 50 ml centrifuge tube 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, 1000 μl 4) 마이크로필터 : 0.22 μm filter 5) 원심분리기 6) 정밀저울 (Chemical balance) ± g 정밀도 7) 일반저울 : ± 0.1g 정밀도 8) Vortex mixer 9) multi-mixer (TAITEC vial mixer, vix-100) 10) Ultrasonic bath (Branson 8510) 4. 시험용액 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 페니실린계 항균물질의 표준품을 각각 10 mg씩 칭량하여 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol 50 ml로 용해한 후 증류수로 표시선까지 채워 4 냉장 보관한다 (100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution) : Stock solution을 증류수로 100배 희석하여 사용한다 (1 μg ml -1 ). 나. 시험용액 1) 0.05 % formic acid in water (0.05 % FA in water) 증류수 1000 ml에 formic acid 0.5 ml을 넣고 혼합하여 0.2 μm PVDF 필터로 여과하여 사용한다 (이동상용액 A). 2) 0.05 % formic acid in acetonitrile (0.05 % FA in MeCN) Acetonitrile 1000 ml에 formic acid 0.5 ml을 넣고 혼합하여 0.2 μm PTFF 필터로 여과하여 사용한다 (이동상용액 B). 3) 0.1 M phosphate buffer (ph 4.5) : Sodium dihydrogen phosphate, anhydrous 6 g을 물에 녹여 500 ml까지 물로 희석한다. 5 M NaOH로 ph를 4.5로 맞춘다. 4) 0.17 M sulphuric acid Sulphuric acid (36 N) 1.67 g에 증류수 100 ml를 첨가한다

99 5) 5 % sodoium tungstate (5 % Na 2 O 4 W) 5 g Na 2 O 4 W를 증류수 100 ml로 녹인다. 6) 25 mm PBS (ph 9.0) 0.34 g KH 2 PO 4 를 증류수 100 ml로 녹인 후 NaOH로 ph를 조절한다. 다. Spike sample 조제 균질화한 시료 2g에 1 μg ml -1 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.05 μg/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 5. 검사방법 가. 시료전처리 주의 : 다음의 전 과정과 표준용액을 만들때는 직사광선이나 인공 조명에 직접 노출되지 않도록 한다. 인공적인 노란색 불빛이 권장된다. Penicillin 검사를 위한 모든 시료는 냉동고와 어두운 곳에 보관해야 한다. 1) 시료의 추출 (1) 근육시료 (2±0.1) g을 칭량하여 50 ml polypropylene centrifuge tube에 넣는다. (2) 0.1 M sodium phosphate buffer (ph 4.5) 10 ml를 넣어 균질화한 후 여기에 2.5 ml 0.17 M sulpuric acid, 2.5 ml 5 % sodium tungstate를 넣고 잘 혼합하고 r/min에서 15분간 원심분리한다. (3) 상층액을 다른 튜브로 옮긴 다음5 M NaOH로 ph 8.1~8.5로 조정한 후 r/min에서 15분간 원심분리하여 상층액만 새 튜브에 모은다. ph 10 이상이면 ampicillin의 회수율이 낮아짐 (4) 모아진 상층액에 20 % NaCl 10 ml를 넣어 잘 흔든다. 2) HLB SPE cartridge clean-up (1) HLB SPE (6 ml, 200 mg) cartridge를 vaccum manifold에 장착한다. 5 ml methanol, 5 ml water, 5 ml 2 % NaCl 순으로 흘려준다. (2) 시료추출물을 카트리지를 통과시킨 후 5 ml 2 % NaCl, 5 ml 25 mm PBS (ph 9.0) 순으로 세척하고 5분 정도 말린다. (3) Acetonitrile 3 ml x 2로 용출시키고 40 에서 건조시킨다. (4) 1 ml 25 mm PBS (ph 9.0) 를 가하여 녹이고0.2 μm PVDF 필터로 여과한 후LC-MS/MS로 분석한다

100 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 (1) 칼럼 : XBridge C 18 ( mm, 3.5 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 : 0.05 % FA in water (A) / 0.05 % FA in MeCN (B) gradient - Gradient 조건 Time (min) A (%) B (%) Flow rate (ml) (3) 칼럼온도 : 실온 (4) 주입량 : 10 μl 2) 질량분석기 조건 (1) Ionization : ESI (positive) (2) Capillary (kv) : 3.00, Extractor (V) : 0.3 (3) Temperature : Source Temp 150, Desolvation Temp : 350 (4) Gas flow : Desolvation 650 L/hr, Cone 50 L/hr (5) Auxiliary Gas : 질소 Collision Gas : 아르곤 물질명 Precursor ion (m/z) Amoxicillin Ampicillin Penicillin G Penicillin V Oxacillin Cloxacillin Nafcillin Dicloxacillin Product ion (m/z) Dwell time (s) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev) Retention window (min) 0~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~

101 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 25, 50, 100, 200, 400 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다. 6. 시험결과 분석 표준용액 10 μl를 위의 분석 조건에 따라LC-MS/MS로 분석하여 각 분석물질별 특이이온을 확인한다. 시료용액 분석에서 얻은 크로마토그램에서 페니실린계 항균물질의 각 물질에 대하여 주요 이온이 일치되는 대사물질 피크에 대한 평균면적을 구한 다음 표준곡선 좌표의Y 축에 동일한 값을 표시하고 이 값과 표준곡선상 만나는 점에서 수직으로 X 축과 만나는 점이 시료용액의 농도를 나타낸다. 이 농도에 시료용액의 희석배수(건조물에 가한 이동상의 부피)를 곱하고 시료 무게로 나누어 최종 시료 중 각 대사물질의 농도를 산출한다. Fig 1. MRM traces obtained from standards of 8 penicillins

102 Ⅴ-3 세팔로스포린계 항균물질 분석법 세팔로스포린계 항균물질은 Cephalosporium acremonium이라는 곰팡이에서 산출된 항생 물질로 세균의 transpeptidase를 불활성화시켜서 세포벽의 합성을 방지하여 살균작용을 일으켜 항균력이 강하며 스펙트럼이 넓으며 체내 조직 침투가 우수하여 penicillin 대체제로 많이 사용되고 있다. 세팔로스포린계 약물은 거의 대부분 신장을 통해서 배설되고 소량은 담즙을 통해서 배설 되며, 단백질과의 결합은 혈장에서 72~74 %, 우유에서 60~75 % 정도로 단백질 결합 범위가 상당히 넓지만 친화력 상수는 비교적 낮아 농도 기울기의 영향에 의해 단백질로부터 빨리 유리되는 편이다. Cefoperazone과 cefpiramide는 주로 담즙을 통하여 배설되며, ceftriaxone은 절반은 신장으로 절반은 담즙을 통하여 배설된다. Ceftiofur의 대사산물은 desfuroylceftiofur로 대사물질이 주요약리독성을 나타내며, cephalothin, cephapirin 및 cefotaxime은 생체에서 deacetylation되어 대사되나, 나머지 약물은 대사되지 않고 배설된다. 특히나, cephapirin을 근육 주사 후 거의 완전하게 신장을 통해 제거되며 주요 대사산물은 deacetylcephapirin이며, 이들 물질은 LC-MS/MS 방법으로 검출이 가능하다. 현재 축산물에서의 세팔로스포린계 항균물질의 잔류허용기준은 ceftiofur만이 소와 돼지 근육에서 1 μg/g, 간장 2 μg/g, 신장 6 μg/g, 그리고 우유에서 0.1 μg ml -1 로 설정되어 있으며, cefacetrile, cefalonium, cefalexin, cefazolin, cefoperazone, cefquinome, cefuroxime, cephapirin 등에 대해서는 잔류허용기준 설정을 추진 중에 있다. 1. 원리 균질화한 시료를 증류수와 메탄올로 추출한 후 원심분리하여 얻어진 상층액을 여과한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프-질량분석기 LC-MS/MS (Triple-quadrupole mass spectrometer) 3. 표준품, 시약 및 기구 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : Cefadroxil, Cephapirin, Cefazolin, Cefuroxime, Ceftiofur, Cefquinome, Cefoperazone, Cephalothin, Cephalexin, Ceftriaxone, Cephaloridine, Cephalonium, Cephacetrile 등

103 2) Acetonitrile : HPLC grade 3) Methanol : HPLC grade 4) Formic acid : HPLC grade 5) 증류수 : 18 MΩㆍcm 2 이상 나. 기 구 1) 50 ml centrifuge tube 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, 1000 μl 4) 마이크로필터 : 0.22 μm filter 5) 원심분리기 6) 정밀저울 (Chemical balance) ± g 정밀도 7) 일반저울 : ± 0.1g 정밀도 8) Vortex mixer 9) multi-mixer (TAITEC vial mixer, vix-100) 10) Ultrasonic bath (Branson 8510) 4. 시험용액 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 세팔로스포린계 항균물질의 표준품을 각각 10 mg씩 칭량하여 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol 50 ml로 용해한 후 증류수로 표시선까지 채워 4 냉장 보관한다 (100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution) (1) 1 단계 working solution : Stock solution을 증류수로 100배 희석하여 사용한다(1 μg ml -1 ). (2) 2 단계 working solution : 1단계 woriking solution을 증류수로 10배 희석하여 사용한다 (100 ng/ml). 나. 시험용액 1) 0.05 % formic acid in water (0.05 % FA in water) : 증류수 1000 ml에 formic acid 0.5 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 2) 0.05 % formic acid in acetonitrile (0.05 % FA in MeCN) : Acetonitrile 1000 ml에 formic acid 0.5 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다

104 다. Spike sample 조제 균질화한 시료 1g에 1 μg ml -1 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.1 μg/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 균질화 된 시료 1 g에 증류수 1 ml를 넣고 multi-mixer로 5분간 진탕 혼합한다. 2) Methanol 2 ml를 50 ml centrifuge tube에 넣고 multi-mixer로 15분간 진탕 혼합한다. 3) -4, r/min에서 15분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 4) 얻어진 상층액은 0.2 μm filter로 두 번 여과한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 (1) 칼럼 : XBridge C 18 ( mm, 3.5 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 : 0.05 % FA in water (A) / 0.05 % FA in MeCN (B) gradient - Gradient 조건 Time (min) A (%) B (%) Flow rate (ml) (3) 칼럼온도 : 실온 (4) 주입량 : 10 μl 2) 질량분석기 조건 가) Ionization : ESI (positive) 나) Capillary (kv) : 3.00, Extractor (V) : 0.3 다) Temperature : Source Temp 120, Desolvation Temp : 350 라) Gas flow : Desolvation 650 L/hr, Cone 50 L/hr 마) Auxiliary Gas : 질소 Collision Gas : 아르곤

105 물질명 Precursor ion (m/z) Cefadroxil Cephapirin Cefquinome Cephalexin Cephalonium Cephaloridine Ceftriaxone Cephacetrile Cefazolin Cefuroxime Cefoperazone Ceftiofur Cephalothin Product ion (m/z) Dwell time (s) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev) Retention window (min) 0~5 4.5~ ~ ~ ~ ~16.0 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 25, 50, 100, 200, 400 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균 면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다

106 6. 시험결과 분석 표준용액 10 μl를 위의 분석 조건에 따라LC-MS/MS로 분석하여 각 분석물질별 특이이온을 확인한다. 시료용액 분석에서 얻은 크로마토그램에서 세팔로스포린계 항균물질의 각 물질에 대하여 주요 이온이 일치되는 대사물질 피크에 대한 평균면적을 구한 다음 표준곡선 좌표의 Y 축에 동일한 값을 표시하고 이 값과 표준곡선상 만나는 점에서 수직으로 X 축과 만나는 점이 시료용액의 농도를 나타낸다. 이 농도에 시료용액의 희석배수 (건조물에 가한 이동상의 부피)를 곱하고 시료 무게로 나누어 최종 시료 중 각 대사물질의 농도를 산출한다. Fig 1. LC-MS/MS chromatograms of 13 cephalosporins standards

107 Ⅴ-4 테트라싸이클린계 동시 분석법 테트라싸이클린계 항균물질은 광범위 항생제로 그람양성균과 그람음성균 뿐만 아니라 Mycoplasma에도 작용하여 동물의 질병치료와 예방 목적으로 널리 사용되고 있다. 대표적인 약물로는 oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline, doxycycline 등이 있으며, 주사제, 사료 첨가제 등의 형태로 많이 사용되어 축산물에서 잔류가 빈발하고 있다. 테트라싸이클린계 약물은 생체내에서 혈장단백질과 가역적으로 결합하여 넓게 분포하며, 혈액을 통해 간으로 가서 대사되는데 특히 담즙 농도는 혈액내 농도의 약 30배가 된다. 또한, 총 투여량의 25~30 %가 신장을 통해 뇨로 배설되고 분변으로는 투여경로와 관계없이 경구 투여량의 약 10 % 정도가 검출된다. 우리나라의 잔류허용기준은 oxytetracycline /tetracycline/chlortetracycline의 합으로 소, 돼지, 닭, 칠면조, 양, 염소, 사슴, 토끼 근육에서 각각 0.2 μg/g, 간장 0.6 μg/g, 신장 1.2 μg/g, 유 0.1 μg ml -1, 알 0.4 μg/g으로 설정되어 있으며, doxycycline은 소, 돼지, 양, 염소, 가금 근육, 간장, 신장에서 각각 0.1 μg/g, 0.3 μg/g, 0.6 μg/g으로 설정되었으며, 유와 알은 불검출로 설정되어 있다. 1. 원리 균질화한 시료를 EDTA와 oxalic acid를 첨가한 extraction buffer (acetonitrile+ethyl acetate = 2+1, v/v)로 추출하고 원심분리하여 얻어진 상층액을 농축한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프-질량분석기 LC-MS/MS (Triple-quadrupole mass spectrometer) 3. 표준품, 시약 및 기구 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : Oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline, doxycyline, minocycline, dimeclocycline (내부표준물질로 사용) 등 6종 물질 2) Acetonitrile : HPLC grade 3) Methanol : HPLC grade 4) Formic acid : HPLC grade 5) 증류수 : 18 MΩㆍcm 2 이상

108 나. 기 구 1) 50 ml centrifuge tube 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, 1000 μl 4) 마이크로필터 : 0.22 μm filter 5) 원심분리기 6) 정밀저울 (Chemical balance) ± g 정밀도 7) 일반저울 : ± 0.1g 정밀도 8) Vortex mixer 9) multi-mixer (TAITEC vial mixer, vix-100) 10) Ultrasonic bath (Branson 8510) 4. 시험용액 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 테트라사이클린계 항균물질의 표준품을 각각 10 mg씩 칭량하여 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol 50 ml로 용해한 후 증류수로 표시선까지 채워 4 냉장 보관한다 (100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution) (1) 1 단계 (working solution) : Stock solution을 증류수로100배 희석하여 사용한다(1 μg ml -1 ). (2) 2 단계 (working solution) : 1단계 woriking solution을 증류수로 10배 희석하여 사용한다 (100 ng/ml). 나. 시험용액 1) 0.3 % formic acid in water (0.3 % FA in water) 증류수 997 ml에 formic acid 3 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 2) 0.3 % formic acid in acetonitrile (0.3 % FA in MeCN) Acetonitrile 997 ml에 formic acid 3 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 다. Spike sample 조제 균질화한 시료 1g에 1 μg ml -1 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.1 μg/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다

109 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 시료 1.0 g을 칭량하여 50 ml 원심튜브에 취한 후 oxalic acid와 EDTA를 각각 0.1 g을 가하고 약 10분간 multi-mixer로 진탕 혼합한다. 2) 추출액인 acetonitrile:ethyl acetate (2:1, v/v) 혼합액을 5 ml 넣고 multi-mixer로 15분간 진탕 혼합하고, r/min에서 15분간 원심분리한 후 상층액만 뚜껑이 있는 15 ml 원심튜브에 취한다. 3) 남은 잔사에 추출액 acetonitrile:ethyl acetate (2:1, v/v) 혼합액 5 ml을 넣고 15분간 multi-mixer로 재혼합한 후 원심분리하여 상층액을 합한다. 4) 합해진 상층액을 r/min에서 15분간 원심한 후 유리시험관에 상층액만 취하여 40, 질소하 농축건조시킨다. 이들 계열 약물은 온도에 민감하므로 건조 온도를 가능한 한 40 이하로 하는 것이 좋다. 5) 0.3 % FA buffer 1 ml을 가한 뒤 초음파 세척기에서10분간 방치하여 완전히 용해시킨 후 4 에서 원심분리 ( r/min, 10 min)하여 상층액을 0.20 μm filter로 여과하여 LC-MS/MS로 분석한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 (1) 칼럼 : XBridge C 18 ( mm, 3.5 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 : 0.1 % FA in water (A) / 0.1 % FA in MeCN (B) gradient - Gradient 조건 Time (min) A (%) B (%) Flow rate (ml) (3) 칼럼온도 : 실온 (4) 주입량 : 10 μl

110 2) 질량분석기 조건 가) Ionization : ESI (positive) 나) Capillary (kv) : 3.00, Extractor (V) : 0.3 다) Temperature : Source Temp 150, Desolvation Temp : 350 라) Gas flow : Desolvation 650 L/hr, Cone 50 L/hr 마) Auxiliary Gas : 질소 Collision Gas : 아르곤 물질명 Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Dwell time (s) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev) Retention window (min) Minocycline Oxytetracycline Tetracycline Dimeclocycline ~ ~ ~ ~11.7 Chlortetracycli ne ~14.0 Doxycycline ~15.0 * 밑줄 친 이온이 정량이온임 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 25, 50, 100, 200, 400 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다

111 6. 시험결과 분석 표준용액 10 μl를 위의 분석 조건에 따라LC-MS/MS로 분석하여 각 분석물질별 특이이온을 확인한다. 시료용액 분석에서 얻은 크로마토그램에서 테트라사이클린계 항균물질의 각 물질에 대하여 주요 이온이 일치되는 대사물질 피크에 대한 평균면적을 구한 다음 표준곡선 좌표의 Y 축에 동일한 값을 표시하고 이 값과 표준곡선상 만나는 점에서 수직으로 X 축과 만나는 점이 시료용액의 농도를 나타낸다. 이 농도에 시료용액의 희석배수 (건조물에 가한 이동상의 부피)를 곱하고 시료 무게로 나누어 최종 시료 중 각 대사물질의 농도를 산출한다. Fig. 1. LC-MS/MS chromatograms of tetracyclines spiked at 20 ng/ml and milk blank samples

112 Ⅴ-5 마크로라이드계 항균물질 분석법 마크로라이드계 (macrolides) 항생제는 인의 및 수의 임상에서 광범위하게 사용되는 매우 중요한 항생제군 중의 하나이다. 이 항생제군은 중간정도의 항균범위를 나타내는데, Mycoplasma, Chlamydia, 그람양성 세균에는 광범위한 활성을 나타내나 대부분의 그람음성 세균에는 항균 능이 떨어진다. 이들 약물의 작용기전을 살펴보면 세균ribosome의 50 S subunit에 결합 함으로써 세포질내 단백질 합성을 억제하며, 포유동물 세포의 80 S subunit에는 결합하지 않으므로 세균에만 선택적으로 독작용을 일으킨다. 이 약물들은 경구투여 후에 매우 잘 흡수되어 높은 조직/혈장 농도비로 조직 중에 광범위하게 분포되는데 특히 폐, 간 및 신장에서 그러하다. 배설은 주로 담즙을 통하여 이루어지며 담즙내 농도가 혈액 농도의 약 10배나 되며, 뇨로는 투여 용량의 약 2~5 %만이 배설된다. 이들 약물은 독성이 미약하여 광범위한 세균성 감염증의 치료에 사용되며, 우리나라의 경우 가축에는 tylosin, erythromycin, kitasamycin, spiramycin, josamycin, sedecamycin, oleandomycin, tilmicosin, roxitrhomycin, tulathromycin 등이 사용되고 있다. 우리나라에서는 마크로라이드계 항균물질의 잔류허용기준을 정하여 그 사용을규제하고 있는데 현재 마크로라이계 항균물질 중에서는 spiramycin, erythromycin, oleandomycin, tylosin, tilmicosin 등이 이에 속한다. Spiramycin은 소, 돼지, 닭고기, 유에서 0.2 μg/g으로 설정되어 있고, erythromycin은 소와 돼지고기에서는 0.05 μg/g, 가금류에서는 0.1 μg/g, oleandomycin은 돼지, 닭, 칠면조고기에서 0.15 μg/g으로 설정되어 있으며, tylosin은 소, 돼지, 가금류에서 0.1 μg/g, tilmicosin은 소, 돼지, 양고기에서 0.1 μg/g으로 설정되어 있으며, kitasamycin, josamycin, sedecamycin, roxithrmycin, tulathromycin에 대해서는 잔류허용기준 설정을 추진 중에 있다. 축산물중에 잔류하는 마크로라이드계 항생제의 검사는 주로 미생물학적 검사로 수행되는데 이러한 방법은 물질별 확인정량을 할 수 없으므로HPLC, LC-MS/MS와 같은 정밀기기를 이용한 확인정량법이 필요하며, 특히나 이들물질의 UV 흡광도는 물질마다 다르기 때문에 LC-MS/ MS를 이용하여 동시분석하는 것이 가장 권장되는 사항이다. 1. 원리 균질화한 시료를 증류수와 메탄올로 추출한 후 원심분리하여 얻어진 상층액을 여과한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프-질량분석기 LC-MS/MS (Triple-quadrupole mass spectrometer)

113 3. 표준품, 시약 및 기구 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : Tylosin, Tilmicosin, Spiramycin, Oleandomycin, Erythromycin, Josamycin, Kitasamycin, Tulathromycin, Roxithromycin 등 2) Acetonitrile : HPLC grade 3) Methanol : HPLC grade 4) Formic acid : HPLC grade 5) 증류수 : 18 MΩㆍcm 2 이상 나. 기 구 1) 50 ml centrifuge tube 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, 1000 μl 4) 마이크로필터 : 0.2 μm filter 5) 원심분리기 6) 정밀저울 (Chemical balance) ± g 정밀도 7) 일반저울 : ± 0.1g 정밀도 8) Vortex mixer 9) multi-mixer (TAITEC vial mixer, vix-100) 10) Ultrasonic bath (Branson 8510) 4. 시험용액 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 마크로라이드계 항균물질의 표준품을 각각10 mg씩 칭량하여 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol 50 ml로 용해한 후 증류수로 표시선까지 채워 4 냉장 보관한다 (100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution) (1) 1 단계 working solution : Stock solution을 증류수로 100배 희석하여 사용한다(1 μg ml -1 ). (2) 2 단계 working solution : 1단계 woriking solution을 증류수로 10배 희석하여 사용한다 (100 ng/ml)

114 나. 시험용액 1) 0.1 % formic acid in water (0.1 % FA in water) : 증류수 990 ml에 formic acid 10 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 2) 0.1 % formic acid in acetonitrile (0.1 % FA in MeCN) : Acetonitrile 990 ml에 formic acid 10 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 다. Spike sample 조제 균질화한 시료 1g에 1 μg ml -1 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.1 μg/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 균질화 된 시료 1 g에 증류수 1 ml를 넣고 multi-mixer로 5분간 진탕 혼합한다. 2) Methanol 2 ml를 50 ml centrifuge tube에 넣고 multi-mixer로 15분간 진탕 혼합한다. 3) -4, r/min에서 15분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 4) 얻어진 상층액은 0.22 μm filter로 두 번 여과한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 (1) 칼럼 : XBridge C 18 ( mm, 3.5 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 : 0.1 % FA in water (A) / 0.1 % FA in MeCN (B) gradient - Gradient 조건 Time (min) A (%) B (%) Flow rate (ml) (3) 칼럼온도 : 실온 (4) 주입량 : 10 μl

115 2) 질량분석기 조건 (1) Ionization : ESI (positive) (2) Capillary (kv) : 3.00, Extractor (V) : 0.3 (3) Temperature : Source Temp 120, Desolvation Temp : 350 (4) Gas flow : Desolvation 650 L/hr, Cone 50 L/hr (5) Auxiliary Gas : 질소 Collision Gas : 아르곤 물질명 Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Dwell time (s) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev) Retention window (min) Tulathromycin Spiramycin Tilmicosin Oleandomycin Erythromycin Tylosin Kitasamycin ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~11.0 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 25, 50, 100, 200, 400 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균 면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다

116 6. 시험결과 분석 표준용액 10 μl를 위의 분석 조건에 따라LC-MS/MS로 분석하여 각 분석물질별 특이이온을 확인한다. 시료용액 분석에서 얻은 크로마토그램에서 마크로라이드계 항균물질의 각 물질에 대하여 주요 이온이 일치되는 대사물질 피크에 대한 평균면적을 구한 다음 표준곡선 좌표의 Y 축에 동일한 값을 표시하고 이 값과 표준곡선상 만나는 점에서 수직으로 X 축과 만나는 점이 시료용액의 농도를 나타낸다. 이 농도에 시료용액의 희석배수 (건조물에 가한 이동상의 부피)를 곱하고 시료 무게로 나누어 최종 시료 중 각 대사물질의 농도를 산출한다. Fig. 1. LC-MS/MS chromatograms of 9 macrolide standards

117 Ⅴ-6 아미노글리코사이드계 분석법 아미노글리코사이드계 항균물질은 Streptomyces 및 Micromonospora 속균에 의하여 생산되며, 인의 및 수의임상에 널리 사용되는 광범위 항생제이다. 현재 가축에서 가장 흔하게 사용되는 아미노글리코사이드계 항균물질은 gentamicin, neomycin, dihydrostreptomycin, streptomycin 이며, 이외에도 hygromycin B와 유사계열의 spectinomycin도 사용되고 있다. 이들 아미노 글리코사이드계 항균물질에 대하여 CODEX, 미국, 유럽 등 세계 각국은 물론 우리나라에서도 식육, 유 및 식용란에서 잔류허용기준을 설정하고 있으며 근육, 신장, 간 또는 지방 등 부위별 이나 물질에 따라 각국별로 다소 차이는 있지만 0.1~7.2 μg/g 수준으로 설정하고 있다. 우리 나라는 neomycin에 대해 소, 돼지, 닭, 칠면조, 오리, 양, 염소고기와 유 및 알에서0.5 μg/g으로 설정하고 있다. 이외에, gentamicin은 소, 돼지, 닭고기에서 0.1 μg/g, dihydrostreptomycin / streptomycin은 그 합으로 소0.5 μg/g, 돼지, 닭, 양고기에서 0.6 μg/g, 유에서 0.2 μg/g, hygromycin B는 돼지와 닭고기에서는 불검출, spectinomycin은 소, 돼지, 닭, 양고기에서 0.5 μg/g, 유에서 0.2 μg/g, 알에서 2.0 μg/g으로 설정하고 있으며, apramycin은 소고기에서 0.5 μg/g, 돼지고기에서 0.1 μg/g, 가금류에서 0.2 μg/g으로 설정하고 있다. 현재 국내에서 사용되고 있는 amikacin, kanamycin, destomycin A에 대해서는 잔류허용기준 설정을 추진 중에 있다. 1. 원리 균질화한 시료를 추출액으로 추출한 후 HLB SPE clean-up으로 정제하여 얻어진 여과액을 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프-질량분석기 LC-MS/MS (Triple-quadrupole mass spectrometer) 3. 표준품, 시약 및 기구 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : Spectinomycin (SPC), gentamicin (GM), neomycin (nm), streptomycin (STR), dihydrostreptomycin (DHS), hygromycin B (HB), kanamycin (KM), apramycin (APM), destomycin A (DA), amikacin (AK), Paromomycin (PM), Tobramycin (TM; 내부표준물질) 등 12종 2) Acetonitrile : HPLC grade 3) Methanol : HPLC grade

118 4) Heptafluorobutyric acid (HFBA) : HPLC grade 5) KH 2 PO 4 : 시약 특급 6) Trichloroacetic acid (TCA) : 시약 특급 7) 증류수 : 18 MΩㆍcm 2 이상 나. 기 구 1) 50 ml centrifuge tube 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, 1000 μl 4) 마이크로필터 : 0.22 μm filter 5) 원심분리기 6) 정밀저울 (Chemical balance) ± g 정밀도 7) 일반저울 : ± 0.1g 정밀도 8) Vortex mixer 9) multi-mixer (TAITEC vial mixer, vix-100) 10) Ultrasonic bath (Branson 8510) 4. 시험용액 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 아미노글리코사이드계 항균물질의 표준품을 각각 10 mg씩 칭량하여 100 ml 용량플라스크에 취하고 증류수 50 ml로 용해한 후 증류수로 표시선까지 채워 4 냉장 보관한다 (100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution) (1) 1 단계 working solution : Stock solution을 증류수로 100배 희석하여 사용한다(1 μg ml -1 ). (2) 2 단계 working solution : 1단계 woriking solution을 증류수로 10배 희석하여 사용한다 (100 ng/ml). 나. 시험용액 1) 20 mm HFBA in water 2.6 ml HFBA를 증류수 1 L에 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 2) 20 mm HFBA in acetonitrile 2.6 ml HFBA를 acetonitrile 1 L에 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다

119 3) 100 mm HFBA이 포함된 acetonitrile과 methanol 혼합액 (2+1, v/v) 10 ml HFBA를 400 ml acetonitrile과 200 ml methanol이 혼합된 용액에 넣어 사용한다. 4) 0.4 mm EDTA과 2 % TCA를 함유한 10 mm KH 2 PO 4 buffer KH 2 PO g을 증류수 1 L로 용해한 후 1 N HCl로 ph 4.0으로 조절한다. 여기에 0.15 g EDTA와 20 g TCA을 넣어 용해하여 시료추출액으로 사용한다. 약 2개월간 안정하다. 다. Spike sample 조제 균질화한 시료 2g에 1 μg ml -1 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.05 μg/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 식육 (1) 2 g 시료를 준비한 후 필요한 만큼 spike한다. (2) 10 ml extraction buffer (10 mm KH 2 PO 4, 0.4 mm EDTA, 2 % TCA 포함)를 넣고 10분간 혼합한다. (3) r/min, 10분간 원심분리한 후 상층액을 새로운 튜브에 모은다. 2번 반복한다. (4) 모아진 상층액은 5 M NaOH로 ph 7.5~8.0으로 조절한다. 약 0.3~0.4 ml 정도 소요된다. HLB (6cc, 200 mg) SPE를 준비한다. 2) 우유 (1) 5 ml 우유에 300 μl 50 % TCA를 넣고 10분간 roller에서 혼합한다. (2) r/min, 15분간 원심분리한 후 맑은 상층액을 새로운 튜브에 모은다. (3) 맑은 상층액에 300 μl 50 % TCA를 넣고 15초 혼합한 후 원심분리한다. (4) 맑은 상층액을 다시 모은 후, 1 M NaOH로 ph 7.5~8.0으로 조절한다. HLB (6cc, 200 mg) SPE를 준비한다. 3) HLB SPE clean-up procedure (1) HLB SPE (6 cc, 200 mg)는 5 ml methanol, 5 ml water로 차례로 활성화 (2) 준비된 시료는 천천히 loading하되 0.5 ml/min의 속도로 한다. (3) 5 ml water로 washing한다. (4) 진공을 가하여 dry한다

120 (5) 3 ml 100 mm HFBA이 포함된 acetonitrile과 methanol 혼합액 (2+1, v/v)으로 두 번 용출한 후 50 질소하 농축한다. (6) 1 ml 20 mm HFBA solution으로 용해하고 여과하여 분석한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 (1) 칼럼 : XBridge C 18 ( mm, 3.5 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 : 20 mm HFBA in water (A) / 20 mm HFBA in MeCN (B) - Gradient 조건 Time (min) A (%) B (%) Flow rate (ml) (3) 칼럼온도 : 실온 (4) 주입량 : 10 μl 2) 질량분석기 조건 (1) Ionization : ESI (positive) (2) Capillary (kv) : 3.00, Extractor (V) : 0.3 (3) Temperature : Source Temp 150, Desolvation Temp : 350 (4) Gas flow : Desolvation 650 L/hr, Cone 50 L/hr (5) Auxiliary Gas : 질소 Collision Gas : 아르곤 물질명 Precursor ion (m/z) Spectinomycin Destomycin A Hygromycin B Product ion (m/z) Dwell time (s) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev) Retention window (min) 0.5~ ~ ~

121 물질명 Precursor ion (m/z) Streptomycin DHS Amikacin Kanamycin Paromomycin Apramycin Tobramycin Gentamicin Neomycin * 밑줄 친 이온이 정량이온임 Product ion (m/z) Dwell time (s) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev) Retention window (min) 4.5~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~15 9.5~15 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 25, 50, 100, 200, 400 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다

122 6. 시험결과 분석 표준용액 10 μl를 위의 분석 조건에 따라LC-MS/MS로 분석하여 각 분석물질별 특이이온을 확인한다. 시료용액 분석에서 얻은 크로마토그램에서 아미노글리코사이드계 항균물질의 각 물질에 대하여 주요 이온이 일치되는 대사물질 피크에 대한 평균면적을 구한 다음 표준곡선 좌표의 Y 축에 동일한 값을 표시하고 이 값과 표준곡선상 만나는 점에서 수직으로 X 축과 만나는 점이 시료용액의 농도를 나타낸다. 이 농도에 시료용액의 희석배수 (건조물에 가한 이동상의 부피)를 곱하고 시료 무게로 나누어 최종 시료 중 각 대사물질의 농도를 산출한다. Fig. 1. LC-MS/MS chromatograms of 11 aminoglycoside standards

123 Ⅴ-7 설파제 및 답손, 오르메토프림, 트리메토프림 동시분석법 1. 정량법의 원리 시료에 5 mm potassium phosphate 용액을 가하여 균질화한 후 acetonitrile로 추출하여 농축 건조한 다음 이를 이동상으로 용해하여 HPLC나 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 측정기기 HPLC 또는 LC-MS/MS (Triple-quadrupole mass spectrometer) 3. 표준품 시약 및 기구 가. 설파제 표준품 및 시약 1) 설파클로르피라진 (Sulfachlorpyrazine, Sulfaclozine) 2) 설파클로르피리다진 (Sulfachlorpyridazine) 3) 설파디아진 (Sulfadiazine) 4) 설파디메톡신 (Sulfadimethoxine) 5) 설파독신 (Sulfadoxine) 6) 설파메라진 (Sulfamerazine) 7) 설파메타진 (Sulfamethazine, Sulfadimidine) 8) 설파메톡사졸 (Sulfamethoxazole) 9) 설파메톡시피리다진 (Sulfamethoxypyridazine) 10) 설파모노메톡신 (Sulfamonomethoxine) 11) 설파페나졸 (Sulfapenazole) 12) 설파퀴녹살린 (Sulfaquinoxaline) 13) 설파티아졸 (Sulfathiazole) 14) 설피속사졸 (Sulfisoxazole) 15) 답손 (Dapsone) 16) 트리메토프림 (Trimethoprim) 17) 오르메토프림 (Ormetoprim) 18) 증류수 : 18 MΩㆍcm 2 이상 19) Methanol : HPLC급 solvent 20) Potassium phosphate (KH 2 PO 4 ) : 특급시약

124 나. 기구 1) 50 ml 원심분리용 튜브 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm 3) 마이크로필터 : 0.20 μm 또는 0.45 μm 4) 마이크로피펫 : 100 μl, 1000 μl 5) 원심분리기 6) 질소농축기 (TurboVap r LV, Caliper Lifescience) 7) 수소 이온농도측정기 8) 정밀저울 (Chemical balance) ± g 정밀도 4. 시험용액 조제 가. 표준원액 (Stock solution) 각각의 표준품을 각각 10 mg씩 칭량하여 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol 50 ml로 용해한 후 증류수로 표시선까지 채워 -20 냉동 보관한다 (100 μg ml -1 ). 나. 표준용액 (Working solution) 1) 1 단계 working solution : Stock solution을 증류수로 100배 희석하여 사용한다 (1 μg ml -1 ). 2) 2 단계 working solution : 1단계 working solution을 증류수로 10배 희석하여 사용한다 (0.1 μg ml -1 ). 다. 시험용액 1) HPLC 분석 이동상 (5 mm, KH 2 PO 4 ) KH 2 PO g을 증류수 1 L에 용해시킨 후 20분간 sonication한 후, 0.2 μm filter로 여과하여 사용한다. 2) 0.1 % formic acid in water (0.1 % FA in water) 증류수 1000 ml에 formic acid 1 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 3) Acetonitrile (MeCN) Acetonitrile 여과하여 사용한다. 라. Spike sample 조제 균질화한 시료 1g에 1 μg ml -1 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.1 μg/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다

125 5. 검사 방법 가. 시료 전처리 방법 시료 (균질화한 조직, 계란, 우유) 1.0 g을 정량하여 50 ml 원심튜브에 취한 후 5 mm potassium phosphate 1 ml을 가하고 약 2분간 균질화 한다. 추출액인 acetonitrile을 10 ml 넣고 10분간 혼합한 후 r/min에서 15분간 원심분리한 후 상층액만 새로운 50 ml 튜브에 취한다. 남은 잔사에 추출액 10 ml 넣고 15분간 혼합한 후 r/min에서 15분간 원심분리하여 상층액을 합한다. 합해진 상층액에 n-hexane 15 ml을 첨가한 후 1분간 혼합한다 r/min에서 15분간 원심분리한 후 hexane층은 버리고, 하층인 추출액만 취하여 50 에서 질소하 농축건조시킨다. 0.1 % formic acid를 첨가한 증류수 1 ml을 가한 뒤, 30 초간 혼합한 후, 초음파에서 10분간 방치하여 완전히 용해시킨 후 4 에서 원심분리 ( r/min에서 10 분)하여 상층액을 0.2 μm syringe filter로 여과하여 시료용액으로 사용한다. 나. 분석 조건 1) HPLC 분석 조건 (1) 컬 럼: Atlantis dc 18 ( mm, 3 μm) 또는 동등품 (2) 검출기: UV 270 nm (3) 이동상: 5 mm KH 2 PO 4 (인산용액으로 ph 3.25조정, A용매), methanol (B용매) gradient* Time (min) A (%) B (%) Flow rate (ml) ) LC-MS/MS 분석 조건 (1) LC 분석 조건 1 컬 럼: Agilent Eclipse C 18 ( mm, 1.8 μm) 또는 동등품 2 이동상 : 이동상 A / 이동상 B 의 gradient 3 칼럼온도 : 35 4 주입량 : 5 μl

126 Table 1. Analytical conditions of sulfonamides and 3 others by LC-MS/MS Compounds Column Mobile phase 14 sulfonamides + dapsone trimethoprim ormetoprim Agilent Eclipse C 18 ( mm, 1.8 μm) A : 0.1 % formic acid in water B : acetonitrile A와 B의 gradient Injection volume : 5 μl Table 2. Mobile phase gradient program Time (min) A (%) B (%) Flow rate (min/ml) ) 질량분석기 조건 (1) Ionization : ESI (positive mode) (2) Capillary : V (3) Nebulizer : 45 psi (4) Gas Temperature : 350 (5) Gas flow : 10 L/min

127 Table 2. Multiple reaction monitoring parameter of sulfonamides and 3 others in LC-MS/MS 물질명 Sulfadiazine (SDZ) Sulfathiazole (STZ) Sulfamerazine (SMR) Sulfamethazine (SMT) Sulfamethoxypyridazine (SMPZ) Sulfamonomethoxine (SMM) Sulfamethoxazole (SMTZ) Sulfadoxine (SDX) Sulfisoxazole (SSX) Sulfachlorpyridazine (SCP) Sulfaclozine (SCR) Sulfaphenazole (SPZ) Sulfadimethoxine (SDM) Sulfaquinoxaline (SQX) Precursor ion (m/z) Dapsone 249 Trimethoprim (TMP) Orimetoprim (OMP) Product ion (m/z) Fragment Voltage (V) Collision Energy (ev) 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 25, 50, 100, 200, 400 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다

128 6. 시험결과 분석 표준용액을 위의 분석 조건에 따라 정밀분석기로 분석하여 각 분석물질별 특이이온을 확인한다. 시료용액 분석에서 얻은 크로마토그램에서 설파제 의 각 물질에 대하여 주요 이온이 일치되는 대사물질 피크에 대한 평균면적을 구한 다음 표준곡선 좌표의Y 축에 동일한 값을 표시하고 이 값과 표준곡선상 만나는 점에서 수직으로X 축과 만나는 점이 시료용액의 농도를 나타낸다. 이 농도에 시료용액의 희석배수 (건조물에 가한 이동상의 부피)를 곱하고 시료 무게로 나누어 최종 시료 중 각 대사물질의 농도를 산출한다. Fig 1. HPLC chromatograms of 14 sulfonamides at 0.1 μg ml -1 (ppm) Fig 2. LC-MS/MS chromatograms of 14 sulfonamides and 3 others at μg kg -1 (ppm)

129 Ⅴ-8 퀴놀론계 항균물질의 동시분석법 1. 정량법의 원리 시료에 2.5 % trichloroacetic acid 용액을 가하여 균질화한 후 acetonitrile로 추출하여 농축 건조한 다음 50 % acetonitrile과 이동상 혼합액으로 용해하여 HPLC/형광검출기 또는 LC-MS/MS로 분석한다. 액상추출법에 의한 시료 전처리법 대신에 시료고체상분산처리법 (Matrix Solid Phase Dispersion Method; MSPD법)을 이용할 수 있다. 2. 측정기기 고속액체크로마토그라프 (HPLC)/형광검출기 (Fluorescence detector) 또는 LC-MS/MS (Triple-quadrupole mass spectrometer) 3. 표준품 시약 및 기구 가. 퀴놀론계 표준품 및 시약 1) Ciprofloxacin (CF) 2) Danofloxacin (Dano) 3) Difloxacin (DF) 4) Enrofloxacin (EF) 5) Flumequine (FMQ) 6) Marbofloxacin (MBF) 7) Nalidixic acid (NA) 8) Norfloxacin (NF) 9) Ofloxacin (OF) 10) Orbifloxacin (OBF) 11) Oxolinic acid (OA) 12) Pefloxacin (PF) 13) Piromidic acid (PA) 14) Sarafloxacin (SF) 15) n-hexane, Methanol, Acetonitrile : HPLC solvent 16) Triethylamine, Phosphoric acid, Sodium sulfate : 특급시약

130 나. 기 구 1) 50 ml centrifuge tube 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, 1000 μl 4) 마이크로필터 : 0.22 μm filter 5) 원심분리기 6) 정밀저울 (Chemical balance) ± g 정밀도 7) 일반저울 : ± 0.1g 정밀도 8) Vortex mixer 9) multi-mixer (TAITEC vial mixer, vix-100) 10) Ultrasonic bath (Branson 8510) 11) 질소농축기 (TurboVap r LV, Caliper Lifescience) 12) 0.2 μm nylon filter 4. 시험용액 조제 가. 표준원액 (Stock solution) 각각의 퀴놀론계 표준품 10 mg을 정밀히 달아 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol로 잘 녹여 표시선 까지 채워 잘 혼합한다 (100 μg ml -1 ). 나. 표준용액 (Working solution) 각각의 표준원액 (100 μg ml -1 ) 1 ml을 정확히 취하여 100 ml 용량 플라스크에 옮기고 이동상으로 표시선 까지 채운 다음 잘 혼합한다 (1 μg ml -1 ). 다. 시험용액 1) HPLC 이동상 증류수 1 L에 4 ml triethylamine과 4 ml 85 % phosphoric acid를 첨가하여 잘 섞어준 후 0.45 μm filter로 여과하여 이동상으로 사용한다. 2) 2.5 % trichloroacetic acid (TCA) : 2.5 g TCA를 취하고 증류수로 100 ml까지 채운 후 용해하고 사용한다. 라. Spike sample 조제 균질화한 시료 1 g에 1 μg ml -1 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.1 μg/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다

131 5. 검사 방법 가. 시료 전처리 방법 1) 액상 추출법 (Liquid-Liquid Extraction Method) 시료 (균질화한 조직, 계란, 우유) 1.0 g을 정량하여 50 ml 원심튜브에 취한 후 2.5 % trichloroacetic acid 1 ml을 가하고 약 10분간 균질화한 후, 추출액인 acetonitrile을 8 ml 넣고 10분간 혼합하여 r/min에서 20분간 원심분리한 후 상층액만 15 ml 튜브에 취한다. 남은 잔사에 추출액 5 ml 넣고 10분간 혼합한 후 r/min에서 20분간 원심분리하여 상층액을 합한다. 합해진 상층액을 Na 2 SO 4 5 g에 통과시키고, 통과하여 받아진 추출액에 10 ml의 n-hexane을 첨가하여 혼합한 후 r/min에서 5분간 원심분리하여 상층액은 버리고 아랫부분만을 취해 50 에서 질소하 농축건조시킨다. 50 % acetonitrile 0.5 ml과 이동상 0.5 ml을 가한 뒤 초음파에서10분간 방치하여 완전히 용해시킨 후 4 에서 원심분리 ( r/min에서 10 분)하여 상층액을 0.2 μm nylon syringe filter로 여과하여 시료용액으로 사용한다. 이 시료용액 50 μl씩 3 회 반복주입한다. 2) 시료고체상분산처리법 (Matrix Solid Phase Dispersion Method; MSPD법) C 18 분말 2 g을 유발에 취하고 시료 0.5 g을 정확히 달고 수산 0.05 g과 무수황산나트륨 0.03 g을 첨가한 후 유봉으로C 18 과 시료가 완전히 균질화 되도록 한다. 여과지 (Whatman No.1) 2 장을 10 ml 주사기에 넣고 균질화된 혼합물을 주사기에 옮겨 담는다. 혼합물 위에 여과지 1장을 놓고 주사봉을 이용하여 혼합물의 부피가 약 4.0 ml되게 압축한다. 헥산 8 ml를 가하여 흘려보내고 주사기를vacuum manifold로 옮겨 혼합물 내에 남아있는 헥산을 음압 하에서 제거한다. 다시 에틸아세테이트 8 ml로 세척하고 주사기를 vacuum manifold로 옮겨 음압 하에서 완전히 건조시킨다. 메탄올 13 ml로 용출시킨 후 그 용출액을 질소농축하여 건조시키고 이동상 0.5 ml를 가하여 10분간 초음파를 통과시키고 용해시킨 후 r/min에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취해 0.2 μm nylon syringe filter로 여과하여 시험용액으로 사용한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석 조건 (1) 컬 럼 : Waters Atlantis TM dc 18 ( mm, 3 μm) 또는 동등품 (2) 검출기 : 형광 (Ex. 278 nm / Em. 455 nm) (3) 이동상 : 증류수 (0.4 % triethylamine, phosphoric acid 포함):MeOH = 77 : 23 (v/v) (4) 유 속 : 1.0 ml/min (5) 주입량 : 50 μl

132 2) LC-MS/MS 분석 조건 (1) HPLC 분석 조건 1 칼럼 : Agilent Eclipse plus C 18 ( mm, 1.8 μm) 또는 동등품 2 이동상 : (A) 0.1 % formic acid in water (B) acetonitrile (gradient) Time (min) A (%) B (%) Flow rate (ml) 칼럼온도 : 40 라) 주입량 : 10 μl (2) 질량분석기 분석조건 1 Ionization : ESI positive mode 2 Capillary (V) : (3) Nebulizer (psi) : 40 3 Gas Temperature : Gas flow (L/min) : 12 Analytes Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Dwell time (ms) Fragment Voltage (V) Collision Energy (ev) Ciprofloxacin 332 Norfloxacin

133 Analytes Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Dwell time (ms) Fragment Voltage (V) Collision Energy (ev) Orbifloxacin 396 Oxolinic acid 262 Flumequine 262 Nalidixic acid 233 Sarafloxacin 386 Marbofloxacin 363 Ofloxacin 362 Enrofloxacin 360 Danofloxacin 358 Pefloxacin 334 Difloxacin 400 Piromidic acid* 다. 표준곡선 작성 퀴놀론계 혼합표준용액 (10 μg ml -1 )을 100 ml 용량플라스크에 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, ml씩 취하고, 이동상으로 표시선 까지 채워 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, , μg ml -1 으로 희석한다

