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1 생체시료 분석법 밸리데이션 가이드라인 행 정 간 행 물 번 호 생체시료 분석법 밸리데이션 가이드라인 Guideline on Bioanalytical Method Validation

2 이가이드라인은생체시료분석법밸리데이션에대해가장적절한방법을제시한것입니다. 이것은현재까지의경험과과학적사실에근거한것이므로새로운과학적근거가있을경우언제든지개정될수있으며이러한사항이있을경우식품의약품안전처에의견을제시하여주시기바랍니다. 또한, 이가이드라인은법적인책임을가지지않으며단지생체시료분석법밸리데이션에대한식품의약품안전처의최근입장을기술하고있는것으로서특별하게규정하거나법적으로요구하고있는사항은아니며단지권고사항입니다. 이가이드라인에서제시하는내용은식품의약품안전처가제안하거나권고하는것을의미하며, 반드시요구하는것은아닙니다. 이가이드라인에대하여의견이있는경우아래로문의하시기바랍니다. 식품의약품안전처의약품안전국의약품정책과식품의약품안전평가원의약품심사부약효동등성과 Tel : Fax : Tel : Fax :

3 개정이력서 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 제 개정번호승인일자주요내용 생체시료분석법밸리데이션가이드라인제정 B 생체시료분석법밸리데이션해설서제정 B 검체검증분석가이드라인제정 B 생체시료분석법밸리데이션가이드라인개정 * 검체검증분석가이드라인통합

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5 머리말 생물학적동등성시험, 생체이용률시험등인체를대상으로한임상시험의신뢰성을확보하기위해서생체시료분석법이타당하게설정되었는지확인하는밸리데이션 (validation) 절차가필수적입니다. 지난 2003년국립독성연구원 ( 현, 식품의약품안전평가원 ) 에서는미국 FDA의가이드라인 (2001.5) 등국외정보를바탕으로생체시료분석법밸리데이션가이드라인을제정하였고, 2010년에 생체시료분석법밸리데이션해설서 를마련하여상세한설명을수록하였습니다. 그러나, 최근유럽 EMA(2011.7) 에서생체시료분석법에대한가이드라인을새롭게발표하는한편, 일본 MHLW(2013.4) 및미국 FDA (2013.9) 에서도잇달아가이드라인개정안을제시함에따라, 우리처에서도종전가이드라인을국제조화할필요가있습니다. 이에그동안별도가이드라인으로운영하던 검체검증분석가이드라인 의내용을통합하고학계, 제약업계및생동성시험기관등전문가의견을수렴하여 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 을개정하게되었습니다. 이가이드라인은생체시료분석법밸리데이션에필요한항목을정의하고, 국제조화된각각의판정기준및시험방법을제시하고있습니다. 앞으로이가이드라인이생체시료분석을수행하는시험기관에서실질적으로도움이되기를기대합니다 식품의약품안전처의약품안전국장유무영

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7 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 목 차 1. 서론 목적 배경 1 2. 표준품 2 3. 분석법밸리데이션 전체밸리데이션 선택성 생체시료효과 캐리오버 최저정량한계 검량선 정확성 정밀성 회수율 희석의타당성 안정성 표준원액및표준용액안정성 냉 해동안정성 단기안정성 장기안정성 전처리시료의안정성 부분밸리데이션 교차밸리데이션 11

8 식품의약품안전처 4. 시험시료분석 일반사항 시스템적합성 검량선 품질관리시료 주의사항 재분석 재주입 재적분 검체검증분석 검체검증분석실시 검체검증분석유의사항 문서 밸리데이션보고서 시료분석보고서 기타정보 용어해설 참고문헌 30 부록 1. 부분밸리데이션항목예시 32 부록 2. 검체검증분석방법 40

9 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 1. 서론 1.1. 목적이가이드라인은신약, 자료제출의약품및제네릭의약품의허가신청을위해인체를대상으로한임상약리시험, 생체이용률시험, 생물학적동등성시험에서사용된생체시료분석법의밸리데이션절차및방법에관한정보를제공한다. 이가이드라인은일반적으로전혈, 혈청, 혈장또는뇨와같은생체시료중에분석하고자하는약물또는그대사체 ( 이하, 분석물질 이라한다 ) 를정량할때기체크로마토그래피 (gas chromatography, GC), 액체크로마토그래피 (liquid chromatography, LC), GC 또는 LC와질량분석기 (mass spectrometer, MS) 의조합 (LC-MS, LC-MS-MS, GC-MS, GC-MS-MS 등 ) 등분석기기를이용하여생체시료를분석하는과정에적용된다. 이가이드라인은생체시료분석법밸리데이션을위한일반적인권장사항이며, 이권장사항은사용되는분석법에따라변경될수있다 배경분석물질을정량하기위해선택적이고감도가우수한분석법을확립하는것은생물약제학적그리고임상약리학적연구를성공적으로수행하는데있어중요하다. 생체시료분석법밸리데이션은생체시료중의분석물질을정량분석하는데에사용되는방법이신뢰성과재현성이있다는것을증명하는모든과정을포함하며, 이러한밸리데이션을위한기본적인파라미터로는선택성, 정확성, 정밀성, 안정성이포함된다. 분석법밸리데이션은특정실험실에서, 특정분석법이적합하고신뢰할만하다는것을문서화하는과정을포함하여야한다. 또한, 이미밸리데이션된분석법을변경하는경우추가적인밸리데이션이필요할수있다. 예를들어공인된분석법은실제시험을수행할때실험실의특성에적합하도록종종변경되기도하고이미개발된분석법이라하더라도약물을개발하는과정중에수차례변경되기도한다. 이때변경된분석법이적합하다는것을보증하기위하여밸리데이션이추가로요구될수있다. 1

10 식품의약품안전처 2. 표준품 분석물질은생체시료 (biological matrix) 에표준품으로조제한검량선용시료 (calibration standard) 와품질관리시료 (quality control sample, QC sample) 를이용하여분석하고, 적절한내부표준물질 (internal standard, IS) 을이용할수도있다. 생체시료에첨가되는표준품의순도는시험결과에영향을미치므로, 성분이확인되고순도가인증된표준품을사용하여야한다. 표준품은가능한한분석물질과동일해야하고동일하지않은경우, 순도가확인된화합물 ( 산 염기가제거된형태, 염또는에스테르형태 ) 을사용하여야한다. 일반적으로공인된표준품 [ 예 : 미국약전 (USP), 유럽약전 (EP), WHO 표준품등 ], 품질이확보된시판표준품, 분석실또는다른비영리단체에의해합성된순도가입증된표준품이사용된다. 각표준품및내부표준물질은제조원, 제조번호, 사용 ( 유효 ) 기한, 가능한경우시험성적서, 그리고 ( 또는 ) 입증된확인시험및순도시험자료가구비되어야한다. 이때, 분석에영향이없는경우내부표준물질의시험성적서는요구되지않는다. 만약사용하려는표준품또는내부표준물질의사용 ( 유효 ) 기한이끝난경우라면, 동일제조번호로만든표준원액의순도는다시확립되어야한다. 질량분석기를이용하여분석하는경우가능한한안정된동위원소로표지된내부표준물질을사용하는것이바람직하다. 표지된표준품은동위원소순도가매우높고동위원소교환반응이일어나지않아야한다. 아울러, 표지되지않은분석물질이있는지확인하고, 분석법밸리데이션을실시하는동안분석법에잠재적인영향을미치는지에대해평가하여야한다. 2

11 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 3. 분석법밸리데이션 3.1. 전체밸리데이션전체밸리데이션 (full validation) 은새로운분석법을개발할때수행된다. 생체시료분석법의밸리데이션은시험시료 (study sample) 와동일한생체시료를가지고수행하여야하고항응고제를사용하는경우시험시료와동일한종류의항응고제를사용하여야한다. 대체생체시료 ( 예 : 합성하여제조한뇌척수액등 ) 를사용하고자할경우에는그타당성을입증하여야한다. 일반적으로전체밸리데이션에서입증하여야할항목들은선택성, 생체시료효과, 캐리오버, 최저정량한계, 검량선, 정확성, 정밀성, 회수율, 희석의타당성및안정성이다 선택성선택성 (selectivity) 이란분석물질과내부표준물질을시료내에존재하는다른물질과분리하여정량하는분석능력을말한다. 선택성은최소 6 가지이상의서로다른기원의적절한생체시료 ( 예 : 여섯사람으로부터채취한생체시료 ) 로수행하여야한다. 다만, 확보가어려운생체시료의경우 6 가지보다적은수의생체시료를사용할수있다. 이때, 간섭물질의반응은일반적으로분석물질의최저정량한계의 20 % 이하, 내부표준물질의 5 % 이하여야한다. 생체시료내에존재가능한간섭물질로는내인성물질, 대사체, 시료전처리과정에서기인한분해산물등이있으며, 실제연구시에는병용투여약물과다른외인성물질등도존재할수있다. 만약해당분석법이한가지이상의분석물질을정량하고자하는경우에는각각의분석물질이간섭물질의영향을받지않음을입증하여야한다. 또한, 일련의분석과정에서대사체가모체약물로역변환될가능성이있을경우이를평가하여야한다. 즉, 산성대사체의에스테르화, 불안정한 N-oxide 또는 glucuronide 포합체, 락톤 (lactone) 고리구조와같이역변환현상에대한확인이필요한경우에는역변환정도를확립하고, 시험결과에미치는영향에대해서도평 3

