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영용 강
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1 원저 J Korean Neurol Assoc / Volume 23 / December, 2005 CMT1A 와 HNPP 신경질환의진단을위한 Microsatellite 다중중합효소연쇄반응시스템의개발 이화여자대학교의과대학신경과학교실, 공주대학교생명과학과 a 최병옥박선화 a 윤지영정기화 a ByungOk Choi, M.D., Sun Wha Park, M.Sc. a, Jiyoung Yun, M.D., Ki Wha Chung, Ph.D. a Department of Neurology, Ewha Womans University College of Medicine, Seoul; Department of Biological Science, Kongju National University a, Gonju, Korea 서론 본논문은 년도한국학술진흥재단의선도연구지원 에의하여연구되었음 분자유전학의발전으로이제까지확실하지않았던유전성말초신경계질환들의본질이규명되면서질병에대한진단과치료의개념이변화하고있는데대표적인것으로샤르코 마리 투스질환 (CharcotMarieTooth disease; CMT) 과유전성압박마비편향신경병증 (Hereditary neuropathy with liability to pressure palsies; HNPP) 이있다. 1,2 CMT 는유전되는신경계질환중가장흔하고, 임상또는유전적으로매우다양한양상을보이는질환에속한다. 3,4 지금까지 10개이상의원인유전자가밝혀져있고 CMT 는유전자변이의종류에따라많은아형

2 CMT1A 와 HNPP 신경질환의진단을위한 Microsatellite 다중중합효소연쇄반응시스템의개발 으로나눌수있는데그중에서 CMT1A 가가장높은비율을차지한다. 5 HNPP 는상염색체우성으로유전하고반복적인신경통및근력약화를보이며신경생검상수초가부분적으로비대된 tomacula 를보이는신경계질환으로서, 서구에비해우리나라에는보고된예가적은데그이유는확진을위해서는신경조직갈래검사 (nerve fiber teasing) 로 tomacula 를확인해야한다는기술적인문제때문인것으로생각한다. 69 그러나최근에는유전자검사를통하여이질환을쉽게진단할수있게되었기때문에빈도는더욱늘어날것으로추정된다. CMT1A 및 HNPP 는 17번염색체단완 (17p.2) 에존재하는 peripheral myelin protein 22 (PMP22) 유전자와관련되어있다. 10 CMT1AREP 로알려진 1.4 mega basepairs (Mb) 크기의염기쌍이감수분열중비균형적교차 (unequal crossingover) 현상을일으켜염색체의중복 (duplication) 이되면 CMT1A 로되고결손 (deletion) 이되면 HNPP 의표현형으로나타난다. 이들질환의발병여부는멘델의법칙에매우충실하고, 유전적결함과발병이직접적으로연관되어있으므로유전자검사결과는단순한경향성이나발병의가능성제시가아닌확진의의미를가지므로, 유전자진단시스템을활용하기에매우적합하다. 사람의유전체는동일한염기단위가반복배열하는부위가존재한다. 이러한반복단위의염기수가 26 bp로구성된좌위를 short tandem repeat (STR: microsatellite) 라한다. 이들반복염기서열은대부분비암호화지역에존재하고개인에따른다형성을나타낸다. 유전자의길이다형성은멘델의유전법칙에따라부와모로부터자식에게유전되어염색체에대립유전자 (allele) 의형태로존재하므로각개체는특징적인유전적다형성을나타내어 CMT1A 와 HNPP 의유전적원인인 17 번염색체 p.2p 의중복과결실을진단하는데이용할수있다., 검사의정확도를높이기위하여환자와그의가족들에대해여러유전좌위를검사하는데이경우유사한과정을반복해야하므로이에따른인적, 물적, 시간적소모가많아진다. 따라서보다빠르고정확한진단시스템이필요하다. 지금까지는유전성신경질환에대해조기진단을하여도적절한치료법이없어그필요성이반감되었으나, CMT1A 를대상으로프로게스테론수용체길항제인오나프리스톤 (onapristone) 과아스코르빈산 (ascorbic acid) 이 PMP22 유전자의발현을억제하여병의진행을늦추거나손상조직을회복시키는효과가있음이최근에연속적으로발표되었다. 17,1 그러므로 CMT 의경우정확한유전적진단에따라궁극적으로발병억제및유전적원인에의한적합한맞춤치료가가능할수있게되었지만, 아직 효율적인유전성신경질환진단시스템의개발은미흡한실정이다. 