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수종 아
4 years ago
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1 Chapter 2. The study of microbial structure 1 미생물검출 / 분석방법

2 2 미생물의검출 : 의미및필요성 환경과미생물 : 미생물이곧자연!! 어떤미생물들이얼마나존재하면서주어진환경 ( 자연환경, 숙주환경 ) 과어떤상호작용을하는지를이해할필요가가있음. 결국검출을통해, 주어진환경에서의미생물다양성 (biodiversity) 자체 (structure) 및다양한미생물들의특성 (function) 을확인함 따라서미생물의검출은기본적으로미생물자체를검출하는방법과미생물유래물질및활성을대상으로함 ( 정량적검출필요 ). 검출법의민감성 (sensitivity) 및선택성 (selectivity) 에따라시료의증폭 (enrichment) 이필요할수있으나, 증폭을통해 bias 가생길수있음. 증폭의예 : 시료의농축, 균체배양, 핵산의증폭 (PCR), 물질의분리 미생물검출의의미

3 3 미생물의검출 : 대상 생체물질 ( 고분자 / 저분자 ) 구조적특징 기능적특징 미생물자체 분열중인세균 유전물질 (DNA/RNA) 미생물검출의의미

4 4 미생물의검출 : 대상 생체물질 ( 고분자 / 저분자 ) 면역학적구조적특징방법생리학적기능적특징방법 현미경미생물방법자체배양법 분열중인세균 유전물질분자생물학적 (DNA/RNA) 방법 미생물검출의의미

5 5 미생물의검출방법 현미경방법 (microscopic methods) 광학현미경 ( 가시광선 ) 형광현미경 ( 형광물질에맞는광원, 주로 UV) 전자현미경 ( 전자선 ) 특수현미경 : atomic force microscope (AFM) Visualization technique: 기능적특성과연결, 다양한기술과접목 배양법 (cultural methods) 계수법, 플레이트법, 최적확수법 (MPN) 배양배지 (cultural media) 생리학적방법 (physiological methods) 면역학적방법 (immunological technique) 분자생물학적방법 (molecular biological technique): 분자지표, NGS 미생물검출의실제

6 Chapter 2. The study of microbial structure 6 Microscopic Methods 현미경법 미생물검출의실제 : 현미경법

7 7 공부할내용 현미경법 ( 요약 )

8 현미경법 : 현미경의구조 8

9 현미경법 : 현미경의원리 9

10 광학현미경의원리 해상 (resolution): 두점을구분함 수차 (aberration) 광원 (illumination) 배율 / 확대 (magnification) 대비 (contrast): 대비를극대화하기위해 ( ) 을함. 현미경법 : 현미경의원리

11 11 배율 / 확대 (magnification) 현미경법

12 12 해상 (resolution) 현미경법

13 13 대비 (contrast) 증가방식 광학적방법 (illumination): 특수조명한외 / 암시야현미경 (dark field microscope) 물질의굴절률차이에의한위상차를명암으로전환위상차현미경 (phase contrast microscope) 미분간섭현미경 (differential interference microscope): p) 3D 염색법 (staining): 세포가죽을수있음 Visualization technique: 기능적특성과연결, 다양한기술과접목 광학염색 : 염색시약 (stains) 형광염색 ( 형광현미경, 공초점주사레이저현미경 ) 현미경법

$refracted by$ bright image of the

14 14 Dark-field microscope Image is formed by light reflected or refracted by specimen Produces a bright image of the object againstaa dark background Used to observe living, unstained preparations internal structures in eukaryotes Treponema Volvox 현미경법

$refractive$ index/cell density

15 15 Phase-contrast microscope Converts differences in refractive index/cell density into detected variations in light intensity Somelight rays from hollowcone of light passing through unstained cell slowed/out of phase (dark against bright background) Excellent way to observe living cells 현미경법

16 16 Phase-contrast microscope Amoeba Paramecium 현미경법

17 17 광학적방법에의한대비증가 Saccharomyces cerevisiae (a budding yeast) Bright field, dark field, phase contrast 현미경법

18 18 염색법에의한대비증가 Simple Differential Special Crystal violet Gram-staining Capsule staining Spore staining 현미경법 Methylene blue Acid-fast staining Flagellar staining

19 19 많이사용되는염색물질 Basic dyes Safranin Basic fuchsin Crystal violet: peptidoglycan Methylene blue Acidic dyes Eosin Acid fuchsin Congo red: exopolysaccharides Gram staining 현미경법

20 20 형광염색 ( 형광현미경 ) 형광물질자체를 probe로사용하거나, 형광물질을다른 probe 에 conjugation 하여사용할수있음 (e.g. genetic stains: 핵산에붙임 ) 현미경법 FISH, Flow cytometry

