특 / 별 / 기 / 고 차세대시퀀싱기법을이용한의학유전체학의발전동향 최무림 서울대학교의과학과 이글은최근의생명분야의많은분야에광범위한영향을미치고있는차세대염기서열해독법 (Next-generation sequencing, NG

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정헌 영
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특 / 별 / 기 / 고 차세대시퀀싱기법을이용한의학유전체학의발전동향 최무림 서울대학교의과학과 E-mail: murimchoi@snu.ac.

1 특 / 별 / 기 / 고 차세대시퀀싱기법을이용한의학유전체학의발전동향 최무림 서울대학교의과학과 murimchoi@snu.ac.kr 이글은최근의생명분야의많은분야에광범위한영향을미치고있는차세대염기서열해독법 (Next-generation sequencing, NGS) 과그의학적응용에대한소개와현황, 특히그기법이희귀질환환자들의진단에미치게될영향과그잠재성을간략히기술하는것을목표로하고있다. 서론작년말타계한영국의생화학자프레데릭생어 (Frederick Sanger, ) 는노벨화학상을두번수상했던유일한인물이다. 그는 1958년단백질을이루는아미노산서열해독법으로, 1980년 DNA 서열해독법으로노벨상을수상하였다. 특히생어시퀀싱기법 (Sanger sequencing) 은지난 30년간실험실에서비교적간단하게 DNA 서열해독을하는방법으로널리쓰여왔다. 생어가 1980년대에 DNA 시퀀싱을도입한직후, 또다른분야에서의혁명이일어나고있었다. 현미국보건원의원장인프시스콜린스 (Francis S. Collins, 1950-) 를비롯한일군의유전학자 (human geneticists) 들이 positional cloning이라는기술을이용하여인간의유전체상에서몇몇질병의원인유전자를밝혀내고있었던것이다 [1]. 이당시유전학적기법은지금관점에서보기에는엄청나게노동집약적이고느린작업이었다. 실제로콜린스그룹이낭포성섬유종 (cystic fibrosis) 의원인유전자가염색체 7번상에위치해있다는것 을알고있는상태에서시작하여그원인유전자가 CFTR라는것을밝히는것도그후 4년간의연구끝에이루어진고된작업이었다. 그렇다면그당시유전병의원인이되는유전자를밝히는것이그렇게힘든이유는무엇이었을까? 중요한두가지의이유가있었다고생각하는데, 첫번째는인간유전체지도 (genetic map) 의부재, 그리고두번째는효율적인 DNA 서열분석법의부재였다. 본론 Human genome project 위의배경을이해한다면콜린스박사가후에미국보건원산하유전체센터 (NHGRI, national human genome research institute) 의소장이되며착수한일이인간유전체지도를구축하고모든염기서열을읽어내는 human genome project(hgp) 라는것은그리놀라운일이아닐것이다. 물론당시에가능한염기서열분석방식은생어시퀀싱이유일했으므로이를이용하여약 30억개가되는인간유전체염기서열을해독하는것은엄청난노력, 시간과돈이들어가는모험적인프로젝트였다. 13년간 38억불의예산이든 HGP는 2003년성공적으로종 1 분자세포생물학뉴스레터

이러한기술적인병목현상을제거해준기술이차세대시퀀싱이다 ( 그림 1). 차세대시퀀싱은특별한기술을지칭하는말은아니며단지예전의생어시퀀싱의데이터출력양을훨씬초과하는여러시퀀싱기술들을통칭하는용어이다.

그후약 10개남짓되는상이한기술들이부침을거듭하였으며현재는일루미나 (Illumina), 아이온토렌트 (Ion Torrent) 등의몇몇기술들이시장을장악하고있다. 1.3.

그후 1-2년이라는짧은기간동안백인뿐만아니라흑인들, 아시아인들의유전체들이해독되었다. 이시기두명의한국인유전체도분석이되어다양한인종의유전체연구에이바지하였다 ( 표 1). 그렇다면이러한건강한개인의유전체를분석하는것은그기술의효용성을증명하는것에더하여어떠한의미가있을까?