12 식품의약품안전처 가하여야한다. 초기신약개발단계와같이아직약물대사가입증되지않은경우이러한역변환가능성에대한평가가가능하지않을수있다. 하지만약물개발과정중모체약물의대사에대한추가적인정보를얻는다면, 역변환가능성을고려하고적절한부분밸리데이션을할수있다. 대사체를구하기어려운경우검체검증분석을통해서역변환을확인할수있지만, 이경우전처리과정에서일어나는역변환가능성을배제하지않는것이바람직하다 생체시료효과생체시료효과 (matrix effect) 란생체시료내의물질이직접또는간접적으로분석물질또는내부표준물질의반응에미치는영향을말한다. 생체시료효과상수 (matrix factor, MF) 를계산하여평가할수있으며이생체시료효과상수는생체시료의유무에따른분석결과의비율로계산할수있다. 생체시료효과는품질관리시료를분석하여평가한다. 6 개의서로다른기원의생체시료를가지고낮은농도 ( 최저정량한계의최대 3 배 ) 와높은농도 ( 최고정량한계부근 ) 의품질관리시료를측정하고이때구한농도값의변동계수 (coefficient of variation, CV) 는 15 % 이내여야한다. 생체시료효과는분석물질의생체시료효과상수를내부표준물질의생체시료효과상수로나누어구한내부표준물질표준화생체시료효과상수 (IS normalized MF) 로도평가할수있다. 이때, 평가기준은 6 개의생체시료에서구한내부표준물질표준화생체시료효과상수의변동계수가 15 % 이내여야한다. 구하기힘든생체시료의경우 6 개보다적은수의생체시료를사용할수있고생체시료효과는대부분시료처리방법, 분석조건변경등을통해감소시킬수있다. 주사제의경우에폴리에틸렌글리콜, 폴리소르베이트와같이생체시료효과가있다고알려진첨가제에대해이러한첨가제가포함되어있는생체시료와포함되어있지않은생체시료에서의생체시료효과시험을수행하는것이바람직하다. 첨가제가생체내에서대사되지않거나변형되지않음을입증하지못하는경우, 생체시료효과를평가하기위해사용되는생체시료는첨가제를사 4

13 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 람이나동물에게투여하여얻어야한다. 첨가제의생체시료효과는생체시료효과상수로서평가할수있고, 고농도의시험시료를첨가제가포함되지않은생체시료로희석하여평가할수있다. 필요한경우생체시료효과는일반생체시료뿐만아니라용혈 (haemolysed) 된혈장이나고지질 (hyperlipidaemic) 혈장과같은생체시료에서도시험하는것이바람직하다. 만약특수군 ( 예 : 신장애또는간장애환자군등 ) 을대상으로시험을진행할때에는생체시료효과역시이러한특수군에서얻은생체시료를사용하는것이바람직하다 캐리오버캐리오버 (carry-over) 란시료를연속하여측정할때분석기기내에서바로전에주입된시료의잔류된분석물질또는내부표준물질이다음시료주입시에나타나는반응을말한다. 캐리오버시험은고농도의시료나최고정량한계농도의검량선용표준시료주입후공시료 (blank sample) 를주입하여수행한다. 이때공시료에서분석물질은최저정량한계의 20 % 이하, 내부표준물질은 5 % 이하여야한다. 밸리데이션이나시험시료분석시캐리오버를피할수없을때에는, 높은농도로예상되는시료주입후에공시료를주입하는방법등을고려하여야한다 최저정량한계최저정량한계 (lower limit of quantification, LLOQ) 란정확성과정밀성이입증된범위에서분석물질을정량할수있는가장낮은농도즉, 감도 (sensitivity) 를말하며, 일반적으로검량선의가장낮은농도를의미한다. 최저정량한계에서분석물질의신호 (signal) 는공시료와비교할때최소 5 배이상이어야한다. 최저정량한계는예측되는농도와연구목적에맞게타당하게설정하여야한다. 예를들어생물학적동등성시험의경우에는최저정량한계를최고혈중농도 (C max ) 의 5 % 이하로설정하여야한다. 5

14 식품의약품안전처 검량선검량선 (calibration curve) 이란이미알고있는분석물질의농도와기기의반응과의관계를말한다. 검량선용표준시료는시험시료와동일한생체시료를사용하여생체시료에이미알고있는농도의분석물질을첨가하여조제하며, 검량선은배치별로작성하여야한다. 검량선용표준시료의수는측정값의예상범위와분석물질의농도-반응상관관계에따라결정되어야한다. 검량선은일반적으로공시료, 영시료 (zero sample), 그리고최저정량한계를포함한최소 6 가지이상농도의검량선용표준시료로구성된다. 검량선을그릴때에는공시료와영시료를제외하여농도-반응관계를적절히기술하는가장간단한모델이사용되어야한다. 검량선으로부터역계산한검량선용표준시료의정확성은최저정량한계에서이론값의 20 % 이내여야하며, 최저정량한계를제외하고는이론값의 15 % 이내여야한다. 이때최소 75 % 이상의검량선용표준시료가적합하여야한다. 반복분석을하는경우에는검량선의농도별로최소 50 % 이상의검량선용표준시료가각평가기준 (±15 % 이내, 최저정량한계는 ±20 % 이내 ) 을만족하여야한다. 검량선용표준시료가기준을만족하지못하는경우에는이를제외하고검량선을재작성하여야한다. 만약최저정량한계나최고정량한계검량선용표준시료의반복분석결과가모두기준을만족하지못하는경우에는해당배치는제외시켜야하고, 이러한현상에대한원인고찰이필요하며필요한경우에는분석법을변경할수도있다. 하지만, 밸리데이션배치에서연속적으로위평가기준을만족하지못한다면분석법을변경해야한다 정확성정확성 (accuracy) 이란분석물질의이론값과분석법에의해얻어진측정값의근접한정도를말한다. 정확성은품질관리시료로서평가할수있으며품질관리시료는검량선용표준시료와독립적인표준원액에서준비하는것이바람직하다. 품질관리시료에대하여시험내 (within-run) 및시험간 (between-run) 정확성을평가하여야한다. 한배치에서의분석경향을평가하기위해서적어도 6

15 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 한번은실제시료분석배치사이즈와동등한수이상의품질관리시료에대하 여정확성및정밀성을확인하는것이바람직하다. 시험내정확성시험내정확성은최저정량한계, 저농도 ( 최저정량한계의 3 배정도의농도 ), 중간농도 ( 검량선의중간정도의농도 ) 및고농도 ( 검량선의최고정량한계부근으로서적어도최고정량한계의 75 % 이상의농도 ) 를포함하여검량선범위내최소 4 가지농도에대해최소 5 번반복분석하여평가할수있다. 이때, 평균값은최저정량한계에서이론값의 20 % 이내여야하며, 최저정량한계를제외하고는이론값의 15 % 이내여야한다. 시험간정확성시험간정확성은최저정량한계, 저농도, 중간농도및고농도품질관리시료를최소서로다른 2 일이상에걸쳐최소 3 번반복분석하여평가할수있다. 이때, 평균값은최저정량한계에서이론값의 20 % 이내여야하고, 최저정량한계를제외하고는이론값의 15 % 이내여야한다 정밀성정밀성 (precision) 이란하나의시료로부터여러번채취하여얻은시료를정해진조건에따라측정하였을때각각의측정값들사이의근접성을말한다. 정밀성은최저정량한계, 저농도, 중간농도및고농도품질관리시료에대하여시험내및시험간정밀성을평가하며, 일반적으로정확성을입증하기위한시험결과를사용하여평가할수있다. 시험내정밀성시험내정밀성은최저정량한계, 저농도, 중간농도, 고농도품질관리시료를검량선범위내최소 4 가지농도에대해최소 5 번반복분석하여평가할수있다. 이때, 변동계수는최저정량한계에서 20 % 이내여야하고, 최저정량한계를제외하고는 15 % 이내여야한다. 7

