보안과제( ), 일반과제( o ) 미래기반기술개발 암표적성 AAV 벡터시스템개발 Development of cancer-targeting AAV vector 단국대학교산학협력단 한국연구재단

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1 암표적성 AAV 벡터시스템개발 Development of cancer-targeting AAV vector 주관연구기관 연구책임자 단국대학교산학협력단 정선주 발행년월 주관부처 사업관리기관 NDSL URL 교육과학기술부 한국연구재단 IP/ID 이용시간 2018/05/19 15:43:38 저작권안내 1 NDSL 에서제공하는모든저작물의저작권은원저작자에게있으며, KISTI 는복제 / 배포 / 전송권을확보하고있습니다. 2 NDSL 에서제공하는콘텐츠를상업적및기타영리목적으로복제 / 배포 / 전송할경우사전에 KISTI 의허락을받아야합니다. 3 NDSL 에서제공하는콘텐츠를보도, 비평, 교육, 연구등을위하여정당한범위안에서공정한관행에합치되게인용할수있습니다. 4 NDSL 에서제공하는콘텐츠를무단복제, 전송, 배포기타저작권법에위반되는방법으로이용할경우저작권법제 136 조에따라 5 년이하의징역또는 5 천만원이하의벌금에처해질수있습니다.

2 보안과제( ), 일반과제( o ) 미래기반기술개발 암표적성 AAV 벡터시스템개발 Development of cancer-targeting AAV vector 단국대학교산학협력단 한국연구재단

3 편집순서 2 제출문 제출문 교육과학기술부장관귀하 이보고서를 " 암표적성 AAV 벡터시스템개발 " 에관한연구의보고서로제출합니다 주관연구기관명 : 단국대학교산학협력단 ( 직인 ) 주관연구책임자 : 정선주 ( 인 ) 연구원 : 이희란 " : 박기랑 1

4 편집순서 3 보고서요약서 과제고유번호 연구사업명 연구과제명 해당단계 연구기간 중사업명미래기반기술개발사업 세부사업명유전자치료기술개발사업 대과제명 연구책임자정선주 연구기관명및 소속부서명 세부과제명암표적성 AAV 벡터시스템개발 단국대학교 분자생물학과 해당단계 참여 연구원수 총연구기간 참여 연구원수 총 : 11 명 내부 : 3 명 외부 : 8 명 총 : 내부 : 외부 : 명 명 명 참여기업명 단계구분 (2 단계 )/ ( 총 3 단계 ) 해당단계 연구비 총연구비 국제공동연구상대국명 : 상대국연구기관명 : 위탁연구연구기관명 : 연구책임자 : 정부 : 천원 기업 : 천원 계 : 천원 정부 : 천원 기업 : 천원 계 : 천원 요약 ( 연구결과를중심으로개조식 500 자이내 ) 보고서면수 105 고효율 무독성 타겟형의유전자전달체바이러스벡터를개발을위하여우선파아지라이브러리를이용한암조직표적용펩타이드후보도출을통해뇌암및폐암에특히특이적으로작동할것으로예상되는펩타이드를확보하였다. 암조직표적용펩타이드가장착된 AAV 기반벡터는성공적으로개발되었고 sc39tk 를치료유전자로, 또한항암제로개발중인 SAHA 와의동시처치로타겟형 AAV 벡터의유전자발현효율을증대와함께개선된항종양효능을유도능을확인하였다. 본연구를통해개발한암조직특이적발현프로모터의유용성도 AAV 에장착하여암특이적유전자전달을생체수준에서도확보하였다. 나아가 AAV 생산기반구축및바이러스생산 master 세포주확보를위한기반도정립하였다. 본연구를통해개발된암표적용펩타이드는암특이적진단및치료법개발에적극활용될수있을것이다. 또한 AAV 벡터는장기적치료효과를요하는경우보다특히적극활용될수있을것이다. 색인어 ( 각 5 개이상 ) 한글 영어 재조합아데노부속바이러스, 암조직특이적타겟형, 고효율감염, 무독성유전자전달체벡터, 항암유전자치료기술 recombinant adeno-associated virus, cancer-specific target, highly efficient transduction, safe gene delivery vector, anticancer gene therapy 2

