대한병리학회지 : 제 35 권제 4 호 2001 The Korean Journal of Pathology. 2001; 35: 결장선암종에병발한선종에서 K-ras 유전자돌연변이와 K-ras, p16, Cyclin D1, p53 단백발현 오화은 조성진 1 원남희

Size: px

Start display at page:

Download "대한병리학회지 : 제 35 권제 4 호 2001 The Korean Journal of Pathology. 2001; 35: 결장선암종에병발한선종에서 K-ras 유전자돌연변이와 K-ras, p16, Cyclin D1, p53 단백발현 오화은 조성진 1 원남희"

한솔 윤
5 years ago
Views:

1 대한병리학회지 : 제 35 권제 4 호 2001 The Korean Journal of Pathology. 2001; 35: 결장선암종에병발한선종에서 K-ras 유전자돌연변이와 K-ras, p16, Cyclin D1, p53 단백발현 오화은 조성진 1 원남희 1 이대일 1 김인선 1 염범우 1 관동대학교의과대학명지병원해부병리과 1 고려대학교의과대학병리학교실 K-ras Gene Mutations and Expression of K-ras, p16, Cyclin D1 and p53 in Synchronous Lesions of The Colon Adenoma- Carcinoma Sequences Hwa Eun Oh, Seong Jin Cho 1, Nam Hee Won 1, Dale Lee 1, Insun Kim 1 and Bom Woo Yeom 1 Department of Pathology, College of Medicine, Kwandong University, Myongji Hospital, Koyang; 1 Department of Pathology, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea 접수 : 2001년 2월 20일게재승인 : 2001년 7월 20일 책임저자 : 오화은우 경기도고양시덕양구화정동 명지병원해부병리과전화 : ext) 713, 704 Fax: ohe11@hanmail.net Background : The colorectal adenoma-carcinoma sequence represents a well-known paradigm for the sequential development of cancer driven by the accumulation of genomic defects. Although the colorectal adenoma-carcinoma sequence has been well investigated, the studies about tumors of different dignity co-existent in the same patient are rare. K-ras mutation is an early genetic change in colon cancer. The genes involved in the cell cycle such as cyclin D1, p16, and p53 are important in the tumorigenesis of the colon. The aims of this study were to determine K-ras gene mutation and expression of K-ras, p16, cyclin D1 and p53 in synchronous lesions of the colon adenoma-carcinoma sequences and their possible relationship with K-ras mutation. Methods : The materials included 45 colonic adenocarcinomas which were accompanied by adenoma (22 low grade and 26 high grade). By using polymerase chain reaction-single strand conformational polymorphism (PCR-SSCP), we detected K-ras mutation of codon 12. An aberrant K-ras, p16, cyclin D1 and p53 expressions were stained using an immunohistochemical method. Results : K-ras mutation was 52.4% (11/21) of high grade adenomas. K-ras expression was 65.4% (17/26) of high grade adenomas. p16 and cyclin D1 expressions were 50% (11/22) and 90.9% (20/22) of low grade adenomas, respectively. p53 expression was 75.6% (34/45) of adenocarcinomas. There were statistical correlations among K-ras, p16 and cyclin D1. Conclusions : These results indicate that the ras gene mutation is an early event and the overexpressions of p16, cyclin D1 and p53 are associated with K-ras mutation and expression in adenoma-carcinoma sequences. Key Words : ras, Protein p16, Cyclin D1, p53, Colorectal neoplasms 결장암종은현재한국인의 10대암중하나이며단백질과육류섭취가많은식이습관때문에점차증가추세에있다. 1 결장암종은대부분결장선종에서기원하고이를뒷받침하는기전으로 선종-암종연쇄 " 에관여하는유전자들이 Vogelstein 등 2 에의해알려짐에따라이에대한연구가활발하다. 즉암종의형성과정에서 APC, ras, DCC, p53 등의돌연변이혹은대립유전자의소실이전암단계에서부터다단계과정을거쳐암종의발생을유도한다. 3,4 결장암종의약 50% 에서돌연변이가발견되는K-ras는성장인자를분비하는세포를유도하고, 종양세포가정상기질에부착되지않고성장할수있도록하는유전자로 서 codon 12에서돌연변이가가장흔하다. 2,5-7 한편세포주기를조절하는인자중세포주기활성인자에는 cyclin 계열단백과 cyclin dependent kinase (cdk) 가밝혀져있고, 세포주기억제인자로는 p16, p21, p53 단백이있다. 8 Cyclin 계열단백중에서 cyclin D1이주로종양의발생과관련이있다고알려져있는데, cyclin D-cdk4/6 복합체가 G1/S 이행단계에서 Rb 단백을인산화시켜비활성화함으로써세포증식을유도한다. p16 유전자는 9p21에위치하고있으며, cdk4와 6을억제하여세포주기가 G1기에서 S기로진입하는것을방해하는종양억제유전자이다. 9 따라서활성화된 p16은 S기로의진행을막고, ras에의한 291

