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1 차 례 1. 시료 채취 및 1차 고정(김기우) 1 2. 시료 채취 및 2차 고정(김기우) 7 3. 탈수 및 치환(정미숙) 전자현미경의 원리 및 이용(윤철종) 임계점 건조(최승규) 이온 코팅(Ion Coating)(조은부) SEM 실습Ⅰ(윤태영) 디지털 현미경(고희진) SEM 실습Ⅱ(윤태영) SEM 자료 해석(윤철종) 57 전자현미경 직무연수 안내 65

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3 시료 채취 및 1차 고정 서울대학교 농생명과학공동기기원 선임연구원 김기우 1. 목표 본 과정에서는 주사전자현미경(SEM)으로 생물 시료를 관찰하기 위한 시료 채취 및 1차 고정에 관한 원리와 기술에 관하여 이해한다. 2. 표면 세척 및 청결화 ( surface cleaning) 가. SE M 으 로 시료의 표면을 관찰 하고자 할 경 우, 실험 목적에 따라 서 시료 표면을 청결히 할 필요가 있다. 즉 시료 표면에 원하지 않는 불순물(먼지, 음 식 소화물 등)이 침적되어 본래 표면을 가리는 경우에는 1차 고정 이전에 먼 저 불순물을 제거하여 본래 시료 표면을 노출시킨다. 하지만 특정 표면에 부 착된 구조물을 관찰하고자 할 경우에는 시료 표면을 세척하지 않고 그대로 보 존한다. 나. 이를 위하여 완충액을 시료 표면에 흘러 보내며 세척한다. 또는 동물 시료 의 장기 내부 표면을 관찰할 경우, 소화 중인 음식물을 관류(perfusion) 방식 으로 제거한다. 다. 필요에 따라서는 특정 효소, 세제, 계면활성제 등을 사용한다. 라. 건조된 시료의 경우에는 블로우어(blower)나 속눈썹, camel's hair brush 등으로 표면에 존재하는 불순물을 제거한다. 마. 이 모든 과정은 시료를 채취하 기 전 에 실 시한다

4 3. 시료 채취 가. 준비물 시료, sealing film, wax plate, 면도칼, 수술용 메스, 미용가위, 1차 고정액, 마 취액, 이쑤시개, 스포이트, 핀셋, 네임펜, 에펜돌프 튜브, 블로우어 등 나. 방법 1) 시료를 sealing film이나 wax plate에 놓고 관찰할 구조 및 부위가 포함되 도록 적당한 크기로(길이, 높이, 너비가 약 mm 정도) 절취한다. 2) 시료의 상하부를 구분해야 할 경우에는 직사각형으로 채취하되 한 모서리 를 절단하여 시료 처리 후에도 상하를 구분할 수 있도록 한다. 4. 1차 고정 가. 완충액 (buffer solution) 1) C acod ylat e b uffer 가) Stock 용액 A 용액 : 0.2M sodium cacodylate (sodium dimethyl arsonate) g N a( C H 3 ) 2 AsO 2 in 1000 ml dh 2 O B 용액 : 0.2M HCl 16.7 ml HCl in 1000 ml dh 2 O 나) 완충액 제조 50 ml의 A용액에 X ml의 B용액을 섞어 총 100 ml로 희석하면 0.1M 200 ml로 희석하면 0.05M X ph X ph

5 2) Phosphate buffer 가) Stock 용액 A 용 액 : 0.2M m onob asic so dium p ho sp h at e B 용 액 : 0.2M d ib asic so dium p ho sp h at e 나) 완충액 제조 Xml의 A용액에 Yml의 B용액을 섞어 200ml가 되도록 희석하면 0.1M X Y ph

6 나. 고정액 (fixative) * K arno v sk y 고정액 제조 법 1) 0.2M phosphate 또는 cacodylate 완충액을 ph 로 준비한다. 2) 2.0g의 paraformaldehyde를 18ml 2차 증류수에 넣고 60 로 가열하여 용해 한 후 1.0N NaOH를 한 방울씩 떨어뜨려 용액이 투명해지도록 한다. 총량을 20ml로 맞추어 10% paraformaldehyde 용액을 만든다. 사용하기 전에 용액을 충분히 식힌다.(후드 사용) 3) 다음과 같이 고정액을 만든다. 0.1M 완충 액 20 ml 10% paraformaldehyde 용액 8ml 8% glutaraldehyde 용액 10ml 2차 증류수 2ml 0.05M 완충액에 2% paraformaldehyde와 2% glutaraldehyde가 포함. 4) 필요에 따라 sucrose, glucose 또는 NaCl을 첨가하여 삼투압을 조절한다. 변형된 Karnovsky 고정액 4% paraformaldehyde 100ml 8% glutaraldehyde 100ml 0.2M caco dylate buffer 132ml dh 2 O 64ml 0.73M KCl 4ml CaCl 2 8mg Sucrose 4g 0.067M cacodylate 완충액에 1% paraformaldehyde와 2% glutaraldehyde가 포함됨

7 다. 고정(fixation)의 필요성 및 효과 생물 시료를 SEM으로 관찰하기 위해서 진공 조건에서도 시료의 형태나 구 조에 변형이 없거나 최소화되어야 한다. 특히 생물 시료는 수분 함량이 높으 므로 탈수, 건조 등의 과정을 거쳐야 하는 데, 이를 위해서도 시료는 원형에 가까운 형태로 보존되어야 한다. 1) 살상 효과 - 생물 시료의 활성을 급속히 중지시킴 2) 보존 효과 - 시료의 크기, 모양, 입체 구조 등이 보존 3) 정지 효과 - 시료의 움직임, 화학적 진행 상황이 정지되어야 함 라. 종류 및 방법 1) 침지 고정 (immersion fixation) 화학적 고정법의 대표적인 방법으로서, 절취한 시료를 즉시 1차 고정액에 침 지하여 고정하는 방법이다. 시료나 실험 목적에 따라서 차이가 있지만 주로 4 에서 2시간 이상 처리한다. 필요할 경우에는 진공펌프 등을 이용하여 저진 공 처리를 하므로 고정액의 침투를 용이하게 한다. 고정액의 부피는 시료 크 기의 약 10-20배 정도가 되도록 조절한다. 장기간 고정할 경우에는 고정액을 교체하여 고정 효과를 유지한다. 이로써 세포의 자가 용해, 부패 및 조직/세포 학적 변화를 최소화한다. 고정액 성분 중의 일종인 글루타르알데하이드(glutaraldehyde, C 5 H 8 O 2 )는 액 상으로 분자량이 로서 주로 생체 내 단백질과 교차결합(cross linking)을 하여 고정한다. 하지만 시료 내 침투력이 시간당 1mm 이하로서 비교적 느린 것으로 알려져 있다. 이에 반하여 다른 고정 성분인 파라포름알데하이드 ( p arafo rmald eh yd e, CH 2 O)는 분말 형태로서 고정 능력은 상대적으로 저조하 지만 시료 내 침투력이 빠르다. 2) 기타 화학적 고정법 - 관류 고정 (perfusion fixation) - 동물 시료의 혈액 흐름을 이용 - 증기 고정 (vapor fixation) - 액체와 접촉시키지 않고 증기로 고정함 3) 물리적 고정 시료의 변형을 최소화하기 위하여 급속으로 동결하는 방식을 주로 이용한다. 이 때 동결 속도가 느릴 경우, 세포내 빙핵(ice crystal)이 형성되어 세포막 구 - 5 -

8 조를 손상시키므로 주의를 요한다. 액체질소를 이용하여 시료를 고정하는 방 법, 고압동결법 등 다양한 기법이 알려져 있다. 마. 세척(washing) 1차 고정 후 여분의 고정액을 제거하고 2차 고정액의 침투 및 효과를 증대시 키기 위하여 완충액으로 세척한다. 이 때 고정액에 사용한 동일한 완충액을 사용하여 10분씩 3회 실시한다. 시료의 물리적인 가해를 최소화하기 위하여 피펫이나 스포이드를 사용할 때 시료와 접촉하지 않도록 주의한다. 세척시 고 정액이나 완충액을 교체할 때 용기 내에 약간의 잔량을 남겨 두어 시료가 잠 기게 한다. 시료 처리시 시료가 대기에 노출되지 않도록 각별한 주의가 요구 된다

9 시료 2차 고정 서울대학교 농생명과학공동기기원 선임연구원 김기우 1. 목표 본 과정에서는 주사전자현미경(SEM)으로 생물 시료를 관찰하기 위한 시료의 2차 고정에 관한 원리와 기술을 익힌다. 2. 2차 고정 가. 생물 시료에 존재하는 다양한 막 구조의 고정을 위하여 1차 고정(primary fixatio n; 전 고정, p re- fixat ion)에 이어 2차 고정( seco nd ary fixatio n; 후 고정, post-fixation)을 실시한다. 주로 이중결합을 갖는 불포화지방산의 고정 역할을 한다. 이외에도 단백질 또는 항원성을 비활성시킨다. 나. 생물 시료의 2차 고정에는 사산화오스미움(osmium tetroxide, OsO 4 )을 사 용한다. 분자량이 254.2이며 강력한 산화제로서 인체에 유해한 발암물질로 알 려져 있으므로 환기가 잘 되는 후드 등에서 취급한다. 다. OsO 4 는 시료 내 침투 속도가 매우 느려서 시간당 0.5 mm 이하인 것으로 알려져 있다. 따라서 시료 외부와 중심부를 비교하면 고정 효과에 차이가 있 다. 2차 고정 후 시료는 검은 색으로 변한다. 라. 고정 성분으로서의 기능 이외에도 시료내 고정 성분으로 잔류하여 시료의 전기전도성을 향상시키므로 SEM으로 관찰시 대전현상(charging)을 저하시키 는 효과가 있다. 시료의 외부를 관찰하는 SEM 실험의 경우 2차 고정을 생략 하기도 한다. 또한 투과전자현미경(TEM)으로 관찰시 전자밀도(electron density)를 증가시켜 대비(contrast)를 향상시키는 염색으로서의 부가적인 기 능을 한다