5 편집순서 4 요약문 Ⅰ. 제목 암표적성 AAV 벡터시스템개발 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성암치료용으로이상적인벡터, 즉고효율 무독성 타겟형의유전자전달체바이러스벡터를개발하는것으로 1단계연구결과확보한암조직표적용펩타이드와암세포특이적프로모터를장착한 raav 벡터를활용한 dual targeting system을확대하고그효능을검증하고자한다. Ⅲ. 연구개발의내용및범위 - 최적화된 transductional retargeting을유도하는바이러스벡터를개발한다. - transductional targeting펩타이드와암조직특이적 transcriptional targeting 프로모터를 AAV에접목하여 dual targeting AAV 벡터를개발한다. - 개발한벡터에치료용유전자를삽입하여항암효능을확인하고자한다. Ⅳ. 연구개발결과 - 암표적화펩타이드의개발및최적화 : 파아지라이브러리를이용도출해된암표적용펩타이드의효능최적화를통해뇌암및폐암에특히특이적으로작동할것으로예상되는펩타이드개발을완료하였다. - 최적화된 transductional retargeting을유도하는바이러스벡터개발 : AAV의캡시트단백의돌연변이형유도를통해암특이적바이러스들을성공적으로제작할수있었고, 추가적인돌연변이유도로개선된유전자전달능이확보된 AAV 벡터를개발할수있었다. - 암조직특이적 transcriptional targeting 프로모터를 AAV에접목하여 dual targeting AAV 벡터를개발하였다. - 개발한벡터에치료용유전자를삽입하여항암효능을확인 : sc39tk 3

6 를치료유전자로, 또한항암제로개발중인 SAHA와의동시처치로타겟형 AAV 벡터의유전자발현효율을증대와함께개선된항종양효능을유도능을확인하였다. - 나아가 AAV 생산기반구축및바이러스생산 master 세포주확보를위한기반도정립하였다. Ⅴ. 연구개발결과의활용계획 - 암표적용 AAV 벡터에장기적으로치료유전자를발현하는유전자전달체로활용하고자한다. - 다수의암치료법과병합하여암선택적유전자치료제의작용을도모하는기반기술이될수있다. - 암세포특이적전달에따라치료효과를극대화시키고항암제독성을낮추는방법이될수있다. 4

7 편집순서 5 S U M M A R Y Ⅰ. Title Development of cancer-targeting AAV vector Ⅱ. Purpose Evaluation and confirmation of ideal vector system for efficient cancer targeting gene delivery vehicle with the previously identified dual targeting elements. Ⅲ. Scope - Optimization of transductional targeting vector to tumor - Test of cancer therapeutic efficacy of transcriptional targeting vector - Development of cancer therapeutic vector Ⅳ. Results - Optimization and development of tumor-targeting peptides : Using phage-library, tumor-specific peptides, particulary to brain or lung cancer, were developed. - Development of transductionaly targeting vector to tumor: By generating various mutations on AAV capsid, transductional retargeting AAV were successfully generated and tumor-targeting gene expression and anti-tumoral effects were further optimized by additional mutations on AAV capsid. - Dual targeting AAV vector encoding both transductional and transcriptional targeting motif were generated. - Enhanced anti-tumoral effects were obtained by encoding sc39tk as therapeutic gene, in combination with chemotherapeutic agent, SAHA. - We further established AAV production method and mast cell for AAV production 5

8 Ⅴ. Applications - Various genetically-modified viral vectors can be utilized as gene delivery tools to preferentially transduce human cancer 6

9 편집순서 6 C O N T E N T S Chapter 1. Overview Chapter 2. Current Status Chapter 3. Results Chapter 4. Achievements Chapter 5. Future Perspectives Chapter 6. Leading Edge Technologies and Information Chapter 7. References 7

