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1 대한내과학회지 : 제 79 권부록 2 호 2010 청람연구비결과보고 대장암발생과정에서 Prostaglandin 의조절기전규명및암예방약제의반응성표지자로 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase의역할 울산대학교의과대학내과학교실 명승재 서 론 2. 병리조직학적분석 (Histopathologic analysis) 과제는인체에서대장암병기의각단계에서 PGs (prostaglandins) 의합성과대사에영향을미치는유전자들, COX-2, 15-PGDH (15-prostaglandin dehydrogenase), mpges (prostaglandin synthase) 의변화를관찰하고그대사산물이며암발생에중요한역할을하는 PGE 2 (prostaglandin E 2) 의발현을측정하여대장암발생과정에서 PGs 조절기전을탐색하고자하였다. 또한중요한대장암종양억제유전자인 15-PGDH 를임상에서응용하기위하여이유전자발현유무에따른암예방약제의반응성을검토하여 15-PGDH 의생물표지자로서의가능성을증명하여향후임상실험및연구에필요한기초자료를확보하고자하였다. 연구범위및연구수행방법 1. 대장조직에서 RNA 분리와 real-time PCR 로 15-PGDH 와 COX-2 mrna 발현측정대장조직에서 total RNA를 RNeasy Mini kit (Qiagen) 을이용하여추출한다. 이렇게얻어진 RNA는분광계를통해 260 nm의흡광도에서농도를측정하고, 260 nm/280 nm의값이 1.7~2.0임을확인한후 0.8% 의 agarose gel에서전기영동한후 ethidium bromide를사용하여 RNA를확인한다. Oligo dt primer와 AMV reverse transcriptase (ABI Applied Biosystems) 를이용하여 cdna를합성한다. Real-time PCR 은 human 15-PGDH TaqMan Probe/Primer kit, human COX-2 (cyclooxygenase-2) TaqMan Probe/Primer kit 그리고 the human ACTB TaqMan primer/probe kit (Applied Biosystems) 을사용하여 Applied Biosystem 7500 Real-time PCR systems로수행하였다. RNA 의정량은 15-PGDH or COX-2/β-actin=2 exp (CT β-actin-ct 15-PGDH) 로측정한다. 조직의일정부분을중성완충포름알데히드 (10% neutral buffered formalin, NBF) 고정액에서 24시간동안고정한후, 일정한수세및통상적인방법에따라알콜탈수과정을거쳐파라핀으로포매한다. 포매된 colon 조직은박절편기를이용하여 4 μm 두께의연속절편을작성하여 hematoxylin-eosin (H-E) 염색을시행한다음 permount로봉입하여영구표본을작성한뒤, 병리조직학적분석을수행한다. 3. mpges-1 의단백질발현측정 (Western blot analysis) 조직을분석직전까지 -80 냉동고에보관한다. 냉동된 colon 조직을차가운 cell lysis buffer (cell signaling) 100 μl에넣고 homogenizer로균질화한후, 원심분리하여 (4, 10,000 g, 30분 ) 상층을준비한다. 균질화된대장조직에서용출된단백질을정량후, 30~50 μg의 whole lysate 단백질을 SDSpolyacrylamide gel에전기영동시킨후 PVDF paper에 electroblotting한다. 각각의항체들을포함하는 solution으로반응시킨뒤, 2차항체를포함한용액으로 immunoblotting 반응시키고 ECL로 detection한다. X-ray film에노출시켜 autoradiography 를하고, 각각의 band의상대적인농도는 Imaging Analyzer로정량화함으로써, 활성화정도를 Western blot를통해확인한다. 4. Prostaglandin E 2 의농도분석냉동된 colon 조직을차가운 cell lysis buffer 100 μl을넣고 homogenizer로균질화한후, 원심분리하여 (4, 10,000 g, 30 분 ) 상층을준비한다. 균질화된 colon 조직에서용출된단백질을정량후, PGE 2 의농도를 prostaglandin E 2 EIA kit (Assay Designs) 로분석한다. 5. Immunohistochemistry 파라핀으로포매된 colon 조직은박편절기를이용하여 4 - S 405 -

