55(1)-02(김종원147).fm

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지승 증
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1 Korean Chem. Eng. Res., 55(), (207) PISSN X, EISSN 질량분석기를활용한효과적이황화결합분석법개발 진종화 민호필 * 권오승 * 오현정 ** 김종원 박철환 ***, 오송첨단의료산업진흥재단신약개발지원센터 2860 충청북도청주시흥덕구오송읍오송생명로 23 * 한국과학기술연구원도핑콘트롤센터 서울특별시성북구화랑로 4 길 5 ** 고려대학교기계공학과 0284 서울특별시성북구안암로 45 *** 광운대학교화학공학과 0897 서울특별시노원구광운로 20 (206 년 0 월 7 일접수, 206 년 월 2 일수정본접수, 206 년 월 7 일채택 ) Mass Spectrometry-Based Strategy for Effective Disulfide Bond Identification Jonghwa Jin, Hophil Min*, Oh-Seung Kwon*, Hyun Jeong Oh**, Jongwon Kim and Chulhwan Park***, New Drug Development Center, Osong Medical Innovation Foundation, 23, Osong Saengmyung-ro, Osong-eup, Heungdeok-gu, Cheongju, Chungbuk, 2860, Korea *Doping Control Center, Korea Institute of Science and Technology (KIST), 5, Hwarang-ro 4-gil, Seongbuk-gu, Seoul, 02792, Korea **School of Mechanical Engineering, Korea University, 45, Anam-ro, Seongbuk-gu, Seoul, 0284, Korea ***Department of Chemical Engineering, Kwangwoon University, 20, Kwangwoon-ro, Nowon-gu, Seoul, 0897, Korea (Received 7 October 206; Received in revised form 2 November 206; accepted 7 November 206) 요 약 이황화결합 (Disulfide Bond) 은다양한생리학적혹은병리학적과정중단백질번역후변형 (Post-Translational Modifications) 과정중에형성된다. 그러므로이황화결합에대한정보는단백질의화학적구조를보다종합적으로이해하는데매우중요한일이다. 질량분석기를이용한이황화결합분석은매우효과적이며, 현재까지질량분석기를활용한다양한이황화결합분석법들이개발되었다. 그러나, 대부분의이황화결합분석법의경우, 이황화결합분석시자유 - 시스테인잔기 (Free Thiol Residues) 분석을고려하지않았다. 본연구에서는이황화결합에관여하는시스테인 / 자유 - 시스테인에초점을두고총 4 단계 ( 단계 : 아미노산서열을통한이황화결합가능부위를예측, 2 단계 : 자유시스테인의존재유무의확인, 3 단계 : 질량분석기를활용한이황화결합분석, 4 단계 : 이황화결합분석법의종합적인검증 ) 의분석법을개발하였다. 나아가, 본연구에서개발된분석기법을실제휴먼유래재조합단백질 (HRPE) 에적용함으로써개발된이황화결합분석법의효용성을확인하였다. HRPE 의경우, 총 6 개의이황화결합 (Inter-chain 형태 :, Intra-chain 형태 : 5) 으로구성된것을최종확인하였다. Abstract The determination of disulfide bonds is important for comprehensive understanding of the chemical structure of protein. So far, many strategies for the disulfide bond analysis have been suggested in terms of speed and sensitivity. However, most of these strategies have not considered free thiol residues in the target