그러므로한국인의유전적원인을분석하고그자료를바탕으로 DNA 진단시스템을개발한다면원인별맞춤치료에도기여할수있을것으로생각한다. 저자들은 17번염색체단완 (17p.2p) 부위에존재하는 6개의 microsatellite marker 들을사용한유전자검사로한국인에서 CMT1A 의중복과 HNPP 의결실을진단하여대립유전자빈도및유전적특성을알아보고, 더정확하고신속한진단시스템을만들어보고자하였다. 대상과방법 1. 대상 본연구는신경학적진찰소견, 전기생리학적검사및비복신경조직검사등을하여 CMT1 질환으로진단된 71가계 2 명과 HNPP 환자 43가계 4 명을대상으로직접본질환에대하여충분히설명하고유전자검사의동의를구하였으며, 동의한환자와그가족구성원들을대상으로하였다. 정상대조군으로는임상진찰소견및전기생리학적검사상 CMT 에합당한신경병증의소견이없으면서동시에 CMT 의가족력이없는 103 명을선택하였다. 전기생리학적검사로는정중신경, 척골신경, 비골신경, 후경골신경및비복신경의운동및감각신경전도검사와청각장애환자들을대상으로뇌간청각유발전위검사를하였다. 2. 시료의채취및 genomic DNA 의추출환자와그가족들의혈액을 EDTA 가들어있는 tube 에채취하여 genomic DNA isolation kit (CoreBio, Korea) 를이용하여 DNA 를추출하였다. 1.5 ml tube 에 300 µl의혈액을담은후 RBC lysis buffer 를 900 µl 가하여잘섞었다. 이혼합액을,000 x g에서 30초간원심분리하여상층액을제거하고, nuclei lysis buffer 250 µl 를넣고피펫으로잘풀어준후 Proteinase K (20 mg/ml) 3 µl를넣고 55 incubator 에서 3 시간처리하였다. 여기에 DNA binding buffer 300 µl를첨가하여,000 x g에서 10분동안원심분리한후상층액을 spin column 에옮겼다. 이어컬럼은,000 x g에서 10초동안원심침전한후 600 µl column wash buffer 를넣어서이물질을세척하였으며 1.5 ml tube 에 spin column 을옮긴후 200 µl의 TE buffer 에 DNA 를분리하였다. 3. 다중중합효소연쇄반응 (multiplex PCR)

3 최병옥박선화윤지영정기화 추출된환자및가족의 genomic DNA 에서염색체 17p.2 부위에위치하는 6개의 microsatellite markers (,,,,, ) 를이용하여유전자좌위의중복과결손여부를검사하였다 (Fig. 1). 본실험에사용된 primer 들은 Table 1과같다. Multiplex system I은,, 로 HEX표지시키고, Multiplex system II는,, 로 FAM 표지시켰다. 반응조건은전체 20 µl 를총반응량으로하여 1020 ng DNA, primer 의차등적인농도혼합액 (Table 1), 200 µm dntps, 2 mm MgCl 2, 0.6 unit Taq DNA polymerase 를사용하여 GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems, USA) 에서증폭하였다. 96 에서 3분간 predenaturation 한후 94 에서 1분간 denaturation 시키고 60 에서 30초간 annealing, 70 에서 1분 30 초간 extension 을하였으며이를 32 회연속반응시킨후 60 에서 45분간최종 extension 하였다. A (A) Proximal CMT1A REP Distal CMT1A REP CEN Genes D17S793 D17S261 D174A D17S57 D17S56 D17S5 D17S39 D17S5 D17S Mb D17S955 D17S900 HREP TEKT3 PMP22 HS3ST3B1 COX10 D17S922 D17S156 TEL B (B) CEN ⅠA ⅠB Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ 2.2Kb 1.6Kb 1.5Kb 20Kb 10.2Kb TEL 35Kb Figure 1. Genomic map of the chromosome 17p.2p. (A) The genomic structure of the CMT1A/HNPP region (centromere to telomere orientation). The STR polymorphic genetic markers are shown above. Proximal and distal CMT1AREPs are