공개특허 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2012년10월24일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 31/454 ( ) A6

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2012년10월24일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 31/454 ( ) A61K 31/506 ( ) A61K 31/675 ( ) A61P 35/00 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 ( 국제 ) 2010 년 12 월 01 일 심사청구일자 없음 (85) 번역문제출일자 2012 년 07 월 03 일 (86) 국제출원번호 PCT/US2010/ (87) 국제공개번호 WO 2011/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 2011 년 06 월 09 일 12/630, 년 12 월 04 일미국 (US) 전체청구항수 : 총 52 항 (71) 출원인 아보트러보러터리즈 미국일리노이주 아보트파크아보트파크로드 100 디파트먼트 377 빌딩에이피 6 에이 -1 (72) 발명자 샤오마르자밀 미국일리노이주 레이크빌라더블유. 컬럼비아베이드라이브 선위 미국일리노이주 거니부캐넌드라이브 7227 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 장훈 (54) 발명의명칭암치료용병용치료요법및이에사용하기위한진단검사 (57) 요약 본원명세서의교시내용은암으로고생하는환자를치료하는데사용하기위한치료제의병용물에관한것이며, 여기서상기병용물은적어도하나의다배수유도제및적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제를포함한다. 또한, 본원명세서의교시내용은또한하나이상의치료제로치료하기위한환자의분류시유용한진단검사에관한것이다. 대표도 - 도 1-1 -

2 (72) 발명자 린샤오야 미국일리노이주 거니올드월넛서클 앤더슨마크 미국일리노이주 그레이슬레이크서머셋드라이브 410 후앙샤올리 미국일리노이주 레이크블러프메도서클 리쥔링 미국일리노이주 거니비스타드라이브 1220 리레이밍 미국일리노이주 버펄로그로브게일드라이브

3 특허청구의범위청구항 1 암으로고생하는환자를치료하는방법으로서, 상기방법은 a) 암으로고생하는환자에게치료학적유효량의적어도하나의다배수유도제 (polyploidy inducing agent) 를투여하는단계 ; 및 b) 상기환자에게치료학적유효량의적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제를투여하는단계를포함하는, 암으로고생하는환자를치료하는방법. 청구항 2 제1항에있어서, 상기적어도하나의다배수유도제가아우로라키나제억제제 (Aurora kinase inhibitor) 인, 방법. 청구항 3 제2항에있어서, 상기아우로라키나제억제제가아우로라키나제 B 억제제인, 방법. 청구항 4 제3항에있어서, 상기아우로라키나제 B 억제제가 VX-680, AZD1152, ZM44739 또는헤르스페라딘 (Hersperadi n) 인, 방법. 청구항 5 제1항에있어서, 상기 Bcl-2 계열단백질억제제가 ABT-263, ABT-737, Bcl-X L 선택적억제제또는이들의병용물인, 방법. 청구항 6 암으로고생하는환자를치료하는데사용하기위한치료제들의병용물로서, 상기병용물은 a) 상기환자에서하나이상의암세포에서다배수체화 (polyploidization) 를유도하는데사용하기위한적어도하나의다배수유도제 ; 및 b) 적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제를포함하는, 암으로고생하는환자를치료하는데사용하기위한치료제들의병용물. 청구항 7 제6항에있어서, 상기적어도하나의다배수유도제가아우로라키나제억제제인, 병용물. 청구항 8 제7항에있어서, 상기아우로라키나제억제제가아우로라키나제 B 억제제인, 병용물. 청구항 9 제8항에있어서, 상기아우로라키나제 B 억제제가 VX-680, AZD1152, ZM44739 또는헤르스페라딘인, 병용물. 청구항 10 제6항에있어서, 상기 Bcl-2 계열단백질억제제가 ABT-263, ABT-737, Bcl-X L 선택적억제제또는이들의병용물인, 병용물. 청구항

4 다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물로치료하기에적격인환자를분류하는방법으로서, 상기방법은 a) 환자로부터의시험시료를제공하는단계 ; b) 시험시료속의 BAX 유전자, BAK 유전자또는 NOXA 유전자로이루어진그룹에서선택된적어도하나의유전자에서의적어도하나의돌연변이의존재또는부재를측정하는단계 ; 및 c) 단계 b) 에서측정한적어도하나의돌연변이의존재또는부재에기초하여다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물을사용하는치료를제공받기에적격인것으로상기환자를분류하는단계를포함하는, 다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물로치료하기에적격인환자를분류하는방법. 청구항 12 제11항에있어서, 상기다배수유도제가아우로라키나제억제제인, 방법. 청구항 13 제12항에있어서, 상기아우로라키나제억제제가아우로라키나제 A 억제제, 아우로라키나제 B 억제제, 아우로라키나제 C 억제제또는이들의병용물인, 방법. 청구항 14 제13항에있어서, 상기아우로라키나제억제제가아우로라키나제 B 억제제인, 방법. 청구항 15 제14항에있어서, 상기아우로라키나제 B 억제제가 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는헤르스페라딘인, 방법. 청구항 16 제11항에있어서, 상기 Bcl-2 계열단백질억제제가 ABT-263, ABT-737, Bcl-X L 선택적억제제또는이들의병용물인, 방법. 청구항 17 제11항에있어서, 상기시험시료가조직시료를포함하는, 방법. 청구항 18 제17항에있어서, 상기조직시료가말초혈액시료, 종양조직또는의심되는종양조직, 박층세포학적시료, 미세침흡인시료, 골수시료, 림프절시료, 뇨시료, 복수액시료, 세척액시료, 식도브러싱시료, 방광또는폐세척액시료, 척수액시료, 뇌유액시료, 관흡인시료, 유두분비물시료, 흉막삼출액시료, 새로이동결된조직시료, 파라핀봉매된조직시료 ; 또는말초혈액시료, 종양조직또는의심되는종양조직, 박층세포학적시료, 미세침흡인시료, 골수시료, 뇨시료, 복수액시료, 세척액시료, 식도브러싱시료, 방광또는폐세척액시료, 척수액시료, 뇌유액시료, 관흡인시료, 유두분비물시료, 흉막삼출액시료, 새로이동결된조직시료또는파라핀봉매된조직시료중어느것으로부터생산된추출물또는가공된시료를포함하는, 방법. 청구항 19 제11항에있어서, 상기측정단계 (b) 가동소하이브리드화에의해수행되는, 방법. 청구항 20 제19항에있어서, 상기동소하이브리드화가형광성표지된핵산프로브를사용하여수행되는, 방법

5 청구항 21 제20항에있어서, 상기동소하이브리드화가적어도 2개의핵산프로브를사용하여수행되는, 방법. 청구항 22 제20항에있어서, 상기동소하이브리드화가펩타이드핵산프로브를사용하여수행되는, 방법. 청구항 23 제11항에있어서, 상기측정단계 (b) 가폴리머라제쇄반응에의해수행되는, 방법. 청구항 24 제11항에있어서, 상기환자가또한화학치료요법, 방사선또는이들의조합으로치료되는, 방법. 청구항 25 암으로고생하는환자를모니터링하고다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물로치료하는방법으로서, 상기방법은 a) 암으로고생하며현재적어도하나의다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물로현재치료중인환자로부터의시험시료를제공하는단계 ; b) 상기시험시료속의 BAX 유전자, BAK 유전자또는 NOXA 유전자로이루어진그룹에서선택된적어도하나의유전자에서의적어도하나의돌연변이의존재또는부재를측정하는단계 ; 및 c) 단계 b) 에서측정한적어도하나의돌연변이의존재또는부재에기초하여, 상기환자가다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물로계속치료받아야하는지를결정하는단계를포함하는, 암으로고생하는환자를모니터링하고다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물로치료하는방법. 청구항 26 제25항에있어서, 상기다배수유도제가아우로라키나제억제제인, 방법. 청구항 27 제26항에있어서, 상기아우로라키나제억제제가아우로라키나제 A 억제제, 아우로라키나제 B 억제제, 아우로라키나제 C 억제제또는이들의병용물인, 방법. 청구항 28 제27항에있어서, 상기아우로라키나제억제제가아우로라키나제 B 억제제인, 방법. 청구항 29 제28항에있어서, 상기아우로라키나제 B 억제제가 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는헤르스페라딘인, 방법. 청구항 30 제25항에있어서, 상기 Bcl-2 계열단백질억제제가 ABT-263, ABT-737, Bcl-X L 선택적억제제또는이들의병용물인, 방법. 청구항 31 제25항에있어서, 상기시험시료가조직시료를포함하는, 방법. 청구항

6 제31항에있어서, 상기조직시료가말초혈액시료, 종양조직또는의심되는종양조직, 박층세포학적시료, 미세침흡인시료, 골수시료, 림프절시료, 뇨시료, 복수액시료, 세척액시료, 식도브러싱시료, 방광또는폐세척액시료, 척수액시료, 뇌유액시료, 관흡인시료, 유두분비물시료, 흉막삼출액시료, 새로이동결된조직시료, 파라핀봉매된조직시료 ; 또는말초혈액시료, 종양조직또는의심되는종양조직, 박층세포학적시료, 미세침흡인시료, 골수시료, 뇨시료, 복수액시료, 세척액시료, 식도브러싱시료, 방광또는폐세척액시료, 척수액시료, 뇌유액시료, 관흡인시료, 유두분비물시료, 흉막삼출액시료, 새로이동결된조직시료또는파라핀봉매된조직시료중어느것으로부터생산된추출물또는가공된시료를포함하는, 방법. 청구항 33 제25항에있어서, 상기측정단계 (b) 가동소하이브리드화에의해수행되는, 방법. 청구항 34 제33항에있어서, 상기동소하이브리드화가형광성표지된핵산프로브를사용하여수행되는, 방법. 청구항 35 제33항에있어서, 상기동소하이브리드화가적어도 2개의핵산프로브를사용하여수행되는, 방법. 청구항 36 제33항에있어서, 상기동소하이브리드화가펩타이드핵산프로브를사용하여수행되는, 방법. 청구항 37 제25항에있어서, 상기측정단계 (b) 가폴리머라제쇄반응에의해수행되는, 방법. 청구항 38 제25항에있어서, 상기환자가또한화학치료요법, 방사선또는이들의조합으로치료되는, 방법. 청구항 39 환자를다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물을사용하는치료에대해내성인암을가진것으로분류하는방법으로서, 상기방법은 a) 암으로고생하는환자로부터의시험시료를제공하는단계 ; b) 시험시료속의 BAX 유전자, BAK 유전자또는 NOXA 유전자로이루어진그룹에서선택된적어도하나의유전자에서의적어도하나의돌연변이의존재또는부재를측정하는단계 ; 및 c) 단계 b) 에서측정된적어도하나의돌연변이의존재또는부재에기초하여, 상기환자를다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물을사용하는치료에대해내성인암을가진것으로분류하는단계를포함하는, 환자를다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물을사용하는치료에대해내성인암을가진것으로분류하는방법. 청구항 40 제39항에있어서, 상기다배수유도제가아우로라키나제억제제인, 방법. 청구항 41 제40항에있어서, 상기아우로라키나제억제제가아우로라키나제 A 억제제, 아우로라키나제 B 억제제, 아우로라키나제 C 억제제또는이들의병용물인, 방법. 청구항

7 제41항에있어서, 상기아우로라키나제억제제가아우로라키나제 B 억제제인, 방법. 청구항 43 제42항에있어서, 상기아우로라키나제 B 억제제가 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는헤르스페라딘인, 방법. 청구항 44 제39항에있어서, 상기 Bcl-2 계열단백질억제제가 ABT-263, ABT-737, Bcl-X L 선택적억제제또는이들의병용물인, 방법. 청구항 45 제39항에있어서, 상기시험시료가조직시료를포함하는, 방법. 청구항 46 제45항에있어서, 상기조직시료가말초혈액시료, 종양조직또는의심되는종양조직, 박층세포학적시료, 미세침흡인시료, 골수시료, 림프절시료, 뇨시료, 복수액시료, 세척액시료, 식도브러싱시료, 방광또는폐세척액시료, 척수액시료, 뇌유액시료, 관흡인시료, 유두분비물시료, 흉막삼출액시료, 새로이동결된조직시료, 파라핀봉매된조직시료 ; 또는말초혈액시료, 종양조직또는의심되는종양조직, 박층세포학적시료, 미세침흡인시료, 골수시료, 뇨시료, 복수액시료, 세척액시료, 식도브러싱시료, 방광또는폐세척액시료, 척수액시료, 뇌유액시료, 관흡인시료, 유두분비물시료, 흉막삼출액시료, 새로이동결된조직시료또는파라핀봉매된조직시료중어느것으로부터생산된추출물또는가공된시료를포함하는, 방법. 청구항 47 제39항에있어서, 상기측정단계 (b) 가동소하이브리드화에의해수행되는, 방법. 청구항 48 제47항에있어서, 상기동소하이브리드화가형광성표지된핵산프로브를사용하여수행되는, 방법. 청구항 49 제47항에있어서, 상기동소하이브리드화가적어도 2개의핵산프로브를사용하여수행되는, 방법. 청구항 50 제47항에있어서, 상기동소하이브리드화가펩타이드핵산프로브를사용하여수행되는, 방법. 청구항 51 제39항에있어서, 상기측정단계 (b) 가폴리머라제쇄반응에의해수행되는, 방법. 청구항 52 제39항에있어서, 상기환자가또한화학치료요법, 방사선또는이들의조합으로치료되는, 방법. 명세서 [0001] 기술분야본원은 2005년 9월 20일자로출원된미국가특허원제60/718,618호및 2005년 5월 12일자로출원된미국가특허원제60/680,107호에대한우선권을청구하는, 2006년 5월 12일자로출원되어, 현재미국특허제7,390,799호인, 미국특허원제11/432,937호의분할출원인, 2008년 5월 15일자로출원된미국특허원제 12/120,914호의부분-연속출원이다

8 [0002] [0003] 기술분야본원명세서의교시내용은암으로고생하는대상체환자를치료하는데사용하기위한치료제의병용물 (combination) 에관한것이다. 당해병용물은 (1) 적어도하나의다배수유도제 (polyploidy inducing agent); 및 (2) 적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제를포함한다. 또한, 본원명세서의교시내용은또한다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물을사용하여치료하기위해환자를분류하는데유용한진단검사에관한것이다. 특히, 본원명세서의교시내용은 BAX 유전자, BAK 유전자또는 NOXA 유전자내에서적어도하나의돌연변이의존재또는부재를확인한후다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물을사용한치료를제공받기에적격인것으로환자를분류하는것에관한것이다. [0004] 배경기술항-세포자멸사 Bcl-2 계열단백질구성원은다수의질환과관련되어있으므로강력한치료용약물표적으로연구중에있다. 중재치료요법 (interventional thearpy) 을위한이들중요한표적은예를들면, 단백질 Bcl-2, Bcl-X L 및 Bcl-w의 Bcl-2 계열을포함한다. 최근에 Bcl-2 계열구성원의억제제는문헌 ( 참조 : 예를들면, WO 2005/049594, Oltersdorf, et. al., Nature, 435: (2005), 미국특허제6,720,338호및미국특허제 7,030,115호 ) 에보고되어있다. 당해문헌이표적단백질에대해높은결합을갖는억제제를교시하고있지만, 이는, 화합물이추가의또는연속된약물개발을위해연구되고있는것으로고려되어야만하는많은매개변수중단지하나이다. 이러한개발의일부로서, 경구투여후암의동물모델에서효과적인화합물을생산하는것이매우바람직하다. 이러한경구효능을달성하기위해, 화합물이연구하에서종양유형또는세포주에대해강력한활성을나타낼뿐아니라, 경구투여후전신계적노출의허용가능한수준을달성하여야만하는것은당해분야에잘공지되어있다. 화합물의세포활성의대표적인척도는 50% 세포효과 (EC 50 ) 를유발하는농도이다. 전신계적노출의대표적인척도는경구투여후혈장화합물농도를시간에대해그래프화한후생성되는곡선하영역 (AUC) 이다. 이들매개변수 (AUC/EC 50 ) 사이의비는당해분야에서경구효능을예측하기위한유용한약력학적매개변수를구성하는것으로잘공지되어있다. [0005] 하나의국면에서, 본원명세서의교시내용은동물에서경구투여후세포효능및전신계적노출과관련하여향상되고예측불가능한특성을입증하는일련의할로알킬설포닐아릴유사체에관한것이다. 상세하게는, 본원명세서의교시내용의화합물은강력한세포효능을유지하는한편동물에대해경구투여후적합한전신계적노출을나타낸다. 이는당해분야에교시된화합물의것보다유의적으로더높은 AUC/EC 50 비를생성한다. 본원 명세서의교시내용의다른국면들은본원명세서에교시되어있고명백하다. [0006] 도면의간단한설명 도면의간단한설명 도 1은 B-세포림프종에대한실시예 1의화합물, 에토포시드및이들의병용물의비교된항종양발생을도시한다. 도 2는 B-세포림프종에대한실시예 1의화합물, 빈크리스틴및이들의병용물의비교된항종양발생을도시한다. 도 3은 B-세포림프종에대한실시예 1의화합물, CHOP 및이들의병용물의비교된항종양발생을도시한다. 도 4는 B-세포림프종에대한실시예 1의화합물, 리툭시마브및이들의병용물의비교된항종양발생을도시한다. 도 5는 B-세포림프종에대한실시예 1의화합물, 라파마이신및이들의병용물의비교된항종양발생을나타낸다. 도 6은외투세포림프종 (mantle cell lymphoma) 에대한실시예 1의화합물, R-CHOP 및이들의병용물의비교된항종양발생을도시한다. 도 7은외투세포림프종에대한실시예 1의화합물, 보르테조미브및이들의병용물의비교된항종양발생을도시한다

9 도 8은, BH3 모사체 ABT-263 및판-아우로라 (pan-aurora) 억제제 VX-680이상승적으로치명적격을나타낸다. 도 8a는, VX-680이, 19개의다른화학치료제와병용된단일의고정된투여량 (1μM) 에서, 각종고형악성종양으로부터기원한 7개의세포주의패널에서 6-pt 투여량-반응에서스크리닝되었음을나타낸다. 세포생존능은병용물요법에대한노출후 3일째에측정하였다. 약물병용물의상승작용또는길항작용은약물-약물상호작용의블리스어디티비즘모델 (Bliss additivism model) 을사용하여측정하였다 [ 참조 : Berenbaum, M. C., Cancer Res 35, (1981)]. 각각의투여량에대한과도한블리스어디티비즘에있어서의값을모든병용물에대해측정하고다음과같이정의하였다 : >15= 상승적, 0-15= 상호작용없음, <-15= 길항적. 이들값은 SPOTFIRE (TIBCO ) 데이타분석소프트웨어를사용하여열지도 (heatmap) 로나타내며, 여기서상승작용은적색으로, 상호작용없음은회색으로, 및길항작용은청색으로표시한다. 각각의투여량반응은 VX-680 단독 (0 μm 병용화합물 ) 에대한점 (point) 을포함하였다. 이들값들은블리스분석에적용가능하지않으므로열지도로부터배제되었다. 함께시험한화합물은우측에나타낸다. 이들제제각각의작용의표적 / 메카니즘및병용물스크린에대한상응하는투여량반응은실시예 40에서표 a에요약한다. 도 8b는 D54MG, HCT116, SW620, A549, PC3, 및 EJ1 세포에서투여량-반응에있어 ABT-263과병용물된 VX-680에대한세포생존능측정의블리스분석을나타낸다. 도 8c는도 8b에서분석된세포생존능측정을나타낸다. 도 9는, 아우로라 B 및 Bcl-X L 의억제가상승적세포독성에충분함을나타낸다. 도 9a는, HCT116 결장암종세포가루시퍼라제, 아우로라 A, 또는아우로라 B sirna 각각으로형질감염되거나형질감염되지않음을나타낸다. 형질감염후 24시간째에, 세포를투여량반응에있어서 ABT-263으로처리하고, 세포생존능을 ABT-263을첨가한후 72 시간째에측정하였다. 도 8b는, HCT116 용해물의면역블롯이도 9a에서사용된 sirna로형질감염후 72시간째에표적단백질의녹다운을입증하였음을나타낸다. MLN8054( 도 9c) 또는 AZD1152( 도 9d) 를 HCT116 세포에서 DMSO 또는 1μM ABT-263과병용하여시험하였다. 세포생존능을처리후 72시간째에측정하였다. 도 8e는, HCT116 용해물의면역블롯이감염후 72시간째에 Bcl-2, Bcl-X L, 및 Mcl-1의녹다운을입증하였음을나타낸다. EJ1( 도 9f) 또는 HCT116( 도 9g) 세포를도 9e에서와같이 Bcl-2, Bcl-X L, 또는 Mcl-1 sirna에대한루시퍼라제 sirna 또는동일한세트의 sirna로형질감염시켰다. 형질감염후 24시간째에, 세포들을상이한양들의 AZD1152로처리하였다. 세포생존능을 AZD1152에노출시킨후 72시간째에측정하였다. 도 9h는, HCT116 세포가아우로라 B 또는 Bcl-X L sirna들의상이한양으로개별적으로또는조합되어형질감염되었음을나타낸다. 세포생존능을형질감염후 72시간째에측정하였다. 모든도면에서, 세포생존능은형질감염되지않은, DMSO-처리된대조군세포에대한퍼센트로나타내었다. 적색생존능곡선은상승적병용물을나타낸다. 도 10은, 다배수체화 (polyploidization) 가세포 Bcl-X L 의존성이되도록함을나타낸다. 도 10a는, HCT116 세포가 INCENP 또는 Bcl-X L sirna로투여량-반응으로개별적으로또는조합되어형질감염되었음을나타낸다. 세포생존능은형질감염후 72시간째에측정하였다. 적색곡선은상승적병용물을나타낸다. 도 10b는, HCT116 용해물의면역블롯이도 10a에서와동일한 sirna로형질감염시킨후 72시간째에 INCENP의녹다운을입증하였음을나타낸다. HCT116 세포 ( 도 10c 내지도 10f) 를 24시간동안 DMSO 또는 200 nm AZD1152로처리하였다. 이후에, AZD1152를배양배지 (AZD 1152) 에두거나배지를약물이없는성장배지 (AZD 1152 세척제거 ) 로교체함으로써세척하였다. 세포를추가로 72시간동안배양한후다음처리 / 분석에적용시켰다 : p53, 포스포릴화된 (pser 10 ) 및포스포릴화되지않은히스톤 H3의양을측정하기위한웨스턴분석 ( 도 10c), 또는세척제거와상관없이, AZD1152 처리된세포에서현저하게증가된세포크기및다핵화와같은다배수의형태학적신호를나타내기위한상대조영상 ( 도 10d), 1μM ABT-263의 4시간동안처리 ( 도 10e) 와카스파제-3 활성에대한검사, 및 1 μm ABT-263을사용한 24시간동안의추가의처리 ( 도 10f) 와세포생존능에대한검사. 도 11은다배수체화동안 Bcl-2 네트웍 (network) 의조정을나타낸다. HCT116 세포 ( 도 11a) 를 DMSO 또는 200 nm AZD1152로 72시간동안처리한후 2시간째에 1μM ABT-263로처리하였다. 구조적으로활성인 BAK 또는 BAX 를면역침전시키고면역블롯팅으로검출하였다. D54MG 및 HCT116 세포 ( 도 11b) 를 DMSO 또는 200 nm AZD1152로 72시간동안처리한후 1μM ABT-263을 4시간동안첨가하였다. 구조적으로활성인 BAK 또는 BAX를면역침전시키고면역블롯팅 ( 상부및중간패널 ) 으로검출하였다. 세포용해물을또한분획화하고시토졸 (cytosol) 분획내로사이토크롬 C의방출을면역블롯팅으로검출하였다. HCT116, SW620, 및 D54MG 세포 ( 도 11c) 를 DMSO( 처리되지않음 ) 또는 200 nm AZD1152(AZD1152) 로 72시간동안처리하고 Bcl-2 네트웍성분들의발현을면역블롯팅으로검출하였다 ( 도 11d 내지도 11e). HCT116 세포를도 11b에서와같이처리하였다. 내인성 Bcl-X L 및 Mcl-1을면역침전시키고, 면역복합체내 Bcl-2 네트웍성분들은면역블롯팅으로검출하였다

10 도 12는, Bcl-2 네트웍이다배수체세포에서 Bcl-X L " 중독 " 및다배수체화-매개된세포자멸사에요구됨을나타낸다. 도 12a는, sirna 표적화 Bcl-2 네트웍성분들의주목된라이브러리가 HCT116 세포내로개개올리고로서형질감염되었음을나타낸다. EJ1 및 DLD1 세포 ( 도 12b) 를개개의 NOXA sirna 또는 BAX 및 BAK sirna를함께사용하여형질감염시켰다. 도 12a 및도 12b 둘다에서, 형질감염후 24시간째에, 세포를 200 nm AZD1152로처리하여다배수를유도시켰다. AZD1152 첨가후 72시간째에, 세포를 1μM ABT-263으로처리하고세포생존능을 ABT-263의첨가후 24시간째에측정하였다. HCT116 세포 ( 도 12c 및도 12d) 를대조군, 비표적화 sirna 또는 NOXA sirna로형질감염시켰다. 형질감염후 24시간째에, 세포를 200 nm AZD1152로 72시간동안처리하였다. 이후에, 1μM ABT-263을 2시간동안가한후세포용해및 Bcl-X L 또는 Mcl-1을면역침전시켰다. HCT116( 도 12e) 세포를도 12a에서와같이주목된 sirna 라이브러리로형질감염시키고, 형질감염후 24시간째에세포를 200 nm AZD1152로처리하여다배수를유도하였다. AZD1152는배지를약물-유리된성장배지로 AZD1152의첨가후 3 및 7일째에교체하여세척하였다. 세포생존능을 AZD1152의첨가후 10일째에측정하여다배수체화-유도된치사율을평가하였다. 도 13은, ABT-263 및 AZD1152가생체내에서상승적인종양성장억제를생산함을나타낸다. 도 13a는실시예 40에서나타낸바와같이, 비히클, ABT-263, AZD1152, 또는 AZD1152과 ABT-263의병용물의투여시마우스에서 HCT116 종양의성장곡선을나타낸다. CT116 종양을지닌마우스 ( 도 13b) 를비히클또는 AZD 1152(100 mg/kg/ 일 ( 이후 "mkd", IP, QD로칭함 ) 로 3 연속일동안처리한후비히클또는 ABT-263(75 mkd, PO) 을투여하였다. ABT-263을투여한후 4시간및 8시간째에, 종양을수집하고, 종양용해물을 p53 및구조적으로활성인 BAX( 활성인 BAX를특이적으로검출하는항체인, 6A7로 IP에이어서 BAX 면역블롯팅 ) 의풍부성에대해분석하였다. 도 13c는다배수체세포에서 Bcl-X L " 중독 " 및 ABT-263에대한민감성에대한모델을나타낸다. 다배수체화는 Mcl-1 단백질을하향조절하고, NOXA를유도하고, NOXA와 Mcl-1의상호작용을증가시키거나, 이들효과의일부조합물에의해 Mcl-1을기능적으로중화시킨다. 또한, Bcl-X L 은 tbid 및 BIK와같은 BH3-유일한단백질에의해부하된다. 이는 Bcl-X L 에의존하여세포생존이증가되도록한다. 이러한의존성또는 " 중독 " 은 Bcl-X L 의항- 세포자멸사기능을불가능하게하고, 다배수종양세포에서신속하고강력한세포자멸사를유발하는, ABT-263과같은다배수체화의분자결점 (Achilles' heel) 을나타낸다. 도 14는종양세포주에서 BAK 및 BAX 활성화를나타낸다. D54MG, SW620, 및 EJ1 세포를도 17b에서와같이처리하였다. 구조적으로활성인 BAK 및 BAX를면역침전시키고면역블롯팅으로검출하였다. 도 15는 Bcl-2 네트웍에서유전자발현변화를나타낸다. D54MG, SW620, 및 HCT116 세포를 72시간동안 200 nm AZD1152, 250 nm MLN8054, 또는 1μM VX-680으로처리하였다. 당해처리는후속적인세포아우로라선택성 : 아우로라 B, 아우로라 A, 또는판-아우로라 (pan-aurora) 를각각생성한다. Bcl-2 네트웍에서유전자발현변화를마이크로어레이로검출하였다. 이들데이타는 SPOTFIRE (TIBCO ) 데이타분석소프트웨어를사용하여연관성유사성측정을사용하여계층적으로군집화하였다. 도 16은 Bcl-X L 및 Mcl-1 상호작용체 (interactome) 의확인을나타낸다. 도 17a는나타낸 Bcl-X L 및 Mcl-1 상호작용인자를확인하기위한작업의흐름도를나타낸다. HCT116 세포는 200 nm AZD1152, 1μM ABT-263 또는병용물로처리하거나처리하지않는다. 내인성 Bcl-X L 및 Mcl-1을면역침전시키고, 면역침전된단백질을겔내트립신분해및 LC-MS/MS에적용시킨다. 모든처리조건으로부터확인된단백질을 Bcl-X L 및 Mcl-1 상호작용인자로서단일목록으로통합하고수동작제된 Bcl-2 네트웍맵에적용한다. 상호작용은녹색으로나타낸다. 상호작용성분들을후속적으로공-면역침전및면역블롯팅 ( 도 17b 및도 17c) Bcl-X L 및 Mcl-1 상호작용인자로확인하였다. 도 18은 Bcl-2 네트웍성분의 sirna-매개된녹다운을나타낸다. HCT116 세포를나타낸바와같이 sirna로형질감염시켰다. 형질감염시킨지 24시간째에, 세포를 200 nm AZD1152로처리하고, 용해물을 72시간후에제조하고면역블롯팅으로분석하였다. Ral-A는로딩대조군및 sint, 표적화되지않은, 대조군 sirna로서제공한다. 도 19는다배수체화-매개된세포자멸사의시간-경과를나타낸다. HCT116 세포를 200 nm AZD1152로처리하고, 세포생존능을나타낸시간과정에걸쳐측정하였다. 도 20은, Mcl-1이 ABT-263에대한다배수체세포의감작화에있어서 NOXA에대해상위임을나타낸다. HCT116 세포 ( 도 20a) 를 sirna로나타낸바와같이형질감염시켰다. 형질감염후 24시간째에, 세포를 200 nm AZD

11 로추가로 72시간동안처리하였다. 이후에, 세포를 4시간동안 1μM ABT-263으로처리하고, 카스파제-3 활성을측정하였다. HCT116 세포 ( 도 20b) 를나타낸바와같이 sirna로형질감염시켰다. 형질감염후 24시간째에, 세포를 200 nm AZD1152로추가로 72시간동안처리하였다. 이후에, 세포를 24시간동안 1μM ABT-263으로처리하고, 세포생존능을측정하였다. [0007] [0008] [0009] 발명을실시하기위한구체적인내용요약하나의국면에서, 본원명세서의교시내용은화학식 II의화합물및이의치료학적으로허용되는염, 프로드럭 (prodrug), 프로드럭의염및대사산물을포함한다 : [ 화학식 II] [0010] [0011] [0012] [0013] 상기화학식 II 에서, X 3 은 Cl 또는 F 이고 ; X 4 는아제판 -1- 일, 모르폴린 -1- 일, 1,4- 옥사제판 -4- 일, 피롤리딘 -1- 일, N(CH 3 ) 2, N(CH 3 )(CH(CH 3 ) 2 ), 7- 아자사이 클로 [2.2.1] 헵탄 -1- 일또는 2- 옥사 -5- 아자비사이클로 [2.2.1] 헵트 -5- 일이며, [0014] R 0 는 [0015] [0016] [0017] 이고, 여기서 X 5 는 CH 2, C(CH 3 ) 2 또는 CH 2 CH 2 이고 ; [0018] [0019] [0020] X 6 및 X 7 은둘다수소이거나둘다메틸이며 ; X 8 은 F, Cl, Br 또는 I 이거나 ; X 4 는아제판 -1- 일, 모르폴린 -1- 일, 피롤리딘 -1- 일, N(CH 3 )(CH(CH 3 ) 2 ) 또는 7- 아자비사이클로 [2.2.1] 헵탄 -1- 일이 고,

12 [0021] R 0 는 [0022] [0023] [0024] ; 또는 X 4 는 N(CH 3 ) 2 또는모르폴린 -1- 일이고, [0025] R 0 는 [0026] [0027] [0028] 이다. 추가의국면은화학식 II 의화합물, 및이의치료학적으로허용되는염, 프로드럭, 프로드럭의염및대사산물 을포함하며, 여기서 X 3 은 Cl 또는 F 이고 ; [0029] X 4 는아제판 -1- 일, 모르폴린 -1- 일, 1,4- 옥사제판 -4- 일, 피롤리딘 -1- 일, N(CH 3 ) 2, N(CH 3 )(CH(CH 3 ) 2 ), 7- 아자비사 이클로 [2.2.1] 헵탄 -1- 일또는 2- 옥사 -5- 아자비사이클로 [2.2.1] 헵트 -5- 일이며, [0030] R 0 는 [0031] [0032] [0033] 이고, 여기서 X 5 는 CH 2, C(CH 3 ) 2 또는 CH 2 CH 2 이며 ; [0034] [0035] [0036] X 6 및 X 7 은둘다수소이거나둘다메틸이고 ; X 8 은 F, Cl, Br 또는 I 이거나 ; X 4 는아제판 -1- 일, 모르폴린 -1- 일, 피롤리딘 -1- 일, N(CH 3 )(CH(CH 3 ) 2 ) 또는 7- 아자비사이클로 [2.2.1] 헵탄 -1- 일이 고,

13 [0037] R 0 는 [0038] [0039] [0040] 이거나 ; 또는 X 4 는 N(CH 3 ) 2 또는모르폴린 -1- 일이고, [0041] R 0 는 [0042] [0043] [0044] 이다. 추가의다른국면은화학식 II 의화합물, 및이의치료학적으로허용되는염, 프로드럭, 프로드럭의염및대사 산물을포함하며, 여기서 X 3 은 Cl 또는 F 이고 ; [0045] X 4 는아제판 -1- 일, 모르폴린 -1- 일, 1,4- 옥사제판 -4- 일, 피롤리딘 -1- 일, N(CH 3 ) 2, N(CH 3 )(CH(CH 3 ) 2 ), 7- 아자비사 이클로 [2.2.1] 헵탄 -1- 일또는 2- 옥사 -5- 아자비사이클로 [2.2.1] 헵트 -5- 일이며, [0046] R 0 는 [0047] [0048] 이고, 여기서 X 5 는 CH 2, C(CH 3 ) 2 또는 CH 2 CH 2 이고, X 6 및 X 7 은둘다수소이거나둘다메틸이며 ; [0049] [0050] X 8 은 F, Cl, Br 또는 I 이다. 추가의다른국면은화학식 II 의화합물, 및이의치료학적으로허용되는염, 프로드럭, 프로드럭의염및대 사산물을포함하며, 여기서 X 3 은 Cl 또는 F 이고 ; [0051] X 4 는아제판 -1- 일, 모르폴린 -1- 일, 피롤리딘 -1- 일, N(CH 3 )(CH(CH 3 ) 2 ) 또는 7- 아자비사이클로 [2.2.1] 헵탄 -1- 일이 며 ;

14 [0052] R 0 는 [0053] [0054] [0055] [0056] 이고, 여기서 X 6 및 X 7 은둘다수소이거나둘다메틸이며 ; X 8 은 F, Cl, Br 또는 I 이다. 추가의다른국면은화학식 II 의화합물, 및이의치료학적으로허용되는염, 프로드럭, 프로드럭의염및대 사산물을포함하며, 여기서 X 3 은 Cl 또는 F 이고 ; [0057] X 4 는 N(CH 3 ) 2 또는모르폴린 -1- 일이며 ; [0058] R 0 는 [0059] [0060] [0061] [0062] 이고 ; X 8 는 F, Cl, Br 또는 I 이다. 추가의다른국면은화학식 II 의화합물, 및이의치료학적으로허용되는염, 프로드럭, 프로드럭의염및대사 산물을포함하며, 여기서 X 3 은 F 이고 ; X 4 는모르폴린 -1- 일이며 ; [0063] R 0 는 [0064] [0065] 이고, 여기서 X 5 는 C(CH 3 ) 2 이고 ; X 6 및 X 7 은둘다메틸이며 ; [0066] [0067] [0068] X 8 은 Cl이다. 추가의다른국면은 N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 )-5,5-디메틸-1-사이클로헥스-1- 엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3- ( 모르폴린-4-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 )-프로필) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드 ( 달리는본

15 원에서 ABT-263 으로언급됨 ), [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스 -1-엔-1-일) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 모르폴린-4-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드, 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-1-사이클로헥스 -1-엔-1-일) 메틸 ) 피페라진- 1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 모르폴린-4-일 )-1- (( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 )-5,5-디메틸사이클로헥스-1- 엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 이소프로필 ( 메틸 ) 아미노 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 )-1-사이클로헵텐-1-일) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 이소프로필 ( 메틸 ) 아미노 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐) 사이클로헥스-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-1S,4S)-2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1] 헵트-5-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 ) 사이클로헥스-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 모르폴린-4-일 )- 1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, 4-(((1R)-3-(7-아자비사이클로 [2.2.1] 헵트-7-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 ) 사이클로헥스-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 ) 사이클로헥스-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조오일 )-4-(((1R)-3-(2-옥사-5-아자비사이클로 [2.2.1] 헵트-5-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 )-5,5-디메틸사이클로헥스-1- 엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-(2- 옥사-5-아자비사이클로 [2.2.1] 헵트-5-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸사이클로헥스 -1-엔-1-일) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-(2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1] 헵트-5-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 ) 사이클로헵트-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-(2-옥사-5-아자비사이클로 [2.2.1] 헵트-5-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐) 사이클로헵트-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-(2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1] 헵트-5-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 )-4,4-디메틸사이클로헥스-1- 엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 이소프로필 ( 메틸 ) 아미노 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 ) 사이클로헥스-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-(1,4-옥사제판- 4-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, 4-(((1R)-3-( 아제판-1-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-N-(4-(4- ((2-(4-클로로페닐)-1-사이클로헥스 - 1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 ) 사이클로헵트-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 디메틸아미노 )- 1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐) 사이클로헥스-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 디메틸아미노 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드, 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸사이클로헥스 -1-엔-1-일) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 모르폴린-4-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드,