16 식품의약품안전처 시험간정밀성시험간정밀성은최저정량한계, 저농도, 중간농도, 고농도품질관리시료를최소서로다른 2 일이상에걸쳐최소 3 번반복분석하여평가할수있다. 이때, 변동계수는최저정량한계에서 20 % 이내여야하고, 최저정량한계를제외하고는 15 % 이내여야한다 회수율회수율 (recovery) 이란생체시료로부터분석과정을통해분석물질이회수되는정도를말한다. 회수율은생체시료를추출한후분석물질을첨가한시료와생체시료에분석물질을첨가한다음추출한시료의반응을비교하여측정하며, 세가지농도 ( 저농도, 중간농도, 고농도 ) 에서최소 3 번반복분석하여평가할수있다. 이때, 회수율은 100 % 가될필요는없으나일관성과재현성이있어야한다 희석의타당성희석의타당성 (dilution integrity) 이란시료의농도가최고정량한계농도를초과하거나분석에사용되는시료의양이충분하지못한경우에동일한생체시료를가하여희석하여도분석에는영향이없음을입증하는것을말한다. 최고정량한계농도를초과하는시료를생체시료로희석하여각희석배수마다 5 번이상반복분석하여평가하며희석한시료의농도는검량선범위이내여야한다. 이때, 정확성과정밀성은 15 % 이내여야하며, 시험시료의희석배수는희석의타당성이입증된희석배수범위이내여야한다. 희석의타당성에대한평가는부분밸리데이션에서확인할수있다. 다른생체시료로희석을하고자하는경우에는, 분석물질의정확성과정밀성에영향이없음을입증하여야한다. 8

17 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 안정성안정성 (stability) 이란특정조건과시간동안에서생체시료내분석물질이안정하다는것을말한다. 안정성은생체시료의준비, 분석의모든단계및저장조건이분석물질의농도에영향을주지않음을확신할수있도록평가되어야한다. 안정성은실제시험에사용한생체시료와유사한조건 ( 생체시료기원, 항응고제, 용기재질, 보관및분석조건등 ) 에서실제시료분석기간이상의기간동안수행되어야하며문헌자료만으로는충분치않다. 일반적으로다음의안정성시험을평가하여야하고, 각각의저장조건을만족하는저농도와고농도의시료를최소 3번반복분석하여야한다. 이때각농도별평균값은이론값의 15% 이내이여야한다. 분석물질과내부표준물질의표준원액과표준용액의안정성 생체시료내분석물질의냉 해동안정성 ( 냉동조건으로부터실온또는전처리온도조건으로해동 ) 생체시료내분석물질의실온또는전처리온도에서의단기안정성 생체시료내분석물질의냉동보관조건에서의장기안정성 전처리시료의안정성 - 실온또는시험기간동안보관조건에서의안정성 - 자동주입기등장비내에서의안정성분석물질이여러개인경우, 해당분석물질의안정성은모든분석물질을포함한생체시료에서평가하는것이바람직하다 표준원액및표준용액의안정성표준원액및표준용액의안정성 (stock and working solution stability) 은각용액을분석물질의반응정도가검량선범위이내로측정되도록희석하여분석한다. 만약표준원액이해당기간동안냉장또는냉동보관된다면이에대한안정성평가도이루어져야한다. 표준용액의안정성은각농도별로확인할필요는없으며, 일반적으로저농도와고농도에서평가하도록한다. 9

18 식품의약품안전처 냉 해동안정성냉 해동안정성 (freeze and thaw stability) 시험에서냉 해동반복횟수는실제시료분석시냉 해동횟수와같거나더많아야한다. 품질관리시료를설정된저장온도에서냉동하고실온또는전처리온도에서해동하며, 완전히녹은다음다시같은조건으로최소 12 시간동안동결한다 단기안정성단기안정성 (short term stability) 은품질관리시료를실온에서해동하고방치한다음분석하여평가한다. 실온에서방치하는시간은해당연구과정에서시료가실온에서방치되는시간을고려하여결정한다. 여기서실온은일반적인실험실온도를의미한다 장기안정성장기안정성 (long term stability) 시험에서저장기간은초회시료채취일로부터시료분석종료일까지의기간보다길어야하고, 장기안정성시험용품질관리시료는시험시료와동일조건하에서저장하여야하며, 시료분석보고서가발행되기전에평가되어야한다 전처리시료의안정성전처리시료의안정성 (processed sample stability) 은분석기기의주입기내에머물러있는시간을포함하여평가한다. 분석물질과내부표준물질의안정성은실제시료분석배치의예상소요시간을고려하여평가한다 부분밸리데이션 부분밸리데이션 (partial validation) 은이미밸리데이션된생체시료분석법에 서변경이있는경우에실시한다. 부분밸리데이션은시험내정확성및정밀 10

19 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 성시험만필요한경우에서부터전체밸리데이션이필요한경우까지를포함 한다. 일반적으로다음과같은경우부분밸리데이션을실시하여야한다. 실험실또는시험자의변경 분석법의변경 ( 예 : 검출기변경등 ) 생체시료채취시항응고제의변경 ( 예 : 헤파린에서 EDTA로변경등 ) 생체시료의변경 ( 예 : 사람혈장에서사람뇨로변경등 ) 시료전처리과정의변경 보관조건의변경 농도범위의변경 ( 예 : 검량선용표준시료의농도변경등 ) 기기또는소프트웨어제어장치의변경 시료용량이제한된경우 ( 예 : 소아관련임상연구등 ) 희귀한생체시료인경우 타약물의공존시분석물질의선택성을증명해야하는경우 분석법이변경되는경우변경정도를고려하여분석법밸리데이션수준을결정하여야한다. 변경정도에따라요구되는분석법밸리데이션수준은부록 1을참고할수있다. 모든변경은기록되어야하고, 재밸리데이션 (revalidation) 또는부분밸리데이션범위의타당성을검토하여야한다. 생체시료분석법밸리데이션을바탕으로부분밸리데이션을실시하는경우보고서에전체밸리데이션과부분밸리데이션의결과를모두기재하는것이바람직하다 교차밸리데이션교차밸리데이션 (cross validation) 이란두개이상의분석법에의해서얻어진밸리데이션평가항목을비교하는것을말한다. 시험내또는시험간에서로다른분석법으로시험결과를얻거나서로다른기관 ( 또는실험실 ) 간에동일한분석법이적용되어시험결과를얻을경우, 해당시험결과를비교해야하며이때해당시험에사용된분석법에대한교차밸리데이션이수행되어야한다. 11

20 식품의약품안전처 교차밸리데이션은시료분석이전에수행하는것이바람직하고교차밸리데이션을위해동일한품질관리시료나동일한시험시료를이용하여분석하여야한다. 품질관리시료를사용하는경우, 서로다른분석법에의해얻어진평균정확성은각분석법별로 15 % 이내여야하고만약 15 % 이상을적용하고자하는경우에는그타당성을입증하여야한다. 시험시료를사용하는경우, 얻어진두값의차이가평균값의 20 % 이내여야하며최소 67 % 이상의시료가만족해야한다. 12

21 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 4. 시험시료분석 4.1. 일반사항시험시료는전체분석법밸리데이션이확립된후분석을수행하고시료의안정성이확보된기간내에완료한다. 일반적으로시험시료의분석결과가밸리데이션된결과내에서의변동범위를가진다면두번이상분석하지않고한번만측정하여분석할수있다. 이는정밀성과정확성의변동범위가허용한계이내인경우에적용된다. 불안정한분석물질로인해정밀성과정확성을확보하기어려운경우, 보다정확한측정값을얻기위해 2 회, 또는 3 회이상의반복분석을수행할수도있다. 하나의분석은공시료, 영시료, 최소 6 가지농도의검량선용표준시료, 최소 3 가지농도의품질관리시료, 그리고한배치로서분석될모든전처리된시험시료로구성된다. 한분석배치내표준시료와품질관리시료의분석순서는시험하는동안의분석동향을파악할수있도록하여야한다. 시험시료분석시분석배치의적합기준은시험계획서또는표준작업지침서에미리정하도록하여야한다. 전체분석이여러배치로구성될경우적합기준은전체분석과개별배치분석모두에적용되어야하며, 비록하나의배치가부적합할지라도전체분석이적합할수있다 시스템적합성시료분석에사용되는분석기기는적절하게유지및관리되어야하며, 시스템적합성 (system suitability) 을평가하기위한표준작업지침서가있어야한다. 분석기기의분석물질과내부표준물질에대한반응은일정하고재현성이있어야한다. 따라서밸리데이션시료또는시험시료를분석하기전에시스템의적합성을확인하는것이바람직하며, 시스템적합성확인을위한시료는분석시료, 검량선용표준시료, 품질관리시료와별도로전처리하여준비하여야한다. 13