shown as vertical gray boxes. (B) PMP22 gene structure. The gene responsible for CMT1A and HNPP, has four coding exons and two alternatively utilized exons. PMP22 spans 35Kb and is transcribed toward the telomere. Each and locates on the first and fourth intron of the PMP22, respectively. Table 1. Primer sequences for PCR amplification of 6 microsatellites Locus Primer sequence (5' 3') Labeling Primer conc. (µm) F: GTGTTGTATTAGGCAGAGTTCTCC R: GGCAGTAGATGGTGACTTTATGGC F: TCTCAGTCCTGATTTCTTGATTTTG R: CCAGAGCTAACACCACATTCA F: CAACCATCAGTGATTTGATGGTTTAC R: GAGTTGTCACTAGAACCCTGTTC F: TCCTGTAATCTGTCCCCAAACGTC R: TTCCTCACACAACCTATTGATAGTC F: CTGTGGAGGAAAGAAAACACTGCC R: GCACTAAAGTAGCTTGTAACTCTG F: AGAGCTGTTCTGCTGAAGTCACTC R: GGCAGGCCAGACAGACCAGGCTC FAM 0. HEX 0.2 HEX 0.5 HEX 0.75 FAM 0.25 FAM 3

4 CMT1A 와 HNPP 신경질환의진단을위한 Microsatellite 다중중합효소연쇄반응시스템의개발 Table 2. Allele nomenclature, sequence structure of analyzed markers Locus Allele Size (bp) Sequence structure PF 24N 33(CA) N 36PR 24 PF 24N 33(CA) N 36PR 24 PF 25N (TTTC) N 6PR 21 PF 25N (TTTC) N 6PR 21 PF 26N 1(CAATA) N 47PR 23 PF 26N 1(CAATA) N 47PR 23 PF 26N 1(CAATA) 1N 47PR 23 PF 24N 7(CAG) N PR 25 PF 24N 7(CAG) N PR 25 PF 24N 54(ATCT) 3AT(ATCT) 6(ACCT) 5N 2PR 24 PF 24N 54(ATCT) (ACCT) 4N 2PR 24 PF 24N 54(ATCT) (ACCT) 6N 2PR 24 PF 24N 35(CA) 19N 95PR 23 PF 24N 35(CA) 22N 95PR 자동유전자분석 PCR 증폭산물은 DW를이용하여 배정도희석한뒤 HiDi Fomamide 와 Size Standard (Rox 500) 를혼합하고 95 에서 5분간가열하여변성시킨후급속히얼음에냉각시켜 ABI 3100 자동유전자분석기로분석하였고, 유전자형결정은 Genotyper 프로그램을이용하였다 (Applied Biosystems, USA). 5. 대립유전자명명각마커의대립유전자는반복단위의횟수로명명하였고, 정확한반복구조를결정하기위해서염기서열을분석하였다. 염기서열은 PCR 증폭산물을 PCR purification kit (Corebio, Korea) 로정제한후 automatic sequencing analyzer (ABI 3100, USA) 를이용하였다. 각유전좌위에서확인된대립유전자의염기서열구조는 Table 2와같다. 6. 통계분석 CMT1A, HNPP 그리고정상대조군에대해 6개유전좌위의대립유전자분포의빈도를확인하였다. 정상대조군의유전좌위에대하여이형접합도 (H obs), Polymorphism information content (PIC), Power of discrimination (PD), Power of exclusion (PE) 등의값은 PowerStatsV program (http: // 을이용하여분석하였다. 각유전좌위에대하여 HardyWeinberg 평형상태를확인 하기위하여 Lewis 의 Genetic Data Analysis program (GDA, 을이용한 Fisher's exact test 로확인하였다. 대립유전자분포에따른환자집단 (CMT1A, HNPP) 과일반인집단사이의유전적차이를알아보기위해 GENEPOP program ( biomed.curtin.edu.au/genepop/) 을이용하여확인하였다. 