134 7개 농도의 희석된 표준용액을50 μl씩 3회 반복 주입하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 퀴놀론계에 대한 농도별 평균면적을 구하여X축을 농도, Y축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다. y = mx + b y : 퀴놀론계 피크의 면적 m : 기울기 b : y축 값 x : 퀴놀론계의 농도 (μg/g) 1) 시료별 농도계산 각 시료의 피크의 면적을 측정하고 위 공식을 이용하여 농도를 계산한다. 상기 시료의 농도를 표준곡선을 이용하지 않고 다음 계산식에 의해서도 구할 수 있다. 시료의 퀴놀론제 면적 표준용액농도 표준용액의 퀴놀론제 면적 시료용액용량 시료무게 시료농도 6. 시험결과 분석 Fig 1. HPLC chromatograms of fluouoroquinolones in egg fortified at 0.05 μg/g and blank

135 Fig. 2. Chromatograms of 13 quinolones

136 Ⅴ-9 폴리에테르계 항균물질 분석법 폴리에테르계 항생제에는 나라신, 라살로시드, 마두라마이신, 모넨신, 밤버마이신, 아빌라 마이신, 살리노마이신, 셈두라마이신 등이 있으며, 주로 닭의 콕시듐증의 예방 및 치료 및 성장촉진 목적으로 사용되나 소, 돼지에도 일부 사용되며, 배합사료 제조용으로 년간 10~20 여톤이 사용되고 있다. 최근 가축에서 항생제 사용에 의한 인체내성균 발생에 대한 우려가 높아짐에 따라 유해사료의 범위와 기준 (농림부고시 제 호, ) 및 배합사료제조용 동물용 의약품등 사용기준 (국립수의과학검역원고시 제 호, )을 개정하여 소, 돼지 및 닭의 배합사료 제조용 동물용의약품 (25 18종)의 사용기준 및 허용량을 설정하였다. 또한 2008년 8월, Ionophore 항생제를 비롯한 배합사료 제조용 항생제에 대한 잔류허용기준이 신설 (식약청 고시 제 호, ) 되었으며 기존 기준기설정 되어있던 Monensin은 소, 돼지, 가금, 염소고기에서 0.05 μg/g으로, salinomycin은 소고기에서는 0.02 μg/g, 돼지 및 가금류에서는 0.1 μg/g으로 개정되었다. 1. 원리 균질화한 시료를 아세토니트릴로 추출한 후 원심분리하여 얻어진 상층액을 여과한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프-질량분석기 LC-MS/MS (Triple-quadrupole mass spectrometer) 3. 표준품, 시약 및 기구 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : Lasalocid, Maduramicin, Monensin, Narasin, Salinomycin, Semduramicin 2) Acetonitrile : HPLC grade 3) Formic acid : HPLC grade 4) 증류수 : 18 MΩㆍcm 2 이상 나. 기 구 1) 50 ml centrifuge tube 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm

137 3) 마이크로피펫 : 100 μl, μl 4) 마이크로필터 : 0.2 μm filter 5) 원심분리기 6) 정밀저울 (Chemical balance) ± g 정밀도 7) 일반저울 : ± 0.1 g 정밀도 8) Vortex mixer 9) multi-mixer (TAITEC vial mixer, vix-100) 10) Ultrasonic bath (Branson 8510) 4. 시험용액 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 표준품을 각각 10 mg씩 칭량하여 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol 100 ml로 용해한 후 4 냉장 보관한다 (100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution) : Stock solution을 증류수로100배 희석하여 사용한다(1 μg ml -1 ). 나. 시험용액 1) 0.3 % formic acid in water (0.3 % FA in water) 증류수 100 ml에 formic acid 0.3 ml를 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 2) 0.3 % formic acid in acetonitrile (0.3 % FA in MeCN) Acetonitrile 100 ml에 formic acid 0.3 ml를 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 3) 0.2 M 인산완충액 (ph 7.2) 500 ml 용량플라스크에 제이인산나트륨 (Na 2 HPO 4 H 2 O) 5.11 g과 제일인산나트륨 (NaH 2 PO 4 H 2 O) 1.68 g을 달아 증류수로 녹여 표시선까지 채운다. 다. Spike sample 조제 균질화한 시료 1g에 1 μg ml -1 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.1μg/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 5. 시험방법 가. 시료전처리 1) 균질화 시료 1 g에 0.2 M 인산완충액 (ph 7.2) 1 ml를 넣어 균질화한 다음 acetonitrile 10 ml를 넣고 multi-mixer로 5분간 강하게 진탕 혼합한다

138 2) -4, r/min에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 3) 얻어진 상층액은 40 에서 질소 농축시킨다. 4) 잔류물을 50 % acetonitrile 1 ml에 녹인 후0.2 μm filter로 여과하여 시험용액으로 한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 (1) 칼럼 : C 8 ( mm, 3.5 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 : 0.3 % FA in water (A) / 0.3 % FA in MeCN (B) gradient Time (min) A (%) B (%) Flow rate (ml) (3) 칼럼온도 : 35 라) 주입량 : 10 μl 2) 질량분석기 조건 (1) Ionization : ESI (positive) (2) Capillary (kv) : 3.5, Extractor (V) : 3 (3) Temperature : Source Temp 150, Desolvation Temp : 400 (4) Gas flow : Desolvation 650 L/hr, Cone 50 L/hr (5) Auxiliary Gas : 질소 Collision Gas : 아르곤 Compound Precursor ion (m/z) Lasalocid Maduramicin Monensin Narasin Salinomycin Semduramicin Product ion (m/z) Dwell time (s) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev)

139 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 25, 50, 100, 200, 400 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다. 6. 시험결과 분석 시료용액 분석에서 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질의 이온에 대하여 머무름시간이 일치되는 각각의 표준물질 피크에 대한 평균면적을 구한 다음 표준곡선 좌표의Y 축에 동일한 값을 표시하고 이 값과 표준곡선상 만나는 점에서 수직으로X 축과 만나는 점이 시료용액의 농도를 나타낸다. 이 농도에 시료용액의 희석배수(건조물에 가한 이동상의 부피)를 곱하고 시료 무게로 나누어 최종 시료 중 각 검출물질의 농도를 산출한다. Fig 1. LC-MS/MS chromatograms of 6 ionophores standards at 100 ng/ml

140 Ⅴ-10 항원충제 잔류분석법 1. 원리 항원충제 계열을 동시분석하기 위하여 시료에2 mm a mmonium formate가 포함된 acetonitrile / water (4:1, v/v)로 추출한 후 dispersive SPE (C 18 )로 정제한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 분석기기 액체크로마토그래프-질량분석기 (LC-MS/MS) 3. 표준품 및 시약 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : Amprolium, clopidol, decoquinate, diaveridine, diclazuril, dicyclanil, ethopabate, halofuginone, imidocarb, m-phenetidine, nicarbazine, robenidine, roxarsone, toltrazuril, toltrazuril sulfone, toltrazuril sulfoxide, zoalene 2) Acetonitrile : LC-MS grade 3) Methanol : LC-MS grade 4) Formic acid : LC-MS grade 5) A mmonium formate : A.C.S 6) C 18 충전제 : 입자크기 37~55 μm, 공극크기 125 A 또는 이와 동등한 것 7) 증류수 : 18 MΩ cm2 이상 나. 기 구 1) 15 ml, 50 ml centrifuge tube 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, μl 4) 마이크로필터 : 0.2 μm filter Whatman, Mini-UniPrep TM PVDF Syringeless filter 100 Units - Cat. No. UN203NPEAQU 5) 원심분리기 6) 정밀저울 (Chemical balance) ± g 정밀도 7) 일반저울 : ± 0.1g 정밀도

141 8) Vortex mixer 9) Multi-mixer ( TAITEC, Vial Mixer, VIX-100) 10) Ultrasonic bath 4. 표준용액, 시험용액 및 첨가시료의 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 각각의 표준품 10 mg (역가 100 %)을 정밀히 달아 100 ml 용량플라스크에 취하여 methanol에 녹여 표시선 까지 채운 다음 잘 혼합한다(100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution): 각 물질별 잔류허용기준을 기준으로 하여validation level (VL)을 정하고, stock solution을 증류수를 이용하여 각 물질별로 VL의 10배가 되도록 혼합하여 표준용액으로 사용한다. Compounds MRL (ng g -1 ) VL (ng g -1 ) Compounds MRL (ng g -1 ) VL (ng g -1 ) Amprolium Imidocarb Clopidol Nicarbazin Decoquinate Robenidine Diaveridine Roxarsone Diclazuril Totrazuril Dicyclanil Toltrazuril sulfone Ethopabate Toltrazuril sulfoxide m-phenetidine Zoalene Halofuginone m-phenetidine은 ethopabate의 대사체임 2 Toltrazuril sulfone과 toltrazuril sulfoxide는 toltrazuril의 대사체임 나. 시험용액 1) 0.1 % formic acid in water (0.1 % FA in water) 증류수 ml에 formic acid 1 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 2) 0.1 % formic acid in acetonitrile (0.1 % FA in MeCN) Acetonitrile ml에 formic acid 1 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 3) 200 mm ammonium formate (200 mm AF) 증류수 100 ml에 ammonium formate 1.25 g을 넣고 용해하여 사용한다

142 다. 첨가시료 (Spiked sample) 균질화한 음성대조시료 2 g에 VL 5배 농도의 희석표준용액을 200 μl 첨가하여 각각의 표준물질이 VL 농도가 되도록 spike sample을 조제하여 매 실험 마다 3개 이상 시험한다. 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 시료 2 g에 200 mm ammonium formate 0.1 ml과 water 2 ml을 첨가하여 균질화 한후, 추출액 acetonitrile 8 ml을 첨가한다. 2) multi-mixer로 15분간 강하게 진탕 혼합한 후 r/min으로 10분간 원심분리한다. 3) 상층액을 분리하여 C 18 분말 500 mg을 분산시킨 후, hexane 10 ml을 첨가하여 1분간 진탕 혼합한다. 4) r/min으로 5분간 원심분리 하고, hexane층 아래 추출액중 5 ml만을 취해 눈금이 표시된 새로운 튜브로 옮긴후, 40 하에서 1 ml이 되도록 질소 농축한다. 5) 추출액 1 ml중 0.5 ml을 취하여 0.2 μm PVDF syringeless filter로 여과후 분석을 실시한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 Column Mobile phase Column temperature Injection volume C 18 (2.1x50 mm, 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것 A : 0.1 % formic acid in water B : 0.1 % formic acid in MeCN A와 B의 gradient 40 5 μl Mobile phase gradient program Time (min) A (%) B (%) Flow rate (min/ml) ) 질량분석기 분석조건 - Ionization : ESI positive/negative ion switching mode - Capillary (kv) : +4.5,

143 - Temperature : Source Temp 150, Desolvation Temp Gas flow : Desolvation 650 L/hr, Cone 50 L/hr - Nebulizing gas : N 2, 3 L/min - Drying gas : N 2, 15 L/min - Collision gas : Argon, 230 kpa Compounds Polarity Precursor Ion (m/z) Product Ion (m/z) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev) Amprolium Positive Clopidol Positive Decoquinate Positive Diaveridine Positive Diclazuril Negative Dicyclanil Positive Ethopabate Positive m-phenetidine Positive Halofuginone Positive Imidocarb Positive Nicarbazin Negative Robenidine Positive Roxarsone Negative Toltrazuril Negative Toltrazuril Negative sulfone Toltrazuril Negative sulfoxide Zoalene Negative 밑줄친 것이 정량이온임 2 Nicarbazin의 경우, nicarbazin의 대사체인 4,4-dinitrocarbanilide에 대한 precursor ion임

144 다. 조직표준곡선 작성 Blank를 포함하여 각 물질별 VL (validation level) 농도의 0.5, 1, 2, 3, 4 6단계로 조직표준곡선 (matrix matched Calibration curve)를 작성하며, LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 검량선을 작성한다. 6. 시험결과 분석 시료의 분석용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 각각에서 얻은 크로마토 그램으로부터 물질별 머무름시간과 특이이온의 검출양상을 비교한다. 표준용액 및 시료의 분석용액의 특이 이온간 ion ratio를 확인하고 정량이온의 평균면적을 구한 다음 표준곡선 좌표의 Y 축에 동일한 값을 표시하고 이 값과 표준 곡선상 만나는 점에서 수직으로 X 축과 만나는 점이 이용해 시료의 농도를 계산한다. Amprolium > (+) Ethopabate > (+) Dicyclanil >41.10 (+) Robenidine > (+) Imidocarb > (+) Toltrazuril sulfone >42.10 (-) Roxarsone > (-) Toltrazuril sulfone >42.10 (-) Clopidol > (+) Nicarbazin > (-) Diaveridine > (+) Toltrazuril sulfoxide >42.15 (-) m-phenetidine > (+) Diclazuril > (-) Zoalene >42.10 (-) Toltrazuril >42.10 (-) Halofuginone > (+) Decoquinate > (+) Fig. 1. LC-MS/MS chromatograms of 14 antiprotozoals and their metabolites in chicken muscle spiked at 100 ng g

145 Ⅴ-11 구충제 (벤지미다졸계, 아버멕틴계, 레바미졸, 클로산텔 등) 분석법 본 분석법은 여러 종의 구충제를 포함하고 있으니, 보유 기기성능 및 실험환경에 따라 필요한 분석대상물질만 선정하여 실험가능 1. 시험법 적용범위 축산물 등에 적용한다. 2. 분석원리 검체 중 벤지미다졸계, 아버멕틴계, 레바미졸, 클로산텔 등을 아세토나이트릴로 추출한 후MgSO 4 및 PSA를 이용하여 정제하고 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다. 3. 장치 액체크로마토그래프/질량분석기 4. 시약 및 시액 가. 용매:액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 나. 물:3차 증류수 또는 이와 동등한 것 다. 표준원액:벤지미다졸계, 아버멕틴계, 레바미졸, 클로산텔 등 표준품 을 정밀히 달아 메탄올 또는 DMSO에 녹여 100 mg ml -1 로 하고 이를 영하 20 에 보관한다. 사용 시 표준품을 실온에 두어 용액의 온도가 실온과 동일해지면 사용한다. 라. 표준용액:표준원액을 DMSO 용액에 적당한 농도로 희석하여 사용하며, 냉장고에 보관한다. 마. 맥바인 (MacIlvaine) 완충용액 (ph 2) : 0.6 M 구연산 (citric acid monohydrate) 및 0.3 M 제이인산나트륨 (disodium hydrogen phosphate dihydrate) 농도로 물에 녹인 후 HCl로 ph를 조절한다. 바. 기타시약:특급

146 5. 시험용액의 조제 가. 추출 1) 조직 (간, 신장), 유 ( 乳 ):균질화한 검체 2 g을 50 ml 원심분리관에 담아 내부표준물질인 5-하이드록시-메벤다졸-d 3 및 페반텔-d 6 표준용액 20 μl 을 첨가한다. 15초 동안 혼합한 후 sodium chloride 1g을 넣고 균질화한 후 물 2 ml 넣고 1분간 균질화한다. 여기에 1 % 아세틱에시드 포함한 아세토나이트릴 10 ml을 넣고 15분간 강하게 균질화한 후 r/min에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취한다. 2) 조직 (근육), 알 ( 卵 ):균질화한 검체 2 g을 50 ml 원심분리관에 담아 내부표준물질인 5-하이드록시-메벤다졸-d 3 및 페반텔-d 6 20 μl을 첨가한다. 15초 동안 혼합한 후sodium chloride 1g을 넣고 균질화한 후 맥바인 완충용액 2 ml 넣고 1분간 균질화한다. 여기에 아세토 나이트릴:메탄올 (9:1) 10 ml을 넣고 15분간 강하게 균질화한 후 r/min에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취한다. 나. 정제 상층액을 MgSO mg, PSA 150 mg 포함한 15 ml 원심분리관에 옮긴 후 30 초간 강하게 균질화한 후 r/min에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 유리튜브에 옮긴 후50, 질소가스 감압농축한 후 500 μl DMSO로 녹인 후 여과하여 시험용액으로 한다. 6 시험조작 가. 측정조건 1) 액체크로마토그래프 조건 (1) 칼럼 : C 18 ( mm, 1.8 μm) 또는 이와 동등한 것 (2) 칼럼온도 : 40 (3) 이동상 A :20 mm Ammonium Formate & 0.1 % formic acid in water (4) 이동상 B :0.2 % formic acid in Methanol Time (min) A (%) B (%) (5) 유속 : 0.25 ml/분 (6) 주입량 : 5 μl

147 2) 질량분석기 조건 (1) Ionization : ESI (positive mode & negative mode) (2) Capillary : V (3) Nebulizer : 45 psi (4) Gas Temperature : 350 (5) Gas flow : 10 L/min 7. 정량시험 가. 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고 각 물질별 피크에 대한 평균면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 각각의 함량을 구한다. 구충제 분석물질 및 내부표준물질의 물질별 정량이온 EIC (Extracted ion chromatogram)

148 구충제의 선구이온, 생성이온, 기기조건 및 머무름시간 Analyte Precursor ion (m/z) Product ion (m/z)** Dwell time (ms) Fragment Voltage (V) Collision Energy (ev) Ionization mode Albendazole , ,35 ESI+ Albendazoleamino-sulphone* , , 20 ESI+ Albendazole sulfone* , , 30 ESI+ Ricobendazole* , , 25 ESI+ Oxfendazole , , 20 ESI+ Oxfendazole sulfone* , , 25 ESI+ Oxibendazole , , 15 ESI+ Fenbendazole , , 40 ESI+ Febantel , , 10 ESI+ Thiabendazole , , 35 ESI+ 5-OH-thiabendazole* , , 30 ESI+ Emamectin , , 35 ESI+ Triclabendazole , , 40 ESI+ Keto-triclabendazole 331, , , , 20 ESI+ Flubendazole , , 20 ESI+ Flubendazole -2-amino* , , 30 ESI+ Fluazuron , , 20 ESI+ Pyrantel , , 45 ESI+ Morantel , , 25 ESI+ Levamisole , , 30 ESI+ Menbendazole , , 35 ESI+ Clorsulon 378, , , 110 3, 6 ESI- Nitroxynil , , 10 ESI- Oxyclozanide , , 15 ESI- Niclosamide , , 26 ESI- Bithionol , , 25 ESI- Chlorfluazuron , , 40 ESI- Praziquantel , , 35 ESI+ Fenbendazole-d , , 35 ESI+ Flubendazole-d , , 35 ESI+ Oxibendazole-d , , 15 ESI+ Thiabendazole-d , , 40 ESI+ Albendazole-d , , 35 ESI+ Febantel-d , , 10 ESI+ 5-OHmebendazole-d , , 25 ESI+ Salicylanilide , , 40 ESI+ Abamectin , , 45 ESI+ Doramectin , , 45 ESI+ Moxidectin , , 40 ESI+ Ivermectin , ,45 ESI+ Eprinomectin , , 55 ESI+ Closantel , , 35 ESI- Rafoxanide , ,35 ESI- Selamectin , , 15 ESI- Retention time (min)*** * 대사체로 잔류허용기준없음 ** 정량이온, 정성이온 순으로 표기 *** 머무름시간에 따라서시간대별로 분석 내부표준문질, Avermectin 계열 내부표준물질인 selamectin을 제외하고는 사용하지 않아도 됨

149 Ⅴ-12 암페니콜계열 분석법 클로람페니콜 (Chloramphenicol; CAP)은 1947년 Streptomyces venezuelae에서 첫 번째로 분리된 항생제이며 70S 리보좀의 50S subunit을 결합하여 세균내의 단백질 합성을 억제시키는 광범위 항생제로 동물질병을 치료하는 데 있어 매우 효과적인 약물로 알려져 있다. 하지만 클로람페니콜은 다양한 혈액 독성을 일으킨다고 알려져 있으며, 망상 적혈구 감소증 (reticulocytopenia), 백혈구 감소증 (leucopenia) 및 혈소판 감소증 (thrombocytopenia), 재생불량성 빈혈 등이 주요 증상이다. 이러한 잠재된 독성에 의한 안전성 문제로1990년대 초반부터 한국, 미국, EU 등 세계 각국에서 식용동물에 사용을 금지하고 있다. 그럼에도 불구하고 클로람페니콜의 광범위한 항균효과 때문에 전 세계적으로 여전히 불법적으로 많이 사용되고 있는 실정이다. FAO/WHO에서는 이런 문제점으로 인하여 클로람페니콜은 식육제품에서의 zero tolerance level을 추천하고 있으며, 항생제 및 합성항균제 등의 미량 잔류로 인한 인간에의 독성과 다량 사용으로 인한 환경 공해 등을 모니터링 해야 할 필요성이 대두되었고 더불어 정밀한 분석법이 요구되고 있다. 그러나 이러한 선진 각국의 클로람페니콜에 대한 사용 규제에도 불구하고 2002년 중국, 베트남 등 동남아 국가에서 사육하는 식용동물, 어류, 꿀벌 등에서 불법사용으로 인해 스위스와 EU 국가로 수출한 닭고기, 새우 등에서 잔류문제가 발생한 바 있으며, 클로람 페니콜을 비롯한 사용금지약물에 대한 국가별 잔류분석법의 검출감도 차이는 국제 무역마찰의 소지가 있으므로 미국에서 개최된 제14차 CODEX 식품중 동물용 의약품잔류분과 위원회 (CC/RVDF)에서는 새우에서 클로람페니콜 잔류문제 가 정식의제로 채택되어 국가간의 조화를 위하여 분석법의 요건에 대해 논의한 바 있으며, 최근 EU에서는 축 수산식품에서의 클로람페니콜 분석법의 최소검출한계치 (Minimun Required Performance Limit; MRPL)를 0.3 ng/g 이하로 정하였다. 현재 축산물에서 클로람페니콜의 잔류분석법으로 면역분석법을 이용한 Charm II receptor assay (Charm Science Inc., USA)나 다양한 ELISA 키트 (Ridascreen, R-Biopharm GMBH, Germany) 등이 스크리닝법으로 사용되고 있다. 미국 FDA에서는 세계적인 추세에 발맞추어LC-MS/MS를 이용하여 새우, 게, 가재 및 벌꿀에서 정량한계0.3 ng/g 수준의 잔류분석법을 개발하여 채택하고 있다. 이렇듯 사용금지약물에 대한 잔류분석법의 검출감도는 국제적으로 매우 중요시 되고 있으나 우리나라 식품공전에서 정하는 HPLC에 의한 클로람페니콜 공정분석법의 검출한계치 (LOD)는 2 ng/g 수준에 불과하기 때문에 최근EU가 정하는 분석법의 최소검출한계치 (MRPL) 0.3 ng/g 이하를 검출 및 정량할 수 있는 방법으로의 개선이 필요하여 국가에서는 2008년 식품공전의 HPLC를 이용한 클로람페니콜 분석법을 폐지하고LC-MS/MS를 이용한 분석법으로 개정하였다. 플로르페니콜은 소, 돼지, 양, 염소 가금, 어류 및 갑각류에서0.1~3.0 mg/kg 으로 설정 ( , 식약청 고시 제 호)되어 있으며, 티암페니콜은 소, 돼지, 닭에서 0.5 mg/kg 로 설정되어 있다

150 1. 원리 조직 5 g에 증류수 2 ml, ethyl acetate 6 ml를 넣고 균질화시킨 후 원심분리하여 상층액을 취하여 건조시킨다. Hexane : chloroform (1 : 1, v/v) 2 ml로 용해시키고 여기에 증류수 1 ml을 더하여 잘 혼합한 후 상층액을 취하여 여과한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프-질량분석기 Agilent, US/6410 triple-quadrupole mass spectrometer 3. 표준품, 시약 및 기구 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : Chloramphenicol, Thiamphenicol, Florfenicol 2) Acetonitrile : HPLC grade 3) n-hexane : HPLC grade 4) Ethyl acetate : HPLC grade 5) Chloroform : HPLC grade 6) Methanol : HPLC grade 7) 증류수 : 18 MΩㆍcm 2 이상 나. 기 구 1) 50 ml centrifuge tube 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, 1000 μl 4) 마이크로필터 : 0.2 μm filter 5) 원심분리기 6) 정밀저울 (Chemical balance) ± g 정밀도 7) 일반저울 : ± 0.1g 정밀도 8) multi-mixer (TAITEC vial mixer, vix-100) 9) Ultrasonic bath (Branson 8510)

151 4. 시험용액 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) Chloramphenicol, Thiamphenicol, Florfenicol 10 mg을 칭량하여 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol 2 ml로 용해한 후 증류수로 표시선까지 채워-20 냉동 보관한다 (100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution) (1) 1 단계 working solution : Stock solution을 증류수로 100배 희석하여 사용한다 (1 μg ml -1 ). (2) 2 단계 working solution : 1단계 woriking solution을 증류수로100배 희석하여 사용한다(10 ng/ml). 나. 시험용액 1) Hexane : chloroform (1:1, v/v) 250 ml n-hexane과 250 ml chloroform을 혼합하여 사용한다. 다. Spike sample 조제 균질화한 시료 5g에 10 ng/ml 농도의 표준용액을 150 μl를 첨가하여 0.3 ng/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 균질화 된 시료 5 g에 증류수 2 ml를 넣고 multi-mixer로 15분간 진탕 혼합한다. 2) Ethyl acetate 10 ml를 50 ml centrifuge tube에 넣고 multi-mixer로 15분간 진탕 혼합한다. 3) -4, r/min에서 15분간 원심분리하여 상층액을 유리시험관에 모은다. 4) 남은 잔사에 ethyl acetate 5 ml를 넣고 위의 2)와 3)의 과정을 반복하여 상층액을 합한다. 5) 모아진 상층액을 40, 질소하 농축 건조한다. 6) 농축된 시료에 hexane : chloroform (1:1, v/v) 2 ml을 넣어 완전 용해시킨다. 7) 증류수 1 ml를 더하여 multi-mixer로 450~500 r/min의 속도로 10분간 진탕 혼합한다. 너무 강하게 진탕 혼합하면 emulsion이 생길 수 있으며, 너무 약하게 혼합하면 회수율이 저하될 수 있으므로 주의해야 한다. 8) 실온에서 r/min으로 5분간 원심분리한 후 조심스럽게 상층액을 취하여 eppendorf tube에 넣는다. 9) -4, r/min에서 15분간 원심분리하고 상층액을 취하여 0.2 μm filter로 여과한 후 LC-MS/MS로 분석한다

152 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 (1) 칼럼 : Agilent Eclipse plus C 18 ( mm, 1.8 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 : water : Methanol (gradient) Time (min) % water % MeOH Flow rate (ml) (3) 칼럼온도 : 실온 (4) 주입량 : 5 μl 2) 질량분석기 분석조건 (1) Ionization : ESI negative (2) Capillary (V) : (3) Nebulizer (psi) : 40 (4) Gas Temperature : 350 (5) Gas flow (L/min) : 10 물질명 Chloramphenicol Thiamphenicol Florfenicol Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Dwell time (sec) Fragment Voltage (V) Collision Energy (ev) 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0,.375, 0.75, 1.5, 3.0, 6.0 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다

153 6. 시험결과 분석 표준용액 10 μl를 위의 분석 조건에 따라LC-MS/MS로 분석하여 각 분석물질별 특이이온을 확인하고, 이온별 비율을 만족해야 한다. 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인하고, 이온별 비율을 만족해야 한다. 각각에서 얻은 크로마토 그램으로부터 머무름시간을 비교하고 m/z 152, 185, 185 의 피크에 대한 평균면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 클로람페니콜, 티암페니콜, 플로르페니콜의 함량을 구한다. Chloramphenicol Thiamphenicol Florfenicol Fig 1. Mass chromatograms of Thiamphenicol, Florfenicol and chloramphenicol spiked at 2 ng/g

154 Ⅴ-13 β-agonists (클렌부테롤, 락토파민, 질파테롤)의 잔류분석법 1. 원리 Clenbuterol, ractopamine 및 zilpaterol을 동시분석하기 위하여 시료를 강산 용액으로 가수 분해한 후 ph 12.0으로 조절하여 ethyl acetate로 추출하여 0.01 N HCl로 용해한 다음 여과하여 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 분석기기 액체크로마토그래프-질량분석기 (LC-MS/MS) 3. 표준품 및 시약 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : clenbuterol, clenbuterol-d9 (내부표준물질로 사용), ractopamine, zilpaterol, zilpaterol-d7 (내부표준물질로 사용) 2) Acetonitrile : LC-MS grade 3) Methanol : LC-MS grade 4) Formic acid : LC-MS grade 5) 증류수 : 18 MΩㆍcm 2 이상 나. 기 구 1) 15 ml, 50 ml centrifuge tube 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, μl 4) 마이크로필터 : 0.2 μm filter 5) 원심분리기 6) 정밀저울 (Chemical balance) ± g 정밀도 7) 일반저울 : ± 0.1g 정밀도 8) Vortex mixer 9) multi-mixer 10) Ultrasonic bath

155 4. 표준용액, 시험용액 및 첨가시료의 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 각각의 표준품 (역가 100 %)을 정밀히 달아 100 ml methanol에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 2) 표준용액 (working solution) : 표준원액을 0.01 N HCl을 이용하여 2 ng/ml로 희석한다. 나. 내부표준용액 표준원액을 0.01N HCl을 이용하여 Clenbuterol-d9은 2 ng/ml의 농도로, zilpaterol-d7은 20 ng/ml의 농도로 희석한다. 다. 시험용액 1) 0.1 % formic acid in water (0.1 % FA in water) 증류수 ml에 formic acid 1 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 2) 0.1 % formic acid in acetonitrile (0.1 % FA in MeCN) Acetonitrile ml에 formic acid 1 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 3) 0.4 N perchloric acid (ph 1.0 이하임) : 70~73 % perchloric acid (분자량 )를 사용하여 조제한다. perchloric acid 28.7 g (ml이 아님. 비중이 높으니 반드시 칭량해서 사용할 것)을 증류수 500 ml에 희석하여 사용한다. Perchloric acid : SIGMA , 70 % (A.C.S. reagent) 라. 첨가시료 (Spiked sample) 균질화한 시료 5g에 2 ng/ml 농도의 clenbuterol, clenbuterol-d9, ractopamine 표준용액과 20 ng/ml 농도의 zilpaterol, zilpaterol-d7 표준용액 혼합액을 500 μl를 첨가하여 spike sample을 조제한다. 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 균질화한 시료 5 g을 50 ml 원심분리관에 취하여 내부표준용액 500 μl를 넣는다 (clenbuterol-d 9 1 ng/ml, zilpaterol-d 7 10 ng/ml의 농도임) 2) 0.4 N perchloric acid 20 ml을 넣고 15분간 진탕혼합한 후, r/min, 4 에서 15분간 원심 분리한다. 3) 상층액을 모으고 5 M NaOH로 ph 12로 조절한다. (약 1.5 ml 소요) 4) 10 ml ethyl acetate를 넣어 10분간 진탕혼합한 후 r/min, 4 에서 15분간 원심 분리하여 상층액인 ethyl acetate를 모은다. 이 과정을 2번 반복한다. 5) 45, 질소하 농축하고 1 ml 0.01 N HCl로 녹이고 여과하여 분석한다

156 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 Column Acquity BEH C 18 (2.1x50 mm, 1.7 μm) 또는 동등품 Mobile phase A : 0.1 % formic acid in water B : Acetonitrile A와 B의 gradient Column temperature Injection volume 40 5 μl Mobile phase gradient program Time (min) % A % B Flow rate (ml) ) 질량분석기 분석조건 - Ionization : ESI positive - Capillary (V) : Source temperature : 150, Disolvation temperature : Disolvation gas flow (L/hr) : 650, Cone (L/hr) : 50 Compounds Precursor ion (m/z) Clenbuterol Clenbuterol-d Product ion (m/z) Dwell time (sec) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev) Zilpaterol Zilpaterol-d Ractopamine

157 다. 조직표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 0.75, 1.5, 3.0, 6.0 ng/ml의 농도로 혼합표준용액과 내부표준물질clenbuterol-d 9 1 ng/ml, zilpaterol-d 7 10 ng/ml의 농도로 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다. 6. 시험결과 분석 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 물질별 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 물질별 머무름시간을 비교하고 내부표준물질의 정량 이온 면적에 대한 각 물질별 정량이온 면적비를가지고 농도를 계산한다. Fig. 1. LC-MS/MS chromatograms of clenbuterol, zilpaterol, ractopamine and 2 ISTDs (clenbuterol-d 9 and zilpaterol-d 7 ) in bovine liver spiked at 10 ng g

158 Ⅴ-14 Glucocorticoids 잔류분석법 1. 원리 Cortisone, Corticosterone, Aldosterone, Betamethasone, Dexamethasone, Flumethasone, Prednisone, Prednisolone 및 Methylprednisolone를 아세토나이트릴로 추출한 후 LC-MS/MS를 사용하여 정성 정량 분석한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프/질량분석기 (LC-MS/MS) 3. 시험용액 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) 9종 글루코코티코이드계 표준물질 표준물질 10 mg을 칭량하여 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol로 용해한 후 표시선까지 채워 4 냉장 보관한다 (100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution) - 1 단계 working solution : Stock solution을 메탄올로 100배 희석하여 사용한다(1 μg ml -1 ). - 2 단계 working solution : 1단계 woriking solution을 증류수로 100배 희석하여 사용한다 (10 ng/ml). 3) Spike sample 조제 균질화한 시료 2g에 10 ng/ml 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.5 ng/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 4) 3 M 아세테이트 완충용액 (ph 4.6) 1L의 증류수에 sodium acetate (MW 82.03, 98 %) g을 충분히 녹이고 acetic acid로 ph 4.6으로 조정하여 사용한다. 나. 검사방법 1) 시료전처리 (1) 시료 2 g을 50 ml 원심튜브에 취한 후 3 M 아세테이트 완충용액 (ph 4.6) 10 ml을 첨가하고 약 2분간 균질화 한다. (2) 효소 가수분해를 위한 Helix pomatia 로서 β-glucuronidase/arylsulfatase 50 μl를 첨가 하여 1시간 동안 60 의 오븐에 보관한다

159 (3) 상온에서 냉각한 시료에 아세토나이트릴을 8 ml를 첨가하여 r/min 에서 10분간 원심 분리한다. (4) 위 과정을 반복한 후 상층액을 모은 후 50 에서 질소하에서 농축 건조시킨다. (5) 농축 후 남은 잔사를 에탄올 1 ml와 증류수 5 ml로 녹인다. (6) C 18 카트리지 (HLB 500 mg, 6 cc)를 vacuum manifold에 장착한 후 메탄올 5 ml와 증류수 5 ml를 흘려서 활성화한다. (7) (5)의 시료를 카트리지에 적재한 후 아세톤/증류수 (2/8, v/v) 5 ml와 n-헥산 5 ml로 세척한 후, 진공을 이용하여 2분간 카트리지를 건조한다. (8) 에틸아세테이트 6 ml로 용리하여 50 에서 질소하에서 농축 건조시킨다. (9) 남은 잔사를 이동상 1 ml로 녹인 후 -4, r/min, 15 min 동안 원심분리하여 맑은 상층만 취하여 0.2 μm nylon filter로 여과한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 2) 분석조건 (1) 액체크로마토그래프 조건 - 칼럼 : Agilent Eclipse plus C18 ( mm, 1.8 μm) 또는 동등품 - 주입량 : 5 μl - 칼럼온도 : 40 - 이동상 A: 10 mm ammonium formate in water, B: Acetonitrile Time (min) % A % B Flow rate (ml/min) (2) 질량분석기 조건 - Ionization : ESI (positive&negative mode) - Gas temperature : Nebulizer gas : N 2 (45 psi) - Capillary voltage : V - Gas Flow : 10 L/min

160 글루코코티코이드계의 머무름시간, 선구이온 및 생성이온 Analyte Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Fragment Voltage (V) Collision Energy (ev) Polarity Flumethasone 455 Dexanethasone 437 Betamethasone 437 Prednisolone Negative Negative Negative Negative Methyl Prednisolone Negative Prednisone 403 Aldosterone 361 Cortisone 363 Corticosterone Negative Positive Positive Positive 3) 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다. 4) 시험결과 분석 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 물질별 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름시간을 비교하고, 각 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 글루코코티코이드계 약물의 함량을 구한다

161 9종 글루코코티코이드계의 TIC (Total ion chromatogram)와 물질별 정량이온 EIC (Extracted ion chromatogram)

162 Ⅴ-15 NSAIDs 잔류분석법 1. 원리 NSAIDs 계열을 동시분석하기 위하여 시료에 2 mm ammonium formate가 포함된 acetonitrile / water (4:1, v/v)로 추출한 후 Dispersive SPE (C 18 )로 정제한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 분석기기 액체크로마토그래프-질량분석기 (LC-MS/MS) 3. 표준품 및 시약 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : Acetyl salicylic acid, Carprofen, Diclofenac, Phenylbutazone, Flunixin, Ketoprofen, Meloxicam, Oxyphenylbutazone, Paracetamol (acetaminophen), Tolfenamic acid 2) Acetonitrile : LC-MS grade 3) Methanol : LC-MS grade 4) Formic acid : LC-MS grade 5) Ammonium formate : A.C.S 6) C 18 충전제 : 입자크기 37~55 μm, 공극크기 125 A 또는 이와 동등한 것 7) 증류수 : 18 MΩㆍcm 2 이상 나. 기 구 1) 15 ml, 50 ml centrifuge tube 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, μl 4) 마이크로필터 : 0.2 μm filter Whatman, Mini-UniPrep TM PVDF Syringeless filter 100 Units - Cat. No. UN203NPEAQU 5) 원심분리기 6) 정밀저울 (Chemical balance) ± g 정밀도 7) 일반저울 : ± 0.1g 정밀도 8) Vortex mixer

163 9) Multi-mixer ( TAITEC, Vial Mixer, VIX-100) 10) Ultrasonic bath 4. 표준용액, 시험용액 및 첨가시료의 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 각각의 표준품 10 mg (역가 100 %)을 정밀히 달아 100 ml 용량플라스크에 취하여 Methanol에 녹여 표시선 까지 채운 다음 잘 혼합한다 (100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution) : 각 물질별 잔류허용기준을 기준으로 하여validation level Compounds MRL (ng g -1 ) (VL)을 정하고, stock solution을 증류수를 이용하여 각 물질별로 VL의 10배가 되도록 혼합하여 표준 용액으로 사용한다. VL (ng g -1 ) Compounds MRL (ng g -1 ) VL (ng g -1 ) Acetyl salicylic acid Flunixin - 20 Carprofen Ketoprofen Phenylbutazone Meloxicam - 20 Oxyphenylbutazone 1-10 Paracetamol Diclofenac 1-10 Tolfenamic acid Oxyphenylbutazone 및 diclofenac은 phenylbutazone의 대사체임 나. 시험용액 1) 0.1 % formic acid in water (0.1 % FA in water) 증류수 ml에 formic acid 1 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 2) 0.1 % formic acid in acetonitrile (0.1 % FA in MeCN) Acetonitrile ml에 formic acid 1 ml을 넣고 혼합하여 여과하여 사용한다. 3) 200 mm ammonium formate (200 mm AF) 증류수 100 ml에 ammonium formate 1.25g을 넣고 용해하여 사용한다. 다. 첨가시료 (Spiked sample) 균질화한 음성대조시료 2 g에 VL 5배 농도의 희석표준용액을 200 μl 첨가하여 각각의 표준물질이 VL 농도가 되도록 spike sample을 조제하여 매 실험 마다 3개 이상 시험한다

164 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 시료 2 g에 200 mm ammonium formate 0.1 ml과 water 2 ml을 첨가하여 균질화 한후, 추출액 acetonitrile 8 ml을 첨가한다. 2) multi-mixer로 15분간 강하게 진탕 혼합한 후 r/min으로 10분간 원심분리한다. 3) 상층액을 분리하여 C 18 분말 500 mg을 분산시킨 후, hexane 10 ml을 첨가하여 1분간 진탕 혼합한다. 4) r/min으로 5분간 원심분리 하고, hexane층 아래 추출액중 5 ml만을 취해 눈금이 표시된 새로운 튜브로 옮긴후, 40 하에서 1 ml이 되도록 질소 농축한다. 5) 추출액 1 ml중 0.5 ml을 취하여 0.2 μm PVDF syringeless filter로 여과후 분석을 실시한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 Column Mobile phase Column temperature Injection volume C 18 (2.1x50 mm, 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것 A : 0.1 % formic acid in water B : 0.1 % formic acid in MeCN A와 B의 gradient 40 5 μl Mobile phase gradient program Time (min) A (%) B (%) Flow rate (min/ml) ) 질량분석기 분석조건 - Ionization : ESI positive/negative ion switching mode - Capillary (kv) : +4.5, Temperature : Source Temp 150, Desolvation Temp : Gas flow : Desolvation 650 L/hr, Cone 50 L/hr - Nebulizing gas : N 2, 3 L/min - Drying gas : N 2, 15 L/min

165 - Collision gas : Argon, 230 kpa NSAIDs Acetylsalicylic acid Polarity Precursor Ion (m/z) Negative Product Ion (m/z) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev) Carprofen Negative Flunixin Negative Ketoprofen Negative Meloxicam Negative Paracetamol Positive Phenylbutazone Negative Oxyphenyl butazone Negative Diclofenac Negative Tolfenamic acid Negative 나. 표준곡선 작성 Blank를 포함하여 각 물질별 VL (validation level) 농도의 0.5, 1, 2, 3, 5단계로 조직표준곡선 (matrix standard curve)를 작성하여 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토 그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다

166 6. 시험결과 분석 시료의 분석용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 각각에서 얻은 크로마토 그램으로부터 물질별 머무름시간과 특이이온의 검출양상을 비교한다. 표준용액 및 시료의 분석용액의 특이 이온간 ion ratio를 확인하고 정량이온의 평균면적을 구한 다음 표준곡선 좌표의 Y 축에 동일한 값을 표시하고 이 값과 표준 곡선상 만나는 점에서 수직으로 X 축과 만나는 점이 이용해 시료의 농도를 계산한다. Paracetamol > (+) Flunixin > (-) Acetylsalicylic acid >93.10 (-) Carprofen > (-) Ketoprofen > (+) Diclofenac > (-) Oxyphenyl butazone > (-) Phenylbutazone > (-) Meloxicam > (-) Tolfenamic acid > (-) Fig. 1. LC-MS/MS chromatograms of 8 NSAIDs and their metabolites in porcine muscle spiked at 100 ng g

167 Ⅴ-16 호르몬 잔류분석법 1. 원리 DES, Dienestrol, Hexestrol, Altrenogest, Zeranol, Estradiol, Trenbolone acetate, Norgestomet, MPA, Melengestrol acetate, Progesterone, Testosterone, Zearalenone를 1 % acetic acid 포함한 아세토나이트릴로 추출한 후 LC-MS/MS를 사용하여 정성 정량 분석한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프/질량분석기 3. 시험용액 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) 13종 스테로이드성 호르몬 표준물질과 3종 내부표준물질 10 mg을 칭량하여 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol로 용해한 후 표시선까지 채워4 냉장 보관한다 (100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution) - 1 단계 working solution : Stock solution을 메탄올로 100배 희석하여 사용한다(1 μg ml -1 ). - 2 단계 working solution : 1단계 woriking solution을 증류수로 100배 희석하여 사용한다 (10 ng/ml). 나. Spike sample 조제 균질화한 시료 2g에 1 μg ml -1 농도의 표준용액을 20 μl를 첨가하여 10 ng/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 다. 10 mm 아세테이트 완충용액 (ph 4.6) 1 L의 증류수에 sodium acetate (MW 82.03, 98 %) 8.2 g을 충분히 녹이고 acetic acid로 ph 4.6으로 조정하여 사용한다. 4. 검사방법 가. 시료전처리 1) 시료 2 g을 칭량하여 50 ml 원심튜브에 취한 후 10 mm 아세테이트 완충용액 (ph 4.6) 10 ml을 첨가하고 약 2분간 균질화하고 한다

168 2) 효소 가수분해를 위한 Helix pomatia 로서 β-glucuronidase/arylsulfatase 20 μl를 첨가하여 1시간 동안 65 의 오븐에 방치했다. 3) 상온에서 냉각한 시료에 1 % acetic acid 포함한 아세토나이트릴을 8 ml를 첨가하여 r/min 에서 10분간 원심 분리한다. 4) 위 과정을 반복한 후 상층액을 모은 후 50 에서 질소하에서 농축건조시킨다. 5) 농축 후 남은 잔사를 10 % 아세토나이트릴 5 ml로 녹인다. 6) C 18 카트리지 (HLB 500 mg, 6 cc)를 vacuum manifold에 장착한 후 아세토나이트릴 5 ml와 5 % 암모니아를 포함한 아세토나이트릴 5 ml, 10 % 아세토나이트릴을 흘려서 활성화한다. 7) 4)의 시료를 카트리지에 적재한 후10 % 아세토나이트릴 5 ml로 2회 세척한 후, 진공을 이용하여 2분간 카트리지를 건조한다. 8) 5 % 암모니아를 포함한 아세토나이트릴 6 ml로 용리하여 50 에서 질소하에서 농축건조시킨다. 9) 남은 잔사를 50 % 메탄올 1 ml로 녹인 후4, r/min, 15 min 동안 원심분리하여 맑은 상층만 취하여 0.2 μm filter로 여과한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 나. 분석조건 1) 액체크로마토그래프 조건 - 칼럼 : Agilent Eclipse plus C18 ( mm, 1.8 μm) 또는 동등품 - 주입량 : 5 μl - 칼럼온도 : 40 - 이동상 A: 10 mm Ammonium acetate in water, B: Methanol Time (min) % A % B ) 질량분석기 조건 - Ionization : ESI (positive&negative mode) - Gas temperature : Nebulizer gas : N 2 (45 psi) - Capillary voltage : V - Gas Flow : 10L/min

169 스테로이드성 호르몬의 선구이온 및 생성이온, 기기조건 (*내부표준물질) Analyte Precursor ion (m/z) Trenbolone acetate 271 Progesterone 315 Testosterone 331 Norgestomet 373 MPA 387 Melengestrol acetate 397 Altrenogest 311 *Progesterone-d9 324 Dienestrol 265 DES 267 Hexestrol 269 Zeranol 321 Estradiol-17ß 271 Zearalenone 319 *DES-d8 275 *Estradiol-17ß-d4 275 Product ion (m/z) Fragment Voltage (V) Collision Energy (ev) Polarity Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Negative Negative Negative Negative Negative Negative Negative Negative 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 5, 10, 20, 40, 80 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다

170 5. 시험결과 분석 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 물질별 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름시간을 비교하고, 각 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 스테로이드성 호르몬 약물의 함량을 구한다. 13종 스테로이드성 호르몬 및 내부표준물질 3종의 물질별 정량이온 EIC (Extracted ion chromatogram)