22 식품의약품안전처 검량선검량선은각각의분석배치내에서각분석물질별로작성하여시험시료내분석물질의농도를계산하는데사용된다. 검량선에는최저정량한계의검량선용표준시료뿐만아니라, 시험시료의예상되는농도를포함하여작성되어야한다. 시험시료의농도는검량선의최저정량한계미만또는최고정량한계를초과하여외삽하는방식으로계산해서는안된다. 이러한경우에는검량선을재작성하거나, 고농도시료의경우희석한다음재분석하여야한다. 최고정량한계를초과하는시료는 에따라희석의정확성및정밀성을확인하여야한다. 분석배치의검량선은밸리데이션에서검증된농도범위및기준을적용한다. 공시료및영시료를제외하고전범위에걸쳐최소 6 가지검량선용표준시료로 1 회또는반복분석하여작성한다. 검량선으로부터역계산한검량선용표준시료의정확성은최저정량한계에서이론값의 20 % 이내여야하며, 최저정량한계를제외하고는이론값의 15 % 이내여야한다. 이때최소 75 % 이상의검량선용표준시료가적합하여야한다. 기준을만족하지못하는농도의검량선용표준시료는제외하여검량선을재작성할수있다. 만약최저정량한계의검량선용표준시료가기준을만족하지못하는경우최저정량한계에서그다음농도의검량선용표준시료가그분석배치의최저정량한계가된다. 마찬가지로최고정량한계의검량선용표준시료가기준을만족하지못하는경우최고정량한계에서그전농도의검량선용표준시료가그분석배치의최고정량한계가된다. 다만, 재작성된검량선범위는반드시모든품질관리시료가포함되도록설정하여야한다. 일반적으로밸리데이션중에설정한최적의검량선조건을해당시험시료분석에동일하게적용하여야한다. 이러한반응함수 (response function) 는밸리데이션과정동안얻어진검량선용표준시료의실측치를바탕으로적절한통계학적방법이적용되어결정된다. 밸리데이션과시험시료분석시반응함수가달라지는경우는분석법에문제가있음을의미한다. 내부표준물질의변동 (drif t) 은모니터링되어야하고내부표준물질의변동가능성과관련한사항은표준작업지침서에미리기술되어야한다. 14

23 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 품질관리시료품질관리시료는분석물질을생체시료에첨가한것으로검량선과시료를분석하는데사용된분석법의유효성을평가하기위하여사용된다. 품질관리시료는검량선용표준시료와독립적인표준원액에서준비하는것이바람직하지만, 표준원액의안정성과정확성이확인된경우에는동일한표준원액으로부터조제할수있다. 또한, 생체시료효과가없다고입증된경우에는한가지기원의생체시료를사용할수있다. 품질관리시료는검량선범위내에서최소각농도당 2 개씩, 3 가지농도 ( 최저정량한계의 3배농도, 중간농도및최고정량한계부근의농도 ) 로준비하여각시험과정에포함되도록하여야한다. 품질관리시료의개수는시험시료의개수를토대로결정하고, 각각조제한품질관리시료를일정한간격을두고시험시료와함께분석하여야한다. 하나의분석배치에서측정하여야하는품질관리시료의수는최소 6 개이상이거나미지농도의시험시료의 5 % 이상중많은수여야한다. 이때, 최소 67 % 의품질관리시료와각농도에서의최소 50 % 의품질관리시료는이론값의 15 % 이내여야한다 주의사항분석법밸리데이션이완료된다음해당분석법이적절히수행되고있음을입증하기위하여정확성및정밀성에대해정기적으로검토하여야한다. 생물학적동등성시험의경우에는한시험대상자의시료는결과의변동성을줄이기위하여한분석배치에서한꺼번에분석하는것이바람직하다. 임상시험중특이하게높은농도의대사체가발견된다면, 그활성에따라대사체분석법을전체밸리데이션할필요가있다. 여러분석물질을동시에분석하는경우, 각분석물질에대한각각의검량선을작성하여야한다. 만약한분석에서하나의분석물질만적합하고다른분석물질은부적합하다면적합한분석물질의데이터는사용될수있으나, 부적합한분석물질의경우시료를다시전처리하여분석하여야한다. 15

24 식품의약품안전처 부적합한분석배치로부터얻은결과는문서화할필요는없으나, 그분석이부적합으로평가된사실과함께부적합사유가보고되어야한다. 재분석, 재주입및재적분의경우아래와같은사항을고려하여야하며, 재분석사유및채택값의선택기준은표준작업지침서나시험계획서등에미리정의되어있어야한다 재분석재분석 (reanalysis) 이란분석한시료를다시전처리하여분석하는것으로서통계분석이전에완료하여야한다. 또한전체시료개수중재분석된시료개수의비율은시료분석보고서에기술되어야한다. 일반적인재분석사유는다음과같다. 검량선또는품질관리시료의기준부적합 내부표준물질의반응이검량선과품질관리시료와유의적으로차이가나는경우 ( 이기준은표준작업지침서에미리설정되어있어야한다.) 시료주입오류 시료처리과정의문제 기기고장 ( 예 : 기기하드웨어고장, 소프트웨어오작동등 ) 측정된농도가최고정량한계를초과하는경우 최저정량한계이하로측정된농도의시료중검량선용표준시료의가장낮은농도값의부적합으로인해다른배치와비교시최저정량한계가높게설정된경우 정량이되지않을정도의농도의시료 ( 예 : 공시료 ) 에서분석값이측정되는경우 크로마토그램이상 [ 예 : 테일링 (tailing), 숄더 (shoulder), 갈라짐 (splitting) 등 ] 비정상적인결과값에대해인과관계조사가필요한경우 생물학적동등성시험에서는시험결과에영향을미치는비뚤림 (bias) 이있을 수있기때문에, 약동학적의심으로인한재분석및결과값의교체는일반적 으로허용되지않는다. 16

25 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 재주입재주입 (re-injection) 이란분석한시료를분석기기에다시주입하여분석하는것으로기기고장에의한재주입의경우밸리데이션시재현성과시료주입기내의안정성 ( 전처리시료의안정성 ) 이입증된경우에수행될수있다. 분석적인사유의확인없이단순히검량선용표준시료나품질관리시료가허용범위를벗어났다는이유로전체분석배치를재주입하거나개별적인검량선용표준시료나품질관리시료를재주입하는것은허용되지않는다 재적분재적분 (re-integration) 이란분석한시료의크로마토그램을변경된적분파라미터로다시적분하여농도를산출하는것으로재적분이이루어진경우원래의데이터와재적분데이터가모두보고되어야한다. 17

26 식품의약품안전처 5. 검체검증분석 분석법밸리데이션시사용하는검량선용표준시료와품질관리시료는시험시료의분석을반영하지못할수있다. 시험시료가보관및분석과정을거치는동안의안정성문제 ( 예 : 시약의 ph 영향, 모체약물의대사체로의변환, 대사체의역변환, 대사체의불안정성, 이성체변환등 ), 생체시료중단백결합의차이, 생체시료효과, 병용약물, 시험시료전처리과정의불균일성, 시험시료전처리시회수율, 내부표준물질반응의편차, 분석시사용되는시약및분석기기의영향, 시험자의실수등의이유로시험시료내의분석물질농도의정확성과정밀성에영향을미칠수있다. 그러므로시험시료의일부즉, 검체를재분석함으로써생체시료분석법의정확성및신뢰성을평가할필요가있다 검체검증분석실시검체검증분석 (incurred sample reanalysis, ISR) 은검체의안정성이확보된기간내에최초분석과서로다른날, 서로다른배치에서실시되어야한다. 검체검증분석의검체수는전체검체의개수에따라달라진다. 전체검체수가 1,000 개이하인경우, 검체검증분석은전체검체수의 10 % 에해당하는수만큼검체를선정한다. 그리고전체검체수가 1,000 개를초과한경우, 1,0 00 개의 10 % 에해당하는수와 1,000 개를제외한나머지의 5 % 에해당하는수만큼검체를선정한다. 검체검증분석대상검체는최고혈중농도 (C max ) 및소실기부근에서무작위추출한다. 이때되도록많은시험대상자의검체가포함될수있도록선정하는것이바람직하다. 검체검증분석의시기, 검체수결정및대상검체선정의방법과기준에대해서는합리적이고객관적인표준작업지침서를마련한다. 검체검증분석을위한분석법은생체시료분석법밸리데이션및검체분석법과동일하여야한다. 18