2 292 오화은 조성진 원남희외 3 인 세포증식을억제한다. 10 p53 단백은 p21 단백을유도시켜 cyclin 계열단백중주로 cyclin D1-cdk4 복합체를비활성화시킴으로써세포주기를 G1기에머물게하여세포주기를억제하며, cyclin A를억제하여 S기로의진행을억제하기도한다. 11 따라서본연구에서는결장의선종과선암종을병발한환자에서선종의이형성등급에따른 ras 유전자돌연변이와암종의 ras 유전자돌연변이의빈도를알아보고, 세포주기조절인자인 cyclin D1, p16, p53과 K-ras 단백에대한면역조직화학염색을시행하여발현양상을비교함으로써, 이들상호간의관계와이들이선종-암종연쇄에미치는영향을알아보고자하였다. 재료 재료와방법 1995년부터 2000년까지고려대학교의과대학부속안암병원과 1999년부터 2000년까지관동대학교의과대학명지병원에서직장결장절제술을시행하여얻은직장결장암종조직을재검토하고, 선종을동반한선암종에서선종을이형성등급에따라분류하였다. 45예의선암종과그에동반된 22예의저이형성선종, 26예의고이형성선종조직을재료로하였다. 병리조직학적검색 직장결장종양중에서슬라이드와파라핀의보관상태가양호한 45예의선암종을고르고이들의조직학적분화도, 전이여부를조사하였으며, 병기는 Astler-Coller의병기를이용하였다. 직장결장암종의분화도는 WHO 분류에의거하여저분화, 중등도분화, 고분화, 그리고점액암종으로구분하였다. 각각의선암종에서동반하고있는선종을이형성등급에따라분류하고, 저등급이형성선종과고등급이형성선종으로구분하였다. 저등급이형성선종은여러층으로이루어진핵이전체상피세포높이의 3/4을넘지않으며, 핵의다형성이경도이고심각한이형성이나구조적이상을초래하지않는경우로하였다. 고등급이형성선종은여러층으로이루어진핵이전체상피세포높이의 3/4을넘으며, 핵의다형성이심하며심각한이형성이나구조적이상을초래하는경우로하였다. 면역조직화학염색 K-ras, p16, cyclin D1, p53 면역조직화학염색파라핀블록을 5 m 두께로절편하여 poly-l-lysine-coated slide 위에조직절편을부착하여 60 에서 2시간건조시켰다. 탈파라핀과함수화과정을거쳐 160 ml methanol과 3% 과산화수소수 4 ml로 10분동안처치하여내인성과산화효소를억 제하였다. 수세후 citrate buffer에담가 microwave (750 w) 에 2분간가열하였다. 증류수에세척하고, Tris buffer (ph 7.6) 를거친후실온에서 10분동안 1:100 fetal calf serum으로배양한후, 잔여혈청은제거하고일차항체를첨가한후실온에서한시간동안반응시켰다. K-ras (Santa Cruz, U.S.A.) 는일차항체 (1:50) 를 16시간동안반응시켰고, p16 (Santa Cruz, U.S.A., 1:100), cyclin D1 (Santa Cruz, U.S.A., 1:50), 그리고 p53 (Zymed, U.S.A., 1:50) 은한시간동안반응시켰다. Tris buffer로세척한후 Dako사의 Universal LSAB peroxidase II kit와 3,3-diaminobenzidine tetrachloride을사용하여면역조직화학염색을시행하였다. Cyclin D1, p16 및 p53은핵에염색된것을양성으로하였고, K-ras는세포질과세포막에염색된것을양성으로하였다. 12 Cyclin D1, p53 및 K-ras는양성반응을보인종양세포가 10% 이상인경우를양성으로하였으며, p16은양성반응을보인면적이 50% 이상일때양성으로간주하였으며, 면적이 50% 가안되는경우는단백소실이있는것으로하였다. DNA 추출및 K-ras 돌연변이검사를위한 Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) K-ras codon 12의변이여부는 PCR-SSCP 방법으로조사하였다. 통상적인포르말린고정과파라핀포매를거친조직을 6 m 두께의연속절편으로만들어 1.5 ml eppendorf tube에넣은후, 파라핀을제거하기위해크실렌 1 ml를가하였다. 그다음 60 에서 10분간방치한후 15,000 rpm으로 10분간원심분리하였다. 이과정을 2회반복한뒤 100% 에탄올 1 ml로크실렌을제거하였고, 15,000 rpm에서 10분간원심분리하며다시이과정을 2-3회반복한다음 pellet을건조시켰다. DNA 분리는 High pure PCR template preparation kit (Boehringer Mannheim, Germany) 를이용하여 eppendorf tube의건조된조직에 boiling resin 150 L를넣고 proteinase K 5 L를넣은후 56 에서한시간동안반응시켰다. 이 tube를 95 에서 10분간반응시킨후얼음에 10분간방치하고, 다시 10분간 95 에서반응시킨다음, 15,000 rpm에서 10분동안원심분리한후상층액 2 L를 PCR에사용하였다. 추출한 DNA 200 ng, 0.2 mm dntps, 1.5 mm MgCl2, 10 mm Tris HCl, 50 mm KCl, 10 pmole primers, 2.5 U Taq polymerase 및증류수를가하여 PCR 혼합액이 25 L가되게한후, PCR thermal cycler (Perkin Elmer 2400, U.S.A.) 을사용하여 K-ras codon 12에대한유전자증폭을시행하였다. 사용한 primer의염기서열은아래와같다. K-ras codon 12: 5 -G ACTGAATATAAACTTGTGG-3 5 -C TATTGTTGGATCATATTCG-3