171 Ⅴ-17 DES 및 Zeranol 분석법 DES (Diethylstilbestrol)와 zeranol은 가축의 성장 촉진과 사료 효율의 개선을 위하여 주로 사용되는 성장 촉진 호르몬의 일종이다. DES는 내분비교란물질 가운데 처음 알려진 호르몬 이나 발암성 등 안전성에 대한 논란으로 사용이 전면 금지되었다. Zeranol은 간에서 대사되어 주로 담즙으로 배설되는데 zeranol의 대사산물의 잔류는 간에서는 taleranol > zeranol > zearalenone의 순이며, 신장에서는 taleranol > zeranol 순으로 많고 근육에서는 zeranol > zearalenone 순으로 잔류하는 것으로 알려져 있다. 우리나라에서는 축산의 생산성 향상을 위하여 성장 촉진용 호르몬 물질로estradiol, progesterone, zeranol의 사용을 허가하고 있으나, zeranol의 경우 쇠고기에서 2 ng/g의 잔류허용기준을 설정하고 있으며, DES는 식품 중 검출되어서는 아니 되는 물질에 포함되어 있다. 1. 원리 이 방법은 GC-MS를 이용한 방법으로 식육 중hormone 성분을 acetonitrile, 는 글리세라이드와 비극성물질을 제거하여 칼럼의 과부하를 막아 회수율을 높이며 동시에 3개의 극성 구분에 따라 성분들을 분획한다. Acetonitrile 추출액은 농축한 다음 알카리화하여 강염기성 SPE cartridge를 사용하여 DES와 zeranol을 흡착시킨다. 이들 물질은pH 12.0 이상에서 이SPE cartridge에 강한 친화성을 갖는다. SPE cartridge의 간섭물질을 제거하기 위하여 5 % trichloroacetic acid로 세척한다. 이 과정에서 SPE cartridge에 흡착된 다량의 음이온성 간섭물질이 유출된다. SPE cartridge를 25 % methanol을 가하여 씻어내고 methanol을 사용하여 DES와 zeranol을 용출한 후 GC-MS로 분석한다. 2. 측정기기 : 가스크로마토그래프-질량분석기 GC-MSD, Agilent 1100 series 3. 표준품 시약 및 기구 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : Diethylstilbestrol (DES), zeranol 2) 내부표준물질 : D 8 DES (DES 내부표준물질), zearalane (zeranol 내부표준물질) 3) Acetonitrile, methanol, dichlormethane, hexane, isopropanol, ethyl acetate, acetic acid : HPLC grade

172 4) BSTFA (N,O-bis (trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) : Sigma 또는 이와 동등품 5) TMSI (N-trimethylsilylimidazole) : Sigma 또는 이와 동등품 6) β-glucuronidase ( unit ) : Sigma 또는 이와 동등품 7) Sodium acetate, NaOH, Trichloroacetic acid (TCA) : 시약특급 나. 기구 1) Water bath 2) 50 ml centrifuge tube 3) Centrifuge 4) 강염기성 SPE cartridge : Sep-pak Accel QMA, vac 3 cc 또는 이와 동등품 5) Vacuum manifold : J.T. Baker 6) Volumetric flask : 10, 50, 100 ml 7) Evaporator (Turbovap, LV) 8) Vortex mixer 9) 정밀저울 : ± g 정밀도 10) 일반저울 : ±0.01 g 정밀도 11) Filter : Acrodisc 0.20, 0.45 μm 12) 유리시험관 : mm 13) Heating block 4. 시험용액의 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : Zeranol과 zeralene은 각각 20 mg을 취하고, DES와 D 8 DES는 10 mg 씩을 정밀히 달아 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol 20 ml에 잘 녹인 다음 methanol로 표시선까지 채워 잘 혼합한다 (zeranol과 zeralene 200 μg ml -1 과 DES와 D 8 DES 100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution) : Stock solution 각 100 μl씩을 100 ml 용량플라스크에 옮기고 methanol로 표시선까지 채운 다음 잘 혼합하여 표준용액으로 사용한다 (DES 및 D 8 DES 0.1 μg ml -1, zeranol 및 zeralene 0.2 μg ml -1 ). 나. 시험용액 1) 0.04 M sodium acetate : Sodium acetate 3.28 g을 1 L 용량플라스크에 넣고 증류수로 용해한 후 눈금까지 채운다

173 2) 2 N NaOH : NaOH 40 g을 물에 녹여 500 ml까지 물로 희석한다. 3) Isopropanol : MeOH (1:1, v/v) 혼합액 Isopropanol 100 ml과 methanol 100 ml을 혼합하여 사용한다. 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 분쇄된 시료 5 g을 정밀히 달아 50 ml centrifuge tube에 취한다. 2) 제랄란과 D 8 DES 측정용 표준용액 50 μl씩 각각 시료에 가한다. 3) 0.04 M Sodium acetate 완충액 11 ml를 넣고 multi-mixdr로 15분간 진탕 혼합한다. 4) 위의 혼합물에 glacial acetic acid 6 방울을 가하여 ph를 4.25~4.75로 조정한다. 5) 표준곡선을 작성하기 위하여 DES와 zeranol이 함유되지 않은 표준시료 4개에 제랄란과 D 8 DES 측정용 표준용액을 50 μl씩 가한 다음 zeranol과 DES- mg 측정용 표준용액을 0, 25, 50, 100 μl씩 가한다. 6) β-glucuronidase 100 μl (약 단위) 씩 넣고 마개를 막아 10초 동안 잘 혼합한다. 7) 37 incubator에서 16~18시간 (하룻밤) 동안 둔다. 8) 시험관을 incubator에서 꺼내어 acetonitrile을 16 ml 가한 다음 마개를 막고5분 동안 흔들어 준다. 9) 원심분리기에서 r/min으로 5분간 원심분리한 후 상층액을50 ml 유리시험관에 취한다. 10) Dichloromethane 2 ml, n-hexane 8 ml 를 가하여 마개를 막고 1 분 동안 흔들어서 혼합한다. 11) 위의 액을 r/min으로 3분간 원심분리하여 중간의 acetonitrile 층을 다른 유리 시험관으로 옮긴다. 12) 잔류물에 다시 acetonitrile 4 ml을 가하여 1분간 흔들어서 혼합한 후 r/min으로 3분간 원심분리한 다음 acetonitrile 층을 취하여 위의 11) 유리시험관에 합한다. 13) 시료농축기에서 질소하 농축 건조한다. 14) Isopropanol과 methanol 동량 혼합액 2 ml를 가하여 5분간 정치한 후 vortex mixer를 이용하여 건조물을 용해한다. 15) 2 N NaOH 1.5 ml을 가하여 10 초간 혼합한 후 시료용액으로 사용한다. 16) 강염기성 SPE cartridge를 vacuum manifold에 장착한다. 17) 장착된 SPE cartridge는 3 ml methanol, 이어서 3 ml 증류수로 활성화시킨다. 18) 위의 15)의 시료 용액을 SPE cartridge에 서서히 통과시킨다

174 19) Methanol 4 ml, 증류수 2 ml, 5 % TCA 3 ml 및 25 % methanol 2 ml의 순서대로 SPE cartridge를 세척한다. 20) Methanol 3 ml로 cartridge에 흡착되어 있는 DES와 zeranol를 용출시킨다. 21) 용출액을 55 에서 질소하 농축 건조시킨다. 22) 잔류물을 2 % TMSI가 혼합된 BSTFA 용액 20 μl을 가하여 trimethylsilyl 유도체를 만든 후 GC-MS로 분석한다. 나. GC-MS 분석조건 1) Column : DB-5, 0.25 μm, mm 15 mm (Fused Silica Capillary column) 2) 주입구 : heat splitless, 275 3) 캐리어 가스 : Helium 30 cm/sec 4) Source temp.: 250 5) Interface temp.: 260 6) 온도 프로그램 설정 : 100 에서 1.5분간 유지시킨 후 220 까지는 1 분당 30 씩 상승시키고 이후 290 까지는 1 분당 15 씩 상승시키고 나서 290 에서 7.5분간 유지시킴 7) Ionization mode : Electron impact 8) Electron energy : 70 ev 표 1 GC/MS에서의 분석치 물 질 Retention time 물 질 Ions cis DES 6.8 Zearalane 435 trans DES 7.2 Zranol 538, 523, 433, 379 Zearalane 8.5 D 8 DES 420 Zeranol 9.4 DES 412, 397,

175 6. 시험결과 분석 가. Peak 면적이나 높이를 계산한다. 나. 다음과 같은 Ion비율을 구한다. Zeranol : 523/538, 433/538, 379/538 Cis-DES : 397/412 Trans-DES:383/412 다. 다음과 같이 내부표준물질에 대한 표준물질의 면적 혹은 높이비율을 구하여 표준곡선을 작성하기 위한 값을 구한다. Zeranol = Ion 538, 523 및 433의 면적의 합/Ion 435의 면적 합 DES = Ion 412 cis 및 trans 면적의 합/Ion 420 cis 및 trans 면적의 합. 라. 다음 회귀방정식을 이용하여 표준물질의 농도에 따른 ion비를 구하여 표준곡선을 작성한다. 마. 제라놀의 확인은 특이 이온 433, 523, 538 이 함께 검출되어야 한다

176 Ⅴ-18 발네물린 및 티아물린 동시 분석법 1. 원리 Valnemulin과 Tiamulin을 동시분석하기 위하여 시료를 0.01 M HCl이 함유된 acetonitrle 용액으로 추출하여 SPE (MCX cartridge) 정제한 후 5 % ammonia가 함유된 methanol 용액으로 용출하여 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 분석기기 액체크로마토그래프-질량분석기 (LC-MS/MS) 3. 표준품 및 시약 가. 표준품 : Valnemulin, Tiamulin 나. Acetonitrile (MeCN), Hexane, Methanol (MeOH) : HPLC grade 4. 표준용액, 시험용액 및 첨가시료의 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 각각의 표준품 10 mg (역가 100 %)을 정밀히 달아 100 ml 용량플라스크에 취하여 Methanol에 녹여 표시선 까지 채운 다음 잘 혼합한다(100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution): Stock solution 10 ml을 정확히 취하여100 ml 용량플라스크에 옮기고 50 % MeCN로 표시선 까지 채운 다음 잘 혼합하여 표준용액으로 사용한다(10 μg ml -1 ). 이 표준용액으로부터 조직표준곡선(tissue standard curve) 작성과 양성대조시료를 조제하기 위하여 5, 2.5, 1.0, 0.5, 0.1 μg ml -1 가 되도록 50 % MeCN로 희석하여 사용한다. 나. 시험용액 1) 시험용액 A: acetonitrile과 0.01M HCl 용액을 40:60 (v:v) 비율로 섞어 제조하여 사용한다. 2) 시험용액 B: 0.1 % formic acid가 포함된 MeCN 용액과 0.1 % formic acid가 포함된 D.W 용액을 15:85 (v:v)비율로 섞어 제조함 다. 첨가시료 (Spike sample) 균질화한 음성대조시료 1g에 1.0 μg/ml 농도의 희석표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.1 μg/g 농도로 spike sample을 조제하여 매 실험 마다 3개 이상 시험한다

177 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 50 ml 원심분리관에 담은 균질화한 시료 1 g에 시험용액 A 10 ml을 넣어 shaker 300 r/min에 15분간 처리한 후 r/min으로 10분간 원심분리한다. 2) 상층액을 분리하여 새로운50 ml 원심분리관에 취하고 하층에1)과정을 반복하여 상층액을 합친 후 Vortex 한다. 3) 상층액 20 ml에 hexane 20 ml을 넣어 격렬히 혼합한 후 hexane을 제거한다. 4) MeOH, D.W 및 시험용액 A 순으로 각각 3 ml씩 conditioning한 MCX cartridge 에 추출용액을 주입한다. 5) Cartridge를 3 ml 시험용액 A로 헹군 다음 1분간 압력을 걸어 남은 용액을 제거한다. 6) Cartridge 아래부분에 시험관을 장착한 후 ammonia:meoh (5:95, v/v) 용액 3 ml를 가하여 용출한다. 7) 40 질소농축기에서 완전히 건조시킨 후 시험용액 B 1 ml 첨가 후 5분간 초음파 처리하여 r/min으로 10분간 원심분리한 후 분석용액으로 한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 - 칼럼 : YMC pack C 18 ( mm, 3 μm) 또는 동등품 - 이동상 : (A) 0.1 % formic acid in water, (B) 0.1 % formic acid in MeCN (gradient) Time (min) % A % B Flow rotolnol 칼럼온도 : 40 - 주입량 : 10 μl 2) 질량분석기 분석조건 - Ionization: ESI (positive) - Capillary (kv): 3 000, Extractor (V): Temperature: Source Temp 150, Desolvation Temp

178 - Gas flow : Desolvation 650L/hr, Cone 0L/hr 물질명 Precursor Ion (m/z) Product Ion (m/z) Dwell Time (s) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev) Retention Time (min) Valnemulin Tiamulin 나. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)에 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 μg/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하고 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토 그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다. 조직표준곡선 작성을 위한 분석용액 조제 Tissue standard Conc. (μg/ml, g) Working solution (μg/ml) Spiking volume (ml) Test solution B added (ml) % MeOH 시험결과 분석 시료의 분석용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 각각에서 얻은 크로마토 그램으로부터 물질별 머무름시간과 특이이온의 검출양상을 비교한다. 표준용액 및 시료의 분석용액의 특이 이온간 ion ratio를 확인하고 정량이온의 평균면적을 구한 다음 표준곡선 좌표의 Y 축에 동일한 값을 표시하고 이 값과 표준 곡선상 만나는 점에서 수직으로 X 축과 만나는 점이 이용해 시료의 농도를 계산한다

179 Fig. 1. LC-MS/MS chromatograms of Tiamulin and Valnemulin residues in porcine muscle spiked 100 μg/g

180 Ⅴ-19 린코마이신 분석법 1. 원리 시료에 잔류하는 린코마이신을acetonitrile를 가하여 추출하고 감압농축한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 측정기기 : 액체크로마토그래프/질량분석기 (LC-MS/MS) 3. 표준품 시약 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : Lincomycin 2) Acetonitrile, methanol hexane : HPLC grade 3) Formic acid : 시약특급 4) 증류수 : 18 MΩㆍcm 2 이상 4. 시험용액의 제조 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 린코마이신 표준품을 정밀히 달아 증류수에 녹여100 μg ml -1 로 한다. 2)표준용액 (working solution) : 표준원액을 50 % methanol로 적당한 농도로 희석하여 사용한다. 나. Spike sample 조제 균질화한 시료 2g에 1 μg ml -1 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.05 μg/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 균질화한 시료 2 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 acetonitrile 10 ml을 넣어 균질화한 후 r/min, 4 에서 15분간 원심분리한다

181 2) 상층인 acetonitrile 층을 취하여 새로운 튜브에 모은다. 3) 남은 잔사에acetonitrile 10 ml을 넣어 균질화한 후5 000 r/min, 4 에서 15분간 원심분리한다. 4) 모아진 상층액에 hexane 15 ml을 넣고 5분간 혼합한 후 r/min, 4 에서 5분간 원심분리하여 하층인 acetonitrile만 유리튜브에 모아 50 이하의 수욕 중에서 감압 농축한다. 5) 잔류물을 0.1 % formic acid 1 ml에 녹이고 0.2 μm 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 (1) 칼럼 : Agilent Eclipse plus C 18 ( mm, 1.8 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 : (A) 0.1 % formic acid in water (B) acetonitrile (gradient) Time (min) % A % B Flow rate (ml) (3) 칼럼온도 : 40 (4) 주입량 : 10 μl 2) 질량분석기 분석조건 (1) Ionization : ESI positive (2) Capillary (V) : (3) Nebulizer (psi) : 40 (4) Gas Temperature : 325 (5) Gas flow (L/min) : 12 물질명 Precursor ion (m/z) Tiamulin Product ion (m/z) Dwell time(msec) Fragment Voltage(V) Collision Energy(eV) 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 25, 50, 100, 200, 400 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다

182 6. 시험결과 분석 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 린코마이신의 함량을 각각 구한다. Fig. 1. LC-MS/MS chromatogram of lincomycin standards at 50 ng/ml

183 Ⅴ-20 아자페론, 카라졸롤 잔류시험법 1. 원리 시료 중의 azaperone, carazolol을 acetonitrile로 추출하여 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프-질량분석기 Agilent, US/6410 triple-quadrupole mass spectrometer 3. 시험용액 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 표준물질 10 mg을 칭량하여 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol로 용해한 후 표시선까지 채워 4 냉장 보관한다 (100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution) (1) 1 단계 working solution : Stock solution을 메탄올로 100배 희석하여 사용한다(1 μg ml -1 ). (2) 2 단계 working solution : 1단계 woriking solution을 증류수로 100배 희석하여 사용한다 (10 ng/ml). 나. Spike sample 조제 균질화한 시료 2g에 1 μg ml -1 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.05 μg/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 4. 검사방법 가. 시료전처리 1) 시료 2 g을 칭량하여 50 ml 원심튜브에 취한 후 water 1 ml를 가해 약 2분간 균질화하고 10분간 초음파에 방치한 후 다시 2분간 혼합하고 추출액인 acetonitrile을 8 ml 넣고 혼합한 후 r/min에서 10분간 원심분리하여 상층액만 새 원심튜브에 취한다. 2) 남은 잔사에 추출액 5 ml를 넣고 재혼합한 후 원심분리하여 상층액을 합한다. 3) 합해진 상층액을 50 에서 질소하에서 농축건조시킨다. 4) 50 % MeCN 1 ml를 가한 뒤 초음파 세척기에서10분간 방치하여 완전히 용해시킨다

184 5) 위의 혼합액을 -4, r/min, 15 min 동안 원심분리하여 맑은 상층만 취하여 0.2 μm nylon filter로 여과한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 (1) 칼럼 : Agilent Eclipse plus C 18 ( mm, 1.8 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 A: 5 mm ammonium formate, B: acetonitrile (gradient) Time (min) % A % B Flow rate (ml) (3) 칼럼온도 : 실온 (4) 주입량 : 5 μl 2) 질량분석기 분석조건 (1) Ionization : ESI positive (2) Capillary (V) : (3) Gas Temperature : 350 (4) Gas flow (L/min) : 10 (5) Nebulizer (psi) : 40 물질명 Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Dwell time (sec) Fragment Voltage (V) Collision Energy (ev) azaperone carazolol 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 12.5, 25, 50, 100, 200 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다

185 6. 시험결과 분석 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름시간을 비교하고, m/z 164.8, 각 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 azaeprone, carazolol의 함량을 구한다. Carazolol Azajerm Fig. 1. LC-MS/MS chromatograms of azaeprone and carazolol in spiked pork kidney at 25 ng g

186 Ⅴ-21 퀴녹살린계 (카바독스, 올라퀸독스)의 잔류분석법 카바독스 (Carbadox)와 올라퀸독스 (Olaquindox)는 대표적 퀴녹살린계 약물로서 우리나라는 물론 미국 등 각국에서도 돈적리, 돼지의 세균성 장염 등 질병 예방 및 성장촉진 목적으로 널리 사용하여 왔다. 약물동태학적으로 카바독스의 경우 체조직에서 빠르게 N-oxide group이 환원되어 desoxycabadox, quinoxaline-1,4-dii-n-oxide-2-carboxaldehyde, hydrazine, quinoxaine-2 -carboxylic acid (QCA) 등으로 대사되며, 올라퀸독스의 경우도 mono 및 desoxy compound를 거쳐 3-methyl quinoxaine-2-carboxylic acid (MQCA)를 포함하여 약 16종의 대사물질이 생성되는 것으로 보고되고 있다. 최근들어 세계 각국에서는 카바독스와 올라퀸독스 및 대사물질에 대해 발암성, 유전독성 등이 있는 것으로 평가하고 사용을 금하거나 주대사물질을 확인 정량하는등 규제를 강화하고 있는 추세이다. 우리나라에서는 2003년 올라퀸독스, 2005년 카바독스에 대해 각각 배합사료 제조용으로 사용하는 것을 금지하고 불검출 기준 개정 추진 중에 있다. 1. 정량법의 원리 시료를 5 % metaphosphoric acid로 제단백하고 ethyl acetate로 추출하여 농축건조한 후 SPE cartridge를 이용하여 정제과정을 거친 다음 이동상 혼합액으로 용해하여 여과한 후LC-MS/MS를 이용하여 카바독스의 대사물질 QCA와 올라퀸독스의 대사물질 MQCA를 분석한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프-질량분석기 LC-MS/MS (UPLC - Quattro Premier XE/MS Waters, USA) 3. 표준품 시약 및 기구 가.표준품 및 시약 1) QCA (quinoxaine-2 -carboxylic acid) 2) MQCA (3-methyl quinoxaine-2-carboxylic acid) 3) D4-QCA (Quinoxaline-2-carboxylic acid-d4; 내부표준물질) 4) Ethyl acetate: HPLC grade 5) Acetic acid: HPLC grade 6) Methanol: HPLC grade 7) Acetonitrile: HPLC grade

187 8) Metaphosphoric acid: reagent grade 9) 10 M HCl: reagent grade 나. 기 구 1) 50 ml centrifuge tube 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, 1000 μl 4) 마이크로필터 : 0.22 μm filter 5) 원심분리기 6) 정밀저울 (Chemical balance) ± g 정밀도 7) 일반저울 : ± 0.1 g 정밀도 8) Vortex mixer 9) multi-mixer (TAITEC vial mixer, vix-100) 10) Ultrasonic bath (Branson 8510) 11) 질소농축기 (TurboVap r LV, Caliper Lifescience) 12) SPE cargridge (Oasis r MAX 3 cc, 60 mg) 4. 시험용액 조제 가. 표준원액 (Stock solution) 표준품을 각각 10 mg씩 칭량하여 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol 100 ml로 용해한 후 -20 냉동 보관한다 (100 μg ml -1 ). 나. 표준용액 (Working solution) 1) 1 단계 working solution : Stock solution을 증류수로 100배 희석하여 사용 한다(1 μg ml -1 ). 2) 2 단계 working solution : 1단계 woriking solution을 증류수로 10배 희석하여 사용한다 (0.1 μg ml -1 ). 다. 시험용액 1) 5 % metaphophoric acid in 10 % methanol Methanol 100 ml 과 water 900 ml을 섞어 10 % methanol을 만든 후, metaphosphoric acid 50 g을 측량하여 조금씩 부어가며 녹인 후, 1 L를 만든다. 2) 0.1 M HCl in water water에 10 M HCl을 1 ml첨가하여 100 ml을 만든다

188 3) 0.1 M HCl in 90 % methanol 90 % methanol을 만든 후, 10 M HCl을 1 ml첨가하여 100 ml을 만든다. 4) 이동상 A: acetonitrile 100 ml, methanol 100 ml, 증류수 796 ml 과 acetic acid 4 ml을 잘 섞은 후 0.2 μm 필터로 여과하여 사용한다. 라. Spike sample 조제 균질화한 시료 5g에 0.1 μg ml -1 농도의 표준용액을 200 μl를 첨가하여 4 ng/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 5. 검사 방법 가. 시료전처리 방법 균질화된 시료 (근육, 간, 신장) 5 g에 내부표준물질인 d4-qca (70 ng/ml) 100 μl와 5 % metaphosphoric acid in 10 % MeOH 10 ml을 넣고 진탕혼합한 후, 30, r/min에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 잔사에 다시 5 % metaphosphoric acid in 10 % MeOH 10 ml을 넣고 진탕 혼합한 후, 30, r/min에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취한 후 이전의 상층액과 합한다. 이 상층액에 ethyl acetate 10 ml을 첨가하여 15분간 진탕 혼합하여, 30, r/min에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취한다. 이 과정을 한번 더 반복하여 취한 상층액을 합하여 60 에서 질소 농축시킨다. 잔류물을 0.1 M HCl 5 ml에 녹인 후, 미리 3 ml methanol과 3 ml 증류수로 활성화시킨 SPE (Oasis r MAX 3cc, 60 mg) cartridge에 녹여놓은 잔류물을 대략 분당 1 ml의 속도로 통과시킨다. 3 ml 증류수로 세척하고 약 5 분정도 vacuum을 이용하여 말린 후 0.1 M HCl in 90 % MeOH 3 ml로 용출한 다음60 에서 질소하 농축 건조시킨다. 이를 이동상 A 0.5 ml로 용해하여 10분간 초음파로 완전히 용해시킨 다음 0.2 μm nylon syringe filter로 여과하여 시료용액으로 사용하였다. 나. 분석 조건 1) UPLC 분석조건 (1) 컬 럼: ACQUITY UPLC TM BEH C 18 ( mm, 1.7 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 : 이동상 A / 이동상 B 의 gradient (3) 칼럼온도 : 35 (4) 주입량 : 10 μl

189 Table 1. Analytical conditions of quinoxalines by LC-MS/MS Compounds Column Mobile phase Detection QCA, MQCA d4-qca ACQUITY UPLC TM BEH C 18 ( mm, 1.7 μm) A : MeCN : MeOH : D.W : acetid acid = 10 : 10 : 79.6 : 0.4 B : MeOH A와 B의 gradient Injection volume : 10 μl MS/MS ESI(+) mode Table 2. Mobile phase gradient program Time (min) A (%) B (%) Flow rate (min/ml) ) 질량분석기 조건 (1) Ionization : ESI (positive) (2) Capillary (kv) : 4.00 Extractor (V) : 0.3 (3) Temperature : Source Temp 150 Desolvation Temp : 300 (4) Gas flow : Desolvation 500 L/hr Cone 50 L/hr (5) Auxiliary Gas : 질소 Collision Gas : 아르곤 Table 2. Multiple reaction monitoring parameter of quinoxalines in LC-MS/MS 물질명 Precursor ion (m/z) QCA MQCA 189 d4-qca Product ion (m/z) Dwell time (s) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev)

190 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0, 16.0 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다. 6. 시험결과 분석 표준용액 10 μl를 위의 분석 조건에 따라LC-MS/MS로 분석하여 각 분석물질별 특이이온을 확인한다. 시료용액 분석에서 얻은 크로마토그램에서 폴리에테르계 항균물질의 각 물질에 대하여 주요 이온이 일치되는 피크에 대한 평균면적을 구한 다음 이를 동일농도로 첨가된 내부표준물질의 평균면적으로 나눈 값을 표준곡선 좌표의Y 축에 표시하고 이 값과 표준곡선상 만나는 점에서 수직으로 X 축과 만나는 점이 시료용액의 농도를 나타낸다. 이 농도에 시료용액의 희석배수 (건조물에 가한 이동상의 부피)를 곱하고 시료 무게로 나누어 최종 시료 중 각 퀴녹살린계 항균물질의 농도를 산출한다. Fig 1. LC-MS/MS chromatograms of QCA and MQCA standards

191 Ⅴ-22 니트로푸란계 잔류분석법 니트로푸란제는 5-니트로기를 갖는 모노니트로화합물군에 속하는 광범위 합성항균제로서 대표적인 약물로는 furazolidone, furaltadone, nitrofurazone, nitrofurantoin 등이 포함된다. 이들 약물은 최근까지도 수의임상에서 주로 소, 돼지, 가금에서 Escherichia coli, Salmnonella spp. 등에 의한 세균성 장염, 콕시듐 등 각종 질병을 예방하거나 성장을 촉진할 목적으로 사료 첨가제나 음수용 제제로서 널리 사용되었다. 그러나 니트로푸란제는 니트로기의 효소적 환원 과정에서 생성된 대사물질에 의해 유발되는 변이원성과 발암성 때문에 유럽연합(EU)에서는 1995년 furazolidone에 이어 1997년부터는 식용동물에서 모든 니트로푸란제의 사용을 금지 하였다. 또한 미국에서는 이전까지 furazolidone과 nitrofurazone에 대해서는 국소적인 사용을 허용하여 왔으나 2002년 5월부터 전면적으로 사용을 금지하였고, 국내에서도 2003년 2월부터 국내 제조 및 수입을 전면 금지하였다. 니트로푸란제는 경구투여 후 빠르게 흡수되어 간, 신장, 지방, 근육 등에 분포하며 주로 뇨로 배출되는데, 원물질은 체내에서 반감기가 수시간에 지나지 않고 빠르게 대사되어 검출하기 어려우나 조직결합형 대사물질은 원물질보다 안정하여 수주까지 잔류하므로 표적 잔류물질 (marker residue)로서 니트로푸란제의 불법사용에 따른 조직내 잔류물질검사 목적으로 활용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 니트로푸란제의 조직결합형 대사물질은 furazolidone의 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), furaltadone의 3-amino-5-morpholinomethyl-1,3-oxazolidin-2-one (AMOZ), nitrofurazone의 semicarbazide (SEM), nitrofurantoin의 1-aminohydantoin (AHD) 등이 알려져 있으며, 특히, nitrofurazone의 대사물질인 SEM (Semicarbazide)은 병가스캣 제품이나 밀가루 함유제품 뿐만 아니라 해조류 등의 자연계 존재, 식품 가공공정에서의 생성 등 다양한 생성경로가 확인됨에 따라 SEM에 대한 기준 및 검사에 있어 대상 식품을 단순 축산물 및 동물성 수산물 (raw material)에 한하여 적용하고 있다. 이들 대사물질은 분자량이 적고 UV 흡광능력이 낮아 2-nitrobenzaldehyde (NBA)와 같은 시약으로 유도체화한 화합물을LC-MS/MS를 이용하여 주로 분석하고 있다. 1. 원 리 시료 중의 furazolidone, furaltadone, nitrofurazone 및 nitrofurantoin의 대사물질을 HCl 용액으로 처리하여 nitrobenzialdehyde (NBA)로 유도체화한 후 ethyl acetate로 추출 농축하여 액체크로 마토그라프/질량분석기 (LC-MS/MS)로 분석한다

192 2. 측정기기 액체크로마토그래프-질량분석기 LC-MS/MS (Waters Micormass Quattro micro TM triple-quadrupole mass spectrometer) 3. 표준품 시약 및 기구 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : Semicarbazide (SEM), 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone (AMOZ), 1-aminohydantoin (AHD) 2) 내부표준품 : 3-amino-2-oxazolidinone-D 4 (AOZ-D 4 ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone-D 5 (AMOZ-D 5 ) 3) 2-Nitrobenzaldehyde (NBA, MW , 99 %) : 시약특급 4) Acetonitrile : HPLC grade 5) n-hexane : HPLC grade 6) Dichloromethane : HPLC grade 7) Methanol : HPLC grade 8) Ethyl acetate : HPLC grade 9) Acetic acid : 시약특급 10) A mmonium acetate (MW 77.08, 98 %) : 시약특급 11) Dipotassium phosphate (K 2 PHO 4, MW 174.2, 99.2 %) : 시약특급 12) Dimethyl sulfoxide (DMSO) : 시약특급 13) Hydrochloride (HCl) : 시약특급 14) 증류수 : 18 MΩㆍcm 2 이상 나. 기구 1) 50 ml 원심분리용 튜브 2) 유리시험관 : 160 x 100 mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, 1000 μl 4) 마이크로필터 : 0.20 μm, 0.45 μm 5) 원심분리기 6) 질소농축기 (Turbo Vap R LV), Caliper Life science 7) 수소이온농도측정기

193 8) 정밀저울 (Chemical Balance) ± g 정밀도 9) 일반저울 : ± 0.1 g정밀도 10) Ultrasonic bath (Branson 8510) 11) Vortex mixer 12) Shaking water bath 13) multi-mixer (TAITEC vial mixer, vix-100) 4. 시험용액의 조제 가. 표준용액 1) Stock solution : 각각의 니트로푸란제 대사물질 표준품 (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 10 mg을 정밀히 달아 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol로 녹인 다음 표시선 까지 채워 녹인다 (100 μg ml -1 ). 2) Working solution : Stock solution 10 ml을 정확히 취하여 100 ml 용량플라스크에 옮기고 acetonitrile로 표시선까지 채운 다음 잘 혼합하여 표준용액으로 사용 한다 (10 μg ml -1 ). 나. 내부표준용액 1) Stock solution : 각각의 내부표준용액 표준품10 mg을 정밀히 달아100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol로 녹인 다음 표시선까지 채워 녹인다 (100 μg ml -1 ). 2) Working solution : Stock solution 10 ml을 정확히 취하여 100 ml 용량플라스크에 옮기고 acetonitrile로 표시선까지 채운 다음 잘 혼합하여 표준용액으로 사용 한다 (10 μg ml -1 ). 다. 시험용액 1) 이동상용액 (1) 5 mm ammonium acetate in 20 % methanol (A sol.) 증류수 800 ml에 methanol 200 ml를 혼합한 후 ammonium acetate 0.39 g을 녹여 용매 여과장치 (0.2 μm membrane filter)로 여과하여 사용한다. (2) 5 mm ammonium acetate in 90 % methanol (B sol.) 증류수 100 ml에 methanol 900 ml를 혼합한 후 ammonium acetate 0.39 g을 녹여 용매 여과장치 (0.45 μm membrane filter)로 여과하여 사용한다. 2) 시험용액 조제 (1) 0.05 M NBA (유도체화 용액) : 2-Nitrobenzaldehyde g을 dimethylsulfoxide (DMSO) 100 ml에 녹여 갈색병에 담아 유도체화 시약으로 사용한다. 이 용액은 사용 직전에 만들어 사용한다

194 (2) M HCl : : 증류수 975 ml에 5 M HCl 용액 25 ml를 가하여 혼합한다. (3) 0.1 M K 2 HPO 4 : 증류수 900 ml에 K 2 HPO g을 가하여 녹인 후 1 L로 맞춘다. (4) 1 M NaOH : 1M NaOH 용액을 그대로 이용한다. (5) 50 % MeCN : 증류수 50 ml에 acetonitrile 50 ml를 가해 잘 혼합한다. 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 시료 1 g을 평량하여 50 ml 원심분리용 튜브에 담는다. 2) 내부표준용액 (100 ng/ml) 40 μl를 첨가한 후 15분간 정치한다. 3) M HCl 용액 10 ml와 유도체화 용액(0.05 M NBA) 100 μl를 넣고 37 수욕조에서 16시간 진탕한다. 4) 유도체화한 시료를 실온으로 냉각한 후 0.1 M K 2 HPO 4 10 ml과 1 N NaOH 1 ml를 가하여 약 ph 7.4로 조정한다. 5) 잔사를 제거하기 위해5 000 r/min에서 5분간 원심분리를 하고 상층액을 새로운 원심관에 옮겨 n-hexane 10 ml를 가하여 혼합한 후 r/min에서 15분간 원심분리한다. 6) 하층을 새로운 원심관에 취하고 ethyl acetate 7 ml를 가하여 혼합하고 r/min에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하여 유리시험관에 담는다. 7) 이런 과정을 2 회 반복하여 얻어진 상층액을 질소하 (40 )에서 농축 건조한다. 8) 50 % methanol 1 ml를 넣어 초음파로 완전 용해한 후 eppendorf tube로 옮겨 r/min에서 15분간 원심분리를 한다. 9) 상층액을 0.20 μm filter로 여과하여 시험용액으로 한다. 1 g sample in 50 ml centrifuge tube and add 40 μl internal standard Add 10 ml M HCl and 100 μl 0.05 M NBA and mix gently Incubation for hour on shaking water bath Adjust to ph 7.4 with 10 ml 0.1 M K 2 HPO 4 and 1 ml 1 N NaOH

195 Centrifuge at r/min, 5 min and transfer the supernatant into new tube Add 10 ml hexane, mix and centrifuge at r/min, 5 min Transfer the aquatic lower phase into new tube Add 7 ml ethyl acetate and centrifuge at r/min, 10 min Transfer the supernatant into glass tube, repeat 2 times Evaporate to dryness (40 ) Dissolve with 1 ml 50 % methanol solution Filter with 0.20 μm syringe filter Inject into LC-MS/MS Fig. 1. The sample preparation scheme of nitrofuran metabolites in animal origin samples. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 (1) 칼럼 : XTerra C 18 ( mm, 3.5 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 : A 용액 (5 mm ammonium acetate in 20 % MeOH) B 용액 (5 mm ammonium acetate in 90 % MeOH) (3) 유속 : 0.2 ml/min - Gradient 조건 시간 (분) % A % B 유속

196 2) 질량분석기 분석조건 - Electrospray ionizaton (ESI) positive mode Compound Precursor ion (m/z) AOZ 236 AMOZ 335 AHD 249 SEM 209 Product ion (m/z) Dwell time (s) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev) D D 다. 표준곡선 작성 1) 표준용액의 유도체화 음성 시료 1 g을 50 ml 원심 튜브에 넣고 니트로푸란제 대사물질 혼합표준용액 100 ng/ml를 200, 100, 40, 20, 10 μl를 취하여 내부표준용액 (100 ng/ml) 40 μl를 넣고 15분간 방치한 후 M HCl 용액 10 ml를 넣고 잘 혼합한 다음 0.05 M NBA 용액 100 μl를 넣고 1분간 혼합하여 준 후 37 에서 16시간동안 진탕한다. 2) 표준곡선의 작성 유도체화 된 표준용액을 시료와 동일한 과정을 통하여 에칠아세테이트로 추출 정제하여 6개 농도의 표준용액을 10 μl씩 주입하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 니트로푸란제 대사물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다. 6. 실험결과 분석 유도체화한 시험용액 10 μl를 위의 분석조건에 따라 LC-MS/MS에 주입하여 각 분석물질별 특이이온을 확인한다. 시료용액 분석에서 얻은 크로마토그램에서 각각의 니트로푸란제 대사물질에 대하여 특이이온을 확인한 후 정량이온이 일치되는 대사물질 피크에 대한 평균면적을 구한 다음 표준곡선 좌표의 Y 축에 동일한 값을 표시하고 이 값과 표준곡선상 만나는 점에서 수직으로 X 축과 만나는 점이 시료용액의 농도를 나타낸다. 이 농도에 시료 용액의 희석배수 (건조물에 가한 이동상의 부피)를 곱하고 시료 무게로 나누어 최종 시료 중 각 대사물질의 농도를 산출한다

197 Fig. 1. Mass chromatograms of 4 nitrofuran metabolites

198 Ⅴ-23 디메트리다졸, 메트로니다졸, 로니다졸 동시 분석법 1. 원리 시료에 ethyl acetate를 가하여 추출하고 감압농축한 후 HPLC-UVD 또는 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기 (HPLC-UVD) 또는 LC-MS/MS (Triple-quadrupole mass spectrometer) 3. 표준품 시약 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : Dimetridazole, ronidazole, metronidazole 2) Acetonitrile, ethyl acetate, methanol, hexane : HPLC grade 3) NH 4 H 2 PO 4 : 시약특급 4) 증류수 : 18 MΩㆍcm 2 이상 4. 시험용액의 제조 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 디메트리다졸, 메트로니다졸 및 로니다졸 표준품 을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 2) 표준용액 (working solution) : 표준원액을 25 % Acetonitrile에 적당한 농도로 희 석하여 사용한다. 나. Spike sample 조제 균질화한 시료 5g에 1μg ml -1 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.02 μg/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 다 M 인산완충용액 (ph 7.0) 1 L 플라스크에 NH 4 H 2 PO g을 넣고 물로 표시선까지 채운다

199 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 균질화한 시료 5 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 ethyl acetate 20 ml을 넣어 균질화한 후 r/min, 4 에서 15분간 원심분리한다. 2) 상층인 ethyl acetate 층을 취하여 40 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한 후 잔류물을 증류수 1 ml에 녹이고 0.2 μm 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석 조건 (1) 칼럼 : C 18 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 (2) 이동상 : 0.05 M 인산완충용액 : acetonitrile (88:12, v/v) (3) 유속 : 1.0 ml/min (4) 측정파장 : UV 312 nm 2) LC-MS/MS 분석 조건 (1) HPLC 분석조건 1 칼럼 : Agilent Eclipse plus C 18 ( mm, 1.8 μm) 또는 동등품 2 이동상 : (A) 0.1 % formic acid in water (B) acetonitrile (gradient) Time (min) % A % B Flow rate (ml) 칼럼온도 : 40 4 주입량 : 10 μl (2) 질량분석기 분석조건 1 Ionization : ESI positive 2 Capillary (V) : 다) Nebulizer (psi) : 40 3 Gas Temperature :

200 4 Gas flow (L/min) : 12 물질명 Precursor ion (m/z) Dimetridazole Metronidazole Ronidazole Product ion (m/z) Dwell time (msec) Fragment Voltage (V) Collision Energy (ev) 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 25, 50, 100, 200, 400 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다. 6. 시험결과 분석 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체중 디메트리다졸, 메트로니다졸 및 로니다졸의 함량을 각각 구한다. - 정량한계 (0.02 mg/kg) Fig. 1. HPLC chromatogram of metronidazole (MDZ), ronidazole (RDZ), and dimetridazole (DMZ) standards at 20 ng/ml (A), and blank sample (B)

201 Fig. 2. LC-MS/MS chromatogram of metronidazole, ronidazole, and dimetridazole standards at 50 ng/ml

202 Ⅴ-24 클로르프로마진, 피리메타민, 콜치신 잔류분석법 1. 원리 시료 중의 chlorpromazine, pyrimethamine, colchicine을 ethyl acetate로 추출하고 농축한 후 여과하여 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프-질량분석기 LC-MS/MS (Waters r Micormass r Quattro micro TM API triple-quadrupole mass spectrometer) 3. 시험용액 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 각 표준물질 10 mg을 칭량하여 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol로 용해한 후 표시선까지 채워 4 냉장 보관한다 (100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution) 가) 1 단계 working solution : Stock solution을 메탄올로100배 희석하여 사용한다(1 μg ml -1 ). 나) 2 단계 working solution : 1단계 woriking solution을 증류수로 100배 희석하여 사용한다 (10 ng/ml). 나. Spike sample 조제 균질화한 시료 2g에 10 ng/ml 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.5 ng/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 4. 검사방법 가. 시료전처리 1) 균질화 된 시료 2 g에 증류수 2 ml를 넣고 multi-mixer로 15분간 진탕 혼합한다. 2) Ethyl acetate 10 ml를 50 ml centrifuge tube에 넣고 multi-mixer로 15분간 진탕 혼합한다. 3) -4, r/min에서 15분간 원심분리하여 상층액을 유리시험관에 모은다. 4) 남은 잔사에ethyl acetate 10 ml를 넣고 위의2)와 3)의 과정을 반복하여 상층액을 합한다. 5) 모아진 상층액을 40, 질소하 농축 건조한다. 6) 농축된 시료에 25 % methanol 1 ml을 넣어 완전 용해한 후 초음파에10분간 방치한다

203 7) 상층액을 취하여 eppendorf tube에 넣는다. 8) -4, r/min에서 15분간 원심분리하고 상층액을 취하여 0.20 μm filter로 여과한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 (1) 칼럼 : XBridge C 18 ( mm, 3.5 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 : 0.1 % formic acid in water (A), 0.1 % formic acid in MeCN (B) (3) 유속 : 0.25 ml/min - Gradient 조건 Time (min) A (%) B (%) Flow rate (ml) ) 질량분석기 분석조건 - Electrospray ionization positive mode Compound Precursor ion (m/z) Pyrimethamine Colchicine Chlorpromazine Product ion (m/z) Dwell time (s) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev) 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각 LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다

204 5. 시험결과 분석 표준용액 10 μl를 위의 분석 조건에 따라LC-MS/MS로 분석하여 각 분석물질별 특이이온을 확인한다. 시료용액 분석에서 얻은 크로마토그램에서 각 물질에대하여 주요 이온이 일치되는 대사물질 피크에 대한 평균면적을 구한 다음 표준곡선 좌표의Y 축에 동일한 값을 표시하고 이 값과 표준곡선상 만나는 점에서 수직으로X 축과 만나는 점이 시료용액의 농도를 나타낸다. 이 농도에 시료용액의 희석배수 (건조물에 가한 이동상의 부피)를 곱하고 시료 무게로 나누어 최종 시료 중 각 대사물질의 농도를 산출한다. 6. 물질별 정량한계 가. 클로르프로마진 : 1 ng/g 나. 콜치신 : 1 ng/g 다. 피리메타민 : 0.5 ng/g

205 Ⅴ-25 반코마이신 (Vancomycin) 잔류분석법 1. 원리 시료 중의 vancomycin을 20 % acetonitrile로 추출하고 SPE (Solid Phase Extraction) 칼럼으로 정제하여 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 분석기기 : 액체크로마토그래프/질량분석기 3. 표준품 및 시약 가. 표준품 : vancomycin 나. Acetonitrile, methanol, hexane : HPLC grade 다. A mmonium hydroxide, formic acid : 시약특 급 라. SPE cartridge : X-C ( styrene-divinylb enzene p olymer s urf ac ed w ith a strong cation exchanger group) 또는 MCX (Mixed Mode Cation Exchange) 칼럼 카트리지 (60 mg, 3 ml) 또는 이와 동등한 것- 강 양이온성 칼럼에 해당됨 4. 시험용액의 조제 가. 표준원액 (stock solution) Vancomycin 표준품을 정밀히 달아 증류수에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 나. 표준용액 (working solution) 표준원액을 25 % Acetonitrile에 100 ng/ml 농도로 희석하여 사용한다. 다. Spike sample 조제 균질화한 시료 5g에 100 ng/ml 농도의 표준용액을 50 μl를 첨가하여 1 ng/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 균질화한 시료 5 g을 50 ml 원심 분리관에 취하고20 % acetonitrile 15 ml를 가한 후20분간 균질화한 후, G에서 10분간 원심분리하고 상층액을 50 ml 원심 분리관에 옮긴다

206 2) 남은 액에 20 % acetonitrile 10 ml를 가하여 위의 과정을 반복한 후 상층액을 합한다. 3) 이 상층액에 hexane 10 ml를 가하고 10분간 균질화한 후, g에서 원심분리하고 하층액을 취한다. 4) 위의 과정을 반복하여 하층액을 합하여 추출액으로 한다. 5) 미리 메탄올 3 ml와 증류수 3 ml 그리고 0.1 % formic acid 3 ml로 활성화시킨 X-C 카트리지에 추출용액을 흡착시킨다. 6) 증류수 3 ml로 카트리지를 세척하여 버리고 메탄올 : 수산화암모늄 (97 : 3) 혼합용액 3 ml로 용출시킨다. 7) 용출액을 50 에서 질소로 농축시킨 시험관에 증류수1 ml를 넣고 녹인 후 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 (1) 칼럼 : Agilent Eclipse plus C 18 ( mm, 1.8 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 : (A) 0.1 % formic acid in water (B) acetonitrile (gradient) Time (min) % A % B Flow rate (ml) (3) 칼럼온도 : 40 (4) 주입량 : 10 μl 2) 질량분석기 분석조건 (1) Ionization : ESI positive (2) Capillary (V) : (3) Nebulizer (psi) : 40 (4) Gas Temperature : 325 (5) Gas flow (L/min) : 12 물질명 Vancomycin Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Dwell time (sec) Fragment Voltage (V) Collision Energy (ev)

207 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다. 6. 시험결과 분석 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 물질의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름시간을 비교하고, 반코마이신은 m/z 144 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 반코마이신의 함량을 구한다. 정량한계 : 1 ng/g Fig. 1. LC-MS/MS chromatogram of vancomycin standards at 1 ng/ml. x Product Ion:4 (0.242 min) ( > **) Vancomycin_pi_0001.d C ou n ts vs. M as s-t o- Ch ar ge ( m/ z) Fig. 2. Vancomycin spectrum

208 Ⅴ-26 티오우라실 (Thiouracil) 잔류분석법 사용금지 동물약품 12 항목에 thiouracil이 포함되어 미국 FSIS (Food Safety and Inspection Service)의 잔류시험법을 사용하고 있음 1. 원리 시료 중의 thiouracil을 acetonitrile로 추출하고 SPE (Solid Phase Extraction) 칼럼으로 정제하여 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 분석기기 액체크로마토그래프/질량분석기 3. 표준품 및 시약 가. 표준품 : 6-phenyl-2-thiouracil, 6-methyl-2-thiouracil, 6-p ropyl-2-thiouracil 및 2-thiouracil 나. Acetonitrile, methanol, dichloromethane : HPLC grade 다. Formic acid : 시약특 급 라. SPE cartridge : S PE용 S ilica gel 카 트리지 ( 500 mg, 10 ml)에 무수 황산나 트륨 (sodium sulfate) 1 g을 가한 것 또는 이와 동등한 것 4. 시험용액의 조제 가. 표준원액 (Stock solution) 2-thiouracil, 6-methyl-2-thiouracil, 6-propyl-2-thiouracil 및 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 6-phenyl-2-thiouracil 표준품을 나. 표준용액 (Working solution) Stock solution을 메탄올로 100배 희석하여 사용한다 (1 μg ml -1 ). 다. Spike sample 조제 균질화한 시료 5g에 1 μg ml -1 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 0.02 μg/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다