10 3. 2차 고정액 제 조 가. 대부분의 OsO 4 는 앰퓰로 포장되어 주로 1g 단위로 시판되며 물에 천천히 녹으므로 사용 전에 미리 만들어 놓는다. 나. 용기 내에 앰퓰을 넣고 막대 등으로 깨뜨린 후 증류수 50ml를 부어 2% stock 용액을 만든다. 다. 고정액으로 사용할 때, 적절한 2% OsO 4 용액과 동량의 완충액(2 )을 섞어 서 사용한다. 본 과정에서는 0.1M phosphate 또는 cacodylate 완충액 (ph 7.2)를 사용하여 최종 고정액이 0.05M 완충액에 1% OsO 4 가 되도록 한다. 변형된 osmium 완충액을 이용한 고정의 예 - Stock 용액 A 용액 : 0.1N HCl B 용액 : 0.2M sodium acetate - 완충액 제조 5ml의 A 용액과 5ml의 B 용액을 섞어 ph 7.4를 확인, 조절 0.489g의 sucrose 첨가 증류수를 첨가하여 12.5ml이 되도록 한다. 2% o smium 용액 12.5 ml을 섞는다 이 고정액 에서 1-2시간 고정한다 차 고정 방 법 가. 1차 고정 후 완충액으로 세척한다. 나. 제조한 1% OsO 4 용액을 시료 용기에 분주한다. 시료 용기의 개구를 sealing film으로 밀봉하여 증기의 유출을 방지한다. 4 에서 2시간 처리한다. 다. 증기 고정을 하는 경우에는 1차 고정 없이 2차 고정을 실시한다. 시료를 액체와 접촉하지 않도록 하고 이후 탈수 과정없이 금막코팅하여 시료를 제작 - 8 -

11 한다. 아래 [그림1]은 곰팡이의 경우 포자와 같이 이탈하기 쉬운 시료를 제작 하기 위하여 페트리디쉬에 OsO 4 용액을 넣고 증기 고정한 예를 보여 주고 있 다. [그림1] 곰팡이의 증기 고정. 포자가 이탈하지 않고 균사에 부착된 형태를 유지하고 있다

12 Memo

13 탈 수 및 치환 구암 중 학교 교사 정 미 숙 1. 목표 전자현미경으로 관찰하기에 알맞은 조건의 시료를 가공하기 위한 단계 중 탈수 및 치환 과정에 대한 목적과 처리조건 및 시료 가공을 위한 시약 제조과 정을 알아본다. 2. 준 비 물 시료, 페니실린공병 10ml, 혈청분리관 10ml 또는 1회용 스포이트, 0.1M phosphate buffer(ph 7.4), 100% Ethanol, Acetone, 증류수, 메스실린더, 시약 병 3. 과정 및 방 법 가. 세정(washing) 세정은 표본에서 반응하지 않은 여분의 사산화오스뮴 고정액을 제거하는 과정이 다. 표본을 고정했던 시간이 오래 되었다면 세척시간을 늘리는 것도 방법이다. 시 약 시 간 횟 수 0.1M phosphate buffer, ph min 3 나. 탈수(dehydration) 사산화오스뮴(OsO 4 )으로 후 고정을 하면 사산화오스뮴에 의해 시료가 전자현 미경으로 관찰할 수 있는 상태로 고정된다. 후 고정을 각 시료에 맞게 일정한 시간동안 실시한 후 탈수(dehydration)과정을 진행하는데, 탈수는 친수성의 세 포환경과 비친수성인 포매제 사이의 용매제로서 작용하는 유동체를 이용하여 세포안의 물을 치환하는 과정이다. 이때 사용하는 유기용매로 알코올과 아세 톤이 사용되는데 경우 알코올을 주로 사용한다

14 1) 탈수(dehydration)의 목적 전자현미경은 대체로 수분이 있는 표본을 좋아하지 않는다. 생명체는 다량의 물을 함유하고 있으므로 전자현미경에서 관찰하기 위해서는 수분을 적절한 방 법으로 생물체 밖으로 제거하여야 한다. 특히 주사전자현미경(SEM)에서 탈수 이후 임계점 건조를 하는데, 시료 중 수분이 남아 있으면 건조할 때 물의 표 면 장력에 의해 조직의 변형을 초래하게 된다. 또한 임계점 건조 시 사용되는 액체 이산화탄소(CO2)나 프레온(freon)등과 물은 완전히 혼합되지 않아 임계 점 건조 효율이 떨어진다. 이를 위해 탈수 시는 물보다 표면 장력이 낮은 유 기 용매로 서서히 대체시킨다. 즉 50%부터 100% 까지 점차로 대체시킨다. 또한 투과전자현미경(TEM) 관찰을 위해 얇은 초박절편(ultrathin section, 60-80nm)의 제작이 필수적이고, 이때 표본을 수지(resin)에 포매해야 하는데 대부분의 단단한 수지는 비수용성 (hydrophobic resin)이므로 세포를 이루는 수분을 없애는 일이 중요하다. 만일 수분이 남아 있으면 수지의 침투가 잘 안 되며 이것은 초박절편기(ultramicrotome)로 박절할 때 절편이 잘 만들어지지 않는다. 한번 실수한 시료는 다시 원래의 모습으로 돌이킬 수 없으며 애써 준 비한 시료를 처음부터 다시 준비해야만 한다. 2) 탈수제의 종류 탈수제로서 유기용매를 사용한다. 이는 물과 잘 혼합되며 세포에 손상을 덜 주기 때문이다. 에탄올(ethanol)은 가장 널리 이용되는 탈수제이다. 에탄올이 아세톤보다 더 좋은 결과를 보이는데, 이는 아세톤은 치환제가 필요 없이 사 용되나 표본을 경화(hardness)시키므로 초박절편(ultrathin sectioning)시 표본 이 잘 부서지며 또한 공기 중에 습기를 흡수하는 특성이 있어 탈수과정 중에 표본병의 마개를 잘 닫고 실시해야만 한다. 100% 알코올이나 아세톤은 공기 중의 수분을 흡수하는 성질이 있다. 보관 시 단단히 밀봉하고 자주 열어보지 말아야 한다. 또한 오래 방치되었던 탈수제는 낮은 농도의 탈수제를 만드는데 사용한다. 가) 에틸알콜(Ethanol) : 가장 많이 사용한다. 프로필렌옥사이드(propylene oxide)같은 치환제가 필요하다. 나) 메틸알콜(Methanol) 다) 아세톤(Acetone) : 프로필렌옥사이드같은 치환제가 불필요하다

15 3) 탈수방법 및 시간 탈수 단계의 일반적인 원칙은 탈수제와 물을 일정비율 배합하여 적절한 단계 를 거쳐 점차적으로 조직안의 물을 치환하는 것이다. 이것은 세포나 조직의 변형을 막기 위한 것이다. 사산화오스뮴에 의한 후 고정 이후 보통 30-50% 에탄올이나 아세톤으로 시작하여 점진적으로 비율을 높인다. 탈수제의 농도가 높아지면서 조직 내부의 수분이 빠져나가 탈수제로 치환된다. 에탄올이나 아 세톤은 조직으로부터 지질을 추출하는 경향이 있으므로 지질 조직이 전자밀도 를 잃어버릴 수도 있다. 후 고정에서 사용했던 사산화오스뮴은 조직을 고정시 켜 탈수과정에서 불포화된 지질을 잃어버리지 않도록 도와준다. 조직의 특성(밀도)과 크기 등에 따라서 탈수시간이 달리할 수 있으나 가능하 면 짧은 시간 내에 실시해야 하고 탈수시간이 필요이상 지체되면 세포를 이루 고 있는 구성성분의 추출(extraction)로 좋은 이미지를 얻을 수 없다. 그러나 탈수시간이 충분하지 못하면 불완전한 탈수로 TEM시료 제작 시 포매제 (resin)의 불완전한 침투로 절편제작(sectioning)시 많은 어려움이 있다. 초박 절편이 물에 젖거나 부서지는 현상이 발생한다. 탈수의 실제 : 저농도에서 고농도 순으로 탈수한다. 농 도 시 간 횟 수 50% Ethanol min 1 60% Ethanol 70% Ethanol 90% Ethanol 95% Ethanol 100% Ethanol

16 다. 치환 농 도 시 간 횟 수 Iso : Ethanol = 1:3 15 min 1회 Iso : Ethanol = 1:1 Iso : Ethanol = 3:3 Ab. Iso 10 ~ 20 min 2회 1) 임계점 건조 과정을 적용할 가장 일반적인 액화기체는 CO 2 로 치환액화기 체(transitional fluid)이다. 그러나 CO 2 는 물과 섞이지 않기 때문에 표본의 물 을 CO 2 와 섞일 수 있는 다른 액체로 대체해야 하는데, 이것을 중간치환용액 ( intermediat e fluid) 이라고 부른 다. 2) 가장 널리 시용되는 치환액화기체로 CO 2 를 이용할 경우, 탈수용액은 일반 적으로 에탄올을 주로 사용한다. 생물표본에 수분을 에탄올로 치환하고 다시 에탄올을 이소아밀아세테이트(isoamyl acetate)로 치환하는 과정을 거친다. 이 과정 후에는 표본을 CO 2 를 이용하여 임계점 건조기에서 표본의 수분을 형태 학적 변화 없이 제거하는 과정을 거친다. 3) 임계점 건조과정이 끝났을 경우 건조된 표본에서 이소아밀아세테이트 냄새 가 남아 있다면 표면의 건조가 완전하지 못하다는 증거이므로 주의해야 한다. [그림 6] 훈증법으로 처리 중 [그림 7] 훈증법으로 고정한 시료

17 라. 건조(Dry) 탈수 후 시료에 포함되어 있는 탈수용액을 제거하기 위하여 실시하며 건조가 완전하지 않을 경우에는 진공에 방해가 되고 진공 중에서 시료가 수축되며 coating이 원활히 실시될 수 없으므로 완전히 건조되어야 한다. 건조의 방법에 는 Air dry(단단한 유각류), Freeze dry, 임계점 건조기(Critical Point Dryer) 이용 등이 있으며 통상 일반적인 조직은 임계점 건조기를 많이 사용하나, 배 양시료 같이 dish 채로 건조를 하는 경우에는 HMDS(hexametyl-disilazane) 또는 TMS(tetrametyl-silane) 등의 시약을 이용하기도 한다. 4. 시약 제 조 과정 가. 인산완충액의 제조 1) 0.1M phosphate buffer(ph 7.4) 본 실험에서는 완충액으로 0.1M phosphate buffer를 사용한다. 이를 만들기 위해서 A, B 두 용액을 먼저 조제한 후 이를 합치는 방법을 사용한다. 가) A용액 (0.2M Monobasic sod. phosphate) NaH2PO4 H2O 13.8g을 눈금이 있는 플라스크에 넣고, 증류수를 첨가하여 전체 용액의 양이 500ml가 되도록 한 후 잘 혼합하여 녹인다. 나) B용액 ( 0.2M Dibasic sod. phosphate) Na2HPO4 2H2O 35.61g을 눈금이 있는 플라스크에 넣고, 증류수를 첨가하 여 전체 용액의 양이 1,000ml 되도록 한 후 혼합하여 녹인다. 다) A액 190ml + B액 810ml + 증류수 1,000ml 를 같이 섞어 0.1M Phosphate buffer완충액을 만든다. 나. 1차 고정액 (glutaraldeh yde) 의 제 조 본 실험에서는 1차 고정액으로 2.5% glutaraldehyde액을 사용한다. 25% 또는 50% glutaraldehyde액을 buffer액과 섞어 2.5%가 되도록 희석하여 사용한다. (1차 고정액인 2.5% glutaraldehyde액은 원액을 냉동고(-20 )에 보관해야 한다.) 1) 25% glutaraldehyde액 100ml + buffer액 925ml 2) 50% glutaraldehyde액 50ml + buffer액 1950ml