결과 1. 다중중합효소연쇄반응 중복과결손을정확하게진단하기위해염색체 17p.2 의 CMT1AREP 로알려진 1.4 Mb 내부에위치하는표지자로이형접합률이높고, 대립유전자의종류가많은 6개의 microsatellite markers (,,,,, ) 를선별하여사용하였다. 다중중합효소연쇄반응증폭을위해하나의반응조건으로서로묶인유전좌위 Multiplex system I은,, 로 HEX 표지하였으며, Multiplex system II는,, D17A2 로 FAM 표지하여동시증폭할수있었다. 자동유전자분석결과각유전좌위들의대립유전자들은서로차이가뚜렷해쉽게구별할수있었다. 대립유전자의판별은각각의유전좌위에대해여러대립유전자로구성된대립유전자사다리표식자 (allelic size ladder) 와비교하여결정하였다. 2. 정상인에대한대립유전자및유전자형분포분석

5 최병옥박선화윤지영정기화 1) 한국인 103 명을대상으로조사한결과대립유전자는 91 bp에걸쳐총 7개가관찰되었고, (CA)n 반복으로염기서열은 [P F24N 33(CA) nn 36P R24] 을보였다 (Table 2). 대립유전자빈도는 가 로가장빈번히관찰되었으며, Hardy Weinberg 평형상태에있는것으로나타났다 (Table 3). 이형접합도 (H obs) 는 0.6이었고 PIC 값은 0.660이었으며 PD 값은 0.64 였고, PE 값은 이었다 (Table 4). 2) 대립유전자는 995 bp에걸쳐총 10개가관찰되었고, (TTTC)n 반복으로 [P F25N (TTTC) nn 6P R21] 의서열을보였다 (Table 2). 대립유전자빈도는 와 이 0.21 과 로빈번히관찰되었으며, HardyWeinberg 평형상태에있는것으로나타났다 (p 0.05). H obs 는 0.771, PIC 는 0.792, PD는 0.933, PE는 0.547이었다 (Table 4). 3) 대립유전자는 4204 bp에걸쳐총 9개가관찰되었고, (CAATA)n 반복으로 [P F26N 1(CAATA) nn 47P R23] 의서열 Table 3. Allele frequencies of,,,, and in Koreans Allele Control CMT1A HNPP Control CMT1A HNPP Control CMT1A HNPP Control CMT1A HNPP Control CMT1A HNPP Control CMT1A HNPP HWE a a Exact test for HardyWeinberg equilibrium (GDA program 5,000 shufflings). Table 4. Statistics for 6 microsatellites Locus H obs a PIC b PD c PE d Allele distribution e CMT1A HNPP a observed heterozygosity, b polymorphic information content, c power of discrimination, d power of exclusion, e allele distributions of controls were compared with each patient group

6 CMT1A 와 HNPP 신경질환의진단을위한 Microsatellite 다중중합효소연쇄반응시스템의개발 을보였다 (Table 2). 대립유전자빈도는 과 가 와 로높게관찰되었으며, HardyWeinberg 평형상태에있는것으로나타났다 (p 0.05). H obs 는 0.76, PIC 는 0.751, PD 는 0.919, PE는 였다 (Table 4). 4) 대립유전자는 bp에걸쳐총 3개가관찰되었고, (CAG)n 반복으로 [P F24N 7(CAG) nn P R25] 의서열을보였다 (Table 2). 대립유전자빈도는 과 가 와 로높게관찰되었으며, HardyWeinberg 평형상태에있는것으로나타났다 (Table 3). H obs 는 0.505, PIC 는 0.4, PD는 0.65, PE는 0.192였다 (Table 4). 5) 대립유전자는 01 bp에걸쳐총 10개가관찰되었고, (ATCT)m(ACCT)n 반복으로.2 대립유전자의경우 [P F24 N 54(ATCT) 3AT(ATCT) 6 (ACCT) 5N 2P R24] 의서열을보였다 (Table 2). 대립유전자빈도는.2 가 로가장빈번히관찰되었으며, HardyWeinberg 평형상태에있는것으로나타났다 (p 0.05). H obs 는 0., PIC 는 0.773, PD는 0.929, PE 는 이었다 (Table 4). 