16 [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 )-5,5-디메틸-1-사이클로헥스-1- 엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3- ( 디메틸아미노 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 )-프로필) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((4-(4-클로로페닐 )-5,6-디하이드로-2H-피란-3-일) 메틸 ) 피페라진-1- -일) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 모르폴린-4-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 )-아미노)-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스 -1-엔-1-일) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 이소프로필 ( 메틸 ) 아미노 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드, 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸사이클로헥스 -1-엔-1-일) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 이소프로필 ( 메틸 ) 아미노 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 )-4,4-디메틸사이클로헥스-1- 엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 모르폴린-4-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스 -1-엔-1-일) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-((1S,4S)-2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1] 헵트-5-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 ) 사이클로헥스-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 디메틸아미노 )- 1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 ) 사이클로헥스-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 )-3-( 피롤리딘-1-일 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스 -1-엔-1-일) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 디메틸아미노 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 ) 사이클로헵트-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 )-3-( 피롤리딘-1-일 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸사이클로헥스 -1-엔-1-일) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 )-3-( 피롤리딘-1-일 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드, 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸사이클로헥스 -1-엔-1-일) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 )-3-( 피롤리딘-1-일 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드, 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-사이클로헵트 -1-엔-1-일) 메틸 ) 피페라진-1- 일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 )-3-( 피롤리딘-1-일 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 ) 사이클로헥스-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 이소프로필 ( 메틸 ) 아미노 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 )-4,4-디메틸사이클로헥스-1- 엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 )-3-( 피롤리딘-1-일 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, 3-(( 클로로 ( 디플루오로 ) 메틸 ) 설포닐 )-N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐) 사이클로헥스-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 )-3-( 피롤리딘-1-일 ) 프로필 ) 아미노 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 )-4,4-디메틸사이클로헥스-1- 엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 디메틸아미노 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 )-4,4-디메틸사이클로헥스-1- 엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3- ((1S,4S)-2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1] 헵트-5-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, N-(4-(4-((4'-클로로 (1,1'-비페닐)-2-일) 메틸 )-1-피페라지닐) 벤조일 )-4- (((1R)-3-( 디메틸아미노 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, 및 N-(4-(4-((4'-클로로 (1,1'-비페닐)-2-일) 메틸 )-1-피페라지닐) 벤조일 )-4- (((1R)-3-(4-모르폴리닐)-1-(( 페닐설

17 파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드, 및이의치료학적으로허용되는염, 프로드럭, 프로드럭의염및대사산물. [0107] 추가의다른국면은하나이상의항세포자멸사 Bcl-X L 단백질, 항세포자멸사 Bcl-2 단백질또는항세포자멸사 Bcl-w 단백질을발현하는질환을치료하기위한조성물을포함하며, 당해조성물은부형제및치료학적유효량 의화학식 II 의화합물을포함한다. [0108] 추가의다른국면은하나이상의항세포자멸사 Bcl-X L 단백질, 항세포자멸사 Bcl-2 단백질또는항세포자멸사 Bcl-w 단백질을발현하는환자에서질환을치료하는방법을포함하며, 당해방법은환자에게치료학적유효량의 화학식 II 의화합물을투여함을포함한다. [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] 추가의다른국면은비정상적인세포성장및 / 또는조절되지않는세포자멸사의질환, 예를들면, 메소티올로마 (mesothioloma), 방광암, 췌장암, 피부암, 두부또는경부의암, 피부또는안구내흑색종, 난소암, 유방암, 자궁암, 난관의암종, 자궁내막의암종, 경부의암종, 질의암종, 외음부의암종, 골암, 난소암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문부위의암, 위암, 위장 ( 위, 결장직장및십이지장 ), 만성림프구백혈병, 식도암, 소장의암, 내분비계의암, 갑상샘의암, 부갑상샘의암, 부신샘의암, 연조직의육종, 요도의암, 음경의암, 고환암, 간세포암 ( 간및쓸개관 ), 원발성또는 2차중추신경계종양, 원발성또는 2차뇌종양, 호지킨병 (Hodgkin's disease), 만성또는급성백혈병, 만성흑색종백혈병, 림프구림프종, 림프모구백혈병, 소포림프종, T-세포또는 B-세포기원의림프구악성종양, 흑색종, 다발골수종, 구강암, 난소암, 비-소세포폐암, 전립선암, 소세포폐암, 신장및자궁의암, 신장세포암종, 신우의암종, 중추신경계의신생물, 원발성중추신경계림프종, 비호지킨림프종, 척추종양, 뇌줄기신경아교종, 뇌하수체샘종, 부신피질암, 담낭암, 비장의암, 담관암종, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는상기암들의하나이상의조합을포함하는암을치료하기위한부형제및치료학적유효량의화학식 II의화합물을포함하는조성물을포함한다. 추가의다른국면은메소티올로마, 방광암, 췌장암, 피부암, 두부또는경부의암, 피부또는안구내흑색종, 난소암, 유방암, 자궁암, 난관의암종, 자궁내막의암종, 경부의암종, 질의암종, 외음부의암종, 골암, 난소암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문부위의암, 위암, 위장 ( 위, 결장직장및십이지장 ), 만성림프구백혈병, 식도암, 소장의암, 내분비계의암, 갑상샘의암, 부갑상샘의암, 부신샘의암, 연조직의육종, 요도의암, 음경의암, 고환암, 간세포암 ( 간및쓸개관 ), 원발성또는 2차중추신경계종양, 원발성또는 2차뇌종양, 호지킨병, 만성또는급성백혈병, 만성흑색종백혈병, 림프구림프종, 림프모구백혈병, 소포림프종, T-세포또는 B-세포기원의림프구악성종양, 흑색종, 다발골수종, 구강암, 난소암, 비-소세포폐암, 전립선암, 소세포폐암, 신장및자궁의암, 신장세포암종, 신우의암종, 중추신경계의신생물, 원발성중추신경계림프종, 비호지킨림프종, 척추종양, 뇌줄기신경아교종, 뇌하수체샘종, 부신피질암, 담낭암, 비장의암, 담관암종, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는상기암들의하나이상의조합을포함하는암을치료하는방법을포함하며, 상기방법은치료학적유효량의화학식 II의화합물을상기환자에게투여함을포함한다. 추가의다른국면은방광암, 뇌암, 유방암, 골수암, 경부암, 만성림프구백혈병, 결장직장암, 식도암, 간세포암, 림프모구백혈병, 소포림프종, T-세포또는 B-세포기원의림프구악성종양, 흑색종, 골수성백혈병, 흑색종, 구강암, 난소암, 비-소세포폐암, 전립선암, 소세포폐암및비장암을치료하기위한, 부형제및치료학적유효량의화학식 II의화합물을포함하는, 조성물을포함한다. 추가의다른국면은방광암, 뇌암, 유방암, 골수암, 경부암, 만성림프구백혈병, 결장직장암, 식도암, 간세포암, 림프모구백혈병, 소포림프종, T-세포또는 B-세포기원의림프구악성종양, 흑색종, 골수성백혈병, 골수종, 구강암, 난소암, 비-소세포폐암, 전립선암, 소세포폐암및비장암을치료하는방법을포함하며, 상기방법은환자에게치료학적유효량의화학식 II의화합물을투여함을포함한다. 추가의다른국면은환자에서하나이상의항세포자멸사 Bcl-X L 단백질, 항세포자멸사 Bcl-2 단백질또는항세 포자멸사 Bcl-w 단백질이발현되는질환을치료하기위한조성물을포함하며, 상기조성물은부형제및치료학 적유효량의화학식 II 의화합물및치료학적유효량의하나의추가의치료제또는하나이상의추가의치료제 를포함한다. [0114] 추가의다른국면은환자에서하나이상의항세포자멸사 Bcl-X L 단백질, 항세포자멸사 Bcl-2 단백질또는항세 포자멸사 Bcl-w 단백질이발현되는질환을치료하는방법을포함하며, 상기방법은환자에게치료학적유효량의 화학식 II 의화합물및치료학적유효량의하나의추가의치료제또는하나이상의추가의치료제를투여함을

18 포함한다. [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] 추가의다른국면은메소티올로마, 방광암, 췌장암, 피부암, 두부또는경부의암, 피부또는안구내흑색종, 난소암, 유방암, 자궁암, 난관의암종, 자궁내막의암종, 경부의암종, 질의암종, 외음의암종, 골암, 난소암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문부위의암, 위암, 위장 ( 위, 결장직장및십이지장 ), 만성림프구백혈병, 식도암, 소장의암, 내분비계의암, 갑상샘의암, 부갑상샘의암, 부신샘 (adrenal gland) 의암, 연조직의육종, 요도의암, 음경의암, 고환암, 간세포암 ( 간및쓸개관 ), 원발성또는 2차중추신경계종양, 원발성또는 2차뇌종양, 호지킨병, 만성또는급성백혈병, 만성흑색종백혈병, 림프구림프종, 림프모구백혈병, 소포림프종, T-세포또는 B-세포기원의림프구악성종양, 흑색종, 다발골수종, 구강암, 난소암, 비-소세포폐암, 전립선암, 소세포폐암, 신장및자궁의암, 신장세포암종, 신우의암종, 중추신경계의신생물, 원발성중추신경계림프종, 비호지킨림프종, 척추종양, 뇌줄기신경아교종, 뇌하수체샘종, 부신피질암, 담낭암, 비장의암, 담관암종, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는상기암들의하나이상의조합을치료하기위한조성물을포함하며, 상기조성물은부형제및치료학적유효량의화학식 II의화합물및하나의추가의치료제또는하나이상의추가의치료제를포함한다. 추가의다른국면은메소티올로마, 방광암, 췌장암, 피부암, 두부또는경부의암, 피부또는안구내흑색종, 난소암, 유방암, 자궁암, 난관의암종, 자궁내막의암종, 경부의암종, 질의암종, 외음의암종, 골암, 난소암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문부위의암, 위암, 위장 ( 위, 결장직장및십이지장 ), 만성림프구백혈병, 식도암, 소장의암, 내분비계의암, 갑상샘의암, 부갑상샘의암, 부신샘의암, 연조직의육종, 요도의암, 음경의암, 고환암, 간세포암 ( 간및쓸개관 ), 원발성또는 2차중추신경계종양, 원발성또는 2차뇌종양, 호지킨병, 만성또는급성백혈병, 만성흑색종백혈병, 림프구림프종, 림프모구백혈병, 소포림프종, T-세포또는 B-세포기원의림프구악성종양, 흑색종, 다발골수종, 구강암, 난소암, 비-소세포폐암, 전립선암, 소세포폐암, 신장및자궁의암, 신장세포암종, 신우의암종, 중추신경계의신생물, 원발성중추신경계림프종, 비호지킨림프종, 척추종양, 뇌줄기신경아교종, 뇌하수체샘종, 부신피질암, 담낭암, 비장의암, 담관암종, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는상기암들중의하나이상의조합을치료하는방법을포함하며, 상기방법은환자에게치료학적유효량의화학식 II의화합물및하나의추가의치료제또는하나이상의추가의치료제를투여함을포함한다. 추가의다른국면은환자에서메소티올로마, 방광암, 췌장암, 피부암, 두부또는경부의암, 피부또는안구내흑색종, 난소암, 유방암, 자궁암, 난관의암종, 자궁내막의암종, 경부의암종, 질의암종, 외음의암종, 골암, 난소암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문부위의암, 위암, 위장 ( 위, 결장직장및십이지장 ), 만성림프구백혈병, 식도암, 소장의암, 내분비계의암, 갑상샘의암, 부갑상샘의암, 부신샘의암, 연조직의육종, 요도의암, 음경의암, 고환암, 간세포암 ( 간및쓸개관 ), 원발성또는 2차중추신경계종양, 원발성또는 2차뇌종양, 호지킨병, 만성또는급성백혈병, 만성흑색종백혈병, 림프구림프종, 림프모구백혈병, 소포림프종, T-세포또는 B-세포기원의림프구악성종양, 흑색종, 다발골수종, 구강암, 난소암, 비-소세포폐암, 전립선암, 소세포폐암, 신장및자궁의암, 신장세포암종, 신우의암종, 중추신경계의신생물, 원발성중추신경계림프종, 비호지킨림프종, 척추종양, 뇌줄기신경아교종, 뇌하수체샘종, 부신피질암, 담낭암, 비장의암, 담관암종, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는상기암들중의하나이상의조합을치료하는방법을포함하며, 상기방법은환자에게치료학적유효량의화학식 II의화합물및하나이상의에토포시드, 빈크리스틴, CHOP, 리툭시마브, 라파마이신, R-CHOP, 보르테조미브, MLN8237, 토자세르티브 ( 또한 VX-680 또는 MK-0457로공지됨 ), PHA , AT9283, AZD1152, BI811283, ENMD-2076, CYC116, AMG900, PF , R763, SNS-314 또는 TAK-901을투여함을포함한다. 추가의다른국면은치료학적유효량의화학식 II의화합물및에토포시드를환자에게투여함을포함하여, 환자에서 B-세포림프종을치료하는방법을포함한다. 추가의다른국면은치료학적유효량의화학식 II의화합물및빈크리스틴을환자에게투여함을포함하여, 환자에서 B-세포림프종을치료하는방법을포함한다. 추가의다른국면은치료학적유효량의화학식 II의화합물및 CHOP를환자에게투여함을포함하여, 환자에서 B-세포림프종을치료하는방법을포함한다. 추가의다른국면은치료학적유효량의화학식 II의화합물및리툭시마브를환자에게투여함을포함하여, 환자에서 B-세포림프종을치료하는방법을포함한다

19 [0122] [0123] [0124] [0125] [0126] [0127] [0128] [0129] 추가의다른국면은치료학적유효량의화학식 II의화합물및라파마이신을환자에게투여함을포함하여, 환자에서 B-세포림프종을치료하는방법을포함한다. 추가의다른국면은치료학적유효량의화학식 II의화합물및 R-CHOP를환자에게투여함을포함하여, 환자에서외투-세포림프종을치료하는방법을포함한다. 추가의다른국면은치료학적유효량의화학식 II의화합물및보르테조미브를환자에게투여함을포함하여, 환자에서외투-세포림프종을치료하는방법을포함한다. 추가의다른국면에서, 본원명세서의교시내용은암으로고생하는환자를치료하는방법에관한것이다. 당해방법은 a) 암으로고생하는환자에게치료학적유효량의적어도하나의다배수유도제를투여하는단계 ; 및 b) 상기환자에게치료학적유효량의적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제를투여하는단계를포함한다. 상기방법에서, 다배수유도제는아우로라키나제억제제일수있다. 아우로라키나제억제제는아우로라키나제 A 억제제, 아우로라키나제 B 억제제, 아우로라키나제 C 억제제또는이들의병용물일수있다. 보다구체적으로, 아우로라키나제억제제는아우로라키나제 B 억제제이다. 예를들면, 아우로라키나제 B 억제제는 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는헤르스페라딘이다. 상기방법에서, Bcl-2 계열단백질억제제는 ABT-263, ABT-737, Bcl-X L 선택적인억제제또는이들의병용물일 수있다. [0130] [0131] [0132] [0133] [0134] 다른국면에서, 본원명세서의교시내용은암으로고생하는환자를치료하는데사용하기위한치료제들의병용물에관한것이다. 당해병용물은 a) 환자에서하나이상의암세포에서다배수체화를유도하는데사용하기위한적어도하나의다배수유도제 ; 및 b) 적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제를포함한다. 상기병용물에서, 다배수유도제는아우로라키나제억제제일수있다. 아우로라키나제억제제는아우로라키나제 A 억제제, 아우로라키나제 B 억제제, 아우로라키나제 C 억제제또는이들의병용물일수있다. 보다구체적으로, 아우로라키나제억제제는아우로라키나제 B 억제제이다. 예를들면, 아우로라키나제 B 억제제는 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는헤르스페라딘이다. 상기병용물에서, Bcl-2 계열단백질억제제는 ABT-263, ABT-737, Bcl-X L 선택적인억제제또는이들의병용물 일수있다. [0135] [0136] [0137] [0138] [0139] [0140] 추가의다른국면에서, 본원명세서의교시내용은다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물로치료하기에적격인환자를분류하는방법에관한것이다. 당해방법은 a) 환자로부터의시험시료를제공하는단계 ; b) 시험시료속의 BAX 유전자, BAK 유전자또는 NOXA 유전자로이루어진그룹에서선택된적어도하나의유전자내적어도하나의돌연변이의존재또는부재를측정하는단계 ; 및 c) 단계 b) 에서측정된적어도하나의돌연변이의존재또는부재에기초하여, 상기환자를다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물을사용한치료를제공받기에적격한것으로분류하는단계를포함한다. 상기방법에서, 다배수유도제는아우로라키나제억제제일수있다. 아우로라키나제억제제는아우로라키나제 A 억제제, 아우로라키나제 B 억제제, 아우로라키나제 C 억제제또는이들의병용물일수있다. 보다구체적으로, 아우로라키나제억제제는아우로라키나제 B 억제제이다. 예를들면, 아우로라키나제 B 억제제는 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는헤르스페라딘이다. 상기방법에서, Bcl-2 계열단백질억제제는 ABT-263, ABT-737, Bcl-X L 선택적인억제제또는이들의병용물일 수있다

20 [0141] [0142] [0143] [0144] [0145] [0146] [0147] [0148] [0149] [0150] 상기방법에서, 시험시료는조직시료를포함할수있다. 예를들면, 시험시료는말초혈액시료, 종양조직또는의심되는종양조직, 박층세포학적시료, 미세침흡인시료, 골수시료, 림프절시료, 뇨시료, 복수액시료, 세척액시료, 식도브러싱시료, 방광또는폐세척액시료, 척수액시료, 뇌유액시료, 관흡인시료, 유두분비물시료, 흉막삼출액시료, 새로이동결된조직시료, 파라핀봉매된조직시료또는말초혈액시료중어느것으로부터생산된추출물또는가공된시료, 종양조직또는의심되는종양조직, 박층세포학적시료, 미세침흡인시료, 골수시료, 뇨시료, 복수액시료, 세척액시료, 식도브러싱시료, 방광또는폐세척액시료, 척수액시료, 뇌유액시료, 관흡인시료, 유두분비물시료, 흉막삼출액시료, 새로이동결된조직시료또는파라핀봉매된조직시료를포함한다. 또한, 상기방법에서, 측정단계 (b) 는동소하이브리드화 (in situ hybridization) 로수행할수있다. 예를들면, 동소하이브리드화는형광성표지된핵산프로브를사용하여수행할수있다. 또는, 동소하이브리드화는적어도 2개의핵산프로브를사용하여수행한다. 추가의다른대안에서, 동소하이브리드화는펩타이드핵산프로브로수행한다. 또한, 상기방법에서, 측정단계 (b) 는폴리머라제쇄반응에의해수행할수있다. 상기방법에서, 환자는또한화학치료요법, 방사선또는이를병용한치료를동시에제공받을수있다. 다른국면에서, 본원명세서의교시내용은암으로고생하는환자를모니터링하고다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물로치료하는방법에관한것이다. 당해방법은 a) 암으로고생하며현재적어도하나의다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물로현재치료중인환자로부터의시험시료를제공하는단계 ; b) 시험시료속의 BAX 유전자, BAK 유전자또는 NOXA 유전자로이루어진그룹에서선택된적어도하나의유전자에서의적어도하나의돌연변이의존재또는부재를측정하는단계 ; 및 c) 단계 b) 에서측정된적어도하나의돌연변이의존재또는부재에기초하여, 다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물로상기환자를계속치료하여야하는지를결정하는단계를포함한다. 상기방법에서, 다배수유도제는아우로라키나제억제제일수있다. 아우로라키나제억제제는아우로라키나제 A 억제제, 아우로라키나제 B 억제제, 아우로라키나제 C 억제제또는이들의병용물일수있다. 보다구체적으로, 아우로라키나제억제제는아우로라키나제 B 억제제일수있다. 예를들면, 아우로라키나제 B 억제제는 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는헤르스페라딘이다. 상기방법에서, Bcl-2 계열단백질억제제는 ABT-263, ABT-737, Bcl-X L 선택적인억제제또는이들의병용물일 수있다. [0151] [0152] [0153] [0154] [0155] 상기방법에서, 상기시험시료는조직시료를포함할수있다. 예를들면, 조직시료는말초혈액시료, 종양조직또는의심되는종양조직, 박층세포학적시료, 미세침흡인시료, 골수시료, 림프절시료, 뇨시료, 복수액시료, 세척액시료, 식도브러싱시료, 방광또는폐세척액시료, 척수액시료, 뇌유액시료, 관흡인시료, 유두분비물시료, 흉막삼출액시료, 새로이동결된조직시료, 파라핀봉매된조직시료또는말초혈액시료중어느것으로부터생산된추출물또는가공된시료, 종양조직또는의심되는종양조직, 박층세포학적시료, 미세침흡인시료, 골수시료, 뇨시료, 복수액시료, 세척액시료, 식도브러싱시료, 방광또는폐세척액시료, 척수액시료, 뇌유액시료, 관흡인시료, 유두분비물시료, 흉막삼출액시료, 새로이동결된조직시료또는파라핀봉매된조직시료를포함한다. 또한, 상기방법에서, 측정단계 (b) 는동소하이브리드화에의해수행할수있다. 예를들면, 동소하이브리드화는형광성표지된핵산프로브를사용하여수행할수있다. 또는, 동소하이브리드화는적어도 2개의핵산프로브를사용하여수행한다. 추가의다른대안에서, 동소하이브리드화는펩타이드핵산프로브로수행한다. 또한, 상기방법에서, 측정단계 (b) 는폴리머라제쇄반응에의해수행할수있다. 상기방법에서, 환자는또한화학치료요법, 방사선또는이를병용한치료를동시에제공받을수있다. 추가의다른국면에서, 본원명세서의교시내용은다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도

21 제와 Bcl-2 계열단백질억제제의조합물로치료에대해내성인암을갖는환자를분류하는방법에관한 것이며, 당해방법은 [0156] [0157] [0158] [0159] [0160] a) 암으로고생하는환자로부터의시험시료를제공하는단계 ; b) 상기시험시료속의 BAX 유전자, BAK 유전자또는 NOXA 유전자로이루어진그룹에서선택된적어도하나의유전자에서의적어도하나의돌연변이의존재또는부재를측정하는단계 ; 및 c) 단계 b) 에서측정된적어도하나의돌연변이의존재또는부재에기초하여상기환자가다배수유도제, Bcl- 2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물을사용한치료에대해내성인암을가진것으로분류하는단계를포함한다. 상기방법에서, 다배수유도제는아우로라키나제억제제일수있다. 아우로라키나제억제제는아우로라키나제 A 억제제, 아우로라키나제 B 억제제, 아우로라키나제 C 억제제또는이들의병용물일수있다. 보다구체적으로, 아우로라키나제억제제는아우로라키나제 B 억제제이다. 예를들면, 아우로라키나제 B 억제제는 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 또는헤르스페라딘이다. 상기방법에서, Bcl-2 계열단백질억제제는 ABT-263, ABT-737, Bcl-X L 선택적인억제제또는이들의병용물일 수있다. 상기방법에서, 상기시험시료는조직시료를포함할수있다. 예를들면, 조직시료는말초혈액시료, 종양조직또는의심되는종양조직, 박층세포학적시료, 미세침흡인시료, 골수시료, 림프절시료, 뇨시료, 복수액시료, 세척액시료, 식도브러싱시료, 방광또는폐세척액시료, 척수액시료, 뇌유액시료, 관흡인시료, 유두분비물시료, 흉막삼출액시료, 새로이동결된조직시료, 파라핀봉매된조직시료또는말초혈액시료중어느것으로부터생산된추출물또는가공된시료, 종양조직또는의심되는종양조직, 박층세포학적시료, 미세침흡인시료, 골수시료, 뇨시료, 복수액시료, 세척액시료, 식도브러싱시료, 방광또는폐세척액시료, 척수액시료, 뇌유액시료, 관흡인시료, 유두분비물시료, 흉막삼출액시료, 새로이동결된조직시료또는파라핀봉매된조직시료를포함한다. [0161] [0162] [0163] [0164] [0165] 또한, 상기방법에서, 측정단계 (b) 는동소하이브리드화에의해수행할수있다. 예를들면, 동소하이브리드화는형광성표지된핵산프로브를사용하여수행할수있다. 또는, 동소하이브리드화는적어도 2개의핵산프로브를사용하여수행한다. 추가의다른대안에서, 동소하이브리드화는펩타이드핵산프로브로수행한다. 또는, 상기방법에서, 측정단계 (b) 는폴리머라제쇄반응에의해수행할수있다. 상기방법에서, 환자는또한화학치료요법, 방사선또는이를병용한치료를동시에제공받을수있다. 발명의자세한설명하나의국면에서, 본원명세서의교시내용은종양및암세포에치료학적유효량의적어도하나의다배수유도제및치료학적유효량의적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제를투여하는경우당해세포내에서발생하는상승효과의발견에관한것이다. 구체적으로, 본원명세서의교시내용의발명자들은, 특정종양및암세포에서다배수체화의유도가, Bcl-X L 의항-세포자멸사활성에의존하는이들생성되는다배수체세포의생존을야기 하거나부여함을발견하였다. 보다구체적으로, 이들종양및암세포에서다배수의유도는이들세포를 Bcl- X L 억제에대해감작화시킨다. 따라서, 본발명자들은, 이들세포에서세포자멸사또는세포사멸을유도하기위한다배수-매개된방법을개발하였다. 당해방법은암으로고생하는환자에게치료제들의병용물을투여함을포함한다. 구체적으로, 환자는적어도하나의다배수유도제를투여받는다. 다배수유도제의목적은하나이상의암세포내에서다배수를유도하는것이다. 본원에서앞서언급한바와같이, 다배수의유도후, 이들다배수체종양및암세포의생존은 Bcl-X L 에대해의존적이다. 다배수종양및암세포의세포자멸사또는사멸은환자에게적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제를투여함으로써수득되거나달성될수있다. 적어도하나의다배수유도제및적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제가투여되는순서는중요하지않다. 그러나, 종양및암세포는, 다배수체의유도후까지 Bcl-2 계열단백질억제제에대해감작화되지않으므로, 적어도하나의다배수유도제를환자에게적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제이전에또는이와함께투여하는것이바람직하다. 상기발견과관련하여, 본원명세서의교시내용의발명자들은또한, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내에적어도하나의돌연변이를함유하는종양및암세포 ( 이들세포가다배수에대해유도되는지또는유도되지않는지에상관없이 ) 가면역성이거나다배수의유도 ( 적어도하나의다배수유도제를사용하는것과같은 ) 후 Bcl

22 계열단백질억제제를사용한처리에대해내성을나타냄을발견하였다. 다시말해서, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이를함유하는다배수종양및암세포는적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제로동시에또는후속적으로처리하는경우세포자멸사또는세포사멸을나타내지않거나경험하지않는다. [0166] [0167] [0168] [0169] [0170] 따라서, 이러한추가의발견의측면에서, 다른국면에서, 본원명세서의교시내용은또한다배수유도제 ( 아우로라키나제억제제와같은 ) 치료요법, Bcl-2 계열단백질억제제치료요법또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제치료요법의병용에대한내성에대해암및종양세포를모니터링하기위한방법및조성물을제공한다. 본원명세서의교시내용은 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이의존재또는부재에대해시험시료를평가함을포함하여암환자를확인하고, 분류하며모니터링하기위한진단검사를제공한다. 본발명의검사는다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제치료요법또는다배수유도제및 Bcl-2 계열단백질억제제치료요법 [ 병용치료요법과함께또는추가의다른치료요법 ( 예를들면, 화학치료요법, 방사선또는이들의병용과같은 ) 과함께의병용치료요법으로서 ] 을제공받기에적격인환자를확인하고이러한치료요법에대한환자반응을모니터링하는검사방법을포함한다. 본원명세서의교시내용은예를들면, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이의동소하이브리드화 (in situ hybridization) 존재또는부재하에서형광성에의해측정함을포함한다. 본원의방법은다배수의유도전에또는다배수의유도후에수행할수있다. (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내기본선 ( 또는예정된 ) 수준에걸쳐하나이상의돌연변이에있어서의증가또는하나이상의돌연변이를가진것으로분류된환자는다음의치료요법각각에거의반응하지않는것으로고려될수있으므로, 당해환자는적어도하나의다배수유도제, 적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제치료요법의병용치료요법을제공받는데적격인것으로고려될수있다. 구체적으로, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내에하나이상의돌연변이를갖는것으로확인된환자는적어도하나의다배수유도제 ( 다배수체화를유도하기위한 ) 를사용한치료전또는치료후적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제를사용한치료에대해면역이거나, 내성이거나거의감작화되지않는것으로여겨진다. 하나의국면에서, 본원명세서의교시내용은다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제 ( 제3의치료요법과함께또는이와병용하여 ) 를사용한치료에적격인것으로환자를확인하거나분류하는방법을포함한다. 당해방법은 : (a) 환자로부터조직시료를제공하는단계 ; (b) (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자에서적어도하나의돌연변이의존재또는부재를측정하는단계 ; 및 (c) (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자에서적어도하나의돌연변이의존재또는부재에기초하여, 다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제둘다를사용한치료에대해적격인것으로상기환자를분류하는단계를포함한다. 상기방법에서, 상기환자는 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자에서기본선 ( 또는예정된 ) 수준을초과하는하나이상의돌연변이의수에있어서의증가또는적어도하나의돌연변이의존재에기초하여, 다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제둘다를사용한치료에대해적격일수있다. 본원에앞서언급한방법을사용하는경우에서와같이, 당해방법은환자에

23 서다배수의유도전또는후에수행할수있다. [0171] [0172] [0173] [0174] [0175] [0176] [0177] [0178] [0179] [0180] [0181] [0182] [0183] 당해국면에서, 암은결장직장암종또는췌장암과같은어떠한유형의암일수있다. 또한, 당해국면에서, 유전자증폭은다중-색형광성동소하이브리드화 (FISH) 검사에의해, 예를들면, 폐암종양생검시료상에서수행할수있다. 다른국면에서, 정량적폴리머라제쇄반응 (Q-PCR) 방법이사용된다. 추가의다른국면에서, 본원명세서의교시내용은다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제, 또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물을사용한치료요법에대해내성인암을지닌환자를확인하거나분류하는방법을포함하며, 당해방법은 (a) 환자로부터시험시료 ( 예를들면, 조직시료와같은 ) 를제공하는단계 ; (b) (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자에서적어도하나의돌연변이의존재또는부재를측정하는단계 ; 및 (c) (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이의존재에기초하여, 다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의조합물에대해내성인암을가진것으로상기환자를분류하는단계를포함한다. 본원의앞에서언급한방법을사용하는경우에서와같이, 당해방법은환자에서다배수의유도전또는후에수행될수있다. 당해국면에서, 암은결장직장암종또는췌장암과같은어떠한유형의암일수있다. 또한, 당해국면에서, 유전자증폭은다중-색형광성동소하이브리드화 (FISH) 검사에의해측정할수있으며, 예를들면, 폐암종양생검시료상에서수행할수있다. 다른국면에서, 폴리머라제쇄반응 (PCR) 이사용된다. 추가의다른국면에서, 본원명세서의교시내용은다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제, 또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물로치료받는환자를모니터링하는방법에관한것이며, 당해방법은 : (a) 적어도하나의다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용으로치료받는암환자로부터의시험시료를제공하는단계 ( 임의로, 조직시료로부터수득된종양또는암세포를확인하거나추출할수있다 ); (b) 시험시료 ( 예를들면, 종양또는암세포 ) 내에서 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자에서적어도하나의돌연변이의존재또는부재를측정하는단계 ; 및 (c) (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내돌연변이의수를기본선수준또는예정된수준에대해비교하는단계 ; 및 (d) 단계 (c) 에서의비교에기초하여, 상기환자가다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용으로계속치료되어야하는지를결정하는단계를포함한다. 본원에서앞서언급한방법을사용하는경우에서와같이, 당해방법은환자에서다배수의유도전또는후에수행할수있다. 시험시료로부터측정된하나이상의돌연변이의수와기본선또는예정된수준의비교 ( 또는정보분석 ) 는, 검사를수행하는장치 ( 예를들면, 컴퓨터플랫폼 ) 의일부또는이와호환가능한소프트웨어프로그램또는정보시스템과같은자동화된시스템으로수행할수있다. 또는, 당해비교또는정보분석은주치의에의해수행될수있다. 구체적으로, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내에적어도하나의돌연변이를갖는시험시료 ( 예를들면, 종양또는암세포 ) 가기본선수준또는예정된수준과동일하거나이보다더높은경우, 다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물을사용한치료는중지되거나, 정지되거나종

24 결될수있다. 또는, 치료하는주치의는병용치료요법으로서다배수유도제와적어도제2의치료요법 ( 예를들면, 제2의소분자를사용한치료 ) 를병용할것을결정할수있다. 추가의추가의대안으로, 치료하는주치의는병용치료요법으로서 Bcl-2 계열단백질억제제와적어도제2의치료요법 ( 예를들면, 제2의소분자를사용한치료 ) 을병용할것을결정할수있다. 그러나, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이가기본선수준또는예정된수준미만이거나, 돌연변이가 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내에서검출되지않는경우, 다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제와 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물을사용한치료를지속할수있다. 다시, 상기치료로수득된결과에따라, 치료하는주치의는병용치료요법으로서다배수유도제와적어도제2의치료요법 ( 예를들면, 제2의소분자를사용한치료 ) 을결합하는것을결정할수있다. 또는, 상기치료로수득된결과에따라, 치료하는주치의는 Bcl-2 계열단백질억제제치료요법과적어도제2의치료요법 ( 예를들면, 제2의소분자를사용한치료 ) 를병용할것을결정할수있다. [0184] [0185] [0186] [0187] [0188] [0189] [0190] [0191] [0192] [0193] [0194] [0195] 다시, FISH 및 PCR 방법을사용하여환자로부터수득된시험시료속에서 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로 -세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이의존재또는부재를검출할수있다. 본원명세서의교시내용은또한예를들면, PCR 프라이머, FISH 프로브등으로서사용되도록가공된올리고- 또는폴리뉴클레오타이드를포장한키트 (kit) 에관한것이다. 본원명세서의교시내용은암치료요법, 및특히다배수유도제치료요법, Bcl-2 계열단백질억제제치료요법또는다배수유도제치료요법과 Bcl-2 계열단백질억제제치료요법의병용물에대한환자의개선된계층화를제공하는유의한능력을갖는다. 본원명세서의교시내용에따른이들바이오마커의측정은또한치료요법에대한개개환자반응의추적을허용한다. A. 정의본단락및본원명세서전체교시내용에서사용된것으로서단락제목은제한하는것으로의도되지않는다. 본원에사용된것으로서, 단수형태 ("a", "an" 및 "the") 는, 내용이명확하게달리기술하지않는한다수의언급을포함한다. 본원에서수치범위의인용의경우, 동일한정밀도사이에존재하는각각의개재수도명백하게고려된다. 예를들면, 6 내지 9의범위의경우, 숫자 7 및 8도 6 및 9외에고려되며, 6.0 내지 7.0의범위의경우, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0도명백하게고려된다. a) 항종양발생본원에사용된것으로서, 용어 " 항종양발생 " 은종양성장의감소를말한다. b) 아우로라키나제억제제 " 아우로라키나제억제제 " 는아우로라키나제 A, 아우로라 A, 아우로라키나제 B, 아우로라 B, 아우로라키나제 C 또는아우로라 C 중적어도하나에결합하여, 핵산또는단백질에관련된적어도하나의아우로라키나제 A, 아우로라 A, 아우로라키나제 B, 아우로라 B, 아우로라키나제 C 또는아우로라 C의활성을길항하는소분자, 항체, 안티센스, 소방해 RNA, 또는마이크로RNA-계화합물을포함하는어떠한유형 ( 예를들면, 비-선택적이거나선택적인 ) 의치료학적화합물을말한다. c) 아우로라키나제 A 억제제 " 아우로라키나제 A 억제제 " 는아우로라키나제 A 또는아우로라 A 중적어도하나에결합하여, 핵산또는단백질에관련된아우로라키나제 A 또는아우로라 A의활성을길항하는소분자, 항체, 안티센스, 소방해 RNA, 또는마이크로RNA-계화합물을포함하는어떠한유형 ( 예를들면, 비-선택적이거나선택적인 ) 의치료학적화합물을말한다. 본원명세서의교시내용의방법은어떠한공지되거나이후에개발된아우로라키나제 A 억제제와함께유용하다. 아우로라키나제 A 억제제의예는 PHA , MLN-8054, R-763, JNJ , MP-529 및 MP-235이다

