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1 Tel / Fax / , (genome project) ,,, / 1, 2, 3 ( 1)

2 35, in vitro assay cell-based assay..., Millennim, Abgenix Medarex.,,,. mrna, DNA,. knockout, knock-in, RNAi... (1) ,,,,,,, (mutation). FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) FP (Fluorescence Polarization). HCS (High-content Screening) 96-well, 384-well plate (2). HCS,, Ca++ influx 37

3 ... in vitro ex vivo luminometer....,. (charged coupled device: CCD) (3) nm, 2-3 ev CCD, CCD. CCD. CCD HCS (Bioluminescence). (Bioluminescence). (Firefly).. 50,.. 70 (4-7)..,,. (luciferin) (Fluorescence). (Stokes law).. FITC, Texas Red, Cy5, Cy3, DAPI. DAPI,,,. GFP, RFP (8, 9). 38

4 2-3. (Fluorescence Resonance Energy Transfer; FRET).. FRET 10 ( ) (10).. FRET 1940 Forster, ( 2). FRET. FRET G. Zlokarnik β-lactamase CCF2 β-lactamase FRET (11). CCF2/AM β-lactamase FRET 409nm 520nm 447nm. 2. FRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer: BRET) BRET.. FRET (autofluorescence), (photoresponsive), (photobleaching) BRET. BRET (Resonance Energy). BRET FRET (luminescent material) (12)., Perkin Elmer BRET2 Renilla luciferase (Rluc), GFP2, FRET, DeepBlueC., A B, Rluc GFP2 A, B, ( 3). A, B,,,,. assay. BRET, DeepBlueC (DBC) Rluc GFP2 emission, DBC 39

5 3. BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer). DBC membrane,,, (Fluorescence Polarization; FP) -,, - DNA,,. (, ). (Anisotropy).. ( 4).,,. FP,. FP,, FP (Fluorescence Polarization) HTS (13)... cell-based assay. in vitro cellbased assay. cell-based assay FITC. (14), (15), (16), β- (17), (18), β- (11), (fluorescent protein) (19), 40

6 (Secreted placental Alkaline Phosphatase, SEAP) (20).., HCS,. p53 VEGF.,,.. (background activity) Kb... mrna.., Firefly luciferase,,,.,. Photinus Pyralis firefly luciferase (Fluc), 560nm 600nm. Fluc D-luciferin oxyluciferin.,, ATP.. ATP -ATP H 3 PO 4. LH2. LH2+ATP LH2-AMP+2H 3 PO 4 LH2-AMP. AMP (hv). LH2-AMP+1/2 O2 L-AMP*+H2O L-AMP* L+AMP+hv ( ) L, L-AMP* -AMP. LH2-AMP (1/2 O2)., ATP. ATP. 2 Mg2, Mn2, Co2 41

7 . 1,.. Fluc -, in vivo luciferin. 20., 1. ATP (4) Renilla luciferase Renillar reniformis Fluc renilla luciferase (Rluc). coelenterazine. Fluc,, ATP ATP. Fluc - in vivo. coelenterazine. 480 nm, 600 nm (5, 6).. 480nm BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) Secreted placental alkaline phosphatase (SPAP) SPAP Placental alkaline phosphatase 30. SPAR (21). p-nitrophenol phosphate, CSPD (22). 65 C endogenous alkaline phosphatases. HTS (FBS, Fetal Bovine Serum)... HTS Green fluorescence protein Green fluorescence protein (GFP) Aequorea victoria. cofactor (excitation wavelength) nm nm.,, GFP. 30 EGFP., ( 5). 42

8 Red fluorescence protein (RFP) R. Tsien Discosoma DsRed nm nm ( 5). 600nm. DsRed tetramer monomeric red flurescence protein (9)..,,,,, (High Throughput Screening, HTS)., HTS (23). QC,, (% Activity) IC 50, Ki, Km curve- fitting. HTS 5. (Excitation) (Emission)..,, (CCL),. 1990,. HTS,. 1 HTS. :. :. :.. 43

9 :. 384-well well ( 6). :.. : HTS 50%.,,. :,,,,. : HTS. :.. HTS,,., (Chemical Inventory),..,.,.,. 6. HTS 96-well.,.. HTS,. HTS,, 1 (, ) 2 ( ) (HCS), (24). HCS,,. HCS 44

10 7. HCS, Evotec Opera,,,, -,,,,.,.,,. 21 HTS ( 7). HCS,,,,,,.,,, DNA ( ),,, (device).,., (DNA),.,, DNA Chip ( ), Protein Chip ( ), Cell Chip ( ), Neuron Chip ( ), Chip, Lab-on-a-Chip SPR (surface plasmon resonance) BIOCORE SPR (surface plasmon resonance). SPR Da (Dalton)., ( 8). SPR. SPR,,. SPR HTS SPR, 45

