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재룡 범
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1 J Korean Orthop Assoc 2006; 41: 골육종에서 Heparanase 의발현과임상적의의 김한수 김준혁 오주한 이미라 설소미 이상훈 목적 : 골육종에서 heparanase 의발현정도를살펴보고그임상적의의를살펴보고자하였다. 대상및방법 : 면역조직화학염색법을통해 51 개의골육종조직에서 heparanase 의발현정도를관찰하였으며, 임상적으로국소재발이나원격전이, 생존율등과비교하고통계적으로분석하였다. 결과 : 51 개의골육종조직중 37 예에서 heparanase 의과발현이관찰되었다. Heparanase 의발현과항암화학요법에대한반응, 원격전이간에는유의한연관성을보였다. 다변수분석에서 heparanase 의과발현이원격전이에대해독립적으로유의한예후인자로나타났다. 광범위절제를시행한 46 명에대해서는 heparanase 의발현과국소재발간에유의한상관관계를보였다. Heparanase 발현이없는군에서는 5 년생존율이 83.8%, 과발현을보이는군에서는 46.9% 로두군간차이는통계적으로유의했다. Cox regression model 을이용한다변수분석에서 heparanase 의발현은독립적인예후인자로나타났다. 결론 : 골육종에서 heparanase 의발현은국소재발이나원격전이에있어중요한역할을한다고여겨지며예후인자로서의미가있을것으로생각한다. 색인단어 : 골육종, Heparanase, 면역조직화학법, 국소재발, 원격전이, 예후인자 Expression and Clinical Significance of Heparanase in Osteosarcoma Purpose: This study examined the expression of heparanase in osteosarcomas and evaluated its prognostic value. Materials and Methods: The immunohistochemical expression of heparanase from 51 osteosarcoma tissues was examined, and the correlations between the heparanase expression level and the clinicopathological factors were evaluated. Results: Heparanase over-expression was observed in 37 tissue samples. There was a correlation between the heparanase expression level and a poor chemotherapeutic response, metastasis and poor survival rate. Multivariate analyses revealed that heparanase over-expression was a significant independent risk factor for a distant metastasis of an osteosarcoma. Among the 46 patients who underwent an adequate wide resection, there was a correlation between the heparanase expression level and recurrence. The 5-year survival rate was 83.8% for patients with heparanase negative tumors, and 46.9% for those with heparanase over-expression. Multivariate analysis using the Cox regression model revealed the heparanase expression level to be an independent prognostic indicator. Conclusion: These results indicate that heparanase expression might play an important role in local recurrence and metastasis, and might be a biological marker of the prognostic significance in osteosarcoma patients. Key Words: Osteosarcoma, Heparanase, Immunohistochemistry, Local recurrence, Metastasis, Prognosis 통신저자 : 오주한경기도성남시분당구구미동 300 번지분당서울대학교병원정형외과 TEL: FAX: ohjh1@snu.ac.kr * 본논문의요지는 2004 년도대한골관절종양학회추계학술대회에서발표되었음. * 본연구는 2004 년도서울대학교의과대학집중육성연구과제지원 ( ) 에의하여이루어진결과임. Address reprint requests to Joo Han Oh, M.D. Department of Orthopaedic Surgery, Seoul National University College of Medicine, Seoul National University Bundang Hospital, 300 Goomi-dong, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do , Korea Tel: , Fax: ohjh1@snu.ac.kr 43