18 다. OsO 4 용액의 제조 및 관리 1) 1% Osmium tetroxide 용액 만드는 방법 : 2% OsO 4 0.1g이나, 1.0g의 OsO4 앰풀을 깨뜨려 갈색병 안에 떨어뜨리고, 5ml(0.1g 앰플)이나 50ml(1.0g 앰플)의 증류수를 첨가하고 녹을 수 있도록 흔들어 준다. 이것을 냉장고에서 보관 후 buffer액으로 1%가 되게 제조한다. 최근에는 4% 용액으로 (ampule) 시판되는 것이 있으나 값이 비싸다. 2) osmium tetroxide는 보통 lgm crystal 로 시판되는데 용해가 잘 되지 않으 므로 사용하기 전 최소 1일 이전에 녹여서 제조하고, 빛에 노출이 되지 않도 록 갈색병에 밀폐하여 저온에서 보존하여야 한다. 특히 기화 및 증발이 잘되 고 피부를 통하여 잘 흡수되므로 반드시 safety hood 내에서 비닐장갑과 마스 크를 착용하고 취급하여야 한다. 3) 0.25% Osmium tetroxide 용액 만드는 방법 : 4% OsO 4 앰플 5ml를 깨뜨려 갈색병 안에 떨어뜨리고, 인산완충액 75ml를 섞어서 사용한다. 4) Osmium tetroxide 용액은 몇 달 동안 안정하며 직접적인 햇빛에 노출되지 않는 후드 안에 보관하는 것이 좋다. 냉장고나 밀폐된 공간 안에 보관하지 말 아야 한다. 그 이유는 증기의 노출에도 모든 내부 면이 변색될 수도 있고 다 른 내용물들에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 라. 탈수액의 조제 탈수액의 조제 : 본 실험에 사용할 탈수액은 에탄올(ethanol)이다. 사용단계 에 따라 다음과 같이 조제한다. 50% ethanol : 100% ethanol 50ml + 증류수 50ml 70% ethanol : 100% ethanol 70ml + 증류수 30ml 80% ethanol : 100% ethanol 80ml + 증류수 20ml 90% ethanol : 100% ethanol 90ml + 증류수 10ml 95% ethanol : 100% ethanol 95ml + 증류수 5ml

19 [그림 8] 전처리 과정 [그림 9] 이온코팅과 스터브 장착 참고 전자현미경 직무연수, 서울 초중등 생물미세구조교육연구회, 2004 전자현미경 심화과정, 서울 초중등 생물미세구조교육연구회, 2005 한국 세포형 태연구소 년도 의 생물 분야 동계워크샵, 한국전자현미경 학회, 2007 전자현미경의 시료처리 및 조작방법, 서울과학교육원,

20 Memo

21 주 사 전 자 현 미 경 의 원리 와 이 용 한 국 세포 형 태 연구소 윤 철 종 1. 주 사 전 자 현 미 경 개 요 20 세 기 전 자 현 미 경 의 출 현 은 그 동 안 광 학 현 미 경 에 서 관 찰 할 수 있 는 분 해 능 의 한 계 를 극 복 하 는 광 학 분 야 의 획 기 적 인 발 명 품 이 다. 그 동 안 광 학 현 미 경 에 서 해 결 하 지 못 했 던 초 기 의 세 포 학 적 미 세 구 조 적 형 태 학 과 바 이 러 스 를 관 찰 할 수 있 어 서 생명과학분 야 뿐 만 아 니 라 공 학 분 야 및 산 업 전 반 에 미 시 세 계 의 중 요 문 제 를 풀 수 있 는 고 분 해 능 (h igh reso lutio n)의 장 비 이 다. 여 기 서 는 주 사 전 자 현 미 경 과 생 물 학 분 야 에 국 한 된 표 본 제 작 과 세 포 분 석 에 대 한 자 료 를 기 술 한 다. 전 자 현 미 경 은 크 게 2차 원 구 조 의 세 포 내 의 미 세 구 조 를 관 찰 하 기 위 한 투 과 전 자 현 미 경 과 주 로 표 면 의 요 철 ( 凹 凸 )을 관 찰 하 여 3차 원 구 조 를 관 찰 하 는 주 사 전 자 현 미 경 으 로 분 류 되 며 그 사 용 영 역 은 광 범 위 하 여 표 본 제 작 만 가 능 하 다 면 그 어 느 영 역 의 표 본 도 관 찰 이 가 능 하 다. 즉, 생 물 학, 의 학, 재 료공학, 반 도 체 등 미 세 구 조 를 연 구 하 는 많 은 영 역 에 서 관 찰 및 분 석 용 으 로 사 용 된 다. 가. 역 사 전 자 의 발 견 은 현 대 인 의 생 활 에 많 은 영 향 을 주 었 다. 광 학 분 야 에 서 도 전 자 의 발 견 은 미 시 세 계 의 새 로 운 분 야 로 그 특 성 상 빛 과 같 은 입 자 와 파 동 과 같 은 특 징 을 갖 는 것 으 로 자 기 장 영 역 에 서 굴 절 하 는 것 을 발 견 하 게 된 다. 이 를 이 용 한 전 자 렌 즈 가 발 명 되 고 렌 즈 의 조 합 을 통 하 여 확 대 되 는 현 미 경 을 제 작 할 수 있 다 는 아 이 디 어 를 갖 게 된 다. 독 일 베 를 린 공과대학교에 서 1931년 최 초 로 투 과 전 자 현 미 경 을 함 께 제 작 했 던 당 시 의 대학원생 에 룬 스 트 루 스 카 (E runst R usk a)의 지 도 교 수 였 던 막 스 크 롤 (M ax K no ll)에 의 해 년 주 사 전 자 현 미 경 의 원 리 가 처 음 소 개 되 었 다. 그 러 나 주 사 전 자 현 미 경 이 투 과 전 자 현 미 경 보 다 발 전 이 늦 은 이 유 는 주 사 전 자 현 미 경 의 원 리 를 현 실 적 으 로 상 용 화 하 는 일 에 있 어 서 고 품 질 의 주 변 장 치 인 전 자 검 출 기, 화 상 모 니 터 가 늦 게 개 발 되 었

22 기 때 문 이 다. 그 러 므 로 상 품 화 된 것 은 년 대 초 에 영 국 과 일 본 에 서 제 작 되 었 다. 현 재 는 국 내 의 해 당 교 육 청 관 할 과 학 전 시 관 과 대 부 분 의 과학고등 학교 및 전 공분 야 관 련 대학이 나 연구소 의 공공기기실, 산 업 체 인 반 도 체 및 재 료 공 학 분 야 의 연 구 소 및 기 업 체 에 투 과 전 자 현 미 경 보 다 많 이 보 급 이 되 었 다. (A ) (B ) 그 림 1. 막 스 크 놀 교수 와 당 시 27세의 대학원생 에 룬 스 트 루 스 카 (A ), 년 노 벨 물 리 학 상 을 받 던 에 룬 스 트 루 스 카 사 진 (B ) 막 스 크 롤 교 수 는 당 시 대학원생인 에 룬 스 트 루 스 카 (E. R usk a, 년 노 벨 물 리 학 상 ) 와 함 께 투 과 전 자 현 미 경 을 처 음 제 작 하 였 다. [표 1] 주사전자현미경의 연도별 발달과정 1897년 톰 슨 (J. J. T hom son, 독 일 ) 전 자 발 견 (노 벨 물 리 학상 ) 드 브 로 글 리 (Louis de Broglie, 전자가 빛과 같은 파동성이 있음 19 24년 프랑스) 을 입증 (노벨 물리학상) 년 부 쉬 (H ans B usch, 독 일 ) 전 자 렌 즈 발 명 크 롤 과 루 스 카 (M. K no ll & E 년 투과전자현미경 처음 제작 Ruska, 독일 ) 1935년 크놀(Max Knoll, 독일) 주사전자현미경의 원리발표 년 아 덴 ( M. V. A rd enne, 독 일 ) 영국(캠브리지회사), 1964년 일본(일본광학회사) 주사전자현미경 제작(주변장치 문 제 로 상 용 화 되 지 는 못 함 ) 주사전자현미경 상품화 및 상용화

23 나. 원 리 주 사 전 자 현 미 경 은 광 학 현 미 경 의 일 종 인 실 체 현 미 경 (S tero sco p e)과 구 조 와 원 리 가 같 다 고 볼 수 있 다. 단 지 빛 (가 시 광 선 ) 대 신 전 자 광 선 (electro n b eam )을 사 용 하 는 차 이 이 다. 주 사 전 자 현 미 경 은 가 속 된 전 자 를 볼 록 렌 즈 기 능 을 하 는 전 자 렌 즈 (m agnetic lens)를 통 해 수 렴 시 켜 빠 른 속 도 로 표 본 위 를 주 사 (scanning)함 으 로 표 본 의 표 면 인 요 철 ( 凹 凸 )부 위 에 서 발 생 하 는 2차 전 자 (seco nd ary electro ns)를 검 출 하 여 이 를 증 폭 함 으 로 심 도 ( 深 度, d ep th )있 는 화 상 (im age)을 관 찰 할 수 있 는 것 이 그 특 징 이 다. 즉, 표 본 의 미 세 구 조 를 해 상 도 가 높 은 입 체 구 조 (3- D )를 관 찰 할 수 있 다. 참 고 : 전 자 현 미 경 은 흑 백 의 화 상 (im age)만 볼 수 있 다. 전 자 광 선 은 사 람 의 눈 으 로 볼 수 있 는 광 선 (ray s)이 아 니 므 로 전 자 를 형 광 판 (투 과 전 자 현 미 경 )이 나 음 극 관 (주 사 전 자 현 미 경 )을 통 하 여 관 찰 한 다. 그 러 므 로 관 찰 할 수 있 는 상 은 흑 백 화 상 이 다. 즉, 전 자 선 은 가 시 광 선 (v isib le ray s, 可 視 光 線 )이 아 니 다. 그 러 나 대 중 매 체 에 나 오 는 전 자 현 미 경 칼 라 사 진 은 흑 백 사 진 을 컴 퓨 터 로 인 위 적 인 색 상 을 처 리 한 것 이 다. 다. 구 조 고 전 압 (h igh v o ltage)상 태 에 서 전 자 를 발 생 시 키 는 부 분 과 이 를 수 렴 (집 속, co nd ensing)시 키 는 2개 의 집 속 렌 즈 가 있 고 전 자 를 작 은 초 점 으 로 모 아 표 본 위 에 주 사 하 는 편 향 코 일 과 전 자 선 을 표 본 에 초 점 을 맞 추 어 집 속 시 키 는 대 물 렌 즈 가 있 다. 표 본 에 서 발 생 하 는 2차 전 자 를 검 출 하 여 증 폭 하 여 음 극 관 에 화 상 을 관 찰 한 다. 1) 전 자 현 미 경 의 광 학 계 가 ) 전 자 발 생 부 위 : 전 자 총 (electro n gun)으 로 텅 스 텐 (W ) 혹 은 LaB 6 (L anth anum h ex ab o rid e)의 필 라 멘 트 에 서 전 자 를 발 생 시 킨 다 나 ) 전 자 광 학 부 위 : (1) 집 속 렌 즈 (집 광 렌 즈, co nd enser lens): 보 통 2개 의 집 속 렌 즈 를 통 해 전 자 를 모 은 다. (2) 대 물 렌 즈 : 생 물 표 본 의 바 로 위 에 있 는 렌 즈 로 주 사 전 자 현 미 경 의 분 해 능 과 상 관 관 계 가 높 은 것 으 로 초 점 을 맞 추 는 일 을 담 당 한 다