27 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 검체검증분석결과를최초분석결과와비교하여분석법의정확성및신뢰성 을평가하여야한다. 검체검증분석결과와최초분석결과간의편차를다음의 수식에따라구한다. 검체검증분석값 최초분석값편차 검체검증분석값과최초분석값의평균값 이때, 검체검증분석검체의최소 67 % 는위수식으로얻어진두값의차이가평균의 20 % 이내에들어야한다. 검체검증분석결과가적합판정기준을벗어난경우, 먼저그원인에대한조사가필요하며부정확성및비정밀성이최소화될수있는적절한단계의과정들이수행되어야한다. 검체검증분석수행에관한문서에는다음과같은사항이포함되어야하고시험기초자료와함께보관하여야한다. 검체선정기준 최초분석결과및검체검증분석결과 편차 (%) 검체검증분석결과가적합판정기준을벗어난경우, 그원인에대한고찰, 해결방안및후속조치등 5.2. 검체검증분석유의사항전처리시검체가튜브에가득담겨있으면전처리에사용되는시약과균일하게혼합되지않는다. 따라서검체의용량을고려하여충분한크기의튜브에담아전처리한다. 전처리과정중사용되는시약의 ph 조건이분석물질을불안정하게하는경우, 최초분석결과와검체검증분석결과가달라질수있다. 따라서분석법개발시다양한 ph 조건에서분석물질의안정성을검토하여불안정한조건을피하는것이바람직하다. 19

28 식품의약품안전처 생체시료내모체약물이대사체로전환되는경우, 최초분석결과와검체검증분석결과가달라질수있다. 따라서분석물질의안정성시험결과를토대로적절한시기에검체검증분석을실시하는것이바람직하다. 대사체가모체약물로역변환되는경우에도모체약물의검체검증분석결과값이최초분석값과달라질수있다. 또한포합체의불안정성으로인하여포합체가다시모체약물로변환되는경우에도이와같은결과가발생할수있다. 산성대사체의에스테르화, 불안정한 N-oxide 또는 glucuronide 포합체, 락톤 (lactone) 고리구조와같이대사체의안정성확인이필요한경우에는안정성시험시표준액에대사체를함께첨가하여안정성평가를실시하는것이바람직하다. 일부대사체의경우, 특정온도조건에서분해되어다른대사체를생성하므로검체검증분석결과가최초분석결과와달라질수있다. 그러므로모체약물뿐만아니라대사체를동시에정량하는경우, 다양한온도조건에서대사체의안정성을검토한후검체전처리및분석법을확립하는것이바람직하다. 20

29 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 6. 문서 생체시료분석의충분한재현성과신뢰성을보장하기위하여, 공통및특정표준작업지침서뿐만아니라분석법밸리데이션및일상적인시험시료분석에서얻어진결과는밸리데이션보고서및시료분석보고서로문서화되어야한다. 분석법밸리데이션및시료분석보고서등모든보고서에는총괄요약표뿐만아니라각종기록 예 : 부적합분석배치, 표준품과공시료에대한기록 ( 영수증, 사용일지, 보관 ), 시료에대한기록 ( 영수증, 반출기록, 준비기록, 보관 ), 분석기록, 기기에대한기록 ( 기기점검일지 ), 일탈기록등 이기술되어야하고크로마토그램과같은시험기초자료와함께보관되어야한다 밸리데이션보고서 밸리데이션보고서에는분석법의개발과확립에관한다음의사항이포함 되어야한다. 요약정보 분석법작업절차에관한기술 분석법밸리데이션실험에사용한약물표준품및대사체표준품, 내부표준물질에관한자료 ( 제조원, 제조번호, 사용 ( 유효 ) 기한, 시험성적서, 안정성, 보관조건등 ) 밸리데이션항목 ( 정확성, 정밀성, 회수율, 선택성, 정량한계, 검량선및안정성 ) 및판정기준 밸리데이션항목을평가하기위해수행된실험에관한기술과그결과 크로마토그램, 질량스펙트로그램등시험기초자료 표준작업지침서, 시험계획서, 또는 GLP( 해당되는경우 ) 에서벗어난경우이탈사항및정당화방법 참고문헌및관련표준작업지침서또는시험계획서 21

30 식품의약품안전처 6.2. 시료분석보고서 시료분석보고서에는밸리데이션된분석법을일상적약물분석에적용하기 위하여다음의사항이포함되어야한다. 요약정보 일상적분석을수행하는동안사용한약물표준품, 대사체표준품과내부표준물질에관한자료 ( 제조원, 제조번호, 사용 ( 유효 ) 기한, 시험성적서, 안정성, 보관조건등 ) 시료전처리와보관에관한정보를포함한요약표. 이표에는시료명, 채취일, 배송전보관, 배송로트에관한정보와분석전의보관에관한사항이포함되어야한다. 각각의정보는날짜, 시간, 시료조건과시험계획서에서벗어난경우이탈에관한사항을포함한다. 임상시료분석에관한요약표. 이표에는시험법명, 분석일자, 분석시간, 시험법, 시험자, 시작과종료시간, 기간, 장비및시료의변경, 그리고확립된분석법의잠재적문제나이탈사항을포함한다. 결과를역계산하는데사용한등식 시료분석에사용한검량선결과표와검량선요약결과 분석배치시험과정의적부평가시사용된품질관리시료의시험내 / 시험간분석값과검량선으로부터의시험내 / 시험간정확성과정밀성에관한데이터의요약정보. 기초자료와통계처리에대한요약뿐만아니라품질관리그래프 (QC graph) 및추이분석 (trend analyse) 에대해기술한다. 임상시료의분석결과표. 이표에는시험법명, 시료명, 기초자료와역계산된결과, 데이터적분확인코드또는기타보고서확인코드가포함된다. 시료분실사유 재분석에관한자료. 이자료에는초회분석결과와재분석의결과, 보고된결과, 시험법명, 재분석사유및채택기준, 재분석요청자, 그리고재분석승인자에관한내용이포함되어야한다. 임상시료의재분석은반드시사전에설정된표준작업지침서에따라수행되어야한다. 22

31 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 재적분에관한자료. 이자료에는초회적분결과및재적분결과, 재적분시사용된방법, 보고된결과, 시험법명, 재적분사유및채택기준, 재적분요청자, 그리고재적분승인자에관한내용이포함되어야한다. 임상시료의재적분은반드시사전에설정된표준작업지침서에따라수행되어야한다. 분석관련시험계획서또는표준작업지침서에서이탈된경우그사유와평가및조치내용 참고문헌및관련표준작업지침서또는시험계획서 6.3. 기타정보 분석법개발과확립또는일상적인시료분석에적용되는기타정보로는 다음과같은사항이포함된다. 약어및시료조건코드, 데이터적분코드, 보고서코드등을포함한기타코드목록 다음과관련된표준작업지침서또는시험계획서 - 임상시료코드와생체시료분석용시료코드를포함한시료코드번호부여체계 - 배치분석을위한임상시료의배정방법 23

32 식품의약품안전처 7. 용어해설 검량선 (Calibration curve) 실험적반응수치와분석물질농도간의상관관계 검량선용표준시료 (Calibration standard) 이미알고있는농도의분석물질을생체시료에첨가한시료로서검량선을작성하는데사용되고, 이검량선으로부터품질관리시료및시험시료내분석물질의농도가결정됨 검출한계 (Limit of Detection, LOD) 생체시료분석법과정으로배경노이즈와확실하게구분되어지는분석물질의 최저농도 검체 (Incurred sample) 검체검증을위해시험시료로부터선택한시료 검체검증분석 (Incurred sample reanalysis, ISR) 최초분석결과의재현성여부를확인하기위해검체중일부를재분석하는과정 단백결합 (Protein binding) 약물이혈장내의단백질과결합하는것으로서단백결합에따라생체내에서 약물의동태및약효의변화가생길수있음 내부표준물질 (Internal standard) 목표로하는분석물질의정량시험을위해이미알고있는일정농도로검량선용표준시료와시험시료에첨가하는시험물질 ( 예 : 구조적으로유사한유도체, 안정하다고알려진물질 ) 24

33 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 분석물질 (Analyte) 측정되는특정화학물질로서, 생체시료내약물자체이거나생분자, 유도체, 대사체, 분해산물이될수있음 분석배치 (Analytical Run or Batch) 밸리데이션을위해적절한수의검량선용표준시료와품질관리시료및분석시료의한세트. 수개의배치가하루에분석될수도있고, 한배치가수일에걸쳐분석될수도있으며분석배치의시료 (unknown sample) 는해동에서전처리까지일괄처리되어같은검량선을사용함 밸리데이션 (Validation) 생체시료분석법이미리설정되어있는판정기준에맞는결과를일관되게도출한다는것을검증하고이를문서화하는것전체밸리데이션 (Full validation) : 새로운생체시료분석법을개발할때실시하는밸리데이션부분밸리데이션 (Partial validation) : 이미밸리데이션된생체시료분석법에서변경이있는경우실시하는밸리데이션교차밸리데이션 (Cross validation) : 동일시험내또는여러시험간에사용된두개이상의분석법의밸리데이션평가항목을비교하기위하여실시하는밸리데이션 생체시료 (Biological matrix) 생체에서분리된물질 ( 예 : 전혈이나혈청, 혈장, 뇨, 변, 타액, 객담, 기타다양 한분리조직 ) 생체시료효과 (Matrix effect) 생체시료내의물질이직접또는간접적으로분석물질또는내부표준물질의 반응에미치는영향 25