25 [0196] [0197] [0198] [0199] [0200] [0201] [0202] [0203] [0204] [0205] [0206] [0207] d) 아우로라키나제 B 억제제 " 아우로라키나제 B 억제제 " 는아우로라키나제 B 또는아우로라 B 중적어도하나에결합하여, 핵산또는단백질에관련된아우로라키나제 B 또는아우로라 B의활성을길항하는소분자, 항체, 안티센스, 소방해 RNA, 또는마이크로R A-계화합물을포함하는어떠한유형 ( 예를들면, 비-선택적이거나선택적인 ) 의치료학적화합물을말한다. 예를들면, 다수의아우로라키나제 B 억제제는적어도하나의히스톤 H3 포스포릴화또는세포분열을억제하는것으로공지되어있다. 또한, 다수의아우로라키나제 B 억제제가적어도하나의세포시스템 ( 급성골수백혈병세포주, 주요급성골수백혈병배양물등과같은 ) 에서세포자멸사를유도하는것으로공지되어있다. 본원명세서의교시내용의방법은어떠한공지되거나이후에개발된아우로라키나제 B 억제제와함께유용하다. 아우로라키나제 B 억제제의예는 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 및헤스페라딘이다. 또한 2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-플루오로페닐 ) 아미노 ]-2-옥소에틸}-1H-피라졸-3-일) 아미노 ]-퀴나졸린-7-일} 옥시 ) 프로필 ]( 에틸 ) 아미노 ] 에틸디하이드로겐포스페이트로공지된 AZD1152는피라졸로퀴나졸린아우로라키나제억제제 (AZD1152-하이드록시퀴나졸린피라졸아닐리드 (HQPA)) 의프로드럭이며혈장에서활성 AZD1152-HQPA로신속하게전환된다 [ 참조 : Mortlock, A A, et al., J. Med. Chem., 50: (2007)]. AZD1152-HQPA는아우로라 B 의매우강력하고선택적인억제제이다. 또한 4-(4-(N-벤조일아미노 ) 아닐리노 )-6-메톡시-7-(3-(1-모르폴리노) 프로폭시 ) 퀴나졸린으로공지된 ZM447439는퀴나졸린유도체이며, 아우로라 A 및아우로라 B를억제한다. ZM447439의화학적구조는문헌 [ 참조 : Ditchfield, C., et al., J. Cell Bio., 161(2): (2003) 및 Montembault, E., et al., Drugs of the Future, 30(1):1-9 (2005)] 에제공된다. VX-680/MK0457은 {4-[4-(4-메틸-피페라진-1-일)-6-(5-메틸-2H- 피라졸-3-일아미노 )-피리미딘-2-일설파닐]-페닐 }-아미드의사이클로프로판카복실산이며아우로라 A, 아우로라 B 및아우로라 C를억제한다. VX-680/MK0457 의화학적구조는문헌 [ 참조 : Montembault, E., et al., Drugs of the Future, 30(1):1-9 (2005)] 에제공된다. 헤스페라딘, 인돌리논은아우로라 B를억제한다. 헤스페라딘의화학적구조는문헌 [ 참조 : Hauf, S., et al., J. Cell Bio., 161(2): (2003) 및 Montembault, E., et al., Drugs of the Future, 30(1):1-9 (200 5)] 에제공된다. e) 아우로라키나제 C 억제제 " 아우로라키나제 C 억제제 " 는아우로라키나제 C 또는아우로라 C 중적어도하나에결합하여, 핵산또는단백질관련된아우로라키나제 C 또는아우로라 C의활성을길항하는, 소분자, 항체, 안티센스, 소방해 RNA, 또는마이크로 RNA-계화합물을포함하는어떠한유형 ( 예를들면, 비-선택적또는선택적 ) 의치료학적화합물을말한다. 본원명세서의교시내용의방법은어떠한공지되거나이후개발된아우로라키나제 C 억제제와함께유용하다. 아우로라키나제 C 억제제의예는 AZD1152 및 VX-680/MK-0457이다. f) 서열동질성 % 를갖는폴리뉴클레오타이드로필수적으로이루어진 " 서열동질성 % 를갖는폴리뉴클레오타이드로필수적으로이루어진 " 은, 폴리뉴클레오타이드가길이에있어서실질적으로상이하지않지만서열에있어실질적으로상이할수있음을의미한다. 따라서, 100개의뉴클레오타이드의공지된서열 "B" 에대해적어도 80% 서열동질성을갖는폴리뉴클레오타이드로필수적으로이루어진폴리뉴클레오타이드 "A" 는, 폴리뉴클레오타이드 "A" 가, 길이가약 100개뉴클레오타이드 (nts) 이지만, 20개 nts까지가 "B" 서열로부터변할수있음을의미한다. 문제의폴리뉴클레오타이드서열은예를들면, 1 내지 15개의뉴클레오타이드의첨가가실질적으로동일하지않은서열이첨가되어의도된제2의구조를창조하는경우에서와같이, 프로브, 프라이머및다른분자도구등의특수유형을생산하는것과같은, 말단의변형으로인해보다길어지거나보다짧아질수있다. 이러한동일하지않은뉴클레오타이드는, 서열이 " 로필수적으로이루어진 " 에의해변형되는경우서열동질성의계산시고려되지않는다. g) Bcl-2 본원에사용된것으로서, 용어 "Bcl-2" 는세포자멸사에대한중요한조절점을구성하는프로- 및항-세포자멸사단백질의계열을말한다. 당해계열의구성원들은프로- 및항-세포자멸사단백질둘다를포함하며 Bcl-2 상동성 (BH) 1-4 도메인으로명명된 4개이하의보존된영역에서상동성을공유한다. 당해계열은 3개의주요소-부류로나누어질수있다 : 항-세포자멸사단백질, 프로-세포자멸사단백질, "BH3-만의" 단백질

26 [0208] Bcl-2 및 Bcl-X L 을포함하는항 - 세포자멸사단백질은모두모든 4 개의 BH 도메인을통해상동성을공유하는 " 다 중도메인 " 이다. 그러나, 프로-세포자멸사단백질은또한소분리되어 BH1-3 도메인에서서열상동성을소유하는, BAX 및 BAK와같은다중도메인단백질을포함한다. 보다멀게관련된 "BH3-만의" 단백질은지금까지모두프로-세포자멸사이며이들의세포자멸사기능에요구되는양친매성의 α-나선 BH3 영역내서열상동성을공유한다. [0209] [0210] [0211] [0212] [0213] [0214] [0215] 사람 BAK를암호화하는사람 BAK 유전자는, 수탁번호제U23765호이며, 문헌 [ 참조 : Chittenden et al. Nature 374: (1995)] 에기술되어있다. 사람 BAK-2 유전자는수탁번호제U16812호이며, 문헌 [ 참조 : Kiefer et al., Nature 374: (1995)] 에기술되어있다. 사람 BAX를암호화하는사람 BAX 유전자는수탁번호제 L22475호, 제L22474호및제L22473호이며, 문헌 [ 참조 : Oltvai et al., Cell 74: (1993)] 에기술되어있다. 본원에사용된것으로서, 어절 " 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 " 는적어도하나의사람 Bcl-2 프로- 세포자멸사단백질또는예를들면, 사람 BAK 또는사람 BAX와같은이의단편을암호화하는유전자를말한다. "BH3-만의단백질 " 은 Bcl-2 계열의제3 소세트를구성하며, 예를들면, BID, NOXA, PUMA, BIK, BIM 및 BAD를포함한다. 이들단백질은양친매성-나선 BH3 영역에서만서열상동성을공유하며, 나타낸당해돌연변이분석은이들의사멸활성에대한프로-세포자멸사구성원에서요구된다. 사람 BID를암호화하는사람 BID 유전자는수탁번호제NM_197966호, 제NM_197967호, 제NM_001196호이며진뱅크 (Genbank) 에기술되어있다. 사람 NOXA를암호화하는사람 NOXA 유전자는수탁번호제NM_021127호이며진뱅크에기술되어있다. 사람 PUMA를암호화하는사람 PUMA 유전자는수탁번호제NM_ 호, NM_ 호, 제NM_ 호, 제NM_014417호이며진뱅크에기술되어있다. 사람 BIK를암호화하는사람 BIK 유전자는수탁번호제NM_001197호이고진뱅크에기술되어있다. 사람 BIM을암호화하는사람 BIM 유전자는수탁번호제 NM_138621호, 제NM_207002호, 제NM_006538호, 제BCO33694호, 제AY305714호, 제AY305716호, 제AY423443호, 제 AY423442호, 제AY423441호이며진뱅크에기술되어있다. 사람 BAD를암호화하는사람 BAD 유전자는수탁번호제NM_032989호, 제NM_004322호, 제BC095431호이고진뱅크에기술되어있다. 본원에사용된것으로서, 어절, " 사람 BH3 암호화유전자 " 는적어도하나의사람 Bcl-2 BH3-만의단백질또는예를들면, 사람 BID, 사람 NOXA, 사람 PUMA, 사람 BIK, 사람 BIM 및사람 BAD와같은이의단편을암호화하는유전자를말한다. h) Bcl-2 계열단백질억제제, Bcl-2 계열억제제또는 Bcl-2 계열단백질의억제제본원에사용된것으로서, 본원에상호교환적으로사용된어절 "Bcl-2 계열단백질억제제 ", "Bcl-2 계열억제제 " 또는 "Bcl-2 계열단백질의억제제 " 는미토콘드리아외막침투 (MOMP) 를지배하고항-세포자멸사 (Bcl-2, Bcl-X L, Bcl-w, Bcl-B, BFL-1 및 MCI-1과같은 ) 인적어도하나의 Bcl-2 계열의유전자또는단백질에결합하고 이의활성을길항하거나억제하는, 소분자-, 항체-, 안티센스-, 소방해 RNA, 또는마이크로RNA-계화합물을포함하는, 어떠한유형 ( 예를들면, 비-선택적이거나선택적인 ) 의치료용화합물을말한다. Bcl-2 계열단백질억제제의예는본원의단락 B에기술된화합물 [ 즉, ABT-263( 이는 N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 )-5,5-디메틸-1-사이클로헥스-1-엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 모르폴린-4-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드 )], ABT-737 [ 공개된미국특허원제 호및제 호에기술된 N-(4-(4-((4'-클로로 (1,1'-비페닐)-2-일) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3- ( 디메틸아미노 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-니트로벤젠설폰아미드], Bcl-X L 억제제및이들의병용물을포함한다. [0216] [0217] i) Bcl-X L 선택적인억제제 ( 들 ) 본원에사용된것으로서, 어절 "Bcl-X L 선택적인억제제 ( 들 )" 은 Bcl-2 보다 Bcl-X L 에대해선택성을나타내는 Bcl-X L 억제제를말한다. Bcl-X L 억제제가 Bcl-X L 선택적인억제제인지를측정하는방법은당해분야에잘공지되어있다. 구체적으로, 이러한방법은 Bcl-X L 억제제화합물에대한억제상수 (Ki) 및결합선택성비 ( 예를들면, Bcl-X L K i :Bcl-2 K i ) 를측정함을포함한다. 억제상수 (Ki) 는효소-억제제복합체또는단백질 / 소분자복합체의해리상수이며, 여기서소분자는하나의단백질의다른단백질또는펩타이드에대한결합을억제한다. 억제상수는시간분석된-형광성공명에너지전달 (Time Resolved-Fluorescence Resonance Energy Transfer:

27 TR-FRET) 검사를사용하여측정할수있다. 화합물에대한 K i 가 ">" ( 초과 ) 특정수치로나타난경우, 이는결합친화성값 ( 예를들면, Bcl-X L 의경우 ) 이검사시측정된것보다큼을의미하는것으로의도된다. 화합물에대한결합선택성비가 ">"( 초과 ) 특정수치로나타난경우, 이는, Bcl-2보다 Bcl-X L 에대한특정화합물의선택성이나타낸수보다적어도큼을의미하는것으로의도된다. 화합물에대한 K i 이 "<"( 미만 ) 특정수치로나타난경우, 이는, 결합친화성값 ( 예를들면, Bcl-2의경우 ) 이사용된검사의검출한계보다더작음을의미하는것으로의도된다. 억제상수는왕방정식 (Wang's equation)( 참조 : Wang Zx,. An Exact Mathematical Expression For Describing Competitive Binding Of Two Different Ligands To A Protein Molecule. FEBS Lett. 1995, 360:111-4) 을사용하여측정하였다. [0218] [0219] [0220] [0221] [0222] [0223] [0224] [0225] [0226] [0227] [0228] [0229] [0230] j) 발현, 안티센스억제및공-제어 " 발현 " 은기능성최종-생성물의생산을말한다. 유전자의발현은유전자의전사및 mrna의전구체또는성숙한단백질로의해독을포함한다. " 안티센스억제 " 는표적단백질의발현을억제할수있는안티센스 RNA 전사체의생산을말한다. " 공-발현 " 은동일하거나실질적으로유사한외부또는내인성유전자의발현을제어할수있는센스 RNA 전사체의생산을말한다 ( 참조 : 미국특허제5,231,020호 ). k) 분리된본원에사용된것으로서, 핵산분자또는폴리뉴클레오타이드와관련하여용어 " 분리된 " 은핵산분자또는폴리뉴클레오타이드의천연공급원속에존재하는다른핵산분자또는폴리뉴클레오타이드로부터분리된핵산분자또는폴리뉴클레오타이드를말한다. 또한, cdna 분자와같은 " 분리된 " 핵산분자또는폴리뉴클레오타이드는, 재조합체기술로생산된경우다른세포물질, 또는배양배지를실질적으로포함하지않거나, 화학적으로합성되는경우화학적전구체또는다른화학물질을실질적으로포함하지않는다. 하나의국면에서, 핵산분자또는폴리뉴클레오타이드가분리된다. l) 유전자 " 유전자 " 는암호화서열의상부의조절서열 (5' 비-암호화서열 ) 및하부 (3' 비-암호화서열 ) 를포함하는, 특수단백질을발현하는핵산단편을말한다. m) 억제상수또는 Ki 본원에사용된것으로서, " 억제상수 " 또는 "Ki" 는효소-억제제복합체또는단백질 / 소분자복합체의해리상수를말하며, 여기서, 소분자는하나의단백질의다른단백질에대한결합을억제한다. 큰 Ki 값은낮은결합친화성을나타내고, 작은 Ki값은높은결합친화성을나타낸다. Ki는왕방정식 ( 참조 : Wang Z X,. An Exact Mathematical Expression For Describing Competitive Binding Of Two Different Ligands To A Protein Molecule. FEBS Lett. 1995; 360:111-4) 을사용함에의한것과같이, 당해분야에공지된어떠한방법을사용하여서도측정할수있다. 항-세포자멸사단백질억제제의결합친화성의전형적인척도는단백질과억제제 (Ki) 사이의결합과해리공정사이의균형이다. n) 천연유전자및키메라작제물 " 천연유전자 " 는이의자체조절서열과함께천연에서발견되는유전자를말한다. 대조적으로, " 키메라작제물 " 은천연에서일반적으로함께발견되지않는핵산단편의조합물을말한다. 따라서, 키메라작제물은상이한공급원으로부터기원한조절서열및암호화서열, 또는동일한공급원으로부터기원한조절서열및암호화서열을포함할수있으나, 천연에서정상적으로발견된것과는상이한방식으로배열된다. o) 핵산서열동질성퍼센트 (%) 핵산서열과관련하여 " 핵산서열동질성퍼센트 (%)" 는경우에따라서열을정렬하고갭을도입하여최대서열동질성퍼센트를달성한후, 목적서열내뉴클레오타이드와동일한후보물서열내뉴클레오타이드의퍼센트로정의한다. 핵산서열동질성 % 를측정하기위한목적의정렬은당해분야의기술내에있는각종방식, 예를들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와같은공공이용가능한컴퓨터소프트웨어를사용하여달성할수있다. 당해분야의숙련가는비교하는서열의완전한길이에걸쳐최대정렬을달성하는데요구되는어떠한알고리즘도포함하는, 정렬을측정하기위한적절한매개변수를측정할수있다. 뉴클레오타이드서열이정렬된경우, 제공된핵산서열 D( 이는제공된핵산서열 D에, 이와함께또는이에대

28 해특정의핵산서열동질성 % 를갖거나포함하는제공된핵산서열 C 로서대안적으로표현될수있다 ) 에, 이와 함께또는이에대해제공된핵산서열 C 의핵산서열동질성 % 은다음과같이계산할수있다 : [0231] [0232] [0233] [0234] [0235] [0236] [0237] [0238] [0239] [0240] [0241] [0242] [0243] [0244] [0245] 핵산서열동질성 % = W/Z*100 여기서 W는 C 및 D의서열정렬프로그램또는알고리즘의정렬에의한동일한매치 (match) 로기록된뉴클레오타이드의수이고, Z는 D내뉴클레오타이드의총수이다. 핵산서열 C의길이가핵산서열 D의길이와동등하지않은경우, D에대한 C의핵산서열동질성 % 는 C에대한 D의핵산서열동질성 % 와동일하지않을것이다. p) 폴리머라제쇄반응또는 PCR 다량의특수 DNA 분절의합성을위한기술인, " 폴리머라제쇄반응 " 또는 "PCR" 은일련의반복주기 [ 제조원 : 퍼킨엘머세투스인스트루먼츠 (Perkin Elmer Cetus Instruments), 코네티컷주노워크소재 ] 로이루어진다. 전형적으로, 이본쇄 DNA가열-변성되며, 표적분절의 3' 경계부에대해상보성인 2개의프라이머를저온에서어닐링한후중간온도에서연장시킨다. 이들 3개의연속적인단계중하나의세트를주기로언급한다. PCR은짧은시간동안주형의반복된복제에의해 DNA를수백만배증폭시키기위해사용된강력한기술이다 [ 참조 : (Mullis, K., et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 51 Pt 1: (1986)]; 유럽특허원제 50,424호 ; 유럽특허원제84,796호 ; 유럽특허원제258,017호, 유럽특허원제237,362호 ; 유럽특허원제 201,184호, 미국특허제4,683,202호 ; 미국특허제4,582,788호 ; 및미국특허제4,683,194호 ]. 당해공정을 DNA 합성을프라이밍 (priming) 하기위한특정의시험관내합성된올리고뉴클레오타이드의세트를사용한다. 프라이머의설계는분석하여야하는 DNA의서열에의존적이다. 당해기술은고온에서주형을용융시키고, 프라이머가주형내상보성서열에대해어닐링되도록한후주형을 DNA 폴리머라제로복제하는많은주기 ( 일반적으로 20 내지 50 주기 ) 를통해수행된다. PCR 반응의생성물은아가로즈겔내에서분리에이어에티디움브로마이드염색및 UV 투조 (transilluminatio n) 를사용한가시화에의해분석할수있다. 또는, 방사성 dntp를 PCR에가하여생성물내로표지를혼입시킬수있다. 이경우, PCR의생성물은겔을 x-선필름에노출시킴에의해가시화된다. 방사선표지된 PCR 생성물의가해진장점은, 개개의증폭생성물의수준이정량화될수있다는것이다. q) 폴리펩타이드 " 폴리펩타이드 " 는리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 변형된 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 또는 DNA 모사체 (PNA와같은 ), 및이의유도체, 및이의동족체의핵산중합체이다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는천연적으로존재하는핵산염기, 당및공유결합성내부-뉴클레오타이드 ( 골격 ) 연결로구성된중합체및유사하게기능하는비-천연적으로존재하는부위를갖는중합체를포함한다. 이러한변형되거나치환된핵산중합체는당해분야에잘공지되어있으며 " 유사체 " 로언급된다. 올리고뉴클레오타이드는일반적으로약 10개내지약 160개또는 200개뉴클레오타이드까지의짧은폴리뉴클레오타이드이다. 폴리뉴클레오타이드는또한핵산서열의유사체및 / 또는유도체, 및이의동족체를포함하는, 표적서열에특이적으로하이브리드화하는프라이머를포함한다. 폴리뉴클레오타이드는업자 [ 어플라이드바이오시스템스 USA 인코포레이티드 (Applied Biosystems USA Inc.)( 미국캘리포니아주포스터시티소재 ), 듀퐁 (DuPont)( 미국델라웨어주윌밍턴소재 ), 또는밀리겐 (Milligen)( 미국매사추세츠주베드퍼드소재 )] 로부터입수가능한것과같은상업적으로입수가능한장치를사용한고체-상합성과같은통상의기술에의해제조할수있다. 포스포로티오에이트및알킬화된유도체와같은변형된폴리뉴클레오타이드또한당해분야에공지된유사한방법에의해용이하게제조할수있다 ( 참조 : 미국특허제4,948,882 호, 제5,464,746호, 및제5,424,414호 ). r) 폴리펩타이드유사체본원에사용된것으로서, 용어 " 폴리펩타이드유사체 " 는변형된골격또는비-천연의내부-뉴클레오사이드연결을갖는중합체를말한다. 변형된골격은골격내에인원자를보유하는것들, 예를들면, 포스포로티오에티트,

29 키랄포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸및다른알킬포스포네이트, 및인원자를더이상갖지않는것들, 예를들면, 단쇄알킬또는사이클로알킬내부 -뉴클레오사이드연결에의해형성되거나, 헤테로원자및알킬또는사이클로알킬내부-뉴클레오사이드연결과혼합되거나, 하나이상의단쇄헤테로원자또는헤테로사이클릭내부-뉴클레오사이드연결로형성된골격을포함한다. 변형된핵산중합체 ( 유사체 ) 는하나이상의변형된당모이어티 (moiety) 를함유할수있다. [0246] [0247] [0248] [0249] [0250] [0251] [0252] [0253] [0254] [0255] [0256] 뉴클레오타이드단위의당및내부-뉴클레오사이드연결둘다가신규그룹으로대체된 RNA 또는 DNA 모사체인유사체가또한유용하다. 이들모사체에서, 염기단위는표적서열과의하이브리드화를위해유지된다. 탁월한하이브리드화특성을가진것으로밝혀진, 이러한모사체의예는펩타이드핵산 (PNA) 이다 ( 참조 : Buchardt, O., P. Nielsen, and R. Berg Peptide Nucleic Acids). s) 다배수유도제본원에사용된것으로서, 어절 " 다배수유도제 " 는하나이상이세포내에서다배수를유도하는, 소분자, 항체, 안티센스, 소방해 RNA 또는마이크로RNA-계화합물을포함하는, 어떠한유형 ( 예를들면, 비-선택적이거나선택적인 ) 의치료학적화합물을말한다. 하나이상의세포에서다배수의유도또는증거를측정하는방법은당해분야에공지된통상의기술을사용하여수득할수있다. 예를들면, 다배수의증거는 p53의상승된발현을검출함으로써측정할수있다. p53은야생형 p53을지닌세포내에서다배수체화를위한대리인자이다 ( 참조 : Gizatullin, F. et al., "The Aurora Kinase inhibitor VX-680 induces endoreduplication and apoptosis preferentially in cells with compromised p53-dependent postmitotic checkpoint function," Cancer Res. 66, (2006)]. 또한, 다배수가유도된세포는세포크기및다핵화에있어서중대한형태학적증가를나타내며, 이들둘다는당해분야에공지된통상의기술을사용하여측정할수있다. 다배수유도제의예는아우로라키나제억제제, 미소관억제제 ( 예를들면, 탁소테레, 빈크리스틴, 노코다졸, 파클리탁셀또는콜세미드와같은 ), 판-키나제억제제 ( 예를들면, 스타우로스포린과같은 ), 온콜리틱바이러스 (oncolytic virus)( 예를들면, ONYX-015와같은 ), 아크리딘오렌지, 돌라스타인-10, 노스카핀, 토포이소머라제 II 억제제 ( 예를들면, ICRF-187 또는 ICRF-193과같은 ), 2-{4-[(7-클로로-2-퀴녹살리닐 ) 옥시 ] 페녹시 } 프로피온산, 2-{4-[(7-브로모-2-퀴놀리닐 ) 옥시 ] 페녹시 } 프로피온산, 플라티코딘 D, 미소관독소 ( 예를들면, JG-03-14와같은 ), 액틴중합화억제제 ( 예를들면, 사이토칼라신 B와같은 ), 비스트라미드 A 또는항종양항생제 ( 예를들면, 미트라마이신 SKI와같은 ) 을포함하나, 이에한정되지않는다. t) 예정된수준본원에사용된것으로서, 용어 " 예정된수준 " 은일반적으로예정된수준에대해검사결과를비교함으로써진단결과를평가하는데사용되는컷-오프값 (cut-off value) 검사를말하며, 여기서예정된수준이각종임상매개변수 [ 예를들면, 질환의위험, 중증도, 진행 / 비-진행 / 개선의평가, 시험시료의노화측정, 시험시료 ( 예를들면, 혈청또는혈장 ) 가용혈되어있는지에대한측정등 ] 와이미연결되거나관련되어있다. 사용될수있는예정된수준의예는하나이상의질환또는상태로임의로고생할수있는하나이상의대상체로부터수득된기본선수준이다. 컷오프값이검사의특성에따라변할수있음을잘공지되어있다. 또한본원명세서의교시내용을다른검사에대해조정하여당해설명을기초로다른검사에대해검사-특이적인컷-오프값을수득하는것은당해분야의숙련가에게익숙하다. u) 프라이머또는프로브본원에사용된것으로서 " 프로브 " 또는 " 프라이머 " 는, 길이가적어도 8개뉴클레오타이드이고표적영역내서열과프로브또는프라이머내적어도하나의서열의상보성에기인하여, 표적서열과하이브리드구조를형성하는폴리뉴클레오타이드이다. 프로브의폴리뉴클레오타이드영역은 DNA 및 / 또는 RNA 및 / 또는합성뉴클레오타이드유사체로구성될수있다. 바람직하게는, 프로브는폴리머라제쇄반응동안에표적서열을준비하는데사용된서열또는서열들에대해상보성인서열을함유하지않는다. v) 재조합체 " 재조합체 " 는예를들면, 화학적합성또는유전가공기술에의한핵산의분리된분절의조작에의한, 2개의달리분리된서열의분절의인공적인조합물을말한다. w) 특이적으로하이브리드화되는

30 [0257] [0258] [0259] [0260] [0261] [0262] [0263] [0264] [0265] [0266] [0267] [0268] [0269] " 특이적으로하이브리드화되는 " 은제2 핵산에대해검출가능하게및특이적으로결합하는핵산의능력을말한다. 폴리뉴클레오타이드는비-특이적인핵산에의해검출가능한결합의적절한양을최소화하는하이브리드화및세척조건하에서표적핵산쇄와특이적으로하이브리드화한다. x) 스트링전시 (stringency) 또는스트링전트조건상보성단편을하이브리드화하는일본쇄 DNA의특이성은반응조건의스트링전시로측정한다. 하이브리드화스트링전시는 DNA 이중쇄 (duplex) 를형성하는경향이감소함에따라증가한다. 핵산하이브리드화반응에서, 스트링전시는특이적인하이브리드화 ( 고스트링전시 ) 를선호하기위해선택될수있다. 거의특이적이지않은하이브리드화 ( 저스트링전시 ) 를사용하여관련된, 그러나정확하지않은 DNA 분자 ( 동종, 그러나동일하지않은 ) 또는분절을확인할수있다. DNA 이중쇄는 (1) 상보성염기쌍의수, (2) 염기쌍의유형, (3) 반응혼합물의염농도 ( 이온강도 ), (4) 반응물의온도및 (5) DNA 이중쇄안정성을감소시키는, 포름아미드와같은특정유기용매의존재에의해안정화된다. 일반적인시도는온도를변화시키는것이며 : 더높은상대온도는스트링전트반응조건을보다더생성한다 ( 참조 : 하이브리드화반응의스트링전시의탁월한설명을제공하는, Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, et al Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York). " 스트링전트조건 " 하에서하이브리드화는, 서로에대해적어도 60% 상동성인뉴클레오타이드서열이하이브리드화되어남아있는하이브리드화프로토콜을의미한다. 폴리뉴클레오타이드는펩타이드 ( 예를들면, 생체내에서숙주세포수용체를표적화하기위한 ) 와같은다른첨부된그룹, 또는세포막을통과하는수송을촉진하는제제를포함할수있다. 또한, 올리고뉴클레오타이드는하이브리드화-개시된절단제 [ 참조 : van der Krol et al., Biotechniques. 6: (1988)] 또는인터카큘레이팅제 (intercalculating agent)[ 참조 : Zon, G., Pharm Res. 5: (1988)] 로변형시킬수있다. 올리고뉴클레오타이드는다른분자, 예를들면, 펩타이드, 하이브리드화개시된교차-결합제, 수송제, 하이브리드화-개시된절단제등에접합시킬수있다. y) 대상체 ( 들 ) 또는환자 ( 들 ) 본원에사용된것으로서, 용어 " 대상체 " 및 " 환자 " 는, 대상체가어떠한형태의치료를받았는지또는현재받고있는지에상관없이상호교환적으로사용된다. 본원에사용된것으로서, 용어 " 대상체 " 및 " 대상체들 " 은포유동물 { 예를들면, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니아피크, 고양이, 개, 랫트및마우스, 비-사람영장류 [ 예를들면, 시노몰구스원숭이 (cynomolgous monkey), 침팬지등과같은원숭이 ] 및사람 } 을포함하나, 이에한정되지않는어떠한척추동물을말한다. 바람직하게는, 대상체는사람이다. 대상체또는환자들은살아있거나사체일수있다. z) 표적서열또는표적핵산서열 " 표적서열 " 또는 " 표적핵산서열 " 은예를들면, 폴리뉴클레오타이드프라이머또는프로브를사용하여증폭시키거나, 검출하거나또는둘다를수행할수있는예를들면, 유전자, 또는이의상보체또는단편을포함하는핵산서열을의미한다. 또한, 용어표적서열이때때로이본쇄핵산서열을언급한다고해도 ; 표적서열은또한일본쇄일수있다. 표적이이본쇄인경우, 폴리뉴클레오타이드프라이머서열은바람직하게는표적서열의쇄둘다를증폭시킨다. 특수유기체에대해보다특이적이거나특이적이지않은표적서열을선택할수있다. 예를들면, 표적서열은전체속에대해, 하나이상의속에대해, 종또는아종, 혈청군, 영양요구체형, 혈청형, 균주, 분리체및유기체의다른소세트에대해특이적일수있다. aa) 시험시료 " 시험시료 " 는대상체, 또는생물학적유액으로부터취한시료를의미하며, 여기서시료는표적서열을함유할수있다. 시험시료는어떠한공급원, 예를들면, 조직, 혈액, 타액, 가래, 점액, 땀, 뇨, 요도면봉, 경부면봉, 비뇨생식기또는항문면봉, 결막면봉, 안구렌즈유액, 뇌척수액등으로부터취할수있다. 시험시료는 (i) 공급원으로부터수득된것으로서직접 ; 또는 (ii) 시료의특성을변형시키기위한전-처리 (pretreatment) 후에사용할수있다. 따라서, 시험시료는예를들면, 혈액으로부터혈장또는혈청을제조하고, 세포또는바이러스입자를파괴하고, 고체물질로부터액체를제조하고, 점성액을희석시키고, 액체를여과하고, 시약을가하고, 핵산을정제하는등에의해사용전에전-처리할수있다. bb) 치료학적유효량용어 " 치료학적유효량 " 은, 환자에게투여시바람직한치료효과를생성하기에, 예를들면, 암성종양의성장을

31 정지하거나수축시키거나암세포또는종양을사멸시키는데효과적인, 약물의양을의미한다. [0270] [0271] cc) " 시간분석된-형광성공명에너지전달 " 본원에사용된것으로서, 어절 " 시간분석된-형광성공명에너지전달 " 또는 "TR-FRET" 는 TRF( 시간-분석된형광성 ) 및 FRET( 형광성공명에너지전달 ) 의원리를단일화하는검사를말한다. 다수의 TR-FRET 검사가공지되어있으며당해분야에시판된다. 본발명에사용될수있는 TR-FRET의예는하기기술되어있다. [0272] [0273] [0274] [0275] [0276] [0277] [0278] [0279] [0280] [0281] 프로브합성사용하기위한하기기술된모든시약은달리명시하지않는한판매회사로부터입수할수있다. 디이소프로필에틸아민 (DIEA), 디클로로메탄 (DCM), N-메틸피롤리돈 (NMP), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일 )-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트 (HBTU), N-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt) 및피페리딘을포함하는펩타이드합성시약은어플라이드바이오시스템스, 인코포레이티드 [Applied Biosystems, Inc.(ABI), 캘리포니아주포스터시티소재 ] 또는아메리칸바이오어낼리티칼 (American Bioanalytical, 매사추세츠주나틱소재 ) 로부터입수할수있다. 예비로딩된 (preloaded) 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 (Fmoc) 아미노산카트릿지 (Fmoc-Ala-OH, Fmoc- Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile- OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmor-Gln(Trt)-OH, Fmoc- Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH) 는 ABI 또는아나스펙 (Anaspec, 캘리포니아주산호세소재 ) 로부터입수할수있다. 펩타이드합성수지 (Fmoc-Rink 아미드 MBHA 수지 ) 및 Fmoc-Lys(Mtt)-OH는노바바이오켐 (Novabiochem, 캘리포니아주샌디에고소재 ) 로부터입수할수있다. 단일의-이성체 6-카복시플루오레세인석신이미딜에스테르 (6-FAM-NHS) 는아나스펙 (Anaspec) 으로부터입수할수있다. 트리플루오로아세트산 (TFA) 은오크우드프로덕츠 (Oakwood Products, 샌프란시스코주웨스트콜롬비아소재 ) 로부터입수할수있다. 티오아니졸, 페놀, 트리이소프로필실란 (TIS), 3,6-디옥사-1,8-옥탄디티올 (DODT) 및이소프로판올은알드리치케미칼코포레이션 (Aldrich Chemical Co., 위스콘신주밀워키소재 ) 로부터입수할수있다. 매트릭스-보조된레이저탈착이온화질량-분광법 (MALDI-MS) 은어플라이드바이오시스템스보이아거 (Applied Biosystems Voyager) DE-PRO MS 상에기록할수있다. 전자분무질량-분광법 (ESI- MS) 은피니간 (Finnigan) SSQ7000[ 제조원 : 피니간코포레이션 (Finnigan Corp.), 캘리포니아주산호세소재 ] 에양성및음성이온방식둘다로기록할수있다. 고체-상펩타이드합성 (SPPS) 을위한일반적인과정펩타이드는최대 250μmol의예비로딩된왕수지 / 용기 (vessel) 를사용하여 ABI 433A 펩타이드합성기상에서 250μmol 규모의 Fastmoc TM 커플링주기로합성할수있다. 형광단의부착위치를제외하고는, 1 mmol 표준 Fmoc-아미노산을함유하는예비로딩된카트릿지를사용하며, 여기서 1 mmol Fmoc-Lys(Mtt)-OH가카트릿지속에위치할수있고전도도피드백모니터링과함께사용될수있다. N-말단아세틸화는표준커플링조건하에서카트릿지내에서 1 mmol 아세트산을사용하여달성할수있다. 리신으로부터 4-메틸트리틸 (Mtt) 의제거합성기로부터의수지를 DCM으로 3회세척하고습윤상태로유지시킬수있다. 150 ml의 95:4:1 디클로로메탄 : 트리이소프로필실란 : 트리플루오로아세트산을수지층을통해 30분에걸쳐유동시킬수있다. 당해혼합물은짙은황색으로변한후담황색으로옅어질수있다. 100 ml의 DMF를층을통해 15분에걸쳐유동시킬수있다. 이후에, 수지를 DMF로 3회세척하고여과한다. 닌하이드린시험은 1차아민에대해강력한시그날을나타내어야한다. 6-카복시플루오레세인-NHS (6-FAM-NHS) 를사용한수지표지화수지는 1% DIEA/DMF 중 2 당량의 6-FAM-NHS로처리하고주위온도에서밤새교반하거나진탕시킬수있다. 완료되면, 수지를배수하고, DMF로 3회, (1% DCM 및 1% 메탄올로 3회세척하고건조시켜닌하이드린시험에의해음성인오렌지수지를제공할수있다. 수지-결합된펩타이드의절단및탈보호를위한일반적인과정펩타이드는 80% TFA, 5% 물, 5% 티오아니졸, 5% 페놀, 2.5% TIS, 및 2.5% EDT(1 ml/0.1 g 수지 ) 로이루어진절단콕테일 (cleavage cocktail) 속에서주위온도로 3시간동안진탕시켜수지로부터절단할수있다. 수지를

32 여과로제거하고 TFA 로 2 회세정할수있다. TFA 를여액으로부터증발시키고, 생성물을에테르 (10 ml/0.1 g 수 지 ) 로침전시키고, 원심분리에의해회수하고, 에테르 (10 ml/0.1 g 수지 ) 로 2 회세척하고건조시켜조악한 (crude) 펩타이드를수득할수있다. [0282] [0283] 펩타이드의정제를위한일반적인과정 조악한펩타이드는 Unipoint 분석소프트웨어 [ 제조원 ; 길슨, 인코포레이티드 ((Gilson, Inc.), 위스콘신주미 들턴소재 ] 를가동시키는길슨제조 HPLC 시스템상에서공극크기가 100A 인 Delta-Pak TM C18 15μm 입자로팩킹되고하기나열된구배방법중하나로용출시키는 2개의 25x100 mm 분절을함유하는방사압축컬럼상에서정제할수있다. 1 내지 2 밀리리터의조악한펩타이드용액 (90% DMSO/ 물중 10 mg/ml) 을주입당정제할수있다. 각각의수행으로부터생성물 ( 들 ) 을함유하는피크를혼주시키고동결건조시킬수있다. 모든예비수행을완충액 A: 0.1% TFA-물및완충액 B: 아세토니트릴로서의용출액으로 20mL/ 분에서수행할수있다. [0284] [0285] [0286] 분석적 HPLC를위한일반적인과정공극크기가 120A 인 ODS-AQ 5μm 입자가패킹된 4.6 x 250 mm YMC 컬럼상에서 HPLC 3D 켐스테이션소프트웨어버젼 (ChemStation software version) A.03.04( 제조원 : 휴렛-팩커드 (Hewlett-Packard), 캘리포니아주팔로알토소재 ) 로수행하는휴렛-팩커드 1046A 형광성검출기와다이오드-배열검출기가장착된휴렛-팩커드 1200 시리즈시스템상에서분석 HPLC를수행하고출발조건에서예비평형화한후 7분동안하기나열된구배방법들중하나로용출시켰다. 용출은완충액 A: 0.1% TFA-물및완충액 B: 아세토니트릴일수있다. 모든구배에대한유동속도는 1 ml/ 분일수있다. F-Bak: 펩타이드프로브 : 아세틸--( 서열번호 1)GQVGRQLAIIGDK(6-FAM)- ( 서열번호 2) INR-NH 2. Fmoc-Rink 아미드 MBHA 수지를일반적인펩타이드합성과정을사용하여연장시켜, 보호된수지-결합된펩타이드 (1.020 g) 를제공할수있다. Mtt 그룹을제거하고, 6-FAM-NHS로표지하고절단하고본원의상기에기술된바와같이탈보호시켜오렌지색고체 (0.37 g) 로서의조악한생성물을제공할수있다. 당해생성물은 RP- HPLC로정제할수있다. 주요피크를통과하는분획을분석적 RP-HPLC로시험하고, 황색고체로서표제화합물 ( g) 을제공하는주요피크를갖는순수한분획을분리하여동결건조시킬수있다 ; MALDI-MS m/z= ((M+H) + ). [0287] [0288] 펩타이드프로브 F-Bak: 아세틸--( 서열번호 1) GQVGRQLAIIGDK(6-FAM)--( 서열번호 2) INR-NH 2 의대안적인합성보호된펩타이드는플루오레세인 (6-FAM)-표지된리신을제외하고는예비-로딩된 1mmol 아미노산카트릿지를사용하는 Fastmoc TM 커플링주기로수행하는어플라이드바이오시스템스 433A 자동화된펩타이드합성기상에서 0.25 mmol Fmoc-Rink 아미드 MBHA 수지 [ 제조원 : 노바바이오켐 (Novabiochem)] 상에서조립할수있으며, 여기서 1 mmol Fmoc-Lys(4-메틸트리틸 ) 은카트릿지내로칭량할수있다. N-말단아세틸그룹은 1 mmol 아세트산을카트릿지내에놓음으로써혼입시킬수있으며위에서기술한바와같이커플링시킬수있다. 4-메틸트리틸그룹의선택적인제거는 15분에걸쳐수지를통해유동하는 95:4:1 DCM:TIS:TFA(v/v/v) 의용액에이어디메틸포름아미드의유동을퀀칭 (quenching) 시킴으로써달성할수있다. 단일-이성체 6-카복시플루오레세인-NHS 는 DMF 속에서 1% DIEA 속에서리신측쇄와반응시키고닌하이드린시험에의해완전히확인하였다. 펩타이드를수지로부터절단하고측쇄를 80:5:5:5:2.5:2.5 TFA: 물 : 페놀 : 티오아니솔 : 트리이소프로필실란 :3,6-디옥사-1,8-옥탄디티올 (v/v/v/v/v/v) 로처리하여탈보호시키고, 조악한펩타이드는디에틸에테르로침전시켜회수하였다. 조악한펩타이드를역-상고-성능액체크로마토그래피로정제하고, 이의순도및실체를분석적역-상고-성능액체크 로마토그래피및매트릭스 - 보조된레이저 - 탈착질량 - 분광법 (m/z= ((M+H) + )) 으로확인하였다. [0289] [0290] 시간분석된-형광성공명에너지전달 (TR-FRET) 검사대표적인화합물을 50μM(2x 출발농도 ; 10% DMSO) 로출발하는디메틸설폭사이드 (DMSO) 속에일련희석시키고, 10μL를 384-웰플레이트로이전시켰다. 이후에, 10μL의단백질 / 프로브 / 항체혼합물을각각의웰에하기표 aa에나열된최종농도에서가할수있다