209 5. 검사방법 가. 시료전처리 1) 균질화 한 시료 5 g을 50 ml 원심 분리관에 취하고acetonitrile 10 ml를 가한 후 5분간 균질화 한다. 2) 균질화한 용액을 G에서 5분간 원심분리하고 상등액 중 5 ml를 취하여 시험관에 옮긴 후 이를 60 이하에서 질소 농축한다. 3) Dichloromethane 0.5 ml에 충분히 녹인 후 5분간 초음파 추출한다. 4) 이 추출액을 Dichloromethane 2 ml로 미리 활성화시킨 무수황산나트륨 함유 silica gel SPE cartridge에 흡착시키고 dichloromethane 0.5 ml로 추출액을 담았던 시험관에 가하여 초음파 추출하여 카트리지에 흡착시킨다. 5) 추출액이 흡착된 카트리지를 dichloromethane 2 ml로 씻어주고, 시험관에 다시 methanol : dichloromethane (25 : 75, v/v) 혼합용액 2 ml를 가하고 1분간 초음파 추출한 용액으로 용출한다. 6) 용출액을 60 이하에서 질소 농축하고methanol 200 μl와 0.1 % formic acid 400 μl를 가하여 충분히 녹인 후 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 (1) 칼럼 : Agilent Eclipse plus C 18 ( mm, 1.8 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 : (A) 0.1 % formic acid in water (B) acetonitrile (gradient) Time (min) % A % B Flow rate (ml) (3) 칼럼온도 : 40 (4) 주입량 : 10 μl 2) 질량분석기 분석조건 (1) Ionization : ESI positive (2) Capillary (V) :

210 (3) Nebulizer (psi) : 40 (4) Gas Temperature : 325 (5) Gas flow (L/min) : 12 물질명 6-phenyl-2-TU 6-propyl-2-TU 6-methyl-2-TU 2-thiouracil Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Dwell time (sec) Fragment Voltage (V) Collision Energy (ev) 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 μg ml -1 의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다. 6. 시험결과 분석 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 물질별 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고 각각의 피크에 대한 평균면적 으로 검량선을 작성하여 시험용액 중 2-thiouracil, 6-methyl-2-thiouracil, 6-propyl-2-thiouracil 및 6-phenyl-2-thiouracil의 함량을 각각 구한다. 각각의 함량을 합하여 검체 중 thioudracil의 함량으로 한다. 정량한계 : mg/kg

211 2-thiov rac il 6-methy1-2-T U 6-puopy1-2-TU 6-phenyl-2-TU Fig. 1. LC-MS/MS chromatograms of 4 thiouracil

212 Ⅴ-27 메드록시프로게스테론 아세테이트 잔류분석법 1. 원리 시료 중의 medroxyprogesterone acetate를 acetonitrile로 추출하여 LC-MS/MS로 분석한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프-질량분석기 LC-MS/MS (Waters r Micormass r Quattro micro TM API triple-quadrupole mass spectrometer) 3. 시험용액 조제 가. 표준용액 1) 표준원액 (Stock solution) : 표준물질 10 mg을 칭량하여 100 ml 용량플라스크에 취하고 methanol로 용해한 후 표시선까지 채워 4 냉장 보관한다 (100 μg ml -1 ). 2) 표준용액 (Working solution) (1) 1 단계 working solution : Stock solution을 메탄올로 100배 희석하여 사용한다(1 μg ml -1 ). (2) 2 단계 working solution : 1단계 woriking solution을 증류수로 10배 희석하여 사용한다 (100 ng/ml). 나. Spike sample 조제 균질화한 시료 2g에 100 ng/ml 농도의 표준용액을 100 μl를 첨가하여 5 ng/g 농도로 spike sample을 조제하여 사용한다. 매 실험마다 3개 이상 시험한다. 4. 검사방법 가. 시료전처리 1) 시료 2 g을 칭량하여 50 ml 원심튜브에 취한 후 water 1 ml를 가해 약 2분간 균질화하고 10분간 초음파에 방치한 후 다시 2분간 혼합하고 추출액인 acetonitrile을 8 ml 넣고 혼합한 후 r/min에서 10분간 원심분리하여 상층액만 새 원심튜브에 취한다. 2) 남은 잔사에 추출액 5 ml를 넣고 재혼합한 후 원심분리하여 상층액을 합한다. 3) 합해진 상층액에 hexane 5 ml를 가하고 약 2분간 vortexing 후, r/min에서 5분간 원심한 후 hexane층은 버리고 유리튜브에 하층인 추출액만 취하여50 에서 질소하에서 농축건조시킨다

213 4) 50 % MeOH 1 ml를 가한 뒤 초음파 세척기에서10분간 방치하여 완전히 용해시킨다. 5) 위의 혼합액을 -4, r/min, 15 min 동안 원심분리하여 맑은 상층만 취하여 0.2 μm nylon filter로 여과한 후 LC-MS/MS로 분석한다. 나. 분석조건 1) HPLC 분석조건 (1) 칼럼 : XBridge C 18 ( mm, 3.5 μm) 또는 동등품 (2) 이동상 : 0.1 % formic acid in water (A), 0.1 % formic acid in MeCN (B) (3) 유속 : 0.25 ml/min - Gradient 조건 Time (min) A (%) B (%) Flow rate (ml) ) 질량분석기 분석조건 - Electrospray ionization positive mode Compound Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Dwell time (s) Cone Voltage (V) Collision Energy (ev) MPA ) 질량분석기 조건 (1) Ionization : ESI (positive) (2) Capillary Temperature : 350 (3) Collision gas : Ar 다. 표준곡선 작성 분석시료와 동일하게 전처리한 6개의 음성대조시료 (blank sample)의 잔사를 재용해할 때 각각 0, 2.5, 5, 10, 20, 40 ng/ml의 농도로 혼합표준용액을 첨가하여 각각LC-MS/MS로 분석하여 얻은 크로마토그램에서 각각의 표준물질에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X 축을 농도, Y 축을 면적으로 하여 표준곡선을 작성한다

214 6. 시험결과 분석 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름시간을 비교하고, m/z 327 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 medroxyprogesterone acetate의 함량을 구한다. 정량한계 : 5 ng/g Fig. 1. LC-MS/MS chromatograms of MPA in spiked pork muscle at 10 ng/g

215 Ⅴ-28 유기염소계 농약 잔류분석법 1. 원리 식육에 잔류하는 농약성분을 1 % acetic acid가 첨가된 acetonitrile로 추출한 다음 Carbon/PSA SPE 카트리지로 정제하여 기체크로마토그래프/전자포획검출기 (GC/ECD)로 분석한다. 이 방법은 식육의 유기염소계 및 그 밖의 유기인계, 아졸계 등 다성분 농약 (γ-bhc, heptachlor, chlorpyrifos-methyl, dimethipin, aldrin, triadimefon, chlorpyrifos, fenitrothion, heptachlor-epoxide, chlorfenvinphos trans-chlordane, 2,4-DDE, cis-chlordane, α-endosulfan, chinomethionat, 4,4-DDE, dieldrin, 2,4-DDD, endrin, 2,4-DDT, 4,4-DDD, β-endosulfan, ethion, 4,4-DDT, propiconazole, endosulfan sulfate)의 잔류분석에 이용한다. 2. 측정기기 기체크로마토그래프/전자포획검출기 (GC/ECD) 3. 시약 시액 및 기구 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : 순도 98 % 이상의 표준물질이나 일정농도로 만들어진 액상의 표준용액을 사용한다. 2) Acetonitrile 3) Acetone 4) Toluene 5) Acetic acid, glacial 6) Magnesium sulfate, anhydrous 7) Sodium acetate, anhydrous 이상 열거된 시약중 특별한 언급이 없는 유기용매는 고순도 잔류물질 분석용 또는 HPLC용, A.C.S Reagent 급의 특급시약을 사용한다. 나. 기구 1) 원심분리용 튜브 : 50 ml 용 2) 유리시험관 : mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, 200 μl, 1000 μl

216 4) 부피 플라스크 : 10 ml 5) SPE Vaccum Manifold 6) SPE 카트리지 : Carbon/PSA=500 mg/500 mg, 6 cc 7) 질소농축기 (TurboVap LV) : 가변온도 수욕조 (20 ~ 100 o C), 질소 발생기 등을 갖춘 것. 8) 원심분리기 9) 진탕기 10) Vortex mixer 11) 저울 : ± 0.1 g 정밀도 및 ± g 정밀도 4. 시험용액의 조제 가. 표준용액 액상의 100 mg ml -1 표준품을 10 ml 부피 플라스크에 200 μl씩 취한 후 acetonitrile 로 눈금선 까지 채운 후 시험표준용액으로 사용한다 (2 mg ml -1 ). 나. 시험용액 1) 1 % acetic acid in acetonitrile Acetonitrile 99 ml 에 acetic acid 1 ml를 넣고 혼합하여 사용한다 2) Acetonitrile:toluene (3:1, v/v) Acetonitrile 150 ml 과 toluene 50 ml를 혼합하여 사용한다 5. 시험방법 가. 시료전처리 1) 시료 (지방 또는 근육) 5 g을 50 ml 튜브에 담는다. 2) 1 % acetic acid가 포함된 acetonitrile 15 ml 첨가한 후, magnesium sulfate 6 g 및 sodium acetate 1.5 g을 넣고 10분간 진탕기에 흔든다. 3) 4, 3800 rcf 에서 10분간 원심분리한다. 4) 상층액 3 ml를 유리튜브에 취한 후 질소농축기로 약 500 μl까지 농축한다. 5) SPE 정제 Carbon/PSA 카트리지를 acetonitrile:toluene (3:1, v/v) 혼합용액으로 컨디셔닝하고, 4) 의 농축시료를 카트리지에 넣은 후 acetonitrile:toluene (3:1, v/v) 8~10 ml로 추출한다. 6) 정제된 추출액을 질소농축기로 약 200 μl까지 농축한 후 acetone으로 1 ml 까지 맞추어 기기분석한다

217 나. 기기분석조건 1) 기체크로마토그래프 분석조건 (1) 칼럼 : DB-608 (30 m 0.25 mm ID, 0.25 μm Film thickeness) 또는 이와 동등한 것 (2) 기체흐름조건 : 0.7 ml/min (2 min) [0.05 ml/min] 1 ml/min (7 min) [0.05 ml/min] 1.2 ml/min (5 min) [0.2 ml/min] 0.7 ml/min (3) 오븐조건 : 210 (5 min) [2 /min] 220 (2 min) [2 /min] 230 (5min) [5 /min] 250 (9 min) (4) 주입부 : Splitmode (40:1), 250 (5) 검출기온도 : 300 (6) 시료주입량: 1 μl 6. 결과판정 및 계산 가. 정성 분석 시료를 추출 정제한 다음 위의 조건으로 분석하여 표준용액의 분석결과와 비교하여 머무름시간이 일치할 경우 동일한 물질로 본다. (겹침이 있거나 불명확한 피크의 보다 정확한 확인을 위해서는 극성이 서로 다른 두 개의 칼럼에서 분석하여 머무름시간의 일치여부를 확인하거나 GC/MSD 또는 GC-MS/MS로 분석하여 확인한다.) 나. 정량분석 1) 농도가 다른 3~5 개의 표준용액을 만들어 분석하고 농도와 면적값 비율로 검량선을 작성한다. 2) 해당물질을 첨가한 시료 (fortified sample)를 분석하여 면적값의 비를 구한 후 검량식에 대입하여 농도를 산출하고 첨가한 농도에 대비시켜 회수율을 구한다. 회수율 (%) = 검출된 농도 x 100 첨가된 농도 3) 시료를 분석하여 면적값의 비를 구한 후 검량식에 대입하여 농도를 산출한 다음 아래식에 따라 최종농도를 계산한다. 최종농도 (μg/g) = 시료 중 검출농도 (μg/ml) 최종시험용액량 (ml) x 희석배수 시료량 (g) 단, 최종농도의 단위는 mg/kg으로 표시한다

218 Fig. 1. GC chromatograms of pesticides at a concentration of 0.2 μg/ml in standard (upper) and fortified bovine fat sample (lower)

219 Ⅴ-29 카바메이트계 농약 잔류분석법 1. 원리 식육에 잔류하는 농약성분을 1 % acetic acid가 첨가된 acetonitrile로 추출한 다음 C18/PSA로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다. 이 방법은 식육의 카바마이트계 농약 (aldicarb, bendiocarb, carbaryl, carbofuran, ethiofencarb, methiocarb, methomyl, oxamyl, propoxur, pirimicarb)의 잔류검사에 이용한다. 2. 측정기기 액체크로마토그래프/질량분석기 (LC-MS/MS) 3. 시약 시액 및 기구 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : 순도 98 % 이상의 표준물질이나 일정농도로 만들어진 액상의 표준용액을 사용한다. 2) 증류수 3) Acetonitrile 4) Acetic acid, glacial 5) A mmonium formate 6) Magnesium sulfate, anhydrous 7) Sodium acetate, anhydrous 8) C18 충진제 (입자크기 μm, 공극크기 60 A ) 또는 이와 동등한 것 9) PSA 충진제 (입자크기 μm, 공극크기 60 A ) 또는 이와 동등한 것 이상 열거된 시약중 특별한 언급이 없는 유기용매는 고순도 잔류물질 분석용 또는 HPLC용, A.C.S Reagent 급의 특급시약을 사용한다. 나. 기구 1) 원심분리용 튜브 : 15 ml, 50 ml 용 2) 유리시험관 : mm 3) 마이크로피펫 : 100 μl, 200 μl, 1000 μl 4) 부피 플라스크 : 10 ml

220 5) 필터 : 멤브레인 필터 (45 mm, 0.2 μm, GHP), 시린지 필터 (25 mm, 0.2 μm, GHP) 6) 질소농축기 (TurboVap LV) : 가변온도 수욕조 (20 ~ 100 o C), 질소 발생기 등을 갖춘 것. 7) 원심분리기 8) 진탕기 9) Vortex mixer 10) 저울 : ± 0.1 g 정밀도 및 ± g 정밀도 4. 시험용액의 조제 가. 표준용액 액상의 100 mg ml -1 표준품을 10 ml 부피 플라스크에 100 μl씩 취한 후 acetonitrile 로 눈금선 까지 채운 후 시험표준용액으로 사용한다 (1 mg ml -1 ). 나. 시험용액 1) 1 % acetic acid in acetonitrile Acetonitrile 99 ml에 acetic acid 1 ml를 넣고 혼합하여 사용한다. 2) 5 mm ammonium formate / 정제수 (이동상 A) Ammonium formate g 을 정제수 100 ml에 녹여 500 mm로 조제 한 후, 이동상 조제량에 따라 희석하여 사용한다. 이동상 200 ml 조제시, 정제수 198 ml에 500 mm ammonium formate 2 ml를 넣고 혼합하여 0.2 μm GHP 멤브레인 필터로 여과한 후 사용한다. 5. 시험방법 가. 시료전처리 1) 균질화된 시료 5 g을 50 ml 튜브에 담는다. 2) 1 % acetic acid가 포함된 acetonitrile 15 ml 첨가한 후, 10분간 진탕기에 흔든다. 3) 2) 튜브에 magnesium sulfate 6 g 및 sodium acetate 1.5 g 첨가하고 1분간 강하게 흔든 후 4, 3800 rcf 에서 10분간 원심분리한다. 4) 상층액 8 ml를 C mg, PSA 400 mg, magnesium sulfate 1200 mg 이 담긴 15 ml 정제튜브에 옮긴 후 1분간 강하게 흔든 후 4, 3800 rcf 에서 10분간 원심분리한다. 5) 정제된 상층액 1.5 ml를 유리튜브에 취한 후 질소농축기로 건조 후, 20 % acetonitrile로 용해하고 0.2 μm GHP 시린지필터로 여과한 후 LC-MS/MS로 분석한다

221 나. LC-MS/MS로 분석조건 1) 액체크로마토그래프 분석조건 (1) 칼럼 : Kinetex C18 (2.1 mm X 100 mm, 1.7 μm, Phenomenex) 또는 이와 동등한 것 (2) 칼럼온도. : 40 (3) 시료주입량 : 7 μl (4) 유속 : 250 μl/min (5) 이동상 : 5 mm ammonium formate / 정제수 (A)/Acetonitrile (B) Gradient Program Time (min) A (%) B (%) ) 질량분석기 분석조건 (1) Ion mode : ESI positive mode (2) Source temperature : 120 (3) Desolvation temperature : 350 (4) Cone gas flow : 50 L/Hr (5) Desolvation gas flow : 700 L/Hr (6) Capillary voltage : 3.5 kv (7) MRM (Multiple Reaction Monitoring) Precursor ion Quantification transition Cone Collision m/z Voltage Energy (V) (V) Confirmatory transition Cone Collision m/z Voltage Energy (V) (V) Oxamyl [M+NH4] + 237> > Methomyl [M+H] + 163> > Aldicarb [M+NH4] + 209> > Propoxur [M+H] + 210> > Bendiocarb [M+H] + 224> > Carbofuran [M+H] + 222> > Pirimicarb [M+H] + 239> > Carbaryl [M+H] + 202> > Ethiofencarb [M+H] + 226> > Methiocarb [M+H] + 226> >

222 6. 결과판정 및 계산 시료를 추출 정제한 다음 위의 조건으로 분석한 후 표준용액의 분석결과와 비교하여 머무름시간 및 정량 정성이온의 이온비가 일치할 경우 동일 물질로 보고 정량분석을 실시한다. 검출농도가 중앙에 오도록 농도가 다른3~5 개의 표준용액을 만들어 분석하고 농도와 면적값 비율로 검량선을 작성한다. 또한 회수율 측정을 위해서는 해당물질을 첨가한 시료 (fortified sample)를 분석하고 검량식에 대입하여 농도를 산출하여 다음 수식에 따라 계산한다. 회수율 (%) = 검출된 농도 x 100 첨가된 농도 시료를 분석하여 면적값의 비를 구한 후 검량식에 대입하여 농도를 산출한 다음 아래식에 따라 최종농도를 계산한다. 최종농도 (μg/g) = 시료 중 검출농도 (μg/ml) 최종시험용액량 (ml) x 희석배수 시료량 (g) 단, 최종농도의 단위는 mg/kg으로 표시한다 Fig. 1. Total ion chromatograms of 10 carbamate pesticides at a concentration of 0.02 μg/ml in standard (left) and fortified sample (right)

223 Ⅴ-30 중금속 잔류분석법 1. 정량법의 원리 유도결합 플라스마 질량분석기 (Inductively coupled plasma mass spectrometer, ICP-MS)를 이용하여 축산물에 잔류 할 수 있는 중금속의 분석에 적용한다. 축산물에 잔류하는 중금속을 microwave (극초단파) 분해법을 이용하여 분석 시료의 유기물을 분해한 후 분석 대상 원소를 희석용액에 용해시켜 유도결합플라스마 질량분석기로 분석한다. 2. 측정기기 유도결합 플라스마 질량분석기 (Inductively coupled plasma mass spectrometer, ICP-MS) 3. 시약 시액 및 기구 가. 시약 및 시액 1) 중금속 표준품 : 납, 카드뮴, 인듐 (내부표준물질) 등 2) 질산 (nitric acid, HNO 3 ) : 고순도 (ultra 및 supra grade) 3) 과산화수소 (hydrogen perooxide, H 2 O 2 ) : 고순도 (supra grade) 4) 정제수 5) 질산용액 (10 %, v/v) : 진한 질산 8 ml에 정제수를 가하여 50 ml로 만든다. 6) 중금속 표준용액 : 중금속 표준품을 시료희석용액 (질산용액)으로 희석하여 각각의 농도를 0.1, 1.0, 5.0, 10.0 μg/ml의 용액을 만든다. 7) 기타 : 중금속 분석에 적합한 것을 사용한다. 나. 기구 1) Microwave digestion system (극초단파 분해기) 2) 중금속 분해용기 3) 냉동동결건조기 4) 중금속 고압스팀세척기 : 고농도 고온/고압의 산 (acid) 증기를 이용하여 중금속 시료 전처리 후 용기에 남아 있는 극미량의 오염물질을완벽하게 세척하는 장치 5) 기타 : 중금속 분석에 적합한 것을 사용한다

224 다. 시료채취방법 시료는 대표성이 있게 채취하여 플라스틱 용기에 잘 보관하고 변형이 없도록 유지되어야 한다. 채취된 시료는 다음절에 따라 시료 전처리하여 분석한다. 단, 즉시 전처리하여 분석할 수 없는 경우에는 채취한 시료를 냉동보관 (-10 o C 이하)한다. 4. 시험용액의 조제 가. 분석 대상 시료의 동결건조 채취된 시료의 일정량을 50 ml 플라스틱 튜브에 담아 시료를 잘게 세절한다. 효율적인 동결 건조를 위해 시료 표면적을 최대한 크게 하기 위하여 잘게 세절된 시료를 튜브 내에 평평하게 놓는다. 동결건조가 최대한 잘 이루어지도록 냉동고 혹은 -20 이하의 환경에서 예비동결을 24시간 동안 실시한다. 이때 50 ml 플라스틱 튜브의 빈 무게(w1)와 시료를 담은 후 무게 (w2)를 측정해 둔다. 24시간 냉동시킨 후 냉동 동결건조기에 시료가 담긴 플라스틱 튜브를 동결건조기 용기에 넣고 48시간 동안 동결 건조시킨다. 동결건조 시킨 후 무게 (w3)를 측정하여 시료의 수분양 (%)을 계산한다 (% 수분양 = (w2-w3) / (w2-w1) 100). 동결 건조된 시료는 플라스틱 재질의 막자와 막자사발을 이용하여 균일하게 분쇄한 후 시료번호가 기재된 50 ml 플라스틱 튜브에 담는다. 나. 시료분해 분해용기에 시료 약0.3 g을 넣고 ultra grade 질산 5 ml, supra grade 과산화수소 2 ml와 내부표준물질로 인듐 (100 ng/ml) 300 μl를 넣고 후드에서 약 2시간 동안 정치하여 예비 분해를 실시한다. 그 다음, 정제수 4 ml를 추가하여 microwave 분해기 (Q-Lab 6000, Questron coporation, USA)에서 시료를 분해한다. Microwave 분해기의 최적 분해 온도 프로그램은 Table 1과 같다. 분해된 시료액을 4 에서 12-24시간 동안 정치한 후50 ml polypropylene sample tube로 옮기고 정제수를 가하여 희석한 후 검액으로 사용한다. 정확한 극미량 분석을 위하여 시료 전처리와 동일한 과정을 거친 바탕시험 용액(system blank)을 분석한 후 시료분석 결과를 보정한다. Table 1. Microwave 분해 조건 Temperature ( ) Power (W) Ramp (min)

225 5. ICP-MS에 의한 시험 조작 ICP-MS에 의한 중금속 분석은 분석원소에 따라 방해물질을 배제한 고유의 질량을 선정 하고 (Table 2), 선정된 질량을 분석하여 질량 크로마토그램의 피크 높이로부터 검량선법으로 정량한다. 가. 유도결합 플라스마 질량분석의 측정 조건 Table 2. 분석원소의 질량 선정 Lead (Pb) Cadmium (Cd) Isotope (m/z) Abundance Interference Analytical Mass Hg Pd Pd Pd Sn Sn Sn Pb 111 Cd Table 3. 유도결합 플라스마 질량분석기의 측정조건 Parameters Pb Cd Nebulizer Gas Flow (L/min) Tuning parameters Timing parameters Signal Processing Auxiliary Gas Flow (L/min) Plasma Gas Flow (L/min) ICP RF Power Sweeps / Reading Readings / Replicate 1 1 Number of Replicates 3 3 Detector Mode Dual Dual Auto lens On On Analyte mass

226 나. 정량시험 표준용액과 공시험용액을 유도결합 플라스마 질량분석기에 직접 주입하여 표준용액의 강도를 측정하고 농도와 강도간의 일차함수로부터 검량선을 작성하여 회귀방정식을 산출한다. 별도로 준비된 시료를 주입하여 분석 대상 원소에 대한 강도를 측정하고 검량선의 회귀방정식에 대입하여 분석 대상 원소의 농도를 정량한다. 유도결합 플라스마 질량분석기에서 검액 중 분석 대상 원소에 대한농도가 정량되면 시료 중 분석 대상 원소의 농도는 다음 식에 따라 계산한다. 시료 중 분석대상원소의 농도 (μg/g) = 분석치 (μg/ml) 최종검액량 (ml) (1 - 수분량 (%) ) 시료채취량 (g)

227 Ⅴ-31 잔류성유기오염물질 (POPs) 분석법 1. 정량법의 원리 동위원소 희석 및 고분해능 기체크로마토그래프/질량분석기를 이용하여 식육에 잔류할 수 있는 잔류성유기오염물질 (Persistent Organic Pollutants, POPs)인 다이옥신 (PCDD/Fs) 17종, 유사 다이옥신 염화비페닐 (dioxin-like PCBs) 12종, 브롬화난연제 (PBDEs) 7종의 분석에 적용한다. 축산물에 잔류하는 잔류성유기오염물질을 용매로 추출한 후 농축하여 지방의 무게를 측정한다. 일정량의 지방 시료를 실리카, 알루미나, 활성탄 칼럼을 차례로 통과시켜 잔류성 유기오염물질 이외의 물질을 제거하고 다시 소량으로 농축시킨 후 고분해능 기체크로마토 그래프/질량분석기로 분석한다. 2. 측정기기 분해능 이상의 고분해능 기체크로마토그래프 / 질량분석기 (High Resolution Gas Chromatograph/Mass Spectrometer, HR-GC/MS) 3. 시약 시액 및 기구 분석에 사용하는 시약 및 기구는 바탕시험 (background test)을 하여 잔류성유기오염물질에 영향을 미치는 방해성분을 함유하지 않은 것을 사용하여야 한다. 가. 표준품 및 시약 1) 표준품 : 미국 환경보호청의 다이옥신 분석법 (US EPA Method 1613), PCBs 분석법 (US EPA Method 1668), PBDEs 분석법 (US EPA Method 1614)에 언급되어 있는 다음과 같은 표준품을 각각 사용한다. (1) 검량선 작성용 표준품 (Calibration Standard Solution, CS1, CS2, CS3, CS4, CS5) (2) 동위원소표지 표준품 (Labeled Compound Spiking Solution, LCS) (3) 정제용 표준품 (Cleanup Standard Solution, CSS) (4) 기기보정용 표준품 (Internal Standard Solution, ISS) 2) 정제수 3) n-헥산 (이하 헥산 이라함), 아세톤, 디클로로메탄, 톨루엔, 벤젠, 에칠아세테이트, 노난 4) 무수황산나트륨 : A.C.S Reagent 급 5) 기타 : PCDD/Fs, dioxin-like PCBs, PBDEs 분석에 적합한 것을 사용한다. 이상 열거된 시약중 특별한 언급이 없는 유기용매는 고순도 잔류물질 분석용, HPLC용, 또는 A.C.S Reagent 급의 특급시약을 사용한다

228 나. 기구 1) TurboVap 농축기 : 가변온도 수욕조 (20 ~ 100 o C), 질소 발생기 등을 갖춘 것. 2) 질소농축기 : N-EVAP TM 111 (Organomation associate Inc. U.S.A) 3) 정제장치 Power-Prep TM (FMS Co. U.S.A) : 시료 중 PBDEs 등의 추출 및 정제장치로서 전원공급기 (Power supply module), 조건 조절기 (Control module), 펌프 및 압력조절기 (Pump & Pressure module), 밸브조절기 (Valve management module), 시료처리기 (Sample processing module)로 구성되어 있다. 특히 시료처리기는 시료주입부와 실리카, 알루미나, 활성탄 칼럼으로 이루어져 있다. 4) 기타 : PCDD/Fs, dioxin-like PCBs, PBDEs 분석에 적합한 것을 사용한다. 다. 시료채취방법 시료는 대표성이 있게 채취하여 용기에 잘 보관하고 변형이 없도록 유지되어야 한다. 채취된 시료는 30일 이내에 다음절에 따라 전처리하여 분석한다. 단, 즉시 전처리하여 분석할 수 없는 경우에는 채취한 시료를 냉동보관하며, HR-GC/MS 분석용 전처리된 시료도 -10 o C 이하의 냉암소에서 보관한다. 4. 시험용액의 조제 가. 추출 1) 액화 추출법 식육의 지방부분을 세절하여 70 오븐에서 하루 정도 방치하여 액화시킨다. 액화된 지방 3~5 g을 헥산 약 50 ml로 완전히 녹인 후 4 ng/ml 농도의 Dioxin-LCS, dioxin-like PCB-LCS, PBDEs-LCS를 각각 100 μl 씩 첨가하여 정제할 농축 시료를 만든다. 2) 속슬렛 (Soxhlet) 추출법 비이커에 균질화된 식육 g과 무수황산나트륨 g을 넣고 잘 혼합한 후 4 ng/ml 농도의 Dioxin-LCS, PCB-LCS, PBDEs-LCS를 각각 100 μl 씩 첨가하여 유리섬유 thimble에 잘 채워 넣는다 시간 동안 정치한 후 디클로로메탄 200 ml를 가하고 18-24시간 동안 속슬렛으로 추출한다. 추출 후 무수황산나트륨이 담긴 깔대기를 통과시켜 수분을 건조시킨 후 TurboVap 농축기를 이용하여 용매를 모두 날려 보낸다. 이때 TurboVap농축 용기의 전후 무게차이를 측정하여 지방 함량을 계산한다. 다시 헥산 50 ml을 첨가하여 TubrboVap 농축용기내의 지방을 완전히 녹이고100 ~ 150 ml 플라스크 용기에 옮겨서 정제할 농축시료를 만든다

229 나. 정제 정제할 농축시료를 정제시스템 (Power - Prep TM )에 장착된 실리카, 알루미나, 활성탄 칼럼을 차례로 통과시킨 다음, 2 % 디클로로메탄/헥산 120 ml로 실리카 칼럼과 알루미나 칼럼을 통과시켜 받는다 (F2). 50 % 디클로로메탄/헥산 120 ml로 실리카 칼럼과 알루미나 칼럼을 다시 통과시켜 따로 받는다 (F3). 마지막으로 활성탄 칼럼에 톨루엔 80 ml를 통과시켜 받는다. (F1) 이렇게 모아놓은 용매시료를 TurboVap 농축기를 이용하여 약 0.5 ml가 남을 때까지 농축한 후 농축 용매를 헥산 3 ml로 3번 정도 세척하여 15 ml 유리 vial에 옮겨 담는데, F2 용매시료와 F3 용매시료는 합하고 F1 용매시료는 따로 담는다. 두개의 15 ml 유리 vial에 담긴 용매를 각각 질소농축기를 이용하여 농축하고 최종 vial에 옮겨 거의 건조 단계가 되도록 용매를 날려 보낸다. 정제한 농축액 F1 용매시료에는 Dioxin-ISS 4 ng/ml 50 μl와 dioxin-like PCB-ISS 4 ng/ml 50 μl를 첨가하여 최종 농축액 100 μl를 만들고 나머지 정제한 농축액 F2 용매시료와 F3 용매시료에는 PBDE-ISS 2 ng/ml 50 μl, PCB-ISS 4 ng/ml 50 μl를 첨가하여 최종 농축액100 μl로 만들어 각각을 물질 그룹별로 HR-GC/MS로 분석한다. 시료의 전처리, 추출 및 분석에 대한 방법을 요약한 흐름도를 Figure 1.에 나타내었다. Homogenize sample Spike LCS 100 μl Extract fat Filtrate solvent through sodium sulfate (Na 2 SO 4 ) Concentrate to dryness Determine % lipids Weight fat Dissolve in n-hexane 200 ml

230 Add 30 % of acidic silica gel (fat:acidic silca gel= 1:10) Shake for 60 min Decant through Na 2 SO 4 Concentrate to 10~15 ml Clean up with silica, alumina & carbon column (using Power-Prep TM ) Concentrate by nitrogen blowing Spike ISS 100 μl (Final volume = 50~100 μl) HR-GC/MS (Inject 1 or 2 μl) Figure 1. Flow chart for analysis of livestock products. 5. HR-GC/MS에 의한 시험 조작 HR-GC/MS에 의한 잔류성 유기오염물질의 분석은 각 이성체의2개 이온을 선택이온 검출법 (SIR)으로 검출하고, 그 선택이온의 면적비를 검사하여 잔류성 유기오염물질인 것을 확인한 다음 질량 크로마토그램의 피크 면적으로부터 내부표준법 또는 검량선법으로 정량한다. 가. 시약 1) 퍼플루오로케로센 (Perfluorokerosene, PFK) 질량분석용 고 비점의 것을 사용한다. 2) 검량선 작성용 표준물질 (CS) 검량선 작성용 표준물질은 Table 1과 같다

231 Table 1. 검량선 작성용 표준물질 (CS) PCDD/Fs Tetra- Penta- Hexa- Hepta- Octa- PCB- 77 PCB- 81 PCB-105 PCB-114 PCB-118 PCB-123 PCB-126 PCB-156 PCB-157 PCB-167 PCB-169 PCB-189 BDE-28 BDE-47 BDE-99 BDE-100 BDE-153 BDE-154 BDE-183 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-TCDF 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-PeCDF 2,3,4,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,6,7,8-HxCDD 1,2,3,7,8,9-HxCDD 1,2,3,4,7,8-HxCDF 1,2,3,6,7,8-HxCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDF 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF OCDD OCDF 3,3',4,4'-TeCB 3,4,4',5-TeCB 2,3,3',4,4'-PeCB 2,3,4,4',5-PeCB 2,3',4,4',5-PeCB 2',3,4,4',5-PeCB 3,3',4,4',5-PeCB 2,3,3',4,4',5-HxCB 2,3,3',4,4',5'-HxCB 2,3',4,4',5,5'-HxCB 3,3',4,4',5,5'-HxCB 2,3,3',4,4',5,5'-HpCB 2,4,4'-TrBDE 2,2',4,4'-TeBDE 2,2',4,4',5-PeBDE 2,2',4,4',6-PeBDE 2,2',4,4',5,5'-HxBDE 2,2',4,4',5',6-HxBDE 2,2',3,4,4',5',6-HpBDE Dioxin-like PCBs PBDEs 13 C 12-2,3,7,8-TCDD 13 C 12-2,3,7,8-TCDF 13 C 12-1,2,3,7,8-PeCDD 13 C 12-1,2,3,7,8-PeCDF 13 C 12-2,3,4,7,8-PeCDF 13 C 12-1,2,3,4,7,8-HxCDD 13 C 12-1,2,3,6,7,8-HxCDD 13 C 12-1,2,3,4,7,8-HxCDF 13 C 12-1,2,3,6,7,8-HxCDF 13 C 12-1,2,3,7,8,9-HxCDF 13 C 12-2,3,4,6,7,8,-HxCDF 13 C 12-1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 13 C 12-1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 13 C 12-1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 13 C 12 -OCDD 37 Cl 4-2,3,7,8-TCDD 13 C 12-3,3',4,4'-TeCB 13 C 12-3,4,4',5-TeCB 13 C 12-2,3,3',4,4'-PeCB 13 C 12-2,3,4,4',5-PeCB 13 C 12-2,3',4,4',5-PeCB 13 C 12-2',3,4,4',5-PeCB 13 C 12-3,3',4,4',5-PeCB 13 C 12-2,3,3',4,4',5-HxCB 13 C 12-2,3,3',4,4',5'-HxCB 13 C 12-2,3',4,4',5,5'-HxCB 13 C 12-3,3',4,4',5,5'-HxCB 13 C 12-2,3,3',4,4',5,5'-HpCB 13 C 12-2,4,4'-TrBDE 13 C 12-2,2',4,4'-TeBDE 13 C 12-2,2',4,4',5-PeBDE 13 C 12-2,2',4,4',6-PeBDE 13 C 12-2,2',4,4',5,5'-HxBDE 13 C 12-2,2',4,4',5',6-HxBDE 13 C 12-2,2',3,4,4',5',6-HpBDE 13 C 12-2,2',3,4,4',6-HxBDE 13 C 12-2,2',5,5'-TeCB 13 C 12-2,2',3,4,4',5-HxCB

232 검량선 작성용 표준액은 분석물질별로 적당한 농도 범위에서 사용한다. 이 농도범위로 조제되는 표준물질은 검출한계부분의 낮은 농도의 것과 예상 검출농도보다 높은 농도의 것이 적어도 하나 이상 포함되어야 하며, 조제된 검량선 작성용 표준액은 HR-GC/MS의 동적 범위 (dynamic range)를 만족해야 한다. 또한 검량선 작성용 표준액에는 13 C 12 이성체가 일정 농도로 함유되어 있어야 한다. 3) 정량 및 회수율 측정용 내부표준물질 (LCS) 시료의 추출과정 전에 첨가하는 정량 및 회수율 측정용 내부표준물질은 13 C 12 이성체로 된 물질로서 Table 2와 같다. Table 2. 회수율 측정용 내부표준물질 (LCS) PCDD/Fs Dioxin-like PCBs PBDEs 13 C 12-2,3,7,8-TCDD 13 C 12-2,3,7,8-TCDF 13 C 12-1,2,3,7,8-PeCDD 13 C 12-1,2,3,7,8-PeCDF 13 C 12-2,3,4,7,8-PeCDF 13 C 12-1,2,3,4,7,8-HxCDD 13 C 12-1,2,3,6,7,8-HxCDD 13 C 12-1,2,3,4,7,8-HxCDF 13 C 12-1,2,3,6,7,8-HxCDF 13 C 12-1,2,3,7,8,9-HxCDF 13 C 12-2,3,4,6,7,8,-HxCDF 13 C 12-1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 13 C 12-1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 13 C 12-1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 13 C 12 -OCDD 13 C 12-3,3',4,4'-TeCB 13 C 12-3,4,4',5-TeCB 13 C 12-2,3,3',4,4'-PeCB 13 C 12-2,3,4,4',5-PeCB 13 C 12-2,3',4,4',5-PeCB 13 C 12-2',3,4,4',5-PeCB 13 C 12-3,3',4,4',5-PeCB 13 C 12-2,3,3',4,4',5-HxCB 13 C 12-2,3,3',4,4',5'-HxCB 13 C 12-2,3',4,4',5,5'-HxCB 13 C 12-3,3',4,4',5,5'-HxCB 13 C 12-2,3,3',4,4',5,5'-HpCB 13 C 12-2,4,4'-TrBDE 13 C 12-2,2',4,4'-TeBDE 3 C 12-2,2',4,4',5-PeBDE 3 C 12-2,2',4,4',6-PeBDE 3 C 12-2,2',4,4',5,5'-HxBDE 3 C 12-2,2',4,4',5',6-HxBDE 3 C 12-2,2',3,4,4',5',6-HpBDE 4) 시료정제용 내부표준물질 (CSS) Power-Prep TM 또는 칼럼크로마토그래피에 의한 시료정제 전에 시료에 첨가하는 내부표준 물질은 Table 3과 같다. Table 3. 분석물질별 시료정제용 내부표준물질 (CSS) PCDD/Fs Dioxin-like PCBs PBDEs 37 Cl 4-2,3,7,8-TCDD 13 C 12-3,4,4,5-TeCB 13 C 12-2,3,3',5,5'-PeCB 13 C 12-2,2',3,4,4',6-HxBDE

233 5) 실린지첨가용 내부표준물질 (ISS) HR-GC/MS에 시료를 주입하기 전에 첨가하는 실린지첨가용 내부표준물질은 Table 4와 같다. Table 4. 분석물질별 실린지 첨가용 내부표준물질 (ISS) PCDD/Fs Dioxin-like PCBs PBDEs 13 C ,4,5-TeCB (70L) 13 C 12-1,2,3,4-TCDD 13 C 12-1,2,3,7,8,9-HxCDD 13 C 12-2,3,3,5,5 -PeCB (111L) 13 C 12-2,2',3,4,4',5'-HxCB (138L) 13 C 12-2,2',3,3',4,4',5'-HpCB (170L) 13 C 12-2,2,5,5 -TeCB (52L) 13 C 12-2,2',3,4,4',5'-HxCB (138L) 나. HR-GC/MS의 분석조건 GC에서의 물질별 칼럼의 종류와 온도조건은 Table 5에 나타내었다. HR-MS에서의 분석 조건은 Table 6에 나타내었다. 또한 Table 7에는 각 그룹별 이온 질량을 나타내었다. 1) 기체크로마토그래프 (GC) 분석조건 Table 5. Analytical conditions of GC for PCDD/Fs, dioxin-like PCBs and PBDEs PCDD/Fs dioxin-like PCBs PBDEs Column Material DB-5MS DB-5MS DB-5HT Column Length (m) Column Diameter (μm) Film Thickness (μm) Inlet Temperature ( ) Initial Temp. 160 (1 min) 160 (1 min) 120 (1 min) Time (min) Rate ( /min) Temp. ( ) Time (min) Rate ( /min) Temp. ( ) Time (min) Rate ( /min) Temp. ( ) Oven Temperature Program Oven Ramp Instrument GC HP

234 Table 6. Analytical conditions of MS for PCDD/Fs, dioxin-like PCBs and PBDEs Descriptor Condition MS Type Voltage SIR Ion Mode EI mode Polarity Positive Source Temperature 260 Electron energy 35.0 ev Trap 500 μa Interface Temperature Capillary line 1, Re-entrant 260 PFK septum 160 Detector Voltage 350 V Instrument Waters Micromass Autospec-Ultima 2) 질량분석기 (HR-MS) (1) 분해능 : 이상 (Baseline으로부터 10 % 높이에서의 피크 너비 기준)의 분해능이 유지되어야 하며 매 분석 전에 확인한다. (2) 검출 : 선택이온검출법 (SIR) (3) 이온화법 : 전자충격이온화 (EI+)법 3) 질량설정 측정하고자하는 이온의 질량은 각 동족체마다 2개의 선택이온 (selected ion), 즉 M+, (M+2)+ 또는 (M+4)+를 사용한다. 주로 사용하는 물질별 대표적 이온 질량은Table 7과 같다. Table 7. Group of M/Z for PBDEs, PCDD/Fs, dioxin-like PCBs and HCB Group Channel PCDD/Fs dioxin-like PCBs PBDEs (TCDF) (TeCB) ( 13 C 12 TeCB) ( 13 C 12 TCDF) ( 13 C 12 TeCB ) (DiBDE) (TCDD) (PeCB) (Lock mass) ( 13 C 12 DiBDE) ( 37 C 12 TCDD) (Lock mass) (Lock mass) ( 13 C 12 PeCB) ( 13 C 12 TCDD) ( 13 C 12 HxCB)

235 Group Channel PCDD/Fs dioxin-like PCBs PBDEs (PeCDF) (HxCB) ( 13 C 12 HxCB) ( 13 C 12 PeCDF) ( 13 C 12 HxCB) (TriBDE) (PeCDD) (Lock mass) ( 13 C 12 TriBDE) (HpCB) (Lock mass) (Lock mass) ( 13 C 12 PeCDF) ( 13 C 12 HpCB) (TeBDE) ( 13 C 12 TeBDE) (HxCDF) (PeBDE) (Lock mass) ( 13 C 12 PeBDE) ( 13 C 12 HxCDF) (Lock mass) (HxBDE) (HxCDD) ( 13 C 12 HxBDE) ( 13 C 12 HxCDD) (HpCDF) (HpBDE) ( 13 C 12 HpCDF) (Lock mass) ( 13 C 12 HpBDE) (HpCDD) (OcBDE) (Lock mass) ( 13 C 12 HpCDD) ( 13 C 12 OcBDE) (OCDF) (Lock mass) (OCDD) ( 13 C 12 OCDD)

236 4) 질량검정 (Mass Calibration) 고분해능 기체크로마토그래프/질량분석기는 시료 분석조건과 동일한 조건에서 분해능을 이상으로 조절 (tuning)한 다음, 물질별로 선택 이온들을 2-5개의 그룹으로 나누어 마그네트 전환방식 (magnet switching)으로 PFK에 대한 질량검정을 하여야 한다. 이때 각 그룹은 최소한 하나 이상의 고정질량 (lock mass)을 사용하고 1회 싸이클시간 (cycle time)은 1초 이내로 한다. 1) PFK 질량검정결과는 PFK의 이론값과 실측값과의 차이가 5 ppm 이하를 만족하여야하며, 이 범위를 만족하지 못할 경우에는 HR-GC/MS를 재조절 하여야 한다. 각 그룹별 PFK 질량검정결과는 신뢰성 검토를 위해 시료 분석결과와 함께 제시되어야 한다. 다. 정성 분석 시료액을 1~2 μl 분취하여 HR-GC/MS에 주입한 다음 선택이온들에 대한 크로마토 그램을 그려서, 얻어진 크로마토그램상의 피크와 머무름시간이 같고 측정한 2개의 선택이온의 피크 면적비가 Table 8과 Table 9를 근거로 Table 10과 Table 11을 기준으로 하여 각 동족체의 면적비에 대하여±15 % 이내에 있으면 정량한다. 동족체 피크 면적비에 대한 계산 결과는 신뢰성 검토를 위해 시료 분석결과와 함께 제시되어야 한다. Table 8. 염소 원자수에 의한 동족체 피크의 자연 존재비 염소 질 량 수 원자수 M M+2 M+4 M+6 M+8 M+10 M+12 M Table 9. 브롬 원자수에 의한 동족체 피크의 자연 존재비 브롬 질 량 수 원자수 M M+2 M+4 M+6 M+8 M+10 M+12 M ) 싸이클시간 (cycle time)은 각 선택이온들의 정체시간 (Dwell time)의 합과 각 선택이온들 사이를 이동하는시간 (shift time)의 합을 더한 값이다

237 Table 10. PCDD/Fs와 dioxin-like PCBs의 이론적 이온 비율과 상한 및 하한 한계값 염소 원자수 m/z ratio Theoretical ratio Lower QC limit Upper QC limit 4 M/(M+2) (M+2)/(M+4) (M+2)/(M+4) a M/(M+2) (M+2)/(M+4) b M/(M+2) (M+2)/(M+4) a For only 13 C 12 -HxCDF, b For only 13 C 12 -HpCDF Table 11. PBDEs의 이론적 이온 비율과 상한 및 하한 한계값 브롬 원자수 m/z ratio Theoretical ratio Lower QC limit Upper QC limit 3 (M+2)/(M+4) (M+2)/(M+4) a (M+4)/(M+6) (M+4)/(M+6) (M+4)/(M+6) b (M+6)/(M+8) (M+6)/(M+8) a For only 13 C 12 -TeBDE, b For only 13 C 12 -HxBDE 라. 동위원소 희석법에 의한 정량 검출된 이성체와 이에 대응하는 13 C 12 동족체를 내부표준물질로 동위원소희석법을 이용 하여 정량한다. 정량용 내부표준물질과 정제용 내부표준 물질에 대한 농도를 절대량으로 구하여 회수율을 계산한다. 회수율은 실린지 첨가용 표준품의 회수율로 보정하여 50 % 이상 150 % 이하이어야 한다. 2) 이 범위를 벗어나면 정제과정을 한번 더 하여야 하며, 재 정제 후에도 이 범위를 만족하지 못하면 시료분석결과를 사용할 수 없다. 시료 추출용 내부 표준물질과 정제용 내부 표준물질에 대한 회수율은 시료 분석 결과에 대한 신뢰성 검토를 위해 시료분석결과와 함께 제시되어야 한다. 3) 2) 시료 분석 결과와 회수율은 동일 시료에 대하여 3회 이상 반복 측정하여 평균치를 제시하여야 한다. 3) 각 농도별로 각각 3회 이상 반복 측정한 평균치를 사용하여 작성하여야 한다