protein in the process of determining the disulfide bond. We suggested the strategy which was composed of four steps for the identification of disulfide bonds; the first step was the prediction of possible disulfide bonds, the second step was the determination of free cysteine residues, the third step was the analysis of disulfide bond using a high-resolution mass spectrometry, and the final step was the determination of disulfide bonds based on the comprehensive verification. In this study, we performed the characterization of disulfide bonds for the recombinant protein (HRPE), where and 5 inter- and intra-chain disulfide bonds were identified, respectively. Key words: Disulfide bond, Free-thiol group, Mass spectrometry, Peptide mapping To whom correspondence should be addressed. jonwkim@kbiohealth.kr (J. Kim), chpark@kw.ac.kr (C. Park) 이논문은광운대학교한춘교수님의정년을기념하여투고되었습니다. This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 27

2 28 진종화 민호필 권오승 오현정 김종원 박철환. 서론티올 (Thiol) 은대부분체액에서발생하여낮은분자량의이황화물과결합하거나자유형태로순환하며, 대사과정과관련되어있다 []. 세포과정에서문제가생기면체액내의티올과이황화물의양이변화한다 [2]. 티올은시스테인, 글루타치온, 메르캅토에탄올등에있으며, -SH기를갖고있기때문에 -SH기사이에서이황화결합 (Disulfide Bond) 을형성한다. 그중에서도시스테인은 20개의아미노산중유일하게 -SH기를포함한다 [3,4]. 이러한시스테인의 -SH간이황화결합은단백질의다양한생리학적, 병리학적과정의번역후수정을통해형성되며구조변화를이루며단백질의 2차, 3차구조를결정하는데중요한역할을한다 [5,6]. 단백질의구조와생물학적기능을이해하는데있어이황화결합의분석은필수적이며, 신속하고높은감도의다양한이황화결합분석법이요구되고있다 []. 결정학및 NMR은최소한의이황화결합변화를식별하는데뛰어난기술이며 [7], Edman Degradation도이황화결합의식별에사용된다 [6]. 하지만위의분석전략들은단백질의크기, 필요한양, 시료의순도에크게영향을받는다는한계를지니고있다 [3,5]. 질량분석장비를이용한분석법도이황화결합을식별하는데적합하다. MALDI-MS, ESI-MS를이용한이황화결합의패턴분석은이미밝혀져있다. 부분적인환원 (Reducing) 조건또는비환원 (Non-reducing) 조건에서도이황화결합패턴이분석되었다. 부분적환원조건은이황화결합을분석하는데널리사용되는접근법으로, 다른환원반응속도를가지는이황화결합이차례로환원되고알킬화되는조건에서단백질이분해된다. 그러나고도로가교되어있는단백질의경우, 완벽한이황화물분석을위해서는여러번의환원과분리과정이필요하다 [8-0]. 비환원조건에서절단되는단백질의분석은이황화결합의패턴분석에서자주사용된다. 또한, 적절한효소를사용한절단으로이황화결합패턴을보다효과적으로분석이가능하다 [,2]. 질량분석장비를이용한분석법은펨토몰 (Femtomole) 단위의높은감도를구현하기때문에샘플의양이제한된상황에서시스테인잔기를분석할수있는우수한방법중하나이다 [3,4]. 본연구에서사용된질량분석장비는초고분해능질량분석기 (High-Resolution Mass Spectrometry: Q-Exactive) 로기존의분석법보다높은감도로샘플분석이가능하다는장점을가진다. 