33 [0291] [ 표 aa] [0292] [0293] [0294] [0295] [0296] [0297] [0298] [0299] [0300] [0301] [0302] [0303] [0304] [0305] [0306] 6-FAM = 6-카복시플루오레세인 ; Tb = 테르비움 ; GST = 글루타티온 S-트랜스퍼라제이후에시료를진탕기속에서 1분동안혼합하고추가로 3시간동안실온에서항온처리하였다. 각각의검사를위해, 프로브 / 항체및단백질 / 프로브 / 항체를각각의검사플레이트상에음성및양성대조군으로서각각포함시킬수있다. 형광성을엔비젼 (Envision)( 제조원 : 퍼킨엘머 ) 상에서 340/35nm 여기여과기및 520/525(F- Bak 펩타이드 ) 및 495/510nm(Tb-표지된항-히스티딘항체 ) 방사여과기상에서측정할수있다. dd) 치료하다, 치료하는또는치료본원에사용된것으로서, 용어 " 치료하다 ", " 치료하는 " 또는 " 치료 " 는 (i) 발생하는병리학적상태를예방하고 ( 예를들면, 예방 ); (ii) 병리학적상태를억제하거나이의발달을정지하고 ; (iii) 병리학적상태를완화시키고 / 시키거나 (i) 내지 (iii) 항목중어느것이대상체에서성공적인지에상관없이, 이러한병리학적상태와관련된하나이상의증상의중증도를예방하거나감소시키기위한노력에서대상체에게하나이상의활성제또는화합물을투여함을의미한다. ee) 변이체폴리펩타이드또는변이체핵산서열 " 변이체폴리펩타이드 " 또는 " 변이체핵산서열 " 은적어도약 60% 핵산서열동질성, 보다바람직하게는적어도약 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 핵산서열동질성을가진폴리뉴클레오타이드및추가의보다바람직하게는제공된핵산서열과적어도약 99% 핵산서열동질성을갖는폴리뉴클레오타이드를의미한다. 변이체는천연의뉴클레오타이드서열을포함하지않는다. 일반적으로, 변이체폴리뉴클레오타이드는, 길이가적어도약 8개뉴클레오타이드, 흔히적어도약 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개뉴클레오타이드, 또는심지어길이가약 75 내지 200개또는그이상의뉴클레오타이드이다. 뉴클레오타이드의영역은, 핵산분자가천연적으로존재하는뉴클레오타이드이외의모이어티로치환, 화학적, 효소적또는다른적절한수단에의해공유결합적으로변형된유도체를포함한다. B. Bcl-2 계열단백질억제제하나의국면에서, 본원명세서의교시내용은특정의 Bcl-2 계열단백질억제제화합물에관한것이다. 본원의화합물의가변모이어티는식별자 ( 숫자및 / 또는알파벳어깨글자를갖는대문자 ) 에의해나타내며구체적으로구현될수있다. 적절한원자가들이모든모이어티및이들의병용물에대해유지되며 1개이상의원자를가진 1가모이어티가이들의좌측말단을통해부착되어있는것을이해해야한다. 또한, 가변모이어티의구체적인국면은동일한식별자를갖는다른구체적인국면과동일하거나상이할수있음을이해해야한다. 본원명세서의교시내용의화합물은 R 또는 S 구조로비대칭적으로치환된탄소원자를함유할수있으며, 여기서용어 "R" 및 "S" 는문헌 [ 참조 : Pure Appl. Chem. (1976) 45, 13-10] 에정의되어있다. 등량의 R 및 S 배열을비대칭적으로치환된탄소원자들을갖는화합물은이들원자에서라세믹이다. 다른배열에비해 1개의배열이과량인원자들은과량의배열로지명되며, 바람직하게는약 85% 내지 90% 과량, 보다바람직하게는약 95% 내지 99% 의과량, 및훨씬더바람직하게는약 99% 초과의과량으로지명된다. 따라서, 본원명세서의교시내

34 용은라세믹혼합물및이의화합물들의상대적및절대적부분입체이성체들을포함하는것으로의미된다. [0307] [0308] [0309] [0310] 본원명세서의교시내용의화합물은또한 Z 또는 E 배열의탄소-탄소이중결합또는탄소-질소이중결합을함유할수있으며, 여기서, 용어 "Z" 는탄소-탄소또는탄소-질소이중결합의동일한면상의보다큰 2개의치환체를나타내고용어 "E" 는탄소-탄소또는탄소-질소이중결합의대향하는면들상의보다큰 2개의치환체를나타낸다. 본원명세서의교시내용의화합물은또한 "Z" 와 "E" 이성체의혼합물로서존재할수있다. 본원명세서의교시내용의화합물은또한토우토머또는이의평형혼합물로존재할수있으며, 여기서화합물의양성자는하나의원자에서다른것으로이동한다. 토우토머의예는케토-에놀, 페놀-케토, 옥심-니트로소, 니트로-아시 (aci), 이민-엔아민등을포함하나, 이에한정되지않는다. NH, C(O)OH, OH 또는 SH 모이어티를갖는화학식 II의화합물은프로드럭-형성모이어티에부착되어있을수있다. 프로드럭-형성모이어티는대사공정에의해제거되어생체내에서유리된 NH, C(O)OH, OH 또는 SH를갖는화합물을방출한다. 프로드럭은가용성및 / 또는소수성, 위장관에서흡수, 생체이용율, 조직침투및청소율과같이화합물의이러한약력학적특성을조절하는데유용하다. 시험관내또는생체내대사공정에의해생산된, 화학식 II의화합물의대사산물은 Bcl-X L 단백질, Bcl-2 단백 질또는 Bcl-w 단백질과같은항 - 세포자멸사계열단백질구성원의발현과관련된질환을치료하기위한용도도 가질수있다. [0311] 시험관내또는생체내에서대사되어화학식 II 의화합물을형성할수있는특정전구체화합물은또한 Bcl-X L 단백질, Bcl-2 단백질또는 Bcl-w 단백질의것과같은항 - 세포자멸사계열단백질구성원의발현과관련된질환 을치료하기위한유용성을가질수있다. [0312] [0313] [0314] [0315] [0316] 화학식 II의화합물은산부가염, 염기성부가염또는양쪽성이온으로존재할수있다. 화학식 II의화합물의염은이들의분리또는이후이들의정제동안제조된다. 산부가염은화학식 II의화합물과산의반응으로부터기원한것들이다. 따라서, 화학식 II의화합물의아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 중탄산염, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트 ( 베실레이트 ), 비설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 디글루코네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글리세로포스페이트, 글루타메이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 락토비오네이트, 락테이트, 말레이트, 메시틸렌설포네이트, 메탄설포네이트, 나프틸렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 포스페이트, 피크레이트, 프로피오네이트, 석시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 트리클로로아세틱, 트리플루오로아세틱, 파라-톨루엔설포네이트, 및운데카노에이트염이본원명세서의교시내용에포함됨을의미한다. 화합물의염기성부가염은화학식 II의화합물과리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘및마그네슘과같은양이온의중탄산염, 탄산염, 수산화물또는인산염과의반응으로부터기원한것들이다. 화학식 II의화합물은예를들면, 볼내로, 안내로, 경구적으로, 삼투압으로, 비경구적으로 ( 근육내, 복강내, 흉골내, 정맥내, 피하로 ), 직장으로, 국소적으로, 경피내로, 질내로및동맥내로및또한동맥내주사, 주입및예를들면, 스텐트를사용한, 예를들면, 혈관형성과같은체내에서교체로투여될수있다. 화학식 II의화합물의치료학적유효량은치료받는사람, 치료하는질환및이의중증도, 이를포함하는조성물, 투여시간, 투여경로, 치료기간, 효능, 청소율및다른약물이공-투여되는지여부에의존한다. 조성물을환자에게단일투여량또는분할된투여량으로매일투여하기위해사용된화학식 II의화합물의양은약 0.03 내지약 200mg/kg 체중이다. 단일투여량조성물들은이들양또는이들의약수의조합을함유한다. 화학식 II의화합물은부형제의존재또는부재하에투여될수있다. 부형제는캡슐화제및흡수촉진제, 항산화제, 결합제, 완충제, 피복제, 착색제, 희석제, 붕해제, 유화제, 연장제, 여과제, 풍미제, 습윤제, 윤활제, 향료, 방부제, 추진제, 방출제, 멸균제, 감미제, 가용화제, 습윤제, 이의혼합물등과같은첨가제를포함하나, 이에한정되지않는다. 경구투여될화학식 II의화합물을포함하는조성물의제조를위한부형제는, 한천, 알긴산, 수산화알루미늄, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 1,3-부틸렌글리콜, 카보머, 카스터오일, 셀룰로즈, 셀룰로즈아세테이트, 코코아버터, 옥수수전분, 옥수수오일, 면화씨오일, 크로스-포비돈, 디글리세라이드, 에탄올, 에틸셀룰로즈, 에틸라우레이트, 에틸올레이트, 지방산에스테르, 젤라틴, 배아오일, 글루코즈, 글리세롤, 땅콩오일, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈, 이소프로판올, 등장성염수, 락토즈, 수산화마그네슘, 스테아르산마그네슘, 맥아,

35 만니톨, 모노글리세라이드, 올리브오일, 땅콩오일, 인산칼륨염, 감자전분, 포비돈, 프로필렌글리콜, 링거액, 잇꽃오일, 참깨오일, 나트륨카복시메틸셀룰로즈, 인산나트륨염, 나트륨라우릴설페이트, 나트륨소르비톨, 대두오일, 스테아르산, 스테아릴푸마레이트, 슈크로즈, 표면활성제, 활석, 트라가칸트, 테트라하이드로푸르푸릴알코올, 트리글리세라이드, 물, 이의혼합물등을포함하나, 이에한정되지않는다. 안내로또는경구로투여될화학식 II의화합물을포함하는조성물의제조를위한부형제는 1,3-부틸렌글리콜, 카스터오일, 옥수수오일, 면화씨오일, 에탄올, 소르비탄의지방산에스테르, 배아오일, 땅콩오일, 글리세롤, 이소프로판올, 올리브오일, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 참깨오일, 물, 이의혼합물등을포함하나, 이에한정되지않는다. 삼투압적으로투여될화학식 II의화합물을포함하는조성물의제조를위한부형제는클로로플루오로하이드로카본, 에탄올, 물, 이의혼합물등을포함하나, 이에한정되지않는다. 비경구적으로투여될화학식 II의화합물을포함하는조성물의제조를위한부형제는 1,3-부탄디올, 카스터오일, 옥수수오일, 면화씨오일, 덱스트로즈, 배아오일, 땅콩오일, 리포좀, 올레산, 올리브오일, 땅콩오일, 링거액, 잇꽃오일, 참깨오일, 대두오일, U.S.P. 또는등장성염화나트륨용액, 물, 이의혼합물등을포함하나, 이에한정되지않는다. 직장으로또는질내로투여될화학식 II의화합물을포함하는조성물의제조를위한부형제는코코아버터, 폴리에틸렌글리콜, 왁스, 이의혼합물등을포함하나이에한정되지않는다. [0317] [0318] [0319] 본원명세서의교시내용은또한치료학적유효량의화학식 II의화합물을포함하는약제학적조성물및치료학적유효량의하나또는하나이상의추가의치료제및 / 또는이온화방사선을환자에게투여함을포함하여, 환자에서암과같은비정상적인세포성장및 / 또는조절되지않는세포자멸사를포함하는질환상태를치료하는병용치료학적방법을포함한다. 병용치료학적방법은화학식 II의화합물과하나이상의추가의치료제또는이온화방사선을환자에게어떠한바람직한투여요법및 / 또는스케쥴요법을사용하여투여함을포함한다. 화학식 II의화합물은알킬화제, 혈관형성억제제, 항체, 항대사제, 항유사분열제, 증식억제제, 항바이러스제, 아우로라키나제억제제, 다른세포자멸사촉진제 ( 예를들면, Bcl-X L, Bcl-w 및 Bfl-1) 억제제, 사멸수용체경 로의활성인자, Bcr-Abl 키나제억제제, BiTE( 이중-특이적인 T 세포인게이저 (Engager)) 항체, 항체약물공액체, 생물제반응개질제, 사이클린의존성키나제억제제, 세포주기억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병바이러스종양유전자동족체 (ErbB2) 수용체억제제, 성장인자억제제, 열쇼크단백질 (HSP)-90 억제제, 히스톤데아세틸라제 (HDAC) 억제제, 호르몬치료요법, 면역제, 세포자멸사단백질의억제제 (IAP) 의억제제, 끼어들기항생제 (intercalating antibiotic), 키나제억제제, 키네신억제제, Jak2 억제제, 라파마이신억제제의포유동물표적, 마이크로RNA, 유사분열-활성화된세포내시그날-조절된키나제억제제, 다가결합단백질, 비-스테로이드성소염약물 (NSAID), 폴리 ADP( 아데노신디포스페이트 )-리보스폴리머라제 (PARP) 억제제, 백금화학치료제, 폴로-유사키나제 (Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제 (PI3K) 억제제, 프로테오좀억제제, 푸린유사체, 피리미딘유사체, 수용체타이로신키나제억제제, 에티노이드 / 델토이드식물알칼로이드, 소억제성리보핵산 (sirna), 토포이소머라제억제제, 유비퀴틴리가제억제제등, 및이들제제중하나이상과의병용물과함께사용되는경우유용한것으로예측된다. [0320] [0321] BiTE 항체는 T-세포를지시하여 2개세포를동시결합시킴으로써암세포를공격하는이중-특이적인항체이다. 이후에, T-세포는표적암세포를공격한다. BiTE 항체의예는아데카투무마브 (adecatumumab)(micromet MT201), 블리나투모마브 (blinatumomab)(micromet MT103) 등을포함한다. 이론에한정되지않고, T-세포가표적암세포의세포자멸사를유발하는메카니즘중하나는페르포린및그란자임 B를포함하는, 세포분해입자성분들의세포외배출에의한다. 이와관련하여, Bcl-2는페르포린및그란자임 B 둘다에의한세포자멸사의유도를약화시키는것으로밝혀졌다. 이들데이타는, Bcl-2의억제가암세포에대해표적화되는경우 T-세포에의해유발된세포독성효과를향상시킬수있음을제안한다 [ 참조 : V. R. Sutton, D. L. Vaux and J. A. Trapani (1997) J. of Immunology. 158 (12): 5783]. SiRNA는내인성 RNA 염기또는화학적으로변형된뉴클레오타이드를갖는분자이다. 변형은세포활성을폐지하지않고, 오히려증가된안정성및 / 또는증가된세포효능을부여한다. 화학적변형의예는포스포로티오에이트그룹, 2'-데옥시뉴클레오타이드, 2'-OCH3-함유리보뉴클레오타이드, 2'-F-리보뉴클레오타이드, 2'-메톡시에틸리보뉴클레오타이드, 이들의병용물등을포함한다. sirna는다양한길이 ( 예를들면, 10 내지 200개 bp) 및구조 ( 예를들면, 헤어핀, 단일 / 이본쇄, 돌출 (bulge), 닉 (nick)/ 갭 (gap), 미스매치 ) 를가질수있으며세포내에서가공되어활성인유전자사일런싱을제공한다. 이본쇄 sirna(dsrna) 는각각의쇄 ( 평활말단 ) 또는비대칭말단 ( 오우버행 (overhang)) 에동일한수의뉴클레오타이드를가질수있다. 1 내지 2개의뉴클레오타이드의오

36 우버행은센스및 / 또는안티센스쇄상에존재할수있으며, 제공된쇄의 5'- 및 / 또는 3'-말단에존재할수있다. 예를들어, sirna 표적화 Mcl-1은다수의종양세포주내에서 ABT-263[ 즉, N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐 )- 5,5-디메틸-1-사이클로헥스-1- 엔-1-일 ) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 모르폴린-4-일 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸- ) 프로필 ) 아미노 )-3-(( 트리플루오로메틸 ) 설포닐 ) 벤젠설폰아미드 ] 또는 ABT-737[ 즉, N-(4-(4-((4'-클로로 (1,1'-비페닐)-2-일) 메틸 ) 피페라진-1-일 ) 벤조일 )-4-(((1R)-3-( 디메틸아미노 )-1-(( 페닐설파닐 ) 메틸 ) 프로필 ) 아미노 )-3-니트로벤젠설폰아미드) 의활성을향상시키는것으로밝혀졌다 [ 참조 : Tse et. al (2008) Cancer Research. 68(9): 3421 및당해문헌의참조문헌 ]. [0322] [0323] [0324] [0325] 다가결합단백질은 2개이상의항원결합부위를포함하는결합단백질이다. 다가결합단백질은 3개이상의항원결합부위를가지도록가공되며일반적으로천연적으로발생하지않는항체이다. 용어 " 다중특이적인결합단백질 " 은 2개이상의관련되거나관련되지않은표적을결합시킬수있는결합단백질을의미한다. 이중가변도메인 (DVD) 결합단백질은 2개이상의항원결합부위를포함하는 4가또는다가결합단백질이다. 이러한 DVD는단일특이적 ( 즉, 하나의항원에결합할수있는 ) 이거나다중특이적 ( 즉, 2개이상의항원에결합할수있는 ) 이다. 2개의중쇄 DVD 폴리펩타이드및 2개의경쇄 DVD 폴리펩타이드를포함하는 DVD 결합단백질은 DVD Ig로언급된다. DVD Ig의각각의반은중쇄 DVD 폴리펩타이드, 경쇄 DVD 폴리펩타이드, 및 2개의항원결합부위를포함한다. 각각의결합부위는항원결합부위당항원결합에관여된총 6개의 CDR을갖는중쇄가변도메인및경쇄가변도메인을포함한다. 알킬화제는알트레타민, AMD-473, AP-5280, 아파지쿠온, 벤다무스틴, 브로스탈리신, 부설판, 카르보쿠온, 카르무스틴 (BCNU), 클로람부실, CLORETAZINE ( 라로무스틴, VNP 40101M), 사이클로포스파미드, 데카르바진, 에스트라무스틴, 포테무스틴, 글루포스파미드, 이포스파미드, KW-2170, 로무스틴 (CCNU), 말포스파미드, 멜팔란, 미토브로니톨, 미토락톨, 니무스틴, 질소무스타드 N-옥사이드, 라니무스틴, 테모졸로마이드, 티오테파, TREANDA ( 벤다무스틴 ), 트레오설판, 로포스파미드등을포함한다. 혈관형성억제제는내피세포-특이적인수용체타이로신키나제 (Tie-2) 억제제, 상피성장인자수용체 (EGFR) 억제제, 인슐린성장인자-2 수용체 (IGFR-2) 억제제, 매트릭스메탈로프로테이나제-2(MMP-2) 억제제, 매트릭스메탈로프로테이나제-9(MMP-9) 억제제, 혈소판-기원한성장인자수용체 (PDGFR) 억제제, 트롬보스폰딘유사체, 혈관내피세포성장인자수용체타이로신키나제 (VEGFR) 억제제등을포함한다. 항대사산물은 ALIMTA ( 페메트렉스드이나트륨, LY231514, MTA), 5-아자시티딘, XELODA ( 카페시타빈 ), 카르모 푸르, LEUSTAT ( 클라드리빈 ), 클로파라빈, 사이타라빈, 사이타라빈옥포스페이트, 사이토신아라비노사이드, 데시타빈, 데페록사민, 독시플루리딘, 에플로르니틴, EICAR(5-에티닐-1-베타-D-리보푸라노실이미다졸 -4-카복사미드 ), 에녹시타빈, 에티닐사이티딘, 플루다라빈, 5-플루오로우라실단독또는류코보린과의조합물, GEMZAR ( 겜시타빈 ), 하이드록시우레아, ALKERAN ( 멜팔란 ), 머캅토푸린, 6-머캅토푸린리보사이드, 메토트렉세이트, 마이코페놀산, 넬라바빈, 놀라트렉세드, 옥포스페이트, 펠리트렉솔, 펜토스타틴, 락티트렉세드, 리바비린, 트리아핀, 트리메트렉세이트, S-1, 티아조푸린, 테가푸르, TS-1, 비다라빈, UFT 등을포함한다. [0326] [0327] [0328] [0329] 항바이러스제는리토나비르, 하이드록시클로로퀸등을포함한다. Bcr-Abl 키나제억제제는 DASATINIB (BMS ), GLEEVEC ( 이마티니브 ) 등을포함한다. CDK 억제제는 AZD-5438, BMI-1040, BMS-032, BMS-387, CVT-2584, 플라보피리돌, GPC , MCS-5A, PD , PHA , 셀리시클리브 (CYC-202, R-로스코비틴 ), ZK 등을포함한다. COX-2 억제제는 ABT-963, ARCOXIA ( 에토리콕시브 ), BEXTRA ( 발데콕시브 ), BMS347070, CELEBREX ( 셀레콕시 브 ), COX-189( 루미라콕시브 ), CT-3, 데라막스 ( 데라콕시브 ), JTE-522, 4-메틸-2-(3,4-디메틸페닐 )-1-(4-설파모일페닐-1H-피롤 ), MK-663( 에토리콕시브 ), NS-398, 파레콕시브, RS-57067, SC-58125, SD-8381, SVT-2016, S- 2474, T-614, VIOXX ( 로페콕시브 ) 등을포함한다. [0330] EGFR 억제제는 ABX-EGF, 항 -EGFR 면역리포좀, EGF- 백신, EMD-7200, ERBITUX ( 세툭시마브 ), HR3, IgA 항체, IRESSA ( 게피티니브 ), TARCEVA ( 에를로티니브또는 OSI-774), TP-38, EGFR 융합단백질, TYKERB [ 라파티니브 (lapatinib)] 등을포함한다

37 [0331] ErbB2 수용체억제제는 CP , CI-1033( 카네르티니브 ), HERCEPTIN ( 트라스투주마브 ), TYKERB ( 라파티니 브 ), OMNITARG (2C4, 페투주마브 ), TAK-165, GW ( 이오나파르니브 ), GW , EKB-569, PI-166, dher2 (HER2 백신 ), APC-8024 (HER-2 백신 ), 항-HER/2neu 이특이적인항체, B7.her2IgG3, AS HER2 삼기능성이특이적인항체, mab AR-209, mab 2B-1 등을포함한다. [0332] [0333] [0334] [0335] [0336] [0337] [0338] [0339] [0340] [0341] 히스톤데아세틸라제억제제는뎁시펩타이드, LAQ-824, MS-275, 트라폭신, 수베로일아닐리드하이드록삼산 (SAHA), TSA, 발프로산등을포함한다. HSP-90 억제제는 17-AAG-nab, 17-AAG, CNF-101, CNF-1010, CNF-2024, 17-DMAG, 겔다나마이신, IPI-504, KOS- 953, MYCOGRAB (HSP-90에대한사람재조합체항체 ), NCS , PU24FC1, PU-3, 라디키콜, SNX-2112, STA VER49009 등을포함한다. 세포자멸사단백질의억제제의억제제는 HGS1029, GDC-0145, GDC-0152, LCL-161, LBW-242 등을포함한다. 항체약물접합체는항-CD22-MC-MMAF, 항-CD22-MC-MMAE, 항-CD22-MCC-DM1, CR-011-vcMMAE, PSMA-ADC, MEDI- 547, SGN-19Am SGN-35, SGN-75 등을포함한다. 사망수용체경로의활성인자는 TRAIL, TRAIL 또는사망수용체 ( 예를들면, DR4 및 DR5) 를표적화하는다른제제, 예를들면, 아포마브, 코나투무마브, ETR2-ST01, GDC0145, ( 렉사투무마브 ), HGS-1029, LBY-135, PRO-1762 및트라스투주마브를포함한다. 키네신억제제는 AZD4877, ARRY-520과같은 Eg5 억제제 ; GSK923295A와같은 CENPE 억제제등을포함한다. JAK-2 억제제는 CEP-701( 레사우르티니브 ), XL019 및 INCB 등을포함한다. MEK 억제제는 ARRY , ARRY PD , PD 등을포함한다. mtor 억제제는 AP-23573, CCI-779, 에베롤리무스, RAD-001, 라파마이신, 템시롤리무스 ; PI-103, PP242, PP30, 토린 1 등을포함하는 ATP-경쟁적 TORC1/TORC2 억제제를포함한다. 비-스테로이드성소염제약물은 AMIGESIC ( 살살레이트 ), DOLOBID ( 디플루니살 ), MOTRIN ( 이부프로펜 ), ORUDIS ( 케토프로펜 ), RELAFEN ( 나부메톤 ), FELDENE ( 피록시캄 ), 이부프로펜크림, ALEVE ( 나프록센 ) 및 NAPROSYN ( 나프록센 ), VOLTAREN ( 디클로페낙 ), INDOCIN ( 인도메타신 ), CLINORIL ( 술린닥 ), TOLECTIN ( 톨메 틴 ), LODINE ( 에토돌락 ), TORADOL ( 케토록락 ), DAYPRO ( 옥사프로진 ) 등을포함한다. [0342] [0343] PDGFR 억제제는 C-451, CP-673, CP 등을포함한다. 백금화학치료제는시스플라틴, ELOXATIN ( 옥살리플라틴 ), 엡타플라틴, 로바플라틴, 네다플라틴, PARAPLATIN ( 카르보플라틴 ), 사트라플라틴, 피코플라틴등을포함한다. [0344] [0345] [0346] [0347] 폴로-유사키나제억제제는 BI-2536 등을포함한다. 포스포이노시티드-3 키나제 (PI3K) 억제제는와르트만닌, LY294002, XL-147, CAL-120, ONC-21, AEZS-127, ETP , PX-866, GDC-0941, BGT226, BEZ235, XL765 등을포함한다. 트롬보스폰딘유사체는 ABT-510, ABT-567, ABT-898, TSP-1 등을포함한다. VEGFR 억제제는 AVASTIN ( 베박키주마브 ), ABT-869, AEE-788, ANGIOZYME TM [ 혈관형성을억제하는리보자임 ( 제조원 : 리보자임파마슈티칼스 (Ribozyme Pharmaceuticals( 콜로라도주보울더소재 ) 및치론 (Chiron)( 캘리포니아주엠베리빌소재 )], 악시티니브 (AG-13736), AZD-2171, CP-547,632, IM-862, MACUGEN ( 페갑타미브 ), NEXAVAR ( 소 라페니브, BAY ), 파조파니브 (GW ), 바탈라니브 (PTK-787, ZK ), SUTENT ( 수니티니브, SU ), VEGF 트랩, ZACTIMA TM ( 반데타니브, ZD-6474) 등을포함한다. [0348] 항생제는인터컬레이팅항생제아클라루비신, 악티노마이신 D, 암루비신, 안나마이신, 아드리아마이신, BLENOXANE ( 블레오마이신 ), 다우노루비신, CAELYX 또는 MYOCET ( 리포좀독소루비신 ), 엘사미트루신, 에피르

38 부신, 글라르부이신, ZAVEDOS ( 이다루비신 ), 미토마이신 C, 네모루비신, 네오카르지노스타틴, 페플로마이신, 피라루비신, 레벡카마이신, 스티말라머, 스트렙토조신, VALSTAR ( 발루비신 ), 지노스타틴등을포함한다. [0349] 토포이소머라제억제제는아클라루비신, 9- 아미노캄프토테신, 아모나피드, 암사크린, 베카테카린, 벨로테칸, BN-80915, CAMPTOSAR ( 이리노테칸하이드로클로라이드 ), 캄프토테신, CARDIOXANE ( 덱스라족신 ), 디플로모테칸, 에도테카린, ELLENCE 또는 PHARMORUBICIN ( 에피루비신 ), 에토포시드, 엑사테칸, 10- 하이드록 시캄프토테신, 기마테칸, 루르토테칸, 미톡산트론, 오라테신, 피라르부신, 픽산트론, 루비테칸, 소부족산, SN- 38, 타플루포시드, 토포테칸등을포함한다. [0350] 항체는 AVASTIN ( 베바키주마브 ), CD40- 특이적인항체, chtnt-1/b, 데노수마브, ERBITUX ( 세툭시마브 ), HUMAX- CD4 ( 자놀리무마브 ), IGF1R- 특이적인항체, 린투주마브, PANOREX ( 에드레콜로마브 ), RENCAREX (WX G250), RITUXAN ( 리툭시마브 ), 티킬리무마브, 트라스투지마브, CD20 항체 I 형및 II 형등을포함한다. [0351] 호르몬치료요법은 ARIMIDEX ( 아나스트로졸 ), AROMASIN ( 엑세메스탄 ), 아르족시펜, CASODEX ( 비칼루타미드 ), CETROTIDE ( 세트로렐릭스 ), 데가렐릭스, 데슬로렐린, DESOPAN ( 트릴로스탄 ), 덱사메타손, DROGENIL ( 플루타미드 ), EVISTA ( 랄록시펜 ), AFEMA TM ( 파드로졸 ), FARESTON ( 토레미펜 ), FASLODEX ( 풀베스트란트 ), FEMARA ( 레트로졸 ), 포르메스탄, 글루코코르티코이드, HECTOROL ( 독세르칼키페롤 ), RENAGEL ( 세벨라머카보네이트 ), 라소폭시펜, 류프롤리드아세테이트, MEGACE ( 메게스테롤 ), MIFEPREX ( 미페프리스톤 ), NILANDRON TM ( 닐루타미드 ), NOLVADEX ( 타목시펜시트레이트 ), PLENAXIS TM ( 아바렐릭스 ), 프레드니손, PROPECIA ( 피나스테라이드 ), 릴로스탄, SUPREFACT ( 부세렐린 ), TRELSTAR ( 황체화호르몬방출호르몬 (LHRH)), VANTAS ( 히스트렐린임플란트 ), VETORYL ( 트릴로스탄또는모드라스탄 ), ZOLADEX ( 포스렐린, 고세렐린 ) 등을포함한다. [0352] 델토이드및레티노이드는세오칼시톨 (EB1089, CB1093), 렉사칼시트롤 (KH1060), 펜레티니드, PANRETIN 티노인 ), ATRAGEN ( 리포좀트레티노인 ), TARGRETIN ( 벡사로텐 ), LGD-1550 등을포함한다. ( 알리레 [0353] [0354] [0355] [0356] PARP 억제제는 ABT-888, 올라파리브, KU-59436, AZD-2281, AG , BSI-201, BGP-15, INO-1001, ONO-2231 등을포함한다. 식물알칼로이드는빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈등을포함하나, 이에한정되지않는다. 프로테오좀억제제는 VELCADE ( 보르테조미브 ), MG132, NPI-0052, PR-171 등을포함한다. 면역제의예는인터페론및다른면역-증진제를포함한다. 인터페론은인터페론알파, 인터페론알파-2a, 인터페론알파-2b, 인터페론베타, 인터페론감마-1a, ACTIMMUNE ( 인터페론감마-1b) 또는인터페론감마-nl, 이들 의병용물등을포함한다. 다른제제는 ALFAFERONE, (IFN-), BAM-002( 옥시드화된글루타티온 ), BEROMUN ( 타 소네르민 ), BEXXAR ( 토시투모마브 ), CAMPATH ( 알렘투주마브 ), CTLA4( 세포독성림프구항원 4), 데카르바진, 데니류킨, 에프라투주마브, GRANOCYTE ( 레노그라스팀 ), 렌티난, 백혈구알파인터페론, 이미퀴모드, MDX- 010( 항 -CTLA-4), 흑색종백신, 미투모마브, 몰그라모스팀, MYLOTARG TM ( 겜투주마브오조가미신 ), NEUPOGEN ( 필 그라스팀 ), OncoVAC-CL, OVAREX ( 오레고보마브 ), 펨투모마브 (Y-muHMFG1), PROVENGE ( 시푸류셀 -T), 사르가라모 스팀, 시조필란, 테셀류킨, THERACYS ( 칼메트 - 구에린간균 (Bacillus Calmette-Guerin)), 우베니멕스, VIRULIZIN ( 면역치료제, 제조원 : 로루스파마슈티칼스 (Lorus Pharmaceuticals)), Z-100( 마루야마 (SSM) 의특이 적인물질 ), WF-10( 테트라클로로데카옥사이드 (TCDO)), PROLEUKIN ( 알데슬류킨 ), ZADAXIN ( 티말파신 ), ZENAPAX ( 다클리주마브 ), ZEVALIN (90Y- 이브리투모마브티욱세탄 ) 등을포함한다. [0357] 생물학적반응개질제는생존한유기체의방어메카니즘또는조직세포의생존, 성장또는분화와같은생물학 적반응을수정하여이들이항 - 종양활성을가지도록하는제제이며크레스틴, 렌티난, 시조피란, 피키바닐 PF

39 (CpG-8954), 우베니멕스등을포함한다. [0358] 피리미딘유사체는사이타라빈 (ara C 또는아라비노사이드 C), 사이토신아라비노사이드, 독시플루리딘, FLUDARA ( 플루다라빈 ), 5-FU(5- 플우오로우라실 ), 플록수리딘, GEMZAR ( 겜시타빈 ), TOMUDEX ( 라티트렉세드 ), TROXATYL TM ( 트리아세틸우리딘트록사키타빈 ) 등을포함한다. [0359] [0360] [0361] [0362] [0363] 또한, 화학식 II 의화합물은 ABRAXANE TM (ABI-007), ABT-100( 파르네실트랜스퍼라제억제제 ), ADVEXIN 푸린유사체는 LANVIS ( 티오구아닌 ) 및 PURI-NETHOL ( 머캅토푸린 ) 을포함한다. 항유사분열제는베타불린, 에포틸론 D(KOS-862), N-(2-((4-하이드록시페닐 ) 아미노 ) 피리딘-3-일 )-4-메톡시벤젠설폰아미드, 익사베필론 (BMS ), 파클리탁셀, TAXOTERE ( 도세탁셀 ), PNU100940(109881), 파투필론, XRP- 9881( 라로탁셀 ), 빈플루닌, ZK-EPO( 합성에포틸론 ) 등을포함한다. 유비퀴틴리가제억제제는 MDM2 억제제, 예를들면, 누틀린스, NEDD8 억제제, 예를들면, MLN4924 등을포함한다. 본원명세서의교시내용의화합물은또한방사선치료요법의효능을향상시키는방사감작화제로서사용될수있다. 방사선치료요법의예는외부빔방사선치료요법, 원격방사선치료요법, 근접치료요법및밀봉방사능원방사선치료요법, 비밀봉방사능원방사선치료요법등을포함한다. (Ad5CMV- p53 백신 ), ALTOCOR 또는 MEVACOR ( 로바스타틴 ), AMPLIGEN ( 폴리 I: 폴리 C12U, 합성 RNA), APTOSYN ( 엑시 술린드 ), AREDIA ( 팔미드론산 ), 아르글라빈, L- 아스파라기나제, 아타메스탄 (1- 메틸 -3,17- 디온 - 안드로스타 -1,4- 디엔 ), AVAGE ( 타자로텐 ), AVE-8062( 콤브레아스타틴유도체 ) BEC2( 미투모마브 ), 카첵틴또는카첵신 ( 종양괴사 인자 ), 칸박신 ( 백신 ), CEAVAC ( 암백신 ), CELEUK ( 셀모류킨 ), CEPLENE ( 히스타민디하이드로클로라이드 ), CERVARIX ( 사람파필로마바이러스백신 ), CHOP (C: CYTOXAN ( 사이클로포스파미드 ); H: ADRIAMYCIN ( 하이드록시독소루비신 ); 0: 빈크리스틴 (ONCOVIN ); P: 프레드니손 ), CYPAT TM ( 사이프로테론아세테이트 ), 콤브레스타틴 A4P, DAB(389)EGF (His-Ala 링커를통해사람내피성장인자에융합된디프테리아독소의촉매적및전좌도메인 ) 또는 TransMID-107R TM ( 디프테리아독소 ), 다카르바진, 닥티노마이신, 5,6-디메틸크산테논-4-아세트산 (DMXAA), 에닐우라실, EVIZON TM ( 스쿠알라민락테이트 ), DIMERICINE (T4N5 리포좀로션 ), 디스코데르몰리드, DX-8951f( 엑사테칸메실레이트 ), 엔자스타우린, EPO906 ( 에피틸론 B), GARDASIL (4 가사람파필로마바이러스 (6, 11, 16, 18형 ) 재조합체백신 ), GASTRIMMUNE, GENASENSE, GMK ( 강글리오사이드접합체백신 ), GVAX ( 전립선암백신 ), 할로푸기논, 히스테렐린, 하이드록시카르바미드, 이반드론산, IGN-101, IL-13-PE38, IL-13- PE38QQR( 신트레데킨베수도톡스 ), IL-13-슈도모나스엑소톡신, 인터페론-알파, 인터페론-감마, JUNOVAN TM 또는 MEPACT TM ( 미파무르티드 ), 로나파르니브, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트, 밀테포신 ( 헥사데실포스포콜린 ), NEOVASTAT (AE-941), NEUTREXIN ( 트리메트렉세이트글루쿠로네이트 ), NIPENT ( 펜토스타틴 ), ONCONASE ( 리보뉴클레아제효소 ), ONCOPHAGE ( 흑색종백신치료 ), ONCOVAX (IL-2 백신 ), ORATHECIN TM ( 루비테칸 ), OSIDEM ( 항체-계세포약물 ), OVAREX MAb( 뮤린 (murine) 단클론항체 ), 파클리탁셀, PANDIMEX TM (20(S) 프로토파낙사디올 (appd) 및 20(S) 프로토파낙사트리올 (appt) 을포함하는인삼으로부터의아글리콘사포닌 ), 파니투무마브, PANVAC -VF ( 조사의암백신 ), 페가스파르가제, PEG 인터페론 A, 페녹소디올, 프로카르바진, 레비마스타트, REMOVAB ( 카투막소마브 ), REVLIMID ( 레날리도미드 ), RSR13( 에파프록시랄 ), SOMATULINE LA( 란레오티드 ), SORIATANE ( 아시트레틴 ), 스타우로스포린 [ 스트렙토마이세스스타우로스포레스 (Streptomyces staurospores)], 탈라보스타트 (PT100), TARGRETIN ( 벡사로텐 ), TAXOPREXIN (DHA- 파클리탁셀 ), TELCYTA ( 칸포스파미드, TLK286), 테밀리펜, TEMODAR ( 테모졸로미드 ), 테스밀리펜, 탈리도미드, THERATOPE (STn-KLH), 티미타크 (2- 아 미노 -3,4- 디하이드로 -6- 메틸 -4- 옥소 -5-(4- 피리딜티오 ) 퀴나졸린디하이드로클로라이드 ), TNFERADE TM ( 아데노벡터 :