238 1) 검량선 작성 (1) Native 검량용 표준물질 상대반응도 (Relative Response, RR) 산출 검량선작성용 표준용액 (CS)을 (다) 정성 과 같은 방법으로 HR-GC/MS에 주입하여 각 선택이온에 대한 크로마토그램을 얻은 후 각 표준물질 (native)의 피크 면적과 이에 대응하는 13 C 12 이성체 (labeled)의 피크 면적으로부터 아래방법에 따라 상대반응도를 계산한다. 상대반응도와 표준용액의 농도 관계를 5개 농도를 사용하여 상대반응도를 각각 구하고 그 평균값을 정량에 사용한다. 그리고 계산된 5개의 상대반응도에 대한 변화량이 상대표준편차로 20 % 이하로 일정하여야 한다. RR = (A1 n + A2 n )(C l ) (A1 l + A2 l )(C n ) A1 n, A2 n : Native 검 량용 표 준물질의 1차 및 2차 선택이온의 피크 면적 A1, l A2 l : 13 C 12 이성체 의 검 량용 표 준물질의 1차 및 2차 선택이온의 피크 면적 C l : 검 량용 표 준물질에서 labeled 화합물의 농도 C n : 검량용 표준물질에서 native 화합물의 농도 (2) Labeled 검량용 표준물질 상대반응계수 (Response Factor, RF) 산출 위 1)과 같은 방법으로 상대반응계수를 구하고 평균값을 정량에 사용한다. 그리고 계산된 5개의 상대반응계수에 대한 변화량이 상대표준편차로 35 % 이하로 일정하여야 한다. RF = (A1 s + A2 s )(C is ) (A1 is + A2 is )(C s ) A1 s, A2 s : Labeled 검 량용 표 준물질의 1차 및 2차 선택이온의 피크 면적 A1 is, A2 is : 내부표준물질 (injection internal) 1차 및 2차 선택이온의 피크 면적 C is : 내부표준물질 (injection internal)의 농 도 C s : Labeled 검량용 표준물질에서의 화합물의 농도 2) 농도 계산 동위원소희석법에 의한 시료 중 잔류성유기오염물질의 농도는 다음 식에 의해 계산한다. C ex = (A1 n + A2 n ) C l (A1 l + A2 l ) RR RR : Native 검량용 표준물질 상대반응도 (Relative Response, RR) 평균 값 A1 n, A2 n : 시료 중의 1차 및 2차 선택이온의 피크 면적 A1, l A2 l : 정량용 내부표 준물 질 (LCS)의 1차 및 2차 선택이온의 피크 면적 C l : 정량용 내 부표준물 질 (LCS)에서 labeled 화합물의 농도 C ex : 시료 중의 검출 농도 (ng/ml)

239 마. 내부표준물질 (LCS)의 정량 및 회수율 계산 회수율 측정용 내부표준물질의 농도는 다음과 같이 상대반응계수를 이용하여 계산한다. C = (A1 s + A2 s ) C is (A1 is + A2 is ) RF RF : Labeled 검량용 표준물질 상대반응계수 (Response Factor, RF) 평균 값 A1 s, A2 s : 회수율 측정용 내부표준물질 (LCS)의 1차 및 2차 선택이온의 피크 면적 A1 is, A2 is : 내부표준물질 (injection internal) 1차 및 2차 선택이온의 피크 면적 C is : 내부표준물질 (injection internal)의 농 도 C : 회수율 측정용 내부표준물질 (LCS)에서의 화합물의 검출농도 회수율은 앞에서 계산된 농도를 이용하여 13 C 12 이성체 물질의 % 회수율을 다음과 같이 계산한다. 검출된 농도 회수율 (%) = x 100 첨가된 농도 6. 결과표시 가. 다이옥신 (PCDD/Fs)의 결과 표시 1) 다이옥신 동족체 및 이성체의 표시방법 동족체 농도는 4~8 염소화합물의 각 동족체 농도와 그 총합을 표시하고, 이성체 농도는 2,3,7,8 위치의 염소치환체의 각 이성체 농도 (17 이성체)를 표시한다. 단, 표시방법은 Table 12를 참조 한다. 2) 다이옥신 정량한계 검출한계 (LOD)는 signal/noise 비율을 3:1로 하고 정량한계 (LOQ)는 10:1로 계산 한다 Table 12. 다이옥신 동족체 및 이성체의 표시방법 염소원자수 다 이 옥 신 퓨 란 동족체 이성체 (2,3,7,8) 동족체 이성체 (2,3,7,8) 4 염소화물 5 염소화물 TCDDs PeCDDs 2,3,7,8-1,2,3,7,8 - TCDFs PeCDFs 6 염소화물 7 염소화물 8 염소화물 (4 염소 ~ 8염소) HxCDDs HpCDDs OCDD PCDDs 1,2,3,4,7,8-1,2,3,6,7,8-1,2,3,7,8,9-1,2,3,4,6,7,8-1,2,3,4,6,7,8,9 - HxCDFs HpCDFs OCDF PCDFs 2,3,7,8-1,2,3,7,8-2,3,4,7,8-1,2,3,4,7,8-1,2,3,6,7,8-1,2,3,7,8,9-2,3,4,6,7,8-1,2,3,4,6,7,8-1,2,3,4,7,8,9-1,2,3,4,6,7,8,

240 3) 다이옥신 농도 표시방법 (1) 시료 중의 다이옥신 농도의 실측치는 pg/g 시료 (식품) 또는 시료 중 지방함량을 계산하여 지방을 기준으로 pg/g 지방 으로 표시한다. (2) 독성등가 환산농도의 계산방법 계산된 농도에 다이옥신 각각의 독성등가계수 (toxic equivalent factor, TEF)를 곱하여 독성등가값으로 환산하고 시료에서 검출된 다이옥신 모두의 농도를 합하여 총 독성 등가값 (toxic equivalent, TEQ)으로 농도를 표시한다. 2005년 WHO에서 제정한 독성등가 계수는 Table 13과 같다. 총 독성등가값 (TEQ) = (다이옥신농도 x TEF) Table 13. 다이옥신 (PCDD/Fs)의 독성등가계수 다 이 옥 신 WHO-TEF 퓨 란 WHO-TEF 2,3,7,8-TCDD 1 2,3,7,8-TCDF 0.1 1,2,3,7,8-PCDD 1 1,2,3,7,8-PCDF ,2,3,4,7,8-HxCDD 0.1 2,3,4,7,8-PCDF 0.3 1,2,3,7,8,9-HxCDD 0.1 1,2,3,4,7,8-HxCDF 0.1 1,2,3,6,7,8-HxCDD 0.1 1,2,3,7,8,9-HxCDF 0.1 1,2,3,4,6,7,8-HxCDD ,2,3,6,7,8-HxCDF 0.1 1,2,3,4,6,7,8,9-OCDD ,3,4,6,7,8-HxCDF 0.1 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF ,2,3,4,7,8,9-HpCDF ,2,3,4,6,7,8,9-OCDF ) 다이옥신 수치의 취급 농도에 대한 유효숫자는 원칙적으로 소숫점 이하4자리에서 반올림하여 3자리로 표시한다. 예를 들면, 독성등가값에서 유효숫자가 소수점이하 4자리에서 시작되는 경우에는 소숫점 이하 3자리까지 표시한다 (0.000 또는 0.001로 한다). 또, 실측값이 정량한계이하의 경우에는 not detected로서 ND 로 표시하는데, 환산농도는 0 으로 한다. 나. Dioxin-like PCBs의 결과 표시 1) Dioxin-like PCBs 동족체 및 이성체의 표시방법 동족체 농도는 4~7 염소화합물의 각 동족체 농도와 그 총합을 표시하고, 이성체 농도는 2,3,7,8 위치의 염소치환체의 각 이성체 농도 (12 이성체)를 표시한다. 단, 표시방법은 Table 14를 참조한다

241 2) Dioxin-like PCBs 정량한계 검출한계 (LOD)는 signal/noise 비율을 3:1로 하고 정량한계 (LOQ)는 10:1로 계산한다 Table 14. Dioxin-like PCBs 동족체 및 이성체의 표시방법 염소원자수 4 염화물 5 염화물 6 염화물 7 염화물 (4염소~7염소) 3) Dioxin-like PCBs 농도표시방법 동족체 TeCB PeCB HxCB HpCB PCBs Dioxin-like PCBs 3,3',4,4'- 3,4,4',5-2,3,3',4,4'- 2,3,4,4',5-2,3',4,4',5-2',3,4,4',5-3,3',4,4',5-2,3,3',4,4',5-2,3,3',4,4',5'- 2,3',4,4',5,5'- 3,3',4,4',5,5'- 2,3,3',4,4',5,5'- 이성체 (1) 시료 중의dioxin-like PCBs 농도의 실측치는 pg/g 시료 (식품) 또는 시료 중 지방함량을 계산하여 지방을 기준으로 pg/g 지방 으로 표시한다. (2) 독성등가 환산농도의 계산방법 계산된 농도에 dioxin-like PCBs 각각의 독성등가계수 (toxic equivalent factor, TEF)를 곱하여 독성등가값으로 환산하고 시료에서 검출된 dioxin-like PCBs 모두의 농도를 합하여 총 독성등가값 (toxic equivalent, TEQ)으로 농도를 표시한다. 2005년 WHO에서 제정한 독성등가계수는 Table 15와 같다. 총 독성등가값 (TEQ) = (dioxin-like PCBs 농도 x TEF) Table 15. Dioxin-like PCBs의 독성등가계수 non-ortho PCBs WHO-TEF mono-ortho PCBs WHO-TEF 3,3',4,4'-TeCB ,3,3',4,4'-PeCB ,4,4',5-TeCB ,3,4,4',5-PeCB ,3',4,4',5-PeCB 0.1 2,3',4,4',5-PeCB ,3',4,4',5,5'-HxCB ',3,4,4',5-PeCB ,3,3',4,4',5-HxCB ,3,3',4,4',5'-HxCB ,3',4,4',5,5'-HxCB ,3,3',4,4',5,5'-HpCB

242 4) Dioxin-like PCBs 수치의 취급 농도에 대한 유효숫자는 원칙적으로 소숫점 이하4자리에서 반올림하여 3자리로 표시한다. 예를 들면, 독성등가값에서 유효숫자가 소수점이하 4자리에서 시작되는 경우에는 소숫점 이하 3자리까지 표시한다 (0.000 또는 0.001로 한다). 또, 실측값이 정량한계이하의 경우에는 not detected로서 ND 로 표시하는데, 환산농도는 0 으로 한다. 다. PBDEs의 결과 표시 1) PBDEs 동족체 및 이성체의 표시방법 동족체 농도는 각 동족체 농도와 그 총합을 표시하고, 이성체 농도는 브롬치환체의 각 이성체 (7 이성체) 농도를 표시한다. 단, 표시 방법은 Table 16을 참조한다. Table 16. PBDEs 동족체 및 이성체의 표시방법 브롬원자수 3브롬화물 4브롬화물 5브롬화물 6브롬화물 7브롬화물 (3브롬~7브롬) 동족체 TriBDEs TeBDEs PeBDEs HxBDEs HpBDEs PBDEs 브롬화난연제 이성체 2,4,4'- 2,2',4,4'- 2,2',4,4',5-2,2',4,4',6-2,2',4,4',5,5'- 2,2',4,4',5',6-2,2',3,4,4',5',6-2) 정량한계 검출한계 (LOD)는 signal/noise 비율을 3:1로 하고 정량한계 (LOQ)는 10:1로 계산한다. 3) 농도표시방법 시료의 농도 실측치는 pg/g 지방 또는 ng/g 지방 으로 표시한다. 4) 수치의 취급 농도에 대한 유효숫자는 원칙적으로 소숫점 이하 3 자리에서 반올림하여 2 자리로 표시한다. 또한 실측값이 정량한계 이하의 경우에는not detected로서 ND 로 표시하는데, 농도는 0 으로 한다

243 수산물의 잔류 동물용의약품 분석법

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245 Ⅰ 수산물의 잔류 동물용의약품 분석법

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247 I. 수산물의 잔류 동물용의약품 분석법 Ⅰ-1 간이시험법 분석원리 : 검체 중 테트라싸이클린계, 마크로라이드계, 페니실린계, 아미노글리코사이드계, 설포아마이드계, 퀴놀론계, 세팔로스포린계, 펩타이드계, 폴리에테르계, 노보 비오신 등의 항균물질 및 합성항균제의 잔류여부를 계통별로 확인한다. 1. Bio-Assay 가. 시험재료 1) 시험균 시험균 ATCC NO. Medium Temp. ( ) 1. Antibiotic 2. medium Bacillus megaterium 9885 Nutrient agar MH Bacillus subtilis 6633 Nutrient agar #5 Bacillus cereus Nutrient agar #8 Bacillus stearothermophilus Nutrient agar #2 Escherichia coli Tryptic soy broth TA Kocuria rhizophila 9341 Tryptic soy broth EEC 2) 배지 (1) 계대, 증식용:Nutrient agar, Tryptic soy broth (이하 TSP라 한다) (2) 시험용:Antibiotic medium No. 2 (ph 6.55±0.05, 이하 AM #2라 한다.) Antibiotic medium No. 5 (ph 7.9±0.1, 이하 AM #5라 한다.) Antibiotic medium No. 8 (ph 5.85±0.05, 이하 AM #8라 한다.) Mueller Hinton medium (ph 7.3±0.1, 이하 MH라 한다.) Test agar ph 6.0 (ph 6.0, 이하 TA라 한다) EEC agar ph 8.0 (물 1L당 peptone 6.9g, NaCl 5.1g, KH2PO4 1.0g 및 Agar 13.0g, 이하 EEC라 한다.) (3) 아포 조제용 : A K #2 sporulating agar (BBL) 및 이와 동등한 것

248 3) 페트리접시 : 안지름 85±1 mm, 높이 20 mm의 밑면이 평평한 것 4) 디스크 : 직경 10 mm, 펄프디스크 (흡수량 0.07~0.08 ml) 5) 시험용 평판 검사용감수성 디스크:스트렙토마이신 감수성 디스크 (직경 6 mm, 10μg) 6) TMP (Trimethoprim) 용액 : TMP 10 mg을 용량플라스크에 달아 메탄올 10 ml에 녹이고 멸균 물을 넣어 10 ml로 한 후 10 μg/ml 용액이 되도록 희석하여 B. megaterium 평판 조제시 사용한다. 7) 착즙기 나. 시험균액의 조제 1) B. megaterium 아포액 조제 보통배지에 계대보관되어 온 시험균을 37 에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2~3 ml에 현탁시킨 후 아포조제용 배지300 ml를 넣어 굳힌 배양병(Roux bottle)에 접종하여 37 에서 1일간 배양 후 실온에서6일간 아포를 형성시킨다. 멸균유리구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣어 집균한 후 65 에서 30분간 가열한 후 분당 r/min으로 20분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균증류수에 부유시켜 세척을 3회이상 반복하고 잔사를 멸균증류수에 부유시켜 65 에서 30분간 재가열한다. 이를 멸균 증류수로 10단계 희석하여 표준한천배지로 균수를 측정한 후 아포농도를 CFU/ ml가 되도록 희석하여 사용한다. 장기간 보관시에는 냉동보관 한다. 2) B. subtilis 및 B. cereus의 아포액 조제 Nutrient agar에 계대보관되어 온 시험균을 멸균생리식염수 5 ml에 현탁시킨 후Nutrient agar 300 ml를 넣어 굳힌 배양병 (Roux bottle)에 접종하여 37 에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2~3 ml에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 ml를 넣어 굳힌 배양병 (Roux bottle)에 접종하여 37 에서 1일간 배양한 후 실온에서6일간 아포를 형성시킨다. 멸균유리구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣어 집균하여 65 에서 30분간 가열한 후 분당 r/min으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균수에 부유시켜 세척을 반복하고 잔사를 멸균수에 부유시켜65 에서 30분간 재 가열한다. 이 포자액은 MacFaland No. 1 정도 되게 멸균수로 희석 소분하여 냉장보관하여 사용한다. 장기간 보관시에는 냉동보관한다. 3) B. stearothermophilus의 아포액 조제 Nutrient agar에 계대, 보관되어온 균주를 멸균생리식염수 5 ml에 현탁시킨 후 Nutrient agar 300 ml를 넣어 굳힌 배양병 (Roux bottle)에 접종하여 시험균을 55 에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2~3 ml에 현탁시킨 후 아포조제용 배지300 ml를 넣어 굳힌 배양병 (Roux bottle)에 접종하여 55 에서 1주일간 배양한다. 멸균유리구슬과 멸균증류수 25 ml를 넣어 집균한 후 85 에서 15분간 가열한 후 분당 r/min으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균증류수에 부유시켜 세척을3회이상 반복하고 잔사를 멸균증류수에 부유시켜 85 에서 15분간 가열한 후 아포액의 농도를MacFaland No. 2 정도 되도록 희석 소분하여 냉장보관 한다. 장기간 보관시에는 냉동보관 한다

249 4) E. coli 및 K. rhizophila의 균액 시험일 하루 전 Tryptic soy broth 20 ml에 계대 보존균을 직경2 mm 백금이로 1 loopful을 접종하여 32 (K. rhizophila), 37 (E. coli) 항온수조에서 16시간 진탕배양한다. 이 균액 1 ml를 멸균물 19 ml에 희석하여 사용하며 (이때 균농도는 약 CFU/mL), 이 희석 균액은 4 냉장보관하면서 약 1주일간 사용 할 수 있다. 다. 시험용액 및 추출완충액의 조제 1) TMP (Trimethoprim)용액 TMP 10 mg을 용량플라스크에 달아 메탄올 10 ml에 녹이고 멸균 증류수를 넣어 100 ml로 한 후 15 μg ml -1 용액이 되도록 희석하여 B. megaterium 평판 조제시 사용한다. 2) 추출완충액 (1) 구연산 아세톤용액 0.2 M 구연산용액 (구연산 4.2 g을 물로 용해하여100 ml로 제조)과 0.5 M 수산화칼륨 용액 (수산화칼륨 2.8 g을 물로 용해하여 100 ml로 제조)를 동량으로 혼합한다 (A 용액). 이미 조제한 A 용액, 아세톤과 멸균증류수의 비율이35:35:30되게 혼합하여 추출완충액으로 한다. (2) 0.2 M 인산완충액 (ph 8.0) 인산이수소칼륨 g 및 인산일수소칼륨 g을 물에 녹여 ml로 한다. 라. 시험용 평판의 조제 1) B. megaterium 평판 멸균 후 약50 로 가온 보존된MH 배지 100 ml당 조제된 시험균액1 ml와 TMP용액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 페트리접시에8 ml씩 분주하여 수평으로 유지하여 응고 시킨다. 2) B. subtilis 평판 멸균 후 약 50 로 가온 보존된 AM #5 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다. 3) B. cereus 평판 멸균 후 약 50 로 가온 보존된 AM #8 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다. 4) B. stearothermophilus var. B. calidolactis C 953 평판 멸균 후 55 로 약 50 로 가온 보존된 AM #2 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다. 5) E. coli 평판 멸균 후 약 50 로 가온 보존된 TA 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다

250 6) K. rhizophila 평판 멸균 후 약 50 로 가온 보존된 EEC 배지에 100 ml당 조제된 시험균액 1 ml를 가하여 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다. 마. 시험용 평판의 검사 시험할 때마다 스트렙토마이신 감수성 디스크(10 μg)를 이용하여 각 시험용 평판의 감도를 확인한다. 즉, B. megaterium, B. cereus, B. subtilis 및 B. stearothermophilus, K. rhizophila 평판에서 스트렙토마이신 감수성 디스크의 저지환의 직경이 각20 mm 이상되는 평판을 사용하고 E. coli의 평판의 경우 직경이 약15 mm 이상이 되는 것을 사용한다. 바. 시험조작 1) 짜내기법 검체를 가능한 한 무균적으로 잘게 잘라서 착즙기를 이용하여 검체의 즙을 짜낸 뒤 그 즙을 디스크에 흡수시킨다. 흡수시킨 디스크를 검사용 평판 위에 놓는다. B. megaterium는 45, B. subtilis와 E. coli는37, B. cereus와 K. rhizophila는 30, B. stearothermophilus 는 55 에서 16~18시간 배양한다. 2) 디스크법 근육을 무균적으로 절개하여 준비한다. 준비한 검체는 디스크를 6개씩 삽입하여 30~60분간 체액을 흡수시킨다. 이후 디스크를 제거하여 6종류의 검사용 평판에 하나씩 올려놓고 가볍게 눌러준 다음 실온에 약 30분간 방치한 뒤 배양시킨다. 각 시험균은 짜내기법과 동일하게 배양한다. 사. 판정 직접법의 경우 주변 억제대 폭이 1.0 mm 이상인 것, 디스크법의 경우 저지환의 직경이 12 mm 이상인 것을 양성으로 판정한다. 양성으로 판정된 검체는 다음표에 따라 항균물질 또는 합성항균제의 계통을 추정할 수 있다. B. megaterium B. stearothermo B. subtilis B. cereus K.rhizophila E.coli (MH) -philus (AM #2) (AM #5) (AM #8) (EEC) (TA) 추정 물질 계통 Tetracycline계 Macrolide계 Penicillin계 Aminoglycoside계 Sulfonamide계 Quinolone계 ± ± ++ Cephalosporin계 Peptide계 Polyether계 Novobiocin 주) +++: 0.1ppm 이하, ++: 0.1 1ppm, +: 1 10ppm,

251 MacFarland 농도 MacFarland No %H 2 SO 4 (ml) %BaCl 2 (ml) 1 2 세균수 ( 10 8 /ml) 3 6 동결건조 균주의 재생방법

252 Ⅰ-2 정밀정량검사법 1. 옥시테트라싸이클린, 클로르테트라싸이클린, 테트라싸이클린, 독시싸이클린 (Oxytetracycline, Chlortetracycline, Tetracycline, Doxycycline) 가. 정량법의 원리 시료에 EDTA가 함유된 트리클로로아세트산를 가하여 균질화한 후 원심분리하고 여기에 헥산을 가해 추출하여 농축한 다음 Sep-pak C 18 카트리지에 흘려 흡착 및 용출시켜 측정한다. 나. 측정기기 액체크로마토그라프/자외부검출기 다. 시약 및 시액 1) 표준원액 : 옥시테트라싸이클린, 클로르테트라싸이클린, 테트라싸이클린, 독시싸이클린 표준품을 각각 정밀히 달아100 ml용량 플라스크에 취하고 메탄올로 표시선 까지 채워 100 mg/l농도가 되게 한다. 2) 표준용액 : 표준원액을 메탄올로 10 μg ml -1 농도가 되게 한 후 희석하여 사용한다. 3) 이 동 상 : 무수수산 1.26 g을 물 1L에 용해시킨 후 이 액720 ml와 아세토니트릴 180 ml 그리고 메탄올 100 ml를 잘 혼합한 후 0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 이동상으로 사용한다. 4) 기타 시약 : 특급 라. 시험용액의 조제 시료를 마쇄한 후 10 g을 취해 0.5 % EDTA가 함유된 5 % 트리클로로아세트산 40 ml를 가하여 균질기로 2분간 균질화한다. 이 액을 r/min에서 20분간 원심분리해 상층액을 취해 분액여두로 옮기고 헥산 : 클로로포름 (9 : 1) 혼합액 40 ml를 가해 혼합한 후 액층이 분리될 때까지 정치한다. 분리된 액층중 아래층은 다른 분액여두에 옮겨 헥산 : 클로로포름 (9 : 1) 혼합액을 다시 40 ml 가하여 액층을 분리한다. 분리된 아래 액층은 농축수기에 받아 3 ml 정도가 되도록 40 에서 감압 농축한다. 농축액은 활성화시킨 Sep-pak C 18 카트리지에 흘린 후, 증류수 40 ml를 흘려 세척한다. 카트리지에 흡착된 성분은 메탄올 40 ml를 흘려 용출시키고, 용출액은 다시 감압하에서 농축기로 건조시킨다. 시험액이 건조된 수기에 이동상 2 ml를 가하여 녹이고 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 후 시험용액으로 사용한다. * Sep-pak C 18 카트리지 활성화 진공음압기에 장착하여 20 ml의 메탄올과 20 ml의 증류수를 순차적으로 흘려 세척하고, 5 % EDTA 용액 10 ml를 흘린다

253 마. 시험조작 1) 측정조건 (1) 칼 럼 : C 18 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 (2) 이 동 상 : 0.01 M 수산 : 아세토니트릴 : 메탄올 (70:20:10, v/v/v) (3) 유 속 : 1.0 ml/분 (4) 측정파장 : 360 nm (5) 정량시험 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 옥시테트라싸이클린, 클로르테트라싸이클린, 테트라싸이클린, 독시싸이클린의 함량을 각각 구한다. 확인시험 가. 측정조건 1) 액체크로마토그래프 조건 - 칼럼 : C 18 ( mm, 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것 - 칼럼온도 : 35 - 이동상 이동상 A : 0.1 % 개미산 용액 이동상 B : 0.1 % 개미산 아세토니트릴 시간 (분) 이동상 A (%) 이동상 B (%) 유속 : 0.3 ml/분 - 주입량 : 5 μl 2) 질량분석기 조건 - Ionization : ESI (positive) - Capillary temperature : Collision gas : 아르곤 (Ar) - Collision energy : 15 ~ 30 V

254 나. 확인 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 표준용액에서 분리 확인되는 특이이온이 시험용액에서 존재하는지를 비교 확인한다. 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름시간과 일치 하여야 한다. 물질 Precursor ion (m/z) Fragment ion (m/z) 옥시테트라싸이클린 , 443, 381 테트라싸이클린 , 410, 154 클로르테트라싸이클린 , 444, 154 독시싸이클린 , 321, 클로람페니콜 (Chloramphenicol) 가. 시험법 적용범위 축 수산물, 벌꿀, 로얄젤리 등에 적용한다. 나. 분석 원리 검체 중 클로람페니콜을 물 또는 에틸아세테이트 등으로 추출한 후 SPE (Solid Phase Extraction) 칼럼 또는 헥산을 이용하여 정제하고 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다. 다. 장치 액체크로마토그래프/질량분석기 (LCMSMS) 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 3) 표준원액 : 클로람페니콜 표준품 을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/ml로 하고 이를 영하 20 에 보관한다. 사용 시 표준품을 실온에 두어 용액의 온도가 실온과 동일해지면 사용한다. 4) 표준용액 : 표준원액을 메탄올:물 (1:1, v/v) 혼합용액에 적당한 농도로 희석하여 사용하며, 냉장고에 보관한다. 5) Divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone Copolymer (충진제) 카트리지 칼럼 : HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance) 카트리지 또는 이와 동등한 것 6) 기타시약 : 특급

255 마. 시험용액의 조제 1) 축 수산물 균질화한 검체 5 g을 50 ml 원심관에 취한 후 (유 ( 乳 )와 알 ( 卵 )의 경우 아세트산 200 μl와 아세토니트릴 5 ml를 가한다) a 에틸아세테이트 20 ml를 가하여 10분간 진탕하고 g에서 5분간 원심분리 한다. a과정을 2번 반복하고 상등액을 합하여 농축한 후 메탄올 2 ml를 가하여 잔류물을 녹이고 20 % 염화나트륨 수용액 20 ml를 가하여 30초간 균질화 한다. b 이 균질액에 헥산 20 ml를 가하고 5분간 균질화한 후 g에서 5분간 원심분리하고 헥산층을 버린다. b과정을 2번 반복한 후 남은 액에 에틸아세테이트 15 ml를 가한다. 이 혼합액을 30초간 균질화한 후 g에서 5분간 원심분리하고 에틸아세테이트층을 다른 원심관에 취한다. 남은 액에 에틸아세테이트 15 ml를 가하고 30초간 균질화한 후 g에서 5분간 원심분리하고 앞의 에틸아세 테이트층과 합한다. 에틸아세테이트 약 2 ml로 벽면을 씻어주면서 이 에틸아세테이트 층을 농축한 잔류물은50 % 메탄올 수용액 1 ml 녹이고 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 측정조건 (1) 액체크로마토그래프 조건 1 칼럼 : C 18 (2 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것 2 이동상 이동상 A : 0.1 % 아세트산 수용액에 10 mm 초산암모늄이 되도록 녹인 용액 이동상 B : 아세토니트릴 (95 %)과 이동상 A (5 %)와의 혼합액 시간 (분) A (%) B (%) 유속 : 0.2 ml/min 4 칼럼온도 : 40 5 주입량 : 20 μl (2) 질량분석기 조건 1 Ionization : ESI (negative) 2 Scan Width : 1.5이하

256 3 Capillary Temperature : 사. 정량 Auxiliary Gas : 질소 5 Collision Gas : 아르곤 또는 헬륨 1) 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인하고, 이온별 비율을 만족해야 한다. 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고 m/z 152의 피크에 대한 평균면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 클로람 페니콜의 함량을 구한다. 검량선 작성은 표준용액 1.0, 2.5, 5.0, 10, 25, 50 μg/l의 농도 중 시험용액의 클로람페니콜 농도에 따라 5개 농도를 이용한다. 물질 Precursor Ion (m/z) 클로람페니콜 321 * 이온별 비율은 분석조건에 따라 차이날 수 있음. 2) 정량한계 - 축 수산물, 벌꿀 0.5 μg/kg Fragment ion (m/z) 이온별 비율 (%)* 스피라마이신 (Spiramycin) 가. 정량법의 원리 시료 중 스피라마이신을 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 액체 크로마토그래프/자외부흡광광도검출기로 분석한다. 나. 측정기기 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기 다. 시약 및 시액 1) 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 3) 표준원액 : 스피라마이신 표준품을 정밀히 달아100 ml 용량플라스크에 취하고 메탄올로 표시선까지 채워 100 μg ml -1 농도가 되게 한다. 4) 표준용액 : 표준원액을 0.05 M 인산완충용액 (ph 4.5)과 아세토니트릴 혼합액 (70:30, v/v)에 적당한 농도로 희석하여 사용한다

257 5) 0.05 M 인산완충용액 (ph 4.5) : 1 L 정용플라스크에 인산이수소나트륨 2수 화물 (NaH 2 PO 4 2H 2 O) 3.9 g을 넣고 물 800 ml로 용해시킨 후 물로 표시선까지 채운다. ph는 인산으로 조정한다. 6) M 인산완충용액 (ph 2.5) : 1 L 정용플라스크에 인산이수소나트륨 2수화물 (NaH 2 PO 4 2H 2 O) 2.0 g을 넣고 물 800 ml로 용해시킨 후 물로 표시선까지 채운다. ph는 인산으로 조정한다. 7) 기타시약 : 특급 라. 시험용액의 조제 균질화한 시료 1 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 20 ml를 가하여 20분간 균질화 한다. 균질액을 G에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 여과지로 여과하여 분액깔대기에 옮긴다. 위의 과정을 2회 반복하여 상층액을 합한 후 아세토니트릴포화헥산 10 ml를 넣고 진탕한다. 층이 분리될 때까지 정치하여 헥산층을 버리고 추출된 용액을 무수황산나트륨에 통과시키고 45 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축한다. 잔류물은 0.05 M 인산완충용액 (ph 4.5)과 아세토니트릴 혼합액 (70:30, v/v) 1 ml에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 마. 시험조작 1) 측정조건 1 칼 럼 : C 18 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 2 이 동 상 이동상 A : M 인산완충용액 (ph 2.5), 이동상 B : 이동상 A와 아세토니트릴 혼합액 (60:40) 시간 (분) A (%) B (%) 유 속 : 1.0 ml/분 4 측정파장 : 232 nm 2) 정량시험 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 스피라마이신의 함량을 각각 구한다

258 4. 날리딕스산 (Nalidicxic acid), 다노플록사신 (Danofloxacin), 디플록사신 (Difloxacin), 마보플록사신 (Marbofloxacin), 사라플록사신 (Sarafloxacin), 오비플록사신 (Orbifloxacin), 옥소린산 (Oxolonic acid), 플루메퀸 (Flumequine) 가. 시험법 적용범위 축산물, 수산물 등에 적용한다. 나. 분석원리 검체 중 날리딕스산, 다노플록사신, 디플록사신, 마보플록사신, 사라플록사신, 오비플록 사신, 옥소린산 및 플루메퀸을 삼염화초산과 아세토니트릴 혼합용액으로 추출한 후 헥산으로 지방을 제거하여 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다. 다. 측정기기 액체크로마토그래프/형광검출기 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 표준원액 : 날리딕스산, 다노플록사신, 디플록사신, 마보플록사신, 사라플록사신, 오비 플록사신, 옥소린산 및 플루메퀸 표준품을 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/l로 한다. 조제된 표준원액은 냉동보관한다. 3) 표준용액 : 표준원액을 0.01 M 수산 완충용액 (ph 3.5):아세토니트릴 (83:17, v/v) 혼합용액으로 희석하여 날리딕스산은 0.015, 0.03, 0.06, 0.09 및 0.12 mg/l, 다노플록사신, 마보플록사신은 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 및 0.6 mg/l (유 ( 乳 ) 분석시에는 0.015, 0.03, 0.06, 0.09 및 0.12 mg/l), 디플록사신은 0.05, 0.1, 0.3, 0.6 및 1.2 mg/l, 사라플록사신은 0.005, 0.01, 0.02, 0.04 및 0.08 mg/l, 오비플록사신은 0.01, 0.02, 0.04, 0.08 및 0.12 mg/l, 옥소린산은 0.025, 0.05, 0.1, 0.15 및 0.3 mg/l, 플루메퀸은 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 및 1.5 mg/l가 되게 한다. 조제된 혼합표준용액은 냉장보관한다. 4) 내부표준원액 : 시노사신 (Cinoxacin) 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/l로 한다. 조제된 내부표준원액은 냉동보관한다. 5) 내부표준용액 : 내부표준원액을 0.01 M 수산 완충용액 (ph 3.5):아세토니트릴 (83:17, v/v) 혼합용액으로 희석하여 4 mg/l가 되게 한다. 조제된 내부표준용액은 냉장보관한다. 6) 0.01 M 수산완충용액 (ph 3.5) : 1 L 메스플라스크에 수산 0.9 g을 넣고 물에 녹여 표시선까지 채우고 5 M 수산화나트륨 용액으로 ph 3.5로 조정한다

259 마. 시험용액의 조제 균질화 한 검체 2 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 내부표준용액 200 μl와 2.5 % 삼염화초산:아세토니트릴 (25:75, v/v) 혼합용액 7 ml를 가한 후 10분간 흔들어 섞는다. 이 용액에 황산나트륨 2 g을 가하고 10분간 흔들어 섞은 후 G에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 남은 액에 2.5 % 삼염화초산:아세토니트릴 (25:75, v/v) 혼합용액 7 ml를 가한 후1분간 흔들어 섞고2 700 G에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 앞의 상층액과 합한다. 이 상층액에 헥산 10 ml을 가하고 1분간 흔들어 섞은 후 G에서 20분간 원심분리를 하여 아래층을 취한다. 45 에서 질소농축 후 잔류물을 0.01 M 수산 완충용액 (ph 3.5):아세토니트릴 (83:17, v/v) 혼합용액 1 ml에 녹이고 4, G에서 20분간 원심 분리한다. 상층액을 취하고 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 측정조건 (1) 칼럼 : C 18 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 (2) 칼럼온도 : 25 (3) 이동상 - 이동상 A : 0.01 M 수산완충용액 (ph 3.5) - 이동상 B : 아세토니트릴 (4) 유속 : 1.0 ml/분 (5) 측정파장 시간 (분) 이동상 A (%) 이동상 B (%) 시간 파장 (분) 여기파장 (nm) 형광파장 (nm) 물질 마보플록사신 (6) 주입량 : 20 μl 다노플록사신, 오비플록사신, 디플록사신, 사라플록사신 옥소린산, 날리딕스산, 플루메퀸

260 사. 정량시험 1) 표준용액 및 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 피크 머무름 시간을 비교하여 시노사신 피크 면적에 대한 날리딕스산, 다노플록사신, 디플록사신, 마보플록사신, 사라플록사신, 오비플록사신, 옥소린산 및 플루메퀸 각각의 피크 면적비로 검량선을 작성하고 시험용액 중 각각의 함량을 구한다. 2) 정량한계 (1) 날리딕스산 : 0.01 mg/kg (2) 다노플록사신 : 0.01 mg/kg (3) 디플록사신 : 0.01 mg/kg (4) 마보플록사신 : 0.02 mg/kg (5) 사라플록사신 : mg/kg (6) 오비플록사신 : 0.01 mg/kg (7) 옥소린산 : mg/kg (8) 플루메퀸 : 0.01 mg/kg 5. 엔로플록사신 (Enrofloxacin), 시프로플록사신 (Ciprofloxacin), 노르플록 사신 (Norfloxacin), 오플록사신 (Ofloxacin) 및 페플록사신 (Pefloxacin) 가. 시험법 적용범위 축산물, 수산물 등에 적용한다. 나. 분석원리 검체 중 플루오로퀴놀론계를 검체고체상분산법 (MSPD, Matrix Solid Phase Dispersion) 또는 인산, 이동상 및 아세토니트릴 등으로 추출하여 헥산 또는SPE (Solid Phase Extraction) 칼럼을 이용하여 정제하고 액체크로마토그래프 /형광검출기로 분석한다. 다. 장치 : 액체크로마토그래프/형광검출기 라. 시약 및 시액 1) 표준원액 : 엔로플록사신, 시프로플록사신, 노르플록사신, 오플록사신 및 페플록사신 표준품을 정밀히 달아 100 ml 메스플라스크에 취하고 메탄올로 표시선 까지 채워 100 μg ml -1 농도가 되게 한다. 2) 표준용액 : 표준원액을 이동상으로 적당한 농도가 되게 희석하여 사용한다. 3) 0.05 M 인산완충용액 (ph 7.4) : 1 L 메스플라스크에 0.2 M 인산이수소칼륨 (KH 2 PO 4 ) 250 ml와 0.2 M 수산화나트륨 ml를 혼합한 후 물로 표시선 까지 채운다. 4) 기타시약 : 특급

261 마. 시험용액의 조제 1) 유 ( 乳 ) 검체를 균질화하여 5 g을 원심분리관에 취한 후20 % 메탄올성 트리클로로초산 2.5 ml를 넣고 15초간 균질화 한다. 이 용액을 g에서 10분간 원심분리한 후 0.05 M 인산 완충용액 (ph 7.4) 12.5 ml을 가하고 g에서 15분간 다시 원심분리 한다. 상층액을 메탄올 6 ml, 물 6 ml, 0.05 M 인산완충용액 (ph 7.4) 6 ml로 차례로 미리 활성화시킨 C 18 카트리지에 흡착시키고 물 3 ml로 세척한 후, 3분간 vacuum하에서 건조시키고 아세토니트릴성 1 % trifluoroacetic acid 6 ml로 용출한다. 용출액은 45 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 이동상2 ml에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 2) 어류 및 갑각류 검체를 마쇄한 후 5 g을 취한 후 이동상과 아세토니트릴을 1:1로 섞은 혼합액40 ml를 가하여 균질기로 2분간 균질화 시킨다. 이 액을 80 에서 10분간 열처리하여 방냉 한 다음 3 000G에서 10분간 원심분리 하여 상등액을 취한다. 이 상등액을 분액여두로 옮겨 헥산 50 ml을 가하여 액층이 분리될 때까지 정치한다. 분리된 하층액은 40 에서 잔사만이 남을 때까지 감압농축하고 이 건고물은 이동상2.5 ml을 가하여 충분히 용해 시킨 다음 멤브레인필터로 여과한 후 시험용액으로 사용한다. 3) 유 ( 乳 ), 어류 및 갑각류를 제외한 모든 식품 C 18 분말 2 g을 유발에 취하고 시료 0.5 g을 정확히 달고 수산 0.05 g과 무수황산나트륨 0.03 g을 첨가한 후 유봉으로C 18 과 시료가 완전히 균질화 되도록 한다. 여과지 (Whatman No. 1) 2장을 10 ml 주사기에 넣고 균질화 된 혼합물을 주사기에 옮겨 담는다. 혼합물 위에 여과지 1장을 놓고 주사봉을 이용하여 혼합물의 부피가 약4.0 ml 되게 압축한다. 헥산 8 ml를 가하여 흘려보내고 주사기를vacuum manifold로 옮겨 혼합물 내에 남아있는 헥산을 음압 하에서 제거한다. 다시 에틸아세테이트 8 ml로 세척하고 주사기를 vacuum manifold로 옮겨 음압 하에서 완전히 건조시킨다. 메탄올 13 ml로 용출시킨 후 그 용출액을 질소 농축하여 건조시키고 이동상 0.5 ml를 가하여 10분간 초음파를 통과시키고 용해시킨 후 4, r/min에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취해 0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다. 바. 시험조작 1) 측정조건 - 칼 럼 : C 18 (4.6 mm 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 - 이 동 상: 0.4 % 트리에틸아민, 0.4 % 인산의 혼합액: 아세토니트릴: 테트라히드로퓨란 (920 : 78 : 2) - 유 속 : 1.0 ml/분 - 측정파장 : 여기파장 278 nm, 측정파장 455 nm

262 사. 정량시험 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그라프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체중 엔로플록사신, 시프로플록사신, 노르플록사신, 오플록사신 및 페플록사신의 함량을 각각 구한다. - 정량한계 (0.05 mg/kg) 6. 니트로퓨란 대사물질 (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 가. 시험법 적용범위 축산물, 수산물 등에 적용한다. 나. 분석 원리 검체 중의 푸라졸리돈, 푸랄타돈, 니트로푸라존 및 니트로푸란토인의 대사물질을 염산 용액으로 처리하여 니트로벤즈알데히드 (NBA)로 유도체화한 후 에틸아세테이트로 추출 농축하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다. 다. 장치 액체크로마토그래프/질량분석기 (LCMSMS) 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 3) 표준품 : 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone (AMOZ), semicarbazide (SEM), 1-aminohydantoin (AHD) 4) 내부표준품 : 3-amino-2-oxazolidinone-D 4 (AOZ-D 4 ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone-D 5 (AMOZ-D 5 ) 5) 표준원액 : 니트로푸란계 대사물질 표준품 (AOZ, AMOZ, SEM, AHD)을 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 6) 표준용액 : 표준원액을 메탄올로 희석하여 각각 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml 농도가 되게 하여 사용한다. 7) 내부 표준물질 표준원액 : 내부 표준품 (AOZ-D 4, AMOZ-D 5 )을 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 8) 내부 표준물질 혼합용액: 내부 표준물질 표준원액을 하나의 용량 플라스크에 메탄올로 희석하여 각각 100 ng/ml가 되게 혼합하여 사용한다

263 9) 0.05 M 유도체화용액 : 2-니트로벤즈알데히드 (2-NBA, MW , 99 %) 0.76 g을 디메틸설폭사이드 100 ml에 녹여 유도체화 용액으로 한다. 이 용액은 사용직전에 만들어 사용한다. 10) 1 M 인산칼륨 용액 : 1 L 정용플라스크에 인산일수소칼륨 (K 2 HPO 4, MW 174.2, 99.2 %) g을 가하여 물400 ml에 녹인후 물로 표시선까지 채운다. 11) 기타시약 : 특급 마. 시험용액의 조제 1) 벌꿀을 제외한 모든 식품 균질화한 검체 5 g을 50 ml 원심분리관에 취하여 ᄂ (내부표준물질 혼합용액 200 μl를 첨가하여 15분간 정치한 후 M 염산 10 ml와 0.05 M 유도체화 용액 200 μl를 넣고 37 수욕조에서 흔들어 주면서 16시간 반응시킨다. 유도체화된 시험용액을 실온까지 냉각시킨 후 0.1 M 인산칼륨용액 1 ml와 1 M 수산화나트륨용액 500 μl를 가해서 혼합한다 M 염산용액과 M 수산화나트륨용액으로 약 ph 7.0으로 조정한다. 이 시험용액의 잔류물을 제거하기 위해 G에서 10분간 원심분리하고 상층액을 원심분리관에 옮겨 헥산 10 ml (우유, 계란의 경우 20 ml)를 가하여 혼합한 후 G에서 5분간 원심분리 한다. 하층을 새로운 원심분리관에 취하고 에틸아세테이트 8 ml를 가하여 혼합하고 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하여 유리관에 넣는다. 이런 과정을 2회 반복하여 얻어진 상층액을 질소하에서 농축 건조한 후 이동상 0.5 ml에 용해시켜 G에서 10분간 원심분리 한다. 상층액을 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 표준용액의 유도체화 음성검체 5 g (벌꿀의 경우 2 g)을 50 ml 원심관에 넣고 농도 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml인 표준용액을 각각 100 μl를 첨가하여 5)의 ᄂ (벌꿀의 경우 ᄀ)을 따른 후 분석시 표준용액으로 사용한다. 사. 시험조작 1) 측정조건 (1) 액체크로마토그래프 조건 -칼 럼 : C 18 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 -이동상 : 메탄올 : 10 mm 암모늄포메이트 (55:45, 개미산으로 ph 3.5로조정) - 유 속 : 0.2 ml/분 (2) 질량분석기 조건 - Ionization : ESI (positive) - Capillary temperature :

264 - Collision gas : Ar - Collision energy : 10~15 V 아. 정량시험 1) 유도체화한 시험용액 및 표준용액을 질량분석기에 주입하여 아래표의 분석물질별 특정이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교 하여 내부표준물질 AOZ-D 4 의 m/z 240 이온에 대한 AOZ m/z 149, SEM m/z 192, AHD m/z 178이온의 면적비와 AMOZ-D 5 의 m/z 340 이온에 대한 AMOZ m/z 262 이온에 대한 면적비를 각각 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 니트로푸란계 대사물질의 함량을 구한다. 대상물질 분석물질 Precursor Ion (m/z) Fragment ion (m/z) AOZ NBAOZ , 134 AMOZ NBAMOZ , 291 SEM NBSEM , 166 AHD NBAHD , 134 AOZ-D 4 NBAOZ-D AMOZ-D 5 NBAMOZ-D ) 정량한계 : 1 μg/kg 7. 니트로빈 (Nitrovin) 가. 시험법 적용범위 축산물, 수산물, 벌꿀 등에 적용한다. 나. 분석 원리 검체 중의 니트로빈을 디클로로메탄:메탄올:암모니아수 혼합용액으로 추출하고 메탄올과 초산과 부틸아민 혼합용액으로 재분산한 후 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기로 분석한다 다. 장치 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

265 3) 표준원액 : 니트로빈 표준품을 정밀히 달아 2 % 암모니아수를 함유한 아세토니트릴에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 4) 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다. 5) 기타시약 : 특급 마. 시험용액의 조제 균질화한 검체 5 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 A과정[디클로로메탄 : 메탄올 : 암모니아수 (900:50:1) 혼합용액 20 ml를 가한 후 균질화하고 30분간 진탕한다. 이를 G에서 10분간 원심분리하고 하층을 취한다.]을 실시한다. A과정을 반복하여 하층을 합친 후 40 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축하고 잔류물을 이동상 1 ml에 녹인다. 이를 다시4 000 G에서 5분간 원심분리하여 상층액을 취하고 여기에 헥산1 ml를 가하여 혼합한 후 G에서 5분간 원심분리하고 하층액을 취한다. 이를 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 측정조건 (1) 칼럼 : CN ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 (2) 이동상 : 메탄올:물:초산:부틸아민 (2500:50:10:1, v/v/v/v) (3) 유속 : 1.0 ml/min (4) 측정파장 : 365 nm 2) 정량 (1) 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 니트로빈의 함량을 구한다. (2) 정량한계 : 0.05 mg/kg 8. 말라카이트 그린 (Malachite Green), 크리스탈 바이올렛 (Crystal Violet) 가. 시험법 적용범위 축산물, 수산물 등에 적용한다. 나. 분석 원리 검체를 아세토니트릴과 디클로로메탄으로 추출하고 감압농축한 후, 2,3-디클로로-5,6- 디시아노-1,4-벤조퀴논 (DDQ)을 이용하여 류코말라카이트 그린 및 류코크리스탈 바이올렛을 각각 말라카이트 그린 및 크리스탈 바이올렛으로 산화시키고SPE (Solid Phase Extraction) 칼럼으로 정제하여 액체크로마토그래프/가시부흡광광도검출기로 분석한다