질량분석장비를이용한분석법의샘플준비단계는 TCEP (Tris-2-Carboxyethlphosphine Hydrochloride), DTT (Dithiothreitol) 를이용하여시스테인간의이황화결합을절단해주는환원반응과 IAA (Iodoacetamide), NEM (N-Ethylmaleimide), M-biotin을이용한알킬화반응을통해 -SH기간의이황화결합이다시이루어지는것을방지하는과정으로이루어진다. 이황화결합은가역적인결합이므로이러한과정을통해시스테인을안정한상태로만들어줄필요가있다. 대부분의분석전략은목적단백질의이황화결합분석시자유-시스테인잔기분석을고려하지않는다. 하지만, 이황화결합을이루고있는시스테인과자유-시스테인의수와위치는단백질의특성을결정하는데더효율적이고정확한정보를제공할수있다. 본연구에서는이황화결합을이루고있는시스테인과자유-시스테인모두에초점을두고 4단계의분석법전략을마련하였다. 첫번째로아미노산서열을통해가능한이황화결합부위를예측하였다. 두번째로이황화결합시스테인과자유-시스테인에환원및알 킬화반응을적용하여자유-시스테인유무를확인하였다. 자유-시스테인은 NEM의유무에따른 modification 차이를이용하여이황화결합시스테인과구분지을수있었다. 이황화결합시스테인은비환원및 DTT를이용한환원과 IAA를이용한알킬화반응후세가지의가수분해효소 (Asp-N, Chymotrypsin, Asp-N&Chymotrypsin) 분해방법을통해분석을진행하였다. 세번째로는초고분해능질량분석기 (HRMS) 를통해얻은분석데이터를이황화결합부위예측프로그램 (PepFinder) 과펩타이드맵핑 (Peptide Mapping) 분석기법을적용하여이황화결합부위를규명하였다. 마지막으로, 이황화결합분석법의종합적인검증단계를거쳤다. 본연구에서는휴먼유래재조합단백질 (HRPE) 의이황화결합을분석하고두가지종류 (Inter-chain 이황화결합, Intra-chain 이황화결합 ) 의이황화결합형태로구분하였다. HRPE의경우는 개의 Inter-chain, 5개의 Intra-chain 이황화결합으로이루어져있음을확인하였다. 본연구를통해제시된이황화결합분석법은자유-시스테인의존재여부의확인을통해보다정확한단백질의화학적구조를파악하는데매우효과적이며, 나아가의약품개발에서의이황화결합의패턴분석을보다효율적으로이해하는데도움이될것으로기대한다. 2. 실험 2-. 실험재료실험재료로포름산 (Sigma, F0507-L), 디티오트레이톨 (Sigma, D0622-0G), 요오도아세트아미드 (Sigma, I49-5G), N-에틸마레이미드 (Sigma, E3876-5G), 중탄산암모늄 (Sigma, A64-KG), 고순도물 (Millipore, Z ), 아세토니트릴 (Millipore, I ), 요소 (GE Healthcare, ), 메탄올 (Honeywell, AH230-4), 트립신 (Promega, V5), Asp-N (Promega, V62), 키모트립신 (Promega, V06) 을사용하였다 시료전처리 (Enzyme digestion) 환원및알킬화과정을포함한효소전처리에서는, 샘플에 8 M urea를처리하여단백질을변성시킨후, 0 mm 중탄산암모늄 (Ammonium Bicarbonate) 에녹인 0 mm DTT (Dithiothreitol) 를이용하여이황화결합을환원시켰다. 그후 55 mm IAA (Iodoacetamide) 를이용해알킬화시켰다. 알킬화된샘플은 Chymotrypsin, Asp-N, Chymotrypsin&Asp-N을이용해 37 C에서 6시간동안반응시켰다. 환원및알킬화과정을제외한효소전처리에서는, 동일한샘플을 8 M urea를처리하여변성시킨후환원, 알킬화과정을생략하고, Chymotrypsin, Asp-N, Chymotrypsin&Asp-N을이용해 37 C에서 6시간동안반응시켰다 자유-시스테인분석 HRPE 내자유시스테인을확인하기위해 NEM을처리하였다. NEM을이용한전처리실험을직접 HRPE에수행하기전에, 먼저 BSA를이용하여양성대조군실험을진행하였다. 각각의샘플에 50 mm NEM을처리한후 37 C에서 2시간동안반응시켰다. NEM 처리된샘플에 8 M urea를처리하여단백질을변성시킨후, 0 mm 중탄산암모늄에녹인 0 mm DTT를이용하여이황화결합을

질량분석기를활용한효과적이황화결합분석법개발 29 환원시켰다. 그이후 55 mm IAA를이용하여알킬화시켰다. 알킬화된샘플은 Trypsin을이용해 37 C에서 6시간동안반응시켰다. 2-4. 분석기기및분석조건효소에의하여절단된펩타이드 (0.5 µg) 를 C8 컬럼을통하여분리하였다. 주입한펩타이드를 0.