3 결장의 K-ras 와세포주기조절인자 293 PCR 조건은처음 94 에서 5분간변성시킨후 94 에서 1분간변성, 55 에서 2분간 annealing, 72 에서 1분간 extension 을 44회반복하고, 마지막에 72 에서 7분간 extension하였다. PCR 반응의적절성을평가하기위하여 20 g ethidium bromide가함유된 1.2% 아가로즈겔에 PCR 산물 3 L와 loading dye를섞어 loading 한후, 100 V에서 20분간전기영동을시키고 UV transilluminator로 bp 사이에나타나는 band 를확인한다음 polaroid 사진기로촬영하였다. DNA marker로 100 bp ladder 5 L를 loading dye와섞어사용하였다. 5 L의 PCR 산물과증류수에 denaturing solution (95% formamide, 0.05% bromophenol blue) 5 L를넣고끓는물에서 3분간방치한후급히얼음에식히고, 12.5% polyacrylamide gel에 load하고 150 V로 6시간전기영동하였다. 전기영동이끝난후 gel을 10% 에탄올에 10분간담가둔후 1% nitric acid에 3분간담그고, M silver nitrate 용액에 30 분간담가증류수로씻어준후 0.28 M sodium carbonate, 0.019% formaldehyde 용액으로발색시켰다. DNA 띠가적절하게염색되면 10% 아세틴산으로 3분간고정한후증류수로씻고셀로판으로겔을말려서보관하였다. 통계학적분석통계학적처리는 SPSS version 7.5 (SPSS Inc., Chicago, U.S.A.) 통계프로그램을이용하여각지표에따라 Chi-square test, McNemar test와 Fisher's exact test를사용하였고, p값이 0.05 미만인경우를통계학적으로의미가있는것으로판정하였다. 이 6예였다. 선암종의 Astler-Coller 병기에따른분류로는 A3 예, B1 5예, B2 16예, C1 1예, C2 20예였다. 선암종의위치는우측결장이 5예, 맹장이 2예, 상행결장이 2예, 가로창자가 5예, 내림창자가 3예, 구불창자가 7예, 직장이 18예, 직장 -구불창자가 1예, 좌측결장이 2예였다. 정상조직, 선종및선암종에서의 K-ras, p16, cyclin D1 및 p53 의발현과 K-ras 돌연변이 (Table 1, Fig. 1, 2) K-ras의돌연변이는총 82예중 28.0% (23예) 에서검출되었으며, 저등급이형성선종 15% (3/20예) 에서, 고등급이형성선종 52.4% (11/21예) 에서, 그리고선암종 22.0% (9/41예) 에서나타났다. K-ras 단백은정상조직에서는 20%, 저등급이형성선종에서는 27.3% 가발현되어정상조직과차이를보이지않았으나, 고등급이형성선종에서는 65.4% 가발현되었고선암종에서는 51.1% 가발현되어정상및저등급이형성선종의발현과의미있는차이를보였다 (p). p16은정상조직에서는모두발현되는데비하여, 저등급이형성선종, 고등급이형성선종, 선암종에서는각각 50%, 61.5%, 33.3% 가발현되어정상에서저등급이형성선종으로이행되는단계에서소실되는것이많았다 (p). Cyclin D1은각각에서 82.2%, 90.9%, 96.2%, 86.7% 가발현되어선종이나암종에서의발현이정상과유사하였다. p53은정상에서는전혀발현되지않고저등급이형성선종에서고등급이형성선종, 그리고선암종으로이행함에따라 40.9%, 69.2%, 75.6% 로그발현이증가하였다 (p). 저등급이형성선종을동반한선암종에서 K-ras, p16, cyclin D1 및 p53 의발현과 K-ras 돌연변이 (Table 2) 결과임상및병리학적소견본연구는 45예의직장결장선암종과각각의예에함께동반하고있는 22예의저등급이형성선종, 26예의고등급이형성선종을대상으로하였다. 환자의평균연령은 62.6세였고남 : 여비율은 29:16이었다. 선암종의분화도는고분화선암종이 19예, 중등도및저분화선암종이각각 19예와 1예, 그리고점액암종 K-ras의경우, 저등급이형성선종에서는발현되지않고선암종에서발현되는예가 45.5% 로의미있게높았다 (p<0.05). p16은저등급이형성선종과선암종모두에서발현되지않는예가 40.9% 로높았다. Cyclin D1은저등급이형성선종과선암종모두에서발현되는경우가 86.4% 였다 (p). p53은저등급이형성선종에서는발현되지않고선암종에서발현되는예가 45.5% 이고모두에서발현되는예가 31.8% 였다 (p<0.05). 저등급이형성선종에서 K-ras의돌연변이를보이고선암종에서는돌연변이를보이지않는경우와, 반대로저등급이형성선종에 Table 1. K-ras mutation and expression of K-ras, p16, cyclin D1 and p53 in normal, adenoma and adenocarcinoma of the colorectum Normal Positive (%) Adenoma, low grade Positive (%) Adenoma, high grade Positive (%) Adenocarcinoma Positive (%) p value K-ras mutation K-ras P16 cyclin D1 p53 9/45 (20) 45/45 (100) 37/45 (82.2) 3/20 (15) 6/22 (27.3) 11/22 (50) 20/22 (90.9) 9/22 (40.9) 11/21 (52.4) 17/26 (65.4) 16/26 (61.5) 25/26 (96.2) 18/26 (69.2) 9/41 (22.0) 23/45 (51.1) 15/45 (33.3) 39/45 (86.7) 34/45 (75.6) <0.05