2 44 세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 의생물학적기능에대한활발한연구가이루어지면서많은생물학적현상에서 heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) 가중요한역할을한다는사실이밝혀졌다 9,26). 이는기저막 (basement membrane) 의방어벽역할을하면서여러세포표면이나세포외기질에붙어있는분자들과상호작용을하기도하고 9,26,32), 세포내신호전달과정이나세포내탐식과정에도관여하는것으로알려져있다 4,14,15,29). 이러한여러과정을통해조직의치유나염증과정, 자가면역, 종양세포의성장이나원격전이, 신생혈관형성등정상또는병적인다양한과정에영향을미친다고알려져있다. 이처럼, 세포생리에있어 HSPG가다양하고도중요한역할을하기때문에, 이것이분해될경우조직의기능적상태가변화될수있으리라짐작할수있다. 실제로 HS의효소에의한분해과정은정상적인임신과정에서부터, 염증과정, 암의진행과정등에이르기까지매우다양한생물학적현상과연관되어있는것으로알려져있다 2,6,22,28). Höök 등이 1975년에쥐의간세포에대한관찰을통해 HS를분해시키는효소의활성도를보고한이래 12), Nakajima 등은 1984년에이효소가 endoglucuronidase라고밝히고 heparanase로명명하였다 20). 최근까지의연구에서 heparanase의구조는확실하게밝혀지지않았으나, 포유류세포에서는주된한종류의효소로만발현되는것으로생각되고있으며, 인간에서는혈소판이나태반등에서 50 kda의분자량으로추출되고있다 22). 인간의 heparanase는박테리아에서연구된 heparanase와달리, 가수분해기전 (hydrolase mechanism) 을통해 HS의배당결합 (glycosidic bond) 을자르는것으로알려져있다. 최근들어정상세포에비해여러암세포에서 heparanase의발현이증가되어있음이밝혀지면서 heparanase가암의진행과정에관여할것이라는추측을하게되었다. Heparanase mrna 나단백이인간의암세포에서높은농도로발현되는현상은대장암, 유방암, 난소에발생한선암, 전이성흑색종, 구강상피암, 간암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 그리고림프종등에서도발견되고있다 8,10,17,19,21-23,30,31,33). 이처럼많은종류의암세포에서높은농도로발현되는 heparanase의발현을억제함으로써항암치료에적용하려는연구가활발히진행되고 있다 21,23,31). 원발성골육종의치료결과는항암화학요법및영상기술의발전등으로크게호전되어 5년생존율은 65-80% 에이르렀지만, 최근 10여년동안은생존율이별로향상되지못하고있는실정이며, 이는여러치료방법에도불구하고많은환자에서전이가발생하기때문이다. 최근에골육종환자의생존율을향상시키기위한방법으로종양의진행이나전이에관련이있는물질을찾아내려는연구가많이시행되고있으나생존율감소와직접적으로연관되어있는원발성골육종의전이에대한연구실적은미미한실정이다. 따라서많은암세포에서암의악성도및전이, 병기등과관련이있다고알려진 heparanase 발현양상을골육종조직에서조사하여환자의생존에미치는영향을알아보고이를치료에적용하는것은골육종환자의생존율을향상시키는데매우의미있는연구일것으로생각된다. 본연구에서는골육종으로진단된환자의암세포에서 heparanase의발현정도를살펴보고임상적으로국소재발이나원격전이, 생존율과의상관관계를후향적으로분석함으로써골육종환자에서 heparanase의발현이예후인자로서의의미가있는지, 나아가치료에대한적용가능성이있는지를살펴보고자하였다. 대상및방법 1. 연구대상 1996년 3월부터 2002년 11월사이에본원에서원발성골육종으로진단, 치료받았던환자중에서수술전항암화학요법시행이전에개방적생검을통하여종양조직을얻어파라핀에포매하여보관할수있었던 51예를대상으로하였다. 수술당시의평균연령은 22세 (4-81 세 ) 였으며남자가 33명, 여자가 18명이었다. 골육종의발생부위는대퇴골원위부가 26예, 경골근위부가 9예, 대퇴골근위부가 6예, 상완골근위부가 3예, 골반골이 3 예, 대퇴골간부가 2예, 기타비골근위부와요골원위부가각각 1예였다. 모든환자들에대해수술이전에사지와흉부방사선사진, 골주사검사및병변부위의자기공명영상, 그리고조직생검을통하여병기설정을시행하였다. Enneking의분류에의한병기는 IB와 IIA가각각 1예, IIB가 45예였고, 처음진단당시에폐전이가있었던 III가 4예였다. 골육종의조직학적분류로는골모세

