현미경의 종류와 기능

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다희 순
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1 현미경의종류와기능 광학현미경 (light microscope) 위상차현미경 (phase contrast microscope) 편광현미경 (polarizing microscope) 형광현미경 (fluorescence microscope) 투과전자현미경 (Transmission electron microscope) TEM 주사전자현미경 (Scanning electron microscope) SEM

2 광학현미경 (light microscope)

3 위상차현미경 (phase contrast microscope)

4 편광현미경 (polarizing microscope)

5 형광현미경 (fluorescence microscope)

6 투과전자현미경 (Transmission electron microscope) TEM 생물절편같은엷은시료를전자선 (electron beam) 을전자렌즈 (electron lens) 로확대하는현미경

7 주사전자현미경 (Scanning electron microscope) SEM 가는전자선을시료에조사하면시료로부터 2 차전자등이방출. 이전자프로브를음극선관 (CRT) 위에밝기의변화로서상을나타내는장치

8 1. 전자현미경검사 광학현미경 micron( μm ) 단위의크기내관찰기능, 미세구조관찰불가 전자현미경 분해능이수 nanometer(nm) 전자현미경은 filament, 즉음극선에서전자기방출 진공관속을통과 공기중의산소나질소원자와같은물체에충돌하지않고고속으로움직임 전자는음극선과코일에의해발생하는자장 (magnetic fields) 속을통과 전자의흐름은직선이며광선보다훨씬파장을가짐. 검체 ( 물체 ) 를통과한전자는최종적으로전자현미경의형광 screen이나감광판에나타남

9 전자현미경관찰용검체표본 초박절편 ( 두께 50~60nm) 으로제작 검경시고진공 (10-5 torr 이하 ) 상태에서관찰 검체의자가융해문제에더욱신경써야함 표본제작단계에서오염될수있는인공산물을최대한방지

10 광학현미경과전자현미경비교

11 TEM 과 SEM 의원리비교

12 투과전자현미경 (transmission electron microscope, TEM) 광학현미경과달리광선대신에전자선을이용 유리렌즈대신에철과코일로만든전자렌즈사용 전자선이고진공상태에서초미세박절편 (ultrathin) 에조사되면전자선이흡수, 산단, 투과되어형광판에맺힌상을관찰 초미세박절편은염료가아닌중금속을침투시켜흑백의콘트라스트를높여줘야함 분해능 0.2~0.3nm

13 투과전자현미경표본제작순서 시료의채취와세절 (removal of specimen and sticing) 시료위에전고정액을적셔즉시 1 mm3크기로세절 전고정과수세 (prefixation and washing) 4 의 2.5% glutaldehyde(ph 7.4) 에고정후완충액으로수세 후고정과수세 (postfixation and washing) 4 의 1.0% Osmium tetroxide(ph 7.4) 에고정후완충액으로수세 탈수 (dehydration) 하강계열알코올 (50 100%) 치환 (substitution) propylene oxide, 15 분 ( 실온, 교반 ) 침투 (infiltration) propylene oxide/epon(1:1), (1:2) 2 회, 각 30 분 ( 실온, 교반 ) 포매 (embedding) epon mixture, 35,45,60 삭정 (trimming) 이등변사다리꼴 준초박절 (semithin sectioning) 1 μm, 유리슬라이드위에부착, toluidine blue 염색및광학현미경관찰 초미세박절 (ultrathin sectioning) 50~60 nm, grid mesh 위에부착 전자염색 (electron staining) uranyl acetate 와 lead citrate 이중염색 - 관찰 (observation)- 사진제작 (photography) 판독 (interpretation)

14 투과현미경표본제작과정

15 투과현미경표본제작과정

16 시료채취및세절 전자현미경용시료 ; 채취후신속히처리하여인공산물없이세포가온전하게보존된시료이여야함 시료채취후고정까지시간을가능한 1~2분이내로 고정액은얼음으로채운 petri dish내에냉각하여두고고정액을시료위에떨어뜨려가면서건조방지 세절용면도날을 2개준비하여 acetone을충분히탈지후고무판이나파라핀위에서조직을각각반대방향으로당기면서 1mm3이하로작게세절 세절시필요이상의힘이조직에가해지지않게주의 조직에따라서관류 (perfusion) 또는침수 (immersion) 하여고정한후세절하기도함 (3) 고정 약 1 mm3크기로세절한시료를목적에따라각종고정액에고정 Glutaraldehyde 등의전고정액에넣을경우 5 mm3정도의크기로잘라일단 20~30 분간고정후 1 mm3크기로다시세절 ( 그림 24-3)