low grade adenomas of the colorectum Low adenoma-ca -- : + (%) Low adenoma-ca + : -- (%) Low

3/20 (15) 10/22 (45.5) 2/22 (9.1) 2/22 (9.1) 10/22 (45.5) 3/20 (15) 6/22 (27.3) 1/22 (4.

9) 0/22 (0) <0.05 <0.05 Ca: carcinoma, Low: low grade. A B C D Fig. 1.

4 294 오화은 조성진 원남희외 3 인 Table 2. K-ras mutation and expression of K-ras, p16, cyclin D1 and p53 protein in adenocarcinomas with low grade adenomas of the colorectum Low adenoma-ca -- : + (%) Low adenoma-ca + : -- (%) Low adenoma-ca + : + (%) Low adenoma-ca -- : -- (%) p value K-ras mutation K-ras p16 Cyclin D1 p53 3/20 (15) 10/22 (45.5) 2/22 (9.1) 2/22 (9.1) 10/22 (45.5) 3/20 (15) 6/22 (27.3) 1/22 (4.5) 2/22 (9.1) 0/20 (0) 5/22 (22.7) 19/22 (86.4) 7/22 (31.8) 14/20 (70) 6/22 (27.3) 9/22 (40.9) 0/22 (0) <0.05 <0.05 Ca: carcinoma, Low: low grade. A B C D Fig. 1. Immunoreactivity for K-ras (A, strong positive in high grade adenoma), p16 (B, strong positive in low grade adenoma), cyclin D1 (C, strong positive in low grade adenoma) and p53 (D, strong positive in adenocarcinoma).