3 45 포성이 35예, 연골모세포성이 7예, 섬유모세포성이 3예, 혼합성이 3예였으며기타소세포성, 방골성, 모세혈관확장성이각각 1예였다. 방골성골육종으로진단된 1예를제외한전예에서수술전항암화학요법을시행하였으며항암화학요법에의한종양의괴사분율이 90% 이상인경우가 20예, 90% 미만인경우가 30예였다. 화학요법에사용된약제는고농도메톡스렉쎄이트와아드리아마이신, 시스플라틴으로전예에서동일하였다. 골육종의수술시절제연은골종양과절단부사이의거리를 5 cm을기본으로하는광범위절제연을기본으로수술시골종양은노출되지않은채로제거하였으나수술후판정된절제연의결과는변연부절제연 (marginal margin) 이 1예, 부적절한광범위절제술 (inadequate wide margin) 이 4예, 적절한광범위절제술 (adequate margin) 이상이 46예였다. 2. 연구방법 1) 조직배열법 (Tissue array) 을이용한파라핀포매블록의제작임상정보를모르는병리과전문의가골육종의조직슬라이드를검토하고, 괴사가되어종양세포가없는부위나종양세포가밀집되어있지않은구역은배제하고, 각종양의가장대표적인두부분을조직슬라이드와파라핀블록에표시한후, 직경 4 mm의중심성조직생검침 (core tissue biopsy needle) 을이용하여각각의공여파라핀블록에서조직을채취하여새로운수여파라핀블록에배열되도록하였다. 정상대조군은최종절제조직에포함된정상부분의조직을대상으로하였다. 2) 면역조직화학법 (Immunohistochemistry) 조직배열법을이용해서만든, 파라핀에포매되어있는골육종병리조직을 4μm 두께로자른다음표본을 poly-l-lysine-coated slide (DAKO slide) 에놓아염색중조직의이탈을방지하였다. 실험하루전에박절한슬라이드를건조한오븐 (dry oven) 에서약 56 C 에서 40 분간배양시킨후실온에서보관하였으며실험시작약 1시간전에 56 C에서 20분간배양시킨후사용하였다. 크실렌 (xylene) 용액으로 5분간 2번세척하여탈파라핀화 (deparaffinization) 하였고, 100% 알코올용액으로 5 분간 2번처리하여단계적으로재수화 (rehydration) 하였다. 이후조직절편을실온에서증류수로 2분간세척하여재수화가완전히이루어질수있게하였다. 포르말린고정후파라핀에포매된조직의염색예민도를높이기위한항원복원방법 (antigen retrieval technique) 을시행하였다. 즉, 포르말린고정으로조직내에감추어진항원을노출시키기위하여시트로산완충액 (citrate buffer) 을증류수를사용하여 20배로희석 (0.01 M citrate buffer, ph 6.0) 시킨후코플린병 (Coplin jar) 에넣고슬라이드를담근다음전자렌지 (microwave) 에서 90 C에서 100 C 사이로 10분간가열 ( 혹은 750 W에서 10분 ) 하였다. 코플린병을전자렌지에서꺼내조직을담근채로실온에서 10분간둔후 Tris buffer 로슬라이드를충분히씻어내었다. 내인성과산화효소 (peroxidase) 의저지를위해조직절편을 10분간 3% 과산화수소수와메탄올의혼합용액으로처리한후 PBS (Phosphate buffered saline) 로 5분씩 3번세척하였다. 비특이적인항원-항체결합을억제하기위해차단용액 (blocking solution, 10% non-immune serum) 으로 4 o C에서 1시간동안반응시켰다. 본연구에서는 Histostain -Plus Kits (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA, USA) 를사용하였다. Heparanase 에대한일차항체 (Santa-Cruz Biotechnology, Santa-Cruz, CA, USA) 를 1 100으로희석한후조직절편에반응시켜 4 C에서 overnight 시킨다음실온에서 PBS로 5분간 3번세척하였다. Biotin-conjugated 이차항체를실온에서 1시간반응시키고 PBS로 5분간 3번세척한뒤 1 1,000 ABC complex (Vector Lab) 로 30분간반응시켰다. 발색제는 DAB kit (Zymed Lab. Inc.) 를사용하였는데 10 mg DAB (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride) 를 15 ml PBS에녹였다. 사용하기바로전에 5μl의 30% H 2 O 2 를 DAB용액에넣은후주사기필터 (syringe filter) 로걸러분주하였다. 발색반응시간은 5분으로하였으며각각의슬라이드를현미경으로확인하여갈색으로염색되면꺼내 PBS용액에옮겼다. 조직절편을실온에서 PBS에 5분씩 3번세척한후 Hematoxylin (Sigma, St. Louis, MO, USA) 으로 3분간대조염색하였다. 염색이끝난슬라이드는수돗물로 2분간세척하고 75%, 80%, 95%, 100% 의에탄올로각각 1분씩탈수한후크실렌용액으로 5분씩 4회처리하고봉입을시행하였다.