266 다. 장치 액체크로마토그래프/가시부흡광광도검출기 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 3) 표준원액 : 말라카이트 그린 및 크리스탈 바이올렛 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg ml -1 로 하고 갈색병에 보관한다. 4) 표준용액 : 표준원액을 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 사용한다. 5) 1 mm 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논 (2,3-Dichloro-5,6- dicyano-1,4-benzoquinone, DDQ) 용액 : 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논 g을 100 ml 용량플라스크에 취하고 아세토니트릴로 녹여 표시선까지 채워10 mm DDQ 용액을 만들어 냉장 보관한다. 사용직전에 10 mm DDQ 용액을 아세토니트릴로 10배 희석하여 사용한다. 6) 25 % 염산수산화아민 용액 (Hydroxylamine hydrochloride, HAH) : 염산수산화아민 25 g을 100 ml 용량플라스크에 취하고 물로 녹여 표시선까지 채운다. 7) 1 M p-톨루엔설폰산 (p-toluene sulfonic acid, p-tsa) 용액 : p-톨루엔설폰산 9.5 g을 50 ml 용량플라스크에 취하고 물로 녹여 표시선까지 채운다. 8) 5 mm p-톨루엔설폰산/0.1 M 암모늄아세테이트 완충용액 : 7.7 g 암모늄아세테이트를 1 L 용량플라스크에 취하고 물로 녹여 표시선까지 채운다. 아세트산 8 ml와 1 M p-톨루엔설폰산 5 ml를 넣어 ph 4.5로 조정한다. 이 액은 이동상A 용액 조제 시 사용한다. 9) 알루미나 (충진제 alumina, 중성) 카트리지 또는 이와 동등한 것 10) 프로필설폰산 (충진제 Propylsulfonic acid, PRS) 카트리지 또는 이와 동등한 것 11) 기타시약 : 특급 마. 시험용액의 조제 균질화한 검체 5 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 5 mm p-톨루엔설폰산/0.1 M 암모늄 아세테이트 완충용액 5 ml, 25 % 염산수산화아민 (HAH) 용액 1 ml, 1 M p-톨루엔설 폰산 (p-tsa) 용액 100 μl를 넣어 30초간 강하게 균질화한다. 여기에 아세토니트릴 25 ml를 넣어 30초간 강하게 진탕하고 다시 알루미나10 g을 넣어 15초간 강하게 진탕한 후 0, G에서 5분간 원심분리하고 상등액은 미리 물50 ml와 디에틸렌글리콜 2 ml를 넣은 250 ml 분액깔대기에 옮긴다. 다시 아세토니트릴 25 ml를 넣어 1분간 강하게 진탕하고 0, G에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 앞의 액과 합한다. 디클로로메탄 25 ml를 넣고 분액깔대기를 30초간 흔들어 섞은 후 정치하여 디클로로메탄층(아래층)을 취한다

267 다시 디클로로메탄 25 ml를 넣어 이 과정을 한 번 반복하고40 수욕 중에서 감압농축한 후 잔류물을 아세토니트릴 3 ml에 녹이고 1 mm 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논 (DDQ) 용액 3 ml를 넣어 30분간 반응시킨다. 알루미나 카트리지 (충진제 1 g) 및 프로필설폰산 (Propylsulfonic acid, PRS) 카트리지 (충진제 500 mg)를 미리 메탄올 5 ml와 아세토니트릴 5 ml로 활성화시키고, 프로필설폰산 카트리지에 아세토니트릴 5 ml를 넣은 후 알루미나 카트리지를 그 위에 연결한다. 시료를 추출한 액과 추출액이 담겨 있던 플라스크를 아세토니트릴 5 ml로 2회 세척한 액을 알루미나 카트리지에 흡착시키고 감압하여 분당 4 ml로 용출하고 알루미나 카트리지를 제거한다. 프로필설폰산 카트리지를 아세토니트릴 5 ml로 세척하고 감압하여 건조시킨 후 15 ml 원심분리관에 이동상 A 용액 4 ml로 용출한 액을 받아 이동상A 용액으로 5 ml 눈금에 맞춘 후 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 측정조건 (1) 칼럼 : C 18 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 (2) 이동상 - 이동상 A (95 %) : 5 mm p-톨루엔설폰산/0.1 M 암모늄아세테이트 완충용액 : 아세토니트릴 (50:50) - 이동상 B (5 %) : 아세토니트릴 (3) 유속 : 1.0 ml/min (4) 측정파장 : 618 nm (말라카이트그린), 588 nm (크리스탈바이올렛) 사. 정량시험 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 말라카이트 그린 및 크리스탈 바이올렛의 함량을 각각 구한다. - 정량한계 : 2 μg/kg 아. 확인시험 액체크로마토그래프/질량분석기로 정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크 높이법 또는 피크 면적법에 따라 확인한다. 1) 액체크로마토그래프 조건 - 칼럼 : C 18 ( mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것 - 이동상 이동상 A : 0.1 % 개미산 수용액 이동상 B : 0.1 % 개미산 메탄올용액

268 시간 (분) A (%) B (%) 유속 : 0.3 ml/min 2) 질량분석기 조건 - Ionization : ESI (positive) - Capillary Temperature : Collision gas : N 2 Compound Malachite green Crystal violet Precursor Ion (m/z) Fragment Ion (m/z) Collision Energy (V) 아목시실린 (Amoxicillin) 및 암피실린 (Ampicillin) 가. 정량법의 원리 칼럼 전 유도체화법을 이용한 것으로 시료중의 아목시실린과 암피실린을 물로 추출하여 삼염화초산 (trichloroacetic acid)으로 불순물을 침전시키고 에테르로 추출한 다음 유도체화 하여 고속액체크로마토그래프-자외부검출기로 측정한다. 나. 측정기기 액체크로마토그래프/자외부검출기 다. 시약 및 시액 1) 표준원액 : 아목시실린 및 암피실린 표준품을 각각 정밀히 달아 증류수에 용해시켜 100 mg/l 농도가 되게 한다. 2) 표준용액 : 표준원액을 증류수에 적당한 농도로 희석하여 사용한다

269 3) 0.05 M 인산완충용액 (ph 6.5) : 제일인산나트륨 (NaH2PO4) g과 제이인산나트륨 (NaHPO4) g을 증류수에 녹여 1L로 하고 멤브레인필터로 여과하여 사용한다. 4) 기타시약 : HPLC급 및 특급 라. 시험용액의 조제 균질화한 검체 5g을 취한 후 증류수 40 ml를 가하여 균질화한 다음 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 이 추출액에 70 % 삼염화초산 (트리클로로초산) 1 ml를 가하여 단백질을 석출시켜 다시 G에서 10분간 원심분리한 후 여과하여 상층액을 50 에서 2~3 ml로 감압농축하여 얻은 액을5mL 정도 되게 물로 정용한 다음 디에틸에테르 6mL를 가하여 30분간 진탕 후 G에서 2분간 원심분리하고 하층을 취한다. 하층은 20 % 삼염화초산 0.5 ml을 가하여 진탕한 후 다시7 % 포름알데히드 용액 1mL를 가하고 뚜껑을 한 후, 60초간 진탕하여 100 에서 30분간 가열하고 즉시 방냉한다. 이 유도체화된 액은 디에틸에테르 6mL를 넣어 30초간 진탕하고 G에서 2분간 원심분리하여 디에틸 에테르층을 취한다. 이 과정을 반복하여 디에틸에테르 추출액 약12 ml를 50 의 농축한 후 증류수 1mL를 가하여 용해한 다음 0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 마. 표준용액의 유도체화 희석한 표준용액 1 ml에 증류수 4 ml, 20 % 트리클로로초산 0.5 ml를 가하여 진탕 한 후 다시 7 % 포름알데히드 용액 1 ml를 가하고 마개를 한 후, 60초간 진탕하여 100 에서 30분간 가열하고 즉시 방냉한다. 이 유도체화된 액은 디에틸에테르 6 ml를 넣어 30초간 진탕하고 1 800G에서 2분간 원심분리하여 디에틸에테르층을 취한다. 이 과정을 반복하여 디에틸에테르 추출액 약 12 ml를 50 에서 농축한 후 증류수 1 ml를 가하여 용해한 다음 0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 분석시 표준용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 측정조건 칼 럼 : C 18 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 이동상 : 0.05 M 인산완충용액 (ph 6.5):아세토니트릴 (85:15, v/v) 유 속 : 1.0 ml/min 측정파장 : 360 nm 칼럼온도 : 35 주입량 : 150 μl

270 사. 정량시험 유도체화한 표준용액을 주입하여 얻은 크로마토그램으로부터 각각의 아목시실린과 암피실린에 대한 농도별 평균면적을 구하여 검량선을 작성한다. 시험용액 분석에서 얻은 크로마토그램으로부터 각 성분에 대하여 머무름시간이 일치되는 각각의 피크의 면적을 검량선에 적용하여 검체중 아목시실린과 암피실린의 함량을 구한다. 아. 확인시험 1) 측정조건 (1) 액체크로마토그래프 조건 - 칼럼 : C 18 ( mm, 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것 - 칼럼온도 : 35 - 이동상 ㆍ이동상 A : 0.2 % 초산 용액 이동상 B : 0.2 % 초산 메탄올 용액 시간 (분) 이동상 A (%) 이동상 B (%) 유속 : 0.2 ml/분 - 주입량 : 10 μl (2) 질량분석기 조건 - Ionization : ESI (positive) - Capillary Temperature : Collision gas : 아르곤 (Ar) - Collision energy : 20 ~ 35 V 1) 확인 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 표준용액에서 분리 확인되는 특이이온이 시험용액에서 존재하는지를 비교 확인한다. 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름시간과 일치 하여야 한다

271 물질 Precursor ion (m/z) Fragment ion (m/z) 아목시실린 , 158, 120 암피실린 , 142, 설파제 설파클로르피리다진 (Sulfachlorpyridazine), 설파디아진 (Sulfadiazine), 설파디메톡신 (Sulfadimethoxine), 설파메톡시피리다진 (Sulfamethoxypyridazine), 설파메라진 (Sulfamerazine), 설파메타진 (Sulfamethazine, Sulfadimidine), 설파메톡사졸 (Sulfamethoxazole), 설파모노메톡신 (Sulfamonomethoxine), 설파티아졸 (Sulfathiazole), 설파퀴녹살린 (Sulfaquinoxaline), 설피속사졸 (Sulfisoxazole), 설파독신 (Sulfadoxine), 설파페나졸 (Sulfapenazole), 설파클로르피라진 (Sulfachlorpyrazine, Sulfaclozine) 가. 시험법 적용범위 축수산물 등에 적용한다. 나. 분석 원리 식품 중 잔류하는 설파계를 아세토니트릴로 추출한 후 C 18 충진제로 정제하여 액체 크로마토그래프/자외부흡광광도검출기로 정량한다. 다. 장치 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것 3) 표준원액 : 설파클로르피리다진, 설파디아진, 설파디메톡신, 설파메톡시피리다진, 설파메라진, 설파메타진, 설파메톡사졸, 설파모노메톡신, 설파티아졸, 설파퀴녹살린, 설피속사졸, 설파독신, 설파페나졸, 설파클로르피라진 표준품을 각각 정밀히 달아 100 ml 용량플라스크에 취하고 메탄올로 표시선까지 채워 100 mg/l농도가 되게 한다. 4) 표준용액 : 표준원액을 적당한 농도로 메탄올로 희석하여 사용한다. 5) 0.1M 인산이수소칼륨 (Potassium dihydrogen phosphate : PDP) 용액 : 인산이수소칼륨 13.6 g을 물 1 L에 녹여 0.15 μm의 필터로 여과한다

272 6) C 18 충진제 (입자크기 μm, 공극크기 125 A ) 또는 이와 동등한 것. 7) 기타시약 : 특급 마. 시험용액의 조제 균질화한 검체 (근육, 간, 신장, 지방, 알, 어류) 1.0 g을 정밀히 달아 15 ml 원심분리관에 넣은 후 아세토니트릴 5 ml를 첨가하고 약 1분간 균질화하고 10분간 초음파 처리한다. 이를 다시 10분간 원심분리 (4500 x g)한 후, 위의 과정을 2회 반복하여 상층액을 합하여 C 18 충진제 100 mg을 첨가해 둔 원심분리관에 넣는다. 이 용액을 약 30초간 강하게 균질화 하여 C 18 충진제를 분산시키고 이를 다시 10분간 원심분리 (4500 x g)한 후 시험관에 상층액만 취하여 질소를 이용하여 농축시킨다. 남은 잔류물에 이동상 1 ml을 가한 뒤 약 5분간 초음파 처리하여 용해시킨 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 측정조건 (1) 칼럼 : C 18 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 (2) 이동상 : 5 mm 인산이수소칼륨 (인산용액으로 ph 3.25되게 조정, A용매), 메탄올 (B용매) 시간 (분) A용매 (%) B용매 (%) (3) 유 속 : 1.0 ml/min (4) 측정파장 : 270 nm 2) 정량시험 (1) 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 설파제의 함량을 각각 구한다. (2) 정량한계 (0.01 mg/kg) 확인시험 가. 측정조건 1) 액체크로마토그래프 조건 - 칼럼 : C 18 ( mm, 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

273 - 칼럼온도 : 35 - 이동상 이동상 A : 5 mm 포름산 용액 이동상 B : 5 mm 포름산 아세토니트릴 용액 시간 (분) 이동상 A (%) 이동상 B (%) 유속 : 0.5 ml/분 - 주입량 : 5 μl 2) 질량분석기 조건 - Ionization : ESI (positive) - Capillary Temperature : Collision gas : 아르곤 (Ar) - Collision energy : 15 ~ 30 V 나. 확인 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 표준용액에서 분리 확인되는 특이이온이 시험용액에서 존재하는지를 비교 확인한다. 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름시간과 일치하여야 한다. 물질 Precursor ion (m/z) Fragment ion (m/z) 설파클로르피리다진 , 108, 156 설파디아진 , 108, 156 설파디메톡신 , 108, 156 설파메톡시피리다진 , 108, 156 설파메라진 , 156, 172 설파메타진 , 156, 186 설파메톡사졸 , 108, 156 설파모노메톡신 , 108, 156 설파티아졸 , 108, 156 설파퀴녹살린 , 108, 156 설피속사졸 , 108, 156 설파독신 , 108, 156 설파페나졸 , 108, 158 설파클로르피라진 , 108,

274 11. 메드록시프로게스테론 아세테이트 (Medroxyprogesterone acetate, MPA) 가. 시험법 적용범위 축수산물 등에 적용한다. 나. 분석 원리 검체 중의 초산메드록시프로게스테론을 트리스완충액 및 디에틸 에테르로 추출하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다. 다. 장치 액체크로마토그래프/질량분석기 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 3) 표준원액 : 초산메드록시프로게스테론 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여100 μg ml -1 로 한다. 4) 표준용액 : 표준원액을 이동상으로 희석하여 사용한다. 5) 0.1 M 트리스완충용액 (ph 9) : 0.1 M Tris (hydroxymethyl) amino-methane에 염산을 넣어 ph 9로 한다. 6) 기타시약 : 특급 마. 시험용액의 조제 균질화 한 검체 1 g을 50 ml 원심 분리관에 취하고 0.1 M 트리스완충용액 (ph 9) 5 ml 가한후 5분간 초음파추출을 한다. 이 추출액에 디에틸 에테르 5 ml를 가하고 5분간 균질화한 후 G에서 5분간 원심분리하고 상층액을 농축수기에 옮긴다. 남은 액에 디에틸 에테르 5 ml를 가하여 위의 과정을 두 번 더 반복한다. 모아진 상층액을 45 에서 감압농축한 후 메탄올 1 ml에 녹여 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 측정조건 (1) 액체크로마토그래프 조건 1 칼럼 : C 18 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 2 칼럼온도 : 20 3 이동상 - 이동상 A : 물

275 - 이동상 B : 5 mm 개미산암모늄 (ammonium formate)/메탄올 시간 (분) A (%) B (%) 유속 : 0.6 ml/min 5 주입량 : 5 μl 2) 질량분석기 조건 (1) Ionization : ESI (positive) (2) Capillary Temperature : 350 (3) Collision gas : Ar (4) Collision energy : 20 V 사. 정량시험 1) 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름시간을 비교하고, m/z 327 이온에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 메드록시프로게스테론 아세테이트 함량을 구한다. 물질 Precursor Ion (m/z) Fragment ion (m/z) 초산메드록시프로게스테론 , 285 2) 정량한계 : mg/kg 12. 멜라민 (melamine) 가. 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기에 의한 멜라민 시험법 1) 시험법의 적용범위 : 불검출 기준 적용대상 식품 2) 분석원리 시료 중의 멜라민을 아세토니트릴 물 (50:50, v/v) 용액으로 추출, 여과하고 이를 양이온 교환수지를 사용하여 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기로 분석 한다. 3) 장치 (1) 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기 (LC/MS/MS)

276 (2) 정제용 카트리지 : 설폰산기 (-SO 3 H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 Oasis MCX (150 mg 함유, 6 ml용) 또는 이와 동등한 것 4) 시약 및 시액 (1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 (2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 (3) 표준원액 : 멜라민 표준품 10 mg을 취하여 0.1 % 개미산 아세토니트릴 (5:95, v/v) 혼합용액으로 녹여 정확히 100 ml로 한다. (4) 표준용액 : 표준원액을 0.01, 0.02, 0.05, 0.10 및 0.20 μg ml -1 농도가 되도록 0.1 % 개미산 아세토니트릴 (5:95, v/v) 혼합용액으로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다 (사용 시 조제한다). (5) 0.1 % 개미산용액 : 개미산 (Formic acid) 0.1 ml에 물을 가하여 100 ml로 한다. (6) 4 % 개미산용액 : 개미산 4 ml에 물을 가하여 100 ml로 한다. (7) 0.1 % 개미산 아세토니트릴 (5:95, v/v) 혼합용액 : 0.1 % 개미산 용액 5 ml에 아세토니트릴 95 ml를 가하여 100 ml로 한다. (8) 0.2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액 : 디에틸아민 (Diethylamine) 0.2 ml에 아세토니트릴을 가하여 100 ml로 한다. (9) 2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액 : 디에틸아민 2 ml에 아세토니트릴을 가하여 100 ml로 한다. (10) 20 mm 개미산암모늄 용액 : 개미산암모늄 (ammonium formate) 1.26 g을 물에 녹여 ml로 한다. (11) 기타시약 : 특급 5) 시험용액의 조제 (1) 추출 시료를 분쇄한 후 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 물 5 ml를 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 ml를 가하여 심하게 흔들어 섞고 30분간 초음파 진탕한 다음 원심분리 (2 600 G, 10분)한다. 상등액을 취하여 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상등액의 층이 분리되어 있을 경우 서로 혼화시킨 후 여과한다). (2) 정제 미리 아세토니트릴 5 ml, 4 % 개미산용액 5 ml를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 4 % 개미산용액 3 ml 및 추출액 2 ml를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하여 유출시킨다. 이어서 아세토니트릴 5 ml, 0.2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 ml를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거하고

277 2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 ml로 용출시킨다. 카트리지 내에 남아있는 용액은 감압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다. 용출액 1 ml를 4 ml 바이알에 취하여 50 에서 질소로 건고한 후 잔류물에0.1 % 개미산 아세토니트릴 (5:95, v/v) 혼합용액 1 ml를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다. 6) 시험조작 (1) 액체크로마토그래프의 측정조건 1 칼럼 : HILIC Silica ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 2 이동상은 A 및 B 용액의 농도 구배조건에 따라 사용한다. 이동상 A : 0.1 % 개미산 아세토니트릴 (5:95, v/v) 이동상 B : 20 mm 개미산암모늄 아세토니트릴 (50:50, v/v) 시간 (분) 이동상 A 이동상 B 유속 : 0.25 ml/분 4 주입량 : 10 μl 5 칼럼온도 : 35 (2) 질량분석기/질량분석기의 조건 1 Ionization : ESI (Positive) 2 Source voltage : 4.8 kv 3 Capillary Temp. : Auxiliary gas : 질소 5 Collision gas : 아르곤 또는 질소 6 Source collision energy : 15 ~ 30 V (3) 검량선 작성 표준용액을 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기에 주입한 후 얻어진 크로마토 그램 상의 m/z 85 이온의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다

278 (4) 정성시험 위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름시간과 비교하여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온이 아래 표와 같이확인되어야 하고 표준용액과 시험용액 이온간 반응세기의 비(m/z 85 이온에 대한 m/z 68 이온의 백분율, response ratio)를 비교하여 그 비가 ± 10 % 이내에서 일치하여야 한다. 물 질 Precursor ion (m/z) 멜 라 민 127 Fragment ion (m/z) (5) 정량시험 정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 m/z 85 이온의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다. 7) 계산 멜라민의 함량 (mg/kg) = C V/S D C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg ml -1 ) V : 시험용액의 최종 부피 (ml) S : 시료 채취량 (g) D : 시험용액의 희석배수 8) 정량한계 : 0.5 mg/kg 나. 액체크로마토그래프에 의한 멜라민 시험법 1) 시험법의 적용범위 : 불검출 기준 적용대상 이외의 식품 (수산물 해당) 2) 분석원리 시료 중의 멜라민을 아세토니트릴 물 (50:50, v/v) 용액으로 추출하고 이를 양이온교환 수지를 사용하여 정제한 후 액체크로마토그래프로 분석한다. 3) 장치 (1) 액체크로마토그래프 : 자외선검출기 (UV detector)를 사용한다. (2) 정제용 카트리지 : 설폰산기 (-SO 3 H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 Oasis MCX (150 mg 함유, 6 ml용) 또는 이와 동등한 것 4) 시약 및 시액 (1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 (2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 (3) 표준원액 : 멜라민 표준품 100 mg을 취하여 물에 녹여 정확히 200 ml로 한다

279 (4) 표준용액 : 표준원액을 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 및 5.0 μg ml -1 의 농도가 되도록 물에 녹여 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다. (5) 4 % 개미산용액 : 개미산 (Formic acid) 4 ml에 물을 가하여 100 ml로 한다. (6) 0.2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 : 디에틸아민 (Diethylamine) 0.2 ml에 아세토니 트릴을 가하여 100 ml로 한다. (7) 2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 : 디에틸아민 2 ml에 아세토니트릴을 가하여 100 ml로 한다. (8) 기타시약 : 특급 5) 시험용액의 조제 (1) 추출 시료를 분쇄한 후 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 물 5 ml을 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 ml을 가하여 심하게 흔들어 섞고 30분간 초음파 진탕한 다음 원심분리 (2 600 G, 10분)한다. 상등액을 취하여 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상등액의 층이 분리되어 있을 경우 서로 혼화시킨 후 여과한다). 동물의 근육이나 조직을 분석할 경우에는 분쇄한 검체 5 g을 취한 후 물 10 ml를 가하여 습윤시키고 아세토니트릴 10 ml를 가한 후 상기와 같이 초음파 진탕, 원심분리 및 여과한다. (2) 정제 미리 아세토니트릴 5 ml, 4 % 개미산용액 5 ml를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 4 % 개미산용액 3 ml 및 추출액 2 ml를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하여 유출시킨다. 이어서 아세토니트릴 5 ml, 0.2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 ml를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거하고 2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 ml로 용출시킨다. 카트리지 내에 남아있는 용액은 감압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다 *. 용출액 2 ml를 4 ml 바이알에 취하여 50 에서 질소로 건고한 후 잔류물에 물 1 ml를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다. 6) 시험조작 (1) 액체크로마토그래프의 측정조건 가 칼럼 : C 18 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 나 이동상 : 완충용액 아세토니트릴 (85:15, v/v) 완충용액 : 무수구연산 1.92 g과 옥탄설폰산나트륨 [C 8 H 17 O 3 SNa] 2.16 g을 950 ml의 물에 녹이고 1 M 수산화나트륨을 사용하여 ph 3.0으로 한 후 물을 가하여 전량을 1 L로 한다

280 다 검출파장 : 240 nm 라 유속 : 1.0 ml/분 마 주입량 : 10 μl (2) 검량선 작성 표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다. (3) 정성시험 위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름시간과 일치 하여야 한다. (4) 정량시험 정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 멜라민의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다. (5) 확인시험 (1) 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기에 의한 멜라민 시험법 (바) 시험조작 4 정성시험 또는(3) 기체크로마토그래피/질량분석기 (라) 시험조작 2 정성시험에 따라 시험할 때 멜라민이 확인되어야 한다. 7) 계산 멜라민의 함량 (mg/kg) = C V/S D C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg ml -1 ) V : 시험용액의 최종 부피 (ml) S : 시료 채취량 (g) D : 시험용액의 희석배수 다. 기체크로마토그래피/질량분석기를 이용한 멜라민 확인시험법 1) 장치 (1) 기체크로마토그래프/질량분석기 (GC/MS) 2) 시약 및 시액 (1) 표준용액 액체크로마토그래프에 의한 멜라민 시험법 (라) 시약 및 시액 4 표준용액을 사용한다. (2) 피리딘 : 특급을 사용한다. (3) 유도체시약 (BSTFA) N,O-Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (1 % trimethyl-chlorosilane 함유)를 사용한다. 3) 시험용액의 조제

281 (2) 추출 및 정제 액체크로마토그래프에 의한 멜라민 시험법(마) 시험용액의 조제 1 추출 및 2 정제에 따라 * 까지 시험하여 용출액으로 사용한다. (3) 유도체화 표준용액 및 위의 용출액200 μl를 각각 바이알에 넣은 다음70 에서 질소로 건고한다. 잔류물에 피리딘 200 μl와 유도체시약 (BSTFA) 200 μl를 넣고 마개를 닫은 후 70 에서 30분간 방치한 것을 확인시험용 표준용액 및 시험용액으로 한다. 4) 시험조작 (1) 기체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건 1 칼럼 : DB-5MS (0.25 mm 30 m, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것 2 주입부 온도 : 검출기 온도 : 오븐온도 : 초기 온도 75 에서 1분간 유지하고 15 /분의 비율로 300 까지 온도를 상승시켜 2분간 유지한다. 5 캐리어가스 및 유량 : 헬륨 (1.0 ml/분) 6 주입방법 : splitless 7 주입량 : 1.0 μl 8 이온화 방법 : EI mode 9 이온화 전압 : 70 V (2) 정성시험 위 조건으로 얻어진 시험용액 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름시간과 비교하여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온이 아래 표와 같이확인되어야 하고 표준용액과 시험용액 이온간 반응세기의 비(m/z 327 이온에 대한 각 이온의 백분율, response ratio)를 비교하여 그 비가 ± 10 % 이내에서 일치하여야 한다. 물 질 이 온 멜 라 민 (M) (M+1) (M+2) (M-15)

282 13. 린코마이신 (Lincomycin), 클린다마이신 (Clindamycin) 가. 시험법 적용범위 수산물에 적용한다. 나. 분석원리 검체 중 린코마이신과 클린다마이신을2 % 초산으로 추출하고 HLB 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다. 다. 장치 액체크로마토그래프-질량분석기 (LC/MS)를 사용한다. 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 3) 표준원액 : 린코마이신과 클린다마이신 표준품을 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여100 mg/l로 한다. 4) 표준용액 : 표준원액을 이동상으로 희석하여 표준원액을 각각 0.025, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2 mg/l가 되게 한다. 5) 2 % 초산 용액 : 초산 10 ml를 물에 녹여 500 ml가 되게 한다. 6) 0.1 % 개미산 용액 : 개미산 0.5 ml를 물에 녹여 500 ml가 되게 한다. 7) HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance) 카트리지 : divinylbenzene-co-n-vinylpyrrolidone 고정상이 충진되어 있는 일회용 카트리지 (200 mg, 6 ml)를 사용한다. 8) 기타시약 : 특급 마. 시험용액의 조제 분쇄한 검체 2 g을 원심분리관에 취하고 2 % 초산 용액 6 ml를 가하여 균질화한 다음 G에서 10분간 원심분리 한다. 미리 메탄올 5 ml과 물 5 ml로 활성화시킨 HLB 카트리지에 상층액을 흡착시킨 다음 물 5 ml로 세척한 후 메탄올 6 ml로 용출한다. 용출액을 약3 ml이 될 때 까지 실온에서 질소 농축시킨다. 잔류한 추출액에0.1 % 개미산을 넣어 총량이 4 ml로 하고 이를 0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 액체크로마토그래프 측정조건 (1) 칼럼:C18 ( mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

283 (2) 이동상 이동상 A : 0.1 % 개미산 용액 이동상 B : 아세토니트릴 시간 (분) A (%) B (%) (3) 유속 : 0.2 ml/min (4) 주입량 : 10 μl 2) 질량분석기 측정조건 (1) Ionization : ESI (Positive) (2) Capillary temperature : 200 (3) 특이이온 및 Spray voltage 물질 SIM ion (m/z) Spray voltage (KV) 린코마이신 클린다마이신 ) 표준품의 크로마토그램

284 사. 정량시험 1) 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 특이이온을 확인한다. 이후, 각각 에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고, 표준용액의 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 시험용액 중 린코마이신 및 클린다마이신의 함량을 구한다. 2) 정량한계 (1) 린코마이신 정량한계 : 0.1 mg/kg (2) 클린다마이신 정량한계 : 0.01 mg/kg 14. 콜리스틴 (Colistin), 아프라마이신 (Apramycin) 가. 시험법 적용범위 축수산물에 적용한다. 나. 분석원리 검체 중 아프라마이신 및 콜리스틴을 아세토니트릴로 추출하고SPE (Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다. 다. 장치 액체크로마토그래프/질량분석기 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 3) 표준원액 : 콜리스틴 및 아프라마이신 표준품을 정밀히 달아 증류수에 녹여100 μg ml -1 로 한다. 4) 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다. 5) 0.2 M 인산완충용액 (ph 7.2) : 500 ml 메스플라스크에 제이인산나트륨 (Na 2 HPO 4 H 2 O) 5.11 g과 제일인산나트륨 (NaH 2 PO 4 H 2 O) 1.68 g을 달아 증류수로 녹여 표시선까지 채운다. 6) Florisil 카트리지 (500 mg, 6 ml) 또는 이와 동등한 것 7) 기타시약 : 특급 마. 시험용액의 조제 1) 유 ( 乳 ), 알 ( 卵 ) 외 식품 균질화한 시료 2 g을 15 ml 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 6 ml를 넣어 강하게 진탕한 후 G에서 5분간 원심분리한다. -20 에서 30분간 방치한 후 상층액

285 ml를 시험관에 옮기고 50 에서 질소 농축시킨 후 헥산 3 ml에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 ml와 헥산 5 ml로 활성화시킨 Florisil 카트리지에 추출액을 흡착시키고 아세톤을 2 % 포함한 헥산 5 ml로 4회 세척한 후, 메탄올 6 ml로 용출한다. 용출액은 40 에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 ml에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 측정조건 (1) 액체크로마토그래프 조건 - 칼럼 : C 8 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 - 이동상 이동상 A : 0.1 % 개미산, 5 % 아세토니트릴 수용액 이동상 B : 아세토니트릴 시간 (분) A (%) B (%) 유속 : 0.4 ml/min - 질량분석기 조건 Ionization : ESI (positive) Spray voltage : 5 kv Capillary temperature : 280 Sheath gas : 질소 (N 2 ) (50 psi) Auxiliary gas : 질소 (N 2 ) (10 psi) SIM ion : m/z 540 (아프라마이신), m/z (콜리스틴) 2) 정량 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 질량분석기에주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하고 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 아프라마이신 및 콜리스틴의 함량을 구한다

286 15. 에리스로마이신 (Erythromycin) 가. 시험법 적용범위 축수산물에 적용한다. 나. 분석원리 시료중의 에리스로마이신과 버지니아마이신을 아세토니트릴/메탄올 (95:5, v/v) 용액으로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다. 다. 장치 액체크로마토그래프/질량분석기 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 3) 표준원액 : 에리스로마이신 (에리스로마이신 A) 및 버지니아마이신 (버지니아마이신 M1) 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 조제된 표준용액을 냉장보관 한다. 4) 표준용액 : 표준원액을 30 % 아세토니트릴로 희석하여 사용한다. 5) 기타시약 : 특급 마. 시험용액의 조제 1) 어류 및 갑각류 균질화한 시료 10 g을 500 ml 원심분리관에 취하고 70 % 아세토니트릴 100 ml와 하이플로슈퍼셀 (Hyflo-Super Cel) 5 g을 각각 첨가하여 2분간 균질화한 후 G에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 500 ml 분액깔때기에 옮기고 염화나트륨 7 g을 첨가하여 10분간 강하게 진탕, 정치시킨 후 하층액은 버린다. 상층액에 아세토니트릴포화헥산 100 ml를 첨가하여 10분간 강하게 진탕한 후 정치시킨다. 하층을 45 에서 감압 농축한 후 잔류물은 90 % 메탄올 2 ml에 녹인다. 이 용액을 멤브레인 필터로 여과하여 시험 용액으로 한다. 2) 어류 및 갑각류 외 식품 균질화한 시료 5 g을 50 ml 원심분리관에 취하고, 아세토니트릴/메탄올 (95:5, v/v) 용액 20 ml를 가한 후 5분간 균질화한다. 이 액을 G에서 10분간 원심분리하고 상층액을 새로운 50 ml 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴포화헥산 20 ml를 가하여 15분간 흔들어 주고 G에서 10분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 멤브레인 필터로 여과한 후 시험용액으로 한다

287 바. 시험조작 1) 측정조건 (1) 액체크로마토그래프 조건 - 칼럼 : C 18 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 - 칼럼온도 : 25 - 이동상 : 아세토니트릴/15 mm 개미산 암모늄 (개미산으로 ph4.5 조정) (40:60, v/v) - 유속 : 0.2 ml/분 - 주입량 : 10 μl (2) 질량분석기 조건 - Ionization : ESI (positive) - Capillary temperature : Collision gas : 아르곤 (Ar) - Collision energy : 에리스로마이신 22 V, 버지니아마이신 14 V 2) 정량 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름시간을 비교하고, 에리스로마이신은 m/z 576 이온, 버지니아마이신은 m/z 508 이온에 대한 면적을 각각 구하고 검량선을 작성하여 검체 중 에리스로마이신과 버지니아마이신 함량을 각각 구한다. 물질 Precursor ion (m/z) Fragment ion (m/z) 에리스로마이신 버지니아마이신 에리스로마이신 (Erythromycin) : 어류 및 갑각류 0.2 mg/kg 16. 올라퀸독스 (Olaquindox) 카바독스 (Carbadox) 시험법 가. 시험법 적용범위 축산물 등에 적용한다. 나. 분석원리 시료 중의 올라퀸독스와 카바독스는 각각의 대사물질인3-메틸 퀴녹살린-2-카르복실산 (3-methyl quinoxaline-2-carboxylic acid, MQCA)과 퀴녹살린-2-카르복실산 (quinoxaline-2- carboxylic acid, QCA)으로 존재한다. 시료에 단백질 분해효소를 첨가하고 산성화 시킨 후, 에틸아세테이트로 각각의 대사물질을 추출하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다

288 다. 장치 액체크로마토그래프/질량분석기 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 3) 표준원액 : 3-메틸 퀴녹살린-2-카르복실산 (MQCA, 3-methyl quinoxaline-2- carboxylic acid) 및 퀴녹살린-2-카르복실산 (QCA, quinoxaline-2- carboxylic acid) 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 조제된 표준원액은 냉동보관 한다. 4) 표준용액 : 표준원액을 5 % 메탄올로 희석하여 사용한다. 5) 내부 표준물질 표준원액 : 퀴녹살린-2-카르복실산 D4 (QCA-D4, quinoxaline -2-carboxylic acid D4) 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 조제된 표준원액은 냉동보관 한다. 6) 내부 표준물질 용액 : 내부 표준물질 표준원액을 5 % 메탄올로 희석하여 1 μg ml -1 가 되도록 한다. 7) 0.2 M 트리스완충용액 (ph 2.5) : 1 L 메스플라스크에 1 M Tris (hydroxymethyl) aminomethane 200 ml와 2 M 염화칼슘용액 50 ml를 넣고 물로 표시선까지 채운다. 10 M 염산으로 ph를 2.5로 한다. 8) 프로테아제 용액 : 프로테아제 (type ⅩⅣ) 50 mg을 물 1 ml에 녹여 사용한다. 시험 당일 제조하도록 한다. 9) 기타시약 : 특급 마. 시험용액의 조제 균질화한 시료 5 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 내부 표준물질 용액 20 μl를 넣고 0.2 M 트리스완충용액 8 ml와 프로테아제 용액 50 μl를 넣어 균질화한 후 항온수조60 에서 16시간 반응시킨다. 실온까지 냉각한 후 10 M 염산 300 μl를 넣고 균질화한다. 이 용액을 4, G 에서 10분간 원심분리 한 후 상층액을 새로운 50 ml 원심분리관에 취하고 에틸아세테이트 8 ml를 가한다. 이 용액을 균질화한 후 4, G 에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하고 잔사에 에틸아세테이트 5 ml를 가한 후 위 과정을 한번 반복한다. 모아진 상층액을 60 에서 질소농축한 후 잔류물은5 % 메탄올 1 ml에 녹인다. 이 용액을 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 측정조건

289 (1) 액체크로마토그래프 조건 - 칼럼:C 18 ( mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것 - 칼럼온도 : 40 - 이동상 이동상 A : 아세토니트릴 : 메탄올 : 물 : 빙초산 (100:100:796:4, v/v/v/v) 이동상 B : 메탄올 시간 (분) A (%) B (%) 유속 : 0.15 ml/분 - 주입량 : 10 μl (2) 질량분석기 조건 - Ionization : ESI (positive) - Capillary temperature : Collision gas : 아르곤 (Ar) - Collision energy : MQCA 13 V, QCA 17 V, QCA-D4 17 V 사. 정량시험 1) 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 머무름시간을 비교하고, QCA-D4 m/z 133 이온에 대한 MQCA m/z 145 이온, QCA m/z 129 이온에 대한 면적비를 각각 구하고 검량선을 작성하여 시험용액 중 올라퀸독스와 카바독스 함량을 각각 구한다. 물질 Precursor ion (m/z) Fragment ion (m/z) MQCA , 102 QCA , 102 2) 정량한계 : 각각 mg/kg

290 17. 세팔렉신 (Cephalexin) 가. 시험법 적용범위 어류 및 유 ( 乳 ) 등에 적용한다. 나. 분석원리 검체 중 세팔렉신을 10 % 삼염화초산으로 추출하고 양이온교환카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기로 분석한다. 다. 측정기기 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 표준원액 : 세팔렉신 표준품을 정밀히 달아 물에 녹여100 mg/l로 하고 조제된 표준원액은 냉동보관 한다. 3) 표준용액 : 표준원액을 물로 희석하여 세팔렉신이 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 및 4.0 mg/l가 되게 한다. 조제된 표준용액은 냉장보관 한다. 4) 내부표준원액 : 카페인 표준품을 정밀히 달아 물에 녹여 100 mg/l로 한다. 5) 내부표준용액 : 내부표준원액을 물로 희석하여 1 mg/l가 되게 한다. 6) 양이온교환 카트리지 : MCX (Mixed Mode Cation Exchange) 카트리지 (60 mg) 또는 이와 동등한 것 마. 시험용액의 조제 균질화 한 검체2 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 내부표준용액200 μl와 10 % 삼염화초산 5 ml를 가하여 흔들어 섞는다. 이 용액을 G에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 4 % 인산과 1:1의 비율로 섞는다. 이 용액을 미리 메탄올 2 ml와 물 1 ml로 활성화 시킨 양이온교환 카트리지에 흡착시키고2 % 개미산 용액 2 ml와 메탄올 2 ml로 세척한 후 5 % 수산화암모늄 메탄올 용액 4 ml로 용출시킨다. 이 용출액을 50 에서 질소 농축하고 잔류물은0.1 % 개미산을 함유한 10 % 아세토니트릴 용액 200 μl에 녹인다. 이 용액을 G에서 10분간 원심분리하고 상층액을 취한 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 측정조건 (1) 칼럼 : C 18 ( mm, 2.7 μm) 또는 이와 동등한 것 (2) 칼럼온도 :

291 (3) 이동상 - 이동상 A : 0.1 % 개미산을 함유한 10 % 아세토니트릴 용액 - 이동상 B : 0.1 % 개미산을 함유한 90 % 아세토니트릴 용액 어류 시간 (분) 이동상 A (%) 이동상 B (%) 유 ( 乳 ) 시간 (분) 이동상 A (%) 이동상 B (%) (4) 유속 : 1 ml/분 (5) 측정파장 : 260 nm (6) 주입량 : 20 μl 사. 정량시험 1) 표준용액 및 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각각의 피크 머무름시간을 비교하여 카페인의 피크의 면적에 대한 세팔렉신의 피크 면적비로 검량선을 작성하고 시험용액 중 세팔렉신 함량을 구한다. 2) 정량한계 (1) 어류 : 0.03 mg/kg (2) 유 ( 乳 ) : 0.05 mg/kg 18. 조사마이신 (Josamycin), 키타사마이신 (Kitasamycin) 가. 시험법 적용범위 축산물, 수산물 등에 적용한다. 나. 분석원리 검체 중 조사마이신, 키타사마이신을 메탄올:아세토니트릴 (5:95) 혼합용액으로 추출하고 헥산으로 지방을 제거하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다

292 다. 장치 액체크로마토그래프/질량분석기 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 표준원액 : 조사마이신, 키타사마이신 표준품을 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/l로 한다. 3) 표준용액 : 표준원액을 30 % 아세토니트릴 용액으로 희석하여 조사마이신은 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 및 0.8 mg/l, 키타사마이신은 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 및 4.0 mg/l가 되게 한다. 조제된 표준용액은 냉장보관 한다. 4) 내부표준원액 : 카페인 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/l로 한다. 조제된 표준원액은 냉동보관 한다. 5) 내부표준용액 : 내부표준원액을 30 % 아세토니트릴 용액으로 희석하여 4 mg/l가 되게 한다. 마. 시험용액의 조제 균질화 한 검체 5 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 내부표준용액 500 μl와 메탄올 : 아세토니트릴 (25:75) 혼합용액 7 ml를 가한 후 10분간 흔들어 섞는다. 이 용액을 G에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 취한다. 남은 액에 메탄올:아세토니트릴 (25:75) 혼합용액 7 ml를 가한 후10분간 흔들어 섞고2 700 G에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 앞의 상층액과 합한다. 이 상층액에 헥산 10 ml를 가하고 1분간 흔들어 섞은 후 G에서 20분간 원심분리를 하여 아래층을 취한다. 45 에서 질소농축 후 잔류물을 30 % 아세토니트릴 용액 1 ml에 녹이고 4, G에서 20분간 원심 분리한다. 상층액을 취하고 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 가) 측정조건 (1) 액체크로마토그래프 조건 - 칼럼 : C 18 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 - 칼럼온도 : 25 - 이동상 : 0.05 % 개미산 용액:아세토니트릴 (3:7) - 유속 : 0.3 ml/분 - 주입량 : 10 μl (2) 질량분석기 조건 - Ionization : ESI (positive)

293 - Capillary Temperature : Collision gas : 아르곤 (Ar) - Collision energy : 조사마이신 (65 V), 키타사마이신 (49 V), 카페인 (31 V) 사. 정량시험 1) 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고, 내부표준물질 카페인의 m/z 138에 대한 조사마이신 m/z 109, 키타사마이신 m/z 174의 면적비를 각각 구하고 검량선을 작성하여 시험용액 중 각각의 함량을 구한다. 물질 Precursor ion (m/z) Fragment ion (m/z) 가) 조사마이신 , 174, 229 나) 키타사마이신 , 109, 215 다) 내부표준물질 (카페인) ) 정량한계 (1) 조사마이신 : 0.01 mg/kg (2) 키타사마이신 : 0.03 mg/kg 19. 플로르페니콜 (Florfenicol) 가. 시험법 적용범위 축산물, 수산물 등에 적용한다. 나. 분석원리 검체 중 플로르페니콜과 대사물질인 플로르페니콜 아민을 에틸아세테이트로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후, 산을 가해 플로르페니콜을 대사물질인 플로르페니콜 아민으로 전환시켜 양이온교환 카트리지로 정제하고 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기로 분석한다. 플로르페니콜 양은 플로르페니콜 아민으로서 정량한다. 다. 측정기기 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 표준원액 : 플로르페니콜 아민 표준품을 정밀히 달아 아세토니트릴에 녹여100 mg/l로 한다

294 3) 표준용액 : 표준원액을 0.01 M 제이인산나트륨 (Na 2 HPO 4 ):메탄올 (8:2) 혼합용액으로 희석하여 플로르페니콜 아민이 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 및 4.0 mg/l가 되게 한다. 4) 0.01 M 제이인산나트륨 용액 : 제이인산나트륨 (Na 2 HPO 4 ) 3.58 g을 물에 녹여1 L로 한다. 5) 0.02 M 헵탄설폰산 (heptanesulphonate) M 제삼인산나트륨 (trisodiumphosphate)(ph 3.85) 혼합용액 : 1 L 메스플라스크에 헵탄설포네이트 (sodium-1-heptanesulphonate) 4.05 g과 제삼인산나트륨 (Na 3 PO 4 ㆍ 12H 2 O) 9.50 g을 넣고 물에 녹이고 인산으로 ph 3.85로 조정한 후 물로 표시선까지 채운다. 6) 양이온교환 카트리지 : MCX (Mixed Mode Cation Exchange) 카트리지 (60 mg) 또는 이와 동등한 것 마. 시험용액의 조제 균질화 한 검체 5 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 제이인산칼륨 (K 2 HPO 4 ) 1 g과 에틸아세테이트 10 ml를 가하여 균질화한 후1 200 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 남은 액에 에틸아세테이트 10 ml과 물 4 ml를 가하여 앞의 조작을2회 더 반복한 후 상층액을 합한다. 모아진 상층액을 35 에서 감압농축하여 1 ml가 되도록 한다. 이 농축액에 아세토니트릴 3 ml를 가하여 녹이고, 헥산 5 ml를 가하여 격렬히 흔들어 섞은 후 원심분리하여 층을 분리한다. 헥산층을 버리고 헥산 5 ml를 가한 후, 이 과정을 2회 더 반복하고 분리된 아세토니트릴층 (하층)을 50 에서 감압농축한다. 잔류물에 12 N 염산 2 ml를 가하고 100 에서 1시간 동안 반응 시킨다. 미리 메탄올 3 ml와 물 3 ml로 활성화시킨 양이온교환 카트리지에 반응액을 흡착시키고 물3 ml로 세척한다. 카트리지를 감압하여 건조시킨 후, 흡착된 성분을 아세토니트릴:수산화암모늄:클로르 포름 (8:1:1, v/v/v) 혼합용액 6 ml로 용출시킨다. 용출액을 50 에서 감압농축한 후 잔류물에 이동상 용액300 µl를 가하여 녹이고 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 측정조건 (1) 칼럼 : C 18 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 (2) 칼럼온도 : 35 (3) 이동상 - 이동상 A : 0.1 % 개미산을 함유한 10 % 아세토니트릴 용액 - 이동상 B : 0.02 M 헵탄설폰산 (heptanesulphonate) M 제삼인산나트륨 (ph 3.85): 0.1 % 트리에틸아민 메탄올 용액 (82:18, v/v) (4) 유속 : 1.5 ml/분 (5) 측정파장 : 224 nm (6) 주입량 : 30 μl

