임상병리검사과학회지 : 제 30 권제 2 호 백혈구측정용진단시혐지의개발과임상적고찰 서울보건대학엄상병리과 . 단국대학교자연과학대학화학과 T 박정오 . 박수민 장원철 T Clinical Evaluation and Development of Diagnostic

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건주 류(유)
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1 임상병리검사과학회지 : 제 30 권제 2 호 백혈구측정용진단시혐지의개발과임상적고찰 서울보건대학엄상병리과 *. 단국대학교자연과학대학화학과 T 박정오 *. 박수민 장원철 T Clinical Evaluation and Development of Diagnostic Strip for Determining Leukocytes in Urine. Park, Chung-Oh*., Park, Soo-Min., Jang, Won-Cheoul t Department 01 Medical Technology, Seoul Health College, Sungnam., Korea tdepartment 01 Chemistη" College 01 Natural Sciences, Chungnam, 커 Korea The detection of leukocyte levels played an important role in indication of such medical informations as urogenital tract infection or other dysfunction. The test strip made of 0.5% borate buffer ph8.0, 0.03% 2-pheny!-4(N-tosyl-alanyloxyI)-thiazole[PTT], % PolyVinyl Pyrrolidone[PVP], and 1% decanol was tested for not only reactivity, stability, variation of the number of leukocytes in urine. The detectable responses were shown at the different number of leukocytes and clinical usefulness. Key Words Clinical Evaluation, Diagnostic Strip, Leukocytes, Urine 이연구는단국대학교연구비에의하여이루어졌음. 1. 서론 여배설되는분비물로서, 신장에서여과, 재 흡수, 분비및농축과정을거쳐수뇨관, 방 요 ( 康, urine) 는인체내부로부터대사과정 을거쳐끊임없이형성되어비뇨기계를통하 광, 요도를따라배설된다 1,2,3, 따라서, 요중 성분의분석결과는질병의진단과치료의

2 경과및예후를판정함에여러가지의학정 보를얻을수가있다 4.5 그중에서도신장을 비롯한비뇨기계에, 임균성, 크라미디아성요 도염과신결핵및바이러스성감염과같은 특이적인감염증과장내세균등에의한신 우신염, 방광염등의비 특이적인감염증에 의해요중에백혈구가증가함은물론, 다양 한형태의백혈구가출현하게된다 6 법에 백혈구를검출하는방법으로는습식 분석 비해시약유출로인한환경오염의폐 해를최소화시키거나별도의장치가필요없 이 간단하게설치하는등거의문제점이없 는건식분석법이오늘날의분석기법으로각 광을받고있는실정이다 7 최근에는백혈구 에스터라제의활성을측정하므로간접적으로 백혈구를측정하는방법이가장많이이용되 고있는것이다 8 백혈구에스터라제의활성 을측정하기위해서사용되고있는발색성 효소기질은백혈구에스터라제에의해활성 화되었을때, 직접적으로착색색소를형성 할수있는에스테르화합물이어야한다. 반응성을이용하여간접적으로요중에존재 하는백혈구를측정하는방법을개발하였다 9 본연구에서는실험실에서합성된기칠로 진단시험지를제조하여 백혈구수를측정하는데 유용성을비교관찰하였다. 1. 시약 11. 실험및방법 임상실험을통하여 있어서의임상적인 백혈구내의에스터라제의활성을측정하기 위한 PTT 는실험실에서합성하였다. 아조 짝지음반응에이용되는디아조늄염 (2-meth oxy- 4(N-morpholino)-benezene diazonium tetrachlorozincate 및촉진제인 a1cohol 류와 pyridine은 Aldrich Chemical Co. 에서구입하였다. 백혈구를분리하기위한 Hank s balanced salt solution(hbss, ph 7.3), Dulbecco s phosphate buffered saline(dpbs, ph 7.5) histopaque 1119, histopaque 1083 과항응고 제인 heparine- sodium 및효소표준용액으로는 porcine liver에서추출한 crude 한 esterase (20,000 unit) 를 Sigma사에서구입하여사용하였다. 또한, 정도관리용요는 KOV A trol 1 (Lot No , high abnormad, KO V A trol n (Lot No , low abnormad, KOVA trol ill(lot No , normal ) 는 HYCOR biomedical Inc. 제품을사용하 였고, 요중백혈구의정도관리용시험지 chek-stix 은 Miles Inc. 제품을사용하였으 며, 요침전물중백혈구를현미경으로관찰하기위해서경검용으로표준화된 KOVA System은 ICL scientific사제품을이용하였다. UV-Vis 분광기는 PU 8710 분산반사장치 (Philips Co.) 가부착된 PU 8700 series 를사용하였으며, Clinitek 200과 Urinyzer 2000 ( 청도제약 Co.) 를이용한요자동화학 분석기를이용하였다. 2. 백훨구의분리 건강한성인에게서헌혈자중건강한성인 에게서 얻은혈액을 heparine sodium salt 으 로처리된진공채혈관으로혈액 10ml 을채취하였다. 채취된혈액과 HBSS(Hank s Balanced Salt Solution) 을동일한부피로섞 어희석한다. 사용된 HBSS 의구성성분은표 1 과같다. 원심침전관에희석된혈액의 60-70% 부피의 ficoll 을가하고여기에희석 된 이 혈액울조심스럽게넣는데 ficoll 과혈액 섞이지않게 ficoll 위에혈액이살짝덮히 게한후실온에서 1400rpm 의속도로 40 분 정도원심분리하였다. 세포층의분리에는 위에서부터혈장, 백혈구, ficoll 층, 적혈구층 으로분리되며혈장과 ficoll 층사이의앓은층 을취하여 침전관으로옮긴다. 다른원심침전용 fa1con 플라스틱 분리된백혈구층의 3 배 정도의용량의 HBSS 를가하고실온에서

