신진연구자칼럼 병원성미생물검출을위한 Oligonucleotide Microarrays 의개발 신화희 포항공과대학교화학공학과박사후연구원분자생명공학연구실 (MAGIC Lab.) 2009 서강대학교화공생명공학과, 공학사 2016 포항공과

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병원성미생물검출을위한 Oligonucleotide Microarrays 의개발 신화희 포항공과대학교화학공학과박사후연구원분자생명공학연구실 (MAGIC Lab.) hwahui@postech.ac.kr 2009 서강대학교화공생명공학과, 공학사 2016 포항공과대학교화학공학과, 공학박사현재포항공과대학교화학공학과, 박사후연구원 1.

1 병원성미생물검출을위한 Oligonucleotide Microarrays 의개발 신화희 포항공과대학교화학공학과박사후연구원분자생명공학연구실 (MAGIC Lab.) 2009 서강대학교화공생명공학과, 공학사 2016 포항공과대학교화학공학과, 공학박사현재포항공과대학교화학공학과, 박사후연구원 1. 서론 식중독은오염된물이나음식물섭취로인해발생하는전염성질병으로한국에서는매년약 300건이상발생하며 6,000명이상의환자가생겨난다. 뿐만아니라세계여러나라에서식중독으로인한피해가꾸준히발생하며그로인한사회, 경제적비용이적지않다. 식중독의원인중가장높은비율을차지하는것은병원성미생물로세포나독소등을이용하여식중독질병을일으킨다 [1-3]. 병원성미생물에인해발생하는식중독의증상은보통설사, 구토, 고열, 구역질등으로경미한편이나유아나노인, 면역손상환자의경우, 위중한증세를동반하기도하며심한경우사망에이르기도한다. 따라서매년꾸준히일어나는식중독발생건수및환자수를줄이고공공위생및보건증진, 식품안전성보장등을위해서는정확하고빠르게병원성미생물을검출하여식중독을예방하는것이무엇보다중요하다. 현재식품공전에서주로사용되는전통적미생물검출법은배양기반방법으로미생물각각을개별적으로진단해야하며노동집약적이고시간이많이소요된다 (2~7일). 이를해결하기위해도입된분 자생물학적검출법에는항원-항체반응과같은면역학적원리를이용하는 fluorescent antibody나 ELISA, genetic assay인 polymerase chain reaction(pcr), in situ hybridization assay 등이있다. 이기술들은기존검출법보다빠르지만역시미생물에따른개별검출이필요하며비용이나정확성, 그리고동시진단에제약을가지고있다. 그에반해 oligonucleotide(on) microarray 기술은여러개의 capture probe를좁은면적의기판위에집적할수있어한실험으로여러개의식품유래병원성미생물을동시검출할수있으며또한정확성과민감도가높고빠르게미생물검출에있어새로운대체기술로제안되어왔다 [4, 5]. ON microarray를이용하기위해 ribosomal DNA를비롯하여 house keeping gene, virulence factor-related gene, antibiotic resistancerelated gene과같은미생물별특이적유전자등이 biomarker로써사용되고있다. 미생물을정확하게구분검출하기위해서는적절한 biomarker gene을찾아특이적 capture probe를디자인하는것이무엇보다중요하다. 본칼럼에서는병원성미생물을특이적으로검출하기위한여러 biomarker gene 기반의 ON microarray 기술들을소개하고자한다. NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 35, No. 1,

신진연구자 칼럼 2. 본론 V. vulnificus, and Y. enterocolitica )을 위한 28개 특이적 capture probes를 디자인하였으며 이를 이용하여 16종 2-1.