결장의 K-ras 와세포주기조절인자 295 서는보여고등급이형성선종이후에도돌연변이가일어났음을알수있었고, 7예 (33.3%) 에서는고등급이형성선종과선암종모두에서돌연변이가일어나지않았다. 정상조직, 선종, 선암종에서 K-ras, p16, cyclin D1 및 p53 상호간의관련성 (Table 4) Fig. 2. Detection of K-ras oncogene mutations by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism.

5 결장의 K-ras 와세포주기조절인자 295 서는보여고등급이형성선종이후에도돌연변이가일어났음을알수있었고, 7예 (33.3%) 에서는고등급이형성선종과선암종모두에서돌연변이가일어나지않았다. 정상조직, 선종, 선암종에서 K-ras, p16, cyclin D1 및 p53 상호간의관련성 (Table 4) Fig. 2. Detection of K-ras oncogene mutations by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism. K-ras codon 12 shows abnormal mobility shifts (arrows). 정상과저등급이형성선종에서 cyclin D1과 K-ras 단백발현간에통계학적관련성을보였다 (p). 고등급이형성선종에서는 cyclin D1과 K-ras 단백발현간에 (p<0.01), p16 단백과 K-ras 돌연변이간에 (p<0.05), p53 단백과 K-ras 돌연변이간에 (p<0.05), K-ras 돌연변이와 K-ras 단백발현간에 (p<0.05) 관련성을보였다. 선암종에서는 cyclin D1과 K-ras 단백의발현간에, p53과 K-ras 단백발현간에, K-ras 돌연변이와 K-ras 단백발현간에관련성을보였다 (p<0.05). K-ras 돌연변이와 K-ras 단백발현의관계를보면, K-ras 돌연변이를보인 23예중 7예 (30.4%) 에서는 K-ras 단백발현을관찰할수없었고, 16예 (69.6%) 에서돌연변이와단백발현이동시에관찰되었다. K-ras 돌연변이와 K-ras 단백의발현은고등급이형성선종과선암종에서의미있는관련성을보였다 (p<0.05). 서 K-ras의돌연변이를보이지않고선암종에서는돌연변이를보이는경우는모두 20예중 3예 (15%) 였다. 반면저등급이형성선종과선암종모두에서돌연변이를보이지않는경우는 20 예중 14예 (70%) 였다 (p). 고등급이형성선종을동반한선암종에서 K-ras, p16, cyclin D1 및 p53 의발현 (Table 3) K-ras, cyclin D1 및 p53 모두에서고등급이형성선종과선암종모두에서발현되는예가각각 34.6%, 76.9%, 50% 였다. p16은고등급이형성선종에서는발현되며선암종에서는발현되지않는예가 38.5% 로가장높았다. K-ras는고등급이형성선종 21예중 11예 (52.4%) 에서돌연변이를보여고등급이형성선종의형성에기여할것으로생각되나, 21예중 3예 (14.3%) 는고등급이형성선종에서는돌연변이를보이지않는데선암종에 선암종에서병기와 K-ras, p16, cyclin D1 및 p53 간의관련성 (Table 5) 선암종에서병기에따른 K-ras 돌연변이와 K-ras, p16, cyclin D1 및 p53 단백의발현의변화를비교하면, 각각은병기와통계학적으로유의한관련성이없었다. 고찰 ras 종양유전자는인체발암과정중초기에작용하는강력한종양유전자중하나이다. ras 유전자가결장암종의선종-암종연쇄중초기에관여할것이라는이론이대두된이후, 최근에는 ras와다른종양유전자와의관련성을밝히려는연구가이루어지고있다. 특히세포주기조절인자와의관련성을밝히려는시도 Table 3. K-ras mutation and expression of K-ras, p16, cyclin D1 and p53 protein in adenocarcinomas with high grade adenomas of the colorectum High adenoma-ca -- : + (%) High adenoma-ca + : -- (%) High adenoma-ca + : + (%) High adenoma-ca -- : -- (%) p value K-ras mutation K-ras p16 Cyclin D1 p53 3/21 (14.3) 2/26 (7.7) 2/26 (7.7) 0/26 (0) 7/26 (26.9) 8/21 (38.1) 8/26 (30.8) 10/26 (38.5) 5/26 (19.2) 5/26 (19.2) 3/21 (14.3) 9/26 (34.6) 7/26 (26.9) 20/26 (76.9) 13/26 (50) 7/21 (33.3) 7/26 (26.9) 7/26 (26.9) 1/26 (3.8) 1/26 (3.8) <0.005 Ca: carcinoma, High: high grade.