17 조직편의고정과정

18 전고정 (Prefixation) Glutaraldehyde[(CHO(CH2)CHO)], paraformaldehyde[(ch2o)2], formaldehyde[hcho] 등의알데하이드계고정제가흔히전고정액으로이용 0.1M phosphate buffer 또는 0.1M cacodylate buffer 에녹여 ph 7.2~7.4 로조정 2.5% glutaraldehyde 를가장많이이용 10 ml정도의병에담아 4 에서 2~3 시간고정

19 후고정 (postfixation) 2.5% glutaraldehyde 전고정후 동일완충액으로 2~3 회수세후 1% osmium tetroxide(os4) 에 O 옮겨 4 에서 1~2 시간고정후 동일완충액으로수세후다음단계로이동 OsO4 자극적냄새, 유독눈이나코점막손상 hood 장치하에취급, 피부접촉금지, 비닐장갑착용 만일 10% 포르말린에고정된시료를전자현미경표본제작에이용할경우 1 mm3이하로세절하여하룻밤수세후 OsO 넣어약간깊게흑갈색을될때까지재고정 조직보존을위해서고정액을교반하면서고정하는것이좋음 고정액의 ph, 삼투압을적정하게유지 지나친고정 세포의미세구조에인공적변화발생

20 탈수와치환 고정이끝난시료 완충액으로수세후 시료내침투되어있는수분과고정제를탈수제로치환하여제거 탈수제 (ex: ethanol, acetone) 는조직변화방지를위해저농도 고농도로이동 탈수후수지포매를위해 propylene oxide 로치환 50% alcohol(5 분 ) 60% alcohol(5 분 ) 70% alcohol(5 분 ) 80% alcohol(5 분 ) 90% alcohol(5 분 ) 95% alcohol(10 분 ) 100% alcohol 30 분 (1 단계 5 분, 2 단계 10 분, 3 단계 15 분 ) absolute ethanolpropylene oxide 동량혼합액 (15 분 ) propylene oxide I(10 분 ) propylene oxide II(10 분 ) * 위의과정을 EM 자동침투기로실행시 탈수, 치환과정에서발생할수있는인공산물을최소화하는데효과적

21 포매와중합 1 포매제로비수용성의에폭시수지 (eposy resin), 폴리스텔렌수지 (polystulen resin), 스틸렌수지 (stylene resin) 이용 주로에폭시수지이용 에폭시수지 중합후수축이적고기포가생기지않으며경화가일정하게진행되어전자선에대해강함 에폭시혼합액사용 ( 표 24-1); 교재 p453 참고 A 액은연하고, B 액은경함, 온도조건에따라 A 액과 B 액에조절하여사용. 여름철에는오래된것은갈색을띄며점도가높고기포도잘안없어짐

22 포매와중합 2 1 포매 (embedding) 치환이끝난조직을 propylene oxide + epon 혼합액 (1:1) (2 시 ) propylene oxide + epon 혼합액 (1:2) (overnight) epon 혼합액 (2~3 시간 ) 에침투시킨후, 시료병을여지나신문지위에부어조직에묻어있는에폰을제거한다음, gelatin capsule, beem capsule, 실리콘포매판 (silicon embedding mold) 을이용하여포매한다 (P 454 그림참고 ) 2 중합 (polymerization) 조직편이가라앉고 labeling 이끝난뒤중합오븐기 (polymerization oven) 에넣고다음과같은순서로온도와시간을조절하여중합 * 60 에서오랜시간방치시 epon 수지가너무딱딱해지므로시간을지키고, 보존하거나너무경하면 50 정도에넣어둠

23 [ 포매중주의사항 ] A. Epon 혼합이얼마안된저장액을황색을띄며점도가낮아 기포가있어도곧없어지나, 오래된것은 갈색을띄며점도가높고기포도잘안없어짐 B. 포매시실온은 20~26, 습도는 50% 이하의포매 room 이 있으면바람직 C. Epon812, DDSA, NMA, DMP-30 은 desicator 에보관하면서사용. DMP-30 은오염이잘되므로사용이 오래된것이나변색된것은폐기 D. 포매제가묻은유리기구는 acetone 이있는용기에넣어 2~3 일 방치후 chrome sulfate 가함유된세정용액에담근후수돗물로충분히씻고, 증류수로다시씻고건조시켜사용