2 신진연구자 칼럼 2. 본론 V. vulnificus, and Y. enterocolitica )을 위한 28개 특이적 capture probes를 디자인하였으며 이를 이용하여 16종 S rdna 기반 ON microarray 개발 의 병원성 미생물을 특이적으로 검출할 수 있음을 확 Ribosomal DNA를 기반으로 한 ON microarray를 인할 수 있었다[12]. Salmonella spp., E. coli, Shigella 이용하여 병원성 미생물을 검출하고자 하는 시도들 spp.와 같은 몇몇 병원성 미생물은 매우 유사한 16S 이 많이 있어 왔다. 특히, ribosomal rrna (rrna) 중 rdna 유전자 서열을 공유하고 있어 비특이적 신호가 에서 16S rrna 유전자(16S rdna)를 이용한 연구들 비록 같이 검출되지만 각각 병원성 미생물이 가지는 이 많이 있는데 이는 16S rrna가 모든 미생물에 있으 신호 코드가 달라 이를 이용하여 충분히 구분할 수 며 미생물 계통학 분류(phylogenetic discrimination)에 있다. 개발한 16S rdna 기반 ON microarray의 민감도 주로 사용되는 유전자이기 때문이다[6-11]. 또, 16S 를 S. boydii 를 대표균주로 사용하여 측정하였으며 민 rdna는 유전자 내에 conserved sequences와 variable 감도는 PCR amplicon의 nm 농도 수준으로 sequences가 있어 미생물 특이적 capture probe와 PCR 이는 fmoles에 해당한다(12). 증폭을 위한 universal primer, 미생물 공통의 positive 또한, 16S rdna 기반 ON microarray의 실용적인 capture probe 디자인이 용이하다는 장점이 있다. 이 활용을 위해 식품으로부터 병원성 미생물 세포를 간 러한 16S rdna의 장점을 기반으로 많은 수의 병원성 단한 전처리 과정을 통해 얻고 추가적인 증폭이나 정 미생물을 검출할 수 있는 ON microarray를 개발하고 제 과정 없이 세포 파쇄물을 바로 microarray 기판에 자 하였다[그림1]. 사용하여 검출 할 수 있는 방법을 개발하고자 하였 식품 공전에서 자주 발생하는 16종의 병원성 미 다. 식품 전처리는 미생물에 오염된 8종의 식품 매트 생물(B. cereus, C. jejuni, C. perfringens, E. coli, E. 릭스별(육류, 채소류, 곡류, 유제품류, 육류 가공품, coli O157:H7, L. monocytogenes, S. enterica subsp. 수산물 가공품 등)로 적절한 rpm의 centrifugation을 통 enterica serotype Choleraesuis, S. Enteritidis, S. boydii, S. 하여 간단하게 식품 부유물을 제거하고 미생물 세포 dysenteriae, S. aureus, V. cholerae, V. parahaemolyticus, 를 얻을 수 있었다. 전처리를 통해 얻어진 세포 파쇄 그림 1. 16S rrna 기반 ON microarray[12]. 42 NICE, 제35권 제1호, 2017

3 물을 microarray 기판에바로사용하여병원성미생물을충분히검출할수있음을확인할수있었다. 그신호세기는증폭한 DNA를사용할때보다는낮은편인데이는 RNA가 DNA보다실험환경에서더불안정하기때문일것으로추측된다 [12]. 16S rdna 기반 ON microarray 검출법은빈번히발생되는여러종류의병원성미생물을특이적이고빠르게검출할수있으며세포를직접사용하여간단하면서좀더실용적으로검출에적용할수있을것이라생각된다 Double biomolecular marker(dbm) 기반 microarray 개발 Vibrio cholerae와같은미생물의경우 virulence factors 를생산함으로써심각한전염성의집단감염을일으킬수가있어미생물의병원성 (pathogenecity) 을분석하고모니터링하는것이필수적이다. 이를위해 toxin gene을포함한 virulence factor-related genes을기반으로하여미생물을검출하는 DNA microarray가연구되어왔다 [13, 14]. 하지만이런 DNA microarray 는미생물검출을하는데꽤효과적이긴하지만 genotype 분석으로한정되어있어실질적인 virulence factors 생산여부나정확한병원인자 (etiology) 를파악하기에는한계가있다. Virulence factors를검출하는방법들이또한여러가지있는데동물을이용하는 bioassays, tissue culture, coagglutination, ELISA 등으로이방법들은 virulence factors를직접표적하지만어떤미생물이존재혹은관련되어있는지알수없다. 따라서하나의검출법으로미생물과 virulence factors를동시에검출및분석을할수있는방법이필요하다. 이를위해서 DNA와당, 두개의 biomolecular marker로구성된새로운하이브리드형태의 microarray인 Double Biomolecular Markers(DBM) microarray를제안하였다 [15]. DBM microarray는콜레라전염병을일으키는 V. cholerae와 virulence factor 인 cholera toxin(ct) 를동시검출하는데적용하고자하였으며 16S rrna 기반의 DNA capture probe 는 V. cholerae 미생물자체를, CT와 interaction 하는당으로알려진 GM1 pentasaccharide를 carbohydrate capture probe로사용하여분비된 CT를검출하고자하였다 [ 그림2]. V. cholerae 세포로부터직접 genomic DNA(gDNA) 와분비된 CT를얻어이를검출표적물질로사용하였으며이는 DNA 증폭이나물질정제과정을생략할수있어표적물질들을간단하게얻을수있고검출시간을단축시킬수있다. 세포로부터직접얻어진 gdna와 CT를이용하여서로다른두개의 interactions(dna-dna, toxin-carbohydrate) 이간섭없이특이적신호를각각보이며성공적으로검출됨을확인하였다. DBM microarray의 limit of detection(lod) 는 1.7x x10 7 cells로추산하였 그림 2. Double Biomolecular marker microarray[15]. NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 35, No. 1,