40 종양괴사인자 - 알파에대한유전자를함유하는 DNA 담체 ), TRACLEER 또는 ZAVESCA ( 보센탄 ), 트레티노인 ( 레 틴 -A), 테트란드린, TRISENOX ( 아르세닉트리옥사이드 ), VIRULIZIN, 우크라인 ( 보다큰애기똥풀 (celandine) 식물로부터의알칼로이드의유도체 ), 비탁신 ( 항 - 알파벡타 3 항체 ), XCYTRIN ( 모텍사핀가돌리늄 ), XINLAY TM ( 아트 라센탄 ), XYOTAX TM ( 파클리탁셀폴리글루멕스 ), YONDELIS ( 트라벡테딘 ), ZD-6126, ZINECARD ( 덱스라족산 ), ZOMETA ( 졸렌드론산 ), 조루비신등을포함한다. [0364] [0365] BAX 및 BAD 펩타이드는문헌 [ 참조 : Zhang, H. C., Nimmer, P., Rosenberg, S. H., Ng, S. C., 및 Joseph, M. (2002). Development of a High-Throughput Fluorescence Polarization Assay for Bcl-x(L). Analytical Biochemistry 307, 70-75] 에보고되어있다. Bcl-X L 단백질에대한화학식 II의화합물의결합친화성은당해단백질의활성의이들의억제의지표이다. Bcl-X L 단백질에대한화학식 II의화합물의결합친화성을측정하기위해, 대표적인실시예를 DMSO 속에서 100 μm 내지 1pM의농도로희석시키고 96-웰미세역가플레이트의각각의웰에가하였다. 검사완충액 (20 mm 인산염완충액 (ph 7.4), 1 mm EDTA, 50 mm NaCl, 0.05% PF-68) 의웰당 125μL, 6 nm의 Bcl-X L 단백질 ( 문헌 : Science 1997, 275, 에기술된바와같이제조됨 ), 1 nm 플루오레세인-표지된 BAD 펩타이드 ( 내부 (inhouse) 에서제조함 ) 및화합물의 DMSO 용액을포함하는혼합물을 2분동안진탕시키고 LJL 분석기 [ 제조원 : 엘제이엘바이오시스템스 (LJL Bio Systems), 캘리포니아주소재 ] 에두었다. 음성대조군 (DMSO, 15 nm BAD 펩타이드, 검사완충액 ) 및양성대조군 (DMSO, 1 nm BAD 펩타이드, 6 nm Bcl-X L, 검사완충액 ) 을사용하여검사범위를측정하였다. 편광을실온에서연속적인플루오레세인램프 ( 여기 485 nm, 방사 530 nm) 를사용하여측정하였다. 억제퍼센트는 (1-(( 웰의 mp 값-음성대조군 )/ 범위 )) x 100% 로측정하였다. 결과는표 1에나타낸다. [0366] [0367] Bcl-2 단백질에대한화학식 II의화합물의결합친화성은당해단백질활성의이들의억제지표이다. Bcl-2에대한화학식 II의화합물의결합친화성을측정하기위하여, 대표적인실시예들을 DMSO 중의 10μM 내지 10pM의농도로희석시키고 96-웰미세역가플레이트의각각의웰에가하였다. 검사완충액 (20 mm 인산염완충액 (ph 7.4), 1 mm EDTA, 50 mm NaCl, 0.05% PF-68) 의웰당 125L, 10 nm의 Bcl-2 단백질 ( 문헌 : PNAS 2001, 98, 에기술된과정에따라제조 ), 1 nm 플루오레세인-표지된 BAX 펩타이드 ( 내부에서제조함 ) 및대표적인실시예의 DMSO 용액을포함하는혼합물을 2분동안진탕시키고 LJL 분석기 ( 제조원 : 엘제이엘바이오시스템스, 캘리포니아주소재 ) 에두었다. 편광을실온에서연속적인플루오레세인램프 ( 여기 485 nm, 방사 530 nm) 를사용하여측정하였다. 결과를또한표 1에나타낸다. 이들데이타는항-세포자멸사 Bcl-X L 단백질및항-세포자멸사 Bcl-2에대한결합제및이의억제제로서화학식 II 의화합물의유용성을입증한다. [0368] 화학식 II 의화합물이 Bcl-X L 및 Bcl-2 에결합하여이이활성을억제하므로, 이들은또한예를들면, 항 - 세포자 멸사 Bcl-w 단백질과같은 BC1-X L 및 Bcl-2 에대해밀접한구조적상동성을갖는항 - 세포자멸사계열단백질구 성원의억제제로서의유용성을가질수있는것으로예측된다. [0369] 따라서, 화학식 II 의화합물은항 - 세포자멸사 Bcl-X L 단백질, 항 - 세포자멸사 Bcl-2 단백질, 항 - 세포자멸사 Bcl- w 단백질또는이들의병용물이발현되는동안질환의치료에있어유용성을가지는것으로예측된다. [0370] [0371] 사람종양세포주에서세포효능의측정 NCI-H146(ATCC, 버지니아주매너서스소재 ) 사람소세포폐암종세포를 96-웰조직배양플레이트속에웰당 50,000개세포로총 100μL의용적으로, 태아소태아혈청대신 10% 사람혈청 [ 제조원 : 인비트로겐 (Invitrogen), 캘리포니아주칼스배드소재 ] 이보충된조직배양배지속에서플레이팅하고 10μM 내지 0.020μ M의목적화합물의 2-배일련희석물로처리하였다. 각각의농도를적어도 3회의별개의회수로중복시험하였 다. 화합물처리후 48시간때에생존세포의수를 CellTiter 96 수성비-방사성세포증식 MTS 검사를사용하여제조업자의추천 [ 제조원 : 프로메가코포레이션, 위스콘신주매디슨소재 ] 에따라측정하였다. 결과를또한표 1에나타낸다

41 [0372] [0373] [0374] [0375] 랫트에서선택된화합물의약력학적평가본원명세서의교시내용의화합물의약력학적거동을수컷스프래그-다울리 (Sprague-dawley) 기원한랫트 ( 그룹당 n=3) 에서 1회의 2 mg/kg 정맥내또는 5 mg/kg 경구투여량후측정하였다. 화합물을경구및정맥내투여둘다에대해 PEG-400 제형중 10% DMSO 속에서 2mg/mL 용액으로서제조하였다. 1mL/kg의정맥내투여량을약한에테르마취하에랫트의목정맥내에서느린주입 ( 약 1 내지 2분 ) 으로투여하였다. 경구투여량은위관영양법 (gavage) 으로투여하였다. 일련의혈액시료를투여량후 0.1(IV로만 ), 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8 및 24 시간째에각각의랫트의꼬리정맥으로부터수득하였다. 헤파린처리한시료를완전히혼합하고빙욕속에두었다. 혈장을원심분리로분리하고분석전에동결저장하였다. 결과를또한표 1에나타낸다. 목적화합물을아세토니트릴을사용한단백질침전을사용하여혈장으로부터분리하였다. 혈장 (100 내지 200 μl, 시료또는스파이크된표준물 ) 분취량을 96-웰폴리프로필렌깊은웰플레이트속에서 50 μl의내부표준물 ( 아세토니트릴중의제조된구조적으로관련된유사체 ) 및 1 ml의아세토니트릴과합하였다. 플레이트를 30 초동안와동시킨후원심분리 (3500 rpm x 15분, 4 ) 하였다. 자동화된방식으로, 상층액을투명한 96-웰플레이트로이전시켰다. 시료를 Micro-Vap TM 상에서건조질소의스트림하에저온 (~37 ) 에서거의무수로증발시켰다. 시료를아세토니트릴중의 0.2 ml의 5% DMSO와함께와동시켜재구성하였다. 0.1 내지 0.2 ml 분취량의아세토니트릴 : 0.1% 트리플루오로아세트산 (20:80, 용적기준 ) 을각각의웰에가한후추가로 30초와동시켰다. 플레이트를원심분리 (3500 rpm x 15분, 4 ) 한후 HPLC-MS/MS 분석하였다. 시료를스파이크된혈장표준물과함께동시에분석하였다. 각각의연구로부터의모든시료를단일의뱃치로서 LC-MS/MS 상에서분석하였다. 목적화합물및내부표준물을서로로부터분리하고오염물을아세토니트릴 : 0.1% 트리플루오로아세트산이동상 (50:50, 용적기준 ) 이있는 50 x 3 mm 키스톤베타실 (Keystone Betasil) CN 5μm 컬럼상에서 0.7 ml/ 분의유 동속도로공-추출하였다. Sciex API 300 TM 생체분자질량분석기상에서가열된분무기인터페이스 (nebulizer interface) 를사용하여분석을수행하였다. 표제화합물및내부표준물의피크영역을 Sciex MacQuan TM 소프트웨어를사용하여측정하였다. 교정곡선은최소제곱법선형회귀비대이론적농도를사용하여스파이크된랫트혈장표준물의피크영역비 ( 모약물 / 내부표준물 ) 로부터기원하였다. 상기방법들을일반적으로 0.01μg /ml 의추정된정량제한을사용하여표준곡선 ( 상관계수 >0.99) 의범위에걸쳐선형화되었다. 각각의동물로부터혈장농도데이타를윈논린 (WinNonlin) 을사용하는다중-기하급수곡선핏팅 (multi-exponential curve fitting) 에제출하였다. 투여후 0 내지 t 시간 ( 마지막측정가능한혈장농도의시간 ) 의혈장농도-시간곡선하영역 (AUC 0-t ) 을혈장농도-시간프로파일에대한선형사다리꼴법칙을사용하여계산하였다. 최종측정된혈장농도 (Ct) 를말단제거율상수 (β) 로나누어측정한, 무한까지외삽된잔류영역을 AUC 0-t 에가하여곡선하총영역 (AUC 0- ) 을생산하였다. 당해결과는표 1에또한나타낸다. 하기표에나타낸 Ki 값을왕의방정식 (Wang's equation)( 참조 : Wang Z X,. An Exact Mathematical Expression For Describing Competitive Binding Of Two Different Ligands To A Protein Molecule. FEBS Lett. 1995; 360:111-4) 을사용하여측정하였다. [0376] [ 표 1] [0377]

42 [0378] [0379] [0380] 본원명세서의교시내용의화합물을실시예 A 내지 L 로서본원에서정의한제 WO 2005/ 호에기재된화합물 과, 세포효능에대한전신계노출의비를측정함으로써비교하였다. 때때로 AUC/EC 50 으로보고된당해척도는 약제학적약물발견및약물개발분야의숙련가들에게경구효능의유용학약력학적예측변수로서잘공지되어 있다. [0381] 본원명세서의교시내용의실시예및제WO 2005/049594호에기재된화합물둘다를 H146 세포검사에서시험하고본원명세서에앞서기술된바와같이둘다랫트에서경구약력학적특성에대해평가하였다. 당해결과를표 2 및 3에나타낸다. 데이타에대한참조를사용하여알수있는바와같이, 본원명세서의교시내용의화합물은당해분야에공지된화합물과비교하여보다바람직한약력학적프로파일 ( 본발명의화합물이보다높은

43 AUC/EC 50 값을나타냄을의미 ) 을갖는다. 이들결과로부터, 다수의관측이유추될수있다. W 1 위치에서 NO 2 모이어티를갖는화합물은탁월한세포효능 ( 예를들면, EC 50 < 1μM) 을가지는경향이있음이관측될수있다. 그러나, 이들동일한화합물의약력학적특성이측정된경우, 경구투여후전신계적노출은불량하여 0.5 내지 19.7의 AUC/EC 50 비를생성함을알수있다. 한편, W 1 위치에서 CF 3 또는 CN 모이어티를갖는화합물이세포검사에서시험되는경우, 이들유도체는, 심지어이들이경구투여후에도적합한전신계적노출을갖는다해도, 비교적불량한세포효능 ( 예를들면, EC 50 > 1μM) 을갖는다. 다시, 당해병용물은약 2.8 내지약 <7.4의전체 AUC/EC 50 비를제공한다. 놀랍게도, 본원명세서의교시내용의화합물은 NO 2 모이어티를갖는한편경구투여후적합한전신계적노출을유지하는화합물을사용하여파 (par) 에서의세포효능을입증한다. 본원명세서의교시내용의화합물에대해수득되는 AUC/EC 50 비는약 20 내지약 554이다. [0382] [0383] [ 표 2] [0384]

44 [0385] [ 표 3] [0386] [0387] [0388] [0389] [0390] [0391] [0392] [0393] [0394] i-pr은이소-프로필을의미한다. 도 1 내지 7에나타낸바와같이, 에토포시드, 빈크리스틴, CHOP, 리툭시마브, 리툭시마브와 CHOP, 라파마이신, 및 VELCADE와병용되는실시예 1의화합물의경구효능에관한연구들은, 실시예 1의화합물이경구투여되는경우병용치료요법동안이들세포독성제의효능이상승적으로향상되었음을입증하였다. 또한, 실시예 1의화합물과빈크리스틴을포함하는병용물은 10% 의완전한종양회귀를생성하였다. 추가의또한, 실시예 1의화합물과리툭시마브를포함하는병용물은 70% 의완전한종양회귀를생성한반면리툭시마브단독에대해서는종양회귀가관측되지않았다. 추가의또한, 실시예 1의화합물과라파마이신을포함하는병용물은 70% 의완전한종양회귀를생성한반면라파마이신단독에대해서는 10% 의종양회귀가관측되었다. 추가의또한, 실시예 1의화합물과리툭시마브와 CHOP를포함하는병용물은 90% 의완전한종양회귀를생성한반면리툭시마브와 CHOP 만에대해서는 10% 의종양회귀가관측되었다. 추가의또한, 실시예 1의화합물과보르텍소미브를포함하는병용물은 10% 의완전한종양회귀를생성한반면, 보르텍소미브만에대해서는종양회귀가관측되지않았다. 항-세포자멸사 Bcl-X L 단백질, 항-세포자멸사 Bcl-2 단백질, 항-세포자멸사 Bcl-w 단백질또는이들의병용물이 발현되는질환은암및자가면역장애를포함하나, 이에한정되지않으며, 여기서암은청신경종 (acoustic neuroma), 급성백혈병, 급성림프구백혈병, 급성골수세포백혈병 ( 단핵구, 골수모구, 샘암종, 혈관육종, 별아교세포종, 골수단핵구및전골수세포 ), 급성 t-세포백혈병, 기저세포암종, 담즙관암종, 방광암, 뇌암, 유방암, 기관지원성암종, 경부암, 연골육종, 척삭종, 융모막암종, 만성백혈병, 만성림프성백혈병, 만성골수세포 ( 과립구 ) 백혈병, 결장직장암, 머리인두종, 낭샘암종, 광범위큰 B-세포림프종, 증식불량변화 ( 형성이상및화생 (metaplasias)), 배아암종, 자궁내막암, 내피육종 (endotheliosarcoma), 뇌실막종, 내피암종, 적백혈병, 식도암, 에스트로겐-수용체양성유방암, 본태성혈소판증가증, 유윙종양 (Ewing's tumor), 섬유육종, 소포림프종, 배아세포고환암, 신경아교종, 중쇄병 (heavy chain disease), 혈관모세포종, 간암, 간세포암, 호르몬무

45 감각전립선암 (hormone insensitive prostate cancer), 평활근육종, 지방육종, 폐암종, 림프형성내피육종 (lymphagioendotheliosarcoma), 림프관육종, 림프모구백혈병, 림프종 [ 호지킨및비-호지킨 (Hodgkin's and non-hodgkin's)], 방광, 유방, 결장, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 피부및자궁의악성종양및고증식성장애, T- 세포또는 B-세포기원의림프구악성종양, 백혈병, 림프종, 수질암종, 속질모세포종, 흑색종, 수막종, 중피종, 다발골수종, 골수성백혈병, 골수종, 점액육종, 신경모세포종, 비-소세포폐암, 희소돌기아교세포종, 구강암, 골육종, 난소암, 췌장암, 유두모양샘암종, 유두모양암종, 송과체종, 진성적혈구증가증, 전립선암, 신장세포암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종, 피부기름샘암종, 고환종, 소세포폐암종, 고형종양 ( 암종및육종 ), 소세포폐암편평세포암종, 윤활막종, 한선암종, 발덴스트롬마이크로글로불린혈증 (Waldenstrom's macroglobulinemia), 고환종양, 자궁암, 빌름스종양 (Wilms' tumor)[ 참조 : Cancer Res., 2000, 60, 및 Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia (1985)] 을포함하고 ; 자가면역장애는후천성면역결핍증질환증후군, 자가면역림프증식성증후군, 용혈빈혈, 염증성질환, 및혈소판감소증 [ 참조 : Current Allergy and Asthma Reports 2003, 3: ; Br. J. Haematol Sep.; 110(3): ; Blood 2000 Feb. 15; 95(4): ; 및 New England Journal of Medicine 2004 Sep.; 351(14): ] 을포함하나, 이에한정되지않는다. [0395] [0396] [0397] [0398] [0399] [0400] [0401] 화학식 II의화합물은유방암 ( 에스트로겐-수용체양성유방암 ), 결장직장암, 자궁내막암, 폐암 ( 소세포페암포함 ), 림프종 ( 난포또는확산성거대 B-세포포함 ), 림프종 ( 비-호지킨림프종포함 ), 신경모세포종, 난소암, 전립선암 ( 호르몬-무감각전립선암포함 ), 고환암 ( 배아세포고환암포함 ) 과같은암또는신생물로부터기원한세포의성장을억제할수있다. 화학식 II의화합물은배아형횡문근육종, 소아급성림프모구백혈병, 소아급성골수성백혈병, 소아포상횡문근육종, 소아역형성뇌실막종, 소아역형성거대세포림프종, 소아역형성속질모세포종, 중추신경계의소아비정형기형 / 횡문근양종양, 소아비페노타이픽급성백혈병, 소아버킷림프종 (pediatric Burkitts lymphoma), 원외신경외배엽종양과같은종양의유윙계열의소아암, 소아확산성역형성빌름스종양, 소아양호한조직학빌름스종양 (pediatric favorable histology Wilm's tumor), 소아아교모세포종, 소아속질모세포종, 소아신경모세포종, 소아신경모세포종-기원한골수구종증, 소아전-B-세포암 ( 예를들면, 백혈병 ), 소아골육종, 소아횡문근양신장종양, 소아횡문근육종, 및림프종및피부암과같은소아 T-세포암 ( 공동소유의미국특허원제10/988,338호 ), Cancer Res., 2000, 60, ) 과같은소아암또는신생물로부터기원한세포성장을억제할수있으며 ; 자가면역장애는후천성면역결핍성질환증후군, 자가면역림프증식성증후군, 용혈빈혈, 염증성질환및혈소판감소증 [ 참조 : Current Allergy and Asthma Reports 2003, 3: ; Br. J. Haematol Sep.; 110(3): ; Blood 2000 Feb. 15; 95(4): ; 및 New England Journal of Medicine 2004 Sep.; 351(14): ] 을포함하나, 이에한정되지않는다. 화학식 II의화합물은합성화학공정에의해제조될수있으며, 이의예는하기에나타낸다. 공정에서단계들의순서는변할수있으며, 시약, 용매및반응조건은구체적으로언급된것들로치환될수있고, 약한모이어티들은경우에따라보호되거나탈보호될수있음이이해되어야함을의미한다. C(O)OH 모이어티에대한보호그룹은아세톡시메틸, 알릴, 벤조일메틸, 벤질, 벤질옥시메틸, 3급-부틸, 3급-부틸디페닐실릴, 디페닐메틸, 사이클로부틸, 사이클로헥실, 사이클로펜틸, 사이클로프로필, 디페닐메틸실릴, 에틸, 파라-메톡시벤질, 메톡시메틸, 메톡시에톡시메틸, 메틸, 메틸티오메틸, 나프틸, 파라-니트로벤질, 페닐, n-프로필, 2,2,2-트리클로로에틸, 트리에틸실릴, 2-( 트리메틸실릴 ) 에틸, 2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시메틸, 트리페닐메틸등을포함하나, 이에한정되지않는다. C(O) 및 C(O)H 모이어티에대한보호그룹은 1,3-디옥실케탈, 디에틸케탈, 디메틸케탈, 1,3-디티아닐케탈, O-메틸옥심, O-페닐옥심등을포함하나, 이에한정되지않는다. NH 모이어티에대한보호그룹은아세틸, 알라닐, 벤조일, 벤질 ( 페닐메틸 ), 벤질리덴, 벤질옥시카보닐 (Cbz), 3 급-부톡시카보닐 (Boc), 3,4-디메톡시벤질옥시카보닐, 디페닐메틸, 디페닐포스포릴, 포르밀, 메탄설포닐, 파라- 메톡시벤질옥시카보닐, 페닐아세틸, 프탈로일, 석시닐, 트리클로로에톡시카보닐, 트리에틸실릴, 트리플루오로아세틸, 트리메틸실릴, 트리페닐메틸, 트리페닐실릴, 파라-톨루엔설포닐등을포함하나, 이에한정되지않는다. OH 및 SH 모이어티에대한보호그룹은아세틸, 알릴, 알릴옥시카보닐, 벤질옥시카보닐 (Cbz), 벤조일, 벤질, 3급-부틸, 3급-부틸디메틸실릴, 3급-부틸디페닐실릴, 3,4-디메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질옥시카보닐, 1,1-디메틸-2-프로페닐, 디페닐메틸, 포르밀, 메탄설포닐, 메톡시아세틸, 4-메톡시벤질옥시카보닐, 파라-메톡시벤질, 메톡시카보닐, 메틸, 파라-톨루엔설포닐, 2,2,2-트리클로로에톡시카보닐, 2,2,2-트리클로로에틸, 트리에틸실릴,

46 트리플루오로아세틸, 2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시카보닐, 2- 트리메틸실릴에틸, 트리페닐메틸, 2-( 트리페닐포스포니 오 ) 에톡시카보닐등을포함하나, 이에한정되지않는다. [0402] [0403] 다음약어들은나타낸의미를갖는다. ADDP 는 1,1'-( 아조디카보닐 ) 디피페리딘을의미하고 ; AD-mix-β 는 (DHQD) 2 PHAL, K 3 Fe(CN) 6, K 2 CO 3 및 K 2 SO 4 의혼합 물을의미하며 ; AIBN은 2,2'-아조비스 (2-메틸프로피오니트릴) 을의미하고 ; 9-BBN은 9-보라비사이클로 [3.3.1] 노난을의미하고 ; (DHQD) 2 PHAL은하이드로퀴니딘 1,4-프탈라진디일디에틸에테르를의미하며 ; DBU는 1,8-디아자비사이클로 [5.4.0] 운덱-7-엔을의미하고 ; DIBAL은디이소부틸알루미늄하이드라이드를의미하며, DIEA는디이소프로필에틸아민을의미하고 ; DMAP는 N,N-디메틸아미노피리딘을의미하고 ; DME는 1,2-디메톡시에탄을의미하며 ; DMF는 N,N-디메틸포름아미드를의미하고 ; dmpe는 1,2-비스 ( 디메틸포스피노 ) 에탄을의미하며 ; DMSO는디메틸설폭사이드를의미하고 ; dppb는 1,4-비스 ( 디페닐포스피노 ) 부탄을의미하며 ; dppe는 1,2-비스 ( 디페닐포스피노 ) 에탄을의미하고 ; dppf는 1,1'-비스 ( 디페닐포스피노 ) 페로센을의미하고 ; dppm는 1,1-비스 ( 디페닐포스피노 ) 메탄을의미하고 ; EDAC는 1-(3-디메틸아미노프로필 )-3-에틸카보디이미드를의미하고 ; Fmoc는플루오레닐메톡시카보닐을의미하고 ; HATU는 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일 )-N,N'N'N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트를의미하며 ; HMPA는헥사메틸포스포르아미드를의미하고 ; IPA는이소프로필알코올을의미하며 ; LDA는리튬디이소프로필아미드를의미하고 ; LHMDS는리튬비스 ( 헥사메틸디실릴아미드 ) 를의미하며 ; MP-BH 3 는다공성트리에틸암모늄메틸폴리스티렌시아노보로하이드라이드를의미하고 ; LAH는리튬알루미늄하이드라이드를의미하며 ; NCS는 N-클로로석신이미드를의미하고 ; PyBOP는벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트를의미하며 ; TDA-1은트리스 (2-(2-메톡시에톡시) 에틸 ) 아민을의미하고 ; TEA는트리에틸아민을의미하며 ; TFA는트리플루오로아세트산을의미하고 ; THF는테트라하이드로푸란을의미하며 ; NCS는 N-클로로석신이미드를의미하고 ; NMM은 N-메틸모르폴린을의미하며 ; NMP는 N-메틸피롤리딘을의미하고 ; PPh 3 는트리페닐포스핀을의미한다. [0404] [ 반응식 1] [0405] [0406] [0407] 반응식 1 에나타낸바와같이, 화학식 1 의화합물은전자 (former) 의클로로설폰산및암모니아를반응시킴에의 해화학식 2 의화합물로전환시킬수있다. [ 반응식 2] [0408] [0409] 화학식 2 의화합물은전자의화합물과화학식 3 의화합물및커플링제를염기와함께또는염기없이반응시켜

47 화학식 II 의화합물로전환시킬수있다. 커플링제의예는 EDCI, CDI 및 PyBop 를포함한다. 염기의예는 TEA, DIEA, DMAP, 및이의혼합물을포함한다. [0410] 화학식 2 의화합물은전자의화합물과화학식 Z 1 -COCl 의화합물및염기를반응시켜화학식 II 의화합물로전환 시킬수있다. [0411] [0412] C. 암을치료하는데사용하기위한다배수유도제및 Bcl-2 계열단백질억제제의상승적조합물다른국면에서, 본원명세서의교시내용은암으로고생하는환자를치료하는데유용한치료제들의상승적병용물의발견에관한것이다. 본원에서앞서언급한바와같이, 본원명세서의교시내용의발명자들은, 특정종양및암세포에서다배수체화의유도가 Bcl-X L 의항-세포자멸사활성에따라수득되는다배수체세포를생존시키거 나생존하도록함을발견하였다. 이들다배수체세포는현재이들의생존에대해 Bcl-X L 에의존적이므로, 이들 종양및암세포는 Bcl-X L 억제에대해감작화 (sensitizing) 된다. [0413] [0414] [0415] 따라서, 본원명세서의교시내용은 (1) 적어도하나의다배수유도제 ; 및 (2) 적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제를포함하는치료제의병용물 ( 즉, 병용치료요법 ) 에관한것이다. 적어도하나의다배수유도제는아우로라키나제억제제 ( 아우로라키나제 B 억제제와같은 ), 미소관억제제 ( 예를들면, 탁소테레, 빈크리스틴, 노코다졸, 파클리탁셀또는콜세미드와같은 ), 판-키나제억제제 ( 예를들면, 스타우로스포린과같은 ), 온콜리틱바이러스 (oncolytic virus)( 예를들면, ONYX-015와같은 ), 아크리딘오렌지, 돌라스타인-10, 노스카핀, 토포이소머라제 II 억제제 ( 예를들면, ICRF-187 또는 ICRF-193와같은 ), 2-{4-[(7-클로로-2-퀴녹살리닐 ) 옥시 ] 페녹시 } 프로피온산, 2-{4-[(7-브로모-2-퀴놀리닐 ) 옥시 ] 페녹시 } 프로피온산, 플라티코딘 D, 미소관독소 ( 예를들면, JG-03-14와같은 ), 액틴중합억제제 ( 예를들면, 사이토칼라신 B와같은 ), 비스트라미드 A 또는항종양항생제 ( 예를들면, 미트라마이신 SKI와같은 ) 일수있다. 예시적인다배수유도제는아우로라키나제억제제이다. 사용될수있는예시적인아우로라키나제억제제는아우로라키나제 B 억제제이다. 사용될수있는아우로라키나제 B 억제제의예는 AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 및헤스페라딘을포함하나, 이에한정되지않는다. 사용될수있는예시적인아우로라키나제 B 억제제는 AZD1152이다. 하나이상의세포에서다배수의유도또는증거를측정하는방법은당해분야에공지된통상의기술을사용하여수득할수있거나측정할수있다. 예를들면, 다배수의증거는 p53의검출된상승된발현에의해측정할수있다. p53은야생형 p53을지닌세포에서다배수체화를위한대용품이다 [ 참조 : Gizatullin, F. et al., "The Aurora Kinase inhibitor VX-680 induces endoreduplication and apoptosis preferentially in cells with compromised p53-dependent postmitotic checkpoint function," Cancer Res. 66, (2006)]. 추가로, 다배수가유도된세포는 >4N DNA 함량, 세포크기및다핵화에있어서총형태학적증가를나타내며, 이들모두는당해분야에공지된통상의기술을사용하여검출할수있다. 적어도하나의 Bcl-2 계열구성원억제제는본원의단락 B에기술된화합물 ( 예를들면, ABT-263와같은 ), ABT- 737, Bcl-X L 억제제 (A 및 A 과같은 ) 및이들의병용물중어느것일수있다. 예시적인 Bcl-2 계열구성원억제제는 ABT-263 이다. [0416] [0417] [0418] 치료제, 즉, 적어도하나의다배수제제및적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제의상술한병용물을사용하여암의적어도하나의유형으로고생하는환자를치료할수있다. 구체적으로, 이러한치료방법은치료학적유효량의적어도하나의다배수유도제및치료학적유효량의적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제를암으로고생하며이의치료가요구되는환자에게투여함을포함한다. 적어도하나의다배수유도제및적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제를환자에게투여하는순서는중요하지않다. 그러나, 종양및암세포는다배수의유도후까지 Bcl-2 계열단백질억제제에대해감작화되지않으므로, 치료학적유효량의적어도하나의다배수유도제를치료학적유효량의적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제투여전에또는이후에투여하는것이가장유리하다. 본원에기술된치료제의병용물과함께치료되는환자에게투여될치료학적유효량의적어도하나의다배수유도제및치료학적유효량의적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제는당해분야의숙련가, 즉, 치료하는주치의에의해용이하게결정될수있다. 암으로고생하는환자를치료하는데사용하기위한치료제의예시적인병용물은다배수유도제로서치료학적유

48 효량의 AZD 1152 및 Bcl-2 계열단백질억제제로서치료학적유효량의 ABT-263 의사용을포함한다. [0419] 위에서언급한치료제의병용물은특정유형의종양, 암, 악성종양또는이의조합으로고생하는환자에게투여할수있다. 예를들면, 치료제의조합물을사용하여청신경종, 급성백혈병, 급성림프구백혈병, 급성골수세포백혈병 ( 단핵구, 골수모구, 샘암종, 혈관육종, 별아교세포종, 골수단핵구및전골수세포 ), 급성 t-세포백혈병, 기저세포암종, 담즙관암종, 방광암, 뇌암, 유방암, 기관지원성암종, 경부암, 연골육종, 척삭종, 융모막암종, 만성백혈병, 만성림프성백혈병, 만성골수세포 ( 과립구 ) 백혈병, 결장직장암, 머리인두종, 낭샘암종, 광범위큰 B-세포림프종, 증식불량변화 ( 형성이상및화생 (metaplasias)), 배아암종, 자궁내막암, 내피육종 (endotheliosarcoma), 뇌실막종, 내피암종, 적백혈병, 식도암, 에스트로겐-수용체양성유방암, 본태성혈소판증가증, 유윙종양 (Ewing's tumor), 섬유육종, 소포림프종, 배아세포고환암, 신경아교종, 중쇄병 (heavy chain disease), 혈관모세포종, 간암, 간세포암, 호르몬무감각전립선암 (hormone insensitive prostate cancer), 평활근육종, 지방육종, 폐암종, 림프형성내피육종 (lymphagioendotheliosarcoma), 림프관육종, 림프모구백혈병, 림프종 [ 호지킨및비-호지킨 (Hodgkin's and non-hodgkin's)], 방광, 유방, 결장, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 피부및자궁의악성종양및고증식성장애, T-세포또는 B-세포기원의림프구악성종양, 백혈병, 림프종, 수질암종, 속질모세포종, 흑색종, 수막종, 중피종, 다발골수종, 골수성백혈병, 골수종, 점액육종, 신경모세포종, 비-소세포폐암, 희소돌기아교세포종, 구강암, 골육종, 난소암, 췌장암, 유두모양샘암종, 유두모양암종, 송과체종, 진성적혈구증가증, 전립선암, 신장세포암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종, 피부기름샘암종, 고환종, 소세포폐암종, 고형종양 ( 암종및육종 ), 소세포폐암편평세포암종, 윤활막종, 한선암종, 발덴스트롬마이크로글로불린혈증 (Waldenstrom's macroglobulinemia), 고환종양, 자궁암및빌름스종양 (Wilms' tumor)[ 참조 : Cancer Res., 2000, 60, 및 Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia (1985)] 으로고생하는환자를치료할수있다. [0420] [0421] [0422] [0423] D. 폴리뉴클레오타이드검사단락 C에서위에기술한발견과관련하여, 본원명세서의교시내용의발명자들은또한, 종양및암세포 ( 이들암세포가다배수로유도되거나유도되지않는것에상관없이 ) 및 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이를함유하는종양및암세포가적어도하나의다배수유도제와함께다배수를유도한후 Bcl-2 계열단백질억제제를사용한치료에대해면역성이며내성을나타냄을발견하였다. 다시말해서, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이를함유하는다배수종양및암세포는적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제와동시에또는이를후속적으로치료하는경우세포자멸사또는세포사멸을억제하거나경험하지않는다. 따라서, 이러한발견의측면에서, 다른국면에서, 본원명세서의교시내용은 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이의존재또는부재를 : (i) 완전한조직또는세포시료에대한동소하이브리드화검사, (ii) 조직시료로부터추출된염색체 DNA에대한마이크로어레이하이브리드화검사, 및 (iii) 조직시료로부터추출된염색체 DNA에대한폴리머라제쇄반응 (PCR) 또는다른증폭검사에의해검출하기위한핵산검사방법을제공한다. 상기양식의어느것에서펩타이드핵산과같은핵산의합성유사체를사용한분석도사용할수있다. 본원명세서의교시내용의검사는다배수유도제치료요법, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제치료요법및 Bcl-2 계열단백질억제제의병용에대한환자반응을모니터링하고치료요법반응을예측하는데둘다에사용하기위한 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이를확인하는데사용된다. 반응예측을위한검사는적어도하나의다배수유도제 ( 다배수를유도하기위한 ) 의투여전또는다배수의유도후그러나적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제를투여하기전에수행할수있으며, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌

49 연변이를나타내지않거나나타내는환자는다배수유도제, Bcl-2 계열단백질억제제또는다배수유도제및 Bcl-2 계열단백질억제제의병용물을사용한치료요법에대해적격인것으로고려될수있다. [0424] [0425] [0426] [0427] [0428] 환자반응을모니터링하기위해, 검사를치료요법의개시 ( 즉, 적어도하나의다배수유도제를투여하는시기또는적어도하나의다배수유도제를투여한후그러나적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제를투여하기전 ) 에수행하여조직시료내에서돌연변이 ( 들 ) 의기본선수준, 예를들면, 시료내에서적어도하나의돌연변이를나타내는총세포의퍼센트또는세포의수를확립할수있다. 이후에, 동일한조직을시료로만들고검사한다음돌연변이의양또는수를기준선또는예정된수준으로비교하였다. 돌연변이의수가동일하거나감소되어남아있는경우, 치료요법은효과적일수있으며지속될수있다. 기본선수준초과의돌연변이내유의적인증가가발생한경우, 환자는연속된다배수유도제치료요법, Bcl-2 계열단백질억제제치료요법또는다배수유도제치료요법과 Bcl-2 계열단백질억제제치료요법의병용에대해반응하지않거나발달된내성을가질수있다. 본원명세서의교시내용의검사는청신경종, 급성백혈병, 급성림프구백혈병, 급성골수세포백혈병 ( 단핵구, 골수모구, 샘암종, 혈관육종, 별아교세포종, 골수단핵구및전골수세포 ), 급성 t-세포백혈병, 기저세포암종, 담즙관암종, 방광암, 뇌암, 유방암, 기관지원성암종, 경부암, 연골육종, 척삭종, 융모막암종, 만성백혈병, 만성림프성백혈병, 만성골수세포 ( 과립구 ) 백혈병, 결장직장암, 머리인두종, 낭샘암종, 광범위큰 B-세포림프종, 증식불량변화 ( 형성이상및화생 ), 배아암종, 자궁내막암, 내피육종, 뇌실막종, 내피암종, 적백혈병, 식도암, 에스트로겐-수용체양성유방암, 본태성혈소판증가증, 유윙종양, 섬유육종, 소포림프종, 배아세포고환암, 신경아교종, 중쇄병, 혈관모세포종, 간암, 간세포암, 호르몬무감각전립선암, 평활근육종, 지방육종, 폐암종, 림프형성내피육종, 림프관육종, 림프모구백혈병, 림프종 [ 호지킨및비-호지킨 ], 방광, 유방, 결장, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 피부및자궁의악성종양및고증식성장애, T-세포또는 B-세포기원의림프구악성종양, 백혈병, 림프종, 수질암종, 속질모세포종, 흑색종, 수막종, 중피종, 다발골수종, 골수성백혈병, 골수종, 점액육종, 신경모세포종, 비-소세포폐암, 희소돌기아교세포종, 구강암, 골육종, 난소암, 췌장암, 유두모양샘암종, 유두모양암종, 송과체종, 진성적혈구증가증, 전립선암, 신장세포암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종, 피부기름샘암종, 정상피종 (seminoma), 소세포폐암종, 고형종양 ( 암종및육종 ), 소세포폐암편평세포암종, 윤활막종, 한선암종, 발덴스트롬마이크로글로불린혈증, 고환종양, 자궁암및빌름스종양 [ 참조 : Cancer Res., 2000, 60, ] 과같은, 그러나이에한정되지않는암으로고생하는환자로부터수득된시험시료에사용될수있다. 본발명의검사는어떠한유형의환자조직시료와같은어떠한유형의시험시료또는, 말초혈액, 종양또는의심되는종양조직 ( 새로이동결되고고정된파라핀-봉매된조직포함 ), 혈액시료, 림프절조직, 골수및미세 -침흡인물에서분리되거나확인된혈액순환하는내피세포 (circulating epithelial cell) 와같은세포분리물을포함하는이의유도체상에서수행된다. 본원명세서의교시내용은데옥시리보핵산 (DNA) 프로브또는단백질핵산 (PNA) 프로브, 또는특이적인염색체표적에대해하이브리드화하도록설계된 / 선택된표지되지않은프라이머와같은검출가능하게표지된핵산-계프로브를사용한하이브리드화검사에의한게놈바이오마커의검출을포함한다. 표지되지않은프라이머는폴리머라제쇄반응 (PCR) 에의한것과같은증폭검사에서사용되며, 여기서프라이머결합후, 폴리머라제는후속적인검출을위해표적핵산서열을증폭시킨다. PCR 또는다른증폭검사에사용된검출프로브는바람직하게는형광성이며, 추가의보다바람직하게는, " 실시간 PCR" 에유용한검출프로브이다. 형광성표지는또한동소하이브리드화에서사용하기에바람직하나하이브리드화기술에일반적으로사용된다른검출가능한표지, 예를들면, 효소, 색원체및동위원소표지를또한사용할수있다. 유용한프로브표지기술은문헌 ( 참조 : Fan, Y.-S Molecular cytogenetics: protocols and applications. Humana Press, Totowa, N.J. xiv, p. 411, 이들내용은본원에참조로인용된다 ) 에기술되어있다. 마이크로어레이분석에의한게놈바이오마커의검출시, 이들프로브표지기술은환자시료로부터추출한염색체 DNA를표지하기위해적용된후마이크로어레이로하이브리드화된다. 바람직하게는, 동소하이브리드화를사용하여 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이의존재또는부재를검출한다. 검출되는적어도하나의돌연변이의존재또는부재가검출되는예시적인유전자는사람 BAX 유전자, 사람 BAK 유전자, 사람 NOXA 유전자및이의모든조합이다. 프라이머및프로브는당해분야의통상

50 의기술을사용하거나 BAX, BAK 및 NOXA 유전자의발현을검출하고 / 하거나측정하기위한 TAQMAN 유전자발현검사 ( 제조원 : 어플라이드바이오시스템스, 캘리포니아주포스터시티소재 ) 와같은시판되는키트에이용가능한것과같은프로브를사용하여당해분야의숙련가에의해제조될수있다. 사용할수있는어플라이드바이오시스템스로부터이용가능한 TAQMAN 유전자발현검사의예는하기표 3에서나타낸다. [0429] [ 표 3] [0430] [0431] [0432] [0433] [0434] [0435] 본원명세서의교시내용의동소하이브리드화방법에서사용하기위한프로브는 2개의광범위한그룹에속한다 : 염색체계수 (enumeration) 프로브, 즉, 염색체부위, 일반적으로반복서열부위에하이브리드화하며전체염색체의존재또는부재를나타내는프로브 ; 및유전자자리 (locus) 특이적인프로브, 즉, 염색체상의특이적인유전자자리에하이브리드화하며특이적인유전자자리의존재또는부재를검출하는프로브. 염색체아암 (arm) 프로브, 즉, 염색체부위에하이브리드화하며특이적인염색체의아암의존재또는부재를나타내는프로브를또한사용할수있다. 예를들면, 하나이상의사람 BAX, BAK 및 NOXA 유전자자리와같이, 정보를얻는유전자자리에서유일한염색체 DNA 서열의변화를검출할수있는유전자자리특이적인프로브를사용하는것이바람직하다. 동소하이브리드화를위한유일한서열프로브의사용방법은미국특허제5,447,841호에기술되어있으며이의내용이본원에참조로인용된다. 염색체계수프로브는동원체근처에위치하거나이로부터제거된반복서열에하이브리드화할수있거나, 염색체의어떠한위치에위치한유일한서열에하이브리드화할수있다. 예를들면, 염색체계수프로브는염색체의동원체와관련된반복된 DNA와하이브리드화할수있다. 주요염색체의동원체는알파-위성 DNA로언급된, 약 171개염기쌍의단량체반복길이로이루어진 DNA의긴탠덤 (tandem) 반복체의복합체계열을함유한다. 염색체 14번및 18번각각에대한동소하이브리드화프로브에서형광성인동원체는애보트몰레큘러 (Abbott Molecular, 일리노이주데스플레인스소재 ) 로부터시판된다. 예외적으로유용한동소하이브리드화프로브는본원에참조로인용된미국특허제5,491,224호에기술된것과같은형광성프로브로직접표지된다. 미국특허제5,491,224호는또한하나이상의형광적으로표지된프로브를사용한동시 FISH 검사를기술한다. 유용한유전자자리특이적인프로브는임의의방식으로생산될수있으며일반적으로약 10,000 내지약 1,000,000개염기길이의염색체 DNA 표적서열에하이브리드화하는서열을함유한다. 바람직하게는프로브는적어도 100,000개염기길이내지약 500,000개염기길이의표적유전자자리에서염색체 DNA의표적신장 (stretch) 에하이브리드화하며또한이의내용이본원에참조로인용된미국특허제5,756,696호에기재된바와같이프로브혼합물내에표지되지않은차단핵산을포함함으로써프로브의비-특이적인결합을피한다. 차단핵산으로서표지되지않은, 합성된올리고머핵산또는펩타이드핵산을사용하는것이또한가능하다. 특정유전자유전자자리를표적화하기위해, 프로브가유전자를스팬 (span) 하는핵산서열을포함함으로써유전자의전체게놈암호화유전자자리의양쪽측면에하이브리드화하는것이바람직하다. 프로브는세균인공염색체 (BAC) 등과같은사람 DNA-함유클론으로출발하여생산할수있다. 사람게놈에대한 BAC 라이브러리는인비트로겐 (Invitrogen, 캘리포니아주칼스바드소재 ) 으로부터이용가능하며유용한클론의확인을위해조사할수있다. 캘리포니아대산타크루즈브라우저 (University of California Santa Cruz Genome Browser) 를사용하여표적유전자자리내 DNA 서열을확인하는것이바람직하다. 이들 DNA 서열은이후에 BAC 라이브러리를스크리닝하기위해 PCR 프라이머를합성하기위해사용됨으로써유용한클론을확인할수있다. 이후에, 당해클론은통상의닉해독방법에의해표지되고동소하이브리드화프로브로서시험될수있다. 본원에기술된동소하이브리드화방법에사용될수있는형광단의예는 7-아미노-4-메틸코우마린-3- 아세트산 (AMCA); Texas Red TM [ 제조원 : Molecular Probes, Inc., 오리건주유진소재 ); 5-( 및 -6)- 카복시 -X- 로다민 ; 리싸 민로다민 B; 5-( 및 -6)- 카복시플루오레세인 ; 플루오레세인 -5- 이소티오시아네이트 (FITC); 7- 디에틸아미노코우마 린 -3- 카복실산, 테트라메틸 - 로다민 -5-( 및 -6)- 이소티오시아네이트 ; 5-( 및 -6)- 카복시테트라메틸로다민 ; 7- 하이

51 드록시-코우마린-3-카복실산 ; 6-[ 플루오레세인 5-( 및 -6)-카복스아미도] 헥사노산 ; N-(4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a 디아자-3-인다센프로피온산 ; 에오신-5-이소티오시아네이트 ; 에리트로신-5-이소티오시아네이트 ; 5-( 및 -6)-카복시로다민 6G; 및 Cascade TM 블루아세틸아지드 [ 제조원 : 몰레큘러프로브스 (Molecular Probes); 인비트로겐상표명 ] 이다. [0436] [0437] [0438] 프로브는형광현미경및각각의형광단용으로적절한여과기를사용하거나, 다중형광단을관측하기위한이중또는삼중밴드-통과여과기세트를사용함으로써검토할수있다 ( 참조 : 이의내용이본원에참조로인용된미국특허제5,776,688호 ). 어떠한적합한현미경영상방법도사용하여자동화된디지탈영상시스템을포함하는하이브리드화된프로브를가시화할수있다. 또는, 유동세포분석법과같은기술을사용하여염색체프로브의하이브리드화패턴을시험할수있다. 동소하이브리드화로부터생성된세포사이 (cell-by-cell) 유전자증폭분석이바람직하다고해도, 게놈바이오마커는또한정량적 PCP에의해검출될수있다. 당해양태에서, DNA는조직시료로부터추출된후 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 BH3 암호화유전자 ( 사람 BID 유전자, 사람 NOXA 유전자, 사람 PUMA 유전자, 사람 BIK 유전자, 사람 BIM 유전자및사람 BAD 유전자와같은 ), 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 중적어도하나에대해특이적이고, 사람 BH3 암호화유전자 ( 사람 BID 유전자, 사람 NOXA 유전자, 사람 PUMA 유전자, 사람 BIK 유전자, 사람 BIM 유전자및사람 BAD 유전자와같은 ) 내에서특이적인프라이머쌍을사용한 PCR에의해, 또는다수의프라이머쌍을사용하는다중 PCR에의해증폭된다. 바이오마커에대한어떠한프라이머서열도사용할수있다. 사용될수있는프라이머의예는하기표 4에나타낸다. 이후에, 적어도하나의돌연변이의존재를참조증폭표준물과비교하여측정한다. [ 표 4] [0439] [0440] 마이크로어레이-계카피수분석을또한사용할수있다. 당해양태에서, 추출후염색체 DNA를기질표면의평방센티미터당수백만개프로브까지의프로브밀도에서배열된다수의고정되고표지되지않은핵산프로브를갖는기질을포함하는마이크로어레이에대해하이브리드화를위해표지한다. 다수의마이크로어레이양식이존재하여이들중어느것도본원명세서의교시내용에서사용할수있다. 사용될수있는마이크로어레이의예는 Affymetrix GeneChip 맵핑 100K 세트 SNP 어레이 [ 참조 : Matsuzaki, H., et al., "Genotyping over 100,000 SNPs on a pair of oligonucleotide arrays," Nat. Methods. 1: (2004)]; Affymetrix GeneChip Mapping 250K 검사키트 (GeneChip 사람맵핑 250K Nsp 어레이또는 GeneChip Human Mapping 250K Sty 어레이와같은 ) 또는 Affymetrix GeneChip Mapping 500K 어레이세트 [ 이들각각은캘리포니아주산타클라라소재의아피매트릭스, 인코포레이션 (Affymetrix, Inc.) 에서시판된다 ], 아질런트사람게놈 acgh 마이크로어레이 44B(Agilent Human Genome acgh Microarray 44B)[ 캘리포니아주산타클라라소재의아질런트테크놀로지스, 인코포레이티드 (Agilent Technologies, Inc.) 로부터이용가능 ], 일루미나마이크로어레이 (Illumina microarrays)[ 캘리포니아주샌디에고소재의일루미나, 인코포레이티드 (Illumina, Inc.)], 님블레겐 acgh 마이크로어레이 (Nimblegen acgh microarrays)[ 위스콘신주매디슨소재의님블레겐인포포레이티드 (Nimblegen, Inc.)] 등이다. 올리고뉴클레오타이드마이크로어레이를사용하여증폭을검출하는경우, 표적화된부위내에 3 개이상의별개의위치에대해프로브서열을갖는마이크로어레이를사용하는것이바람직하다. 마이크로어레이에서사용될수있는프로브의예는하기표 5에나타낸다

52 [0441] [ 표 5] [0442] [0443] [0444] [0445] [0446] [0447] [0448] E. 발현의검출 : mrna (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자유전자에대한유전자발현의정도는시험시료속에서하나이상의 mrna의양을평가함으로써측정할수있다. 시료속에서 mrna를측정하는방법은당해분야에공지되어있다. mrna 농도를측정하기위해, 시험시료속의세포를용해시키고, 용해물또는용해물로부터정제되거나반-정제된 RNA내 mrna의농도를당해분야의숙련가에게친숙한어떠한다양한방법에의해서도측정할수있다. 이러한방법은검출가능하게표지된 DNA 또는 RNA 프로브 ( 즉, 노던블롯팅 ) 를사용하는하이브리드화검사또는적절한올리고뉴클레오타이드프라이머를사용하는정량적또는반-적량적 RT-PCR 방법론을포함한다. 또는, 정량적또는반-적량적인동소하이브리드화검사를예를들면, 조직단면, 또는용해되지않은세포현탁액, 및검출가능하게표지된 ( 예를들면, 형광성또는효소-표지된 ) DNA 또는 RNA 프로브를사용하여수행할수있다. mrna를정량화하는추가의방법은 RNA 보호검사 (RPA), cdna 및올리고뉴클레오타이드마이크로어레이, 대표적인차등분석 (RDA), 차등적인디스플레이, EST 서열분석, 및유전자발현의일련분석 (SAGE) 을포함한다. 적합한양태에서, PCR 증폭을사용하여시험시료내 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 내및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이를검출한다. 요약하면, PCR에서, 예를들면, (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자에대한서열을함유하는마커서열의반대되는상보성쇄상의부위에대해상보성인 2개의프라이머서열을제조한다. 과량의데옥시뉴클레오타이드트리포스페이트를반응혼합물에 DNA 폴리머라제, 예를들면, Taq 폴리머라제와함께가한다. 표적서열이시료속에존재하는경우, 프라이머는서열에결합하고폴리머라제는뉴클레오타이드에첨가함에의해마커서열과함께프라이머가연장될것이다. 반응혼합물의온도를상승시키고저하시킴으로써, 연장된프라이머를마커로부터분리하여반응생성물이형성될것이며, 과량의프라이머는마커및반응생성물에결합할것이고, 당해공정을반복함으로써증폭생성물이생성된다. 역전사효소 PCR 증폭과정을수행하여증폭된 mrna의양을정량화할수있다. (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자의어떠한적합한단편도증폭시키고검출할수있다. PCR을위한효율적인프라이머의설계는당해분야의통상의기술내에있다. 전형적으로, 검출용으로증폭된단편은, 길이가대략 50 내지 300개뉴클레오타이드이다. 증폭생성물은수개의방식으로검출할수있다. 증폭생성물은시료를겔속에서전기영동후 DNA 결합염료, 예를들면, 에티디움브로마이드를사용하여염색함으로써가시화할수있다. 또는, 증폭생성물을방사활성또는형광성뉴클레오타이드로통합적으로표지한후 x-선필름을사용하거나적절한자극스펙트럼하에서가시화할수있다. 증폭은또한 " 실시간 " 방법을사용하여모니터링할수있다. 실시간 PCR은핵산표적의검출및정량화를허용한다. 전형적으로, 정량적 PCR에대한당해시도는 SYBR GREEN 과같은, 이본쇄특이적인염료일수있는, 형광성염료를사용한다. 또는, 다른형광성염료 ( 예를들면, FAM 또는 HEX) 를올리고뉴클레오타이드프로브또는프라이머에접합시킬수있다. 실시간 PCR을수행할수있는각종장치는당해분야에공지되어있으며, 예를들면, ABI PRISM 7900( 제조원 : 어플라이드바이오시스템스 ) 및 LIGHTCYCLER 시스템스 [ 제조원 : 로쉐

53 (Roche)] 를포함한다. PCR의각각의주기에서생성된형광성시그날은 PCR 생성물의양에비례한다. 형광성의플롯대주기수를사용하여증폭의역학을기술하고형광성한계수준을사용하여초기주형농도와관련된단편주기수를정의한다. 증폭을수행하여열주기동안형광성을판독할수있는장치상에서검출한경우, 비-특이적인 PCR 생성물로부터의도된 PCR 생성물은용융분석을사용하여구별할수있다. 형광성에있어서의변화를측정하는한편증폭및시그날생성에대해후속적인반응물의온도를서서히증가시킴으로써, 의도된생성물 ( 들 ) 의 Tm 및비특이적인생성물의 Tm을측정하는것이가능할수있다. [0449] 당해방법은또한 " 다중검출 " 또는 " 다중화 (multiplexing)" 로공지된, 시료에서다수의핵산을증폭시킴을포함한다. " 다중 PCR" 은 PCR 프라이머의하나이상의세트를반응물에가하여하나이상의표적유전자마커로부터핵산을포함하는다중핵산을검출하고정량화함을포함하는 PCR을말한다. 또한, 내부대조군 ( 예를들면, 18S rrna, GADPH, 또는액틴 ) 을사용한다중화는반응없이 PCR용대조군을제공한다. [0450] [0451] [0452] [0453] [0454] F. 시료프로세싱및검사수행본원에서앞서논의한바와같이, 본원명세서의교시내용의시험시료는조직시료일수있다. 본원명세서의교시내용의방법에의해검사될조직시료는말초혈액시료, 종양조직또는의심되는종양조직, 박층세포학적시료, 미세침흡인물시료, 골수시료, 림프절시료, 뇨시료, 복수액시료, 세척액시료, 식도브러싱시료, 방광또는폐세척액시료, 척수액시료, 뇌유액시료, 관흡인물시료, 유두분비물시료, 흉막삼출액시료, 새로이동결된조직시료, 파라핀봉매된조직시료 ; 또는말초혈액시료, 종양조직또는의심되는종양조직, 박층세포학적시료, 미세침흡인물시료, 골수시료, 림프절시료, 뇨시료, 복수시료, 세척액시료, 식도브러싱시료, 방광또는폐세척액시료, 척수액시료, 뇌유액시료, 관흡인물시료, 유두분비물시료, 흉막삼출액시료, 새로이동결된조직시료또는파라핀봉매된조직시료중어느것으로부터생산된추출물또는가공된시료를포함하는어떠한유형도포함할수있다. 예를들면, 환자말초혈액시료를초기에가공하여내피세포집단을추출한후, 당해추출물을검사할수있다. 의심되는종양세포가풍부한세포시료를수득하기위한조직시료의미세해부를또한사용할수있다. 본원에서사용하기위한바람직한조직시료는미세침흡인물, 새로이동결된조직및파라핀봉매된조직, 및골수를포함하는, 말초혈액, 종양조직또는의심되는종양조직이다. 조직시료는동소하이브리드화또는다른핵산검사를수행하기위한어떠한바람직한방법에의해서도가공할수있다. 바람직한동소하이브리드화검사를위해, 파라핀봉매된종양조직시료또는골수시료를유리현미경슬라이드에고정시키고용매, 통상적으로크실렌을사용하여탈파라핀화한다. 조직탈파라핀화및동소하이브리드화를위한유용한프로토콜은애보트몰레큘러인코포레이티드 ( 일리노이주데스플레인즈소재 ) 로부터이용가능한다. 어떠한적합한장치또는자동화도본발명의검사를수행하는데사용될수있다. PCR계검사는 m2000 장치시스템 ( 제조원 : 애보트몰레큘러, 일리노이주데스플레인즈소재 ) 상에서수행할수있다. 자동화된영상을동소하이브리드화검사에서바람직한형광성을위해사용할수있다. 하나의양태에서, 시료는 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이의존재또는부재에대해시험할혈액순환하는종양또는암세포의추출물을생산하도록가공된환자로부터의말초혈액시료를포함한다. 혈액순환하는종양세포는이뮤니콘 (Immunicon)( 펜실베이니아주헌팅던밸리소재 ) 으로부터이용가능한것과같은면역자기분리기술에의해분리할수있다. 적어도하나의돌연변이는혈액순환하는종양세포에대해측정된후치료요법의개시와같은앞서의시점에서측정된하나이상의돌연변이의존재또는부재로이루어진측정을갖는혈액순환하는종양세포의예측된수준또는기본선수준과비교한다. 기본선수준또는예측된수준과비교하여적어도하나의돌연변이의증가또는존재는치료요법실패를나타낼수있다. 시험시료는임상진단에충분한어떠한수의세포도포함할수있으며, 전형적으로적어도약 100개의세포를함유한다. 대표적인 FISH 검사에서, 하이브리드화패턴은약 25 내지 1,000개세포로평가된다. 시험시료는시료의충분한비로유전자증폭을함유하는것으로밝혀진경우통상적으로 " 시험양성 " 으로고려된다. 적어도하나의돌연변이를가진다수의세포가확인되고사용되어특정시료를양성으로분류되며, 일반적으로시료내세포의수와함께변한다. 양성분류에사용된세포의수는컷-오프값 (cut-off value) 으로도공지되어있다. 측정에사용될수있는컷-오프값의예는시료집단에서약 5, 25, 50, 100 및 250개세포이거나, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50% 및 60% 의세포를포함한다. 최소가능한하나의세포가시료를양성

54 으로분류하기에충분할수있다. 대표적인파라핀봉매된조직시료에서, 적어도 30개세포를양성으로확인하는것이바람직하며적어도하나의돌연변이를갖는것에대해적어도 20개세포를양성으로확인하는것이보다바람직하다. 예를들면, 30개세포의대표적인파라핀봉매된결장직장암종에있어서의검출은양성으로조직을분류하는데충분할수있고치료에대해적격일수있다. [0455] [0456] [0457] [0458] G. 키트본원명세서의교시내용은또한각종키트를고려한다. 하나의국면에서, 키트는적어도다음 2개의치료제를함유한다 : (1) 적어도다배수유도제 ; 및 (2) 적어도하나의 Bcl-2 계열단백질억제제. 또한, 키트는임의로사용지침, 즉, 암으로고생하고이의치료가요구되는환자에대한적어도 2개의치료제의투여를포함할수있다. 이들지침은디스크, CD, DVD 등과같은컴퓨터-판독가능한형태또는종이형태로제공될수있다. 다른국면에서, 본원명세서의교시내용의키트는시험시료속에서 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이의존재또는부재를측정하기위한키트이다. 적어도하나의돌연변이의존재또는부재를상기키트를사용하여측정하기위한예시적인유전자는사람 BAX 유전자, 사람 BAK 유전자, 사람 NOXA 유전자및이들의어떠한조합이다. 이러한키트는상기기술한적어도하나의돌연변이의존재또는부재를측정하기위한하나이상의시약을포함할수있다. 예를들면, 상기키트는하나이상의핵산프로브를함유할수있다. 또는, 또한상기프로브들외에, 키트는하나이상의핵산프라이머를함유할수있다. 따라서, 본기내내용은또한하나이상의핵산프라이머, 핵산프로브또는본원에기재된핵산프라이머및프로브를포함하는진단및품질조절키트를제공한다. 임의로, 본원명세서의교시내용의검사, 키트및키트성분들은시판되는플랫폼 ( 예를들면, 일리노이주애보트파크소재의애보트래보러토리즈의 PRISM, AxSYM, ARCHITECT 및 EIA( 비드 ) 플랫폼, 및다른시판되고 / 되거나시험관내진단검사 ) 에서사용하기위해최적화될수있다. 또한, 검사, 키트및키트성분들은다른플랫폼, 예를들면, 전기화학적또는다른소형 (hand-held) 또는현장현시 (point-of-care) 검사시스템상에서사용될수있다. 본원명세서의교시내용은예를들면, TnI, CKMB 및 BNP를포함하는몇가지심장마커에대한샌드위치면역검사를수행하는시판되는애보트현장현시 (Abbott Point of CARE)(i-STAT, 일리노이주애보트파크소재의애보트래보러토리즈 ) 전기화학적면역검사시스템에적용가능하다. 단일-용도시험장치에서이들을작동시키는방법및면역센서는예를들면, 본원에참조로인용된미국특허원공보제2003/ 호, 제2004/ 호, 제2005/ 호및제 2006/ 호에기술되어있다. 전기화학적및다른유형의면역센서의제조시추가의배경은이들에관한이의교시를위해참조로또한인용된미국특허제5,063,081호에서찾을수있다. [0459] [0460] [0461] [0462] 임의로, 당해키트는품질조절시약 ( 예를들면, 민감성패널, 교정기 (calibrator), 및양성대조군 ) 을포함한다. 품질조절시약의제조는당해분야에잘공지되어있으며예를들면, 각종의면역진단제품삽입시트 (sheet) 에대해기술되어있다. 상기키트는형광단, 방사활성모이어티, 효소, 바이오틴 / 아비딘표지, 화학단, 화학발광성표지등과같은검출가능한표지를포함할수있거나, 상기키트는핵산프라이머, 핵산프로브를표지하기위한시약, 또는본원에기술된적어도하나의돌연변이의존재또는부재를검출하기위한핵산프라이머및핵산프로브를포함할수있다. 프라이머및 / 또는프로브, 교정기및 / 또는대조군은적절한검사양식, 예를들면, 미세역가플레이트내로예비-제공되거나별도의용기속에제공될수있다. 키트는임의로완충제, 염, 효소, 효소보조-인자, 기질, 검출시약등과같은품질조절평가를촉진하거나진단검사를수행하는데요구되는다른시약을포함할수있다. 완충제및시험시료의분리및 / 또는처리를위한용액 ( 예를들면, 예비처리시약 ) 과같은다른성분들이또한상기키트에포함될수있다. 상기키트는또한하나이상의다른대조군을포함할수있다. 상기키트의하나이상의성분들은동결건조될수있으며상기키트는동결건조된성분들의재구성에적합한시약을추가로포함할수있다. 상기키트의각종성분들이적합한용기속에임의로제공된다. 상기나타낸바와같이, 용기중하나이상은미세역가플레이트일수있다. 상기키트는또한시료를보유하거나저장하기위한용기 ( 예를들면, 혈액또는뇨시료를위한용기또는카트릿지 ) 를포함할수있다. 경우에따라, 상기키트는또한반응용기, 혼합용기

55 및시험시료또는시약의제조를용이하게하는다른성분들을임의로함유할수있다. 상기키트는또한주 사기, 피펫, 집게, 계량스푼등과같은시험시료를수득하는것을보조하기위한하나이상의장치를포함할 수있다. [0463] 상기키트는또한임의로디스크, CD, DVD 등과같은컴퓨터 - 판독가능한형태또는종이형태로제공될수있는 사용지침서를포함할수있다. [0464] [0465] [0466] H. 키트의조정상기키트 ( 또는이의성분들 ), 및 (i) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ), (ii) 사람 NOXA 유전자, 또는 (iii) 사람 Bcl-2 프로-세포자멸사암호화유전자 ( 사람 BAX 유전자및사람 BAK 유전자와같은 ) 및사람 NOXA 유전자내적어도하나의돌연변이의존재또는부재를본원에기술된성분들및방법을사용하여측정하는방법은예를들면, 미국특허제5,089,424호및제5,006,309호에기술되고, 예를들면, 애보트래보러토리즈 ( 일리노이주애보트파크소재 ) 에의해 ARCHITECT 로서상업적으로시판되는각종자동화된및반-자동화된시스템 ( 고체상이미세입자를포함하는것들포함 ) 에서사용하기위해조정될수있다. 비-자동화시스템 ( 예를들면, ELISA) 과비교하여자동화되거나반-자동화된시스템사이의차이점들중일부는, 제1의특이적인결합파트너 ( 예를들면, 포획항체 ) 가부착된 ( 이는샌드위치형성및분석물반응성에영향을미칠수있다 ) 기질, 및포획, 검출및 / 또는어떠한임의의세척단계의길이및시기선택을포함한다. ELISA 와같은비-자동화된양식은시료및포획시약을사용하여비교적더긴항온처리시간 ( 예를들면, 약 2시간 ) 을필요로할수있지만, 자동화되거나반-자동화된양식 ( 예를들면, ARCHITECT, 제조원 : 애보트래보러토리 즈 ) 은비교적보다짧은항온처리시간 ( 예를들면, ARCHITECT 의경우대략 18분 ) 을가질수있다. 유사하게, ELISA와같은비-자동화된양식은비교적보다긴항온처리시간 ( 예를들면, 약 2시간 ) 동안접합체시약과같은검출항체를항온처리할수있지만, 자동화되거나반-자동화된양식 ( 예를들면, ARCHITECT ) 은비교적보다짧은항온처리시간 ( 예를들면, ARCHITECT 의경우대략 4분 ) 을가질수있다. [0467] 애보트래보러토리즈로부터이용가능한다른플랫폼은 AxSYM, IMx ( 참조 : 예를들면, 이의전문이본원에참 조로인용된미국특허제5,294,404호 ), PRISM, EIA( 비드 ), 및 Quantum TM II, 및다른플랫폼을포함하나, 이에한정되지않는다. 또한, 검사, 키트및키트성분들은다른양식, 예를들면, 전기화학적또는다른소형또는현장현시검사시스템상에서사용될수있다. 본원명세서의교시내용은예를들면, 샌드위치면역검사를수행하는시판되는애보트포인트오브케어 (Abbott Point of Care)(i-STAT, 제조원 : 애보트래보러토리즈 ) 전기화학적면역검사시스템에적용가능하다. 면역센서및이들의제조방법및단일-용도시험장치에서작동은, 이와관련한이들의교시내용에대한참조에의해이들의전문이인용된미국특허제 5,063,081호, 미국특허원공보제2003/ 호, 제2004/ 호, 제2005/ 호, 및제2006/ 호에기술되어있다. [0468] [0469] 본원에기술된방법및키트가검사를수행하기위한다른시약및방법을필수적으로포함하는것은또한당연하다. 예를들면, 당해분야에공지되고 / 되거나용이하게제조되거나사용되도록최적화된각종완충액이포함된다. 다음실시예는본원명세서의교시내용의과정들및개념적국면의기술을가장유용하고용이하게이해할것으로여겨지는것들을제공하기위해나타낸다. [0470] [0471] 실시예 1A 65 에서디옥산 (700mL) 중문헌 ( 참조 : J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, ) 에기술된바와같이제조된 3-(R)-(( 카보벤질옥시 ) 아미노 )-γ-부티로락톤(62 g) 및모르폴린 (46 ml) 을 24시간동안교반하고, 냉각시키고농축시켰다. 농축액을 10% 메탄올 / 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상에서크로마토그래피하였다

56 [0472] [0473] 실시예 1B 80 에서톨루엔 (250 ml) 중실시예 1A의화합물 (16.5 g), 디페닐디설파이드 (14.5 g) 및트리부틸포스핀 (16.6 ml) 을 24시간동안교반하고, 냉각시키며농축시켰다. 농축액을 1:1 에틸아세테이트 / 헥산을사용하여실리카겔상에서크로마토그래피하였다. [0474] [0475] 실시예 1C 25 에서아세트산 (250 ml) 중 30% HBr 중실시예 1B의화합물 (18 g) 을 24시간동안교반하고, 농축시키고, 1M HCl에붓고디에틸에테르로추출하였다. 추출물을 1M HCl로추출하고, 당해추출물을 0 로냉각시키고, KOH 로 ph 12로조절하고디클로로메탄으로추출하였다. 추출물을염수로세척하고건조 (Na 2 SO 4 ) 시키고, 여과하고 농축시켰다. [0476] [0477] 실시예 1D 55 에서 THF (500 ml) 중실시예 1C 의화합물 (45.4 g) 을 1M BH 3 THF(650 ml) 로 2 시간동안처리하고, 24 시간 동안교반하고, 0 로냉각시키고, 메탄올 (80 ml) 로처리하고, 메탄올 (500 ml) 에붓고농축시켰다. 메탄올 (400 ml) 중농축물의혼합물을 HCl-포화된메탄올 (800 ml) 로처리하고, 24시간동안환류시키고, 냉각시키고, 농축시키며, 2M NaOH에붓고에틸아세테이트로추출하였다. 추출물을 1M NaOH 및염수로세척하고건조 (Na 2 SO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. 농축물을에틸아세테이트 10% 메탄올 / 에틸아세테이트및 10% 메탄올 /10% 아세토니트릴 /5% TEA/75% 에틸아세테이트를사용하여실리카겔상에서크로마토그래피하였다. [0478] [0479] 실시예 1E 25 에서 DMF (80 ml) 중메틸바이올로겐하이드로클로라이드 (1.17 g) 를트리플루오로메틸요오다이드로포화시키고, 2-플루오로벤젠티올 (9.7 ml) 및 TEA(20 ml) 로처리하고, 24시간동안교반하고, 물 (240 ml) 로희석시키고디에틸에테르로추출하였다. 추출물을 1M NaOH, 포화된염화암모늄및염수로세척하고농축시켰다. [0480] [0481] 실시예 1F 25 에서 1:1:2 사염화탄소 / 아세토니트릴 / 물 (800 ml) 중실시예 1E의화합물 ( g) 을나트륨퍼요오데이트 (56.8 g) 및염화루테늄 (III) 수화물 (183 mg) 로처리하고, 18시간동안교반하고, 디클로로메탄 (100 ml) 으로희석시키고규조토 (Celite ) 를통해여과하였다. 여액을포화된중탄산나트륨으로세척하고디클로로메탄으로추출하였다. 추출물을염수로세척하고건조 (MgSO 4 ) 시키고, 여과하고농축시킨다. 농축물을실리카겔을통해 여과하였다. [0482] [0483] 실시예 1G 120 에서클로로설폰산 (32.8 ml) 중실시예 1F의화합물 (37.3 g) 을 18시간동안교반하고, 25 로냉각시키고파쇄된얼음위에피펫팅하였다. 혼합물을에틸아세테이트로추출하고, 추출물을물및염수로세척하고건조 (MgSO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. [0484] [0485] 실시예 1H -78 에서이소프로판올 (706 ml) 중실시예 1G의화합물 (23 g) 을 1시간에걸쳐수산화암모늄 (98 ml) 으로처리하고, 1시간동안교반하고, 6M HCl (353 ml) 로퀀칭시키고, 25 로가온시키고농축시켰다. 농축물을물과혼합하고에틸아세테이트로추출하고. 추출물을건조 (MgSO 4 ) 시키며, 여과하고농축시켰다. 농축물을에틸아세테이

57 트 / 헥산으로부터재결정화하였다. [0486] [0487] 실시예 1I THF (218 ml) 중실시예 1H의화합물 (13.48 g) 및실시예 1D의화합물 (11.56 g) 을 DIEA (15.1 ml) 로처리하고, 50 에서 4시간동안교반하고, 냉각시키고, 포화된중탄산나트륨으로처리하고에틸아세테이트로추출하였다. 추출물을건조 (MgSO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. 농축물을헥산 / 에틸아세테이트로부터재결정화하였다. [0488] [0489] 실시예 1J 3 에서 DMF (10 ml) 및클로로포름 (80 ml) 을 PBr 3 (12 ml) 로처리하고, 25 에서 20 분동안교반하고, 클로로 포름 (50 ml) 중 4,4-디메틸사이클로헥사논 (7.15 g) 으로처리하고, 18시간동안교반하고, 얼음위에붓고, 고체중탄산나트륨으로중화시키고디에틸에테르로추출하였다. 추출물을염수로세척하고건조 (MgSO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. 농축물을 0 내지 10% 에틸아세테이트 / 헥산을사용하여실리카겔상에서크로마토그래피하였다. [0490] [0491] 실시예 1K 메탄올 (30 ml) 중실시예 1J의화합물 (1.7 g) 및 4-피페라진-1-일벤조산에틸에스테르 (1.9 g) 를나트륨시아노보로하이드라이드 (0.6 g) 로처리하고, 아세트산을사용하여 ph 5로조절하고, 18시간동안교반하고규조토 (Celite ) 를통해여과하였다. 여액을농축시키고, 농축물을 10 내지 30% 에틸아세테이트 / 헥산을사용하여실리카겔상에서크로마토그래피하였다. [0492] [0493] 실시예 1L 7:3:2 DME/ 물 / 에탄올 (20 ml) 중실시예 1K 의화합물 (1.1 g), 4- 클로로페닐보론산 (0.6 g), 2M Na 2 CO 3 (2 ml) 및 PdCl 2 (PPh 3 ) 2 (0.1 g) 을 85 에서 18 시간동안교반하고, 규조토 (Celite ) 를통해여과하고농축시켰다. 농축 물을 10 내지 30% 에틸아세테이트 / 헥산을사용하여실리카겔상에서크로마토그래피하였다. [0494] [0495] 실시예 1M 디옥산 (75 ml) 및물 (10 ml) 중실시예 1L의화합물 (4.59 g) 및 LiOH (1.25 g) 를 100 에서 18시간동안교반하고, 25 로냉각시키고농축시켰다. 농축물을물속에용해하고, 가열하여환류시키고, 1M HCl(28.5 ml) 로중화시키고, 25 로냉각시키고, 여과하고농축시켰다. [0496] [0497] 실시예 1N 25 에서디클로로메탄 (500 ml) 중실시예 1M의화합물 (31.5 g), 실시예 1I의화합물 (39.93 g), EDAC HCl (20.60 g) 및 DMAP(13.15 g) 를 18시간동안교반하고, 디클로로메탄으로희석시키고, 포화된염화암모늄및염수로세척하고건조 (MgSO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. 농축물을 0 내지 10% 메탄올 / 암모니아-포화된디클로 로메탄을사용한실리카겔상에서크로마토그래피하였다. 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.12 (d, 1H), 7.94 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.38 (d, 2H), 7.30 (m, 4H), 7.18 (m, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.98 (d, 1H), 6.85 (d, 3H), 4.07 (m, 1H), 3.53 (br, 4H), 3.28 (m, 12H), 2.44 (m, 8H), 1.99 (m, 3H), 1.80 (m, 1H), 1.44 (t, 2H), 0.97 (s, 6H)