24 (3) 주 사 부 위 : 주 사 전 자 현 미 경 에 있 는 집 속 렌 즈 와 대 물 렌 즈 사 이 에 위 치 해 있 으 며 주 사 전 자 현 미 경 의 주 사 (scanning)를 담 당 하 는 장 치 로 2개 의 편 향 코 일 이 있 어 집 속 렌 즈 를 통 과 한 전 자 를 상 하, 좌 우 로 편 향 (주 사 )시 킨 다. 주 사 전 자 현 미 경 의 심 도 를 나 타 내 주 는 장 치 이 다. (4) 비 점 보 정 : 광 학 현 미 경 과 는 달 리 전 자 현 미 경 은 비 점 수 차 를 조 절 할 수 있 다. 즉, 비 점 수 차 의 방 향 과 정 도 는 주 사 전 자 현 미 경 에 서 는 항 상 일 정 하 지 않 아 표 본 을 관 찰 할 때 자 주 보 정 해 야 하 는 데 보 정 장 치 의 코 일 에 전 류 의 양 을 X, Y 방 향 으 로 조 절 함 으 로 맞 출 수 있 다. 고 배 율 로 관 찰 할 때 는 비 점 수 차 를 최 소 화 해 야 해 상 력 높 은 화 상 을 얻 는 다. (5 ) 대 물 조 리 개 (o b jectiv e ap erture): 대 물 렌 즈 속 에 있 는 크 기 가 다 른 4 개 의 작 은 구 멍 을 선 택 하 여 화 상 의 대 조 (co ntrast), 명 암 과 심 도 를 선 택 할 수 있 는 장 치 이 다. 2) 표 본 실 ( sp ecim en ch am b er) 2개 의 본 체 중 경 통 이 있 는 본 체 로 충 격 완 충 (방 진 )장 치 가 있 다. 표 본 제 작 처 리 가 완 료 된 표 본 을 넣 고 밖 에 서 좌 우, 상 하 (작 동 거 리, w o rk ing d istance, W D )를 조 절 하 며 기울기, 회 전 을 할 수 있 다. 표 본 의 표 면 에 서 발 생 되 는 여 러 가 지 신 호 를 검 출 할 수 있 는 검 출 기 (d etecto r)가 있 다. 3) 진 공시스 템 전 자 총 및 전 자 광 학 부 위, 표 본 실 은 고 진 공 (h igh v acuum )상 태 를 유 지 하 는 것 은 전 자 현 미 경 기 기 의 공 통 된 조 건 으 로 전 자 는 공 기 가 있 으 면 진 행 에 장 애 가 되 므 로 높 은 진 공 상 태 를 유 지 해 야 한 다. 다 음 과 같 은 진 공 펌 프 가 있 다. 가 ) 로 타 리 펌 프 (R o tary p um p ): 단 독 으 로 사 용 할 때 는 진 공 정 도 가 낮 다 (10-2~-3 T o rr). 그 러 므 로 일 반 적 으 로 기 름 확 산 펌 프 와 함 께 사 용 된 다. 나 ) 기 름 확 산 펌 프 (O il d iffusio n p um p ): 증 기 압 이 낮 은 순 수 하 게 정 제 된 기 름 을 높 은 온 도 로 가 열 하 여 가 스 상 태 로 증 기 화 하 여 이 가 스 를 분 사 함 으 로 공 간 내 의 작 은 공 기 입 자 를 기 름 입 자 (o il p articles)에 부 착 시 켜 저 온 의 물 을 이 용 해 냉 각 된 환 경 으 로 만 들 면 공 기 와 기 름 이 분 리 되 고

25 이 때 떨 어 진 공 기 입 자 는 로 터 리 펌 프 에 의 하 여 배 출 되 고 기 름 은 계 속 해 서 순 환 하 게 된 다. 일 반 적 으 로 전 자 현 미 경 진 공 계 에 널 리 사 용 된 다. 수 랭 식 펌 프 이 다. 다 ) 스 펏 터 이 온 펌 프 (S p utter io n p um p ): 어 느 정 도 진 공 이 된 상 태 에 서 공 기 압 의 방 전 으 로 공 기 를 이 온 화 하 고 음 극 판 에 충 돌 하 도 록 하 여 공 기 를 배 출 하 여 높 은 진 공 상 태 를 만 든 다. 라 ) 터 보 분 자 펌 프 (T urb o m o lecular p um p ): 저 진 공 에 서 고 진 공 상 태 까 지 원 하 는 만 큼 진 공 을 선 택 할 수 있 다. 수 많 은 추 진 날 개 를 갖 고 있 는 펌 프 로 공 기 의 운 동 속 도 보 다 빠 르 게 고 속 회 전 시 켜 진 공 을 만 드 는 경 우 이 다. 초 고 속 진 공 을 만 들 수 있 으 나 고 가 의 장 비 이 다. 고 급 전 자 현 미 경 의 배 기 시 스 템 에 사 용 된 다. * 참고: 2008년 서울특 별 시과학전 시관 에 도 입 된 본 제 품 은 로 터 리 펌 프 와 터 보 펌 프 가 있 는 공 랭 식 의 주 사 전 자 현 미 경 이 다. 4) 본 체 전 기 계 가 ) 외 부 에 서 주 사 전 자 현 미 경 으 로 전 원 을 공 급 하 는 부 분. 나 ) 대 물 렌 즈 를 통 과 한 1차 전 자 가 표 본 에 서 나 오 는 2차 전 자 를 화 상 신 호 (signal)를 검 출 하 고 증 폭 시 키 는 부 분. 다 ) 전 달 된 화 상 을 관 찰 하 도 록 음 극 관 (cath o d ray tub e, C R T )이 사 용 되 었 으 나 최 근 에 는 대 형 컴 퓨 터 모 니 터 가 음 극 관 을 대 신 함 으 로 높 은 해 상 력 과 배 율 을 관 찰 할 수 있 다. 라 ) 관 찰 한 영 상 을 사 진 촬 영 장 치 하 였 으 나 최 근 에 는 컴 퓨 터 를 이 용 한 디 지 털 화 상 장 치 부 분 과 화 상 분 석 장 치 를 부 착 하 고 있 음.. 참 고 : 고 분 해 능 의 환 경 을 위 해 주 사 전 자 현 미 경 의 설 치 는 건 물 의 진 동 이 없 도 록 고 층 보 다 는 지 하 층 이 나 저 층 이 좋 으 며 주 변 에 큰 인 접 도 로 혹 은 철 로 가 있 어 서 교 통 량 이 빈 번 하 면 곤 란 하 다. 이 는 외 부 의 진 동 이 나 소 음 이 주 사 전 자 현 미 경 의 경 통 에 좋 지 않 은 영 향 을 주 며 강 력 한 자

26 기 장 이 발 생 하 는 곳 은 좋 지 않 다. 한 예 로 엘 리 베 이 터 근 처 등 강 력 한 모 터 가 작 동 하 는 근 처 는 자 기 장 이 형 성 되 어 주 사 전 자 현 미 경 의 경 통 의 집 속 렌 즈, 편 향 코 일, 대 물 렌 즈 에 영 향 을 줄 수 있 다. 이 를 방 지 하 기 위 해 서 전 자 렌 즈 에 영 향 이 미 치 지 않 는 일 정 한 거 리 이 상 을 격 리 되 는 환 경 을 유 지 하 는 일 이 중 요 하 다. 또 한 설 치 된 공 간 은 청 정 한 환 경 과 습 기 가 없 어 야 하 며 일 정 한 상 온 을 유 지 할 필 요 가 있 다. [그 림 2] 광 학 현 미 경, 투 과 전 자 현 미 경 과 주 사 전 자 현 미 경 의 구 조 와 광 원 의 경 로 를 단 순 구 조 로 비 교 한 그 림

27 [그 림 3] 주 사 전 자 현 미 경 의 3차 원 구 조 (Jeo l 社, Japan 제 공) 라. 주 사 전 자 현 미 경 의 배 율 대 물 렌 즈 위 에 존 재 하 는 편 향 코 일 에 서 주 사 하 는 각 도 에 따 른 면 적 대 비 음 극 관 (C R T, 요 즘 은 컴 퓨 터 모 니 터 )의 면 적 비 율 이 다. 즉, 편 향 코 일 의 각 도 에 따 라 서 저 배 율 에 서 고 배 율 을 선 택 할 수 있 다. 편 향 각 도 는 전 기 적 인 신 호 에 의 하 여 다 양 한 변 화 를 줄 수 있 다. 즉 컴 퓨 터 의 모 니 터 는 크 기 가 고 정 되 었 으 므 로 편 향 시 킨 면 적 이 작 을 수 록 상 대 적 으 로 배 율 이 증 가 한 다. 주 사 전 자 현 미 경 의 분 해 능 : 대 물 렌 즈 의 주 사 선 을 아 주 작 게 수 렴 시 켜 표 본 의 표 면 에 초 점 을 맞 추 는 일 이 중 요 하 다. 대 물 렌 즈 를 투 과 한 전 자 를 프 로 브 (p ro b e, 탐 침 )라 고 표 현 한 다 면 가 능 하 면 표 본 의 표 면 에 근 접 시 키 고 프 로 브 를 작 은 각 도 로 최 소 화 한 작 은 점 (sp o t)으 로 만 드 는 일 이 다. 가 속 전 압 을 올 리 고 대 물 렌 즈 와 표 본 과 의 거 리 를 단 축 시 키 면 분 해 능 은 올 라 간 다. 일 반 적 으 로 주 사 전 자 현 미 경 은 투 과 전 자 현 미 경 보 다 분 해 능 은 낮 다