295 사. 정량시험 1) 표준용액 및 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 피크 머무름 시간을 비교하여 플로르페니콜 아민의 피크 면적으로 검량선을 작성하고 시험용액 중 플로르페니콜 함량을 구한다. 2) 기준 (1) 어류: 0.2 mg/kg (2) 갑각류 : 0.1 mg/kg 3) 정량한계 (1) 어류 : 0.05 mg/kg (2) 갑각류 : 0.01 mg/kg (3) 어류 및 갑각류 외 식품 : 0.1 mg/kg 20. 겐타마이신 (Gentamicin), 네오마이신 (Neomycin) 가. 시험법 적용범위 수산물에 적용한다. 나. 분석원리 검체 중 겐타마이신 및 네오마이신을 인산완충용액으로 추출하고 HLB 카트리지 및 약양이온교환 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다. 다. 장치 액체크로마토그래프-질량분석기 (LC/MS)를 사용한다. 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 3) 표준원액 : 겐타마이신 및 네오마이신 표준품을 각각 정밀히 달아 표준품 희석용매에 녹여 100 mg/l로 한다. 4) 표준용액 : 표준원액을 표준품 희석용매로 희석하여 겐타마이신은 0.025, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2 mg/l, 네오마이신은 0.125, 0.25, 0.5, 0.75, 및 1.0 mg/l가 되게 한다. 5) 표준품 희석용매 : 100 ml 아세토니트릴과 10 ml 초산을 넣고 물에 녹여500 ml가 되게 한다. 6) 5 mm 헵타플로오로뷰티린산 (HFBA) 용액 : 헵타플로오로뷰티린산 (HFBA) 0.65 ml를 물에 녹여 ml가 되게 한다

296 7) 10 mm 인산완충용액 (0.4 mm EDTA와 2 % 삼염화초산 함유) : 2 L 매스플라스크에 제일인산칼륨 (KH 2 PO 4 ) 2.72 g를 넣고 물 1.9 L로 녹인 후 1 N 염산으로 ph 4.0을 맞춘다. 여기에 EDTA-나트륨 이수화물 (Na 2 EDTA dihydrate) 0.3 g과 삼염화초산 (trichloroacetic acid) 40 g을 넣고 용해시킨 후 물로 표시선까지 채운다. 8) 용출용액 : 삼염화초산 4.1 g을 넣고 물 100 ml로 녹인 후 아세토니 트릴 50 ml를 첨가하고 물로 250 ml가 되게 한다. 9) HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance) 카트리지 : divinylbenzene-co-n-vinylpyrrolidone 고정상이 충진되어 있는 일회용 카트리지 (200 mg, 6 ml)를 사용한다. 10) 약양이온교환 (Weak Cation Exchange) 카트리지 : 약양이온교환수지 고정상이 충진되어 있는 일회용 카트리지(150 mg, 6 ml)를 사용한다. 11) 기타시약 : 특급 마. 시험용액의 조제 분쇄한 검체 2 g을 폴리프로필렌 (Polypropylene) 재질의 원심분리관에 취하고 10 mm 인산완충용액 10 ml를 가하여 1분 동안 균질화한 다음 초음파로 10분간 추출한다. 진탕기를 이용하여 10분간 격렬하게 진탕한 다음 G에서 10분간 원심분리 한다. 상층액을 원심분리관에 옮긴 다음 남은 잔여물에10 mm 인산완충용액 10 ml를 가하여 교반기로 섞고, 진탕기를 이용하여 10분간 격렬하게 진탕한 다음 G에서 10분간 원심분리 한 후 상층액을 합한다. 30 % 수산화나트륨을 약 0.2 ml를 가하여 ph 7.5~8.0으로 맞추어 추출액으로 한다. 메탄올 5 ml와 물 5 ml로 각각 HLB 카트리지와 약양이온교환 카트리지를 활성화한다. HLB 카트리지와 약양이온교환 카트리지를 연속으로 연결하여 추출액을 1~3 ml/min의 속도로 흡착시키고 물 5 ml를 넣어 같은 유속으로 세척한다. 수분을 제거하기 위해 5분 이상 공기를 통과시켜 건조한다. 용출용액 4 ml를 1~3 ml/min의 속도로 용출시켜0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험액을 폴리프로필렌 (Polypropylene)재질의 바이알에 담아 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 액체크로마토그래프 측정조건 (1) 칼럼:C18 ( mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것 (2) 이동상 이동상 A : 5 mm 헵타플로오로뷰티린산 (HFBA) 용액 이동상 B : 아세토니트릴

297 시간 (분) A (%) B (%) (3) 유속 : 0.2 ml/min (4) 주입량 : 10 μl 2) 질량분석기 측정조건 (1) Ionization : ESI (Positive) (2) Capillary temperature : 200 (3) 특이이온 및 Spray voltage 물 질 SIM ion (m/z) Spray voltage (KV) 겐타마이신 (C1a) 겐타마이신 (C2, C2a) 겐타마이신 (C1) 네오마이신 ) 표준품의 크로마토그램

298 사. 정량시험 1) 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 특이이온을 확인 한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하 고, 표준용액의 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 시험용액 중 겐타 마이신 및 네오마이신의 함량을 구한다. 2) 정량한계 : 겐타마이신: 0.04 mg/kg, 네오마이신 정량한계 : mg/kg

299 21. 프라지콴텔 (Praziquantel), 티아물린 (Tiamulin) 가. 시험법 적용범위 수산물에 적용한다. 나. 분석원리 검체 중 프라지콴텔과 티아물린을 2 % 수산화암모늄으로 추출하고 HLB 카트 리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다. 다. 장치 액체크로마토그래프-질량분석기 (LC/MS)를 사용한다. 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 3) 표준원액 : 프라지콴텔과 티아물린 표준품을 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여100 mg/l로 한다. 4) 표준용액 : 표준원액을 이동상으로 희석하여 프라지콴텔은 0.005, 0.01, 0.02, 0.03 및 0.04 mg/l, 티아물린은 0.025, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2 mg/l가 되게 한다. 5) 2 % 수산화암모늄 용액 : 암모니아수 10 ml를 물에 녹여 500 ml가 되게 한다. 6) 0.1 % 개미산 용액 : 개미산 0.5 ml를 물에 녹여 500 ml가 되게 한다. 7) HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance) 카트리지 : divinylbenzene-co-n-vinylpyrrolidone 고정상이 충진되어 있는 일회용 카트리지 (200 mg, 6 ml)를 사용한다. 8) 기타시약 : 특급 마. 시험용액의 조제 분쇄한 검체 2 g을 원심분리관에 취하고 2 % 수산화암모늄 용액 6 ml를 가하여 균질화한 다음 G에서 10분간 원심분리 한다. 미리 메탄올 5 ml와 물 5 ml로 활성화시킨 HLB 카트리지에 상층액을 흡착시킨 다음 물5 ml로 세척하고 메탄올 6 ml로 용출한다. 용출액을 약3 ml가 될 때 까지 실온에서 질소 농축시킨다. 잔류한 추출액에0.1 % 개미산을 넣어 총량이 4 ml로 하고 이를 0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 액체크로마토그래프 측정조건 (1) 칼럼:C 18 ( mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

300 (2) 이동상 이동상 A : 0.1 % 개미산 용액 이동상 B : 아세토니트릴 시간 (분) A (%) B (%) (3) 유속 : 0.2 ml/min (4) 주입량 : 10 μl 2) 질량분석기 측정조건 (1) Ionization : ESI (Positive) (2) Capillary temperature : 250 (3) 특이이온 및 Spray voltage 물질 SIM ion (m/z) Spray voltage (KV) 프라지콴텔 티아물린 ) 표준품의 크로마토그램

301 7) 정량시험 1) 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 특이이온을 확인한다. 이후, 각각 에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고, 표준용액의 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 시험용액 중 프라지콴텔 및 티아물린의 함량을 구한다. 2) 정량한계 (1) 프라지콴텔 정량한계 : mg/kg (2) 티아물린 정량한계 : mg/kg 22. 트리메토프림 (Trimethoprim) 가. 시험법 적용범위 축산물과 수산물 등에 적용한다. 나. 분석원리 검체 중 트리메토프림를 아세토니트릴: 물 (1:1, v/v) 혼합액[유 ( 乳 )의 경우는 아세토니트릴 : 5 % TCA 용액 (1:1, v/v) 혼합액]으로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 클로로포름으로 분배하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다. 다. 장치 액체크로마토그래프/질량분석기 (LC/MS/MS)를 사용한다. 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 3) 표준원액 : 트리메토프림 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 용해시켜 100 mg/l로 한다

302 4) 표준용액 : 표준원액을 아세토니트릴 : 물 (2:1, v/v) 혼합액으로 희석하여 알 ( 卵 )분석법은 0.05, 0.1, 0.2, 0.3 및 0.4 mg/l가 되게 하고, 알 ( 卵 ) 외의 분석법은 0.125, 0.25, 0.5, 0.75 및 1.0 mg/l가 되게 한다. 5) 5 % 삼염화초산 용액: 삼염화초산 (Trichloroacetic acid) 5 g을 물에 녹 여 100 ml가 되게 한다. 6) 염화암모늄-암모니아 완충용액 : 염화암모늄 67.6 g을 암모니아수 570 ml에 녹이고 물을 넣어 1000 ml로 한다. 7) 기타시약 : 특급 마. 시험용액의 조제 균질화한 검체 5 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 : 물 (1:1, v/v) 혼합액[유 ( 乳 )의 경우는 아세토니트릴 : 5 % 삼염화초산 용액 (1:1, v/v) 혼합액] 20 ml를 가한 후 1분간 진탕한 다음 G에서 10분간 원심분리를 시킨다. 상층액 10 ml를 다른 원심분리관에 옮긴 후 헥산 5 ml를 가하여 1분간 진탕한다. 이 용액을 G에서 5분간 원심분리하여 헥산층 (상층)을 버리고 남은 액에 염화암모늄-암모니아 완충용액을 넣어 ph 10으로 맞춘다. 이 용액에 20 ml 클로로포름을 넣고 1분간 진탕 후 G에서 5분간 원심분리 하고 물층 (상층)을 버린 후 클로로포름층 (아랫층)을 40 에서 질소 농축한다. 잔사를 아세토니트릴 : 물 (2:1, v/v) 혼합액 1 ml에 용해시킨 후0.2 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다. 바. 시험조작 1) 액체크로마토그래프 측정조건 (1) 칼럼:C 18 ( mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 (2) 칼럼온도 : 40 (3) 이동상 이동상 A : 0.1 % 초산 용액 이동상 B : 0.1 % 초산을 함유한 아세토니트릴 용액 시간 (분) A (%) B (%)

303 (4) 유속 : 0.25 ml/min (5) 주입량 : 10 μl 2) 질량분석기 측정조건 (1) Ionization : ESI (Positive) (2) Capillary temperature : 350 (3) Collision gas : 아르곤 (4) Collision Energy : 23 V 3) 표준품의 크로마토그램 트리메토프림 RT 5.7분 사. 정량시험 1) 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이후, 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름시간을 비교하고, 표준용액의 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 시험용액 중 트리메토프림의 함량을 구한다. 물질 Precursor ion (m/z) Fragment ion (m/z) 트리메토프림 ) 정량한계 : mg/kg 23. 오르메토프림 (Ormetoprim) 가. 시험법 적용범위 축산물 등에 적용한다. 나. 분석원리 검체를 0.2 N 황산으로 추출하여 알카리성으로 하여 에틸아세테이트로 추출한다. 에틸 아세테이트층을 감압건고한 후 잔류물을 0.5 % 과염소산 메탄올 (7:3)의 혼합액에 녹여 액체크로마토그래프로 측정한다

304 다. 장치 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기 라. 시약 및 시액 1) 유기용매 잔류농약 시험용 2) 표준원액:오르메토프림 10 mg을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 ml로 한다. 3) 표준용액:오르메토프림 표준원액 5 ml를 취해 메탄올을 넣어 100 ml로 한다. 4) 완충용액 (ph 11):0.1 M 탄산나트륨 96.5 ml와 붕산-염화칼륨용액 (붕산 6.2 g 및 염화칼륨 7.45 g을 물에 녹여 ml로 한다) 3.5 ml 혼합한다. 5) 기타시약:최순품 마. 시험용액의 조제 검체 5 g을 달아 0.2 N 황산 20 ml 및 클로로포름 15 ml를 넣어 균질기로 균질하게 한 후 2 500~3 000 r/min에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분액깔때기에 취한다. 잔류물은 0.2 N 황산 15 ml로 위의 조작을 되풀이한 후 상등액을 위의 분액깔때기에 합한다. 이 액에 1 N 수산화나트륨용액을 넣어 ph 12로 조정하여 방치한 후 염화나트륨 5 g 및 에틸아세테이트 100 ml를 넣어 10분간 진탕하여 상층액을 취한다. 다시 하층에 에틸아세테이트 50 ml로 위의 조작을 되풀이하여 상층액을 위의 액에 합한다. 에틸아세 테이트층에 황산나트륨 (무수) 5 g을 넣고 때때로 흔들어 섞으면서 방치한 후 탈수여과 하고 감압건고한다. 잔류물을 0.5 % 과염소산 메탄올 (7:3, v/v)의 혼합액 1 ml로 녹여 이를 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 액체크로마토그래프의 측정조건 (1) 칼럼:길이 250 mm, 안지름 4.6 mm Nucleosil 10 C18, 4.6 mm i.d.x 250 mm (2) 이동상용매:0.5 % 과염소산 및 메탄올 (7:3, v/v)의 혼합액 (3) 측정파장:230 nm 사. 정량시험 오르메토프림 표준용액을 취하여 메탄올을 감압건고한 후 0.5 % 과염소산 메탄올 (7:3, v/v)의 혼합액으로 녹여 각각 0.25, 0.5, 1.0 및 2.0 μl/ml의 용액을 만든다. 이들 용액 및 시험용액 20 μl를 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간 (Retention time)을 비교해서 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 오르메토프림의 함량을 구한다

305 24. 델타메쓰린 (Deltamethrin) 가. 시험법 적용범위 축 수산물 등에 적용한다. 나. 분석원리 검체를 헥산으로 균질화하고 아세토니트릴로 추출하여 감압 농축한 후 기체크로마토그래프 /전자포획검출기 (GC/ECD)로 분석한다. 다. 장치 기체크로마토그래프/전자포획검출기 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 3) 표준원액 : 델타메쓰린 표준품을 정밀히 달아 아세톤에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 4) 표준용액 : 표준원액을 헥산에 적당한 농도로 희석하여 사용한다. 5) 기타시약 : 특급 마. 시험용액의 조제 1) 유 ( 乳 ) 균질화한 검체 10 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 헥산 20 ml와 황산마그네슘 2 g을 넣은 다음 20분간 진탕하고 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 ml 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴 20 ml를 넣어 2분간 균질화하고 5분간 진탕한 후 G에서 10분간 원심분리한다. 아세토니트릴층 (하층)을 농축 플라스크에 취하여 50 이하 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 헥산2 ml에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 2) 알 ( 卵 ) 균질화한 검체 10 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 디클로로메탄:헥산 (1:1, v/v) 20 ml를 넣은 다음 2분간 균질화하고 20분간 진탕한 후4 500 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 ml 원심분리관에 취한다. 여기에 무수황산나트륨 10 g을 넣고 1분간 균질화한 후 -20 에서 30분간 정치하여 지질을 응고시키고 유기용매층 (상층) 10 ml를 취하여 250 ml 분액깔때기에 옮긴다. 포화식염수 20 ml, 증류수 50 ml 및 디클로로메탄 50 ml를 넣고 진탕한 후 정치하고 디클로로메탄층 (하층)을 무수황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거하면서 농축 플라스크에 취한다. 다시 디클로로메탄 20 ml를 넣어 위 과정을 1회 반복하고 모아진 추출물은 50 이하 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 에틸아세테이트 2 ml에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다

306 3) 가금류 균질화한 검체 10 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 2 % 초산을 포함한 아세토니트릴 20 ml와 염화나트륨 4 g을 넣은 다음 2분간 균질화하고 30분간 진탕한 후 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 ml 원심분리관에 취한다. 여기에 무수황산 나트륨 5 g을 넣고 1분간 균질화한 후 -20 에서 30분간 정치하여 지질을 응고시키고 아세토니트릴층 (상층) 10 ml를 취하여 250 ml 분액깔때기에 옮긴다. 포화식염수 15 ml, 증류수 35 ml 및 디클로로메탄 20 ml를 넣고 진탕한 후 정치하고 디클로로메탄층 (하층)을 무수황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거하면서 농축 플라스크에 취한다. 다시 디클로로메탄 20 ml를 넣어 위 과정을 1회 반복하고 모아진 추출물은 40 이하의 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 에틸아세테이트2 ml에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 4) 어류 균질화한 검체 10 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 2 % 초산을 포함한 아세토니트릴 20 ml와 염화나트륨 4 g을 넣은 다음 2분간 균질화하고 30분간 진탕한 후 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 ml 원심분리관에 취한다. 여기에 무수황산 나트륨 5 g을 넣고 1분간 균질화한 후 -20 에서 30분간 정치하여 지질을 응고시키고 아세토니트릴층 (상층) 10 ml를 취하여 250 ml 분액깔때기에 옮긴다. 포화식염수 15 ml, 증류수 35 ml 및 디클로로메탄 30 ml를 넣고 진탕한 후 정치하고 디클로로메탄층 (하층)을 무수황산 나트륨을 통과시켜 수분을 제거하면서 농축플라스크에 취한 후 40 이하의 수욕 중에서 감압 농축한다. 잔류물은 에틸아세테이트 2 ml에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 5) 유 ( 乳 ), 알 ( 卵 ), 가금류, 어류 외 식품 균질화한 검체 10 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 헥산 20 ml를 넣은 다음 2분간 균질화하고 30분간 진탕한 후 G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 ml 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴 20 ml를 넣어 2분간 균질화하고 5분간 진탕한 후 -20 에서 30분간 정치한다. 아세토니트릴층 (하층)을 농축 플라스크에 취하고 50 이하의 수욕 중에서 감압 농축하고 잔류물은 헥산2 ml에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 측정조건 (1) 칼럼 : Ultra-2 캐필러리 칼럼 (30 m 0.25 mm ID, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것 (2) 캐리어가스 및 유량 : 질소, 1 ml/분 (3) 오븐온도 : 180 에서 검체를 주입하고10 /분의 비율로240 까지 온도를 상승시켜2분간 유지한다. 다시 5 /분의 비율로 290 까지 온도를 상승시켜5분간 유지한다. (4) 주입부 : Split mode (5:1, v/v), 270 (5) 검출기온도 :

307 사. 정량시험 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 기체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 델타메쓰린 함량을 구한다. 25. 디에틸스틸베스트롤 (Diethylstilbestrol, DES) 가. 시험법 적용범위 축 수산물 등에 적용한다. 나. 분석원리 검체 중의 디에틸스틸베스트롤 및 제라놀을 분해효소제를 사용하여 조직에서 분해한 후 냉동 및 카트리지를 이용하여 지방 및 단백질을 제거한 후 유도체화 하여 기체크로마토 그래프 / 질량분석기로 분석한다. 다. 장치 기체크로마토그래프/질량분석기 라. 시약 및 시액 1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 3) 표준원액 : 디에틸스틸베스트롤 및 제라놀 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 4) 표준용액 : 표준곡선을 작성하기 위하여 5가지 농도로 표준원액을 메탄올로 희석한 후 각각 시험관에 100 μl를 취하고 내부 표준물질 용액 100 μl를 가한 후 농축 및 건조시킨다. 시험관에 유도체화 용액 100 μl를 넣고 밀봉하여 60 에서 20분간 반응시킨 후 원심분리하여 상층액을 각각의 표준용액으로 한다. 5) 내부 표준물질 표준원액 : 디에틸스틸베스트롤 D 8 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 6) 내부 표준물질 용액: 내부 표준물질 표준원액을 메탄올로 희석하여100 μg/l가 되도록한다. 7) 분해효소제 : β-글루쿠로니다제/아릴설파타제 (β-glucuronidase/arylsulfatase) 8) 유도체화용액 : BSTFA (N, O-Bistrimethyl-trifluoroacetamide)와 TMSI (N-Trimethyl silylimidazole)의 혼합액 (98:2, v/v) 9) C 8 카트리지 (500 mg, 6 ml) 및 아미노 (NH 2 ) 카트리지 (500 mg, 6 ml) 또는 이와 동등한 것 10) 기타시약 : 특급

308 마. 시험용액의 조제 균질화한 검체 5 g을 50 ml 원심분리관에 취하고 증류수 5 ml를 가한 후 균질화하여 마이 크로파 (microwave)로 30초간 추출한다. 이 추출액에 분해효소제 80 μl를 가하고 균질화시켜 배양기에 넣고 52 에서 15시간 이상 반응시킨다. 실온으로 냉각한 후 내부 표준물질 용액 100 μl와 메탄올 30 ml를 가하고 20분간 초음파 추출한 후 G에서 5분간 원심분리한다. 이 추출용액을 -20 의 냉동고에 30분 이상 넣어두어 지질을 응고 시킨 후 상층액을 취한다. 이 때 석출된 지방질을 거름종이로 제거하고 용기를 메탄올로 씻어 준다. 상층액과 세척액을 합한 후 40 에서 감압 농축하여 메탄올을 제거한다. 미리 메탄올 5 ml와 증류수 5 ml로 활성화시킨 C 8 카트리지에 농축 후 남은 액을 10 % 메탄올 수용액 15 ml에 녹여 흡착시킨다. 증류수 5 ml로 용기와 카트리지를 세척하여 버리고 메탄올 5 ml로 용출 시킨다. 이 용출액을 60 에서 질소로 농축시킨 후 에틸아세테이트 : 메탄올 (80:20, v/v) 혼합용액 2 ml에 녹여 추출액 으로 한다. 미리 물포화에틸아세테이트 5 ml와 에틸아세테이트 : 메탄올 (80:20, v/v) 혼합용액 5 ml로 활성화시킨 아미노(NH 2 ) 카트리지에 추출액을 흡착시키고 에틸아세테이트 : 메탄올 (80:20, v/v) 혼합용액 6 ml로 용출시킨다. 이 용출액을 60 에서 질소로 농축시키고 완전히 농축시킨 시험관에 유도체화 용액 100 μl를 넣고 밀봉한 후 60 에서 20분간 반응시킨다. 반응액을 G에서 5분간 원심분리하고 상층액을 취하여 시험용액으로 한다. 바. 시험조작 1) 측정조건 (1) 기체크로마토그래프 조건 1 칼럼 : Ultra 2, DB 5 (5 %-phenyl-methylpolysiloxane)(50 m 0.2 mm, 0.33μm) 또는 이와 동등한 것 2 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1 ml/분 3 검체주입부 : Split (5:1) 4 주입부온도 : 오븐온도 : 초기온도 160 에서 10 /분 비율로 270 까지 승온한 후10분간 유지하고 6 검체주입량 : 1 μl 5 /분 비율로 315 까지 승온한 후 10분간 유지 (2) 질량분석기 조건 1 이온 mode : EI 2 이온에너지 : 70 ev 3 Interface 온도 : SIM ion : m/z 412 (디에틸스틸베스트롤), m/z 433 (제라놀), m/z 420 (디에틸스틸베스트롤 D8)

309 사. 정량시험 1) 유도체화한 시험용액 및 표준용액을 질량분석기에 주입한 후, 각각에서 얻은 크로마토 그램으로부터 머무름시간을 비교하여 내부표준물질 디에틸스틸베스트롤 D8의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합에 대한 디에틸스틸베스트롤의Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합의 비 및 제라놀의 피크 면적 또는 높이의 비를 구하고 각각의 검량선을 작성하여 시험용액 중 디에틸스틸베스트롤 및 제라놀의 함량을 구한다. 각 물질에 대한 확인이온은 아래의 표와 같다. 시험용액 중 디에틸스틸베스트롤의 함량 이온 412의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합 = 이온 420의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합 시험용액 중 제라놀의 함량 = 이온 433의 피크 면적 또는 높이의 합 이온 420의 Cis 및 Trans 피크 면적 또는 높이의 합 확인이온 물질 확인이온 (m/z) 디에틸스틸베스트롤 412, 397, 383 제라놀 538, 523, 433, 379 디에틸스틸베스트롤 D ) 정량한계 (1) 디에틸스틸베스트롤 : 0.5 μg/kg

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311 Ⅱ 수산물의 유해물질분석법

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313 Ⅱ. 수산물의 유해물질분석법 중금속 시험 : 농산물 이외 식품의 경우는 원칙적으로 가식부를 시험부위로 한다. Ⅱ-1 납 잔류분석법 1. 시험용액의 조제 가. 건식회화법 시료 (건조물로서 5~20 g에 상당하는 양)를 도가니, 백금접시에 취해 건조하여 탄화시킨 다음 450~500 에서 회화한다. 회화가 잘 되지 않으면 일단 식혀 질산 (1+1) 또는 50 % 질산 마그네슘용액 또는 질산알루미늄 40 g 및 질산칼륨 20 g을 물 100 ml에 녹인 액 2~5 ml로 적시고 건조한 다음 회화를 계속한다. 회화가 불충분할 때는 위의 조작을 1회 되풀이하고 필요하면 마지막으로 질산(1+1) 2~5 ml를 가하여 완전하게 회화를 한다. 회화가 끝나면 회분을 물로 적시고 염산 2~4 ml를 가하여 수욕상 또는 건조장치에서 건조한 다음 염산 1~2 ml를 가하여 가온해서 녹이고 불용물이 있으면 석면 또는 유리여과기로 여과한 다음 일정량으로 하여 시험용액으로 한다. 주1) 회화보조제는 염산, 산화마그네슘, 탄산나트륨등을 사용하나 시험조작에 영향이 없을 때에만 사용하되 공시험용액에 대해서도 같은 조작을 하여 시험용액을 보정한다. 주2) 원자흡광광도법을 사용하여 측정할 경우의 회화시킨 건고물은 0.5 N 질산을 이용하여 시험용액으로 한다. 2. 측정 가. 원자흡광광도법 이 방법은 시험용액중의 금속원소를 적당한 방법으로 해리시켜 원자증기화하여 생성한 기저 상태의 원자가 그 원자증기를 통과하는 빛으로부터 측정파장의 빛을 흡수하는 현상을 이용하여 광전측정등에 따라 목적원소의 특정파장에 있어서 흡광도를 측정하고 시험용액중의 목적 원소의 농도를 구하는 방법이다. 시료를 원자화하는 일반적인 방법은 화염방식과 무염방식이 있다. 시험용액 및 공시험용액을 그대로, 혹은 희석 또는 농축한 다음 원자흡광광도계에 주입하여 흡광도를 구하고 따로 표준용액 및 이의 공시험용액에 대해서도 각각 시험용액의 경우와 같은 조작을 해서 검량선을 작성하여 시험용액의 농도를 구한다

314 나. 유도결합플라즈마법 이 방법은 아르곤 가스에 고주파를 유도결합방법으로 걸어 방전되어 얻어진 아르곤 플라즈마에 시험용액을 주입하여 목적원소의 원자선 및 이온선의 발광광도를또는 질량값을 측정하여 시험용액 중의 목적원소의농도를 구하는 방법이다. 표준용액과 시험용액 및 공시험용액을 ICP (유도결합플라즈마)에 주입하여 시험용액의 농도를 구한다. Ⅱ-2 카드뮴 잔류분석법 1. 시험용액의 조제 가. 건식회화법 시료 (건조물로서 5~20 g에 상당하는 양)를 도가니, 백금접시에 취해 건조하여 탄화시킨 다음 450~500 에서 회화한다. 회화가 잘 되지 않으면 일단 식혀 질산 (1+1) 또는 50 % 질산마그네슘용액 또는 질산알루미늄 40 g 및 질산칼륨 20 g을 물 100 ml에 녹인 액 2~5 ml로 적시고 건조한 다음 회화를 계속한다. 회화가 불충분할 때는 위의 조작을 1회 되풀이하고 필요하면 마지막으로 질산(1+1) 2~5 ml를 가하여 완전하게 회화를 한다. 회화가 끝나면 회분을 물로 적시고 염산 2~4 ml를 가하여 수욕상 또는 건조장치에서 건조한 다음 염산 1~2 ml를 가하여 가온해서 녹이고 불용물이 있으면 석면 또는 유리여과기로 여과한 다음 일정량으로 하여 시험용액으로 한다. 주1) 회화보조제는 염산, 산화마그네슘, 탄산나트륨등을 사용하나 시험조작에 영향이 없을 때에만 사용하되 공시험용액에 대해서도 같은 조작을 하여 시험용액을 보정한다. 주2) 원자흡광광도법을 사용하여 측정할 경우의 회화시킨 건고물은 0.5 N 질산을 이용하여 시험용액으로 한다. 2. 측정 가. 원자흡광광도법 이 방법은 시험용액중의 금속원소를 적당한 방법으로 해리시켜 원자증기화하여 생성한 기저상태의 원자가 그 원자증기를 통과하는 빛으로부터 측정파장의 빛을 흡수하는 현상을 이용하여 광전측정등에 따라 목적원소의 특정파장에 있어서 흡광도를 측정하고 시험용액중의 목적원소의 농도를 구하는 방법이다. 시료를 원자화하는 일반적인 방법은 화염방식과 무염 방식이 있다. 시험용액 및 공시험용액을 그대로, 혹은 희석 또는 농축한 다음 원자흡광광도계에 주입하여 흡광도를 구하고 따로 표준용액 및 이의 공시험용액에 대해서도 각각 시험용액의 경우와 같은 조작을 해서 검량선을 작성하여 시험용액의 농도를 구한다

315 나. 유도결합플라즈마법 이 방법은 아르곤 가스에 고주파를 유도결합방법으로 걸어 방전되어 얻어진 아르곤 플라즈마에 시험용액을 주입하여 목적원소의 원자선 및 이온선의 발광광도를또는 질량값을 측정하여 시험용액 중의 목적원소의농도를 구하는 방법이다. 표준용액과 시험용액 및 공시험용액을 ICP (유도결합플라즈마)에 주입하여 시험용액의 농도를 구한다. Ⅱ-3 총수은 잔류분석법 1. 원자흡광광도법에 의한 정량 (금아말감법) 가. 분석원리 시료 중 수은을 금아말감으로 포집하여 냉원자흡광법으로 측정한다. 나. 장치 시료의 연소에서 금아말감에 의한 포집, 냉원자흡광법에 의한 측정까지를 자동화한 수은 측정 장치를 쓴다. 다. 시약 및 시액 1) 수은표준원액 : 염화제이수은 mg을 % L-시스테인 용액에 녹여 ml로 한다 (어두운 곳에서 1~2개월간 보존). 1 ml = 100 μg Hg 2) 수은표준용액 : 수은표준용액을 % L-시스테인용액으로 희석하여 0~20μg ml -1 로 한다 (쓸 때에 만든다). 3) 첨가제 (1) 산화알루미늄 (2) 수산화칼슘 + 탄산나트륨 (1:1 혼합물)을 쓸 때에 950 에서 30분간 활성화시킨다. 라. 시험조작 첨가제 (a) 약 1 g을 도가니에 고르게 펴고 고체 시료는 그 위에 세절 또는 균질화한 시료를 10~300 mg, 액체시료는 0.1~0.5 ml를 첨가제 (a)에 완전히 스며들게 하고, 그 위에 첨가제 (a) 약 0.5 g (b) 약 1 g을 차례로 고르게 펴 층을 이루게 한다. 도가니를 연소부에 넣고 공기 또는 산소를0.521 L/min를 통과하면서 약900 로 가열하여 수은을 유지시켜 포집관에 수은을 포집한다. 포집관을 약 700 로 가열하여 수은증기를 냉원자흡광분석장치에 보내고, 흡광도를 측정하여 A로 한다. 따로 도가니에 첨가제만을 취해 같은 조작을 되풀이하여 흡광도를 측정하여 Ab로 한다. 다음 수은표준용액을 써서 같은 조작을 되풀이하여 얻어진 흡광도에서 검량선을 작성하여 A-Ab 값을 검량선으로부터 시료 중의 수은량을 산출한다

316 Ⅱ-4 메틸수은 잔류분석법 1. 시험법 적용범위 이 방법은 메틸수은 (MeHg)의 기준 규격이 설정된 모든 식품에 적용한다 2. 분석원리 시료 중 메틸수은을 톨루엔으로 추출한 후 GC-ECD로 분석한다. 3. 장치 가스크로마토그래프:전자포획검출기 (ECD)를 사용한다. 4. 시약 및 시액 1) 용매 : HPLC급 및 GC분석용 또는 이와 동등한 것 2) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것 3) 표준원액 : 염화메틸수은[methylmercury chloride (II)] g을 톨루엔에 녹여 mg/l로 한다. 4) 표준용액 : 표준원액을 톨루엔에 녹여 적당한 농도로 희석한다. 5) L-시스테인 용액 : L-시스테인 (L-cystein hydrochloride monohydrate) 1.0 g, 아세트산나트륨 (sodium acetate trihydrate) 0.8 g, 무수황산나트륨 (sodium sulfate, anhydrous) 12.5 g을 물 100 ml에 교반하면서 녹여 제조한다 (사용시 제조) 6) 염산용액 : 염산과 증류수를 3:1의 비율로 제조한다. 5. 시험용액의 조제 시료를 균질화한 후 약 2 g을 100 ml 원심분리관에 넣고 25 % 염화나트륨 용액 10 ml를 첨가하여 진탕한 후 진한 염산4 ml, 톨루엔 15 ml 첨가하여 2분간 강하게 흔들어서 추출한다 r/min에서 20분간 원심분리한 후 톨루엔층을 125 ml 분액깔때기에 옮긴다 (다만, 거품이 발생할 경우에는 1 ml의 이소프로판올을 첨가하여 진탕한 후 다시 원심분리 한다). 여기에 25 % 염화나트륨 10 ml를 첨가하여 수세한 후 L-시스테인용액 5 ml를 첨가하여 진탕기로 10분간 강하게 진탕한다. 10분간 방치한 후 L-시스테인층을 15 ml 원심분리관에 분취하고 여기에 염산용액 4 ml, 톨루엔 5 ml를 첨가하여 1분간 강하게 흔들어 추출한다. 추출액을 원심분리 (2 500 r/min, 5분)하고 톨루엔층을 분취하여 탈수한 후 시험용액으로 한다

317 6. 시험조작 가. 가스크로마토그래프의 측정조건 1) 칼럼:HR-Thermon-HG capillary column 또는 이와 동등한 것 2) 시험용액 주입부 온도:160 3) 검출기 온도:170 4) 칼럼오븐 온도:140 5) 캐리어가스 및 유량:질소 및 메틸수은이 약10분에서 유출되는 속도로 조정한다(약 6 ml/min). 6) 주입량 : 1 μl 7. 정성시험 위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름시간과 일치하여야 한다. 8. 정량시험 정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 결과에 의해 얻어진 피크의 머무름시간를 비교해서 피크높이법 또는 피크면적법에 따라 정량한다. Ⅱ-5 벤조피렌 잔류분석법 1. 시험법 적용범위 수산물 및 그 가공품에 한한다. 2. 분석원리 내부표준물질로 3-메틸콜란트렌을 사용하여 1M 수산화칼륨 에탄올 용액으로 알칼리 분해하고 헥산으로 추출한 후 고체상 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다. 3. 장치 가. 액체크로마토그래프/형광검출기 (High Performance Liquid Chromatograph/ Fluorescence Detector, HPLC/FLD)를 사용한다. 4. 시약 및 시액 1) 용매:HPLC급 또는 이와 동등한 것

318 2) 물:3차 증류수 또는 이와 동등한 것 3) 후로리실 카트리지:SPE용 또는 이와 동등한 것 4) 멤브레인 필터:수용성 폴리테트라플루오로에틸렌 또는 이와 동등한 것 5) 표준원액:벤조피렌 표준물질을 아세토니트릴에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 6) 내부표준원액:3-메틸콜란트렌 표준물질을 아세토니트릴에 녹여 100 μg ml -1 로 한다. 7) 표준용액:표준원액을 아세토니트릴을 사용하여 적당한 농도로 희석한다. 8) 내부표준용액:내부표준원액을 아세토니트릴을 사용하여 적당한 농도로 희석한다. 9) 기타시약:잔류농약시험용 또는 특급 5. 시험용액의 조제 가. 추출 균질화 된 검체 약 10 g (건조물의 경우 1~2 g)을 달아 1 M 수산화칼륨 에탄올 용액 100 ml와 함께 둥근바닥 플라스크에 넣고 내부표준물질 1 ml를 첨가한 후 환류냉각장치를 부칙시킨다. 이를 미리 80 로 예열된 전열기에서 3시간 동안 가열하여 알칼리분해시키고 신속히 냉각 후 헥산 50 ml를 환류냉각관을 통하여 넣어준다. 둥근바닥 플라스크의 알칼리 분해액을 분액깔대기에 옮기고 에탄올 : 헥산 (1:1)용액 50 ml로 세척하여 분액깔대기에 합친다. 이 액에 50 ml의 물을 넣어 심하게 흔들어 섞은 후 헥산층을 분리하여 다른 분액깔대기에 받아두고 물층에 핵산 50 ml를 넣어 추출하는 과정을 두 번 반복하여 얻은 헥산층을 모두 합친다. 이 헥산층에 물 50 ml를 넣고 흔들어 섞은 후 정치하여 물층은 버리는 조작을 3회 되풀이하고 헥산층을 무수황산나트륨 약15 g을 넣은 여과지를 사용하여 탈수여과한 후 40 이하의 수욕상에서 감압하여 약 2 ml로 농축한다. 나. 정제 후로리실 카트리지는 미리 디클로로메탄 10 ml 및 헥산 20 ml를 초당 2~3방울의 속도로 유출시킨 후 사용한다. 이 카트리지에 위의 농축액을 넣고 헥산10 ml와 헥산/디클로로메탄 (3:1) 20 ml로 각각 용출시킨 후 이 용출액을 40 이하의 수욕상에서 질소가스 하에 농축 건고한 후 잔류물을 아세토니트릴에 녹여 전량을1 ml로 하고 이를0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 6. 시험조작 가. 액체크로마토그래프의 측정조건 1) 칼럼:Supelguard LC-18을 연결한Supelcosil LC-PAH (25 cm 4.6 mm) 또는 이와 동등한 것 2) 칼럼온도 :

319 3) 이동상 유량 : 1.0 ml/min 4) 이동상 시간 (분) 아세토니트릴 (%) 물 (%) ) 검출기파장 시간 (분) 여기파장 (nm) 방출파장 (nm) 나. 검량선의 작성 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피이크높이 또는 피이크면적을 구하여 검량선을 작성한다. 다. 크로마토그램 (분) 그림 1. 표준품 (벤조피렌 : BaP)과 내부표준물질 (3-메틸콜란트렌) 크로마토그램 라. 정량한계 : 0.9 μg/kg

320 7. 정성시험 위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름시간과 일치하여야 한다. 8. 정량시험 정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크높이법 또는 피이크면적법에 따라 정량한다. 가. 계산방법 검량곡선에서 얻어진 표준물질과 내부표준물질의 피크에 대한 면적비[A S /A IS ]를 Y축으로 하고 표준물질의 농도를X축으로 하여 검량곡선을 작성하고시험용액의 면적비[A SAM /A SAMIS ]를 Y축에 대입하여 벤조피렌의 농도를 계산한다. A S : 검량곡선표준용액의 표준물질 피크면적 A IS : 검량곡선표준용액의 내부표준물질 피크면적 A SAM : 시험용액의 벤조피렌 피크면적 A SAMIS : 시험용액의 내부표준물질 피크면적 Ⅱ-6 엔도설판 잔류분석법 1. 시험법의 적용범위 수산물 2. 분석원리 시료에 무수황산나트륨을 가하여 탈수하고 헥산으로 추출한 후 후로리실 칼럼크로마토 그래피로 정제하여 기체크로마토그래프로 측정한다. 3. 장치 1) 기체크로마토그래프 : 전자포획 검출기 (ECD)를 사용한다 4. 시약 및 시액 1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한것

321 2) 후로리실카트리지 : 후로리실 (1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지 또는 이와 동등한 것 3) 표준원액 : 엔도설판 (α, β) 및 엔도설판 설페이트 표준품을 각각 헥산에 녹여500 mg/l가 되게 한다 4) 표준용액 : 표준원액을 헥산에 녹여 적당한 농도로 혼합 희석한다 5) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급 5. 시험용액의 조제 가. 추출 균질화된 어류 시료20 g을 500 ml의 호모게나이이저컵에 정확히 취하여 무수황산나트륨 100 g을 가하여 잘 섞는다. 헥산 100 ml를 가하고 2분간 균질화한 다음 여지가 깔려 있는 부크너깔대기로 흡인 여과하고 잔류물은 헥산 50 ml로 씻어 위의 여액과 합한다. 합친 여액을 40 에서 감압농축하고 잔류물을 아세토니트릴포화헥산 30 ml와 헥산포화 아세토니트릴 30 ml로 씻어 250 ml의 분액여두에 옮긴다. 1분간 격렬하게 진탕하고 정치한 후 헥산포화아세토니트릴층을 250 ml의 증류플라스크에 옮긴다. 다시 아세토니 트릴포화헥산층에 헥산포화아세토니트릴 30 ml를 첨가하여 위와 같이 되풀이한 다음 위의 헥산포화아세토니트릴과 합한다. 합친 용액을 40 이하의 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 건고물을 헥산 10 ml에 녹인다. 나. 정제 후로리실 카트리지에 헥산 10 ml를 초당 2~3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시키고 위의 녹인 액을 카트리지 상단에 가한다. 초당 1~2방울 정도의 속도로 용출시켜 버리고 여분의 헥산 2 ml을 가하여 씻어버린다. 표면이 노출되기 직전 다시 헥산10 ml를 가하여 유출시켜 버리고, 디클로로메탄/헥산 혼합액 (50/50, v/v) 10 ml로 용출시킨다. 용출액을 40 의 수욕상에서 감압농축하고 잔류물을 헥산 10 ml로 녹여 시험용액으로 한다. 6. 시험조작 가. 가스크로마토그라프의 측정조건 1) 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼 (0.25 mm i.d. 30 m, 0.25 μm) 또는 이와 동등한것 2) 캐리어가스 및 유량 : 질소, 1 ml/min 3) 칼럼오븐온도 : 80 에서 2분간 유지한 후 10 /분의 비율로 280 까지 상승시킨 후 10분간 유지한다. 4) 주입부 온도 :

322 5) 검출기 온도 : 280 6) 주입량 : 1 μl, split (20:1) 나. 검량선 작성 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토 그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다. 다. 표준품의 크로마토그램 Detector response α-endosulfan β-endosulfan Endosulfan sulfate Retention time (min) 그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램. α-endosulfan (19.3분) 0.1 ng, β-endosulfan (20.4분) 0.1 ng, endosulfan sulfate (21.1분) 0.1 ng. 라. 정량한계 mg/kg 마. 가스크로마토그래프 질량분석기 측정조건 1) 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼 (0.25 mm i.d. 30 m, 0.25 μm) 또는 이와 동등한것 2) 캐리어가스 및 유량 : 질소, 1 ml/min 3) 칼럼온도 : 80 에서 2분간 유지한 후10 /분의 비율로 280 까지 상승시킨 후10분간 유지한다. 4) 주입부 : Splitless mode

323 5) 주입부 온도 : 260 6) Interface 온도 : 280 7) 분자량 범위 : 100 ~500 8) 주입량 : 1 μl 표 1. 기체크로마토그래프 질량분석기 분석을 위한 이온 화합물 머무름시간 분자량 α-endosulfan β-endosulfan Endosulfan sulfate 정성시험 위 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름시간과 일치하여야 한다. 8. 정량시험 정성시험과 같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크높이법 또는 피이크면적법에 따라 정량한다. Ⅱ-7 트리플루라린 잔류분석법 1. 시험법의 적용범위 새우 2. 분석원리 시료에 무수황산나트륨을 가하여 탈수하고 헥산으로 추출한 후 후로리실 칼럼크로 마토그래피로 정제하여 기체크로마토그래프로 측정한다. 3. 장치 1) 기체크로마토그래프 : 전자포획 검출기 (ECD)를 사용한다

324 4. 시약 및 시액 1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한것 2) 후로리실카트리지 : 후로리실 (1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지 또는 이와 동등한 것 3) 표준원액 : 트리풀루라린 표준품을 각각 헥산에 녹여 500 mg/l가 되게 한다 4) 표준용액 : 표준원액을 헥산에 녹여 적당한 농도로 혼합 희석한다 5) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급 5. 시험용액의 조제 가. 추출 균질화된 시료 20 g을 500 ml의 호모게나이이저컵에 정확히 취하여 무수황산나트륨 100 g을 가하여 잘 섞는다. 헥산 100 ml를 가하고 2분간 균질화한 다음 여지가 깔려 있는 부크너깔대기로 흡인 여과하고 잔류물은 헥산 50 ml로 씻어 위의 여액과 합한다. 합친 여액을 40 에서 감압농축하고 잔류물을 아세토니트릴포화헥산 30 ml와 헥산포화 아세토니트릴 30 ml로 씻어 250 ml의 분액여두에 옮긴다. 1분간 격렬하게 진탕하고 정치한 후 헥산포화아세토니트릴층을 250 ml의 증류플라스크에 옮긴다. 다시 아세토니 트릴포화헥산층에 헥산포화아세토니트릴 30 ml를 첨가하여 위와 같이 되풀이한 다음 위의 헥산포화아세토니트릴과 합한다. 합친 용액을 40 이하의 수욕 중에서 감압농축하여 날려버리고 건고물을 헥산 10 ml에 녹인다. 나. 정제 후로리실 카트리지에 헥산 10 ml를 초당 2~3 방울 정도의 속도로 유출하여 활성화시키고 위의 녹인 액을 카트리지 상단에 가한다. 초당 1~2방울 정도의 속도로 용출시켜 시험관에 받고 카트리지가 용매에 젖어 있는 상태에서 표면이 노출되기 직전 디클로로메탄/헥산 혼합액 (50/50, v/v) 15 ml로 용출시켜 동일 시험관에 합친다. 합친 용액을 40 의 수욕상 에서 감압농축하고 잔류물을 헥산 10 ml에 녹여 시험용액으로 한다. 6. 시험조작 가. 가스크로마토그라프의 측정조건 1) 칼럼 : DB-5 캐필러리 칼럼 (0.25 mm i.d. 50 m, 0.25 μm) 또는 이와 동등한것 2) 캐리어가스 및 유량 : 질소, 1 ml/min 3) 칼럼오븐온도 : 100 에서 2분간 유지한 후 10 /분의 비율로 280 까지 상승시킨 후 10분간 유지한다

325 4) 주입부 온도 : 260 5) 검출기 온도 : 280 6) 주입량 : 1 μl, split (10:1) 나. 검량선 작성 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토 그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다. 다. 표준품의 크로마토그램 그림 1. 기체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램. Trifluralin (15.1분) 0.1 ng 라. 정량한계 0.01 mg/kg 마. 가스크로마토그래프 질량분석기 측정조건 1) 칼럼 : HP-5MS 캐필러리 칼럼 (0.25 mm i.d. 30 m, 0.25 μm) 또는 이와 동등한것 2) 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 1.6 ml/min 3) 칼럼온도 : 100 에서 5분간 유지한 후 10 /분의 비율로 230 까지 상승시킨 후 6분간 유지한다. 4) 주입부 : Splitless mode 5) 주입부 온도 : 260 6) Interface 온도 : 280 7) 분자량 범위 : 100 ~500 8) 주입량 : 1 μl

326 표 1. 기체크로마토그래프 질량분석기 분석을 위한 이온 화합물 머무름시간 분자량 Fragment moitored (m/z) Trifluralin , 264, 정성시험 위 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름시간과 일치하여야 한다. 8. 정량시험 정성시험과 같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크높이법 또는 피이크면적법에 따라 정량한다. Ⅱ-8 PCBs 잔류분석법 1. 적용범위 어류 중의 폴리염화비페닐 7종 정량에 적용한다. 2. 분석원리 어류의 가식부를 취하여 속실렛 추출장치에 넣고 조지방을 추출한 후 추출용액을 농축하고 산성실리카겔 칼럼 및 다층 실리카겔 칼럼으로 정제하여 기체크로마토그래프/질량분석기로 폴리염화비페닐 7종을 분석한다. 3. 장치 1) 기체크로마토그래프/질량분석기를 사용한다. 4. 시약 및 시액 1) 용매:잔류농약 분석용 또는 이와 동등 이상인 것. 2) 무수황산나트륨:특급이상 (400 에서 최소 1시간 이상 구운 것) 3) 다층 실리카겔 칼럼 : 안지름 25 mm, 길이 550 mm의 정제용 칼럼에<그림 1.>와 같이 무수황산나트륨 2 g, 중성실리카겔 1 g, 산성실리카겔 5 g, 중성실리카겔 1 g, 염기성실리카겔 3 g, 중성실리카겔 1 g, 무수황산나트륨 1 g의 순서로 충전한 것(또는 이와 동등 이상의 것)