58 [0498] [0499] 실시예 2A 벤젠 (400 ml) 중분말화된 NaOH(31.2 g), TDA-1(5 ml) 및 2- 플루오로벤젠티올 (33.6 ml) 을클로로디플루오로메 탄으로포화시키고, 80 에서 30 분동안교반하고규조토 (Celite ) 를통해여과하였다. 여액을포화된 NaHCO 3 로세척하고물층을디에틸에테르로추출하였다. 추출물을합하고건조 (MgSO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. [0500] [0501] 실시예 2B 25 에서 1:1:2 CCl 4 /CH 3 CN/ 물 (1.2 L) 중실시예 2A 의화합물 (46 g) 을 NaIO 4 (165.6 g) 및 RuCl 3 xh 2 O(534 mg) 로처리하고, 18시간동안교반하고, 디클로로메탄으로희석시키고, 규조토 (Celite ) 를통해여과하였다. 여액을포화된 NaHCO 3 로세척하고건조 (Na 2 SO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. 농축물을실리카겔을통해여과하였다. [0502] [0503] 실시예 2C -78 에서 THF (700 ml) 중실시예 2B의화합물 (25 g) 및 NCS(17.55 g) 를 LHMDS(178.5 ml) 로 1시간에걸쳐처리하고 1시간동안교반하고염화암모늄으로퀀칭시켰다. 혼합물을에틸아세테이트로추출하고, 추출물을염수로세척하고건조 (MgSO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. 농축물을 0 내지 5% 에틸아세테이트 / 헥산을사용하 는실리카겔상에서크로마토그래피하였다. [0504] [0505] 실시예 2D 120 에서클로로설폰산 (36.7 ml) 중실시예 2C 의화합물 (44 g) 을 18 시간동안교반하고, 25 로냉각시키고, 파쇄된얼음에피펫팅하고에틸아세테이트로추출하였다. 추출물을물및염수로세척하고건조 (MgSO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. [0506] [0507] 실시예 2E -78 에서이소프로판올 (700 ml) 중실시예 2D의화합물 (22 g) 을수성암모니아 (90 ml) 로 1시간에걸쳐처리하고, 추가로 1 시간동안교반하고, 6M HCl(300 ml) 로퀀칭시키고, 25 로가온시키고농축시켰다. 농축물을물과혼합하고에틸아세테이트로추출하였다. 추출물을건조 (MgSO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. 농축물을헥 산 / 에틸아세테이트로부터재결정화하였다. [0508] [0509] 실시예 2F THF (20 ml) 중실시예 2E의화합물 (2.89 g) 및실시예 1D의화합물 (2.39 g) 을디이소프로필에틸아민 (3.2 ml) 으로처리하고, 60 에서 18시간동안교반하고, 냉각시키고, 포화된중탄산나트륨으로처리하고에틸아세테이트로추출하였다. 추출물을건조 (MgSO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. 농축물을메탄올 / 디클로로메탄중 1.5 내지 5% 7M 암모니아를사용하는실리카겔상에서크로마토그래피하였다. [0510] [0511] 실시예 2G -5 에서디클로로메탄 (300 ml) 중헥산-세척된 60% 오일성 NaH (17 g) 을문헌 [ 참조 : Tetrahedron (1992), 48 (21), , (53.89 g)] 에기술된바와같이제조한 4,4-디메틸-2-옥소-사이클로헥산카복실산메틸에스테르로처리하고, 30분동안교반하고, -78 로냉각시키며, 트리플루오로메탄설폰산무수물로처리하고, 25 로가온시키고, 18시간동안교반하고, 염수로세척하고건조 (MgSO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다

59 [0512] [0513] 실시예 2H 70 에서 2:1 DME/ 메탄올 (600 ml) 중실시예 2G의화합물 (86 g), 4-클로로페닐보론산 (50 g), CsF(104 g) 및테트라키스 ( 트리페닐포스핀 ) 팔라듐 (0) (2.5 g) 을 18시간동안교반하고농축시켰다. 농축물을디에틸에테르중에용해시키고, 용액을건조 (MgSO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. 농축물을 20% 에틸아세테이트 / 헥산을사용 하는실리카겔을통해여과하였다. [0514] [0515] 실시예 2I 붕수소화리튬 (18 g) 을디에틸에테르 (400 ml) 및메탄올 (23 ml) 중실시예 2H 화합물 (76 g) 로처리하고, 4시간동안환류하에교반하고, 냉각시키고 1M HCl로퀀칭시키고, 물로희석시키고디에틸에테르로추출하였다. 추출물을건조 (MgSO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. 농축물을 0 내지 30% 에틸아세테이트 / 헥산을사용하는실리 카겔상에서크로마토그래피하였다. [0516] [0517] [0518] 실시예 2J 0 에서디클로로메탄 (100 ml) 중실시예 2I의화합물 (17.5 g) 을메탄설포닐클로라이드 (5.6 ml) 및 TEA (21 ml) 로동시처리하고, 5분동안교반하고, 4-피페라진-1-일벤조산에틸에스테르 (17 g) 로처리하고, 25 에서 18시간동안교반하고, 염화암모늄으로세척하고건조 (Na 2 SO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. 농축물을 10% 에틸 아세테이트 / 헥산을사용하는실리카겔상에서크로마토그래피하였다. [0519] [0520] 실시예 2K 당해실시예는, 실시예 1M 에서, 실시예 1L 을실시예 2J 로대체하여제조하였다. [0521] [0522] 실시예 2L 25 에서디클로로메탄 (200 ml) 중실시예 2K의화합물 (16.9 g) 및실시예 2F의화합물 (22 g) 을 EDAC HCl(11.06 g) 및 DMAP (7.06 g) 로처리하고, 18시간동안교반하고, 디클로로메탄 (400 ml) 으로희석시키고, 포화된염화암모늄및염수로세척하고, 건조 (MgSO 4 ) 시키며, 여과하고농축시켰다. 농축물을 0 내지 10% 메탄 올 / 암모니아-포화된디클로로메탄을사용하는실리카겔상에서크로마토그래피하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.07 (d, 1H), 7.90 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.29 (m, 2H), 7.20 (m, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.86 (d, 1H), 6.80 (d, 2H), 6.76 (d, 1H), 4.02 (m, 1H), 3.50 (m, 4H), 3.33 (m, 2H), 3.16 (m, 4H), 2.81 (s, 2H), 2.29 (m, 12H), 1.99 (s, 2H), 1.94 (m, 1H), 1.71 (m, 1H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H). [0523] [0524] 실시예 3A 당해실시예는, 실시예 1K 에서, 실시예 1J 의화합물을문헌 ( 참조 : Collect. Czech. Chem. Commun., 1961, 26, 3059.) 에기술된바와같이제조된 2- 브로모 - 사이클로헥실렌카르브알데하이드로대체하여제조하였다. [0525] [0526] 실시예 3B 당해실시예는, 실시예 1L 에서, 실시예 1K 의화합물을실시예 3A 의화합물로대체하여제조하였다

60 [0527] [0528] 실시예 3C 당해실시예는, 실시예 1M 에서, 실시예 1L 의화합물을실시예 3B 의화합물로대체하여제조하였다. [0529] [0530] 실시예 3D 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 및실시예 1I 의화합물을각각실시예 3C 의화합물및실시예 2F 의 화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.11 (d, 1H), 7.92 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.37 (d, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.27 (t, 2H), 7.18 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.94 (d, 1H), 6.84 (m, 3H), 4.04 (m, 1H), 3.51 (br, 4H), 3.27 (br, 10H), 2.84 (br, 2H), 2.33 (br, 6H), 2.18 (br, 4H), 1.97 (m, 1H), 1.76 (m, 1H), 1.66 (s, 4H). [0531] [0532] 실시예 4A THF (100 ml) 중의 3-(R)-(( 카보벤질옥시 ) 아미노 )-γ-부티롤락톤( 문헌 : J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 에기술된과정에따라제조함, 7.72 g, 32.8 mmol) 의용액을가스성디메틸아민으로포화시키고, 실온에서 16시간동안교반하고, 농축시켰다. 잔사를헥산중 50% 아세톤으로용출시키는실리카겔의플러그를통해여과하여목적한생성물을수득하였다. [0533] [0534] 실시예 4B 톨루엔 (15 ml) 중의실시예 4A의화합물 (8.45 g, mmol) 의용액을트리부틸포스핀 (9.76 ml, mmol) 및디페닐디설파이드 (7.30 g, mmol) 로처리하고 80 까지 16시간동안가열하였다. 반응혼합물을농축시키고헥산중 0 내지 50% 에틸아세테이트의구배로용출시키는실리카겔상에서컬럼크로마토그래피로정제하여목적생성물을수득하였다. [0535] [0536] 실시예 4C 25 에서 THF (100 ml) 중의실시예 4B의화합물 (7.5 g) 및비스 ( 사이클로펜타디에닐 ) 지르코늄 (IV) 클로라이드수화물 (10.31 g) 을 20분동안교반하고농축시켰다. 농축물을헥산중 50% 에틸아세테이트를사용하는실리카겔상에서크로마토그래피하였다. [0537] [0538] 실시예 4D 25 에서 1,2-디클로로에탄 (50 ml) 중의실시예 4C의화합물 (2.87 g) 및 N-이소프로필메틸아민 (1.92 g) 을나트륨트리아세톡시보로하이드라이드 (3 g) 로처리하고, 2시간동안교반하고, 에틸아세테이트로희석시키고, 2M NaOH, 물및염수로세척하고건조 (Na 2 SO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. 농축물을 1% 메탄올 / 디클로로메탄을 사용하는실리카겔상에서크로마토그래피하였다. [0539] [0540] 실시예 4E 당해실시예는, 실시예 1C 에서, 실시예 1B 의화합물을실시예 4D 의화합물로대체하여제조하였다. [0541] [0542] 실시예 4F 당해실시예는, 실시예 1I 에서, 실시예 1D 의화합물을실시예 4E 의화합물로대체하여제조하였다

61 [0543] [0544] 실시예 4G 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물을실시예 4F 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.08 (s, 1H), 7.98 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.37 (m, 4H), 7.28 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.89 (d, 1H), 6.78 (d, 2H), 6.70 (d, 1H), 4.01 (m, 1H), 3.13 (m, 6H), 2.75 (m, 2H), 2.28 (m, 6H), 2.04 (m, 4H), 1.99 (m, 2H), 1.43 (m, 2H), 1.12 (m, 10H), 0.97 (s, 6H). [0545] [0546] 실시예 5 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을각각공동소유의미국특허원제 10/988,338 호에기술된바와같이제조한 4-(4-(2-(4- 클로로페닐 ) 사이클로 -1- 에닐메틸 ) 피페라진 -1- 일 ) 벤조산, 및실시예 4F의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.00 (m, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.98 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.90 (d, 1H), 6.78 (d, 2H), 6.65 (d, 1H), 4.00 (m, 2H), 3.13 (m, 4H), 2.78 (m, 2H), 2.55 (m, 2H), 2.40 (m, 4H), 2.31 (m, 4H), 2.00 (m, 3H), 1.79 (m, 4H), 1.58 (m, 4H), 1.51 (m, 2H), 1.12 (m, 6H). [0547] [0548] 실시예 6A 당해실시예는, 실시예 1C 에서, 실시예 1B 의화합물을실시예 4B 의화합물로대체하여제조하였다. [0549] [0550] 실시예 6B 25 에서 THF (200 ml) 중의실시예 6A의화합물 (6.13 g) 을디-3급-부틸디카보네이트 (7 g) 로처리하고, 4시간동안교반하고농축시켰다. 농축물을에틸아세테이트 (500 ml) 내로용해하고, 1M NaOH, 물및염수로세척하고건조 (Na 2 SO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. 25 에서 THF (200 ml) 중의농축물을 1M NaOH(200 ml) 로처리 하고, 5 시간동안교반하고분리하였다. 물층을에틸아세테이트로추출하고, THF 및에틸아세테이트추출물 을합하고, 물및염수로세척하고건조 (Na 2 SO 4 ) 시키고, 여과하고농축시켰다. [0551] [0552] 실시예 6C 당해실시예는, 실시예 4C 에서, 실시예 5B 의화합물을실시예 6B 의화합물로대체하여제조하였다. [0553] [0554] 실시예 6D 당해실시예는, 실시예 4D에서, 실시예 4C의화합물및 N-이소프로필메틸아민을, 실시예 6C의화합물및공동소유의미국특허원제10/988,338호에기술된바와같이제조된 2-옥사-5-아자-비사이클로 [2.2.1] 헵탄으로대체하여제조하였다. [0555] [0556] 실시예 6E 25 에서디클로로메탄 (200 ml) 중의실시예 6D 의화합물 (7.86 g) 을디에틸에테르 (200 ml) 중의 2M HCl 로 처리하고, 18 시간동안교반하고농축시켰다. [0557] [0558] 실시예 6F 당해실시예는, 실시예 2F 에서, 실시예 1D 의화합물을실시예 6E 의화합물로대체하여제조하였다

62 [0559] [0560] 실시예 6G 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물및실시예 1M 의화합물을실시예 6F 의화합물및실시예 3C 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.07 (s, 1H), 7.92 (d, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.37 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.21 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.84 (d, 1H), 6.79 (d, 2H), 4.21 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 4.01 (m, 2H), 3.82 (m, 2H), 3.46 (m, 1H), 3.18 (m, 6H), 2.86 (m, 4H), 2.75 (m, 4H), 2.28 (m, 2H), 2.18 (m, 4H), 1.88 (m, 4H), 1.66 (m, 4H). [0561] [0562] 실시예 7 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물을실시예 3C 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.09 (d, 1H), 7.92 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.31 (m 7H), 7.18 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.92 (d, 1H), 6.82 (m, 3H), 4.04 (m, 1H), 3.51 (m, 4H), 3.26 (m, 10H), 2.82 (m, 2H), 2.30 (m, 10H), 1.94 (m, 1H), 1.72 (m, 5H). [0563] [0564] 실시예 8A DMF 중의공동소유의미국특허원제10/988,338호에기술된바와같이제조한 3-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노 )-4-페닐설파닐부티르산및 HATU의용액을 7-아자-비사이클로 [2.2.1] 헵탄 ( 문헌 : Org. Lett., 2001, 3, 에기술된바와같이제조함 ); 및 N-메틸모르폴린으로처리하고, 주위온도에서 30분동안교반하고, 에틸아세테이트로희석시키고, 1.5% HCl, NaHCO 3 (aq), H 2 O 및염수로세척하고, 건조 (Na 2 SO 4 ) 시키고, 여과하고 농축시켜목적생성물을수득하였다. [0565] [0566] 실시예 8B THF 중의실시예 8A 의화합물의용액을디에틸아민으로처리하고, 주위온도에서 2 시간동안교반하고농축시 켰다. 잔사를 CH 2 Cl 2 (NH 3 로포화시킴 ) 에이어에틸아세테이트로용출시키는실리카겔크로마토그래피로정제 하여목적생성물을수득하였다. [0567] [0568] 실시예 8C 당해실시예는, 실시예 1D 에서, 실시예 1C 의화합물을실시예 8B 의화합물로대체하여제조하였다. [0569] [0570] 실시예 8D 당해실시예는, 실시예 1I 에서, 실시예 1D 의화합물을실시예 8C 의화합물로대체하여제조하였다. [0571] [0572] 실시예 8E 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물및실시예 1M 의화합물을각각실시예 8D 의화합물및실시 예 3C 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.19 (m, 1H), 8.07 (d, 1H), 7.97 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.31 (m 6H), 7.20 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.89 (d, 1H), 6.76 (d, 2H), 6.65 (d, 1H), 4.03 (m, 2H), 3.31 (m, 4H), 3.12 (m, 4H), 2.90 (br, 2H), 2.76 (m 2H), 1.96 (m, 21H). [0573] 실시예 9A

63 [0574] 당해실시예는, 실시예 1I 에서, 실시예 1D 의화합물을실시예 6E 의화합물로대체하여제조하였다. [0575] [0576] 실시예 9B 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물및실시예 1M 의화합물을실시예 9A 의화합물및실시예 3C 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.08 (d, 1H), 7.94 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.32 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.87 (d, 1H), 6.78 (d, 3H), 4.40 (m, 1H), 4.03 (m, 2H), 3.83 (m, 2H), 3.54 (m, 2H), 3.26 (m, 2H), 3.14 (m, 4H), 2.80 (br, 2H), 2.78 (m, 4H), 1.97 (m, 14H). [0577] [0578] 실시예 10 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물을실시예 9A 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.09 (d, 1H), 7.95 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.33 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.90 (d, 1H), 6.79 (d, 3H), 4.44 (m, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.84 (m, 1H), 3.57 (m, 1H), 3.02 (m, 13H), 2.25 (m, 6H), 1.99 (m, 6H), 1.43 (t, 2H), 0.97 (s, 6H). [0579] [0580] 실시예 11 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물을실시예 6F 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.07 (d, 1H), 7.93 (d, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.33 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.81 (m, 4H), 4.41 (m, 1H), 4.06 (m, 1H), 3.83 (m, 1H), 3.47 (m, 1H), 3.02 (m, 13H), 2.25 (m, 6H), 1.99 (m, 6H), 1.43 (t, 2H), 0.97 (s, 6H). [0581] [0582] 실시예 12 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을각각공동소유의미국특허원제 10/988,338 호에기술된바와같이제조된, 4-(4-(2-(4- 클로로페닐 ) 사이클로헵트 -1- 에닐메틸 ) 피페라진 -1- 일 ) 벤조 산, 및실시예 9A 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.09 (d, 1H), 7.95 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.32 (m 7H), 7.19 (tt, 1H), 7.09 (dt, 2H), 6.90 (d, 1H), 6.79 (d, 3H), 4.45 (m, 1H), 4.03 (m, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.55 (m, 2H), 3.04 (m, 8H), 2.34 (m, 8H), 1.85 (m, 7H), 1.54 (m, 5H). [0583] [0584] 실시예 13 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을각각공동소유의미국특허원제 10/988,338 호에기술된바와같이제조된, 4-(4-(2-(4- 클로로페닐 ) 사이클로헵트 -1- 에닐메틸 ) 피페라진 -1- 일 ) 벤조 산, 및실시예 6F 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.07 (d, 1H), 7.93 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.32 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.09 (dt, 2H), 6.87 (d, 1H), 6.79 (d, 3H), 4.45 (m, 1H), 4.02 (m, 2H), 3.84 (m, 2H), 3.56 (m, 2H), 3.07 (m, 8H), 2.33 (m, 8H), 1.85 (m, 7H), 1.54 (m, 5H). [0585] [0586] 실시예 14 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을각각실시예 2K 의화합물및실시 예 4F 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.07 (d, 1H), 7.96 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.33 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.09 (dt, 2H), 6.87 (d, 1H), 6.77 (d, 2H), 6.72 (d, 1H), 4.00 (m,

64 1H), 3.28 (m, 4H), 3.12 (m, 4H), 2.79 (m, 2H), 2.48 (m, 2H), 2.23 (m, 8H), 2.02 (m, 4H), 1.42 (t, 2H), 1.08 (m, 6H), 0.96 (s, 6H). [0587] [0588] 실시예 15A 당해실시예는, 실시예 4D 에서, 실시예 4C 의화합물및 N- 이소프로필 -N- 메틸아민을실시예 6C 의화합물및 1,4- 옥사제판으로대체하여제조하였다. [0589] [0590] 실시예 15B 당해실시예는, 실시예 6E 에서, 실시예 6D 의화합물을실시예 15A 의화합물로대체하여제조하였다. [0591] [0592] 실시예 15C 당해실시예는실시예 1I 에서실시예 1D 의화합물을실시예 15B 의화합물로대체하여제조하였다. [0593] [0594] 실시예 15D 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물및실시예 1M 의화합물을각각실시예 15C 의화합물및실 시예 3C 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 8.32 (s, 1H), 8.01 (br, 1H), 7.67 (d, 2H), 7.34 (t, 4H), 7.24 (m, 3H), 6.99 (m, 3H), 6.67 (br, 3H), 3.97 (br, 1H), 3.88 (s, 2H), 3.79 (s, 2H), (br m, 12H), 3.14 (m, 6H), 2.29 (s, 6H), 2.08 (m, 2H), 1.74 (s, 4H). [0595] [0596] 실시예 16A 당해실시예는, 실시예 4D 에서, N- 이소프로필 -N- 메틸아민을아제판으로대체하여제조하였다. [0597] [0598] 실시예 16B 당해실시예는, 실시예 4E 에서, 실시예 4D 의화합물을실시예 16A 의화합물로대체하여제조하였다. [0599] [0600] 실시예 16C 당해실시예는, 실시예 1I 에서, 실시예 1D 의화합물을실시예 16A 의화합물로대체하여제조하였다. [0601] [0602] 실시예 16D 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물및실시예 1M 의화합물을각각실시예 16C 의화합물및실 시예 3C 의화합물로대체하여제조하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 8.33 (s, 1H), 8.01 (d, 1H), 7.67 (d, 2H), 7.34 (t, 4H), 7.23 (m, 3H), 6.98 (m, 3H), 6.67 (m, 3H), 3.99 (m, 1H), (br m, 10H), 3.12 (s, 4H), 2.86 (m, 2H), 2.55 (br, 2H), 2.29 (s, 4H), 2.06 (m, 1H), 1.93 (m, 3H), 1.74 (s, 8H), 1.60 (m, 2H). [0603] [0604] 실시예 17A 당해실시예는, 실시예 1D 에서, 실시예 1C 의화합물을실시예 6A 의화합물로대체하여제조하였다

65 [0605] [0606] 실시예 17B 당해실시예는, 실시예 1I 에서, 실시예 1D 의화합물을실시예 17B 의화합물로대체하여제조하였다. [0607] [0608] 실시예 17C 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을각각공동소유의미국특허원제 10/988,338 호에기술된바와같이제조된 4-(4-(2-(4- 클로로페닐 ) 사이클로헵트 -1- 에닐메틸 ) 피페라진 -1- 일 ) 벤조 산, 및실시예 17B의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.58 (brs, 1H), 9.46 (brs, 1H), 8.18 (d, 1H), 8.00 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 7.29 (d, 2H), 7.24 (m, 2H), 7.13 (m, 4H), 6.96 (m, 3H), 4.12 (m, 1H), 3.87 (m, 1H), 3.63 (m, 1H), 3.38 (m, 4H), 3.15 (m, 4H), 3.02 (m, 2H), 2.74 (s, 6H), 2.46 (m, 4H), 2.09 (m, 2H), 1.81 (m, 2H), 1.57 (m, 4H). [0609] [0610] 실시예 18A 당해실시예는, 실시예 1I 에서, 실시예 1H 의화합물및실시예 1D 의화합물을실시예 2E 의화합물및실시예 17B 의화합물로대체하여제조하였다. [0611] [0612] 실시예 18B 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물및실시예 1M 의화합물을각각실시예 18A 의화합물및실 시예 3C의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.60 (brs, 1H), 9.47 (brs, 1H), 8.18 (d, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (m, 2H), 7.15 (m, 3H), 7.12 (d, 1H), 6.96 (m, 3H), 6.92 (d, 1H), 4.10 (m, 1H), 3.91 (m, 2H), 3.60 (m, 2H), 3.37 (m, 4H), 3.15 (m, 2H), 3.02 (m, 1H), 2.74 (s, 6H), 2.25 (d, 4H), 2.08 (m, 2H), 1.71 (m, 4H). [0613] [0614] 실시예 19 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물을실시예 2F 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.11 (d, 1H), 7.93 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.27 (m, 2H), 7.18 (m, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.97 (d, 1H), 6.85 (m, 3H), 4.05 (m, 1H), 3.53 (m, 4H), 3.23 (m, 1H), 2.83 (m, 1H), 2.34 (m, 8H), 2.22 (m, 2H), 1.99 (m, 2H), 1.96 (m, 1H), 1.77 (m, 1H), 1.44 (t, 2H), 0.97 (s, 6H). [0615] [0616] 실시예 20 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물을실시예 17B 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.46 (brs, 1H), 8.18 (d, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.76 (d, 2H), 7.40 (d, 2H), 7.29 (d, 2H), 7.23 (t, 2H), 7.14 (s, 4H), 6.95 (m, 3H), 4.11 (m, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.58 (m, 4H), 3.08 (m, 4H), 2.73 (s, 6H), 2.27 (m, 2H), 2.08 (m, 2H), 2.02 (s, 2H), 1.47 (t, 2H), 1.00 (s, 6H). [0617] [0618] 실시예 21 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물을공동소유의미국특허원제 10/988,338 호에기술된바와 같이제조된 4-(4-(4-(4- 클로로페닐 )-5,6- 디하이드로 -2H- 피란 -3- 일메틸 ) 피페라진 -1- 일 ) 벤조산으로대체하여제 조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.27 (d, 1H), 8.11 (d, 1H), 7.89 (d, 2H), 7.59 (d, 2H), 7.48 (m, 4H), 7.37 (m, 3H), 7.13 (m, 1H), 7.01 (m, 3H), 4.35 (s, 2H), 4.24 (m, 1H), 3.97 (m, 2H), 3.68 (m,

66 4H), 3.36 (m, 6H), 3.07 (m, 3H), 2.68 (s, 2H), 2.59 (m, 4H), 2.14 (m, 2H), 1.93 (m, 2H). [0619] [0620] 실시예 22A 당해실시예는, 실시예 2F 에서, 실시예 2E 의화합물을실시예 4E 의화합물로대체하여제조하였다. [0621] [0622] 실시예 22 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을실시예 2K 의화합물및실시예 22A의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.21 (brs, 1H), 8.17 (m, 1H), 8.00 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.42 (m, 2H), 7.31 (m, 2H), 7.24 (m, 2H), 7.14 (m, 4H), 6.97 (m, 3H), 4.11 (m, 1H), 3.90 (m, 1H), 3.12 (m, 6H), 2.84 (m, 3H), 2.63 (m, 3H), 2.25 (m, 2H), 2.07 (m, 4H), 1.49 (t, 2H), 1.16 (m, 6H), 0.97 (s, 6H). [0623] [0624] 실시예 23 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물을실시예 22A 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.21 (brs, 1H), 8.18 (m, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.78 (d, 2H), 7.40 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (m, 2H), 7.15 (m, 4H), 6.97 (m, 3H), 4.11 (m, 1H), 3.89 (m, 1H), 3.13 (m, 6H), 2.84 (m, 2H), 2.63 (m, 3H), 2.28 (m, 2H), 2.07 (m, 4H), 1.48 (t, 2H), 1.17 (m, 6H), 1.00 (s, 6H). [0625] [0626] 실시예 24 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물을실시예 2K 의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ (brs, 1H), 9.89 (brs, 1H), 9.52 (s, 1H), 8.18 (d, 1H), 8.00 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (t, 2H), 7.14 (m, 4H), 6.96 (m, 3H), 4.12 (m, 1H), 3.93 (m, 3H), 3.63 (m, 4H), 2.93 (m, 10H), 2.24 (m, 2H), 2.09 (m, 4H), 1.48 (t, 2H), 0.97 (s, 6H). [0627] [0628] 실시예 25 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을각각실시예 2K 의화합물및실시 예 6F의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.58 (brs, 1H), 9.39 (brs, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (t, 2H), 7.14 (m, 4H), 6.97 (m, 3H), 4.63 (d, 1H), 4.43 (d, 1H), 4.13 (m, 1H), 3.92 (m, 2H), 3.69 (m, 2H), 3.52 (m, 2H), 3.01 (m, 6H), 2.25 (m, 2H), 2.04 (m, 6H), 1.49 (m, 2H), 0.98 (s, 6H). [0629] [0630] 실시예 26 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물및실시예 1M 의화합물을각각실시예 17B 의화합물및실 시예 3C의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.49 (brs, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.95 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.84 (m, 2H), 6.78 (d, 2H), 3.98 (m, 1H), 3.28 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.81 (brs, 1H), 2.77 (s, 1H), 2.46 (s, 6H), 2.28 (s, 4H), 2.19 (m, 4H), 2.00 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.65 (m, 4H). [0631] 실시예 27A

67 [0632] 당해실시예는, 실시예 4D 에서, N- 이소프로필에틸아민을피롤리딘으로대체하여제조하였다. [0633] [0634] 실시예 27B 당해실시예는, 실시예 4E 에서, 실시예 4D 의화합물을실시예 27A 의화합물로대체하여제조하였다. [0635] [0636] 실시예 27C 당해실시예는, 실시예 1I 에서, 실시예 1D 의화합물을실시예 27B 의화합물로대체하여제조하였다. [0637] [0638] 실시예 27D 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물및실시예 1M 의화합물을각각실시예 27C 의화합물및실 시예 3C의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.08 (d, 1H), 7.96 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.87 (m, 1H), 6.77 (d, 2H), 6.72 (d, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.97 (m, 6H), 2.76 (s, 1H), 2.28 (brs, 4H), 2.19, (m, 4H), 2.05 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 1.82 (brs, 4H), 1.65 (m, 4H). [0639] [0640] 실시예 28 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을각각실시예 2K 의화합물및실시 예 17B의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.59 (brs, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.94 (dd, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.21 (tt, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.83 (d, 1H), 6.78 (d, 3H), 3.97 (m, 1H), 3.28 (m, 2H), 3.13 (brs, 4H), 2.90 (brs, 2H), 2.79 (s, 2H), 2.55 (s, 6H), 2.28 (brs, 4H), 2.20 (m, 2H), 1.99 (s, 2H), 1.90 (m, 2H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H). [0641] [0642] 실시예 29 당해실시예는실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을각각공동소유의미국특허원제 10/988,338 호에기술된바와같이제조된 4-(4-(2-(4- 클로로페닐 ) 사이클로 -1- 에닐메틸 ) 피페라진 -1- 일 ) 벤조산, 및실시예 27C의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.60 (brs, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.94 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.83 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.80 (m, 5H), 2.76 (s, 2H), 2.40 (m, 4H), 2.31 (brs, 4H), 1.99 (m, 1H), 1.89 (m, 1H), 1.77 (brs, 6H), 1.58 (m, 2H), 1.51 (m, 2H). [0643] [0644] 실시예 30A 당해실시예는, 실시예 1I 에서, 실시예 1H 의화합물및실시예 1D 의화합물을실시예 2E 의화합물및실시예 27B 의화합물로대체하여제조하였다. [0645] [0646] 실시예 30B 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물및실시예 1D 의화합물을실시예 30A 의화합물로대체하여 제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.57 (brs, 1H), 8.07 (d, 1H), 7.93 (dd, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.21 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.81 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.80 (m, 5H), 2.76 (s, 2H), 2.27 (m, 4H), 2.22 (m, 2H), 1.99 (m, 3H),

68 (m, 1H), 1.77 (brs, 4H), 1.43 (t, 2H), 0.97 (s, 6H). [0647] [0648] 실시예 31 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을각각실시예 2K 의화합물및실시 예 30A의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.52 (brs, 1H), 8.06 (d, 1H), 7.92 (dd, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.21 (t, 1H), 7.08 (d, 2H), 6.81 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.76 (s, 2H), 2.75 (m, 5H), 2.26 (m, 4H), 2.20 (m, 2H), 1.99 (m, 3H), 1.86 (m, 1H), 1.76 (brs, 4H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H). [0649] [0650] 실시예 32 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을각각공동소유의미국특허원제 10/988,338 호에기술된바와같이제조된, 4-(4-(2-(4- 클로로페닐 ) 사이클로헵트 -1- 에닐메틸 ) 피페라진 -1- 일 ) 벤조 산및실시예 30A의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.50 (brs, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.94 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.83 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.80 (m, 5H), 2.76 (s, 2H), 2.40 (m, 4H), 2.31 (brs, 4H), 1.98 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 1.76 (brs, 6H), 1.58 (m, 2H), 1.51 (m, 2H). [0651] [0652] 실시예 33 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1I 의화합물및실시예 1M 의화합물을각각실시예 4F 의화합물및실시 예 3C의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.03 (s, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.97 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (tt, 1H), 7.13 (dt, 2H), 6.88 (m, 1H), 6.78 (d, 2H), 6.70 (m, 1H), 3.99 (m, 1H), (m, 4H), 3.12 (s, 4H), 2.76 (s, 2H), (m, 2H), (m, 10H), (m, 2H), 1.66 (s, 4H), 1.13 (m, 6H). [0653] [0654] 실시예 34 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을각각실시예 2K 의화합물및실시 예 27C의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.53 (s, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.97 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (tt, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.89 (d, 1H), 6.78 (d, 2H), 6.71 (d, 1H), 4.01 (m, 1H), (m, 4H), (m, 10H), 2.79 (s, 2H), 2.27 (s, 4H), 2.20 (t, 2H), 2.03 (m, 2H), 1.85 (m, 4H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H). [0655] [0656] 실시예 35 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을각각실시예 3C 의화합물및실시 예 30A의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 8.06 (d, 1H), 7.93 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (m, 2H), 7.21 (m, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.81 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.97 (m, 1H), 3.26 (m, 4H), 3.12 (s, 4H), 2.78 (m, 6H), 2.27 (s, 4H), 2.18 (m, 4H), 1.99 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 1.76 (s, 4H), 1.66 (s, 4H). [0657] [0658] 실시예 36 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을각각실시예 2K 의화합물및실

69 시예 9A의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.09 (d, 1H), 7.97 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.33 (m, 6H), 7.21 (m, 1H), 7.08 (d, 2H), 6.87 (m, 1H), 6.78 (m, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.14 (m, 4H), 2.95 (m, 1H), 2.80 (m, 3H), 2.58 (s, 6H), 2.28 (m, 4H), 2.20 (m, 2H), 1.99 (m, 4H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H). [0659] [0660] 실시예 37 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물및실시예 1I 의화합물을각각실시예 2K 의화합물및실시 예 17B의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.09 (d, 1H), 7.97 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.33 (m, 6H), 7.21 (m, 1H), 7.08 (d, 2H), 6.87 (m, 1H), 6.78 (m, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.14 (m, 4H), 2.95 (m, 1H), 2.80 (m, 3H), 2.58 (s, 6H), 2.28 (m, 4H), 2.20 (m, 2H), 1.99 (m, 4H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H). [0661] [0662] 실시예 38 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 각각실시예 1M 의화합물을공동소유의미국특허원제 10/988,338 호에기술된 바와같이제조한, 4-(4-(1,1'- 비페닐 -2- 일메틸 )-1- 피페라지닐 ) 벤조산으로대체하고, 실시예 1I 의화합물을실 시예 17B의화합물로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.19 (d, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.76 (d, 3H), 7.52 (d, 4H), 7.40 (d, 2H), 7.35 (m, 1H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (t, 2H), 7.16 (t, 2H), 6.96 (m, 3H), 4.25 (br, 2H), 4.12 (m, 1H), 3.37 (m, 2H), 3.14 (m, 1H), 3.10 (br, 8H), 2.74 (s, 6H), 2.10 (m, 2H). [0663] [0664] 실시예 39 당해실시예는, 실시예 1N 에서, 실시예 1M 의화합물을공동소유의미국특허원제 10/988,338 호에기술된바와 같이제조한, 4-(4-(1,1'-bi 페닐 -2- 일메틸 )-1- 피페라지닐 ) 벤조산으로대체하여제조하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.19 (d, 1H), 8.00 (dd, 1H), 7.76 (d, 2H), 7.52 (m, 5H), 7.14 (m, 8H), 6.96 (m, 3H), 4.29 (m, 2H), 4.14 (m, 2H), 4.02 (m, 1H), 3.10 (m, 8H), 2.13 (m, 2H). [0665] [0666] [0667] 실시예 40 항체모든항체는다음과같이시판되는공급원으로부터입수하였다 : INCENP, 히스톤 H3, 히스톤 H3-(pSer 10 ), BIK, PUMA, 및 BAK에대한항체는셀시그날링테크놀로지 (Cell Signaling Technology) 로부터입수하고 ; 아우로라 B, Bad, 및 Ral-A에대한항체는에피토믹스 (Epitomics) 로부터입수하며 ; 아우로라 A, p53, 시토크롬 C, Bid, 및 Bim에대한항체는비디바이오사이언스 (BD Biosciences) 로부터입수하고 ; Bcl-2, Bcl-X L, Mcl-1, 및 S6K1에 대한항체는산타크루즈바이오테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology) 로부터입수하며 ; BAX에대한항체는아 브캠 (Abcam) 으로부터입수하고 ; NOXA에대한항체는임게넥스 (Imgenex) 로부터입수하며 ; 활성 BAX 이형태체 (conformer)(6a7) 에대한항체는시그마 (Sigma) 로부터입수하며 ; 활성 BAK 이형태체 (Ab2) 에대한항체는칼바이 오켐 (Calbiochem) 으로부터 입수하고 ; 베타-액틴에 대한 항체는 알앤디 시스템스 (R&D systems) 로부터 입수하였다. [0668] [0669] 소-분자및 sirna 임상약물 BCNU, 독소루비신, 겜시타빈, 에토포시드, 5-FU, ALIMTA, 라파마이신, 및앞서기술된애보트화합물, ABT-751(β-튜불린억제제 ), ABT-888(PARP 억제제 )[ 참조 : Donawho, C. K. et al., "ABT-888, an orally active poly(adp-ribose) polymerase inhibitor that potentiates DNA-damaging agents in