28 마. 주 사 전 자 현 미 경 의 생명과학분 야 의 기여 도 [그림4] 과거와 현재의 전자현미경이 생명과학분야에 기여한 분야에 대한 도식 [그림5] 전자현미경의 생명과학분야에서 영역별 학습의 효과와 기대에 대한 도식

29 임계 점 건 조 ( C rit ical P o int D rier) 세종 과학고등 학교 교사 최 승 규 1. 목표 시료를 코팅하기전 시행하는 임계점 건조의 목적과 방법을 이해하고, 임계점 건조기를 사용하여 건조된 시료를 제작할 수 있다. 2. 필 요 성 공기 또는 진공 중에서 수분을 함유한 생물학상 시편들은 건조 중 그 구조들 이 변형되거나 파괴 될 수 있다. 이를 보완 할 수 있는 가장 잘 알려진 방법 이 바로 임계점 건조법(Critical Point Drying)이다. 액체와 그 증기의 상태가 같아지기 시작하는 일단의 조건을 임계점이라고 한 다. 각 물질의 임계점을 결정하는 조건은 임계온도 임계압력 임계밀도이다. 이 것은 간단한 실험을 통해 쉽게 이해할 수 있다. 밀폐된 용기에 일부는 액체상 태이고 일부는 증기상태인 순수한 물질이 가득 차 있다면 평균밀도가 임계밀 도와 같아지므로 임계조건을 얻을 수 있다. 온도가 올라감에 따라 증기압은 증가하고 기체상의 밀도는 더욱 커진다. 임계점에 이르러 액체와 증기의 밀도 가 같아지고 2가지 상의 경계가 불분명해질 때까지 액체의 부피는 늘어나고 밀도는 작아진다. 최초의 평균밀도가 매우 낮으면 임계온도에 이르기 전에 액 체는 모두 기화되며, 매우 높으면 액체는 팽창해서 용기 전체를 채우게 된다. 액체에서 기체상태로 변하는 시점에서의 물의 표면 장력은 섬세한 시편을 파 괴할 수 있다. 시편에 압력과 온도를 증가시키면 상계면을 통과하지 않고도 건조가 가능하고 일단 임계점을 통과하면 액체와 기체가 밀도는 같기 때문에 이 같은 건 조가 가능 하다. 물의 임계 점은 3212p si, 37 4 C이 다. 그 러나 이와 같 은 고압과 고온에서 생물 시료는 보통 파괴된다. 그러므로 시편이 먼저 CO 2 (임계점 : 1072psi, 31 C)와 같은 적절한 전이유체에서 다루어져야 한다

30 3. 원리 가. 상평형과 임계점 물질의 온도를 일정하게 유지하면서 압력을 변화시키면 특정한 압력에서 세 가지상(고체, 액체, 기체) 중 두 상 사이에서 상 전이가 일어난다. 온도를 변화 시켜가면서 같은 과정을 되풀이하면 그 물질의 상평형 그림을 얻을 수 있다. 어느 물질이든 삼중점(triple point)이라 불리는 고유한 압력과 온도의 점이 있 는데 이 상태에서는 기체, 액체, 고체 상이 동시에 평형을 이루며 공존한다. 액체-기체가 공존하는 곡선은 삼중점으로부터 온도나 압력에 대해 위쪽방향으 로 뻗어 있다. 이 선은 액체 물질의 증기압 곡선과 같다. 이 액체-기체 공존 곡선은 무한히 계속되지 않고 임계점(critical point)이라 불리는 점에서 끝난 다. 액체와 기체 성질의 차이점은 임계점에 근접할수록 작아지고 임계점에서 는 사라진다. 밀폐된 용기에 어떤 물질을 넣고 서서히 가열하면 액체와 기체 간의 경계면에 오목면(meniscus)이 있는데 임계점에서는 이 오목면이 사라진 다. 임계점보타 높은 압력에서는 기체나 액체 등의 어느 특정한 상태로 정의 할 수 없다. 그래서 임계점 이상에 있는 물질을 초임계 유체라고 한다. 유체란 기체와 액체를 다 포함하는 용어이다. 임계온도이상에서는 기체에 압력을 가 해도 액체가 되지 않는다. 물의 임계점은 374, 218 기압이다. [그림 1] 물의 상평형도 [그림 2] 이산화탄소의 상평형도 물과 달리 이산화탄소는 고체/액체 경계선이 양의 기울기를 보인다. 즉 고체 상태일 때가 액체상태일 때보다 밀도가 더 크다. 삼중점의 압력이 1기압보다 높으며, 1기압일 때는 -78 에서 승화가 시작된다. 이산화탄소는 임계조건이 31, 72.8 기압으로 비교적 온화하다(psi는 제곱인치당파운드/1atm = 14.7psi)

31 나. 임계점 건조의 원리 전자현미경을 위한 생물 시료는 수분의 제거가 필수적이다. 건조과정에서 표 면장력에 의한 생물 시료의 변형을 막기 위해 임계점 건조를 시행한다. 임계 점에서는 액체가 기체로 변할 때 표면장력이 0이 되므로 시료에 충격을 주지 않는다. 물(H 2 O) 자체의 임계점은 온도와 압력이 높아 사용하기에 유용하지 않으며 또한 시료에 열충격을 주게된다. 이를 대체하기 위해 가장 많이 쓰이 는 것은 이산화탄소(CO 2 )이다. 그러나 이산화탄소는 물과 혼합되지 않는다. 그 래서 중간 매개체를 필요로 하는데 보통 아세톤을 많이 사용한다. 4. 임계 점 건 조 기 사 용 방 법 실험에 사용할 EMS850기기는 아세톤이나 에탄올과 같은 매개체에 의해 치 환되어 있는 시료를 다시 이산화탄소를 사용하여 임계점 건조를 시행하도록 되어있다. 시료는 EMS850의 챔버 압력하에 놓이게 된다. 챔버를 미리 차게하는 것은 이산화탄소 압력탱크에서 나오는 액체 이산화탄소로 챔버를 채우는 것을 도와 준다. 액체 이산화탄소가 채워지고 챔버가 데워지면 몇분후 임계점 온도와 압 력에 도달한다. 이산화탄소 가스는 시료의 뒤틀림을 막기 위해 미세 밸브를 통해 배출된다. 가. 임계점 건조기 구성 [그림 3] 챔버 [그림 4] 압력 표시계

32 챔버 압력계 히터 초미세 배기 밸브 미세 배기 밸브 배기 밸브 주입 밸브 냉각 밸브 [그림 5] 전면부 전원 가스 공급 가스 배출 구 [그림 6] 후면부

33 [그림 7] 시료대 [그림 8] 분해된 시료대 나. EMS 850 임계점 건조기 사용 순서 단 계 온 도 / 시간 / 압 력 1 아세톤이나 에탄올로 치환된 시료를 준비한다. 2 모든 밸브가 잠겨져 있는지 확인한다 냉각 밸브(파랑)를 열어 챔버를 미리 차갑게 한다. 단 천천히 냉각시켜야 챔버가 얼지 않는다. 챔버에 시료를 넣고 꽉 조인다. 챔버를 열 때, 주입 밸브는 잠겨져 있는지, 배기 밸브가 열려져 있는지, 압력계는 0에 위치해 있는지 먼저 확인한다. 필요하면 챔버안에 교반용 마그네틱바를 넣는다. 또 한 챔버의 O-ring이 망가져있지 않은지 확인한다. 주입 밸브(녹색)를 열고 CO 2 를 주입하여, 챔버 창의 붉은 색 눈금을 기준으로 최소 중간까지 액체 CO 2 를 채운다. +5 / 4분 1분 6 치환(필요시 교반기 사용) +5 / 3분

34 단 계 온 도 / 시간 / 압 력 챔버를 깨끗하게 청소하기 위해, 액체 CO 2 눈금을 최소 붉은 색 눈금 사이 중간이상을 유지하면서 주 입 밸브(녹색)와 배기 밸브(검정)를 균형있게 사용하 여 액체 CO 2 를 일정하게 내보낸다. 치환(필요시 교반기 사용). 필요하다면 냉각 밸브(파 랑)를 사용하여 챔버를 차갑게 한다. 모든 다른 밸브 는 잠겨져 있어야 한다. (7번부터 반복). 원한다면 치환상태를 알아보기 위해 장치 뒷편에 있는 배출구를 필터 페이퍼로 체크한 다. 챔버의 중간까지 액체 CO 2 를 채운다. 모든 밸브가 잠겨져 있는지 확인하고 히터의 스위치를 켠다. 기 기의 상태가 안정적인지 확인한다. 이산화탄소의 양이 부족하게 채워지면 온도가 잘 안오르고 1250psi까지 압력이 도달하지 않는다. 임계점에 도달하면 감압 시스템을 작동시킨다. (1) 배기 밸브(검정) - 덜 예민한 샘플 (2) 미세 배기 밸브(빨강) - 예민한 샘플 1분 +5 / 3분 1분 +35 / 15분 / 1250psi (1) +35 / 10분 (2) +35 / 20분 12 재가동시 3번부터 다시 시작 +35 에서 5 까 지 8분소요 기기를 완전히 끌 때 (1) 이산화탄소 가스통을 잠근다. 13 (2) 배기 밸브(검정)를 연다. (3) 냉각 밸브(파랑)를 연다. ( 4) 기기의 전기 스위 치를 끈다. 미세 배기 밸브를 너무 꽉 조이면 밸브 고장의 원인이 된다. 6 ~ 9 단계는 생략이 가능하다. 참고문헌 : EMS 850 Critical Point Drier Manual

35 이 온 코 팅 ( Io n C o at ing) 서울신 용 산 초 등 학교 교사 조 은 부 1. 목표 시료의 표면에 금속으로 피막을 입히는 이온 코팅에 대한 목적과 방법을 이해 하고 이온 코팅기를 사용하여 전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)으로 관찰하고자 하는 시료를 제작할 수 있다. 2. 원리 가. 이온 코팅(Ion Coating)의 목적 1) 대전방지( 帶 電 防 止 ) 전도성이 없는 생물, 광물, 고분자등의 시료는 연속적으로 전자선을 조사함 에 따라 마이너스로 대전하여 2차전자의 발생이 무질서해져서 관찰이 곤란해 진다. 이러한 장해를 없애기 위한 가장 일반적인 방법이 이온 코팅방법이다 2) 이차전자 발생효율( 二 次 電 子 發 生 效 率 )의 향상 SEM 상의 像 質 과 分 解 能 은 이차전자의 양에 의해 좌우되어진다. 이온코팅 은 이차전자의 발생량을 증가시키기 위한 방법이다. 3) 정확한 표면구조( 表 面 構 造 )의 관찰 코팅막은 일차전자가 시료 깊숙이 침입하지 못하게 해주며 또한 시료내부 에서 발생하는 이차전자를 흡수하여 정확한 표면구조의 형성을 돕는다. 4) 전자선( 電 子 線 )이나 열에 의한 손상으로부터 보호 생물, 고분자, 유기물 등의 시료는 전자조사(대전, 발열)에 의해 변질 혹은 변형을 일으키기 쉽다. 적당한 두께의 열전도가 용이한 코팅막은 시료의 손상 을 방지해준다