10 편집순서 7 목 차 제 1 장연구개발과제의개요 * 연구개발의목적, 필요성및범위등을기술 제 2 장국내외기술개발현황 * 국내 외관련분야에대한기술개발현황과연구결과가국내 외기술개발현황에서 차지하는위치등을기술 제 3 장연구개발수행내용및결과 * 이론적, 실험적접근방법, 연구내용, 연구결과를기술 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 * 연도별연구목표및평가착안점에입각한연구개발목표의달성도및관련분야의 기술발전에의기여도등을기술 제 5 장연구개발결과의활용계획 * 추가연구의필요성, 타연구에의응용, 기업화추진방안을기술 * 연구기획사업등사업별특성에따라목차는변경가능함 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 제 7 장참고문헌 * 보고서작성시인용된모든참고문헌을열거한다 8

11 편집순서 8 본문작성요령 1. 본문의순서는장, 절, 1, 가, (1), ( 가 ), 1, 가, 등으로하고, - 장은 17 포인트고딕계열 - 절은 15 포인트명조계열 - 본문은 11 포인트명조계열로한다. 단, 본문의내용중중요부문은고딕계열을사용할수있다. 2. 장은원칙적으로페이지를바꾸어시작한다. 3. 본문은 11 포인트횡으로작성한다. 4. 페이지번호는하단중앙끝에 11 포인트로한다. 5. 각주는해당페이지하단에 8 포인트활자로표기하며, 본문과구분토록한다. 6. 페이지수는편집순서 2 의제출문부터시작한다. 단, 삽입물이있을때는그삽입물의크기에불문하고 1 면을한페이지로하 여일련번호를붙인다. 7. 한글, 한문, 영문을혼용한다. 8. 뒷면지에주의문을넣는다. 9. 참고문헌 (reference) 인용의경우본문중에사용처를반드시표시한다. 9

12 제 1 장연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의목적및필요성 1. 연구개발의목적 항암유전자를독성없이질환부위로전달할수있는유전자전달체개발이필수적이므로, 암세포만을특이적으로인지하도록유전자전달체를표적화하고자한다. 본연구에서는이상적인유전자전달체요건을만족시키는재조합아데노부속바이러스 (recombinant adeno-associated virus; raav) 벡터를이용하여무독성, 고효율, 타겟형암치료용유전자전달체벡터를개발하고항암특이적효능을검증하는것을목표로한다. 2. 연구개발의필요성 가. 기술적측면항암유전자치료제개발의한계는항암제의효율적인전달법이다. 특히유전자전달체바이러스는바이러스특유의트로피즘에따라특정조직에만감염할가능성이있어, 정상조직의세포에감염하여독성을나타내는부작용이있다. 암표적화는유전자전달체벡터의특이성을높이는방법으로바이러스가암세포에결합하고감염하는효율을증가시킨다. 암세포만선택적으로공격하는바이러스로서정상세포에대한세포독성이없는효율적인무독성표적화바이러스가될것이다. 나. 경제 산업적측면항암유전자치료법의가장심각한문제는높은독성과비특이적전달이므로무독성고효율바이러스의개발이시급하다. 또한암조직의일차적인제거에도불구하고암세포가전이되어암이재발되는경우치료가더욱어렵기때문에이를조기에차단하는효율적인암세포표적화방법이시급히개발되어야한다. 암환자치료에드는막대한사회적비용을감안할때경제산업적손실을막는유일한방법은무독성표적화항암전달체의개발이다. 다. 사회 문화적측면현재암환자의숫자는사회적문화적으로큰문제가될만큼많다. 그러므로암의치료법은다양한방법으로개발되었고이를위한사회적인투자도막대하나, 대부분의항암치료제는그효능에비하여부작용및전이에따른재발등, 사회적 10