70 preclinical tumor models," Clin Cancer Res 13, (2007)], ABT-263 (Bcl-2 단백질계열억제제 )[ 참조 : Tse, C. et al., "ABT-263: a potent and orally bioavailable Bcl-2 family inhibitor," Cancer Res 68, (2008)], 리토나비르 [ 참조 : Kempf, D. J. et al., "Discovery of ritonavir, a potent inhibitor of HIV protease with high oral bioavailability and clinical efficacy," J Med Chem 41, (1998)], A (AKT 억제제 )[ 참조 : Luo, Y. et al., "Potent and selective inhibitors of Akt kinases slow the progress of tumors in vivo," Mol Cancer Ther 4, (2005)], 및 A ( 히스톤데아세틸라제 )[ 참조 : Vasudevan, A. et al., "Heterocyclic ketones as inhibitors of histone deacetylase," Bioorg Med Chem Lett 13, (2003)] 을본출원의양수인인, 애보트래보러토리즈의화합물기탁기관으로부터입수하였다. 17-AAG는에이지사이언티픽 (AG Scientific)( 캘리포니아주샌디에고소재 ) 으로부터시판되었다. MLN8054의화학구조 [ 참조 : Manfredi, M. G. et al., "Antitumor activity of MLN8054, an orally active small-molecule inhibitor of aurora A kinase," Proc Natl Acad Sci USA 104, (2007)], AZD1152[ 참조 : Mortlock, A. A. et al., "Discovery, synthesis, and in vivo activity of a new class of pyrazoloquinazolines as selective inhibitors of aurora B kinase," J Med Chem 50, (2007)], 및 VX-680/MK-0457[ 참조 : Harrington, E. A. et al., "VX-680, a potent and selective small-molecule inhibitor of the Aurora Kinases, suppresses tumor growth in vivo," Nat Med 10, (2004)] 및 BI 2536은기재되어있다. 이들화합물은비교목적을위해애보트래보러토리즈에서합성되었다. AZD1152-하이드록시퀴나졸린피라졸아닐리드 (HQPA) 는혈장의존재하에서인산이수소프로드럭, AZD1152로부터신속하게전환된다 [ 참조 : Mortlock, A. A. et al., "Discovery, synthesis, and in vivo activity of a new class of pyrazoloquinazolines as selective inhibitors of aurora B kinase," J Med Chem 50, (2007)]. 모든연구에대해, AZD1152- HQPA를사용하였고 AZD1152로언급하였다. [0670] Bcl-2, Bcl-X L, Mcl-1, 아우로라 A, 아우로라 B, INCENP, BIK, NOXA, BAX, BAK, PUMA, BAD, 및 BIM 에대한 sirna는다르마콘 (Dharmacon)( 콜로라도주라파예트소재 ) 로부터시판되었다. 각각의표적의경우, 4 ON-TARGET Plus sirna의세트를표적녹다운 (knowdown) 및오프-표적세포독성에대해예비스크리닝시켰다. 72-시간증식검사에서 10% 이상의오프-표적성장억제를유발하지않는표적단백질의 70% 이상의감소를개시한 sirna를모든 sirna-관련연구에대해선택하였다. 각각의표적에대해대부분의강력한 sirna가, 단지하나의 sirna/ 표적이사용된실험에서사용되었다. 대조군, 비표적화 sirna 및앞서기술된루시퍼라제 sirna[ 참조 : Lin, X. et al., "Seed' analysis of off-target sirnas reveals an essential role of Mcl-1 in resistance to the small-molecule Bcl-2/Bcl-X L inhibitor ABT-737," Oncogene 26, (2007)] 는또한다르마콘으로부터시판되었다. [0671] [0672] [0673] [0674] 세포배양및동물연구사람암세포주 SW620, D54MG, A549, PC3, EJ1, DLD1, HCT116, 및 786-O를아메리칸타입컬쳐컬렉션 (American Type Culture Collection)(ATCC) 으로부터입수하였다. 모든세포주는공급업자의추천에따라배양하였다. C.B.-17 scid-bg(scid-bg) 또는 C.B.-17 scid(scid) 마우스를찰스리버래보러토리즈 (Charles River Laboratories) 로부터 5 내지 6주령시기에입수하여 8주령이상및 / 또는크기가 ~20g일때연구에사용하였다. 모든동물연구는사람보호및동물사용에있어서공중위생국인, 농업동물후생법령 (Agriculture Animal Welfare Act) 의미국부서, 및실험동물후생에대한 NIH 가이드에의해설정된표준을충족시키거나이를능가하는조건하에서실험동물보호의미국연합회가승인한, 국제기관동물보호및사용위원회 (Internal Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC) 에따라특이적인병원체가없는환경하에서수행하였다. 탈수의명시적인신호, 털손질의결여, 무기력, >15% 체중손실및종양용적 > 체중의 20% 를사용하여종양종결점을측정하였다. 종양세포주 HCT116을마이코플라즈마 (Mycoplasma) 에대해정규적으로시험하고감염성미생물 PCR 증폭시험 (IMPACT, Missouri Research Animal Diagnostic Laboratory) 에의해생체내접종전에미생물이없음을확인하였다. 1 mm L-글루타민및 10% 소태아혈청이보충되고, 5% CO 2, 95% 공기로평형화시킨습윤화된대기속에 서 37 로유지시킨, RPMI 속에서세포를성장시키고종양세포접종을위해대수기일때 3 내지 7 회계대배양 사이에서사용하였다. 세포 (1x10 6 ) 를매트리겔 ( 제조원 : 비디바이오사이언시스 ) 로 1:1 로혼합하고암컷마우스

71 의제모한옆구리로피하주사 (0.2mL) 하였다. 종양을크기-조화 ( mm 3 ) 시키고투여를개시하기전에치료그룹으로할당하였다. 2개의양분직경 (bisecting diameter) 을캘리퍼스 (calipers) 로측정하고종양용적을수학식 : ( 길이 x 너비 2 )/2로부터추정하였다. VX-680을복강내 (I.P., 50 mg/kg/d, 종결점까지 b.i.d.; 종결점에도달하고연구가종결된경우에따라 17일 ) 10% 솔루톨 (solutol)[ 제조원 : BASF, 뉴저지주플로르햄파크소재 ] 및 90% 타르타르산 [ 제조원 : 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich), 미주리주세인트루이스소재 ] 를함유하는비히클로투여하였다. AZD1152를복강내 (100 mg/kg/d, b.i.d. x 3) 에 2% 에탄올, 5% 트윈-80, 20% PEG-400, 73% HPMC( 제조원 : 시그마-알드리치 ) 를함유하는비히클로투여하였다. ABT-263을 PO로, 75 또는 100 mg/kg/d, q.d. x 13 내지 17일동안 60% 포살 (Phosal) 50, 30% PEG 400, 10% 에탄올을함유하는비히클로투여하였다. 제제를나타낸기간동안조합물치료요법과초기에동시에투여하였다. [0675] [0676] sirna 형질감염전형적으로, 세포를항생제가없는성장배지속에서 96-웰플레이트내에 5,000개 / 웰로씨딩 (seeding) 하고밤새배양하였다. 다음날, 세포를리포펙타민 RNAiMAX 형질감염시약 ( 제조원 : 인비트로겐 ) 또는 DharmaFECT 형질감염시약을사용하여제조업자의추천에따라 sirna 올리고로형질감염시켰다. 개개의 sirna를 10 nm의최종농도에서형질감염시켰다. 면역블롯팅실험을위해, 세포를추가로 3일동안배양한후용해물을제조하였다. sirna/ 약물조합물을위해, 세포를형질감염후 24시간째에화합물로처리한후, 추가로 72시간동안배양하였다. 장기간의다배수체화를위해, 세포를형질감염후 10일까지배양하였다. [0677] [0678] [0679] [0680] [0681] [0682] [0683] 세포생존능검사및카스파제 3/7 검사세포생존능을 CellTiter-GLO 발광성검사 ( 제조원 : 프로메가 ) 를사용하여제조업자의제안된프로토콜에따라측정하였다. 일반적으로, 세포를 >90% 생존능 ( 트립판블루배제로측정된것으로서 ) 에서 96-웰플레이트내로밤새씨딩하고, 나타낸기간동안화합물또는 sirna로처리하고, 전체세포생존능을발광을측정함으로써측정하였다. 카스파제-3 활성은카스파제-GLO 3/7 검사 ( 제조원 : 프로메가 ) 를 CellTiter-GLO 생존능검사 ( 제조원 : 프로메가 ) 와연계하여사용하여측정하였다. 평행실험을수행하였으며, 여기서, 하나의실험에서는카스파제-3/7 활성이측정되었고, 다른실험에서는, 세포생존능이측정되었다. 세포당카스파제-3/7 활성기준은카스파제-3 효소의특이적인활성및생존세포의수둘다를반영하며, 당해데이타는카스파제-3/7 활성을세포생존능으로나누어나타낸다. 면역블롯팅및면역침전세포용해물을 CHAPS 용해완충액 (10 mm HEPES, ph 7.4, 150 mm NaCl, 1% CHAPS) 또는 1% 트리톤 X-100, 0.1% SDS, 및 0.5% 데옥시콜레이트 ( 제조원 : 인비트로겐 ) 을함유하는세포추출완충액을사용하여제조하였다. 모든완충액에프로테아제및포스파타제억제제칵테일 ( 제조원 : 시그마 ) 을사용전에보충하였다. 면역블롯팅을위해, 용해물을 3x 로딩완충액 ( 제조원 : 셀시그날링테크놀로지 ) 과혼합하고동일한양의단백질을비스 / 트리스겔 ( 제조원 : 인비트로겐 ) 상에서전기영동으로분리하였다. 면역침전을위해, 용해물을 CHAPS 용해완충액속에서제조하고 >4 mg의세포용해물을적어도 8μg의면역침전항체와밤새 4 에서혼합하였다. 다음날, 30μl 의단백질 A- 또는단백질 G-아가로즈슬러리를추가로 2시간동안가하였다. 면역침전물을 CHAPS 용해완충액속에서 3회세척하고, 95 에서 5분동안 1.5 x 로딩완충액속에서가열하였다. 시토졸의정제대략 20x10 6 개세포를빙냉시킨 PBS로세정하고, 트립신처리하고, 2분동안 1,300 rpm에서 25 에서원심분리하였다. 세포펠렛을 PBS로 1회세정하고미세원심분리튜브에이전시켰다. 펠렛이 200μl의균질화완충액 (10 mm HEPES, ph 7.4, 250 mm D-만니톨, 1 mm EGTA, 10 mm KCl, 및 5 mm MgCl 2 와포스파타제및프로테아제억제 제 ) 중에서 30분동안팽윤되도록한후 B-형막자를사용하여 50 스트록크로다운스 (dounce) 균질화시켰다. 세포균질물을 1,000xg에서 5분동안 4 에서두번원심분리하여핵및세포부스러기를펠렛화하였다. 상층액을 10,000xg에서 10분동안 4 에서원심분리하였다. 당해회전으로부터의펠렛을 " 미토콘드리아 " 로지정하고 80μl의 CHAPS 용해완충액속에서추가로추출하였다. 미토콘드리아의추출은빙상에서시료를 ~20분동안

72 각 1분에걸쳐반복적으로와동시켜수행하였다. 최종추출물을 14,000xg에서 10분동안 4 에서원심분리하여투명하게하여어떠한오염시키는세포부스러기도제거하였다. 시토졸및저밀도막을함유하는 10,000xg 상층액을다시 100,000xg(TLA 회전기속에서 55,000 rpm) 에서 1시간동안원심분리하여막을펠렛화하였다. 상층액을 " 시토졸 " 로지정하고시료완충액속에서즉시비등시켰다. [0684] [0685] [0686] [0687] 약물-약물상호작용의측정 VX-680 및화학치료제의상승적활성을블리쓰어딕티비즘모델 (Bliss additivism model)[ 참조 : Berenbaum, M. C., "Criteria for analyzing interactions between biologically active agents," Adv Cancer Res 35, (1981)] 을사용하여측정하였으며, 여기서개개의효과 A 및 B를갖는제제둘다의조합물된반응 C는다음과같다 : C = A + B - (A B)( 여기서 A 및 B는 0과 1 사이의분획억제를나타낸다 ). 15를초과하는조합물된반응점수는상승적인것으로고려하였다. 마이크로어레이에의한유전자발현분석동결된세포펠렛을용해시키고총 RNA를 QIAshredder 및 RNeasy 컬럼 ( 제조원 : 퀴아젠 ) 을사용하여분리하였다. 표지된 crna는마이크로어레이제조업자의프로토콜에따라제조하고사람게놈 U133A 2.0 어레이 [ 제조원 : 아피메트릭스 (Affyme trix)] 로하이브리드화하였다. 마이크로어레이데이타파일을분석용로제타리졸버소프트웨어 (Rosetta Resolver software) 에로딩하고, 모든프로브세트에대한강도값을리졸버실험정의 (Resolver's Experimental Definition) 를사용하여정규화하였다. 리졸버내집단분석을 1회처리조건에서 1.5-배변화또는그이상을갖는유전자를사용하여, 유사성척도에대한응집성알고리즘 (Agglomerative algorithm) 및피어슨상관관계 (Pearson correlation) 를사용하였다 미만의 p-값을갖는차이만이나타난다. 경로분석을위해, 1.5-배컷-오프 (cut-off) 를적용시키고 5% 거짓발견율 (false discovery rate) 을 p-값컷-오프에사용하였다 [ 참조 : Benjamini, Y. & Hochberg, Y., "Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing," J R Statist Soc B 57, (1995)]. [0688] [0689] 면역침전된단백질의질량분광법적분석 내인성 Bcl-X L 및 Mcl-1 을 HCT116 세포로부터면역침전시켰다. 질량분광법을위해프로세싱될시료를 10- 웰 x 1 mm 4 내지 12% 비스 / 트리스겔 ( 제조원 : 인비트로겐 ) 의매다른웰에로딩하여측면오염을감소시켰다. 겔을 45 내지 60분동안 MOPS 이동완충액속에서고정 200V에서이동시킨후, 50% 메탄올, 7% 아세트산용액에서속에서 15분동안고정시켰다. 물속에서세정한후, 겔을시프로루비단백질겔착색제 (Sypro Ruby protein gel stain)( 제조원 : 인비트로겐 ) 으로 3시간동안실온에서처리하였다. 완료된후, 겔을 10% 메탄올, 7% 아세트산의용액으로 10분동안탈염시킨후물속에서 30분동안세척하고항온처리하였다. 단백질밴드를녹색채널을사용하여후지영상화기 (Fuji imager) 에서후속적으로영상화하였다. [0690] [0691] 겔위의각각의레인을 24개의동일한크기의조각으로수동절단하여, 96-웰플레이트내에두고갈았다. 갈린겔조각을겔속트립신분해에 37 에서 5시간동안퍼킨-엘머매쓰프렙장치 (Perkin-Elmer MassPrep unit) 를사용하고등급변형된트립신 (6 ng/μl) 을서열분석하여적용시켰다. 각각의시료에대해추출된펩타이드를 5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산의용액 10μL의용액속에재현탁하기전에동결건조시켰다. 9.5μL의재현탁된시료를미크롬 (Michrom) C18AQ 매직 (magic) 역상수지가충전된 15 cm의분석모세관컬럼 (I.D. 75μm, 5μm 입자크기, 200A 공극크기 ) 위에주입하였다. 펩타이드를에익시전트나노 (Eiksigent nano)-lc 단위를사용하여 35분선형구배 (0.1% 포름산중 15 내지 35% 아세토니트릴 ) 속에서용출시켰다. 아세토니트릴조성을 35% 에서 80% 로다음 5분에걸쳐증가시킴으로서소수성펩타이드를후속적으로제거하였다. 용출액을선형트랩 4 중극 (linear trap quadrupole: LTQ) 질량분광계 [ 제조원 : 터모피셔 (ThermoFisher), 매사추세츠주월섬소재 ] 의오리피스 (orifice) 내로향하도록하였다. 스캔을크로마토그래피분리동안데이타-의존성이중-플레이유형으로수집하였다. 각각의 LC-MS/MS 데이타파일을마스콧대몬 (Mascot Daemon) v.2.2를포유동물분류에한정된 NCBI 풍부하지않 은데이타베이스에대해조사하였다. 2 + 내지 3 + 전하상태의펩타이드를최대 2개의손실된트립신분해, 고정된변형으로서카복시아미도메틸, 가변변형으로서산화된메티오닌및완전한펩타이드용의 +1.2 Da 및탠덤질량분광법으로부터생성된이온용의 +0.8 Da의질량윈도우를사용하여조사하였다. 각각의데이타파일에대한마스코트 (Mascot) 조사결과를 MudPIT 편집특징을사용하여스캐폴드 (Scaffold) v.1.0 속에서겔레인에

73 의해편집하여처리에의한단백질확인을수득하였다. [0692] Bcl-2 네트웍의상호작용체맵을인게뉴이티경로분석소프트웨어 (Ingenuity Pathway Analysis software)[ 제 조원 : 인게뉴이티시스템스 (Ingenuity Systems), 캘리포니아주레드우드시티소재 ] 를사용하여수동으로작제 하였다. 모든처리조건하에서 Bcl-X L 면역침전물로부터반납된모든단백질확인의복합체를 Bcl-2 네트웍맵 에적용하였다. Mcl-1 면역침전물을유사하게분석하였다. [0693] [0694] [0695] [0696] 결과상승적세포독성을유발하는 VX-680/MK-0547 및 ABT-263 아우로라계열의세린 / 트레오닌키나제를특이적으로표적화하는소-분자억제제를단독치료요법으로서임상평가하에두며다른화학치료제와결합되는것이명백할것이다. 아우로라키나제억제제와치료학적으로결합될수있는제제를실험적으로확인하기위하여, 판-아우로라억제제억제제, VX-680을 19개의임상및실험적암치료요법과함께세포생존능에있어서의이들의효과에대해스크리닝하였다. Bcl-X L, Bcl-2, 및 Bcl-w를 억제하는, 경구로생체이용가능한소-분자 BH3 모사체인 ABT-263( 도 8a) 과 VX-680이결합되는경우유일한상승활성이관측되었다 ( 도 8a). 블리스분석 (Bliss analysis) 은, VX-680이조직학적유형 [ 예를들면, D54MG( 신경아교종 ), NCI-H460 및 A549( 폐암종 ), PC3( 전립선암종 ), EJ1( 방광암종 ), HCT116, DLD1, 및 SW620( 결장암종 ), 및 786-O( 신장암종 ); 도 8a 내지 8b 및데이타는나타내지않음 ] 과관계없이종양세포주에서 ABT-263과상승적이었음을나타내며, 이는종양약물의이들 2개부류에대해관측된상승효과가암세포에서전반적인분자민감성을반영할수있음을나타낸다. 19개의임상적및실험적암치료제각각의작용의표적 / 메카니즘및병용물스크린에대한상응하는투여량반응은하기표 a에요약되어있다. [0697] [ 표 a] [0698] [0699] VX-680 및 ABT-263 의상승활성은아우로라 B 및 Bcl-X L 의조합의억제에충분히속하는것으로고려될수

74 있다. [0700] VX-680 는, K i(app) 값이각각 0.6, 18, 및 4.6 nm 인아우로라 A, B, 및 C 키나제의강력한억제제이다. 아우로라 A의억제는주로세포분열지연또는정지를일으키는반면 [ 참조 : Manfredi, M. G. et al., "Antitumor activity of MLN8054, an orally active small-molecule inhibitor of Aurora A kinase," Proc Natl Acad Sci USA 104, (2007)]; 아우로라 B의억제는대량의다배수체화를생산한다 [ 참조 : Wilkinson, R. W. et al., "AZD1152, a selective inhibitor of Aurora B kinase, inhibits human tumor xenograft growth by inducing apoptosis," Clin Cancer Res. 13, (2007)]. 따라서, VX-680의판-아우로라프로파일로부터 ABT-263과상승작용에충분할수있는아우로라키나제활성을추출하는것이중요하다. 유사하게, ABT-263은 Bcl-X L, Bcl-2, 및 Bcl-w를각각 0.5, 1 및 1nM의 K i 값을나타내는유사한효능으로억제하며, 유사한컴플리케이션 (complication) 을나타낸다. 따라서, 이러한활성들은디콘볼루트 (deconvolute) 하여 sirna 및선택적인소-분자둘다를사용한상승작용에충분한활성을확인하였다. ABT-263, 아우로라 B와함께, 그러나아우로라 A를제외하고첨가하는경우, sirna 둘다가이들의각각의표적을충분히녹다운하였다고해도, sirna 는 ABT-263과함께상승적으로항증식시켰다 ( 도 9a 및 9b). 아우로라 A의소-분자억제제인 MLN8054는아우로라 A-선택적인농도 (<5μM) 에서 ABT-263과함께상승작용을나타내지않았다 ( 도 9c)[ 참조 : Manfredi, M. G. et al., "Antitumor activity of MLN8054, an orally active small molecule inhibitor of Aurora A kinase," Proc Natl Acad Sci USA 104, (2007) and Li, J. et al., "Inhibition of Aurora B kinase sensitizes a subset of human glioma cells to TRAIL concomitant with induction of TRAIL-R2," Cell Death Differ, Epub ahead of print (2008)]. 대조적으로, 상승작용은, ABT-263을아우로라 B-선택적인억제제, AZD1152와병용하는경우관측되었다 [ 참조 : Wilkinson, R. W. et al., "AZD1152, a selective inhibitor of Aurora B kinase, inhibits human tumor xenograft growth by inducing apoptosis," Clin Cancer Res. 13, (2007) and Mortlock, A. A. et al., "Discovery, synthesis, and in vivo activity of a new class of pyrazoloquinazolines as selective inhibitors of aurora B kinase," J Med Chem 50, (2007)]( 도 9d). [0701] ABT-263 이 Bcl-2, Bcl-X L, 및 Bcl-w 를억제하지만, 이는 Mcl-1 및 Bcl-A1 과같은 Bcl-2 계열의다른항 - 세포자 멸사구성원에대해비교적불활성이다. Bcl-2 및 Bcl-X L 은일반적으로많은사람암세포내에서발현되므로, sirna는, 2개의 ABT-263 표적중이들이억제되는경우, 어느것이 AZD1152와병용된 ABT-263에대해관측된상승효과활성을표현형모사할수있는지를측정하는데사용되었다. 상이한종양기원의암세포 (HCT116, DLD1, EJ1, PC3, D54MG) 내로형질감염되는경우, Bcl-X L, 그러나루시퍼라제를제외한, Bcl-2, 또는 Mcl-1 sirna는 AZD1152와함께세포성장의상승적억제를나타내었다 ( 도 9e 내지도 9g 및데이타는나타내지않음 ). 따라서, 그러나 Bcl-2를제외한, Bcl-X L 의억제는아우로라 B 억제와공동작용하여이들세포주에서세포사멸을유도한다. Bcl-X L 및아우로라 B sirna는또한상승적으로항증식성이었다 ( 도 9h). 종합적으로, 이들데이타는, VX-680 및 ABT-263의상승적활성이아우로라 B 및 Bcl-X L 의억제에충분히속하는것으로고려될수있음을나타낸다. [0702] [0703] ABT-263 은다배수체세포내에서신속한세포자멸사를개시한다. 다배수는아우로라 B 의지속된억제와관련된궁극적인세포운명을나타내므로, 본발명자들은, Bcl-X L 억제 및다배수체화가아우로라 B와독립적으로상승적으로세포독성인지를측정하기위해셋팅하였다. CPC는아우로라 B, 서바이빈, INCENP, 및보레알린 (borealin) 을포함하는상위그룹이며, 세포분열방추사조립체크포인트의중심이다 [ 참조 : Ruchaud, S., Carmena, M. & Earnshaw, W. C., "Chromosomal passengers: conducting cell division," Nat Rev Mol Cell Biol 8, (2007)]. CPC의파괴는세포질분열실패및다배수를생성한다 [ 참조 : Honda, R., Korner, R. & Nigg, E. A., "Exploring the functional interactions between Aurora B, INCENP, and survivin in mitosis," Mol Biol Cell 14, (2003)]. 다배수에대해보호하기위한 INCENP의역할에따라서 [ 참조 : Uren, A. G. et al., "Survivin and the inner centromere protein INCENP show similar cell-cycle localization and gene knockout phenotype," Curr Biol 10, (2000)], INCENP sirna는다수의미소핵을지닌극도로확장된세포와같은다배수의형태학적특징을유도하였다 ( 데이타는나타내지않음 ). INCENP의녹다운은 Bcl-X L 녹다운과함께상승적으로항증식성이었으며 ( 도 10a 내지 10b),

75 이는, Bcl-X L 의억제가다배수체세포에유해함을제안한다. 그러나, INCENP를 sirna로표적화하는것은또한아우로라 B를다른위치로옮기도록하여이의활성을억제한다 [ 참조 : Klein, U. R., Nigg, E. A. & Gruneberg, U., "Centromere targeting of the chromosomal passenger complex requires a ternary subcomplex of Borealin, Survivin, and the N-terminal domain of INCENP," Mol Biol Cell 17, (2006)]. 따라서, INCENP sirna의효과는아우로라 B의파괴와는완전히분리될수없다. 다배수그자체가 Bcl-X L 억제에대해세포를민감화하기에충분한지를결론적으로측정하기위하여, 세포를 AZD1152로처리하여다배수를유도하고, 약물을세척하고, 다배수체세포를아우로라 B 활성이회복될때까지배양하였다. 다배수는야생형 p53을지닌세포내에서다배수체화용대용품인, p53의상승된발현에의해 ( 도 10c)[ 참조 : Gizatullin, F. et al., "The Aurora Kinase inhibitor VX-680 induces endoreduplication and apoptosis preferentially in cells with compromised p53-dependent postmitotic checkpoint function," Cancer Res. 66, (2006), Li, J. et al., "Inhibition of Aurora B kinase sensitizes a subset of human glioma cells to TRAIL concomitant with induction of TRAIL-R2," Cell Death Differ, Epub ahead of print (2008) and Kojima, K., Konopleva, M., Tsao, T., Nakakuma, H. & Andreeff, M., "Concomitant inhibition of Mdm2- p53 interaction and Aurora Kinases activates the p53-dependent postmitotic checkpoints and synergistically induces p53-mediated mitochondrial apoptosis along with reduced endoreduplication in acute myelogenous leukemia," Blood 112, (2008)], 및세포크기및다핵화에있어서총형태학적증가에의해 ( 도 10d) 입증되었다. AZD1152를세척제거한후, 히스톤 H3 포스포릴화가처리되지않은수준으로회복되는것은, 다배수체세포 ( 도 10d) 내에서아우로라 B 활성이완전히회복되었음을나타낸다 ( 도 10c). ABT-263은다배수체세포내에서, 그러나이배체세포를제외하고, 아우로라 B의활성화상태와는독립적으로, 배수체세포에서카스파제-3 활성및생존능의손실을유도하였다 ( 도 10e 내지 10f). 이들데이타는, 다배수의급성유도가, 세포생존이 Bcl-X L 의항-세포자멸사활성에의존하도록함을제안한다. [0704] [0705] 다배수체화는 Bcl-X L 에대한생존부담을이동시킨다. 다중도메인세포자멸사단백질 BAX 및 BAK는함께세포자멸사에대한의무적인포탈 (portal) 을구성한다 [ 참조 : Wei, M. C. et al., "Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death," Science 292, (2001) and Zong, W.X., Lindsten, T., Ross, A. J., MacGregor, G. R. & Thompson, C. B., "BH3-only protein that bind pro-survival Bcl-2 family members fail to induce apoptosis in the absence of BAX and BAK," Genes Dev 15, (2001)]. Bcl-X L 중화가다배수체세포내 에서세포사멸을유발하는메카니즘을조명하기위하여, 활성 BAX 및 BAK 이형태체를선택적으로인식하는항체를사용하여 AZD1152와다배수를만든세포내에서 BAX 및 BAK의활성화를시험하였다. 다배수 HCT116, D54MG, SW620, 및 EJ1 세포내로의 ABT-263의첨가는 BAX 및 BAK 활성화를신속하고상승적으로유도하였다 ( 도 11a 및도 14). BAX 및 BAK의활성화는, 세포자멸사로의전념에있어결정적인현상인, 시토크롬 C의시토졸내로의미토콘드리아방출을수반하였다 ( 도 11b). [0706] BAX 및 BAK 의프로 - 세포자멸사기능은일반적으로 Bcl-X L 및 Mcl-1 과같은 bcl-2 계열의항 - 세포자멸사구성원 에의해일반적으로억제되며, 이는고유의경로를통해세포자멸사에대한한계를설정한단지 BH3과다중도메인단백질사이의상호작용의균형이다.[ 참조 : Kim, H. et al., "Hierarchical regulation of mitochondriondependent apoptosis by BCL-2 subfamilies," Nat Cell Biol 8, (2006) 및 Willis, S, N. et al., "Apoptosis initiated when BH3 ligands engage multiple Bcl-2 homologs, not BAX or BAK," Science 315, (2007)]. 다배수체세포에서관측된것과는대조적으로, Bcl-X L 의중화는일반적으로이배체또는홀다배수체세포내에서세포자멸사를개시하는데충분하지않다 ( 도 8c). 다배수체화가세포자멸사기구의성분들과관계하여다배수체세포생존을 Bcl-X L -의존성이되도록하는방법을설명하기위해, Bcl-2 네트웍를다배수체화에대한반응시 mrna 및단백질수준에서모니터링하였다. Bcl-2 네트웍유전자의계층적무리화는, 이들이세포주에따라상이하다고해도 ( 도 15), 다배수체화의전사프로파일 (VX-680 및 AZD1152) 이아우로라 A 억제 (MLN8054) 와비교하여지속적으로가장유사하였음을나타내었다. 단백질수준에서, 다수의프로-세포자멸사 BH3-단독단백질은다배수체화후상향조절되었다 ( 도 11c). PUMA 및 NOXA에서의증가는세포주에따라보존된효과이었던반면 ; tbid, BIK, BIM, 및 BAX는세포주-의존적방식으로증가하였다. 발현에서미묘한변화만이 Bcl-2 및 Bcl-X L 에대해관측되었다하더라고, Mcl-1은 HCT116, SW620, 및 EJ1 세포에서유의적으로감소되었다

76 ( 도 11c 및데이타는나타내지않음 ). NOXA는 Mcl-1에결합하여이의항-세포자멸사기능을억제한다 [ 참조 : Chen, L. et al., "Differential targeting of prosurvival Bcl-2 protein by their BH3-only ligands allows complementary apoptotic function," Mol Cell 17, (2005)]. 따라서, D54MG 세포내에서 Mcl-1의풍부성이감소되지않았다고해도 ( 도 11c), D54MG에서 NOXA의상향조절은 Mcl-1을길항하는것으로예측된다. 종합적으로, 다배수체화는 Mcl-1 기능을절충하면서, 세포자멸사의효과를유도하였다. 세포생존능이다배수체화의당해기간동안유지되므로, 생존능을지지하는부담은 Mcl-1으로부터 Bcl-X L 로이동되는것으로추론되었다. [0707] 유전자발현이, Bcl-2 네트웍이조절되는하나의수준을나타낸다고해도, 프로 - 및항 - 세포자멸사단백질사이 의결합현상의수집은궁극적으로생존과세포자멸사사이의균형을결정한다. Bcl-X L 및 Mcl-1 상호작용체는 실증적으로정의되었으며이들상호작용에있어서다배수체화의효과가모니터링되었다. HCT116 세포는 DMSO, ABT-263, AZD1152, 또는 AZD1152 및 ABT-263으로처리되었다. 내인성 Bcl-X L 또는 Mcl-1은이후면역침전되었고, 면역복합체가겔내트립신분해및 LC-MS/MS에의해분석되었다. 단백질확인은모든처리로부터편집되어모든 Bcl-X L 및 Mcl-1 상호작용이검출됨을나타내는복잡한상호작용체를생성하였다 ( 도 16). 상호작용은후속적으로공-면역침전및면역블롯팅에의해각각의처리조건하에서확인되었다 ( 도 11d 내지 11e). 공면역침전된단백질중어느것도 IgG 동형-조화된항체를사용한항-S6K1 면역침전물에서검출되지않았으며 ( 도 1e 내지 1f), 이들상호작용의특이성을강조한다. 다배수체세포 (AZD1152) 에서, Bik 및 tbid와 Bcl-X L 의상호작용은증가한반면, BAD, BIM, BAX, 및 PUMA의결합은변하지않았으며 ( 도 11e), 이는, Bcl-X L 가다배수체화시프로-세포자멸사단백질에의해증가되게부담이되었음을나타낸다. Mcl-1 단백질수준의감소와일치하여, 감소된양의 Mcl-1이다배수체세포내에서면역침전에의해포획되었다 ( 도 11e). 또한, 다배수체화동안 NOXA 결합에있어화학량론적증가가존재하였다 ( 도 11e). 또한, Mcl-1과 Bim 및 Puma의연합은다배수체세포내에서현저히약화되었으며 ( 도 11e), 이는, Mcl-1의감소및 NOXA의동시증가가 Mcl-1을부분적으로중화시키기에충분하였음을제안한다. [0708] [0709] Bcl-X L / 아우로라 B 억제제상승작용에요구되는 Bcl-2 네트웍성분들의확인 비록다수의 Bcl-2 계열단백질이발현및 / 또는단백질 - 단백질상호작용의수준에있어서다배수체화에의해조 절되었다고하더라도, 이것들이, 만약에있다면, Bcl-X L 억제에대한다배수체세포의감작화에필수적인지는명 확하지않았다. sirna 스크린을, Bcl-X L 과 Mcl-1 상호작용체를강조하기위해수행하여, 녹다운 (knockdown) 시, Bcl-2 네트웍의성분이아우로라 B 및 Bcl-X L 의이중억제의존재하에서생존능을구제할수있는지를확인하였다. NOXA, BAX를표적화하는다수의 sirna, 및보다적은정도로 BAK를표적화하는다수의 sirna가 ABT- 263-매개된세포사멸로부터다배수체세포를구제하는것으로밝혀졌다 ( 도 12a 및도 17). 실제로, 몇몇세포주에서 NOXA 및 BAX의 sirna-매개된고갈은, 다배수체세포가 Bcl-X L 억제에대해내성이되도록하였다 ( 도 12b 및도 17). 이들데이타는다배수체세포에서 BC1-X L 억제의상승적활성에있어서 NOXA 및 BAX에대한인과관계적역할을나타낸다. [0710] Noxa 억제가다배수체세포를 ABT-263- 매개된세포자멸사로부터보호하는방법을추가로이해하기위하여, Bcl- X L 및 Mcl-1 상호작용체를대조군또는 NOXA sirna 로형질감염된세포내에서다배수체화전과후에비교하였다. 앞서와같이, Mcl-1 단백질의감소및 Mcl-1에대한 NOXA 결합에있어서의화학량론적증가가 AZD1152를사용하는다배수로제조된세포내에서관측되었다 ( 도 12d). NOXA의고갈은다배수체세포내에서 Mcl-1에대한 Puma 및 Bim의결합을회복시켰으며, 이는프로-세포자멸사효과인자에결합하는 Mcl-1의능력이회복되었음을나타낸다. 비록이것이 Bcl-X L 의존성을유발하는데충분하다고하더라도, 다배수체화동안 Mcl-1의억제는, AZD1152/ABT-263에의해유도된세포자멸사가 Mcl-1 녹다운에의해증강되므로, 불완전한것으로여겨진다 ( 도 19). [0711] 이중아우로라 B/Bcl-X L 억제로부터명백한메카니즘을포함하는다배수체화 - 매개된세포자멸사

77 [0712] 암세포는다배수체화동안생존가능한세포질량을축적하며 AZD1152 의첨가후 1 주까지계속이를지속한다. 그러나, 다배수의개시후 10 일째에, 생존능은, 세포가다배수체화공정에굴복하면서급격하게감소한다 ( 도 18). 연장된다배수체화에대해 2 차적인세포자멸사가비록지연되더라도, 아우로라 B/Bcl-X L 의이중억제와 같은, 동일한세포자멸사프로그램에관여하는지를측정하기위해, 추가의 sirna 구제스크린을수행하여, 기능적으로파괴되는경우다배수체세포의장기간생존능을보존할수있는 Bcl-2 네트웍의성분을확인하였다 ( 도 12e). AZD1152/ABT-263 병용물에의해유도된급성세포자멸사에대한 BAX 및 NOXA의우세한요건과는대조적으로, BAX 및 BAK에대한 sirna는유사한보호정도를부여하며, 조기구제스크린에서효과적이지않았던, BIK 및 BID에대한 sirna는생존능의다배수체화-매개된손실로부터세포를보호하였다 ( 도 12f). 또한, NOXA의고갈은당해셋팅에서어떠한보호효과도제공하는데실패하였다 ( 도 12f). [0713] [0714] ABT-263 은생체내에서아우로라키나제억제제의효능을향상시킨다. 아우로라키나제억제제가전임상연구에서효과적인것으로밝혀졌다고해도, 다배수종양세포에서 Bcl-X L 의 표적화는단독치료요법과같이아우로라키나제억제제보다우세한효능을생성할수있다. 이는단일제제 AZD1152 치료의항종양효능을스트링전트및치료학적으로관련된셋팅 : 잘-확립된거대종양 (~0.5그람) 및 AZD1152의최대내성투여량을사용할때 AZD1152/ABT-263의병용물에대해비교함으로써평가하였다. 단일제제로서 AZD1152는, 비록종양이 1주내에치료요법으로회복되기시작했다고하더라도 ( 종양재성장에의해입증됨 ), HCT116 결장암종모델에서유의적인종양성장억제를생성하였다. 대조적으로, AZD1152/ABT-263의병용물요법은적어도 2주동안지속된신속하고보다지속된종양회귀를생성하였다 ( 도 13a). AZD1152를사용한 3일동안예비치료된종양에서, 다배수체화의대용마커인, p53의유도가관측되었다 ( 도 6b). 활성 BAX 이형태체는 AZD1152-처리된마우스로부터의종양에서 ABT-263 치료의 4시간내에검출되었지만, 나이브종양 (naive tumor) 에서는그렇지않았고, 이는, 다배수종양세포에서 ABT-263-매개된세포자멸사의신속한시작을반영한다 ( 도 13b). [0715] [0716] 당해분야의숙련가들은, 본원명세서의교시내용이언급된목적을수행하고, 언급된결론및장점, 및또한본원에서고유한것들을수득하기위해우수하게조정됨을용이하게인식할수있다. 본원에기술된분자복합체및방법, 과정, 치료, 분자, 특이적인화합물은바람직한국면을현재대표하며, 예시적이고, 본원명세서의교시내용의영역을한정하는것으로의도되지않는다. 당해분야의숙련가에게는, 다양한치환및변형이본원명세서의교시내용의영역및취지에벗어남이없이본원명세서의교시내용에대해이루어질수있음이용이하게명백할것이다. 명세서에서언급된모든특허및공보들은본원명세서의교시내용에관한당해분야의숙련가의수준의지표이다. 모든특허및공보는, 각각의개개공보가참조문헌으로인용된것으로구체적이고개별적으로나타낸경우와동일한정도로참조로인용된다. 본원에설명적으로기술된본원명세서의교시내용은본원에구체적으로기재되지않은어떠한성분또는성분들, 제한또는제한들의부재하에실시될수있다. 따라서, 예를들면, 본원의각각의경우에서용어 " 포함하는 ", " 로필수적으로이루어진 " 및 " 로이루어진 " 중어느것도다른 2개의용어중어느것과교체될수있다. 사용된용어들및표현들은설명의측면에서및제한없이사용되며, 이러한용어들및표현들의사용에있어서, 나타내거나기술된특징의어떠한등량체또는이의일부를제외할의도는없지만, 각종변형이특허청구된교시내용의범위내에서가능할수있음이인식된다. 따라서, 비록본원명세서의교시내용이바람직한국면및임의의특징들에의해구체적으로기재되어있다고해도, 기재된본원의개념의변형및변화는당해분야의숙련가에의해재분류될수있으며, 이러한변형및변화는첨부된특허청구범위에의해정의되는본원명세서의교시내용의영역내에있는것으로고려된다

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