11 8. SPR Sensorgram 9. caspase 2 SPR SPR image system. SPR sensor system, HTS (25) (Chemical chip) 1 (26). ( 9).. Schreiber 3,780 Ure2p, Ure2p Uretupamine (27) ,.. (28).,.,,,

12 CPU 10. ( 10)..,,.,, (pharmacophore),., false-postivie hit. ~,. hit ,.. HTS, HCS. 1. Schreiber, S. L. (1998) Chemical genetics resulting from a passion for synthetic organic chemistry. Bioorg. Med. Chem. 6, Kapur, R. (2002) Fluorescence imaging and engineered biosensors: functional and activity-based sensing using high content screening. Ann N Y Acad Sci. 961, Massoud, T. F. and Gambhir, S. S. (2003) Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev 17,

13 4. Contag, C. H., Spilman, S. D., Contag, P. R., Oshiro, M., Eames, B., Dennery, P., Stevenson, D. K., and Benaron, D. A. (1997) Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochem Photobiol 66, Bhaumik, S. and Gambhir, S. S. (2002) Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proc Natl Acad Sci USA 99, Bhaumik, S., Lewis, X. Z., and Gambhir, S. S. (2004) Optical imaging of Renilla luciferase, synthetic Renilla luciferase, and firefly luciferase reporter gene expression in living mice. J Biomed Opt 9, Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., and Breakefield, X. O. (2005) Codon optimized Gaussia luciferase cdna for mammalian gene expression in culture and in vivo. Mol Ther 11, Hoffman, R. M. (2004) Imaging tumor angiogenesis with fluorescent proteins. Apmis 112, Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N., Palmer, A. E., and Tsien, R. Y. (2004) Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol 22, Wallrabe H., and Periasamy A. (2005) Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol Zlokarnik G., Negulescu PA, Knapp TE, Mere L, Burres N, Feng L, Whitney M, Roemer K., and Tsien RY. (1998) Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter. Science 279, Boute N, Jockers R., and Issad T. (2002) The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, Kakehi K., Oda Y., and Kinoshita M. (2001) Fluorescence polarization: analysis of carbohydrate-protein interaction. Anal Biochem. 297, de Wet J. R., Wood K.V., DeLuca M., Helinski D. R., and Subramani S. (1987) Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Mol Cell Biol. 7, Lorenz W. W., McCann R.O., Longiaru M., and Cormier M.J. (1991) Isolation and expression of a cdna encoding Renilla reniformis luciferase. Proc Natl Acad Sci USA 88, Gorman C.M., Moffat L.F., and Howard B. H. (1982) Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol Cell Biol. 2, Hall C. V., Jacob P. E., Ringold G. M., and Lee F. (1983) Expression and regulation of Escherichia coli lacz gene fusions in mammalian cells. J Mol Appl Genet. 2, Selden R. F., Howie K. B., Rowe M. E., Goodman H. M., and Moore D..D. (1986) Human growth hormone as a reporter gene in regulation studies employing transient gene expression. Mol Cell Biol. 6, Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W. W., and Prasher D. C. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263, Berger J., Hauber J., Hauber R., Geiger R., and Cullen B. R. (1988) Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene 66, Cullen B. R. and Malim M. H. (1992) Secreted placental alkaline phosphatase as a eukaryotic reporter gene. Methods Enzymol. 216, Bronstein I., Fortin J. J., Voyta J. C., Juo R. R., Edwards B., Olesen C. E., Lijam N., and Kricka L. J. (1994) Chemiluminescent reporter gene assays: sensitive detection of the GUS and SEAP gene products. Biotechniques 17, , Beske O. E. and Goldbard S. (2002) High-throughput cell analysis using multiplexed array technologies. Drug Discov Today 7, S131-S Milligan G. (2003) High-content assays for ligand regulation of G-protein-coupled receptors. Drug Discov Today 8, McDonnell J. M. (2001) Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition. Curr Opin Chem Biol. 5, Uttamchandani M., Walsh D. P., Yao S. Q., and Chang Y. T. (2005) Small molecule microarrays: recent advances and applications. Curr Opin Chem 48

14 Biol. 9, Kuruvilla F. G., Shamji A. F., Sternson S. M., Hergenrother P.J., and Schreiber S. L. (2002) Dissecting glucose signalling with diversity-oriented synthesis and small-molecule microarrays. Nature 416, Shoichet B. K. (2004) Virtual screening of chemical libraries. Nature 432,

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