즉여러명의건강한사람들의유전체를분석하여그변이의목록을만들어야비로소환자대상유전체연구의기반을닦을수있는것이다. 1.

2 Molecular and Cellular Biology Newsletter 료가되었다. 그당시의몇몇언론발표처럼 곧인간질병정복가능 하지는않았지만, 그결과물로인하여연구자들은보다효과적으로관심이있는유전자를찾고그유전자상의변이를연구하는토대를닦을수있었다. 그리고 HGP가종료가된지 10년남짓지난지금, 그누구보다유전학자들은 HGP 달성의수혜자가되어연구를수행하고있다 NGS 기술 HGP는결국한명분의유전체를읽어내는작업이었지만기술적으로생어시퀀싱을사용하였기에천문학적인비용과긴시간이걸렸다. 이러한기술적인병목현상을제거해준기술이차세대시퀀싱이다 ( 그림 1). 차세대시퀀싱은특별한기술을지칭하는말은아니며단지예전의생어시퀀싱의데이터출력양을훨씬초과하는여러시퀀싱기술들을통칭하는용어이다. 첫차세대시퀀싱기술은 454라고불리며 DNA의이중나선구조를판독하여노벨상을수상했던제임스왓슨 (James Watson, 1928-) 의유전체를 4달만에 150만불의비용으로해독해내어그에게처음으로 NGS를통한전장유전체시퀀싱이이루어진개인이라는영예를부여했다 *[2]. 그후약 10개남짓되는상이한기술들이부침을거듭하였으며현재는일루미나 (Illumina), 아이온토렌트 (Ion Torrent) 등의몇몇기술들이시장을장악하고있다 건강한사람의유전체해독 454 이후새로운 NGS 기술이나올때마다각회사들은건강한사람들의유전체를해독하여그기술력을증명하곤했다. 후속주자인일루미나, 솔리드 (SOLiD), 아이온토렌트등도건강한백인의유전체를성공적으로해독해내었다. 그후 1-2년이라는짧은기간동안백인뿐만아니라흑인들, 아시아인들의유전체들이해독되었다. 이시기두명의한국인유전체도분석이되어다양한인종의유전체연구에이바지하였다 ( 표 1). 그렇다면이러한건강한개인의유전체를분석하는것은그기술의효용성을증명하는것에더하여어떠한의미가있을까? HGP를통하여유전서열의대략적인의미와유전자들의위치를알수는있을것이다. 하지만질병을일으키는변이를파악하기위해서는인류에분포하고있는개인간, 인종간의유전체변이를이해해야한다. 즉여러명의건강한사람들의유전체를분석하여그변이의목록을만들어야비로소환자대상유전체연구의기반을닦을수있는것이다. 1. NGS 초기전장유전체분석의사례들 ([3] 에서인용 ) 2. NGS 1. 최근십여년간시퀀싱단가의하락속도 2.1. Whole exome sequencing(wes) 위와같은기반이갖춰지고, NGS 기술을환자진단, 치료용으로쓰기위해서는결국환자의유전체를분석, 병인이되는변이를발견해야한다. 2008년급성골수성백혈병 (acute myeloid leukemia) 환자의혈액샘플을처음분석한것을효시로환자의유전체분석이급속도로증가하였다 [4]. 연구 * 그이전처음으로전장유전체시퀀싱이이루어진개인은크랙벤터 (J. Craig Venter, 1946-) 로서미정부의 HGP 진행당시 Celera genomics 라는회사를통하여본인의유전체를분석하여 HGP 를추월, 인간유전체를특허화하려는시도를하였다. 그후벤터는본인의유전체데이터를공개하였다. HGP 는여러익명의샘플을분석하였다. 웹진 2014 ㅣ 04 2