46 3) 슬라이드의검경관찰면역조직화학법으로염색된슬라이드는임상정보를모르는병리과전문의에의해검사되었다. 조직배열슬라이드에있는직경 4 mm 의각조직을모두광학현미경으로판독하고, 세포질염색세포의백분율을측정하였다.

staining, Grade 0), 중간정도의발현 (moderate staining, Grade 1), 강한발현 (intense staining, Grade 2) 으로구분하고, 통계적편의성을위하여 Grade 1 이상을양성발현군으로판정하였다 (Fig. 1). 4) 통계학적분석 SPSS-statistical software (SPSS Inc.

생존자료에대한다변수회귀분석에는 Cox proportional hazards model l5) 을사용하였고, 원격전이에대한위험인자를평가하기위해다변수로지스틱회귀분석 16) 을사용하였다.

4 46 3) 슬라이드의검경관찰면역조직화학법으로염색된슬라이드는임상정보를모르는병리과전문의에의해검사되었다. 조직배열슬라이드에있는직경 4 mm 의각조직을모두광학현미경으로판독하고, 세포질염색세포의백분율을측정하였다. 즉, 전시야에서보이는세포들가운데세포질에면역염색이된세포들의백분율을기술하였는데, 염색정도가 10% 이하인경우, 11% 에서 49%, 그리고 50% 이상발현되는군등 3개군으로나누는반정량적인방법으로판독하였으며정상골조직에서의염색정도를음성조절 (negative control) 로하여각각발현없음 (absent staining, Grade 0), 중간정도의발현 (moderate staining, Grade 1), 강한발현 (intense staining, Grade 2) 으로구분하고, 통계적편의성을위하여 Grade 1 이상을양성발현군으로판정하였다 (Fig. 1). 4) 통계학적분석 SPSS-statistical software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) version 11.5를사용하였다. Heparanase 발현과여러임상적변수와의비교및유의성판정에는 χ 2 검정법을사용하였으며, 환자의생존율분석에는 Kaplan-Meier 방법을사용하였고군간생존율비교에는 log rank test를사용하였다. 생존자료에대한다변수회귀분석에는 Cox proportional hazards model l5) 을사용하였고, 원격전이에대한위험인자를평가하기위해다변수로지스틱회귀분석 16) 을사용하였다. 다변수분석시에는 Enneking 병기, 수술전화학요법에대한반응 (90% 기준 ), 국소재발, 절제연, heparanase 발현정도의다섯가지변수를대상으로단변수분석에서 p value 가 0.1보다작은변수들을포함시켰으며 p value 가 0.05보다작을때통계학적으로유의하다고판정하였다. A B C Fig. 1. Immunohistochemical staining of heparanase shows an example of grade 0 (A), grade 1 (B), grade 2 (C) staining, respectively.