24 박절 (CUTTING) 포매와중합이끝난시료를 50~60nm 두께로초미세박절 1 도구 a. 유리칼 ( 칼날의각도 45 ) b. 다이아몬드칼 : 고가, 널리사용, 각도는 40~60 ( 약 54 정도 ) c. 미세박절기 d. 그리드 (mesh grid) : 초박절된절편을올려놓는것으로, 파라핀절편을 유리슬라이드에부착시키는것과같은역할 ( 그림 24-13)

25 Cupper Grid mesh

26 박절실기 block trimming 박절면이노출되도록여분의수지를실체현미경하에서면도날이나전용삭정기를사용하여사다리꼴이되도록함 ( 그림 )

27 박절실기 b. 블록과칼의고정 블록을앞면이 3~5mm 정도나오게고정 시료면의한변이칼날에평행하게되도록조정한후칼을단단히고정 틈의각은 5 전후 모세관피펫을사용하여물받이내에증류수를주입하여수면이시료와평행하도록채움

28 박절실기

29 초박절기 (ultramicrotome)

30 Diamond Knife

31 Diamond Knife cutting

32 박절실기

33 Ultra structure-tem

34 EM- 검경가능범위

35 Kidney

36 Ultra section c. 초미세박절 t 칼과시료를접근시켜자르기시작 절편이연속적으로박절되어물받이수면위로부유 이중일부절편을준초박절편 (semithin section) 용으로슬라이드에취에 oluidine blue로염색하여광학현미경으로관찰 광학현미경관찰후필요에따라다시불록을삭정한다음절편의색이회색 ~ 은색또는금색을띤은색이되도록약 100nm 이내로초미세박절편을제작 ( 표 24-2) 손상되지않고깨끗하게박절된절편만을가는털이달린막대로모아그리드위에올린다. 그리드는시계핀셋 (tweezer) 으로조심스럽게잡아절편을떠올린다. 그리드에묻어있는수분은여과지위에서건조시킨후검경

37 표 절편의두께에따른간섭색

38 Ultra staining [Uranyl acetate 용액 ] Absolute ethanol 25 ml + uranyl acetate 1.5g * 갈색병에넣어하룻밤방치하여용해시키면형광을띤황색용액이됨 냉암소보관시 1 개월간사용가능 * 이염색액은열또는빛에분해되기쉬우므로갈색병에넣고밀봉하여실온보관 냉장보관시더오래사용가능

39 Ultra staining [Lead citrate 용액 ] Lead citrate 1.33g + sodium citrate 1.76g + 증류수 30 ml 30 분간교반기에진탕하여녹임 완전용액후신선한 1N NaOH 8 ml를가하여 ( 젖빛색용액이 ntorxn 명 ) ph12 로조절후잘밀폐되용기에담아냉암소보관 (2~3 개얼간사용가능 )

40 Ultra staining method < 염색방법 > Petri dish 내에파라필름을깔고그위에주사기나모세관피펫을이용하여 uranyl acetate 용액을직경 5mm 정도떨어뜨린다. 초미세박절편이놓여있는면이밑을향하게하여그리드를 uranyl acetate 액위에부유시켜 15~30 분간염색 시계핀셋으로그리드를잡고비이커위에서증류수로 30 초 ~1 분간, 40~50 회수세 여과지에그리드의물기를흡수시켜건조 검경 Lead citrate 염색법도위와동일 ; 단염색시공기중의 ( 혹은호흡으로인한 ) 탄산가스와결합하여 lead carbonate 침전물이생기지않게페트리접시내에 NaOH 를깔고탄산을흡착시킴

41 Ultra staining method

42 주사전자현미경 (Scanning electron microscope) SEM 주로시료표면의 3 차원미세형태를조사할때사용

44 SEM image

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TEM 시료제작 박창현 ( 고려대학교의과대학 ) I. 조직채취 (Sampling) 1. TEM 조직이든 SEM 조직이든가급적작게체취하는것이좋다. 특히 TEM 에서는 1x1x1mm 정도로작게하는것이좋다. 2. 방향성이요구되는경우에는 1x1x2mm 정도로한쪽방향을약간길게하

TEM 시료제작 박창현 ( 고려대학교의과대학 ) I. 조직채취 (Sampling) 1. TEM 조직이든 SEM 조직이든가급적작게체취하는것이좋다. 특히 TEM 에서는 1x1x1mm 정도로작게하는것이좋다. 2. 방향성이요구되는경우에는 1x1x2mm 정도로한쪽방향을약간길게하여야후에 embedding 과정에서포매하기가용이하여진다. (skin, nerve등 ) 3.