3 특 / 별 / 기 / 고 자들이가장처음주목한분야는암이었으며전장유전체수준으로암에의하여생긴돌연변이들의양상을본다는것은연구자들에게엄청난이익을가져다줄수있는가능성을제시하였다 ( 암유전체학의최신동향과의생명학적인성과들은다른논문들이상세히다루고있다 [5-6]). 또한유전성이강한질환들에관한연구들의수요도급격히늘고있었다. 하지만이러한동향이최대한으로뻗어나가기에는여전히높은가격이걸림돌이었다. 비록 HGP 시절보다는엄청나게저렴해진수준이었지만환자대상의연구를위해서는적어도두명이상, 혹은열명이상의같은질환환자군을분석하는실험조건이필요했기에보통의실험실에서손쉽게할수있는실험은아니었다. 실제로 2009년당시한명의유전체를일루미나기계를통하여분석하기위해서는 10만불정도의비용이들었다. 이를보완하기위하여연구자들은좀더저렴하고효율적으로유전체상의유전변이를탐지하고분석할수있는방법에대해서고민하기시작하였다. 2007년일군의논문들이유전체상의원하는부분만을특이적으로증폭하여추후분석용으로쓸수있다는방법론적인연구결과를발표하였다. 이방법들은때마침나온 NGS 방법과짝이된다면당시 NGS의가장큰단점인높은단가를해결할수있었다. 예를들어, 실제단백질을합성하는부분인엑손부분들은모두다합치더라도약 3천만개정도의염기쌍밖에되지않아전체유전체중약 1% 정도밖에차지하지않는다. 그리고실제로병을일으키는유전변이들의약 80% 정도가이 엑솜 (exon + ome = exome, 전체엑손들의집합 ) 에서발견되기때문에유전체의전체중약 1% 만분석을하여대부분의유전변이를찾아내자는생각을할수있었다. 2009년여름, 워싱턴대학과예일대학의두그룹이각각 whole exome sequencing(wes) 을구축하여그효용성을증명하였다 [8-9]. 특히한그룹에서는기존후보유전자에서돌연변이를발견하지못한바터증후군 (Bartter Syndrome) 으로진단된터키환자의 WES을수행하였다 [8]. 바터신드롬은신장세뇨관세포에서의재흡수문제로인하여전해질과수분이소변으로과다배출되는질환이다. 분석결과예상치못하게 SLC26A3라는유전자상의돌연변이를발견했다. SLC26A3은선천성염소성설사 (chloride-losing diarrhea, OMIM ) 를일으키는것으로알려져있으며신생아인환자의잘못된진단을유전체분석을통하여바로잡은경우이다. 현재이증례는 NGS 기법을이용하여환자를분자적진단을한첫번째예로서알려져있다. 2. 시간에따른 whole exome sequencing의사용증가분포 [6] 환자진단과변이탐색을통한질병원인규명 WES의성공적인용례발표가있고난후연구자들은보다싼가격에환자들의유전체를연구할수있는방법을가지게되었고그후유전체의학에서널리사용되며현재까지발전해왔다 ( 그림 2). 가장특이할경향성은기존부터유전성질환으로알려져있는질환의유전적인기작을밝혀내려는움직임이다. 2010년세가족, 네명의환자를대상으로밀러증후군의병인유전자를밝혀낸것을효시로그뒤를이어여러선천성질환들에대한유전적인이해가높아져가고있다 [10]. 본글에서는몇가지의주요실험적인접근방법들과질병의유전적인이해를위한성공적인예시를들어보겠다. 2.2.a. 산발적환자군을가지는질환의유전적이해희귀질환의연구의가장큰걸림돌은많은수의환자들을모집하는것이쉽지않다는것이다. 특히희귀하게산발적으로병이일어나는환자들이있는경우효과적인분석이힘들수있다. 이러한경우는그러한환자들의유전체를분석 3 분자세포생물학뉴스레터