5 47 결과 51명의골육종환자에대한평균추시기간은 36.5개월 (6-100개월) 이었다. 종양학적결과로서국소재발은 9예에서관찰되었는데적절한광범위절제술이상의절제연을가졌던 46명의환자에대해서국소재발은 6예 (13%) 에서발생하였다. 원격전이는 29명 (56.8%) 의환자에서발견되었으며전이부위로는폐가 27예, 척추와간이각각 1예로전예에서전이암에대한절제술을시행하였다. 종양학적결과로는지속적무병생존이 25예, 실질적무병생존이 9예, 사망이 17예로나타났다. 면역조직화학법으로분석한 heparanase의발현정도는강한발현이 16예, 중간정도의발현이 21예, 발현이없는경우가 14예로나타났다. 중간정도의발현이상을보이는양성발현군은 37예 (72.5%) 로나타났다. Heparanase의발현정도와여러임상적변수와의상관관계를조사하였을때, 조직학적분류나나이, 국소재발여부등은 heparanase의발현간에유의한연관성이없었다. 통계적으로유의한연관성을보인인자들로는, 항암화학요법에대한반응이 90% 이하인경우 (50.0% vs. 86.7%, p=0.005) 와원격전이 (54.5% vs. 82.8%, p=0.029) 가있었다. Ennecking 에의한병기에 Table 1. Correlation between heparanase expression and the clinicopathological factors Variable Cases Heparanase positive (%) p value Histologic type Osteoblastic (65.7%) Others (87.5%) Age years old (65.7%) 20 years old (87.5%) Response to chemotherapy % (86.7%) 90% (50%) Local recurrence Absent (69.0%) Present 9 8 (88.9%) Distant metastasis Absent (54.5%) Present (82.8%) Ennecking stage I 1 0 (0.0%) II (50.0%) III 4 4 (100.0%) 대해서는 stage I 에서 0%, stage II 에서 50%, stage III 에서 100% 로나타났으나, heparanase expression에대하여통계학적으로는유의한상관관계를보이지않았다 (p=0.089)(table 1). 원격전이의위험인자에대한단변수분석의결과 Ennecking 병기 (p=1.0), 국소재발 (p=0.515), 절제연 (p=0.295) 은제외되었고, 항암화학요법에대한반응 (p=0.002), heparanase의발현정도 (p=0.014) 가다변수회귀분석에포함되었으며, 다변수회귀분석결과 heparanase 발현과항암화학요법에의한괴사가 90% 이하인것이원격전이의유의한위험인자로나타났다 (Table 2). 적절한광범위절제연이상의절제술을시행한 46예의골육종세포를대상으로국소재발및생존율을조사해보았을때, heparanase의발현이없었던 14명중 0명 (0%) 에서, 발현이있었던 32명중 9명 (28.1%) 에서국소재발이있었으며 (Table 3), 두군간에는통계적으로유의한차이가있었다 (p=0.013). Heparanase의발현이없는환자군의 5년생존율은 91.1% 였으며, 발현이있는환자군에서는 70.9% (Fig. 2) 로발현이없는군의환자들이유의하게더오래사는것으로나타났다 (p=0.0116). 절제연에관계없이전체환자에대한비교에서도, heparanase 의발현이없는환자군의 5년생존율은 83.8% 이었으며, 발현이있는환자군에서는 46.9% (Fig. 3) 로두군간의차이는통계적으로유의하였다 (p ). Cox proportional hazards model을이용하여예후인 Table 2. Multivariate logistic regression analysis showing the risk factors for a distant metastasis Prognostic value Relative risk (95% confidence interval) p value Response to chemotherapy ( ) Heparanase expression ( ) Table 3. Recurrence rate according to heparanase expression in a patient who underwent an adequate wide resection Heparanase expression Cases No. of recurrence (%) p value Negative 14 0 (0) Positive 32 9 (28.1)