36 나. 이온 코팅의 재료 및 방법 1) 코팅 재료의 종류 가) 금(Au): 일반적으로 널리 사용되는 재료로서, 피막 형성이 용이하고 코팅 이 끝난 시료가 황금빛을 띠고 있어 피막의 두께 및 상태를 미루어 짐작할 수 있다. 나) 백금(Pt): 원소의 입자가 금보다 미세하나 피막형성이 용이하지 않으며, 코팅이 끝난 후 피막을 육안으로 식별하기 어렵다. 고분해능(10만배 이상)을 필요로 할 때 사용한다. 다) 합금(금+백금) 2) 이온 스퍼터 코팅법(Ion Sputter Coating Method) 가) SEM(Scanning Electron microscope)시료제작을 위하여 일반적으로 많이 사용하는 코팅 방법으로 Ion sputter를 이용하여 시료의 표면에 금속 피막을 입힘으로써 시료의 전기전도성을 좋게 하는 방법이다. 나) 스퍼터 코팅의 원리는 시료실 내부의 잔류가스를 높은 전압으로 전리시켜 만들어진 이온들이 Target 금속(gold disk)의 물질과 충돌하여 이 때 튕겨져 나온 Target 금속입자들이 잔류 가스에 의해 산란되어 시료 표면에 떨어져 금속 피막을 형성하게 하는 것이다. [그림 1] 이온 스퍼터 코팅 장치의 구조와 원리

37 3. 준 비 물 stub(시료대), 금속양면테이프(구리, 탄소 등의 얇은 박판에 접착제가 처리 된 양면테이프), 가위, 핀셋, 시료, 이온 코팅기 [그림 3] Stub(시료대) [그림 4] 금속양면테이프(탄소,구리) 4. 이 온 코 팅 과정 및 방 법 [그림 5] 이온 코팅기 가. M ounting( 시료대 위 시료 고정) 과정 1) Mounting의 목적

38 시료 관찰을 위하여 시료를 진공환경이나 전자선을 조사하는 환경에 두었 을 때, 시료의 흔들림이나 이탈을 막아주기 위하여 시료를 Stub(시료대) 위에 고정하기 위함이다. 2) M o unting 방법 시료처리 과정을 거쳐 건조가 끝난 시료를 이온 코팅기의 시료실에 넣기 전 에 접착제(구리나 탄소양면테이프)를 사용하여 관찰하고자 하는 부위가 위로 가게 한 후 시료를 St ub ( 시료대) 위에 고정시킨다. 나. Ion Coating(이온 코팅) 과정 1) 이온 코팅기의 시료실(chamber) 뚜껑을 열고 Sample(시료를 고정한 Stub) 을 넣은 다음, 뚜껑을 두 손으로 잡고 조심스럽게 천천히 내리면서 닫는다. 2) 전원스위치(Power)를 켠다(On). 3) Auto 단추를 누른다. 4) Cycle 단추를 누른다. 5) Plasma가 형성되면서 보랏빛의 Particle들이 떨어져 나와 시료 위에 증착 된다. 6) 시간조정은 Pause/Test 단추를 누른 상태에서 Set단추를 이용하여 설정 한다. (보통 생물시료의 경우에는 100~200초 정도) 7) Set μa 단추를 누른 상태에서 Set 단추를 이용하여 설정한다. (보통 생물시 료의 경우 10~20 μa) 8) 코팅(coating)이 끝나면 전원스위치(Power)를 끈다(Off). 피막의 두께: 시료와 배율에 따라 차이가 있으나 일반적으로 20~30nm 두께로 코팅(coating)을 실시한다. 9) 시료실(chamber) 내 압력이 대기압과 같아지면 시료실 뚜껑을 열고 코팅된 Sample(시료를 고정한 Stub)을 조심스럽게 꺼낸다

39 5. 이 온 코 팅 시 유 의 점 가. 오염의 방지 장치에 부착된 배기펌프의 기능과 진공도달도가 낮기 때문에 시료를 미리 충 분히 건조시키지 않는다면 코팅하는 도중에 진공도가 저하되고 방전전류가 증 가하여 시료의 온도상승을 촉진하게 된다. 이 때 시료에서 방출된 유분이나 유기성분이 시료표면에 부착하여 금속 피막의 형성을 방해하게 되므로 시료 주변에는 항상 신선한 가스의 공급이 필요하다. 나. 이온이나 전자에 의한 시료손상의 방지 방전에 의해 발생하는 이온이나 전자가 시료의 손상을 주는 경우가 생기기 때문에 이를 최대한 보완하여 개발된 장치를 이용하는 것이 좋으며, 시료의 위치는 되도록이면 양전극을 피하도록 함으로써 이온이나 전자에 의한 손상을 줄일 수 있다. 다. 적당한 피막 형성 필요 이상으로 두터운 피막은 시료의 요철부위를 덮게 되어 관찰에 문제가 있다. 반면에 얇은 피막은 여분의 전자가 축적되고 전자의 방전현상이 발생하 여 깨끗한 상을 얻기가 어렵다. 6. 참고 문 헌 가. 日 本 電 子 顯 微 鏡 學 會 (1982). 電 子 顯 微 鏡 觀 察 法, 丸 善 株 式 會 社 나. 전자현미경 직무연수, 서울 초중등 생물미세구조교육연구회, 2004 다. 전자현미경 심화과정, 서울 초중등 생물미세구조교육연구회,

40 Memo

41 S E M 실 습 Ⅰ 숭문 고등 학교 교사 윤 태 영 1. 목표 전처리가 완료된 시료를 전자현미경을 통해 관찰할 수 있도록 기본 기기조작 법을 배운다. 또한 기기 사용법을 숙련시켜 미세구조를 이해하고 나노 과학에 서 과학적으로 응용할 수 있도록 노력한다. 2. 원리 텅스텐 필라멘트에서 나오는 전자빔을 내려받아 자석렌즈를 통해 확산 및 굴 절시켜 시료를 비춘다. 시료를 맞고 튕겨져 나온 2차 전자빔을 검지관에서 검 지해 영상신호로 바꿔준다. 영상신호로 바뀐 시료 사진은 모니터를 통해 관찰 하게 되고 초점 및 Contrast를 맞춘 사진은 최종 컴퓨터 파일로 저장한다. 3. 준 비 물 SEM, Stub holder, 시료 교체봉, 육각렌치, USB 메모리 스틱 또는 외장형하 드 같은 컴퓨터 파일 저장장치 4. 유 의 점 시료 교체 시에는 반드시 Stub holder Z축 높이를 최대한 낮춰 교체해줘야 한다. BSI(후방산란전자) 센서가 바로 전자총 하단 10mm에 붙어 있어 시료 교체 시 이 센서를 건들이면 고장을 일으켜 교체해줘야 한다. 고가의 센서이 므로 주의하도록 한다

42 5. 과정 및 방 법 가. 기기 가동 SEM 전원키를 오른쪽으로 돌려 "ON" 시킨다 이때 진공펌프가 가동되면서 경통내 진공도를 맞추고 컴퓨터 본체에 전원을 공급해줌으로써 기기를 STAND BY 상태로 만들어 준다. 우측 하단부의 SEM 전용 프로그램 운영 컴퓨터 전원을 켜준다. 나. 시료준비 이온코팅까지 전처리가 끝난 Stub 시료를 Stub holder에 육각렌치로 조여 고정한다. 고정된 St ub ho lder를 시료주 입봉에 사진 과 같이 나사선으로 봉을 돌려 고정한다

43 다. 컴퓨터 SEM MAIN MENU 프로그램 가동 SEM 조작용 프로그램 SEM MAIN MENU" 프로그램을 바탕화면에서 더블 클릭으로 가동시킨다 사진과 같은 화면이 뜨면서 가동상태까 지 약간의 시간이 걸린다. 운영 프로그램이 가동되어 STAND BY 상태 라. 시료주입 및 사진 촬영 마. SEM 촬영을 마칠때 프로그램 우측 상단의 HT" 버튼을 눌러 필라멘트를 OFF" 시킨다. 주 의 시료 높이에 따른 BSI(후방산란전자) 감지기의 손상을 막기 위해 반드시 Z 축을 최대한 낮춰 시료를 꺼낸다. 시료 주입시와 마찬가지로 Sample"

44 버튼을 눌러 Evac 상태로 만들고 주입봉을 넣어 시료를 꺼낸다. Computer 프로그램을 off"시키고 전 원을 끈다. SEM 키박스에 있는 열쇠를 시계반대 방향으로 최대한 돌려 전원을 끈다. 6. 결과 및 해 석 SEM의 촬영은 앉아서 좋은 상을 많이 찾아보는 것이 중요하다. 초점이나 Contrast조정이 광학현미경에 비해 많이 민감하기에 많은 조작만이 훌륭한 사 진을 얻을 수 있다. 새로 전시관에 도입된 SEM으로는 다양한 레포팅을 할 수 있는 레포트 문서 프로그램도 있으니 많이 활용해 본다. 7. 참고 JEOL 6390LV INSTRUCTION MANUAL, Printed in japan JEOL

45 디 지 털 현 미 경 서울신 도 림 초 등 학교 교사 고희 진 1. 디 지 털 현 미 경 을 수 업 에 활 용 하 면 좋 은 점 가. 여러 사람의 동시 관찰이 가능하다. 1) 기존의 현미경은 접안렌즈를 통해 개인적인 관찰만이 가능했지만, 디지 털 현미경은 현미경과 PC를 USB로 연결하여 모니터에 이미지를 보여줌으로 서 여러 사람의 동시 관찰이 가능하다. 2) PC와 프로젝션 TV, 프로젝터 등을 연결하면 더 많은 사람의 동시 관찰 이 가능하다. 나. 디지털화된 이미지를 수업에 활용할 수 있다. 1) 디지털 현미경은 소프트웨어를 이용하여 관찰한 영상을 캡쳐하여 사진 또는 동영상으로 저장할 수 있다. 2) 디지털화된 이미지는 사용 소프트웨어에 의해서 쉽고 빠르게 저장, 삭제, 편집이 가능하며, 캡춰된 이미지들은 다양한 포맷(JPEG, BMP, TIFF)으로 저 장이 가능하며 또한 동영상(AVI, MPEG)으로도 저장할 수 있다. 다. 현미경으로 시료를 관찰하면서 동시에 길이, 면적, 각도 등을 측정할 수 있다. 또한 그 정보를 이미지와 함께 저장할 수 있다. [그림 1] 시료(짚신벌레)를 관찰하면서 길이를 측정하고 길이 정보를 이미지와 함께 저장한 경우