3 e 띠야Table 1. Components of HBSS without ca1cium chloride, magnes ium sulfate, phenol red and with sodium bicarbonate. Refrigerated 0-5 oc Component g!l D fa F U m m 비Pν Potassium phosphate Sodium chloride Sodium phosphate dibasidanhydrousj ph :t0.3 2,OOOrpm으로 10분정도원심분리하였다. 백를제조하였다. 백혈구가함유되어있는요혈구침전물을다시 HBSS 로희석하여현탁중에백색을띄고있는음성시험지를잠시액을만들고 1200rpm으로실옴에서 10분정담갔다꺼내면, 요중에존재하는백혈구수도원심분리시켰다. 이과정을 2회반복한또는백혈구에스터라제의활성도에따라열 후적당한양의 HBSS를가해현탁액을만들었다. 혈구자동분석기와 hemocytomer로용액속에포함되어있는백혈구의수를측정하였으며, 백혈구가담긴액을조제뇨로희석 은청색에서짙은청색으로발색된다. 제조된시험지는습기에민감하므로실리카겔등의제습제가들어있는용기에넣어보관한다. 하여적당한수의백혈구가존재하도록하였 다. III. 결과및고찰 3. 백혈구측정용시험지의제조 1. 백혈구수에대한안정성에대한검토 백혈구를검출하기위한시험지는 borate NaOH완충용액 (o.4mole, ph8. 0) 과 PVP(0.8g) 와 NaCl을함유하는 100ml 의 1 차침지수용액에 Advantec No.2를충분히침지시킨다. 이시험지를열풍건조기에서 30분간건조사킨후, 0.75mM 의기질과 0.75mM의디아조늄염과 l%(v N)decanol을함유하는 acetone용액에침지시킨다. 5ü o C 에서 5분정도건조시켜건조된시험지를한변의길이가 5mm 인정사각형으로자르고 polysryrene 필름을받침대위에부착하고백혈구검출용시험지 백혈구가포함된세포현탁액을건강인의혼합뇨 (pooled urine) 로희석하여마이크로리터 ( 뼈 ) 당일정수의백혈구가포함되도록조제하여표준시료로사용하였으며, 한편, 요침전물의현미경적인검사방법의경검표준화를위한등급을설정하기위하여백혈구현탁액을정상뇨로희석한후고배율시야 (400배율) 의현미경 (field number, 20mm) 으로관찰하여각각의등급을구분하고판정결과에대한기준을설정하였으며백혈구측정용시험지의표준백혈구현탁액으로사용