2 - 대한내과학회지 : 제 79 권부록 2 호 μm 두께의연속절편을작성하여 60 에서 20분동안처리하여파라핀을제거하고함수시킨다. 96 에서 5분동안 10 mm citrate buffer (ph 6.0) 로처리하여항원을복구시키고 20 분간식힌다. 상온에서 3% H 2O 2 가함유된물에 30분간처리하여내인성 peroxidases 를비활성화시키고 serum-free protein block (Dako, Carpenteria, CA, USA) 로 60분간 blocking시킨다. Monoclonal anti-15-pgdh antibody 함유한 1% BSA 로처리한후 EnVision+anti-mouse kit (Dako) 으로처리한다. Harris modified hematoxylin으로염색한다 PGDH knockout 마우스의 breeding Case Western Reserve University로부터 15-PGDH knockout 마우스를도입한다. 7. FVB mouse, 15-PGDH knockout 마우스에서 celecoxib 의반응성연구종양억제유전자로서의 15-PGDH 의역할을규명하기위해 15-PGDH knockout FVB 마우스에 AOM을이용한대장암모델을구축하여종양발생단계과정에서 prostaglandin pathway의활성화에미치는영향을알아본다. AOM 유발대장암모델 : AOM 단독투여로대장종양유발이가능한 FVB 마우스를이용하여, 8주내지 12주령의마우스에 6주간 AOM 10 mg/kg 를매주복강내주입하였고, 마지막 AOM 투여후 24주가경과한시점에서마우스를희생하여종양의개수, 크기를분석하고, 15-PGDH, PGE2의분석에필요한검체를채취하였다. 연구수행내용및결과 1. 대장암환자와용종환자에서 PGs 의대사조절기전연구대장암과선종의 15-PGDH 의유용성을확인하기위해대장암조직과정상조직, 용종환자에서용종절제술시행시용종및정상대장점막에서의 15-PGDH 의발현정도를 Real time PCR을이용해서측정하였다. 15-PGDH 의발현외에도관련유전자인 COX-2와 mpges-1 과그산물인 PGE2의생성정도를함께측정하였다. 총 20명의대장선종환자와 27명의대장암환자를대상으로대장조직에서 15-PGDH, COX-2, mpges-1, PGE2 를측정하였으며, 15-PGDH 및 COX-2의발현은 Real time PCR 로정량분석하였고, mpges-1 는 Western bolt를시행하였으며, PGE2 는 ELISA를이용해정량하였다. 정상조직에비해대장선종에서유의하게 15-PGDH 의발현이저하되어있었으나 (p=0.000), COX-2, PGE2 및 mpges-1 의발현은정상조직에비해대장선종에서유의한증가를보이지는않았다 (p=0.195, p=0.347, p=0.095) ( 그림 1). 또한, 정상조직에비해대장암조직에서는유의하게 15-PGDH 의발현이저하되고 mpges-1와 PGE2의발현이증가하였고 (p=0.000), COX-2 의발현은정상조직에비해대장암조직에서유의한증가를보이지는않았다 (p=0.209) ( 그림 2). 정상조직에비해대장암조직에서는 15-PGDH의감소는 90.9% 에서, COX-2의증가는 68.4%, PGE2 의증가는 59.1% 에서관찰되었고, 대장선종에서는 15-PGDH 는 75% 에서감소하였고, COX-2 및 PGE2는각각 50%, 45% 에서증가하였다. 이러한 Figure 1. 대장선종환자에서정상조직에대한선종조직의 15-PGDH, COX-2, mpges-1, PGE2 의상대발현도. - S 406 -

3 - 명승재. 대장암발생과정에서 Prostaglandin 의조절기전규명및암예방약제의반응성표지자로 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase 의역할 - Figure 2. 대장암환자에서정상조직에대한대장암조직의 15-PGDH, COX-2, mpges-1, PGE2 의상대발현도. A B C Figure 3. 대장암조직과선종조직에서의 15-PGDH발현의병리적분석. 결과를종합하면, 15-PGDH 는 COX-2, PGE2 및 mpges-1 와달리대장선종에서도발현의변화가빈번하게나타나며선종의진단또는재발의조기표지자로서의유용성에대해추가적으로연구를지속할만한가치가있다고할수있겠다. 2. 대장암환자와선종환자에서 15-PGDH 의발현의병리학적분석대장선종및대장암에서의조직에서의발현을눈으로관찰하기위해 15-PGDH의면역조직화학 (immunohistochemistry) 검사법을시행한결과, 대장암조직에서는 85.7% (21개중 18 개 ) 가염색이되지않고주변정상조직에서의발현이나타났으며, 80% (20개중 16개 ) 의대장선종에서발현이나타나지않고주변정상조직에발현이나타났다. 스코어는 0에서 3까지측정하여도표화하였다 ( 그림 3) PGDH knockout 마우스에서 celecoxib 의반응성연구대장암또는대장선종의화학예방과관련하여 COX-2의선택적저해제인 Celecoxib이가족성선종성용종증및산발성대장선종에서선종발생을예방하는효과가있음이알려져있으나, 상당수의환자에서는 celecoxib 의화학예방효과에내성을보이는데, 이러한내성을보일수있는기전은아직알려져있지않다. 한편, 15-PGDH 는대장암발생과관련된 prostaglandin의대사에관여함으로써종양억제자로작용함이알려져있다. 따라서주관연구자는 celocoxib에의한 COX-2 억제에따른 prostaglandin의생성저하외에도 15-PGDH 에의한 prostaglandin의대사정도가대장점막에서의 prostagladin 수준에중요한역할을하고, celecoxib의화학예방효과대한반응성에도영향을미칠것이라는가정하에 15-PGDH knockout FVB 마우스를이용한실험을수행하였다 ( 그림 4). - S 407 -