46 2. 준 비 물 가. 디지털 현미경, 관련 소프트웨어가 설치된 PC, 디지털 현미경 용 USB 케이블 나. 실험 기구 : 홀슬라이드글라스, 슬라이드글라스, 커버글라스, 스포이트(또 는 혈청 분리관), 비커, 핀셋, 면봉, 거름종이 다. 관찰 시료 : 물벼룩, 짚신벌레 등 라. 시약 : 메틸셀룰로오스 용액 3. 시료 제 작 및 관 찰 방 법 가. 디지털 현미경의 사용법은 프레파라트 준비와 초점 맞추기 등 광학현미 경의 사용법과 동일하다. 관찰하고자 하는 시료의 프레파라트를 만들어 디지 털 현미경의 대물대에 올려놓고, 초점을 맞춰 관찰하면 된다. 나. 물벼룩 등과 같이 움직이는 미생물의 경우 메틸셀룰로오스 용액을 면봉 에 묻혀 홀슬라이드글라스의 홀에 작은 원을 그리고, 그 안쪽에 생물 시료를 놓아 활동을 제한하여야 관찰이 용이하다. 다. 움직이는 미생물의 경우 접안렌즈나 PC 모니터로 보이는 범위를 벗어나 면서 활동하는 경우가 있다. 이 경우, 조절 나사를 이용하여 프레파라트를 앞, 뒤, 좌, 우로 조금씩 이동시키면서 관찰한다. 미생물의 위치를 맞춘 후엔 다시 미동나사를 이용하여 초점을 맞추어 관찰한다. 4. 디 지 털 현 미 경 을 활 용 한 사 진 자 료 제 작 과정 및 방 법 가. 디지털 현미경 시작하기 : 바탕화면에 있는 Motic 프로그램 아이콘(또는 광학현미경 바로가기, Motics Image Plus 등)을 클릭하여 프로그램을 실행시 킨다. (디지털 현미경의 기종에 따라 관련 프로그램은 달라질 수 있으며, 이미 지 프로그램의 버전에 따라 바로가기 아이콘은 달라질 수 있음.) Motic Images Plus 2.0.lnk

47 나. 현미경의 영상 보기 : [파일]메뉴의 [캡처 창]을 클릭하면 캡처창(Motic DS Capture)이 열리면서 현재 현미경에서 보고 있는 영상이 나타난다. 다. 영상 조절하기 : 캡처창(Motic DS Capture)의 [옵션] 메뉴에서 [비디오 저장 필터]를 선택하면 [등록정보 창]이 뜨면서 현재 보이는 영상의 밝기, 명 암, 색상, 채도, 선명도, 노출 등을 수정할 수 있다

48 라. 정지 이미지 캡처하기 : 캡처창((Motic DS Capture)의 [캡처] 메뉴에서 [정지 이미지]를 클릭하면, 프로그램의 맨 오른쪽에, 클릭한 순간의 정지 영상 이 나타난다. 마. 정지 이미지 불러와서 수정하기 : 정지 영상을 캡처한 것(프로그램 맨 오 른쪽에 나타난 사진)을 클릭하면, 그 영상이 화면 전체에 나타난다. 이때 사진 아래 왼쪽의 색칠, 텍스트, 측정 등의 메뉴나, 사진 위쪽의 메뉴 중에서 [측정] 또는 단축메뉴들을 이용하면 사진을 수정하거나 길이 등을 측정할 수 있다. (다음의 바. 길이 측정하기 참고)

49 바. 길이 측정하기 : 사진 아래 왼쪽의 [측정]에서 현재 대물렌즈의 배율과 길이의 단위를 선택한 후, 사진 위쪽의 메뉴 중에 [측정]의 [선], 또는 단축메 뉴 [선]을 클릭한 다음 사진에서 길이 측정을 원하는 곳에 마우스를 클릭하고 드래그하면 선택한 선의 실제 길이가 나타난다. 프로그램의 위쪽에 있는 단축 메뉴들 중에서 측정과 관련된 단축 메뉴들(선, 직사각형, 원 등)을 이용하면, 같은 방법으로 길이뿐만 아니라 면적 등도 구할 수 있다. 또한 사진 아래쪽의 [텍스트]메뉴를 이용하면 원하는 위치에 글자를 입 력할 수 있다

50 사. 사진 저장하기 : 사진의 수정을 마친 후, [파일]메뉴의 [다른이름으로 저 장]을 눌러 원하는 위치에 파일을 저장한다. 이때 jpeg등 원하는 파일 형식도 지정하여 저장한다. ( 저장 을 누를 경우에는 하드디스크의 Motic images plus 프로그램 관련 폴더의 Capture folder" 위치에 sfc 형식으로 저장된다.) 5. 디 지 털 현 미 경 을 활 용 한 동영 상 자 료 제 작 과정 및 방 법 가. 동영상 캡처 준비 : 정지 사진을 찍을 때와 마찬가지로 [파일]메뉴의 [캡 처 창]을 클릭하여 현재 현미경에서 보고 있는 영상을 연결한 후, [옵션] - [비디오 저장 필터]를 이용하여 색상, 채도 등을 조절한다. [옵션] - [비디오 저장 메뉴]에서 원하는 비디오 영상을 위해 촬영 속도와 출력 등을 수정할 수 도 있다. 나. 동영상 캡처하기 : 캡처창(Motic DS Capture)의 [캡처] 메뉴에서 [비디 오] - [시작]을 클릭하면, 캡처한 동영상 파일을 저장할 위치, 파일 이름을 지 정하는 Save as"창과 비디오 압축 형식을 지정하는 창이 나타난다. 지정이 끝남과 동시에 동영상 캡처가 시작된다. 다. 동영상 캡처 정지하기 : 캡처창((Motic DS Capture)의 [캡처] 메뉴에서

51 [비디오] - [정지]를 클릭하거나, 캡처창 왼쪽의 빨간 정지 버튼(을 클릭하면 동영상 캡처가 끝난다. 라. 동영상 확인하기 : 캡처창이나 프로그램 상으로는 캡처된 동영상이 보이 지 않는다. 동영상 캡처 직전에 지정한 파일 저장 위치에 지정한 이름으로 동 영상이 저장되어 있으므로, 그 파일을 찾아 확인한다

52 Memo

53 S E M 실 습 Ⅱ 숭문 고등 학교 교사 윤태 영 1. 목표 기존 전자현미경은 사진만 찍을 수 있었던 비교적 단순 구조였던 반면 최근 전자현미경은 BSI(후방산란전자)빔과 EDS(성분분석기)등의 다양한 부가기능 을 부가함으로 사용 용도를 많이 넓혔다. 시료의 사이즈를 잴 수 있는 기능 및 성분분석기(EDS)의 기능을 중점적으로 활용해본다. 2. 원리 각각의 원소들은 외부 에너지를 받게 되면 그 에너지 힘을 받아 전자파를 발 산하게 되는데 이 원리를 활용해 성분을 분석해 낸다. EDS 성분분석기는 핵 주위를 돌고 있는 전자가 최외각 전자 괘도에서 바로 전단계 전자괘도로 떨어질때 나는 에너지파를 분석해 성분을 알아내는 장비이 다. 3. 준 비 물 SEM,, EDS, 시료교체봉, 육각렌치, 레이져프린터, USB 메모리 스틱 또는 외 장형 하드 같은 컴퓨터 파일 저장장치, INCA프로그램 4. 유 의 점 시료 높이를 전자총으로 부터 반드시 10mm가 되도록 한다. EDS 센서가 바로 전자총 하단 10mm에 붙어 있어 이 부분에서만 성분분석이 가능하다. 그 외 높이에서는 성분 분석이 이뤄지지 않으니 주의토록 하자

54 5. 과정 및 방 법 가. EDS 가동 SEM 전원과 컴퓨터를 모두 ON"시키고 컴퓨터 바탕하면에 "INCA" 아이콘을 더블 클릭하면 왼편 사진과 같이 프로젝트명을 입력하라는 화면이 뜨게된다. 프로젝트명을 입력하고 세부 내용을 간략히 기술한다. 프로젝트명의 입력이 완료되었으면 화면 좌측편Navigator화면에서 Sample"단계를 클릭한다. 시료 Sample의 간략한 설명을 입력한다. Sample에 대한 입력이 끝났으면 Navigator 화면에서 다음단계 Site of interest"를 클릭 한다. 우측편 사진과 같이 화면창이 뜨고 화면창 상부에 빨간동그라미가 있다. 이 아이콘을 누르면 SEM 전자현미경 사진이 화면창에 뜨게 된다. 사진을 화면창으로 불러온 모습

55 나. 성분분석 Navigator 다음순서 Acquire spectra"를 클릭하면 왼편 사진과 같이 성분분석을 원하는 부위를 체크할 수 있도록 대기화면 이뜬다. 우측화면에 점,면등의 다양한 측정부를 지정 할수 있는 아이콘을 눌러 측정부위를 지정 해주면 1분에 걸쳐 시료 분석에 들어간다. 사진 아래쪽에 어느정도 분석이 끝난 성분 에 대해서는 원소기호를 피크점에 보여줘 어떤 성분이 시료에 있는지 쉽게 알수 있다. 1분에 걸쳐 성분분석을 마쳤으면 Navigator 다음 단계인 Confirm elements"단계를 클 릭한다. 성분분석한 시료의 성분을 주기율표에 나타 내주고 성분 영문명이 나타나 있다. Navigator 다음단계 Quant"를 클릭하여 성분 분석비를 차트와 수치로 다양하게 확인 할 수 있다

56 다. 결과 Report 작성 및 저장, 프로그램 끝내기 Navigator 다음순서 Report"를 클릭하면 왼편 사진과 같이 Report양식이 나오는데 다양한 Report양식이 있으므로 확인 후 결과보고에 유용한 양식을 활용토록 한다. Report양식은 Report가 떠 있는 화면창 위 Template" 스크롤바 아이콘을 눌러 선택 할수 있다. Report를 다 작성했으면 프로그램 화면 좌측상단 file"메뉴를 선택해 Save as.."를 선택하여 파일을 저장한다. 파일 저장이 끝났으면 모든 프로그램을 종료하고 컴퓨터를 끈다