4 Table 2. On the Basis of Grade were a Number of Leukocytes in High Power Microscopic Field(400 x) Grade No. αf leuko뿔짧s (HPF.400x) Grade 1 1 개이하 Grade 개 Grade 개 Grade H Grade 개 Grade H Table 3. Changes of the Number of Leukocytes in Urine Preservatives with Time Variation at 5:t 0.1 oc N뼈 Ok.~O o앤 f$ 씨 d aey \ about 1, 많빠 :t 150 :t150 :t150 :t150 :t50-50 about 2,1 얹 )() :t1oo :t1oo :t1oo :t 100 :t1oo about 5,1 따껴 3 :t500 :t5oo :t500 :t500 :t about 10. 얹썼 :t1.000 :t1,000 :t1000 :t1,ooo L_:t7;>O - 2,000 하였고고배율시야당둥급별백혈구수의기준은표 2와같으며자가조제한백혈구뇨보존용현탁액내에서의백혈구수를혈구자동분석기로측정하여안정성올관찰하였던바, 표 3과같이냉장상태에서 5일정도는안정하였다. 2. 시험지판정결과에대한비교검토제조된시험지를이용하여백혈구수에따라기대치값에대한비교정도관리를실시하였다. 분석은 Hoeltage와 Ersts 의방법을인용하였고, KOVA-trol I, II, m 를기대치에대한기준으로정했으며, Check-Stik 의경우에는 control No 에규정된정도관리용수치에준하였고자가조제한시험지의평가수단으로시간변동과백혈구수에따른 정도관리의기대치는표 4. 와같이기존에시 판되고있는시험지의판정결과와거의 치하였으며오히려청색의양성반응색상 이 안정되어둥급별차이는보였으나반웅후 발색된시험지는건조된냉암소에서 1 주일간 안정하였다. 또한, 표 5. 와같이판독시간은 초가적절하였으며, 백혈구수가 증가될수록양성판정에대한시간이단축 되는것으로보아백혈구에스터라제의검출 감도를더 및 높일수있는기질과디아조늄염 촉진제를개발한다면즉시 90 초이내에도 판독이가능한것으로사료되었다. 3. 백혈구수의변화에관한검토 시험지에의한판정결과와요침전물중백혈구수와의관계를검토하기위하여 198 일

5 Table 4. Measurement of Substrate Sensitivity for Leukocyte in Quality Controlled and Self-prepared Urine at Room Temoerature 꿇 캘 L Visual analysis Clinitek 200, urine chemical analyzer KOVA trol 1 Trace - Moderate Smallleukocytes!HPF 6-26 Moderate KOVA trol n Trace - leukocytes/hpf 1-13 Moderarte Small- Moderate KOVA trol m Negative Negative leukocytes!hpf o -5 Chek-Stix Trace - Moderate Trace - Moderate Se}f-prepared Trace - Moderate Trace - Moderate urine control Self-prepared n Negative Negative urine control 0-4 Table 5. Optimization of the Observation Time and Leukocyte Grade for Test Strip time Immediate Gl + G G3 :t -1+ :t -1+ :t G G *G1 : 0-4(-, negative), G2: 5-9(:t, trace), G3 : 10- 껑 (1 +, positive) G4 : 26-75(2+, positive), G5 : (3+, positive) + :t

6 Table 6. Comparison of the Leukocytic Determinations between Microscopy and Test Strips Test Strip High-power microscopic field TotaI Total (Sensitivity 96%, Specificity 94%, Efficiency 52%) 명으로부터무작위적으로채취된중간수시 뇨 10m~ 를원심침전관에넣는다. 450G (l, 500rpm) 에서 5 분간원심분리하여 상층액은버리고요침전물을 KOVA pette 로희석한후, KOVA slide 에넣어 400 배율 로경검하여시험지에의한결과와비교관 찰하였다. 이때, 백혈구에스터라제의활성을이용한 시험지의판정기준이 1+ 에 해당하는시료 를요침전물의경검결과에따른고배율 시야당, 백혈구수가 5-107ß 되게기준을설 정한후비교한결과는표 6 과같이효율성 이 52%, 감도가 96%, 특이성이 94% 로비교 적높았으며유의성이있었다. 4. 시험지의평가 제조된시험지에대하여요중에존재하는 백혈구를검출하는능력을평가하기위하여요침전물의현미경적분석에의해판독된 S 병원을내원한피겸자의뇨를실험에사용하 였다. 이때, 표준비색표에의한육안적인판독과광분산반사장치가있는 PU8700 UV Vis. 분광광도계를이용하였으며, 맹겸용 (GU 은건강인으로판정된시료중에서시험 지법과현미경으로백혈구가확인되지않는 피검뇨를사용하였다. 피검뇨는고배율시야당으로등급을 G1(Bl a띠, 1 개이하, Negative), G2(2-107H, i: -1 +), G4(257ß, 1+), G5(427ß, 2+), G6(75개이상, 3+) 로하였다. 제조된백혈구검출용시험지를등급에따른피검뇨에침적시켜즉시꺼낸후 2분후에표준비색표에의한육안적인관찰과분광광도계를이용하여파장 336nm 에서반사율을측정한결과는표 7. 과같았으며모두가실험시료중의백혈구수에따라명확하게구분되었고광반사율의차이를나타낸것으로보아육안적인식별과요화학자동분석기에의응용성이좋았다. 이때, 육안적으로시험지의색깔을관찰하기위하여따당 107H 의백혈구가포함된시료에시험지를침적시킨결과, 약 90초경부터열은청색으로변화되었으나맹겸용은색깔이변화되지않았다. 표 5와 6의결과로보아 positive( 1 + ) 이상의시료에서는표준비색표에따라육안적인구별이가능하였으며, 시험지의감도측정과 trace의결과에대한판독기준은육안적으로구별하기가곤란하였으나분광광도계를이용한 % reflectance치는차이가나기때문에시험지제조에따른감도및판정등급에대한기준설정에기초자료를제공할수있