6) 대립유전자는 bp에걸쳐총 개가관찰되었고, (CA)n 반복으로 [P F24N 35(CA) nn 95P R23] 의서열을보였다 (Table 2). 대립유전자빈도는 21이 로가장빈번히관찰되었으며, HardyWeinberg 평형상태에있는것으로나타났다 (p 0.05). H obs 는 0.740, PIC 는 0.61, PD는 0.0, PE는 0.493이었다 (Table 4). 3. 환자가계의중복 / 결실분석 CMT 71가족과 HNPP 43가족을대상으로다중중합효소연쇄반응을이용하여 17번염색체에있는 PMP22 유전자의중복과결손을검사하였다. CMT1 형 71가족중 56.3%(40 가족 ) 에서유전자의중복을확인하였고, HNPP 의경우 43가족중 72.1% (31 가족 ) 에서유전자의결손을확인하였다. 대조군으로혈연관계가없는한국인 103 명을대상으로유전자타입을확인하였고, 세대에걸쳐서정상적으로유전되는양상을 Fig. 2에서보여주고있다. 자 (Ⅱ1) 는부 (Ⅰ1) 와모 (Ⅰ2) 로부터정상인대립인자가전이된것을알수있다. CMT1A 로확진된가족은상염색체우성 (autosomal dominant) 으로유전되는양상을 Fig. 3에서보여주고있다. 환자의외조부 (Ⅰ1) 에게정상인대립인자와비정상인중복된대립인자가있으며, 모 (Ⅱ2) 에게중복된대립인자가, 외삼촌 (Ⅱ3) 에게는정상인대립인자가전이되는모습을보여준다. 환자 (Ⅲ1) 에게는모의중복된대립인자와부의정상인대립인자가전이되는것을알수있고, 환자의여동생 (Ⅲ2) 은정상인대립인자만이 A B Ⅰ Markers ladder 부 ,,,,,19,20 Ⅱ 모자,,,,.2,1,20,,,, 1,19, Figure 2. Pedigree analysis (control). (A) Pedigree. The open symbols stand for unaffected males ( ) and unaffected female ( ). The son has received normal allele from his parents. (B) Chromatogram of microsatellite typing. The PCR was performed by the hexaplexing method.

7 최병옥박선화윤지영정기화 A B Ⅰ Markers ladder 외조부 ,,,, 1,17 20,1 외조모 Ⅱ 1 2 3,,,,, 21, 외삼촌부,,,17, 1,21, Ⅲ 1 2 모,,,,,17 19, 자 1 9, 9,,,, 1, 20,22,,, 1,17 20,22 자 2,,,,, 19,22 Figure 3. Pedigree analysis (CMT1A duplication). (A) Pedigree. The open symbols stand for unaffected males( ) and unaffected females( ). The filled symbols represent affected males( ) and affected female( ). The duplication haplotype responsible for CMT1A was indicated as shadowed box. (B) Chromatogram of CMT1A duplication. Ⅰ A Markers B ladder 조모 ,,,,.2, 19,20 Ⅱ 삼촌부 () () () () () 19() () () () () () 19() Ⅲ 1 모 21 자, (), (), (), (),17 () 21,21 21() Figure 4. Pedigree analysis (HNPP deletion). (A) Pedigree. The open symbols stand for unaffected male( ) and unaffected females ( ). The filled symbols represent affected males( ). The deletion of six markers region responsible for HNPP was indicated as shadowed box. The son has not received allele from his father. Father and son are patients and this family shows an autosomal dominant inheritance. (B) Chromatogram of HNPP deletion.