327 무수황산나트륨 2g 중성실리카겔 2g 산성실리카겔 5g 중성실리카겔 1g 염기성실리카겔 3g 중성실리카겔 1g 무수황산나트륨 1g 그림 1. 다층 실리카겔 칼럼 4) 중성 실리카겔:칼럼크로마토그래피용 실리카겔 (100~200 mesh)을 유리칼럼에 채우고 메탄올, 헥산과 디클로로메탄으로 순으로 용리 세척하여 180 에서 8시간 이상 가열한 후 데시케이터에서 방냉한다. 5) 산성 실리카겔 (44 %, g/g):중성 실리카겔 100 g에 진한 황산 78.9 g를 넣고 균일하게 혼합한다. 6) 염기성 실리카겔 (33 %, g/g):중성 실리카겔 100 g에 1N 수산화나트륨 49.2 g를 넣고 균일하게 혼합한다. 7) 추출용매 : 디클로로메탄 헥산 (1:1, v/v) 사용되는 시약 및 시액은 폴리염화비페닐 분석에 영향을 미치는 방해성분을 함유하지 않아야 하며, 차광용기를 사용한다. 8) 표준원액:폴리염화비페닐 7종 표준품을 노난에 녹여 1000 μg/ml가 되게 한다<표 1>. 표 1. 분석대상 폴리염화비페닐 (indicator PCBs 7종)의 표준물질 동족체 IUPAC 번호 3염화 비페닐 2,4,4'-trichlorobiphenyl 28 4염화 비페닐 2,2,'5,5 -tetrachlorobiphenyl 52 5염화 비페닐 2,2',4,5,5'-pentachlorobiphenyl 101 2,3',4,4',5-pentachlorobiphenyl 118 6염화 비페닐 2,2',3,4,4',5'-hexachlorobiphenyl 138 2,2',4,4',5,5'-hexachlorobiphenyl 153 7염화 비페닐 2,2',3,4,4',5,5'-heptachlorobiphenyl

328 9) 내부표준원액: 13 C 12 동족체로 된 폴리염화비페닐 7종의 내부 표준품을 노난에 녹여 50 μg/ml가 되게 한다. 10) 검량선 작성용 표준용액:표준원액과 내부표준원액에 노난을 가해 <표 2>와 같이 표준용액 5단계 이상의 농도 범위 (0.01 ~ 0.5 μg/ml)로 조제한 것을 사용한다. 단, 검량선 작성용 표준용액들은 직선성을 유지하여야 한다. 표 2. 폴리염화비페닐의 검량선 작성용 표준용액 표준액 3염화 비페닐 4염화 비페닐 5염화 비페닐 6염화 비페닐 7염화 비페닐 IUPAC 번호 CS* 0.01 CS 0.05 CS 0.1 CS 0.2 (단위 : μg/ml) CS L* L* L* L* L* L* L* CS* : 검량선 작성용 표준용액 (Calibration Standard Solution) L* : 동위원소로 치환된 (Labeled Compound, 13 C 12 ) 내부표준물질 5. 시험용액의 조제 가. 조지방 추출 어류 가식부의 균질화된 시료 약 10 g을 막자사발에 취한다. 무수황산나트륨을 가하여 막자로 저어 수분을 제거한 다음 속실렛 추출장치용 원통형 여지로 옮긴다. 따로 시료를 넣지 않은 무수황산나트륨을 대조시료로 하여 속실렛 추출장치용 원통형 여지에 넣고, 각각 동일한 농도의 내부표준첨가용액을 첨가 한 다음 속실렛 추출장치를 이용하여 추출용매 300 ml로 18~24시간 동안시간당 3~4번의 환류속도로 추출한다. 추출액을 35 이하의 수욕상에서 10 ml까지 감압 농축 한 후 질소농축기를 이용하여 농축한다

329 나. 정제 유리솜이 들어있는 분액깔때기에 유리깔때기를 이용하여 무수황산나트륨 20 g을 넣은 다음 산성실리카겔 30 g을 넣어준다. 농축된 조지방을 헥산 3 ml로 용해한 다음 분액깔때기에 묻지 않도록 산성실리카겔 표면에 넓게 뿌려서 넣는다. 이러한 조작을 2회 반복한 다음 20분간 정치시킨 후 헥산 150 ml로 용출한다. 따로 미리 제조된 다층 실리카겔 칼럼을 헥산 100 ml로 활성화시킨 후 앞의 용출액을 가하고 헥산 200 ml로 용출한다. 이 용출액을 회전감압농축장치로 5 ml까지 농축하고 질소 농축기로 농축한 다음 최종 부피가 1 ml되도록 하여 이를 시험용액으로 한다. 6. 시험조작 가. 기체크로마토그래프의 조건 1) 칼럼:HP-5MS ( mm I.D., 0.25 μm) 또는 이와 등등 이상의 것 2) 주입부온도:280 3) 오븐온도:초기 온도 100 에서 15 /분의 비율로 200 까지 온도를 상승시켜 3분간 유지하고 2 /분의 비율로 250 까지 상승시켜 5분간 유지한 다음5 /분의 비율로 300 까지 상승시켜 3분간 유지한다. 4) 캐리어가스 및 유량:헬륨 (1.0 ml/분) 5) 주입방법 : splitless 6) 주 입 량 : 1.0 μl 나. 질량분석기의 조건 1) 이온화방법: EI 2) 이온화전압 : 70 ev 3) 특성이온 : <표 3> 참조 표 3. 대상물질 및 이온세기의 이론비 동족체 IUPAC Number 특성이온 M + (M+2) + (M+4) + 이론비 (M+/(M+2) + 또는 (M+2) + /(M+4) + 3염화 비페닐 4염화 비페닐 L* L*

330 동족체 5염화 비페닐 6염화 비페닐 7염화 비페닐 IUPAC Number 특성이온 M + (M+2) + (M+4) L* L* L* L* L* L* : 동위원소로 치환된 (Labeled Compound, 13 C 12 ) 내부표준물질 이론비 (M+/(M+2) + 또는 (M+2) + /(M+4) 정성시험 위의 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램상의 각 피크를 표준용액의 표준물질 및 내부표준물질의 피크의 머무름시간과 비교할 때 일치하여야 하며, 측정한 선택 이온 2개의 이온세기 비율 (M/M+2 혹은 M+2/M+4)은 <표 2>에 나타난 이론비에 대하여±20 % 이내이어야 한다. 8. 정량시험 검량선 작성용 표준용액의 각각 표준물질의 피크면적(A S )과 내부표준물질 피크면적 (A IS )에 대한 비[A S /A IS ]를 Y 축으로 하고 표준물질의 농도를 X 축으로 하여 검량곡선을 작성하고, 시험용액에서 얻어진 폴리염화비페닐의 피크면적과 내부표준물질의 면적비[A SAM /A SAMIS ]를 Y축에 대입하여 각각의 폴리염화비페닐 농도를 계산한 후7종의 폴리염화비페닐 7종의 합을 폴리염화비페닐 7종 (indicator PCBs 7종) 농도로 한다. 폴리염화비페닐 농도 (C, ng/g) = P V M s P V M S :검량선에서 구한 폴리염화비페닐 농도 (ng/ml) :최종부피 (ml) :시료 채취량 (g) 폴리염화비페닐 7종 농도 (ng/g) = C i C i : i 동족체의 폴리염화비페닐의 농도 (i = PCB 28, 52, 101, 118, 138, 153, 180)

331 참 고 자 료

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333 잔류물질 실험실 운영가이드 1. 총칙 가. 이 지침서는 국가표준기본법 제23조, 동 법 시행령 제16조에 의거한 시험기관 및 검사기관 인정제도 운영요령, 축산물위생관리법 제20조, 동법 시행규칙 제28조의4에서 규정한 시험 검사기관 관련 법적 요구사항, ISO/IEC 국제규격에 준하는 축산물위생검사기관의 실험실 운영을 목적으로 한다. 나. 이 지침서는 잔류물질 검사 등을 담당하는 축산물위생검사기관의 실험실 운영에 적용한다. 다. 이 지침서에서 따로 규정한 것 이외에는 축산물위생관리법에 의한 축산물위생검사기관의 검사업무에 관한 규정 및 축산물의 가공기준 및 성분규격에 정한 규정을 준용한다. 라. 시험에 이용되는 표준시약 및 용매는 관련 규정의 시험법에서 정하는 규격의 동등품 이상을 사용하며, 별도 규정이 없는 한 잔류시험등급 (residue grade) 또는 HPLC 분석급 이상을 사용한다. 마. 시약을 이용하여 조제하는 시험용액은 6. 표준시약의 관리요령에 준하여 조제하고 조제자 (preparer), 조제일자 (date prepared), 시험용액 조제시 사용된 시약의 고유번호를 명시 하고, 시험용액의 농도 및 사용기한을 표시하거나 라벨을 부착하여 지정된 적합한 장소에 보관 관리하여야 한다. 2. 실험실의 일반 관리 가. 목적 이 지침은 축산물위생검사기관 (이하 시험기관 이라 한다)에서 시험 활동에 참여하는 모든 직원의 독립적인 판단과 시험결과의 신뢰성을 유지할 수 있도록 부서별 업무분장과 직무권한의 한계를 명확히 함으로써 업무를 효율적으로 수행하고자 함이다. 나. 용어의 정의 1) 시험 (test) 이란 해당 제품, 물질, 장비, 유기체, 물리적 현상, 공정 또는 서비스의 하나 또는 여러 특성이나 성능을 정해진 절차에 따라 결정하는 일련의 기술적 조작을 말한다. 2) 시험기관 (testing laboratory)"이란 시험을 수행하는 시험기관을 말한다. 3) 시험방법 (test method)"이란 시험을 수행하기 위하여 규정된 기술적 절차를 말한다. 4) 시험결과 (test result) 란 규정된 측정방법을 완전히 수행하여 얻은 특성 값을 말한다

334 다. 책임과 권한 1) 실험실 책임자는 시험업무와 관련하여 업무 분장표를 작성하고 해당 시험요원의 직무기술서를 작성 관리하여야 한다. 직무기술서에는 담당업무, 담당업무 수행에 필요한 자격 및 교육여건, 담당업무별 보고 및 위임전결사항, 업무대행자, 교육훈련에 관한 사항 등을 포함하여야 한다. 2) 실험실 책임자 및 시험요원은 시험업무을 수행하는데 있어 시험의뢰자의 소유권 및 비밀사항에 대하여 보호를 보장하여 해당기관의 공신력을 유지함과 시험의뢰자의 기밀을 보호하고자 하여야 한다. 3) 실험실 책임자는 시험업무 수행과 관련한 문서 및 자료들을 최신본으로 관리하여야 한다. 4) 실험실 책임자는 고객의 시험의뢰에 대한 절차에 대하여 구체적으로 마련하여 시험 요원이 절차에 따라 이행될 수 있도록 하여야 한다. 5) 실험실 책임자는 시험업무에 사용되는 물품(시약, 장비, 표준물질, 소모품 등)의 신뢰성을 유지할 수 있도록 물품 구매 절차를 마련하여야 하며, 시험요원은 물품구매 의뢰, 인수 및 검수 절차에 따라 입고하고 해당 시험기관별 정해진 물품관리대장을 작성 관리하여야 한다. 3. 실험실 환경 및 안전관리 가. 목적 이 지침은 실험실의 환경조건 및 안전을 효율적으로 유지 관리함으로써 시험업무를 원활히 수행하고 시험결과의 정확성을 확보하고자 하는데 목적이 있다. 나. 책임과 권한 1) 실험실 책임자는 시험설비의 정밀도를 유지하고 시험환경 및 근무조건이 시험업무수행에 적절한지 확인 및 관리하도록 하여야 한다. 2) 실험실 책임자는 온도, 습도 등 환경조건에 민감한 시험설비에 대해서 적합한 환경조건을 유지토록 하여야 한다. 3) 실험실 책임자는 실험실의 온도, 습도 등 환경기준과 안전관리지침을 정하고 실험실의 환경점검 및 안전관리점검 기록을 검토하고 승인하여야 한다. 4) 시험요원은 실험실의 환경관리점검표 및 안전관리점검 대장을 작성하여 실험실 책임자 에게 검토 승인을 받아야 한다. 다. 실험실 환경관리 1) 시험요원은 구획화된 실험실별로 환경관리점검표 [서식1 : AT27-R-F1]에 따라 매일 14:00-16:00 사이에 실험실의 온 습도 등의 점검결과를 작성하여 월 1회 이상 실험실 책임자에게 검토승인을 받아야 한다

335 2) 실험실의 온 습도 등 환경조건이 정해진 환경기준에 벗어날 경우 즉시 실험실 책임자에 보고하고 개선조치를 하여야 한다. 라. 실험실 안전관리 1) 시험요원이 실험실에서 시험을 실시하는 경우 개인 안전을 위해서 실험복, 보안경, 보호장갑, 발등을 보호할 수 있는 신발을 착용하여야 한다. 2) 시험설비의 정밀도와 신뢰성 향상 및 보안 유지를 위하여 모든 실험실은 외부인의 출입을 통제하여야 하며, 실험실 출입문에 관계자외 출입금지 와 같은 제한구역 식별표를 부착하여야 한다. 3) 부득이하게 외부인이 실험실을 출입하여야 하는 경우는 실험실 책임자의 승인하에 보호구역 출입자 통제 대장 을 기록하고 해당 시험요원과 함께 출입을 하여야 한다. 4) 시험요원이 시험업무 수행 중 자리를 비워야 하는 경우에는 해당 시험이 시험 진행 중 임을 식별표시를 부착하여야 한다. 5) 실험실 책임자는 시험업무 관련 직원에 대해 매년 1회 이상 안전교육을 실시하여야 하며, 안전점검은 매월 마지막 주에 안전점검대장 [서식 2 : AT27-R-F2]에 따라 정기 점검을 실시하고, 필요시 수시로 안전점검을 실시하여 대장에 작성 관리하여야 한다. 4. 시료채취 및 관리 가. 목적 이 지침은 시험대상 시료의 대표적인 시료채취를 제공하기 위한 절차를 마련하고 시료의 접수, 운반, 시험, 보관, 반환 및 폐기까지의 과정을 통해 변질, 훼손 및 파손이 되지 않도록 하여 시험결과의 신뢰성과 정확성을 유지하고자 하는데 목적이 있다. 나. 책임과 권한 1) 실험실 책임자는 접수된 시료에 대하여 보관, 파손, 훼손, 폐기 등에 대하여 관리 감독 하여야 한다. 2) 시험요원은 시료의 접수 및 인수, 취급 및 관리, 시료 식별 표시 등 시험이 끝날때까지 시료의 변질, 훼손 및 파손이 되지 않도록 관리하여야 한다. 3) 시험요원은 시료의 특성에 따라 지정된 적절한 장소에 보관 관리하여야 한다. 다. 시료의 채취, 접수 및 보관 1) 시료 채취에 관한 사항은 축산물위생관리법 제16조 1항, 제26조 1항 관련 시행규칙 별표6 검사시료의 채취 및 축산물의 수거기준 및 축산물 가공기준 및 성분규격에서 정하고 있는 검사 시료의 채취 및 취급방법에 따른다

336 2) 시료채취는 해당 도축장의 검사관이 하며, 검사대상 선정, 검사시료 채취, 취급, 운반, 시험 등의 효율성을 확보하면서 과학적인 방법으로 실시하여야 한다. 3) 검사시료는 검사 목적, 검사 항목 등을 참고하여 검사 대상 전체를 대표할 수 있는 최소량을 채취하여야 한다. 가식부위별로 시료채취하는 경우 포유류는 해당 조직별 각 500 g, 가금은 한 농장 출하분으로부터 무작위로 6마리 도체를 선정, 근육 500 g, 지방 g, 간과 신장 전체 ( g)를 채취하여 해당 조직별로 구분 포장하며, 검사항목 등에 따라 필요한 경우 검사관에 증량을 요구할 수 있다. 4) 시료채취시 시료 채취자는 시료의 추적성을 확보하기 위하여 시료채취자 성명, 시료 채취일자, 시료채취방법, 시료번호 등 기타 필요한 정보를 기록하고 봉인하여 냉장상태로 운반하여야 한다. 장거리 송부가 필요한 경우 검사시료를 냉동한 후 냉동 상태를 유지하여 운반하여야 한다. 5) 시험요원은 의뢰받은 시료에 시료명, 접수일자, 의뢰자, 기타 필요한 사항 등에 대하여 직접표기하여 시료를 식별하거나 별도의 태그 (tag), 스티커 등을 이용하여 식별하고 시료접수대장 [서식 3 : AT27-R-F3]에 기록하여야 한다. 6) 시험요원은 식별표시가 완료된 시료는 시험 진행 시료와 시험완료된 시료 등이 혼동되지 않도록 구분하여 보관 관리하여야 한다. 7) 시험이 완료된 시료는 정해진 장소에 보관하며 보관기간이 경과된 시료는 정해진 방법에 따라 폐기처리하고, 시료접수대장 또는 폐기물처리대장에 폐기일자, 폐기방법, 폐기량 등을 기록하여야 한다. 5. 시험장비의 관리 가. 목적 이 지침은 시험업무에 사용하는 시험장비와 측정기기에 대한 정기적인 관리를 통하여 장비의 충분한 성능과 정밀도 및 정확도를 유지함으로써 시험결과의 신뢰성을 확보하는데 그 목적이 있다. 나. 용어의 정의 1) 시험장비 (testing equipment) 란 시험에 사용하는 장비로서단독으로 또는 보조장치와 결합하여 측정하는데 사용하는 측정기기 (measuring instrument)를 포함한다. 2) 교정 (calibration) 이란 특정한 조건 하에서 측정기기, 측정 시스템 등에 의해 나타나는 결과와 알려진 측정 대상에 대해 인정된 값 사이의 관계를 설정하는 일련의 업무를 말한다

337 3) 내부점검 대상 장비 (internal calibration equipment) 란 시험장비의 지속적인 신뢰성 유지를 위하여 외부교정 대상 장비를 포함하여 내부적으로 설정한 점검 주기별로 점검을 수행하는 주요 장비를 말한다. 내부 점검에는 정기 점검과 수시 점검이 있으며, 정기 점검은 점검 주기별로 수행하고 수시 점검은 장비의 이상 발생시나 일정기간 사용하지 않은 경우 수행하여야 한다. 4) 외부교정 대상 장비 (external calibration equipment) 란 온도 (temperature), 습도 (humidity), 속도/회전수 (velocity/revolution), 질량 (mass), 부피 (volume) 등과 관련한 측정기기를 교정기술 능력이 있는 국가표준교정기관에 위탁하여 교정하는 장비로서 온 습도계, 저울, 분동, 용량플라스크, 피펫을 포함한 초자기구 등을 포함한다. 다. 책임과 권한 1) 실험실 책임자는 시험장비의 구입, 취급, 운반, 보관, 점검 및 사용에 필요한 업무를 담당하는 시험장비 담당자 (정, 부)를 지정하여 관리하여야 한다. 2) 시험요원은 매년 3월말까지 보유하고 있는 시험장비에 대한 연간 교정계획을 수립하고 해당연도에 구매할 시험장비가 시험규격에서 요구하는 성능에 부합하는 장비인지 규격을 파악하여 실험실 책임자에게 보고하여야 한다. 3) 시험요원은 시험장비의 효율적인 운영, 유지 및 관리를 위하여 시험장비의 사용 기록, 주기적인 점검 및 교정을 실시하고 그 결과를 시험장비 사용 (점검)대장에 기록하고 교정결과서 등 관련서류를 보관 관리하여야 한다. 라. 시험장비의 구매 및 등록 관리 1) 신규로 구매하여 검수를 완료한 장비에 대해서는 관리부서로부터 물품 분류번호를 부여받아 각 장비에는 물품 스티커를 아래와 같이 품명, 규격, 취득일자 등을 표시하여 부착하여야 한다. 관리책임자 (정) 취급자 (부) 분류번호 회 계 품 명 물품용도 규 격 운용부서 사용위치 취득일자 취득단가 2) 각 시험장비에는 시험장비 담당자(정, 부)를 지정하고 시험장비의 성능저하 및오작동을 막기 위해 지정된 담당자 이외에 다른 사람은 직접 사용하지 않아야 한다. 3) 시험장비는 정밀도를 유지할 수 있도록 적절한 위치에 설치하고, 장비 매뉴얼은 사용하기 편리한 위치에 보관, 관리하여야 한다

338 4) 시험요원은 시험장비의 사용 또는 점검시 이상이 발견되면 실험실 책임자에게 보고하고 원인을 파악한 후 부품교체 또는 수리 등에 의해 정상적 성능을 갖출때까지 시험에 사용하지 않아야 한다. 5) 일정기간 동안 장비를 시험업무에 사용하지 않은 경우 시험업무 수행을 다시 시작하기 전에 장비의 기능 및 교정 상태를 점검하여 적절함을 입증하여야 한다. 마. 시험장비의 점검 1) 시험장비의 내부점검은 개별 장비 특성에 따라 필수 점검사항을 정하고, 장비별 점검 기준 및 절차에 따라 실시하여야 한다. 2) 시험요원은 시험장비의 주요 부품 교체 또는 수리 등이 발생할 때나 일정기간 사용하지 않아 수시점검을 실시할때마다 그 내역을 시험장비 사용(점검)대장 [서식4 : AT27 -R-F4]에 작성, 관리하여야 한다. 3) 시험요원은 시험결과에 미치는 영향에 따라 장비의 교정상태에 대한 신뢰성을 유지하기 위하여 내부적으로 규정한 점검 주기별로 장비의 중간점검을 실시하고 그 결과를 기록 유지하여야 한다. 4) 냉장 냉동고, 인큐베이터 등 내부 온도관리가 필요한 장비에 대하여는 교정받은 온도계를 내부에 설치하고 매일 1회 이상 온도를 확인, 기록하여야 한다. 5) 초순수 제조장치는 매일 1회 이상 저항값 등 점검 항목을 확인하고, 그 결과를 초순수제조장치 점검대장 [서식5 : AT27-R-F5]에 기록, 관리하여야 한다. 바. 시험장비의 교정 1) 시험요원은 교정이 필요한 장비에 대하여 교정계획을 수립하여 실험실 책임자에게 보고하고 계획에 의거 교정을 실시하여야 한다. 2) 시험장비 중 내부점검이 아닌 교정이 필요한 장비는 장비별 교정주기 및 교정 유효기간 내에 국가교정기관으로부터 교정을 받아야 한다. 다만, 온 습도계와 저울 (balance)는 매 12월마다, 분동 (weights)은 매 24개월마다, 용량플라스크, 피펫 등의 초자기구는 적어도 60개월마다 교정을 실시하여야 하며, 기타 교정이 필요한 측정기는 한국인정기구 (KOLAS)의 관련 규정에서 정하는 측정기의 교정대상 및 주기를 준용하여 실시한다. 3) 시험요원은 교정을 실시한 후 교정계획 및 결과서에 교정내용을 기록하고 교정성적서를 인수하여 보관, 관리하여야 한다. 6. 표준시약의 관리 가. 목적 이 지침은 실험실에서 사용하는 표준시약의 관리 절차를 수립하여 시험장비의 정확성 및 시험결과의 신뢰성을 유지하기 위함이다

339 나. 용어의 정의 1) 표준시약 (reference standard material) 이란 기준용 표준, 표준물질, 인증 표준물질을 포함한다. 2) 기준용 표준 (reference standard) 이란 일반적으로, 주어진 장소나 주어진 기관에서 이용할 수 있는 최고의 측정학적 성능을 가진 표준으로, 그곳에서 이루어지는 측정은 이 표준으로부터 유도된다. 3) 표준물질 (reference material ; RM) 이란 측정기의 교정, 측정방법의 평가 또는 물질의 값을 결정하는데 사용하는 것으로 한 개 혹은 그 이상의 특성치가 충분히 확정되어 있는 균일한 소재 또는 물질을 말한다. 표준물질은 순수 또는 혼합된 기체, 액체 또는 고체의 형태를 가질 수 있다. 4) 인증 표준물질(certified reference material ; CRM) 이란 특성치를 표현하는 단위의 정확한 실현을 위하여 소급성이 확립된 방법에 따라 하나 또는 그 이상의 특성치를 인증한 인증서가 첨부되어 있는 표준물질로서 각 인증치에는 정해진 신뢰도 수준에서 불확도가 표시되어 있다. 5) 소급성 (traceability) 이란 명시된 불확도를 갖는 끊어지지 않는 비교의 사슬을 통하여, 규정한 기준(일반적으로 국가 또는 국제표준)과 연관될 수 있는 측정결과 또는 표준값의 특성을 말한다. 6) 측정 불확도 (uncertainty of measurement)"란 합당하게 측정량으로 추정할 수 있는 값들의 산포를 특성짓는, 측정결과와 관련된 파라미터를 말한다. 다. 책임과 권한 1) 실험실 책임자는 표준시약의 구입, 취급, 운반, 보관, 점검 및 사용에 필요한 업무를 담당하는 시험요원을 지정하여 관리하여야 한다. 2) 시험요원은 표준시약 관리대장을 작성하고, 매년 12월말까지 표준시약의 재고현황을 파악하여 실험실 책임자에게 보고하여야 한다. 라. 표준용액의 조제 및 관리 1) 시험요원은 해당 기관의 구매절차에 따라 구입된 표준시약에 대하여 조제회사, 중량/용량, 순도, 개봉일자, 유효기한, 보관방법 등 내용을 표준시약 관리대장 [서식6 : AT27 -R-F6])에 작성하고, 각 물질별 인증서(certificate)를 보관하여야 한다. 이때 해당 표준시약 용기에는 표준시약 관리대장의 고유번호를 표시하거나 라벨을 부착하여야 한다. 2) 표준시약은 오염이나 품질저하를 방지하기 위하여 소정의 자격을 인정받은 자에 한하여 사용하도록 제한하여야 하며, 물질별 특성을 고려하여 관리대장에 지정한 적합한 장소 (냉동/냉장/실온)에 보관하여야 한다

340 3) 표준시약을 이용하여 표준용액 (stock solution 및 working solution)을 조제한 때는 조제자, 조제일자, 칭량무게, 조제농도, 희석용매 및 용매사용량, 유효기한 등을 시험노트에 기록하여야 한다. 이때 표준시약에 염(salt), HCl 등이 함유되어 있는 경우 이들 무게를 환산하여 칭량하여야 한다. 4) 조제한 표준용액 (standard solution)의 용기에는 조제자 (preparer), 조제일자 (date prepared), 표준시약명 (표준용액 조제시 사용된 표준시약의 고유번호 명시), 표준용액농도 (standard concentration) 및 사용기한을 표시하거나 라벨을 부착하여야 한다. 5) 표준용액 (stock solution 및 working solution)의 보관은 해당 물질별 특성을 고려하여 적절한 보관조건에 따라 지정된 장소 (냉동/냉장/실온)에 보관하여야 한다. 6) 유효기한이 경과한 표준시약 및 표준용액은 시험에 사용하지 않으며, 적합한 절차에 따라 폐기하고 각각 관리대장 및 시험노트에 폐기일자를 기록하여야 한다. 7. 잔류물질 시험업무 관리 가. 목적 이 지침은 시험업무를 객관적이고 공정하게 실시하고 정확성 및 정밀성을 확보함으로써 시험결과에 대한 신뢰도 및 공신력을 유지하고자 하는데 목적이 있다. 나. 용어의 정의 1) 정확도 (accuracy) 란 분석물질 농도의 참값과 동일 시료를 반복 실험을 통해 얻은 평균값간의 일치도를 말한다. 인증표준물질 (CRM)을 이용할 수 없는 경우 회수율 (recovery)을 측정한다. 2) 정밀도 (precision) 란 규정된 분석조건에서 동일한 시료로부터 얻어진 독립된 분석 결과들 간의 일치도를 나타내는 것으로 다른 실험실간의 분석오차는 재현성으로 나타내며 한 실험실에서 반복된 분석 결과의 변이는 반복성으로 나타낸다. 3) 반복성 (repeatability) 이란 동일한 시료 및 분석법을 이용하여 같은 실험실, 장비 및 분석자에 의해 연속적으로 측정하여 얻은 분석결과 간의 일치하는 정도를 말하며, 동일한 측정조건에서 반복 시험하여 얻은 정밀도를 의미한다. 4) 재현성 (reproducibility) 이란 동일한 시료 및 분석법을 이용하여 서로 다른 실험실, 장비 및 분석자에 의해 측정된 분석결과 간의 일치하는 정도를 말한다. 실험실 내 재현성은 같은 실험실에서 이미 결정된 조건하에서시간간격을 두고 측정하여 얻은 정밀도를 말한다. 5) 검출한계 (LOD) 란 어느 주어진 시험법으로 시료에 대한 잔류분석 전 과정을 실시한 후 분석대상물질의 유무를 확인할 수 있는 최소 검출농도를 말한다. 즉, 한 시료에서 반드시 정량성이 있는 것은 아니지만 검출해낼 수 있는 분석물질의 최소농도를 의미한다. 해당 품목의 조직표준곡선 y-절편에 표준곡선의 선형회귀분석으로부터 얻은 표준편차의 3배를 더하여 산출하거나 이와 동등한 수준의 합리적인 신뢰도를 갖는 방법으로 산출한다

341 6) 정량한계 (LOQ) 란 어느 주어진 시험법으로 시료에 대한 잔류분석 전 과정을 실시한 후 분석대상물질을 합리적인 신뢰성을 가지고 정량할 수 있는 최소 검출농도를 말한다. 즉, 한 시료에서 수용할 수 있는 정밀도를 가지고정량적 측정결과를 산출해낼 수 있는 최소농도를 의미한다. 해당 품목의 조직표준곡선 y-절편에 표준곡선의 선형회귀분석 으로부터 얻은 표준편차의 10배를 더하여 산출하거나 이와 동등한 수준의 합리적인 신뢰도를 갖는 방법으로 산출한다. 7) 설정값 (assigned value) 이란 특정량에 귀속된 값으로서, 주어진 목적에 적합한 불확도를 갖는 것으로 때로는 합의에 의해 인정된 값을 말한다. 8) 이상값 (outlier) 이란 일련의 값들에서 다른값들과 일치하지 않는 값을 말한다. 9) 조직표준곡선 (tissue standard curve)이란 분석물질의 정량시 매질 효과를 최소화하기 위하여 음성대조시료를 시험법에 따라 추출 후 분석물질을 첨가하여 분석한 후 작성하는 검량선을 말하며, r 를 권장한다. 10) 숙련도시험 (proficiency testing) 이란 시험기관의 능력을 확인하기 위해 설계 및 운영되는 시험기관간 비교를 통하여 시험기관의 시험 수행도를 판정하는 것을 말한다. 11) 시험기관간 시험 프로그램(inter-laboratory testing scheme) 이란 참가하는 시험기관들 에게 공동시험을 할 수 있도록 하나의 시료 또는 하나의 재료원으로부터 임의로 선택된 부차시료 (sub-sample)를 동시에 배부하는 방법이다. 때로는, 이 기법이 시험기관간 측정 프로그램에 이용되기도 한다. 시험 완료 후, 그 결과는 운영기관으로 보내져 개개 시험기관과 그룹전체의 수행도 지표를 부여하기 위하여 설정값과 비교된다. 12) 시험기관간 비교시험 (inter-laboratory comparison) 이란 둘 또는 그 이상의 시험기관이 미리 설정된 조건에 따라 같거나 유사한 시험물에 대하여 시험을 구성, 수행 및 평가하는 것을 말하며, 어떤 경우에는 시험기관간 비교에 참가한 시험기관 중 하나가 시험물의 설정값을 부여하는 역할을 수행할 수도 있다. 13) 시험자간 비교시험 (within laboratory comparison) 이란 하나의 시험기관이 미리 설정된 조건에 따라 같거나 유사한 시험품에 대하여 시험기관내 시험자간에 시험을 수행 및 평가하는 것을 말한다. 14) 실험실내 시료점검 (intra-laboratory sample check) 이란 시험요원의 숙련도를 모니터링 하기 위하여 수행하는 내부점검 (internal check)을 말한다. 15) 품질관리 (quality control) 란 시험장비, 표준시약, 저울 및 보관온도 관리, 피펫, 용량 플라스크 등 초자기구의 교정관리, 시험요원의 교육관리 등 시험업무 전반에 걸쳐 체계적인 관리절차를 갖추고, 일상적인 시험업무 과정에서 첨가시료 (spike sample)의 시험, 양성 검출시 재시험(re-testing) 등을 통해 시험요원의 시료분석과 관련된 요소들을 모니터링하고 실험실내 시험결과의 품질을 높이는 것이다

342 16) 품질보증 (quality assurance) 이란 실험실내 시료점검 (internal check), 인증표준물질 (CRM)이나 실험실내 표준물질 (in-house reference materials)을 사용하여 실험실내 시험자간 비교시험이나 시험기관간 비교시험 또는 다른 실험실에 의해검증받거나 시험기관 숙련도시험 등을 통해 고객에게 신뢰성있는 시험결과를 제공하고 실험실간 시험결과의 품질을 비교할 수 있는 기회를 보장하는 것이다. 다. 책임과 권한 1) 실험실 책임자는 시험업무와 관련된 제반 업무를 관리 감독하고 시험성적서의 검토 및 결과를 승인하여야 한다. 2) 실험실 책임자는 숙련도 시험이나 시험기관간 또는 시험자간 비교시험 참여에 대한 계획을 수립하고 실시하여야 한다. 3) 실험실 책임자는 신규 시험요원의 임용시 시험업무를 수행하기전 전문교육기관 또는 분석기기업체 등으로부터 기술교육을 받은 후 시험에참여하도록 하여야 한다. 4) 실험실 책임자는 시험요원이 담당하는 분석물질의 분석을 시작하기전 표준품, 첨가시료, 점검시료 (check sample) 순으로 분석경험을 익히도록 한 후 공식적인 시료분석을 하도록 하여야 한다. 5) 실험실 책임자는 시험요원의 숙련도를 모니터링하기 위하여 적어도 주 1회 또는 분석 작업이 부정기적으로 행해진다면 실험때마다 실험실내 시료점검을 실시하여야 한다. 6) 실험실 책임자는 담당분야 시험요원별로 control chart (회수율의 분포도)를 작성, 관리 하여야 한다. 이 control chart에는 회수율에 대한 control limits (UCL, UWL, LCL, LWL)를 표시하여야 한다. * UCL (upper control limit), LCL (lower control limit) : Mean ± 3SD, UWL (upper warning limit), LWL (lower warning limit) : Mean ± 2SD 7) 실험실 책임자는 시험결과 발생한 이상값 (outlier)의 원인을 분석하고 불만족시 개선 및 시정조치를 통하여 향후 재발 방지하여야 한다. 8) 시험요원은 해당 시험방법을 준수하여 시험업무를 수행하여야 하며, 시험 관련 기록을 유지, 관리하여야 한다. 9) 시험요원은 시험에 대한 측정결과를 시험노트에작성하여야 한다. 시험노트에는 시료 번호, 시료명, 시험항목, 시험방법, 시험일자, 시험자, 사용 장비명, 표준시약명, 시험결과 등을 작성하여야 한다. 10) 시험요원은 컴퓨터나 자동화된 장비를 이용하여 시험데이터를 수집, 처리, 기록, 보관 및 검색을 하는 경우에는 전자매체를 이용한 측정 데이터를 주기적으로 확인하고 유지관리하여야 한다

343 11) 시험요원은 연간계획에 의거 숙련도 시험이나 시험기관간 또는 시험자간 비교시험에 적어도 년 1회이상 참여하여야 한다. 라. 실험실내 시료점검 (내부점검) 1) 실험실책임자는 시험요원이 해당 물질의 분석을 시작할 때 표준품과 첨가시료의 분석경험을 익힌 후 적어도 음성대조시료 1개, 회수율 점검용 첨가시료 3개시료 (기준 설정물질의 경우 MRL 1.0x, 불검출 물질의 경우 LOQ 1.0x), 미지시료 (unknown sample) 2개이상을 포함하여 최소 6개의 점검시료를 제공하여 분석결과를 보고하도록 하여야 한다. 2) 실험실책임자는 시험요원이 정기적으로 분석하는 물질의 경우 해당 시료로서 적어도 주당 1 점검시료를, 비정기적으로 분석하는 물질의 경우 매번 적어도 1점검시료를 제조하여 제공하여야 한다. 3) 시험요원은 각 실험실내 점검시료별 분석을 실시하여 음성대조시료의 결과, 회수율, 반복성, control chart 등 기록을 유지하고 실험실책임자에 보고하여야 한다. 4) 실험실 책임자는 내부점검결과 음성대조시료에서 위양성 (false positive)이거나 회수율 점검용 첨가시료에서 위음성 (false negative)인 경우 시료분석을 중단하고 개선조치를 취하여야 한다. 마. 시험자간 비교시험 1) 실험실 책임자는 농림수산검역검사본부가 주관하는 숙련도시험 이외에 연간 계획에 따라 표준물질 또는 인증표준물질을 구매하거나 실험실내 첨가시료 (spike sample)를 조제하여 시험자간 비교시험을 실시하여야 한다. 2) 실험실책임자가 실험실내 첨가시료 (spike sample)를 조제하여 시험자간 비교시험을 실시하는 경우 시험요원별 적어도 조직표준곡선 작성을 위한 음성대조시료 6개시료, 회수율 점검용 첨가시료 3개시료 (기준설정물질의 경우 MRL 1.0x, 불검출 물질의 경우 LOQ 1.0x), 미지시료 (unknown sample) 3개이상을 포함하여 최소 12개 시료를 제공하여 분석결과를 보고하도록 하여야 한다. 3) 시험요원은 점검시료에 대한 분석을 실시한 후 정확도, 반복성 (정밀도), LOD, LOQ 등 분석결과 기록을 작성하고 실험실책임자에 보고하여야 한다. 4) 실험실 책임자는 시험요원별 정확도와 반복성 (정밀도)이 별표 1의 권장기준내 있는지, 최저검량농도 (lowest calibrated level)은 잔류허용기준의 1/2이하인지 등을 확인하고 필요시 개선조치를 취하여야 한다

344 바. 시험결과의 품질관리 1) 시험요원은 시료 (test sample)를 분석하는 시험단위 (batch)마다 음성대조시료 (blank sample) 및 회수율 점검용 첨가시료 (spike sample) 3개 이상, 주 1회이상 점검시료 (check sample)를 분석한 후 음성대조시료의 결과, 회수율 등 시험결과를 시험노트에 기록하여야 한다. 이때 첨가시료 (양성대조시료)는 잔류허용기준이 있는 물질의 경우 적어도 기준 농도 (MRL 1.0x)를, 불검출 물질의 경우 정량한계 농도 (LOQ 1.0x)를 포함하여야 한다. 2) 스크리닝 검사에 양성 시료에 대한 정량분석시에는 한 시료에 대하여 시험을2회 이상 반복하여 시험결과값을 산출하여야 한다. 그 결과를 시험노트에 기록하고 크로마토그램 등 실험데이터는 디스켓, 문서 등으로 보관하여야 한다. 3) 시험결과값은 지정된 시험법에 따라 시험한 후 정량하되, 매질효과 (matrix effect)를 최소화할 수 있는 조직표준곡선 (tissue standard curve)를 이용하여 정량한다. 만약, 표준 용액을 이용하여 정량하여야 할 경우 회수율에 의한 보정을 하지 않는다. 4) 표준용액의 검량선 또는 조직표준곡선 작성은 기기상의 최저검출량을 포함하여 분석 하고자 하는 농도가 가능한 검량선의 중심에 오게 하여, 기기의 측정값 (peak height/peak area)이 등간격이 되도록 6단계로 하여야 한다. 이때 표준용액 조제시 사용한 용매를 reagent blank로 하거나 blank sample을 포함하여야 한다. 5) 시험결과 판정이 모호한 측정치(peak)가 있는 등 확인이 필요한 경우, 재시험 (re-testing)을 실시한다. 6) 질량분석시 분석물질의 최종확인을 위해서는 최소2개의 MSMS transition product ion이 있어야 하고 (별표 2와 3), 시료내 상대이온강도 (relative ion intensity)가 허용범위 (별표 4)내에서 표준용액 및 첨가시료(spike sample)에서의 분석물질 양상과 일치하여야 한다. 7) 시험결과는 시험노트에 기록으로 관리 유지하여야 하며, 실험 데이터, 보고서, 시험성적서 등 실험 관련 자료는 발행 날짜 등을 표시하여 향후 분쟁시 기록된 내용을 확인할 수 있도록 디스켓, 문서 등으로 보관하여야 한다. 8) 시험결과의 전달은 해당 시험요원이 해당 실험실 규정에 따라 시험의뢰자에게 시험 성적서와 함께 공문을 통해 시험결과를 전달하여야 한다. 9) 시험성적서에는 제목, 주소, 기관명칭, 소재지, 시료번호, 시료명, 접수일자, 시험일자 또는 시험기간, 의뢰자의 이름 및 주소, 시험항목, 성적서 승인권자의 이름 및 서명, 기타 시험에서 요구되는 추가 정보를 기재하여야 한다

345 <별표 1> 정확 도 및 정밀 도 권 장 기준 첨가농도 정확도 반복 정밀 도 1 μg/kg % 35 % 1 μg/kg, 10 μg/kg % 30 % 10 μg/kg, 100 μg/kg % 20 % 100 μg/kg % 15 % 1) 정확도는 평균 분석농도를 설정농도로 나눈 값에 100을 곱하여 산출한다. 정확도 = (평균분석농도/설정농도) 100 2) 정밀도는 변이계수 (Coefficient of variation, CV)를 구하여 산출한다. 변이계수는 표준편차를 평균분석농도로 나눈 값에 100을 곱하여 산출한다. 변이계수 (Coefficient of variation, CV) = (표준편차/평균분석농도) 100 <별표 2> 특 이이온 당 부여 점 수 질량분석법 특이이온당 부여점수 Mass spectrometry 1 MS n prec ursor ion 1 MS n product ion

346 <별표 3> 특 이이온 의 획 득 점 수 표 질량분석법 특이이온수 획득점수 LC-M S N n LC-M S/M S 1 prec ursor, 2 p roducts 4 G C-M S/M S 1 prec ursor, 2 p roduc ts 4 LC-M S/M S 2 p recurs or, 각각의 1 produc t 5 G C-MS/MS 2 precurs or, 각각의 1 produc t 5 * 잔류허용기준이 설정된 물질의 경우 획득점수 (identification point)가 3이상이어야 하고, 불검출 물질의 경우 4이상이어야 한다. <별표 4> 상 대 이온 강 도 에 대 한 최대 허용치 상대이온강도 (b ase peak의 %) EI-GC-MS LC-M S, LC-MS n, CI -G C-M S > 50 % ± 10 % ± 20 % > 20 %, 50 % ± 15 % ± 25 % > 10 %, 20 % ± 20 % ± 30 % 10 % ± 50 % ± 50 %

347 [서식 1 : AT27-R-F1] 환경관리 점검표 실험실명 환경기준 온도( ) 습도(%RH) 확 인 점검일시 온도( ) 습도(%RH) 점검자 비고

348 [서식2: AT27-R-F2] 안전점검대장 점검일자 분야 점검항목 실험실명 작성 확인 점검결과 양호 보통 불량 비고 개인장비 및 일반안전 실험에 적합한 안전보호구의 확보 및 착용은? 후드는 정상적으로 작동하며, 성능은 양호한가? 실험실 내에서 금연금식을 준수하고 있는가? 보행자 통행에 장해요소는 없는가? 실험실 정리정돈 및 청결상태는? 화학약품 및 위험물안전 실내에 위험물을 과다 보관, 사용하고 있지 않은가? 유독가스가 발행되는 화학약품의 취급은 후드 내에서 실시하고 있는가? 화약약품의 특성을 이해하고 취급시 안전지침에 따르는가? 가스 안전 가스 실린더의 전도방지 장치 설치여부 가스 실린더 주위에 인화성 물질은 없는가? 가스 조정기는 안전용품을 사용하며 연결부분 밸브는 누설되지 않는가? 인체에 유해한가스 사용시 안전대책은 있는가 전기 안전 소방 안전 폐기물 안전 기타 전기코드, 배선기구의 정격용량 사용여부 전선피복, 콘센트 등이 손상 없이 기능을 유지 하는가? 분전함 앞에 물건이 적재되어 지장을 주지 않는가? 소화기가 제자리에 위치하는가? 소화기 기능의 상태가 양호한가? 소방위치의 위치 및 상태가 양호한가? 실험 종료 후 발생되는 폐액은 지정폐액통에 분리, 수거하고 있는가? 폐액통 마개의 닫힘상태는?(실내유출방지) 기타 안전 저해 요소는 없는가?

349 [서식3 : AT27-R-F3] 시료접수대장 접수 번호 접수 일자 시료번호 품 명 수량 검사 항목 운송자 시료 상태 접수자 서 명 확인자 서 명 비고

350 [서식4 : AT27-R-F4] 시험장비 사용(점검)대장 장 비 명 : 규격: 사용담당자 : 확인자 결재 점검주기: 수시점검 - 장비 수리/일정기간 사용하지 않은 경우 정기점검 - (월/격월/분기/반기/년) 1회 사용일 (년월일) 사용시간 소요 사용자 시간 시작 종료 소속 성명 사용 목적 점검사항 담당자 확인 비고 *사용목적: 시험분석, 수시점검, 정기점검

351 [서식5: AT27-R-F5] 초순수제조장치 점검대장 담당자 확인자 장비명 초순수제조 장치 규 격 용 도 초순수제조 점검항목에 따른 점검결과 점검일자 점검항목 기준 점검방법 허용범위 점검결과 비고 저항값 18(±0.2)MΩ cm2 값 읽음 18±0.2 특 기 사 항

352 [서식6 : AT27-R-F6] 표준시약 관리대장 실험실명: 작성자: (서명), 확인자: (서명) 관리번호 (Identity number) 표준시약 (Test materials) 제조회사 (Manufacturin g company) 제품번호 (Catalog No.) Lot 번호 (Lot No.) 순도 (Purity) 중량/용량 (Weight/ Volume) 수량 (Inventory number) 비고란에는 폐기날짜 등의 특이사항을 기록한다. 보관장소/온도 (Storage place/temp.) 개봉일 (Date opened) 유효기한 (Expiration date) 비고 (Remarks) 344

353 축 수산물 중 유해물질 분석법 편람 발행일 인쇄일 2011년 12월 2011년 12월 발행자 농림수산검역검사본부장 박용호 저 자 농림수산검역검사본부 독성화학과 과 장 손성완 농림수산검역검사본부 수산물검역과 과 장 박순연 농림수산검역검사본부 독성화학과 수의연구관 임채미 농림수산검역검사본부 독성화학과 환경연구관 김미경 농림수산검역검사본부 독성화학과 수의연구사 박수정 농림수산검역검사본부 독성화학과 환경연구사 김동규 농림수산검역검사본부 독성화학과 수의연구사 강정우 농림수산검역검사본부 독성화학과 수의연구사 김명애 농림수산검역검사본부 독성화학과 수의연구사 신진영 농림수산검역검사본부 수산물검역과 해양수산연구사 김재현 농림수산검역검사본부 수산물검역과 해양수산연구사 정현미 농림수산검역검사본부 수산물검역과 해양수산연구사 김상조 발행처 인쇄처 농림수산검역검사본부 경기도 안양시 만안구 안양로 175 Tel : 가현기획 경기도 안양시 동안구 관양동 동원빌딩 4층 Tel : ISBN <비매품>

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