3 질량분석기를활용한효과적이황화결합분석법개발 29 환원시켰다. 그이후 55 mm IAA를이용하여알킬화시켰다. 알킬화된샘플은 Trypsin을이용해 37 C에서 6시간동안반응시켰다 분석기기및분석조건효소에의하여절단된펩타이드 (0.5 µg) 를 C8 컬럼을통하여분리하였다. 주입한펩타이드를 0.% 포름산을포함하는아세토니트릴을 5% 에서 60% 까지상온에서 60분동안일정한기울기로증가시키는방법을통해분리시켰다. 이동상의유속을분당 300 nl로설정하였고, 분리된펩타이드는전자분무방식을이용한질량분석기인 Q-Exactive (Thermo Scientific TM ) 로주입하였다. NanoLC-MS/MS 실험은 Waters사의 NanoAcquity 초고성능액체크로마토그래피와 Thermo사의나노전자분무방식질량분석기 (Q-Exactive) 를이용하였다. 펩타이드는자동샘플러를통하여시료로딩컬럼 (2 cm long; ID, 80 µm; particle size, 5 µm) 과 C8 역상분석컬럼 (0 cm long; ID, 50 µm; particle size,.7 µm) 으로주입되었다. 주입한펩타이드를 0.% 포름산을포함하는아세토니트릴을 5% 에서 60% 까지상온에서 60분동안일정한기울기로증가시키는방법을통해분리하였다. 이동상의유속을분당 300 nl/min로설정하였고, 분리된펩타이드는전자분무방식을이용한질량분석기인 Q-Exactive로주입되었다. 샘플분석전용매및컬럼에의한간섭여부를판단하기위한 blank 분석을수행하였다. Q-exactive 분석조건은다음과같다. Top2 데이터에의존취득법을사용하였으며, full-scan에서의 MS (m/z) 범위는 350~,600, 해상도는 70,000 FWHM, AGC는 5 0 4, 최대충전시간은 60밀리초로설정하여분석을진행하였다. MS/MS 질량분석조건은, 시작 MS 조건은 00 M/Z이며, 해상도는 7,500 FWHM, AGC는 5 0 4, 최대충전시간이 60밀리초, 표준화충돌에너지 NCE 27%, 동적제외 30초로설정하여분석을진행하였다 예측프로그램 (PepFinder TM 2.0) 활용이황화결합분석이황화결합패턴분석을위해서 차로비환원조건과환원조건에서의 MS 스펙트럼데이터를얻고, 2차로이황화결합예측프로그램인 PepFinder TM 2.0 (Thermo Scientific, Version: ) 을활용하여실제이황화결합부위를규명하였다. 분석은 단계-타겟단백질및데이터설정, 2단계-데이터프로세싱, 3단계-리포트생성의총 3단계로나누어진행하였다. Fig.. Overall scheme of identification of disulfide bond using highresolution mass spectrometry. 마지막으로이황화결합분석법의종합적인검증단계를거쳤다. Fig. 에개발된분석법에대한전략을나타내었다 자유-시스테인분석기법의검증자유-시스테인의존재유무확인법의경우, 소혈청알부민 (Bovine Serum Albumin) 시료를활용하여실제존재하는자유-시스테인의존재유무를정확히규명할수있는지에대한검증을수행하였다. 전체적인실험방법은 NEM 알킬화반응처리한것과하지않은것으로나누어자유-시스테인의존재여부를검증하였다. Fig. 2에자유-시스테인검증을위한실험절차를나타내었다. 본실험을통하여자유-시스테인의경우, NEM ( Da) 로 modification된것을확인할수있었고, 이황화결합의시스테인의경우, Carbamidomethyl ( Da) 로 modification된것을확인할수있었다. Fig. 3과 3. 결과및고찰 3-. 이황화결합분석전략본연구에서는이황화결합에관여하는시스테인 / 자유-시스테인에초점을두고, 총 4단계의분석법개발에대한전략을세웠다. 첫번째단계에서는아미노산서열을기반으로한이황화결합생성가능부위를예측하였다. 두번째단계에서는이황화결합시스테인과자유-시스테인에각각다른알킬화반응을적용하여자유시스테인의유무를확인하였다. 자유-시스테인은 NEM의유무에따른 modification 차이를이용하여최종이황화결합-시스테인과구분지을수있었다. 세번째로는초고분해능질량분석기 (High-Resolution Mass Spectrometry) 를통해얻은분석데이터를이황화결합부위예측프로그램 (PepFinder TM Software) 과펩타이드맵핑 (Peptide Mapping) 분석기법을적용하여이황화결합부위를규명하였다. Fig. 2. LC-MS/MS procedure of quality control and target sample analysis.

30 진종화 민호필 권오승 오현정 김종원 박철환 Fig. 3. The result of identified free thiol group in bovine serum albumin (BSA). (A) The result of identification of free thiol group in No-NEM treatment condition.

The result of prediction of disulfide bond using prediction tool based on the amino acid sequence (DISULFIND, http:// disulfind.dsi.unifi.it/). Table 에 소혈청알부민에서 확인된 4개의 자유 시스테인을 나타내 었다. 3-3.