34 식품의약품안전처 생체시료효과상수 (Matrix factor, MF) 생체시료유무에따른분석결과의비율 소실기 (Elimination phase) 생체에약물을투여하고얻은혈중농도 - 시간곡선의마지막부분으로일정소 실속도 (elimination rate) 로혈중농도가감소하는부분 선택성 (Selectivity) 분석물질과내부표준물질을시료내존재하는다른물질과분리하여정량하는분석능력을말함. 선택성은종종특이성 (specificity) 과혼용되는데, 특이성은선택성을내포하는의미로서구별될필요성이있음. 특이성은일반적으로단일성분을측정하는능력인데반해, 선택성은어떤특성을갖는일련의물질을측정하는능력을의미함. 즉, 선택성은다른물질로부터분석물질및내부표준물질을분리하여측정할수있는능력을의미함 시료 (Sample) 공시료, 시험시료, 그리고전처리시료등을포함한일반적인용어공시료 (Blank sample) : 분석시료나내부표준물질을가하지않은생체시료를전처리한시료시험시료 (Study sample) : 임상시험으로부터얻은분석대상이되는생물학적시료영시료 (Zero sample) : 공시료에내부표준물질만첨가한시료전처리시료 (Processed sample) : 분석을위해다양한기법 ( 예 : 추출, 희석, 농축 ) 으로처리된시료품질관리시료 (Quality control sample, QC sample) : 생체시료에분석물질을첨가한시료로서생체시료분석법의성능을검사하고각각의분석배치에서분석되는시험시료분석결과의타당성평가에사용함 26

35 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 시스템적합성 (System suitability) 분석배치를시험하기전에표준품을분석함으로써기기성능 ( 예 : 감도, 피크 유지시간등 ) 을평가 안정성 (Stability) 주어진기간동안특정조건하에서주어진생체시료내분석물질의안정성 재현성 (Reproducibility) 서로다른실험실간또는단기간동안동일조건에따라측정하였을때의정 밀성 정량범위 (Quantification range) 농도 - 반응관계를이용해서정확도와정밀도를가지고신뢰성있고재현성있 게정량할수있는농도범위로서최고정량한계와최저정량한계를포함함 정밀성 (Precision) 균질한시료를여러번채취하여정해진조건에따라측정하였을때각각의측정값 들사이의근접성 ( 분산정도 ) 정확성 (Accuracy) 설정된조건하에서측정값이이미알고있는참값이나표준값에근접한정도 재분석 (Reanalysis) 분석한시료를다시전처리하여분석하는것 재적분 (Re-integration) 분석한시료의크로마토그램에대해적분파라메타를변경하여다시농도를 산출하는것 27

36 식품의약품안전처 재주입 (Re-injection) 분석한시료를분석기기에다시주입하여분석하는것 최고혈중농도 (C max, Peak Plasma Concentration) 생체에약물을투여하고얻은혈중농도 - 시간곡선에서가장높은혈중농도 최고정량한계 (Upper Limit of Quantification, ULOQ) 적절한정밀성과정확성을가진정량값으로표현할수있는시료내분석물질의최 고량 최저정량한계 (Lower Limit of Quantification, LLOQ) 적절한정밀성과정확성을가진정량값으로표현할수있는시료내분석물질의최 소량 캐리오버 (Carry-over) 시료의연속측정시분석기기내에잔류된분석물질또는내부표준물질이 다음시료주입시에나타나는반응 특이성 (Specificity) 선택성부분참고 표준작업지침서 (Standard Operating Procedure, SOP) 특정업무를표준화된방법에따라일관되게실시할목적으로해당절차및 수행방법등을상세하게적은문서 표준품 (Reference standard) 분석물질을정량하기위하여표준으로사용되는물질. 주로검량선용시료와 품질관리시료조제에사용 28

37 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 표준원액 (Stock solution) 표준품을일정한농도 ( 예 : 1 mg/ml) 로녹인용액 표준용액 (Working solution) 표준원액을희석한용액. 주로검량선용시료와품질관리시료조제에사용 희석의타당성 (Dilution integrity) 희석과정이분석물질의농도를측정하는데영향을주지않음을입증하는것 회수율 (Recovery) 시료전처리과정을통해분석물질이회수되는정도 29

38 식품의약품안전처 8. 참고문헌 1. 생체시료분석법 Validation( 국립독성연구원, 2003) 2. 의약품등시험방법밸리데이션에대한가이드라인적용을위한해설서 ( 식품의약품안전청, 2008) 3. 생체시료분석법밸리데이션해설서 ( 식품의약품안전청, 2010) 4. Surendra Bansal et al., Key Elements of Bioanalytical Method Validation for S mall Molecules, AAPS Journal, 9(1) Article 11, E109-E114 (2007) 5. C.T. Viswanathan et al., Workshop/Conference Report - Quantitative Bioanalytic al Methods Validation and Implementation: Best Practices for Chromatographic and Ligand Binding Assays, AAPS Journal, 9(1) Article 4, E30-E42 (2007) 6. B.K. Matuszewski et al., Strategies for the Assessment of Matrix Effect in Qua ntitative Bioanalytical Methods Based on HPLC-MS/MS, Anal Chem, 75, (2003) 7. Nicola C. Hughes et al., Determination of Carryover and Contamination for Ma ss Spectrometry-Based Chromatographic Assays, AAPS Journal, 9(3) Article 42, E353-E360 (2007) 8. FDA, Guidance for Industry : Bioanalytical Method Validation (2001) 9. FDA, Guidance for Industry : Bioanalytical Method Validation(Draft) (2013) 10. ICH, VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES: TEXT AND METH ODOLOGY Q2(R1) (2005) 11. ICH, NOTE FOR GUIDANCE ON GOOD CLINICAL PRACTICE (2005) 12. Yadav M., Shrivastav P.S. Incurred sample reanalysis(isr): a decisive tool in bioanalytical research. Bioanalysis 3(9), (2011) 13. EMA, Guideline on bioanalytical method validation (2011) 14. MHLW, Draft Guideline on Bioanalytical Method Validation in Pharmaceutical Development (2013) 30

39 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 15. Fabio G., Workshop report - The Canadian Workshop on the Crystal City AA PS/FDA White Paper(Montreal, QC, Canada) (2007) 16. Fast D.M. et al., Workshop report and follow-up - AAPS Workshop on curre nt topics in GLP bioanalysis: Assay reproducibility for incurred samples - imp lications of Crystal City recommendations. AAPS Journal 11(2), (2009) 17. Christopher T., Highlights of 4th Regulated Bioanalysis Workshop: Discussing, Reviewing, Sharing Perspectives, Providing Potential Solutions and Agreeing u pon a Consistent Approach on the Recent Issues in Regulated Bioanalysis. Qu ality Matters-Special Supplement 2(26), 1-18 (2010) 18. Fu Y. et al., An investigation of incurred human urine sample reanalysis failu re. Bioanalysis 3(9), (2011) 19. Voicu V. et al., Incurred sample reanalysis: different evaluation approaches on data obtained for spironolactone and its active metabolite canrenone. Bioanalys is 3(12), (2011) 20. Savoie N. et al., 2010 White Paper on recent issues in regulated bioanalysis & global harmonization of bioanalytical guidance. Bioanalysis 2(12), (2010) 21. Rocci M.L. Jr., Investigation and resolution of incurred sample reanalysis failu res two case studies. Presented at: The CVG 4th Workshop on Recent Issue s in Regulated Bioanalysis(Montreal, QC, Canada). (2010) 22. Philip T. et al. Incurred sample reproducibility: views and recommendations b y the European Bioanalysis Forum. Bioanalysis 1(6), (2009) 23. William Nowatzke and Eric Woolf., Best Prectices During Bioanalytical Metho d Validation for the Characterization of Assay Reagents and the Evaluation of Analyte Stability in Assay Standards, Quality Controls, and Study Samples. A APS Journal, 9(2) Article 13 (2007) 31

40 식품의약품안전처 부록 1 부분밸리데이션항목예시 변경항목 시험항목 선택성 최저정량한계 검량선 정확성및정밀성 시험내 시험간 회수율 안정성 비고 1. 절차 가. 시약 1) 재용해용매변경 2) 재용해용매량변경 3) 표준원액제조시사용된용매변경 4) 표준용액조제시사용된용매변경 5) 내부표준액의농도나첨가량변경 6) 시약조제방법변경 7) 고체상추출카트리지의활성화액, 세척액, 용출액의변경 8) 단백침전과정에첨가되는시약 9) 액상추출과정에첨가되는용매및시약의변경 10) 유도체화시약의변경 나. 방법 1) 질소증발건고방법변경 2) 질소와진공증발건고방법간의변경 3) 증발건고온도변경 4) 혼합방법변경 ( 흔듦, 진탕혼합, 회전등 ) 5) 상분리를위한원심분리용기또는가속도 ( 설정치의이내 ) 6) 상분리를위한원심분리용기또는가속도 ( 설정치의미만 ) 32