21 21 많이사용되는형광염색물질 격벽 (septum/chitin) 염색 Calcofluor 핵 / 핵산염색 DAPI AO, PI, SYTO series 접합용형광물질 FITC 특수염색 LIVE/DEAD BacLight TM (SYTO9과 PI 혼합물 ) : 살아있는세균과죽어있는세균을구분할수있음 현미경법

22 Confocal Laser Scanning Microscope 공촛점레이저주사현미경 (3D): 100 nm 22 Nerve cells 현미경법

by using laser beam, aperture to eliminate stray light, and

23 23 Confocal laser scanning microscope Confocal laser scanning microscopy (CLSM) creates sharp, composite 3D image of specimens by using laser beam, aperture to eliminate stray light, and computer interface Numerous applications including study of biofilms 현미경법

24 현미경법 24

25 25 전자현미경의원리 전자 (electrons): 광자 (photons) 대신 전자기렌즈 (electromagnetic lens) 형광검출 (fluorescent screens) 두종류의전자현미경 투과전자현미경 (Transmission EM, TEM) 주사전자현미경 (Scanning EM, SEM) 현미경법

26 26 전자현미경장비 현미경법 Figure 2.9

27 현미경법 27

28 28 Electron Micrographs 현미경법

29 DIC Microscope Phase-Contrast Microscope 29 Paramecium 현미경법

30 30 Paramecium 현미경법

31 31 Paramecium 현미경법

32 Other preparations for TEM Negative staining

render dark background : for virions, gas vacuoles

heavy metal on only one side : for virions,

$fracture along lines of greatest weakness$

32 32 Other preparations for TEM Negative staining heavy metals do not penetrate the specimen but render dark background : for virions, gas vacuoles T4 Shadowing coating specimen with a thin film of a heavy metal on only one side : for virions, flagella, DNA Proteus Freeze etching freeze and fracture along lines of greatest weakness (membranes) : for 3 D observation of shapes of viral and intracellular structures 현미경법

33 Electron Cryotomography (Cryo-ET) Rapid

native state of structures examined in vacuum

directions to create 3 D structures Provides

subcellular structures such as cytoskeletal

33 33 Electron Cryotomography (Cryo-ET) Rapid freezing technique provides way to preserve native state of structures examined in vacuum Images are recorded from many different directions to create 3 D structures Provides extremely high resolution images of viral and subcellular structures such as cytoskeletal elements, magnetosomes, inclusion bodies, and flagellar motors Caulobacter Bunyavirus 현미경법

34 34 특수현미경 Scanning probe microscope A tiny stylus (probe) is placed close to a specimen The stylus measures weak repulsive forces between it and the specimen A computer generates an image based on the data received from the stylus: scanning tunneling microscope vs. atomic force microscope 현미경법

35 35 AFM and DNA double helix Resolution of the double helix of Lambda Digest DNA on APTES treated mica. Imaged on a Cypher in a physiological buffer (TRIS EDTA) using an Olympus BioLever Mini in AC Mode with an amplitude of 1.2 nm. Image size 210 x 105 nm. 현미경법

36 Chapter 2. The study of microbial structure 36 Cultural Methods 배양법 미생물검출의실제 : 배양법

37 Pure culture and colony isolations 배양법 37

38 38 공부할내용 순수분리및정량 시료로부터미생물의분리, 희석 / 농축 순수분리 : 콜로니형성및추출 (streaking) 정량방법 : 계수 / 물리적 / 화학적 / 생물학적 계수법 (counting), 최적확수법 (MPN) 난배양미생물 (VBNC, VBDC) 미생물별배지 숙주를이용한바이러스배양 배양법 ( 요약 )

39 배양법 39

40 40 Streak plate method (a) (b) (c) Sterilizingan inoculating loopin a flame. Dipping the sterilized loop into a suspension of microbial cells. Streaking the cells on solid medium of a petri dish. 배양법

41 41 Streak plate method 배양법

42 42 Streak plate method Pseudomonas aeruginosa 배양법

43 43 Streak plate method Identification of antibacterial substances 배양법

44 Pure culture and colony isolations 44 배양법

45 Pure culture and colony isolations 45 배양법

46 46 미생물정량의원리 Direct counting total cell count (+ 현미경법 ) viable cell count Physical methods PCV (packed cell volume) Weight (wet or dry) : DCW OD (optical density) Chemical methods total DNA, protein, lipid, ATP Biochemical methods enzyme activity, respiration rate 배양법

47 47 Total count: 눈에보이는균체수 Haematocytometer (Petroff Hausser counting chamber) 배양법