57 6. 결과 및 해 석 EDS는 최소한 전자 L각 궤도에서 힘을 받아 K각으로 전자가 이동할 때 나오는 에너지를 측정하기 때문에 최외각전자가 K각 하나뿐인 수소나 헬륨 은 측정하지 못한다. 따라서 의학, 생물 분야에 서는 유기물 이 C, H, O 세가지 대표 원소로 구성 되어 있어 H(수소)의 구성 성분비가 많이 중요한데 이를 확인하지 못해 현재 이 E D S 측정기는 재 료분야 나노 과학에 서 많 이 활 용되고 있다. 7. 참고 JEOL 6390LV INSTRUCTION MANUAL, Printed in japan JEOL IN CA T ech nical M anual T M 231/11M ISS U E1 - O XF OR D Inst rument s

58 Memo

59 주 사 전 자 현 미 경 ( S E M ) 의 자 료 해 석 한 국 세포 형 태 연구소 윤철종 1. 학습 목표 관찰하고자 하는 대상을 전자현미경으로 고 분해능을 동반한 고배율로 관찰 하기 때문에 이에 대한 사전 학습이 필요하다. 먼저 관련 논문이나 참고 서적 을 읽고 전문가의 도움을 받는 것도 좋다. 필요하다면 광학현미경으로 표본을 관찰한 후 이를 바탕으로 주사전자현미경 화상을 분석하는 것이 순서이다. 2. 인 공산 물 표본 제작하는 과정에서 원치 않게 인공산물이 발생할 수 있다. 그리고 그 원인 이나 과정에 서 문제 를 찾 아 낼 수 있어 야 하 며 표본 제작 할 때 인공산 물 이 생기지 않도록 주의한다. 가. 표본 채취 1) 1차고정 할 때 표본을 살아 있을 때와 같은 신선한 상태가 아니고 변성되 었을 때 형태구조가 변한다. 2) 표본을 다룰 때 핀셋이 닿은 부위나 칼로 인한 표면에 흠집이 생길 수 있다. 3) 1차 고정 전이나 제작과정 중에 표본에 다른 이물질이나 먼지에 오염되었 을 때 관찰하기 어렵거나 이물질 부위를 피하기 어렵다. 나. 표본의 탈수 생물표본은 탈수 과정에서 수축된다. 임계점 건조는 사용한 액체의 표면장력 을 0 상태에서 건조가 되지만 심하게 수축되어 밀도 차이에 의한 변화된 표 면으로 균열이 생길 수 있다. 다. 이온금속피막 재료대(stub)에 부착할 때 관찰하고자 하는 방향이 잘못 설정되어 재료대에 부착되었을 경우와 전자가 접지(grounding)가 잘 되지 않았을 경우에 대전 (charge up)현상이 발생할 수 있다. 금(Au)이나 백금(Pt-Pd)피막을 입히면 본 래의 이미지 위에 얇은 두께 금속 막이 형성된다. 피막의 두께에 영향을 받고 각도에 따라 달라진다

60 라. 관찰할 때 주요 문제점 표본의 탈수가 완전히 이루어 지지 않아 금속피막이 입혀지지 않았을 때 전 자의 대전과 방전(discharge up)형상으로 이미지가 손상될 수 있다. 그리고 한 분위를 지속적으로 장시간 관찰하면 전자의 오염으로 주변과 다른 이미지가 발생한다. 특히 고배율로 관찰을 오래 하면 발생할 수 있다. 마. 화상 분석과정에서 오류 전자현미경과 관련 표본에 대한 사전 지식이 없어서 분석에서 잘못 오해하는 경우가 있다. 사전에 충분한 사전 지식이 필요하다. 관련 교재나 논문을 충분 히 숙지한 후 표본제작과 관찰을 한다면 시간절약과 원하는 좋은 이미지를 얻 을 수 있다. 경우에 따라서 관련분야의 전문가에게 도움이나 분석을 의뢰한다. 인터넷에 많은 자료가 올라와 있으므로 참고하는 것도 도움이 된다. 참고: 인터넷 검색(naver.com, google.com, yahoo.com)에서 key words: electron microscope, micrograph, photo gallery, technique 3. 분 해 능 향 상 을 위 한 방 법 가. 가속전압을 높인다. 그러나 장시간 관찰하면 관찰하는 표본에 전자에 의 한 손상을 줄 수 있다. 나. 표본과 작동거리(working distance, WD)를 가능한 짧게 한다. 상대적으 로 화상의 심도(depth)는 낮아진다. 다. 집속렌즈(condenser)를 크게 한다. 라. 비점수차(stigmatism)가 없도록 맞춘다. 고배율에서는 반드시 한다. 마. 대물조리개(objective aperture)를 작은 것을 선택한다. 그러나 전자가 통 과하는 양이 적어 화상이 어두워진다. 참고: 표본의 특성상 고분해능을 얻기 어려운 것이 있다. [그림1] 주사전자현미경 업무에서 발생할 수 있는 문제점

61 전자현미경 직무연수 주사전자현미경 자료 해석(1) [사진 1] 딱정벌레 [사진 2] 벼멸구 사진 3. 식물의 공변세포 사진 4. 비강의 섬모

62 전자현미경 직무연수 [사진 5] 들국화 꽃가루 사진 6] 사람의 지방세포 [사진 7] 사람의 혈구세포 [사진 8] 전구의 필라멘트

63 [사진 9] 초파리(Sugar fly) [사진 10] 초파리 머리 [사진 11] 진딧물 [사진 12] 짚신벌레

64 전자현미경 직무연수 주사전자현미경(SEM)과 투과전자현미경(TEM)의 자료 해석(2) [사진13] 소장 융모-주사전자현미경 [사진14] 소장 융모-투과전자현미경 4. 주사전자현미경 자료 해석 할 때 유의할 점 표본을 탈수하는 방법에 따라서 수축되는 양의 차이로 용적의 차이가 있다. 생물표본을 관찰할 때 실제 크기보다 작게 관찰되는 것은 탈수과정에서 물이 세포내에서 추출되기 때문이다. 그림 14. 탈수방법에 따른 표본 용적의 수축정도를 나타내는 그림

65 5. 주 사 전 자 현 미 경 과 투 과전 자 현 미 경 의 화상 비 교 투과전자현미경으로 관찰할 때는 입체구조를 상상하고 주사전자현미경으로 관찰할 때는 평면구조의 내부 구조를 생각해야 한다. 가능하다면 한 표본을 투과전자현미경과 주사전자현미경으로 관찰하면 보다 나은 이해를 도울 수 있 다. [그림15] 주사전자현미경은 주로 표본의 표면을 3차원적으로 관찰하며 투과전 자현미경은 내부(section)의 구조물을 2차원적으로 관찰한다

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67 2008년도 초등 전자현미경 직무연수 연수 안내 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 연수개요 1. 연수개요 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 연수목적 2. 연수목적 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 운영방침 3. 운영방침 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 교육과정 및 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 강사 4. 교육과정 및 강사 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 연수자 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 유의사항 5. 연수자 유의사항 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 교통 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 안내 6. 교통 안내 서 울특별시과학전시관

68 1. 연수 개요 초등 전자현미경 직무연수 연수 안내 교육연수부 가. 주 최 : 서울특별시교육청 나. 주 관 : 서울특별시과학전시관 다. 연수종별 및 시간 : 직무연수, 15시간 라. 연수 대상 : 초등교사 17명 마. 연수기간 및 장소 일시 : ( 월) ~ 5.22( 목) 시간 : 15 시 30 분~17 시 20 분( 월 : 3시간, 화~ 목 : 4시간) 장소 : 서울특별시과학전시관 전자현미경실 바. 개강식 및 등록 개강식 : (월) 15:20 서울특별시과학전시관 생물실험실Ⅱ(206호) 등 록 : (월) 15:00~15:20, 서울특별시과학전시관 생물실험실Ⅱ(206호) 2. 연수 목적 가. 전자현미경 및 주변기기 조작 방법, 활용, 시료 제작 기술의 습득을 통하 여 초등 교사들의 연구의욕을 고취시킨다. 나. 초등 교사들의 교과 전문성 확보 기회를 제공하고 연구 능력을 향상시켜 질 높 은 과학교육 활동이 이루어지도록 지원한다. 다. 초등 교사의 다양한 실험활동 자료 개발능력 및 탐구 지도역량 강화로 학력신장에 기여한다. 3. 운영 방침 가. 연수 대상자는 국 공 사립의 초등학교 교사로서 전자현미경 및 주변기 기의 조작과 활용능력을 습득하여 과학교육활성화에 기여하고자 하는 교사 를 선정한다. 나. 연수 결과에 대한 평가는 없으며, 개강식 외 12시간(연수 시간의 80%) 이상 출석하여야 수료할 수 있다

69 4. 교육과정 및 강사 교시 월일 1교시 2교시 3교시 4교시 15:30~16:20 16:30~17:20 17:30~18:20 18:30~19:20 5월 19 일 (월) 시료 채취 및 1차 고정 김기우 시료 2차 고정 김기우 5월 20 일 (화) 탈수 및 치환 정미숙 전자현미경의 원리 및 이용 윤철종 5월 21일 (수) 임계 점 건 조 조은부 임계 점 건 조 최승규 이온코팅 조은부 이온코팅 최승규 SEM실습Ⅰ 윤태영 디지털 현미경 Ⅰ 고희 진 5월 22일 (목) SEM실습 윤태 영 Ⅱ 디지털 현미경 Ⅱ 고희진 SEM 자료 해석 윤철종 5. 연수자 유의사항 가. 연수자는 연수 교재, 연수 안내, 필기도구를 휴대하고, 연수 기간 중 신 분증(공무원증 또는 주민등록증)을 지참한다. 나. 연수 개강일에는 15 : 20까지 생물실험실Ⅱ(206호) 입구에서 등록하고 입실한다. 다. 강의는 생물실험실Ⅱ(206호) 및 전자현미경실(208호)에서 진행된다. 라. 연수 기간 중 전자현미경실에서는 제반 안전사고 방지에 특별히 유의한다. 마. 연수 기간 중 결석, 지각, 조퇴 등이 공적으로 불가피할 경우에는 사전 에 연수 담당자에게 연락하고 공문으로 사유서를 제출한다

70 6. 교통 안내 가. 도보 : 지하철 2호선 낙성대역 4번 출구에서 15~20분정도 소요 나. 마을버스 02번 : 지하철 2호선 낙성대역 4번 출구 전방 30m 골목길 쪽 에서 마을버스 02번 승차 과학전시관앞 하차 다. 승용차를 이용하는 경우 요 일 제 전 자 태 그 부 착 차량 만 주 차가 가 능 합 니다 라. 전시관 약도