7 Table 7. Percent Reflectance of Leukocyte Grade in Urine Experimental Leukocyte concentration %Reflectance grade (cells퍼 PF) at 336nm G1(Blank*) less than G G G G6 more than * Visual observation-purplish blue color, formed at 10 cells microliter. Blank gave no color change Table 8. Comparative Studies on the Test Strips of Ester Substrates 1; 렛 t Substrates Azo coupling dye Reaction time (sec.) 5ensitivity leukocyte ( 뼈 ) A 3-TAPP *1 DANS *5 120 B Indoxyl ester Diazonium salt C Naphthol AS-C *2 CBMBD * PTAAE *3 MMBDT * S2 FES *4 MMBDT *7 Immediate * 1 : 3-(N-tosyl-L-alanyloxy)-5-phenyl-pyrrole ester * 2 : Naphthol AS-chloroacetate * 3 Phenyl thiazole-amino acid ester * 4 Fluorogenic enzyme substrate * 5 : 1-diazo-2-naphthol-4-sulfonic acid * 6 2-chloro-4-benzamide-5-methyl benzene diazonium chloride * 7 2-methoxy-4(N-morpholino)-benzene diazonium tetrachlorozincate 었다. 또한, 기존에 개발되어사용하고있는백 혈구의 에스터라제검출용시험지와비교하 였던바, 표 8과같이형광성기질의경우에 는반응즉시 형광을나타냈으나, 반응단계 에 따른육안적인식별이어려워형광을발 하는물질을정성적이면서정량적으로분석 할수있는기초를마련하였다. 한편, 티아졸유도체와아미노산유도체로부터새로운에 스테르기질인 pheny 1 thiazole 아미노산의에스테르기질을합성하여임상실험을하였 던바, 감도가높고정확하였으며, 기존상품과비교한결과그효능이같거나반응의안

8 정성이더좋은기질을개발하게되어건식 화학분석 기법을이용하는진단용시약의 국산화에터전을마련하게되었다. 에 N. 결론 임상실험을통한결과에의하면백혈구수 따른반응단계를육안적으로명확하게 구별할수있었고요화학자동분석기에의 응용성이좋아효용가치가클것으로생각되 어진다. 백혈구의 esterolyric enzyme 인에 스터라제의활성을측정하여간접적으로백 혈구의수를측정하는분석기법등을이용 하므로써진단용시약의국산화에기여할것 으로사료되었다. 본연구는단국대학교연구비로지원받아 수행되었습니다. REFERENCE 1. Newall R.G., Howell R.,: clinical urinalys is, the principles and practice of urine testing in the Hospital and community, Ames division, Miles Limited, Sussman M.,: clinical advances in urinalysis, Bayer diagostics symposium, paris. May, Kass E. H.,: Asymtomatic infections of the urinary tract, Americal Association of physicians, 69, 56-63, Sussman M., Asscher A.W.,: Urinary tract infection in Renal disease, pp , Blackwell scientific publications, Oxford, Lowe P.A.,: chemical screening and prediction of bacteria- a new approach, Med.Lab.Sci., 43, 28-33, Marks V.:Ann. clin. Biochem., 25, 220-5, Schumann G. B., Schweitzer S.C.,: Examination of urine, In Henry J,B., clinical Diagnosis and Management by Laboratory Method (18th ed.), Philadelphia, W.B.Saunders Co., Free A.H., Free A.H.,: Urinalysis, crtitical Discipline of Clinical science, CRC, Crit. Rev. clin. Lab. Sci., 3(4), , Brühl P., et al., Detection of leukocytes In urine by means of a test strip. B M publication series, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Triger, D.R.and J,W.G.Smith. Survival of urinary leucocytes. J,Clin. Path. 19:

임상병리검사과악외 XI: 저 134 뀐제 2 호, , 2002 한국여성의요중아초산염과 백혈구에스터라제의활성및세균뇨에대한평가 서울보건대학임상병리과 박정오 An Evaluation of Screening for Leukocyte Esterase - Nitrite

임상병리검사과악외 XI: 저 134 뀐제 2 호, , 2002 한국여성의요중아초산염과 백혈구에스터라제의활성및세균뇨에대한평가 서울보건대학임상병리과 박정오 An Evaluation of Screening for Leukocyte Esterase - Nitrite 임상병리검사과악외 XI: 저 134 뀐제 2 호, 95-100, 2002 한국여성의요중아초산염과 백혈구에스터라제의활성및세균뇨에대한평가 서울보건대학임상병리과 박정오 An Evaluation of Screening for Leukocyte Esterase - Nitrite Activity and Significant Bacteriuria as a Predictive