4 - 대한내과학회지 : 제 79 권부록 2 호 A B A Figure 4. Celecoxib resistance in 15-PGDH knockout mice. B 먼저, 15-PGDH +/+ FVB 마우스에서 AOM으로대장종양을유발한군과 AOM으로대장종양을유발하면서동시에 celecoxib 를투여한군을비교하였을때, 대장종양의개수는 celecoxib 비투여군에서 2.3±0.4개, celecoxib 투여군에서는 0.7±0.3개로 celecoxib 투여군에서유의하게적었으며 (p=0.003), 크기도각각 2.2±0.4 mm, 0.3±0.1 mm로 celecoxib 투여군에서유의하게작았다 (p=0.001). 이를통해 celecoxib 가 15-PGDH 발현이정상인 FVB 마우스에서는 AOM을이용한대장종양유발을예방하는효과가있음을확인할수있었다. 15-PGDH 의발현정도에따라 celecoxib 의대장종양발생예방효과가달라지는지확인하기위해 15-PGDH -/- FVB 마우스와 15-PGDH +/+ FVB 마우스에 AOM으로종양을유발하면서 celecoxib를투여하였을때, 15-PGDH -/- FVB 마우스에서대장종양이유의하게많이발생하였으며, 종양의크기도유의하게컸다. 또한 15-PGDH -/- FVB 마우스에대해 AOM으로종양을유발하면서 celecoxib 를투여한군과 celecoxib 를투여하지않은군을비교했을때에는종양의크기및개 수에유의한차이가없음을확인하였다. 따라서 celecoxib 즉, COX-2 억제를통한대장종양예방을위해서는 15-PGDH 에의한 prostaglandin 대사작용이함께수반되어야하며, 체내에서의 15-PGDH 의소실이 celecoxib 에대한내성을유발함을확인할수있었다. 15-PGDH 발현수준에따라 celcoxib 의화학예방효과가다르게나타나는기전을확인하기위해각각의실험조건에따른 FVB 마우스대장점막의 PGE2의수준을측정하였다. AOM으로대장종양유발후 PGE2를측정했을때, 15-PGDH +/+ FVB 마우스 (5.1 ng/mg protein±0.8) 에비해 15-PGDH -/- FVB 마우스 (9.1 ng/mg protein±1.5) 에서 PGE2가유의하게높았으며 (p=0.04), celecoxib를함께투여한경우에는 15-PGDH +/+ FVB 마우스에서는 PGE2가 1.6 ng/mg protein±0.4로현저히감소한반면, 15-PGDH -/- FVB 마우스에서는 PGE2가 4.7 ng/mg protein±0.8로상대적으로 PGE2의감소정도가경미하였다 (p=0.0002). - S 408 -

5 - 명승재. 대장암발생과정에서 Prostaglandin 의조절기전규명및암예방약제의반응성표지자로 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase 의역할 - 요약및결론 Prostaglandin 대사에서매우중요한역할을하는 15-PGDH 는종양억제유전자로작용을하며, 본연구결과를검토하면대장암진전에서매우초기에그발현이줄어드는것을확인할수있었다. 따라서향후대장암전구병변인대장선종의발생기전의연구와진단바이오마커로의개발에중요한역할을할수있는유전자로생각할수있다. 또한암예방약제로개발가능성이있는 celecoxib 의경우실제 15-PGDH 의발현유무에따라그반응성이달라서향후암예방약제치료반응을예측할수있는바이오마커로개발할수있는가능성을제시할수있었다. 향후위암, 췌장암등의다른암종에서의 15-PGDH 의역할에관한연구, 또한대장암의진단과치료에서바이오마커로개발하기위한임상연구등이이어져야할것으로생각된다. - S 409 -

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α α α α α α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를

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