8 CMT1A 와 HNPP 신경질환의진단을위한 Microsatellite 다중중합효소연쇄반응시스템의개발 전이된것을알수있다. HNPP 로확진된가족으로상염색체우성으로유전되는양상을 Fig. 4에서보여주고있다. 환자 (Ⅲ1) 는모 (Ⅱ3) 에게서정상인대립인자가전이되었으나부 (Ⅱ2) 에게서결손된대립인자가전이된것을알수있고, 부 (Ⅱ2) 와삼촌 (Ⅱ1) 은조모 (Ⅰ2) 에게서정상인한개의대립인자와확인되진않았지만조부에게서결손된대립인자를받은것으로추측된다. 4. CMT1A, HNPP 환자집단과정상대조군의유전자빈도비교대립유전자분포에따른유전적차이를대조군과 CMT1A 환자군과비교했을때모두유사한대립유전자빈도를보였다 (p 0.05). 대조군과 HNPP 환자군과비교했을때 을제외한 5개에서는유의한차이를보이지않았다 (Table 4). 고찰 유전성신경계질환의원인유전자를분리하고분자생물학적기전을밝히는연구는세계적으로매우활발하며그본질이규명되면서질병에대한진단과치료의개념이변화하고있다. 1 유전성신경질환의대부분을차지하는 CMT 는크게신경수초의탈수초화에기인하는 CMT1 과축삭돌기의손상에기인하는 CMT2 로나눈다. 2 CMT1 중에서 50% 이상은 PMP22 유전자가위치하는 17p.2p 의중복으로발병하는데, 이를 CMT1A 질환이라고하며전체 CMT 질환군중에서가장높은비율을차지한다. 19 또, HNPP 질환은 CMT1A 질환과는반대로염색체 17p.2p 지역의결실이 70100% 에서있는것으로보고되어있다.,20,21 따라서 PMP22 유전자의중복이있으면 CMT1A, 그리고결손이있으면 HNPP 질환으로확진할수있다. CMT1A 중복과 HNPP 결실을검사하기위해서기존에는방사성동위원소를이용하는 Southern blotting 방법을사용하였으나, 최근에는 1.4Mb 중복 / 결실지역내에존재하는 microsatellite 의타이핑방법을활용함으로써위험한방사성동위원소를사용하지않아도검사가가능해졌다 그러나타이핑에주로사용되는, D17S955, D17S39, marker 들은 (CA)n 반복서열로 PCR 수행시심한 slippage 현상에의한비특이적 DNA 증폭반응이심하게나타나므로정확한타이핑이어려웠다. 본연구에서는 (CA)n 2염기반복이아닌 microsatellite 를염색체 17p.2 부위에서탐색하여지금까지 CMT1A 중복 /HNPP 결실의진단에활용되지않던새로운 4개의 marker (,,, ) 를선별하였 고, 진단확률이높은기존의 2개의 marker (, ) 는그대로사용하여 CMT1A 의중복과 HNPP 의결손의진단방법에사용하였다. 이중 과 는 PMP22 유전자의 intron 내에존재하고있다. 여러유전좌위에대한검사에다중중합효소연쇄반응의도입은많은시간과비용의절약뿐만아니라비슷한검사를하는데나타나기쉬운오차를줄여주기도한다. 25 다중중합효소연쇄반응을하기위해서는몇가지조건이필요한데각각의유전좌위에특이한 primer 들이서로반응하지않아야하고이들의 annealing 온도가비슷해야한다. 각유전좌위에대한증폭조건이서로비슷해야하지만 marker 간에 PCR 산물의크기가중복되는경우는각기다른형광으로표지시켜사용하였다 (HEX, FAM). 본연구에서는각 marker 간에비슷한강도의증폭을위해 primer 의농도를차별화하여 6개의 microsatellite marker 들을검사할수있는 hexaplex PCR 방법을확립하여효율적인검사가가능하게되었다. 본연구의대상이된 6개의 microsatellite marker 에대해관찰되는유전자형을 HardyWeinberg 평형상태에있는지알아보기위해예상되는유전자형을비교한바, 모두평형상태에있었다. 따라서분자유전학적진단목적에유용하게이용될수있을것으로판단된다. 일반적으로다형성을나타내는유전좌위에서대립유전자의수가많을수록진단 marker 로효용성이높다. 본연구에서밝혀진바와같이 유전좌위에서는 7개, 유전좌위에서는 10개, 유전좌위에서는 9 개, 유전좌위에서는 4개, 유전좌위에서는 10 개, 그리고 유전좌위에서는 개의대립유전자가관찰되었다. 유전좌위는한대립유전자들이차지하는비중이 0.5 정도로특정대립유전자가차지하는비율이다소높아대립유전자가골고루분포하는다른유전좌위들에비해서는다형성의정도는다소떨어진다. 