4 으며이는 V. cholerae의 infectios dose인 10 8 cells 보다적은수이지만효과적인검출을위해서는 preenrichment가불가피함을알수있었다 [15]. 새롭게제안된하이브리드형태의 DBM microarray 는 oligonucleotide capture probes를이용하여미생물을검출할수있으며 GM1 pentasaccharide capture probe를이용해서는분비된 CT를검출함과동시에병원성을분석할수있다. 이는 V. cholerae 이외에도 virulence factor 분석이필요한다른병원성미생물에도추후적용할수있을것으로기대된다 살모넬라혈청형검출을위한 carb 기반 oligonucleotide microarray 개발 Salmonella는한국이나미국등여러나라에서빈번히발생하는병원성미생물로 salmonellosis라고통칭되는감염병을일으킨다. Salmonella는다른병원성미생물과다르게독특한분류체계를가지고있는데그중 S. enterica subsp. enterica는 species 중에서유일하게온혈동물에서식하여식중독의대부분의원인을차지한다. 특히, S. enterica subsp. enterica는약 1,500 개이상의혈청형 (serotype) 으로구성되어있고혈청형각각이가지는병원성, 항생제내성, 병의경중, 숙주특이성 (host-specificity) 이달라혈청형수준으로구분검출하는것이중요하다. 또한, 역학조사를위해서도필요하다 [16, 17]. 앞서언급했듯이 Salmonella serotypes과가까운미생물인 E. coli, Shigella spp. 는서로 16S rrna 유전자서열이매우유사하여 16S rdna 기반 capture probes만으로는혈청형수준까지의구분검출이현실적으로어렵다. Salmonella serotypes을특이적이고신뢰성높게구분검출할수있는새로운 biomarker gene가필요한데이를위해 carbamoyl-phosphate synthetase(cps) large subunit (carb) gene을새로운 biomarker gene으로선정하였다 [18]. 이는미생물생존에필수적인효소를인코딩하고있어모든 Salmoenlla 혈청형이가지고있으며 capture probe 디자인에용이하게 conserved and variable sequences를가지고있기때문이다. 또한이유전자를이용하여 Salmonella 분류학연구 (phylogenetic analysis) 에사용된전례들이있어 Salmonella 혈청형을구분할수있는충분한 sequence variability를가졌을것이라고추측하였다 [19-22]. CarB 유전자를기반으로 Salmonella 혈청형중빈번히발생하는주요세균주, Salmonella serotypes, Choleraesuis, Enteritidis, Typhimurium를구분검출하고자하였으며이를위해각각혈청형에특이적인 capture probes를총 6개디자인하여 ON microarray를제작하였다 [ 그림3]. Universal primer를이용하여증폭시킨 carb-amplicons을이용하여세혈청형을특이적으로구분검출할수있음을확인하였으며 LOD 는 1.6~3.1 nm로측정되었다 [18]. 또한, 계통학적으로 Salmonella spp. 와가깝다고알려진 E. coli나 Shigella spp. 를포함한다른병원성미생물의 PCR amplicons 을사용하였을때에도비특이적신호가생성되지않았다. 또한다른미생물들속에 Salmonella가섞여있을때에도혼선없이성공적으로검출되는것또한확인하였다. 3. 결론 본컬럼에서병원성미생물을효과적, 선택적이며정확하게병원성미생물을검출할수있는여러가지 detecton biomarker를사용한 ON microarray 검출법을소개하였다. 16S rdna 기반 ON microarray 검출법은흔하게발생하는여러개의병원성미생물을오염된음식물로부터효과적으로검출할수있었으며실용적적용을위해오염된음식물의간단한전처리과정을통해미생물세포를얻어바로검출법에적용할수있었다. DNA 기반그리고당기반의 capture probes를같이도입하여병원성미생물과미생물이분비하는독소를검출하고미생물의병원성을동시에분석할수있는 DBM microarray를새롭게제안했다. 또한, Salmonella enterica subsp. enterica의주요세혈청형을구분검출하기위해서새로운 detection biomarker gene으로 carb를선정하고이를기반으로한 ON microarray가혈청형을정확하게구분검출할 44 NICE, 제 35 권제 1 호, 2017