4 Molecular and Cellular Biology Newsletter 한후가장많은환자에게서발견된변이, 혹은그러한변이를가장많이가지고있는유전자를밝히는것이한가지방법으로쓰이고있다. 물론유전체상의많은유전자들을그러한식으로단순나열한다면엄청나게많은수의유전자들이비슷한빈도로나올것이며이는정확한유전자들의돌연변이부담을계산하는데에문제를일으킬것이다. 그예로신장의먼쪽세관 (distal tubule) 상의이온교환의문제에의하여발생하여고혈압과같은증상을보이는거짓저알도스테론증 (pseudohypoaldosteronism, PHAII) 이라는희귀질환에대한예를들겠다 [11]. 연구자들이가지고있던 11명의산발적환자군을 WES으로분석한후돌연변이의목록을작성한후, 이를 700명의건강한대조군의데이터와비교하여상대적인유전자수준의돌연변이부담을계산하였다. 그결과로 KLHL3, CUL3와같은전혀새로운유전자들이전체환자군의약 80% 를설명할수있다는것을발견하였고추후연구를통하여이들이기존 PHAII의병인유전자인 WNK 계열단백질의위쪽에서활동한다는것을밝혀내어새로운유전인자의존재와그활동기작을확인하였다 [12]. 2.2.b. 종양성질환의유전적이해이러한접근방법의예로서알도스테론분비부신선종 (aldosterone producing adenoma, APA) 발생의기작연구를다루겠다 [13]. APA는 primary aldosteronism 증상을일으키는중요한원인으로알려져있으며그로인하여많은특발성고혈압환자들의원인으로도주목되어왔다. 이질환의기작을이해하기위하여연구자들은네명의환자에서유래한선종조직과혈액조직에서 DNA를분리, 선종조직특이적인돌연변이를발견하였다. 놀랍게도네종양조직중두환자의조직에서 potassium channel의일종인 KCNJ5 라는유전자에서돌연변이가발견되었고연구자들은여러기능연구를통하여이 potassium channel의문제로인하여알도스테론분비세포에서세포분열의증가 (adrenal hyperplasia) 와알도스테론분비증가 (aldosteronism) 가유발됨을증명하였다. 실제로대규모후속연구를통하여전체 APA 환자의약 50% 정도가 KCNJ5의돌연변이로인하여발병한다는것을확인하였다. 이러한성과는후에특발성고 혈압환자의병인규명의한가지방법으로널리쓰일것으로기대하고있다. 2.2.c. 건강한부모와유전성질환환자자녀가족의이해또다른움직임은건강한부모에서는관찰되지않지만환자특이적으로유전성질환이발병하는경우이다. 이경우는두가지의기본가설을세울수가있다. 즉, (1) 부모에서질병원인 allele을하나씩물려받아열성인자로서질환이나타나는경우와 (2) 부모에게서는관찰되지않지만부모에서의생식세포생성, 수정단계등에서우연히생긴돌연변이 (de novo variant) 에의하여질환이나타나는경우이다. 이러한가설을시험하기위하여두부모와환자의샘플을채취, WES으로분석하는방법이가능하다. 이러한방법을이용하여자폐증, 선천성심장병과같은소아질환에이용하는연구들이최근보고되고있다. 일례로건강한부모에게서태어난선천성심장병환자가족 ( 트리오 ) 들에관한대규모연구를통하여일군의 de novo 변이들을발견하였고흥미롭게도이변이들의많은수가후생유전적인조절을하는유전자들에게서발견된다는보고가있었다 [14]. 이러한접근방법은특히복합적인선천성질환의이해에많은도움을주고있다. 전망유전체의학은 NGS라는기술적인발전과 HGP라는유전적인기반에힘입어지난 7년간비약적으로성장해왔다. 희귀질환환자의진단과병인의이해작업또한많은진보를이루어왔다 ( 그림 3). 보통 WES을통한희귀질환환자의유전적진단성공률을 30-40% 정도로생각하고있다. 그나머지의환자의경우는어느정도의가능성이있는유전자후보가있거나, 혹은별다른유전적인단서도발견되지못한경우이다. 최근의전체적인연구의발달로보다더많은유전자들이진단을위한그룹으로진입하게될것이며, 보다적극적인연구를통하여나머지단서가없는환자에대한병인탐색이가능하게될것이다. 웹진 2014 ㅣ 04 4

특 / 별 / 기 / 고 미국을비롯한주요선진국에서는정부차원의대규모희귀질환연구계획을세웠으며현재진행중이다 ( 예 : 미국의 Center for Mendelian Genomics, http://www. mendelian.org, 영국의 100k Genome Project, http:// www.genomicsengland.co.uk).