4 30 진종화 민호필 권오승 오현정 김종원 박철환 Fig. 3. The result of identified free thiol group in bovine serum albumin (BSA). (A) The result of identification of free thiol group in No-NEM treatment condition. (B) The result of identification of free thiol group in NEM treatment condition. Fig. 4. The result of prediction of disulfide bond using prediction tool based on the amino acid sequence (DISULFIND, disulfind.dsi.unifi.it/). Table 에 소혈청알부민에서 확인된 4개의 자유 시스테인을 나타내 었다 아미노산 서열 기반 HRPE의 이황화결합 부위 예측 본 연구에서는 차적으로 이황화결합 분석을 위한 분석기법을 개발하고 2차로 개발된 분석기법을 휴먼유래 재조합 단백질 (HRPE)에 적용함으로써 본 연구에서 개발된 이황화결합 분석기 법의 효용성을 확인하고자 하였다. HRPE 단백질의 경우, 총 58개 의 아미노산으로 구성되었으며, 이 중 9개의 아미노산이 시스테인 으로 구성되었다. HRPE 단백질의 아미노산 서열분석을 통한 이 황화결합 가능부위예측을 위해 DISULFIND 프로그램을 사용하 였다( 분석결과 총 4개(Bond : 2~0, Bond 2: 6~36, Bond 3: 7~20, Bond 4: 29~42)의 이황화결합 부위가 예측되었다(Connection Confidence: 0.293). Fig. 4에 예측된 이황 화결합 부위를 나타내었다. Fig. 5. The result of identified free thiol group in HRPE protein. Identified result of free thiol group in Asp-N (A), Chymotrypsin (B), and Asp-N&Chymotrysin (C) treatment conditions HRPE단백질에 대한 자유-시스테인 분석 HRPE의 자유-시스테인 분석을 위해 NEM 알킬화 반응 처리한 것과 하지 않은 것으로 나뉘어 자유-시스테인의 존재여부를 검증하 였다. NEM 처리는 2차 알킬화(Carbamidomethy)처리 전에 수행하 였으며, HRPE에 자유-시스테인이 존재한다면, 해당 자유-시스테 인은, NEM ( Da)으로 modification되며, 이황화결합-시 스테인은, Carbamidomethyl ( Da)로 modification된다. HRPE의 자유-시스테인 분석결과, 9개 모두 Carbamidomethyl ( Da)로 modification됨을 확하였다. 따라서, HRPE에는 자유-시스테인이 없는 것으로 확인되었다. Fig. 5에 HRPE에 대한 자유-시스테인 분석 결과를 나타내었다. Table. Identified free thiol residues for BSA in no-nem and NEM treatment conditions N Sequence GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK Condition (NEM) RT m/z CCTKPESER CCTKPESER RPCFSALTPDETYVPK RPCFSALTPDETYVPK MPCTEDYLSLILNR MPCTEDYLSLILNR Modification C4-Carbamidomethyl ( Da) C4-Nethylmaleimide ( Da) C-Carbamidomethyl ( Da) C2-Carbamidomethyl ( Da) C-Nethylmaleimide ( Da) C2-Carbamidomethyl ( Da) C3-Carbamidomethyl ( Da) C3-Nethylmaleimide ( Da) C3-Carbamidomethyl ( Da) C3-Nethylmaleimide ( Da)