6 48 Fig. 2. Overall survival curves of the patients undergoing a curative resection shows that the 5-year survival rate was 91.1% for patients with heparanase-negative tumors, and 70.9% for those with heparanase-positive tumors. The difference between two groups was statistically significant (p=0.0116). Table 4. Multivariate analysis showing the independent predictors of the overall survival according to the Cox proportional hazards models Clinicopathological factors Relative risk (95% confidence interval) p value Response to chemotherapy ( ) Heparanase expression ( ) 자로서의다변수분석을하였을때항암화학요법에대한반응정도와 heparanase의발현정도가독립적인예후인자로나타났다 (Table 4). Fig. 3. Overall survival curves of patients with an osteosarcoma subdivided according to heparanase expression shows that the 5-year survival rate was 83.8% for patients with heparanasenegative tumors, and 46.9% for those with heparanase-positive tumors. Patients with heparanase-positive tumors had a significantly poorer prognosis than those with heparanase-negative tumors (p ). 고찰원발성골육종환자에서항암제만으로는더이상의생존율향상을기대하기어려운시점에서골육종치료의새로운타깃을찾는것은매우의미있는시도라고생각한다. 아직까지골육종에서생존율감소와직접적으로연관되어있는원격전이에대한연구는미미한실정이며, 신생혈관형성이나원격전이를억제할수있는약제를개발하기위한분자생물학적타깃도알려진바없다. 이런현실에서다른여러종류의고형암에서종양의침습이나원격전이능력등과연관성이밝혀지고있는 heparanase에대한연구는주목할만한데아직골육종환자의조직에서는이에대한어떠한연구도이루어진바없었다. 본연구의결과에따르면, 골육종환자에서 heparanase의 발현은수술적요인을제거하였을때국소재발과유의한관련이있었으며, 원격전이에대한위험인자로서의미가있었고, 생존율에대한독립적인예후인자로나타나는등골육종의진행을가속화하고환자의예후를악화시키는데관여하는것으로보인다. 골육종환자의예후인자로서여러저자들에의해항암화학요법에대한반응이가장중요한인자로보고되고있는데, 본연구에서도이는원격전이에대한위험인자로서, 생존율에대한독립적인예후인자로서유의한것으로나타났다. 이와더불어 heparanase 의발현과의관련성에있어서도항암화학요법에대한반응이좋지않은군에서유의하게높은발현을보인다는점또한주목할만한데, 이러한환자군에서는진단당시에 heparanase 의과발현을인지하게되면항암화학요법에의해치료가지연되는것보다광범위절제술등다른방법의치료를우선적으로고려하는것이나을수도있을것으로생각하나이에대해서는추가적인연구가필요할것으로보인다. 골육종의병기에관해서도병기가진행될수록 heparanase 의발현이양성을보이는비율이증가하는경향을보였지만통계적유의성은없었는데, 이는낮은병기에속하는환자의수가너무작아통계적검정력이떨어진것으로보인다. 이와같은결과는여러다른암에서밝혀지고있는그것과크게다르지않는데, El-Assal 등은간암세포에서

7 49 heparanase mrna의발현이종양의크기나침습여부와연관성이있음을보고하였으며 7), 유방암에서는 heparanase-1 의발현이림프선전이나종양의크기와상관관계를보였다고하였다 18). 또한 Koliopanos 등은증가된 heparanase mrna의발현이췌장암환자의불량한생존율과관계가있었다고보고하였고 17), Sato 등은대장암환자에서의과발현이나쁜예후인자로서유의한결과를보인다고보고하였다 24). 한편, Goldschmidt 등은분비된 heparanase의과발현을보이는림프종세포에서세포내과발현을보이는경우보다기저막에대한침습이높다고보고하여 heparanase 의세포표면에서의발현이나분비정도가신생혈관형성이나원격전이에대한주된결정인자라고주장하였다 11). 그러나 Inoue 등은대장암에서 heparanse 의발현정도가갖는임상적, 병리학적연관성은낮다고주장하기도하였다 13). 이처럼많은종류의암조직에서 heparanase가과발현된현상이보고되면서암치료의새로운분자생물학적타깃으로제시되고있다. Uno 등은 antisense cdna 를이용하여 heparanase 유전자의발현을억제함으로써암세포가늑막으로파급되는것을방지하였다고보고한바있으며 27), Shteper 등은 heparanase promoter 부위의분석을통해이부위의 CpG island 에대한메틸화정도가적을수록 heparanase 의활성이증가한다고보고하면서, heparanase유전자발현의조절기전에대한치료적용가능성을제시하였다 25). 