41 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 7) 원심분리온도 ( 설정치의이내 ) 8) 원심분리온도 ( 설정치의미만 ) 9) 고체상추출카트리지의용출방법변경 10) 액-액추출법 (LLE) 추출용매의변경 11) 유도화제를중성화하거나제거 12) 수동및자동절차간의변경 13) 추출전시료의원심분리변경 14) 주입전추출액을원심분리하거나여과하는과정변경 15) 액상추출 ( 액체-액체 ) 과고체상추출간의변경 16) 분석자의변경 17) 밸리데이션과시료분석사이에다른성분의분석 다. 시간 1) 증발건고시간 2) 추출 ( 혼합 ) 시간 3) 원심분리시간 * : 평가항목, : 면제항목 가. 시약 란중 1. 1) 재용해용매변경 재용해용매변경은증발건조후잔사의재용해에사용하는용매의변경을뜻한다. 재용해용매는회수율의재현성, 전처리시료의안정성, 공시료크로마토그램, 피크모양, MS 검출기의경우검출기의반응성변화에의한최저정량한계, 검량선, 시험내정확성및정밀성, 회수율, 안정성에영향을줄수있다. 2. 2) 재용해용매량변경 재용해용매량의변경은회수율의재현성, 공시료크로마토그램에영향을줄수있으며주입량이동일한경우선택성과최저정량한계에영향을줄수있으므로선택성, 최저정량한계, 검량선, 시험내정확성및정밀성, 회수율의재현성시험이필요하다. 3. 3) 표준원액조제시사용된용매변경 표준원액이검량선용표준시료의조제에직접사용되는경우에는 1. 절차가. 시약 4) 표준용액의조제시사용된용매변경 의예시에따라야한다. 반면표준원액이검량선용표준시료의조제에직접사용되지않는경우에는표준원액의안정성과장기안정성시험이필요하다. 4. 4) 표준용액조제시사용된용매변경 공시료에소량 ( 일반적으로 1.0% 이하 ) 의표준용액을가하여검량선용표준시료를조제하였다면생체시료의성질이 33

42 식품의약품안전처 유지되었다고간주할수있다. 그러나 5~10% 의표준용액을가하여조제하였다면검량선용표준시료와시료의성질이동일하다고보기어려우며, 이경우표준용액용매의변경은선택성, 최저정량한계, 검량선, 시험내정확성및정밀성에영향을줄수있다. 표준용액의용매가표준원액의용매와동일한경우표준용액안정성, 장기안정성시험은표준원액안정성, 장기안정성시험으로대체할수있다. 5. 6) 시약조제방법변경 은암실조건, 조제실온도, 습도등주변환경의변경을뜻한다. 6. 7) 고체상추출카트리지의활성화액, 세척액, 용출액의변경 시험시료의고체상추출카트리지의활성화액, 세척액, 용출액의변경은선택성, 검량선, 정확성, 정밀성, 회수율에영향을줄수있다. 특히용출액을직접주입하는경우에는전처리시료의안정성도확인되어야한다. 다만, 용출액을건고하여재용해하는방법에서건고시잔류되는성분이용출액에첨가되지않았다면전처리시료의안정성은불필요하다. 7. 8) 단백침전과정에첨가되는시약 시험시료의단백침전과정에서첨가되는시약의변경은선택성, 검량선, 최저정량한계, 시험내정확성및정밀성, 회수율및전처리시료의안정성에영향을미치므로이에대한평가를다시해야한다. 다만, 단백침전상등액을건고하여재용해하는방법에서건고시잔류되는성분이첨가되지않았다면전처리시료의안정성은불필요하다. 8. 9) 액상추출과정에첨가되는용매및시약의변경 시험시료의액상추출과정에서첨가되는시약의변경은선택성, 검량선, 최저정량한계, 시험내정확성및정밀성, 회수율및전처리시료의안정성에영향을미치므로이에대한평가를다시해야한다. 다만, 건고하여재용해하는방법에서건고시잔류되는성분이첨가되지않았다면전처리시료의안정성은불필요하다 ) 유도체화시약의변경 유도체화시약의변경은안정성을제외한모든시험항목에영향을줄수있으므로안정성을제외한 ( 단, 전처리시료의안정성은포함 ) 전체밸리데이션이필요하다. 나. 방법 란중 1. '1) 질소증발건고방법변경 은건고시간, 질소기류의양의변경을뜻한다. 2. 6) 상분리를위한원심분리용기또는가속도 원심분리의가속도범위를벗어나거나 ( 예 : 설정치의 80% 미만 ) 모양이나직경이다른용기를사용하는경우에는동일한가속도가주어진다하더라도상분리정도가동일하다고볼수없으므로원심분리용기의변경에는선택성, 최저정량한계, 검량선, 시험내정확성및정밀성시험이필요하다 ) 액상추출 ( 액체-액체 ) 과고체상추출간의변경 추출방법의변경은안정성을제외한모든시험항목에영향을줄수있으므로안정성을제외한 ( 단, 전처리시료의안정성은포함 ) 전체밸리데이션이필요하다 ) 분석자의변경 분석자를변경하는경우최저정량한계, 검량선, 정확성및정밀성시험이필요하다. 단, 분석방법및조건의변경이있을경우변경항목에따라추가적인밸리데이션이필요할수있다 ) 밸리데이션과시료분석사이에다른성분의분석 밸리데이션과시료분석사이에다른성분의분석이이루어진경우 ( 예 : A성분밸리데이션후 B성분의분석을진행한후다시 A성분의시험시료를분석하는경우 ) 최저정량한계, 검량선, 정확성및정밀성시험이필요하다. 단, 분석방법및조건의변경이있을경우변경항목에따라추가적인밸리데이션이필요할수있다. 다. 시간 란중 1. '2) 추출 ( 혼합 ) 시간 추출시간의변경은분석물질과내부표준물질의회수율에영향을줄가능성이크다. 회수율이최초밸리데이션시와동등하지않다면추출은평형에도달하지않았다고볼수있으므로, 만일변경전의추출률이크다면변경전의추출시간을사용하여야하며변경후의추출률이크다면안정성을제외한전체밸리데이션이필요하다. 34

43 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 변경항목 시험항목 선택성 최저정량한계 검량선 정확성및정밀성 시험내 시험간 회수율 안정성 비고 2. 시스템 가. 기기 1) 검출기변경 2) 분석기기변경 3) 측정파라메타변경 4) 기기변경 5) 주입량변경 6) 실린지세척액변경 캐리오버시험 7) 주입포트라이너 / 처리 /Septum 캐리오버시험 8) 분석시간변경 나. 컬럼 1) 이동상변경 2) 캐리어가스변경 3) 컬럼온도나온도램프파라메타의변경 4) 컬럼충전물변경또는동일형태의컬럼제조처변경 5) 컬럼직경또는길이의변경 6) 입자크기변경 7) 필름두께변경 다. 데이터처리 ( 인식 ) 1) 질량분석기에대한데이터인식파라미터변경 2) 크로마토그래프법에대한데이터인식파라미터변경 3) 데이터처리하드웨어나소프트웨어변경 측정농도값재계산 측정농도값재계산 * : 평가항목, : 면제항목 35