5 질량분석기를활용한효과적이황화결합분석법개발 질량분석기를활용한이황화결합분석효과적인이황화결합분석을위하여, 본연구에서는 차로비환원조건과환원조건에서 HRPE의질량분석스펙트럼을얻고, 2차로 Fig. 6. Identified disulfide bonds of HRPE protein in Asp-N enzyme treatment condition. (A) Detected disulfide bond in Asp-N enzyme treatment condition. (B) LC/MS chromatogram with/ without DTT treatment conditions. 이황화결합예측프로그램 (PepFinder TM software) 을활용하여실제이황화결합부위를규명하였다. 또한, 모든가능한이황화결합에대한위치확인을위해, 3가지의가수분해효소 (Asp-N, Chymotrypsin, Asp-N&Chymotrypsin) 를사용하여총 39번의 LC-MS/MS 분석을진행하였다 (Asp-N: 0회, Chymotrypsin: 0회, Asp-N&Chymotrypsin: 9회 ). 3가지가수분해효소를활용한이황화결합분석을통하여모든가능한이황화결합부위를예측할수있었다. 본연구를통하여분석된 Asp-N 가수분해효소에서의이황화결합분석결과를 Fig. 6A에나타내었다. Asp-N 유래이황화결합분석결과 개의 Inter-chain과 5개의 Intra-chain의이황화결합부위가규명되었으며, 6개의이황화결합부위를팹타이드맵핑분석을통해확인하였다 (Fig. 6B). 분석된상세한이황화결합정보를 Table 2에나타내었다. Fig. 7A에 Chymotrypsin 가수분해효소유래이황화결합분석결과를나타내었다. Chymotrypsin에의한이황화결합분석결과, 4개의 Intra-chain의이황화결합부위가규명되었으며, Inter-chain 이황화결합형태는나타나지않았다. 규명된 4개의이황화결합부위를팹타이드맵핑분석을통해확인하였으며 (Fig. 7B), 분석된이황화결합정보를 Table 2에나타내었다. 보다정확한이황화결합분석을위해서, Asp-N&Chymotrypsin 가수분해효소유래이황화결합분석도함께수행하였다. Asp- N&Chymotrypsin 가수분해효소유래이황화결합분석결과를 Fig. 8A에나타내었다. Asp-N&Chymotrypsin에의한이황화결합분석결과, 2개의 Inter-chain과 3개의 Intra-chain의이황화결합부위가 Table 2. Overall result of identified disulfide bonds in Asp-N, Chymotrysin, Asp-N&Chymotrysin enzyme treatment conditions A. Detected disulfide bonds (Asp-N) Theoretical Mass HRPE Frag# Res# Disulfide bridge Amino acid sequence m/z m/z RT Area D -2 C2=C0 XCXXXXXXXCXX E+07 D C6=C7=C20=C29 XXXCCXXCXXXXXXXXCXXXXX E+05 D C36=C42 XCXXXXXCXX E+05 D C36=C42 XCXXXXXCXX E+05 D C42=C49 XXXXXCXXXXXXCXX E+07 D5-34 C2=C0=C6=C7=C20=C29 XCXXXXXXXCXXXXXCCXXCXXXXXXXXC XXXXX E+06 D6=6 45-5=45-5 C49=C49 XXXXCXX E+06 B. Detected disulfide bonds (Chymotrypsin) Theoretical Mass HRPE Frag# Res# Disulfide bridge Amino acid sequence m/z m/z RT Area D 5-22 C0=C6=C7=C20 XXXXXCXXXXXCCXXCXX E+04 D C0=C6=C7=C20 XXXXXCXXXXXCCXXCXXXXXXX E+05 D C0=C6=C7=C20 XXXXXCXXXXXCCXXCXXXXXXX E+05 D C29=C36=C42=C49 XCXXXXXXCXXXXXCXXXXXXCXXXXXX E+05 D C29=C36=C42=C49 XCXXXXXXCXXXXXCXXXXXXCX XXXXXXXX E+06 C. Detected disulfide bonds (Asp-N&Chymotrypsin) Theoretical Mass HRPE Frag# Res# Disulfide bridge Amino acid sequence m/z m/z RT Area D= -2 C2=C2 XCXXXXXXXCXX E+06 D= -2=-3 C2=C2 XCXXXXXXXCXX, XCX E+06 D C0=C6=C7=C20 XXXXXCXXXXXCCXXCXXXXXXX E+06 D C29=C36=C42=C49 XCXXXXXXCXXXXXCXXXXXXCXXXXXX E+05 D C42=C49 XXXXXCXXXXXXCXX E+06 D5=5 45-5=45-5 C49=C49 XXXXCXX E+06

32 진종화 민호필 권오승 오현정 김종원 박철환 Fig. 9. Final result of identified disulfide bonds for the HRPE protein (inter-chain disulfide bonds: and intra-chain disulfide bonds: 5). Fig. 7.