5 특 / 별 / 기 / 고 미국을비롯한주요선진국에서는정부차원의대규모희귀질환연구계획을세웠으며현재진행중이다 ( 예 : 미국의 Center for Mendelian Genomics, mendelian.org, 영국의 100k Genome Project, 한국또한현재의유전체의학의발전을통한기회를최대한으로이용하기위하여정부적인차원의체계적인희귀질환환자모집, 관리시스템, 샘플처리, 분석시스템을구축하여연구자들의효율적인 NGS 기반연구지원, 임상에서손쉽고저렴하게쓰일수있는 NGS 기반진단방법의개발, 궁극적으로는희귀질환으로고통받고있는환자, 환자가족들의삶의질의향상을위한적극적인지원을아끼지말아야할것이다. 3. Whole exome sequencing을이용한병인유전자발견추이 [15]. [ ] [1] Rommens JM, Iannuzzi MC, Kerem B, Drumm ML, Melmer G, Dean M, Rozmahel R, Cole JL, Kennedy D, Hidaka N, et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science : [2] Wheeler DA, Srinivasan M, Egholm M, Shen Y, Chen L, McGuire A, He W, Chen YJ, Makhijani V, Roth GT, Gomes X, Tartaro K, Niazi F, Turcotte CL, Irzyk GP, Lupski JR, Chinault C, Song XZ, Liu Y, Yuan Y, Nazareth L, Qin X, Muzny DM, Margulies M, Weinstock GM, Gibbs RA, Rothberg JM. The complete genome of an individual by massively parallel DNA sequencing. Nature : [3] Yngvadottir B, Macarthur DG, Jin H, Tyler-Smith C. The promise and reality of personal genomics. Genome Biol :237. [4] Ley TJ, Mardis ER, Ding L, Fulton B, McLellan MD, Chen K, Dooling D, Dunford-Shore BH, McGrath S, Hickenbotham M, Cook L, Abbott R, Larson DE, Koboldt DC, Pohl C, Smith S, Hawkins A, Abbott S, Locke D, Hillier LW, Miner T, Fulton L, Magrini V, Wylie T, Glasscock J, Conyers J, Sander N, Shi X, Osborne JR, Minx P, Gordon D, Chinwalla A, Zhao Y, Ries RE, Payton JE, Westervelt P, Tomasson MH, Watson M, Baty J, Ivanovich J, Heath S, Shannon WD, Nagarajan R, Walter MJ, Link DC, Graubert TA, DiPersio JF, Wilson RK. DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome. Nature : [5] Garraway LA, Lander ES. Lessons from the cancer genome. Cell : [6] Vogelstein B, Papadopoulos N, Velculescu VE, Zhou S, Diaz LA Jr, Kinzler KW. Cancer genome landscapes. Science : [7] Goh G, Choi M. Application of whole exome sequencing to identify disease-causing variants in inherited human diseases. Genomics Inform : [8] Choi M, Scholl UI, Ji W, Liu T, Tikhonova IR, Zumbo P, Nayir A, Bakkaloğlu A, Ozen S, Sanjad S, Nelson-Williams C, Farhi A, Mane S, Lifton RP. Genetic diagnosis by whole exome capture and 5 분자세포생물학뉴스레터