5 신진연구자 칼럼 그림 3. 살모넬라 혈청형 검출을 위한 carb 기반 ON microarray[18]. 수 있음을 확인하였다. 이 유전자는 또한 16S rdna 유전자 서열만으로는 구분하기 어려운 미생물 species 나 strain 검출에도 확장되어 사용할 수 있을 것으로 기대된다. ON microarray를 병원성 미생물 검출에 적용하기 위해서는 소개된 연구들에서처럼 적절한 biomarker gene을 선정하여 정확한 미생물 구분 검출을 하는 것 이 중요하다. 이 뿐만 아니라, 충분히 낮은 수의 미 생물을 검출할 수 있어야하기 때문에 ON microarray 의 민감도를 좀 더 증가시킬 수 있는 연구와 음식물 이나 감염된 환자의 혈액 샘플 등에서부터 효과적으 로 미생물을 샘플링하거나 획득할 수 있는 방법에 관 한 연구 또한 필요하다. 이런 연구들을 바탕으로 ON microarray 검출 기술이 좀 더 향상되면 정확하고 민 감하게 병원성 미생물을 검출할 수 있을 것이며 실제 검출 현장에 적용할 수 있을 것으로 기대한다. 참고문헌 1. Korean Ministry of Food and Drug Safety. The statistic system for foodborne disease. Available from grp=menu_grp02 (2015). 2. Centers for Disease Control and Prevetion. Surveillance for foodborne disease outbreaks, United States, Annual report. US Department of Health and Human Services, CDC, Atlanta, Georgia, USA (2012). 3. A. J. Linscott, Clin Microbiol Newsl 33, 41 (2011). 4. V. Chizhikov, A. Rasooly, K. Chumakov, and D. Levy, Appl Environ Microbiol 67, 3258 (2011). 5. D. R. Call, M. K. Borucki, and F. J. Loge, J Microbiol Methods 53, 235 (2003). 6. K. Rudi, O. M. Skulberg, R. Skulberg, and K. S. Jakobsen, Appl Environ Microbiol 66, 4004 (2000). 7. H. S. Eom, B. H. Hwang, D. H. Kim, I. B. Lee, Y. H. Kim, and H. J. Cha, Biosens Bioelectron 22, 845 (2007). 8. X. W. Wang, L. Zhang, L. Q. Jin, M. Jin, Z. Q. Shen, S. An, F. H. Chao, and J. W. Li, Appl Microbiol Biotechnol 76, 225 (2007). 9. P. Cremonesi, G. Pisoni, M. Severgnini, C. Consolandi, P. Moroni, M. Raschetti, and B. Castiglioni, J Dairy Sci 92, 3027 (2009) 10. B. H. Hwang, and H. J. Cha, Biotechnol Bioeng 106, 183 (2010). 11. B. H. Hwang, H. H. Shin, J. H. Seo, and H. J. Cha, Anal Chem 84, 4873 (2012). 12. H. H. Shin, B. H. Hwang, and H. J. Cha, Biotechnol J 11, 1405 (2016). 13. D. Jin, H. Qi, S. Chen, T. Zeng, Q. Liu, and S. J. Wang, J Microbiol Methods 75, 365 (2008). 14. Y. You, C. Fu, X. Zeng, D. Fang, X. Yan, B. Sun, D. Xiao, J. Zhang, J Microbiol Methods 75, 566 (2008). 15. H. H. Shin, J. H. Seo, C. S. Kim, B. H. Hwang, and H. J. Cha, Biosens Bioelectron 79, 398 (2016). 16. K. Chan, S. Baker, C. C. Kim, C. S. Detweiler, G. Dougan, S. Falkow, J Bacteriol 185, 553 (2003). 17. G. A. Grassl and B. B. Finlay, Curr Opin Gastroen-terol 24, 22 (2008). 18. H. H. Shin, B. H. Hwang, J. H. Seo, and H. J. Cha, Appl Environ Microbiol 80, 366 (2014). 19. H. Nyunoya and C. J. Lusty, Proc Natl Acad Sci USA 80, 4629 (1983). 20. J. Hong, W. L. Salo, C. J. Lusty, and P. M. Anderson, J Mol Biol 243, 131(1994). 21. F. S. Lawson, R. L. Charlebois, and J. A. Dillon, Mol Biol Evol 13, 970 (1996). 22. F. Javid-Majd, L. S. Mullins, F. M. Raushel, and M. A. Stapleton, J Biol Chem 275, 5073 (2000). NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 35, No. 1,

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PDFCoTemp.HWP 국립수의과학검역원 고시 제2010-2호 축산물가공처리법 제4조제2항의 규정에 의거 축산물의가공기준및성분규격을 다음과 같이 개정 고시합니다. 2010년 4월 7일 국립수의과학검역원장 축 산 물 의가 공 기 준 및 성 분 규 격 제1조(목적) 이 고시는 축산물가공처리법(이하 법 이라 한다) 제4조제2항의 규정에 의하여 축산물의 가공기준 및 성분규격을 규정함으로써