한편집단에서임의로선택된두사람이같은유전자형을나타내지않을확률을계산하여유전좌위의변별력을나타내는 PD값에서는 (PD=0.65) 이다소낮았고 (PD=0.933) 와 (PD=0.929) 가높았다. 그리고대립유전자수가상대적으로많은 (H obs=0.771, PIC=0.792, PE=0.547) 와 (H obs=0., PIC=0.773, PE=0.621) 는높은수치를나타내었다. PIC 는 0.5 이상이면상당한정보력을가지고있는것으로판단하는데 (PIC>0.5; highly informative, 0.25<PIC<0.5; reasonably informative, PIC<0.25; slightly informative), 본연구에서도 유전좌위를제외하고는 0.5 이상의값을나타내었다. PIC 는대립유전자의수가많을수록 1에가까워지고유전정보량도충분히함유하는것으로이해

9 최병옥박선화윤지영정기화 된다. 관찰된이형접합도 (H obs) 는 6개의 marker 모두에서 0.5 보다높은값을나타내었다. 기존에흔히사용하던 marker 를사용하여유전자중복이나결손을검사할경우에정확도는 74% 이내로검사상의오진율은 26% 로상당히높으며, 실제임상에서검사기관에따라 CMT1A 유전자중복검사의결과가다르게나온것을가끔경험한바있었다. 그러나 6개의 marker 를사용하여 17p.2 p 지역의중복및결손을판단할경우오진율은 0.1% 이하가된다. 이들 marker 중일부, 예를들어,, 의 3개 marker 만을사용해도오진율은기존의진단방법에비해훨씬낮은 2.6% 이하가되지만오진율을더욱줄이기위해서는 6개의 marker 를모두사용하는것이바람직하다고생각된다. 대립유전자분포에따른유전적차이에서정상대조군집단과 CMT1A 집단사이에는모두유사한대립유전자빈도를보였으나 (p 0.01) 정상대조군집단과 HNPP 집단사이에는 5개 microsatellite markers 에서유사한대립유전자빈도를보였고 에서는차이 (p=0.009) 를보였다. HNPP 집단의경우수가너무적어대립유전자빈도분포에크게비중을두긴어려운점이있다고본다. 6개의 microsatellite markers 를사용하여 HNPP 질환으로진단된 43가족중 72.1% (31 가족 ) 에서상염색체우성유전으로염색체 17p.2p 의결손을확인하였다. HNPP 의결손으로밝혀진 31가족외 2가족의경우는환자에서는 PMP22 유전자를포함하는염색체 17p.2p 의결손을확인하였으나, 부모는각각 2개씩의대립인자를가지고있어유전학적으로정상이었다. 혹친생자관계가아닌지의심하여유전자감식을하였으나친생자관계가성립됨을확인하였다. 이경우는정상인부모에서발생한상염색체우성유전이아닌산발성으로질환이발생하였음을알수있었다. 한국인환자들에서 CMT1A 중복과 HNPP 결손빈도는다른집단자료와비슷하였다. CMT1A 와 HNPP 의질환을본연구에서개발한 6개 microsatellite marker 들을사용한 hexaplex PCR 을사용하여유전자의이상유무를한번의 PCR 로빠르게, 그리고 99.9% 이상의정확도로진단할수있었다. 특히프로게스테론수용체길항제및아스코르빈산등이 CMT1A 치료에유용한약물표적으로활용될수있다는사실이밝혀져있으므로이제정확한진단은필수불가결하다고할수있다. 본연구에따르면, 유전성이강하면서도단일유전자결함에의해발병하는유전성신경질환인 CMT1A 와 HNPP 에대하여 hexaplex PCR 검사방법을사용하여더빠르고정확한진단이가능하고, 이에따라최근개발되고있는치료방법을적용하여맞춤치료를하는데도움을줄 수있을것으로생각한다. REFERENCES

10 CMT1A 와 HNPP 신경질환의진단을위한 Microsatellite 다중중합효소연쇄반응시스템의개발

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29(2)-04(임시근).fm Printed in the Republic of Korea ANALYTICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Vol. 29, No. 2, 79-84, 2016 http://dx.doi.org/10.5806/ast.2016.29.2.79 Note ( 단신 ) Performance of MiniPCR TM mini8, a portable thermal cycler