6 Molecular and Cellular Biology Newsletter massively parallel DNA sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A : [9] Ng SB, Turner EH, Robertson PD, Flygare SD, Bigham AW, Lee C, Shaffer T, Wong M, Bhattacharjee A, Eichler EE, Bamshad M, Nickerson DA, Shendure J. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature : [10] Ng SB, Buckingham KJ, Lee C, Bigham AW, Tabor HK, Dent KM, Huff CD, Shannon PT, Jabs EW, Nickerson DA, Shendure J, Bamshad MJ. Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder. Nat Genet :30-5. [11] Boyden LM, Choi M, Choate KA, Nelson-Williams CJ, Farhi A, Toka HR, Tikhonova IR, Bjornson R, Mane SM, Colussi G, Lebel M, Gordon RD, Semmekrot BA, Poujol A, Välimäki MJ, De Ferrari ME, Sanjad SA, Gutkin M, Karet FE, Tucci JR, Stockigt JR, Keppler-Noreuil KM, Porter CC, Anand SK, Whiteford ML, Davis ID, Dewar SB, Bettinelli A, Fadrowski JJ, Belsha CW, Hunley TE, Nelson RD, Trachtman H, Cole TR, Pinsk M, Bockenhauer D, Shenoy M, Vaidyanathan P, Foreman JW, Rasoulpour M, Thameem F, Al- Shahrouri HZ, Radhakrishnan J, Gharavi AG, Goilav B, Lifton RP. Mutations in kelch-like 3 and cullin 3 cause hypertension and electrolyte abnormalities. Nature : [12] Shibata S, Zhang J, Puthumana J, Stone KL, Lifton RP. Kelch-like 3 and Cullin 3 regulate electrolyte homeostasis via ubiquitination and degradation of WNK4. Proc Natl Acad Sci U S A : [13] Choi M, Scholl UI, Yue P, Björklund P, Zhao B, Nelson-Williams C, Ji W, Cho Y, Patel A, Men CJ, Lolis E, Wisgerhof MV, Geller DS, Mane S, Hellman P, Westin G, Åkerström G, Wang W, Carling T, Lifton RP. K+ channel mutations in adrenal aldosterone-producing adenomas and hereditary hypertension. Science : [14] Zaidi S, Choi M, Wakimoto H, Ma L, Jiang J, Overton JD, Romano-Adesman A, Bjornson RD, Breitbart RE, Brown KK, Carriero NJ, Cheung YH, Deanfield J, DePalma S, Fakhro KA, Glessner J, Hakonarson H, Italia MJ, Kaltman JR, Kaski J, Kim R, Kline JK, Lee T, Leipzig J, Lopez A, Mane SM, Mitchell LE, Newburger JW, Parfenov M, Pe'er I, Porter G, Roberts AE, Sachidanandam R, Sanders SJ, Seiden HS, State MW, Subramanian S, Tikhonova IR, Wang W, Warburton D, White PS, Williams IA, Zhao H, Seidman JG, Brueckner M, Chung WK, Gelb BD, Goldmuntz E, Seidman CE, Lifton RP. De novo mutations in histonemodifying genes in congenital heart disease. Nature : [15] Boycott KM, Vanstone MR, Bulman DE, MacKenzie AE. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nat Rev Genet : < 이글은본인이 서울대학교의과대학재활의학교실 30 주년및한태륜교수정년기념학술심포지엄 의종설록집에실었던글을바탕으로쓰였음을알립니다.> 저 자 약 력 최무림 서울대학교분자생물학과, 학사 서울대학교분자생물학과, 석사 Duke 대학교세포생물학과, 박사 Yale 대학교유전학과, 박사후연구원 현재서울대학교의과학과, 조교수 웹진 2014 ㅣ 04 6

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°ø±â¾Ð±â±â 20, 30, 40 20, 30, 40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3.1 6.3 9.4 12.6 15.7 18.8 22.0 25.1 28.3 31.4 2.4 4.7 7.1 9.4 11.8 14.1 16.5 18.8 21.2 23.6 7.1 14.1 21.2 28.3 35.3 42.4 49.5 56.5 63.6 70.7 5.9 11.9 17.8 23.7