48 48 배양액및시료의희석 Serial dilution/ Standard plate counts 배양법

49 49 Viable count: 배양가능한균체수 배양법

50 50 Viable count: 배양가능한균체수 배양법

51 51 최적확수법 (MPN) Most probable number 측정된값 (5 2 0) 을 MPN 표와비교 배양법

52 52 정량의물리적방법 : 탁도 Turbidity (Spectrophotometric) 배양법

53 53 정량의물리적방법 : 탁도 배양법

54 54 배지선택 : 배지구분기준 3 가지 refertochapter 6: 정성 / 복합 ; 일반 / 강화 / 선택 / 감별배지 배양법

55 55 난배양미생물 생물자원으로서의미생물 ( 난배양미생물포함 ) 배양법

56 56 난배양미생물 자연상태에존재하는미생물혹은미생물유래유전자원을확보하기위해전통적으로사용해온방법은원하는미생물을순수배양 (pure culture) 하는것이다. 많은종류의미생물이순수배양을통해그고유한성질이밝혀졌으며, 산업적으로활용되어오고있기때문에, 최근까지도순수배양기술은미생물연구에있어서매우중요한기술이라고할수있다. 그러나, 과학적지식이축적될수록순수배양기술의문제점이대두되었다. 현미경기술과아래에서언급할 SSU rrna 유전자분석법이발달하면서, 순수배양기술만으로얻어지는미생물의종류가지극히제한적이라는것인데, 더중요한점은, 자연서식지에서매우중요한활성을가지는미생물들중상당수가배양되지않았다는사실이다 (Amann et al. 1995). 비슷한성질의미생물만이순수배양을통해알려지고있고, 그수는자연계전체미생물의 1% 정도에불과하다고추산되고있다 (Pace. 1997). 배양법

57 57 난배양미생물 순수배양기술의문제점은, 이러한난배양미생물 (VBNC. viable but non culturable) 의존재뿐아니라, 자연환경시료에대한미생물의흡착력차이로인해배양자체가불가능한경우도있을수있다. 대부분실제서식환경에서미생물은 microcolony라는집락을이루며동종간혹은이종간상호작용을통해서식하는데, 순수배양기술은이러한서식환경으로한종류의생물만을인위적으로분리하는것이므로, 미생물의성질을바꾸기도한다 (Kaeberlein et al. 2002). 이러한성질의변화는미생물의빠른진화속도와맞물려, 실험실에서배양과계대가장기화될때, 자연계에서와는전혀다른성질을가지는방향으로변화될수도있는데, 내생포자형성를형성하는세균인 Bacillus subtilis 의예에서이러한사실이증명되기에이르렀다 (Branda et al. 2003). 배양법

58 58 산소활용패턴에따른분류 배양법

59 59 저산소 / 혐기미생물의배양 배양법

60 배양법 60

61 61 숙주를이용한바이러스배양 Cytopathogenic effect (CPE) method Plaque formingunit unit (PFU) method 배양법

62 62 배양법의공중보건학적의미 Detection by culture or infectivity is preferred Demonstrates that the target microbes are alive and capable of multiplication or replication. From a public health and risk assessment standpoint, microbial assays based on infectious units are the most relevant and easily interpretable ones. 배양법

바이러스배양 : 유정란 vs 세포 63 지난 1월녹십자는세계보건기구 (WHO) 산하범미보건기구 (PAHO) 의 2014년도남반구의약품입찰에서 2300

이번에중남미국가들로수출되는독감백신의규모는금액기준으로녹십자의의약품수출사상최대이며, 지난해녹십자의독감백신연간수출액에육박한다.

PAHO의북반구독감백신입찰에도참가할예정이어서올해백신수출규모가크게성장할것 이라고전망했다. 녹십자는지난 2009년국내에선최초로독감백신을개발했다.

63 바이러스배양 : 유정란 vs 세포 63 지난 1월녹십자는세계보건기구 (WHO) 산하범미보건기구 (PAHO) 의 2014년도남반구의약품입찰에서 2300 만달러 ( 약 245 억원 ) 규모의독감백신납품계약을수주했다. 이번에중남미국가들로수출되는독감백신의규모는금액기준으로녹십자의의약품수출사상최대이며, 지난해녹십자의독감백신연간수출액에육박한다. 녹십자관계자는 WHO 의독감백신입찰자격은전세계에서녹십자를비롯해단 4 곳만이갖고있으며아시아에서는녹십자가유일하다 며 조만간 PAHO의북반구독감백신입찰에도참가할예정이어서올해백신수출규모가크게성장할것 이라고전망했다. 녹십자는지난 2009년국내에선최초로독감백신을개발했다. 독감백신은북반구와남반구의독감유행시기가달라연중지속적인수출이가능한품목이다. 녹십자는전통적독감백신생산방법인유정란방식뿐만아니라세포배양방식을활용한새로운백신도개발한다. 세포배양방식은동물세포를이용해바이러스를배양한뒤백신으로만드는신기술이다. 이방식은생산기간이짧아조류인플루엔자같은전염병이창궐해백신수요가갑자기늘어나도안정적인공급이가능하다. 배양법

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video slide CHAPTER 4 A Tour of the Cell Today Microscopic methods to study cells A picture show of cellular diversity Next times The components of cells Membranes and membrane proteins Cell wall /extracellular matrix