44 식품의약품안전처 가. 기기 란중 1. 1) 검출기변경 검출기가변경 ( 예 : FLD에서 UV로의변경 ) 되면선택성, 최저정량한계, 검량선, 정확성, 정밀성에영향을미치므로이에대한평가를다시해야한다. 2. 2) 분석기기변경 분석기기의변경 ( 예 : LC에서 GC로의변경 ) 은시료의모든전처리등의방법이동일할경우, 선택성, 최저정량한계, 검량선, 정확성, 정밀성에영향을미치므로이에대한평가를다시해야한다. 3. 3) 측정파라미터변경 측정파라미터변경 ( 예 : 검출조건, 피크인식조건, 분무가스온도, 유량등기기설정변경 ) 이있을경우전항목에영향을미치므로재밸리데이션해야한다. 다만회수율과안정성은시료자체에대한기본적인문제이므로생략될수있으며 Mass 이온의소수점자리변경등과같은기기상태에의한변경항목은검량선과적합성을확인함으로평가할수있다. 4. 4) 기기변경 기기제조업체에따라또는동일한제조업체라도타모델은물론, 동일한모델에서감도등이달라지므로선택성, 최저정량한계, 검량선, 시험내정확성및정밀성에영향을미치므로이에대한평가를다시해야한다. 5. 5) 주입량변경 주입량을변경할시피크형태가완전히달라지므로선택성, 최저정량한계, 검량선, 시험내정확성및정밀성등에영향을미치는지에대한평가를다시해야한다. 6. 8) 분석시간변경 분석시간을줄이는경우아직용출되지않은성분이다음분석시겹쳐나올수있다. 따라서분석시간변경시선택성, 최저정량한계, 검량선, 시험내정확성및정밀성을시험해야한다. 이때품질관리시료를여러번반복주입하여확인해야한다. 나. 컬럼 란중 1. 1) 이동상변경 이동상의조성또는비율변경시선택성, 최저정량한계, 검량선, 시험내정확성및정밀성을시험해야한다. 이동상조성비율이낮은용매의양은상대비로서 ± 30 %, 절대비로서 ± 2 % 중더큰범위까지조정할수있으며, 용매의모든변경은전체이동상에대한절대비로서 ± 10 % 를초과할수없다. 2. 2) 캐리어가스변경 캐리어가스의종류를변경하면선택성, 최저정량한계, 검량선, 시험내정확성및정밀성에대해영향을미칠수있으므로이에대한재평가를해야한다. 3. 3) 컬럼온도나온도램프파라미터의변경 ± 10% 이내에서필요에따라변경가능하고이범위를벗어나면선택성, 최저정량한계, 검량선, 시험내정확성및정밀성등에대해재평가를해야한다. 4. 4) 컬럼충전물변경또는동일형태의컬럼제조처변경 컬럼충전물의입자크기또는관능기가다르거나동일형태의컬럼제조처가변경되는경우선택성, 최저정량한계, 검량선, 정확성, 정밀성등에영향을미치므로이에대한평가를다시해야한다. 5. 5) 컬럼직경또는길이변경 컬럼의길이가변경되면피크유지시간이달라지고컬럼직경이변경되면분리능이감소될수있으므로선속도를조절해야한다. 따라서선택성, 최저정량한계, 검량선, 시험내정확성및정밀성시험이요구된다. 6. 6) 입자크기변경 최대 50 % 까지축소가능하고, 증가는허용되지않는다. 7. 7) 필름두께변경 GC의경우, 필름두께가두꺼워지면피크의형태가넓어지며감도가떨어지므로선택성, 최저정량한계, 검량선, 시험내정확성및정밀성시험을수행하여야한다. 36

45 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 다. 데이터처리 ( 인식 ) 란중 1. 1) 질량분석기에대한데이터인식파라미터변경 데이터인식파라미터란, 시그널을얻을때까지의파라미터또는측정파라미터를의미한다. 선택성, 최저정량한계, 검량선, 시험내정확성및정밀성등의항목에영향을미칠수있으므로이에대한재평가를한다. 2. 2) 크로마토그래프법에대한데이터인식파라미터변경 적분법, 면적-높이데이터처리방법의변경 ( 예 : 밸리데이션시료와시험시료에있어피크유지시간, 대사체의존재유무등의이유로적분법을변경시켜야하는경우 ) 과같은재계산을의미한다. 변경사유를문서화하고만약분석종료후인경우데이터를재처리하여재계산한다. 단, 변경된파라미터는분석전과정에걸쳐서동일하게적용되어야한다. 3. 3) 데이터처리하드웨어나소프트웨어변경 하드웨어의변경은상관없으나 ( 단, 소프트웨어의정상설치및작동을확인 ), 소프트웨어의변경 ( 예 : 버전변경 ) 은데이터인식파라미터의변경과같은것으로변경사유를문서화하고만약분석종료후인경우데이터를재처리하여재계산한다. 단, 변경된파라미터는분석전과정에걸쳐서동일하게적용되어야한다. 변경항목 시험항목 선택성 최저정량한계 검량선 정확성및정밀성 시험내 시험간 회수율 안정성 비고 3. 규격 1) 검량선농도범위변경 가 ) 범위확대 나 ) 범위축소 2) 회귀분석법변경 3) 내부표준물질-외부표준물질상호간변경 4) 면적-높이상호간변경 시스템적합성평가측정농도값재계산측정농도값재계산측정농도값재계산 5) 복합성분분석법을단일성분분석에적용 6) 환경요소 ( 빛, 온도등 ) * : 평가항목, : 면제항목 3. 규격 란중 1. 1) 검량선농도범위변경 범위를확대하는경우전체밸리데이션을해야하지만범위를축소 ( 예 : 혈액중약물농도를측정할때시험범위를넓게설정한다음범위를점점줄여서측정 ) 하는경우검량선과시스템적합성을확인함으로서평가할수있다. 37

46 식품의약품안전처 2. 2) 회귀분석법변경 회귀분석모델 ( 예 : 가중치 ) 을변경할경우, 새로얻어진회귀방정식을이용하여측정농도를재계산하여재평가를실시한다. 3. 5) 복합성분분석법을단일성분분석에적용 복합성분분석법을단일성분분석에적용할경우별도의밸리데이션이필요하지않다. 변경항목 시험항목 선택성 최저정량한계 검량선 정확성및정밀성 시험내 시험간 회수율 안정성 비고 4. 생체시료 가. 기원 1) 공급업체변경 2) 형태변경 ( 혈장, 혈청, 뇨등 ) 3) 유사생체시료변경 나. 처리 1) 보존제변경 2) 항혈액응고제변경 3) 항혈액응고제에대한카운터이온변경 4) 채취방법변경 5) 채취용기변경 6) 보관용기변경 7) 보관온도를높게변경 8) 보관온도를낮게변경 9) 열처리 * : 평가항목, : 면제항목 가. 기원 란중 1. 3) 형태변경 ( 혈장, 혈청, 뇨등 ) 같은물질을분석하더라도생체시료의형태 ( 혈장, 혈청, 뇨등 ) 에따라전처리방법 ( 예 : 혈장의경우에는재단백, 뇨의경우에는 LLE) 이달라지는경우가많다. 따라서전체밸리데이션이요구된다. 38

47 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 2. 4) 유사생체시료변경 유사생체시료변경 이라함은밸리데이션을수행하기에충분한시료를얻을수없는경우이를대신할만한다른형태의생체시료를이용함을뜻한다. 유사생체시료로변경하는경우, 생체시료내에서의안정성, 생체시료효과등이다르게나타나분석법에영향을줄수있으므로전체밸리데이션을수행해야한다. 변경항목 시험항목 선택성 최저정량한계 검량선 정확성및정밀성 시험내 시험간 회수율 안정성 비고 5. 시약및재료 1) 시약제조처변경 2) 시약등급품질의상향변경 3) 시약등급품질의하향변경 4) 내부표준물질변경 5) 표준품제조원변경 6) 시험법에사용된마개의변경 ( 예 : 플러그와스크류 ) 7) 튜브구성성분의변경 ( 예 : 플라스틱과유리 ) 8) 초자류관리방법변경 9) 고체상추출카트리지 (SPC) 의로트번호변경 10) 고체상추출카트리지의제조처변경 11) 고체상추출카트리지의정지상변경 12) 고체상추출카트리지에충전물질의양변경 - 로딩가능한시료 ( 혈장, 혈청, 뇨등 ) 의양변경인경우 * : 평가항목, : 면제항목 5. 시약및재료 란중 1. '4) 내부표준물질변경 ' 내부표준물질변경은내부표준물질의농도또는종류의변경을의미한다. 농도변경의경우선택성, 최저정량한계, 검량선, 정확성, 정밀성, 회수율시험이요구되며종류변경의경우추가적으로내부표준물질의안정성시험이요구된다. 2. 5) 표준품제조원변경 표준품제조원변경시에는순도, 염등이바뀔수있으므로선택성, 최저정량한계, 정확성및정밀성이요구된다. 39

48 식품의약품안전처 부록 2 검체검증분석방법 40

49 생체시료분석법밸리데이션가이드라인 발행일 발행인 발행위원 2013 월 12 월 의약품안전국장유무영의약품심사부장이선희 의약품안전국의약품정책과김성호, 김명호, 옥기석, 오정원, 유대규, 왕소영, 박희영, 안명수, 임상우, 김지연, 현미영, 정명훈, 박선임, 박원영, 한기태, 전보명, 김규서 의약품심사부약효동등성과서경원, 홍정희, 조창희, 박현주, 이윷모, 정신애, 김미애, 김지명, 엄소영, 배수영, 박윤상, 손추영 발행처 식품의약품안전처의약품안전국의약품정책과식품의약품안전평가원의약품심사부약효동등성과 의약품정책과 : T / F 약효동등성과 : T / F

50 생체시료 분석법 밸리데이션 가이드라인 행 정 간 행 물 번 호 생체시료 분석법 밸리데이션 가이드라인 Guideline on Bioanalytical Method Validation