6 296 오화은 조성진 원남희외 3 인 Table 4. Correlation between K-ras mutation and expression of K-ras, p16, cyclin D1 and p53 protein in normal, low grade adenomas, high grade adenomas and adenocarcinomas of the colorectum p16 (%) Cyclin D1 (%) p53 (%) negative positive negative positive negative positive Normal a K-ras (-) (+) Low grade adenoma b K-ras (+) K-ras mu (+) High grade adenoma c K-ras (+) K-ras mu (+) Adenocarcinoma d K-ras (+) K-ras mu (+) 1/3 (33.3) 6/26 (23.1) 3/11 (27.3) 12/45 (26.7) 6/9 (66.7) 36/45 (80) 9/45 (20) 2/3 (66.7) 10/26 (38.5) 8/11 (72.7) 11/45 (24.4) 3/9 (33.3) 5/45 (11.1) 3/45 (6.7) 0/22 (0) 0/3 (0) 0/26 (0) 0/11 (0) 1/45 (2.2) 0/9 (0) 31/45 (68.9) 6/45 (13.3) 6/22 (27.3) 3/3 (100) 17/26 (65.4) 11/11 (100) 22/45 (48.9) 9/9 (100) 36/45 (80) 9/45 (20) 3/3 (100) 4/26 (15.4) 2/11 (18.2) 5/45 (11.1) 0/9 (0) 0/3 (0) 13/26 (50) 9/11 (81.8) 18/45 (40) 9/9 (100) a : p value in normal : cyclin D1-ras, b : p value in low grade adenomas : p16-ras, cyclin D1-ras, p53-ras, p16-ras mu, cyclin D1-ras mu, p53-ras mu, ras-ras mu, c : p value in high grade adenomas : p16-ras, cyclin D1-ras <0.01, p53-ras, p16- ras mu <0.05, p53-ras mu <0.05, ras-ras mu <0.05, d : p value in adenocarcinomas: p16-ras, cyclin D1-ras, p53-ras <0.05, p16-ras mu, cyclin D1-ras mu, p53-ras mu, ras-ras mu <0.05, mu: mutation. Table 5. Correlation between K-ras mutation and expression of K-ras, p16, cyclin D1 and p53 protein in adenocarcinomas according to stage and adenomas of the colorectum Adenoma (%) Stage A (%) B1+B2 (%) C1+C2 (%) p value K-ras mutation K-ras p16 Cyclin D1 p53 10/41 (24.4) 23/48 (47.9) 27/48 (56.3) 45/48 (93.8) 27/48 (56.3) 1/3 (33.3) 1/3 (33.3) 1/3 (33.3) 3/3 (100) 2/3 (66.7) 3/21 (14.3) 12/21 (57.1) 8/21 (38.1) 18/21 (85.7) 15/21 (71.4) 5/21 (23.8) 10/21 (47.6) 6/21 (28.6) 19/21 (90.5) 17/21 (81) 가있다. 13 다단계발암과정에서 myc이나 cyclin D의과발현, 혹은 p53의돌연변이같은유전자적이상이 ras의형질전환을야기하는데필요하다는이론이대두되고있고, 14,15 ras와 p16 간의관계에대한연구도있다. 16 최근에는 ras가세포표면에있는성장인자수용기에서핵으로의정보를전달하는주된경로의역할을한다는보고도있다. 16 MacLeod 등에의하면 ras는 AP-1 복합체를활성화시켜서 DNA methyltransferase를 upregulate한다고한다. 17 이것은 ras가세포형질전환과 DNA 메틸화를매개하는역할을하는것을시사하며 p16의메틸화와불활성화에도관여한다는것을말해준다. 16 본연구에서 K-ras의발현이정상조직과저등급이형성선종에서보다고등급이형성선종에서의미있게높은것, 그리고저등급이형성선종에서는발현되지않으나선암종에서는발현되는예가많은점, 그리고고등급이형성선종과선암종에서동시에발현되는예가많은점등은모두K-ras가저등급이형성선종에서그다음단계로진행하는데기여할것이라는것을시사한다고하겠다. 본연구에서 K-ras의돌연변이는 20예의저등급이형성선종중 3예 (15%) 에서, 21예의고등급이형성선종중 11예 (52.4%) 에서, 그리고 41예의선암종중 9예 (22.0%) 에서나타나서, 총 82예중 23예의돌연변이를보여 28.0% 였다. 선암종의경우 22% 가 검출되어다른논문 2,5 의 50% 에비해적었는데, 이것은 PCR 생성물을정제하는과정에서 K-ras가빠져나갔기때문일것으로생각된다. 또선종에서선암종으로의이행시에 K-ras 돌연변이이외의다른인자가관여할것임을시사하는것이라하겠다. p16 유전자의불활성화기전은돌연변이라기보다는동종성소실이나과메틸화가주된기전으로알려져있다. 18 p16 유전자의불활성화는단백소실이나불안정한단백을만들므로면역조직화학염색상종양세포의핵에서음성을보이는것을의미있는것으로간주하였다. p16 유전자의동종성소실빈도는종양마다차이가있어서 10-70% 까지보고되고있다 본연구에서 p16 단백이정상조직에비해저등급이형성선종에서의미있게소실된점, 저등급이형성선종과선암종에서동시에소실된예가많은점등은 p16의작용시기가저등급이형성선종이되기이전이라는것을보여주는것이라하겠다. 사람의유전체에는적어도 11개의명백한 cyclin 유전자가있고이들은 3가지종류로분류할수있다. G1기 cyclin (C, D1-3, E, G, H), S기 cyclin (A, F), G2/M기 cyclin (A, B1-2) 가있고 23,24 이들과결합하여활성을나타내는 cdk가있으며, cdk는 1번부터 6번까지의아형으로구분되고, 이들각각은세포주기 G1, S, G2, M기에따라발현양이변화되어세포주기진