6 32 진종화 민호필 권오승 오현정 김종원 박철환 Fig. 9. Final result of identified disulfide bonds for the HRPE protein (inter-chain disulfide bonds: and intra-chain disulfide bonds: 5). Fig. 7. Identified disulfide bonds of HRPE protein in Chymotrypsin enzyme treatment condition. (A) Detected disulfide bond in Chymotrypsin enzyme treatment condition. (B) LC/MS chromatogram with/without DTT treatment conditions. 과를바탕으로, 다음의조건을만족시키는이황화결합부의를선정하여최종결론을내렸다. 우선적으로이황화결합분석을위하여분석된아미노산서열 (DISULFIND 프로그램 ) 및질량분석데이터 (PepFinder TM Software) 기반분석결과를바탕으로, 3가지가수분해효소유래이황화결합에대한분석결과에서공통적으로규명된이황화결합부위를우선적으로선정하였다. 이황화결합에대한이론적인질량값과실제확인된질량값과의차이 (Accuracy: 정확도 ) 가가장낮은것을선정하였다. 이황화결합의경우, 단백질의 3차원구조를형성하는데매우중요한역할을담당하기때문에, 이황화결합의구조적인유효성여부도함께고려하였다. 본연구를통해서최종제안된 HRPE의이황화결합부위를그림9에나타내었다. 이황화결합분석결과 개의 Inter-chain과 5개의 Intra-chain 이황화결합부위가최종적으로규명되었다. 4. 결론 본연구를통해분석된재조합단백질의이황화결합위치를확인한결과 9개의시스테인에서는자유-시스테인이없는것으로확인되었으며, 개의 Inter-chain과 5개의 Intra-chain 이황화결합부위가최종적으로규명되었다. 특히, 본연구에서는이황화결합분석을위해자유-시스테인분석법, 아미노산서열 (DISULFIND) 및질량분석데이터 (PepFinder TM Software) 기반분석법을적용함으로써이황화결합의확실성 (Confidence) 및정확성 (Accuracy) 에대한평가를수행할수있었다. 본연구에서개발된이황화결합분석법은의약품개발에서의이황화결합에대한효율적인패턴분석과관련한유용한자료로활용될것으로기대된다. Fig. 8. Identified disulfide bonds of HRPE protein in Asp-N & Chymotrysin enzyme treatment condition. (A) Detected disulfide bond in Asp-N&Chymotrysin enzyme treatment condition. (B) LC/MS chromatogram with/without DTT treatment conditions. 규명되었다. 분석된 5개의이황화결합부위를팹타이드맵핑분석을통해확인하였으며 (Fig. 8B), 분석된이황화결합정보를 Table 2에나타내었다 이황화결합분석법의종합적인검증최종제안된 HRPE의이황화결합부위분석은 3개 (Asp-N, Chymotrypsin, Asp-N&Chymotrypsin) 의가수분해효소에따른결 감 본연구는오송첨단의료산업진흥재단신약개발지원센터의연구장비및인력지원을받아수행되었습니다. 본연구에사용된휴먼유래재조합단백질 (HRPE) 은아이진 ( 주 ) 에서제공하였습니다. 사 References. Rietsch, A. and Beckwith, J., The Genetics of Disulfide Bond Metabolism, Annu. Rev. Genet., 32, 63-84(998). 2. Seiwert, B. and Karst, U., Simultaneous LC/MS/MS Determination of Thiols and Disulfides in Urine Samples Based on Differential Labeling with Ferrocene-Based Maleimides, Anal.

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환경중잔류의약물질대사체분석방법확립에 관한연구 (Ⅱ) - 테트라사이클린계항생제 - 환경건강연구부화학물질연구과,,,,,, Ⅱ 2010

11-1480523-000702-01 환경중잔류의약물질대사체분석방법확립에 관한연구 (Ⅱ) - 테트라사이클린계항생제 - 환경건강연구부화학물질연구과,,,,,, Ⅱ 2010 목차 ⅰ ⅱ ⅲ Abstract ⅳ Ⅰ Ⅱ i 목차 Ⅲ Ⅳ i 목차 ii 목차 iii Abstract α β α β iv Ⅰ. 서론 Ⅰ 1 Ⅱ. 연구내용및방법 Ⅱ. 2 Ⅱ. 연구내용및방법