최근들어 heparanase의활성을억제하는여러구조물들이개발되고있으나면역반응이나조직의치유과정, 항응고기전, HS대사에서와같은 heparanase 의정상적인기능까지억제할가능성이있는것은물론, heparanase 의활동을직접적으로억제하는소분자량구조물들의개발도이루어지지않은실정이다. Heparanase 의발현에대한조절기전은정확히밝혀지지않았으나전사단계 (transcriptional level) 에서이루어지는것으로생각되고있는데, 이로인해 heparanase 단백의발현은 heparanase mrna의발현양상을가깝게따르는경향이있다고보고되었으며 1,17), 본연구에서는면역조직화학염색을통해골육종세포내의 heparanase 단백의발현만을관찰하고이로서 heparanase의발현양상을분석하였다. 이러한방법을통해 heparanase mrna의발현양상을간접적으로측정할 수있으나염색성의판정에있어다소주관적일수있다는점과정량적인판독이어렵다는단점이있겠는데, 이는숙련된판독자에대해눈가림법을시행하고, 반복적이고무작위적인판독을통해어느정도극복할수있다고생각한다. 이러한단점을극복한다면, 면역조직화학염색을통해골육종환자에서 heparanase의발현양상을조사하여이들의임상적예후와의연관성을분석하는것은골육종의예후를예측하고치료계획을수립하는데도움을줄수있는방법이될수있으리라생각한다. 종양의진행또는전이능력과관련하여 heparanase 의작용기전은, 조직의방어벽을파괴하여종양세포가기질이나혈관벽을통해침습할수있게하는것으로짐작하고있다. HSPG 가혈관의중요한구성성분으로서큰혈관에서는내막 (intima) 이나내중막 (inner media) 에대부분분포되어있으며모세혈관에서는내피하기저막 (subendothelial basement membrane) 에주로분포되어혈관내피세포의성장과이동을돕고모세혈관벽의구조를안정화한다고알려져있는점이이러한가설을뒷받침한다. 그러므로 HS의분해는혈관생성을위한혈관내피세포와종양세포들로하여금혈관외유출을가속화하게할것임을짐작할수있다. 이러한작용은분해효소의활성이나, 혈관내피세포또는내피하기질에대한종양세포의부착능력을향상시킴으로써가능할것이다. 이에대해 Zester 등은세포부착수용체인 β1-integrin 의활성이 heparanase의발현과연관되어있다고보고하기도하였다 34). 최근들어 metalloproteinase (MMP) 나 heparanase 등의기질분해효소는세포외기질의분해를통한암세포의침습을조장할뿐만아니라성장인자의활동성이나생체이용도를변화시켜혈관생성을유도하는혈관생성스위치 (angiogenic switch) 로서의역할도하는것으로밝혀지고있다 3,8). Elkin 등은면역조직화학염색을통해인간의간및유방암에서 heparanase 단백의발현이종양내의성숙한혈관에서가아닌새로이생성된혈관의내피조직에서발현됨을보고한바있어, 이는 heparanase가혈관생성과정에있어혈관내피세포로하여금기저막이나세포외기질의방어벽을뚫고가로지르게하는데중요한역할을함을시사한다 8). 또한이들의연구에서신생혈관생성과정중에 heparanase 유전자가과조절 (up-regulation) 되어있음이증명되기도하였다. 악성종양에의한신생혈관생성

8 50 과정은단클론성항 CD34항체를이용한면역조직화학염색기법으로측정할수있는데, 향후이기법을이용하여 heparanase의발현정도와미세혈관농도의연관성을분석해봄으로써, 골육종세포에서신생혈관생성과정에대한 heparanase 의역할을가늠해볼수있을것으로생각한다. 전술한바와같이, 아직까지 heparanase를활성화하거나이를만드는단백효소등의조절기전이나작용기전에대해명백히밝혀진바없으며 heparanase 자체의구조에대한연구도시작에불과하다. 본연구를바탕으로향후 heparanase에대한항체나 heparanase가작용타깃으로하는부위에대한조절, heparanase의발현을줄이는방법등에대한지속적인연구를통해궁극적으로골육종의치료에일조할수있을것으로생각한다. 결론골육종조직에서의 heparanase 발현정도를검사하고골육종환자에서의임상적결과와비교분석한결과다음과같은결론을얻을수있었다. 골육종세포에서 heparanase의발현은원격전이에있어중요한역할을하며, 암의진행이나나쁜예후와연관성이있는것으로보인다. 골육종환자에서면역조직화학염색법을통한 heparanase의발현을분석하는것은예후를예측하고치료방법을결정하는데도움이되는방법이라고생각한다. 참고문헌

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Jkbcs016(92-97).hwp Expression of bcl-2 and Apoptosis and Its Relationship to Clinicopathological Prognostic Factors in Breast Cancer - A Study with Long Term Follow-up correlated with the survival rate.(journal of Korean