7 결장의 K-ras 와세포주기조절인자 297 행에관여한다. 유방암종, 두경부암종, 식도암종, 간세포암종, 방광암종등에서염색체 11q13이증폭하여 cyclin의발현이증가되었음이보고되었고, 종양세포주를이용한연구에서도 cyclin 이종양형성에관여한다고보고되었다. 25,26 Cordon-Cardo 등 13 은유방암종과폐암종조직을이용한 cyclin D1 단백연구에서 cyclin D1 단백발현과유전자증폭은연관성이있다고기술하였다. 그러나, Bartkova 등은 cyclin D1 유전자의증폭없이 cyclin D1 단백의발현이증가하며, cyclin D1 유전자증폭보다는 cyclin D1 단백의과발현이종양형성과더밀접한요소일수있다고보고하였다. 27 Arber 등 28 은결장선종과선암종에서 cyclin D1의핵발현을 34% 와 30% 로보고하였고, 정상조직에서는핵에서발현되지않고세포질에발현되었으며선암종주변의이행성상피에서는 85% 에서세포질에발현되었다고보고하였다. 그러나본연구에의하면정상조직에서도 82.2% 에서핵에발현되었고, 저등급이형성선종, 고등급이형성선종, 및선암종에서각각 90.9%, 96.2%, 86.7% 로발현되어 Arber 등의연구결과와는차이를보였다. 본연구결과에의하면, cyclin D1 역시저등급이형성선종이되기이전단계에서역할을할것으로생각된다. 종양조직에서 p53 단백발현에대한설명은크게두가지로할수있다. 첫째로, 대부분의경우는 p53 유전자의돌연변이로생성된 p53 단백이정상야생형 p53보다안정한상태로있어서세포핵내에축적된다는것이다. 29 둘째로, 종양세포가세포손상을받거나 DNA 손상이있을때, 생리적반응으로증가한다는것이다. 30 본연구에서 p53 단백은정상조직에서는전혀발현되지않았고, 저등급이형성선종, 고등급이형성선종그리고선암종으로진행하면서발현이점차증가하여 p53은다단계암종기전에서각시기마다어떤역할을할것으로생각되며, 특히암종이되기바로전단계에서그역할이클것으로생각된다. 선암종에서병기와 K-ras, p16, cyclin D1 및 p53 단백의발현간에는통계학적으로유의한관련성이없으므로, 이런종양유전자의발현이나돌연변이, 세포주기조절인자의발현정도를암의예후인자로사용하기에는어려울것같다. 본연구에서는 K-ras의돌연변이와면역조직화학적방법, 그리고몇가지세포주기조절인자의발현에대하여면역조직화학적방법만을이용하였기때문에, 이들상호간의정확한발현양상을파악하여상호비교하기에는다소어려움이있었다. 좀더세밀한분자생물학적방법을도입하여추가적인연구가필요할것으로생각한다. 참고문헌 1. Ministry of Health and Welfare, Republic of Korea. Annual report of the central cancer registry of Korea ( ). June, Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, et al. Genetic alterations during colorectal tumor development. N Engl J Med 1988; 319: Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model of colorectal carcinogenesis. Cell 1990; 61: Gryfe R, Swallow C, Bapat B, Redston M, Gallinger S, Couture J. Molecular biology of colorectal cancer. Curr Probl Cancer 1997; 21: Bos JL, Fearon ER, Hamilton SR, et al. Prevalence of ras gene mutations in human colorectal cancers. Nature 1987; 327: Forrester K, Almoguera C, Han K, Grizzle WE, Perucho M. Detection of high incidence of K-ras oncogenes during human colon tumorigenesis. Nature 1987; 327: Boughdady IS, Kinsella AR, Haboubi NY, Schofield PF. K-ras gene mutations in adenomas and carcinomas of the colon. Surg Oncol 1992; 1: Cordon-Cardo C. Mutation of cell cycle regulators. Biological and clinical implications for human neoplasia. Am J Pathol 1995; 147: Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cellcycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature 1993; 366: Serrano M, Gomez-Lahoz E, DePinho RA, Beach D, Bar-Sagi D. Inhibition of ras induced proliferation and cellular transformation by p16ink4a. Science 1995; 267: Shaw PH. The role of p53 in cell cycle regulation. Pathol Res Pract 1996; 192: Jansson DS, Radosevich JA, Carney WP, et al. An immunohistochemical analysis of ras oncogene expression in epithelial neoplasms of the colon. Cancer 1990; 65: Arber N, Hibshoosh H, Yasui W, et al. Abnormalities in the expression of cell cycle-related proteins in tumors of the small bowel. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1999; 8: Land H, Parada LF, Weinberg RA. Tumorigenic conversion of primary embryo fibroblasts requires at least two cooperating oncogenes. Nature 1983; 304: Weinberg RA. Oncogenes, antioncogenes, and the molecular bases of multistep carcinogenesis. Cancer Res 1989; 49: Guan RJ, Fu Y, Holt PR, Pardee AB. Association of K-ras mutations with p16 methylation in human colon cancer. Gastroenterology 1999; 116: MacLeod AR, Rouleau J, Szyf M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. J Biol Chem 1995; 270: Herman JG, Merlo A, Mao L, et al. Inactivation of the CDKN2/p16/ MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers. Cancer Res 1995; 55: Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator

8 298 오화은 조성진 원남희외 3 인 potentially involved in genesis of many tumor types. Science 1994; 264: Nobori T, Miura K, Wu DJ, Lois A, Takabayashi K, Carson DA. Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature 1994; 368: Sibert R, Willers CP, Schramm A, et al. Homozygous loss of the MTS1/p16 and MTS2/p15 genes in malignant lymphoma and lymphoblastic cell lines. Br J Haematol 1995; 91: Giani C, Finocchiaro G. Mutation rate of the CDKN2 gene in malignant gliomas. Cancer Res 1994; 54: Pines J, Hunter T. Cyclins and cancer II: cyclin D1 and CDK inhibitors come of age. Cell 1994; 79: Sherr CJ. Mammalian G1 cyclins. Cell 1993; 73: Motokura T, Arnold A. Cyclins and oncogenesis. Biochem Biophys Acta 1993; 1155: Hinds PW, Dowdy SF, Eaton EN, Arnold A. Function of a human cyclin gene as an oncogene. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: Bartkova J, Lukas J, Strauss M, Bartek J, The PRAD-1/cyclin D1 oncogene product accumulates aberrantly in a subset of colorectal carcinomas. Int J Cancer 1994; Arber N, Hibshoosh H, Moss SF, et al. Increased expression of cyclin D1 is an early event in multistage colorectal carcinogenesis. Gastroenterology 1996; 110: Hinds PW, Finlay CA, Quartin RS, et al. Mutant p53 DNA clones from human colon carcinomas cooperate with ras in transforming primary rat cells: a component of the hot spot mutant phenotypes. Cell Growth Differ 1990; 1: Hall PA, Lane DP. p53 in tumor pathology: Can we trust immunohistochemistry? -Revisited! J Pathol 1994; 172: 1-4.

Jkbcs016(92-97).hwp

Jkbcs016(92-97).hwp Expression of bcl-2 and Apoptosis and Its Relationship to Clinicopathological Prognostic Factors in Breast Cancer - A Study with Long Term Follow-up correlated with the survival rate.(journal of Korean