13 문화적인문제점을내포하고있다. 항암유전자치료제의개발은미래항암치료법 의새장을여는중요한사건이될것이며그중에서도독성이없는효율적인항암 제개발에는유전자치료제의표적화방법의개발이가장시급하다. 제 2 절연구개발의범위 1. 암표적화 transductional targeting 벡터의최적화 본연구팀은 1단계연구결과암세포및암조직에과다발현된단백질을표적으로하여이에특이적으로결합하는펩타이드서열을확보하였다. 2단계연구에서는펩타이드의암표적화효율을상승시키고 AAV의감염효율성을증대시키는최적화된초소형앱타머로개발하고자한다. 또한암조직타겟형펩타이드를삽입한 transductional retargeting AAV 벡터를개발하여최적화된 transductional retargeting 을유도하는바이러스벡터를개발하고자한다. 2. Dual targeting A A V 벡터의확보 1단계연구결과획득한 transductional targeting 펩타이드와암조직특이적 transcriptional targeting 프로모터를이용하여 dual targeting AAV 벡터를개발하고자한다. 이벡터의 in vivo에서의암조직특이적감염성및프로모터활성을확인하고자한다. 또한개발한벡터를임상실험에적용하기위하여대량생산을위한기반기술을마련하고생산화를준비할예정이다. 3. 개발한벡터에치료용유전자장착 1 단계연구결과선정한 AAV2 와 AAV5 벡터에 dual targeting 을위한변형을유 도하고이벡터에치료용유전자를삽입하여항암효능을확인하고자한다. 치료용 유전자로는 Anti-angiogenic gene 과 Anti-tumorigenic aptamer 를활용할예정이다. 11

14 제 2 장국내외기술개발현황 제 1 절국내 외관련분야에대한기술개발현황 1. 국외암세포표적화기술방법 유전자치료제의개발과정에서효율적인바이러스의개발은암조직의종류에따른바이러스트로피즘을증가시키기위한목적으로많은연구가수행되고있다. 특히파아지발현펩타이드를 in vitro에서활용하여암특이적표적화서열을발굴하거나 in vivo로주사하여 organ specific 하거나 cancer site specific 한펩타이드를분리하는방법이수행되기도하여유전자치료제개발분야외에도다양한응용가능성을제시하였다. 특히암조직및주변기질에다량발현되는단백질들은암의진행및전이에중요한분자이므로이를표적으로하면유전자치료용바이러스를정상조직과는달리구분하는암조직특이마커및표적화타겟이될것이다. 특히 2000 년전후로암조직의 vasculature 가정상조직과다르며, 이를타겟할수있는 small peptide 시퀀스가밝혀지면서암조직을표적화하는연구가크게활성화되는계기가되었다. 미국의 Dr. T. Wickham 은 American society of gene therapy 학회에서 Approaches to targeting angiogeneic tissues using adenovirus vector" 라는주제로강연한바있다. 그러나 cancer targeting peptide, 혹은 cancer homing peptide 를이용하여바이러스벡터의특이성을재프로그래밍하는것은여러가지기술적인어려움때문에아직도초기의기술발전단계에있다. 한편, AAV의경우에는캡시드단백질의일부에세포표면인테그린수용체에결합하는펩타이드서열 (RGD motif) 을삽입하여바이러스를재표적화한연구결과가보고된바있다. 2. 펩타이드의국내연구기반 국내에서는여러실험실에서파아지발현펩타이드라이브러리를활용한다양한종류의연구를수행하고있다. 대부분의경우는단백질-단백질상호작용의발굴을목적으로하거나표적단백질에결합하여기능을저해하고자하는의학적목적으로시도되는경우가대부분이다. 그러나암세포특이적분자를표적으로하거나암조직특이적 targeting peptide 를발굴하는작업을전문적으로수행하는경우는거의없다. 특히 cancer targeting 의경우에는바이러스를재프로그래밍하는기술과수반하여수행되어야하므로두분야의전문가들의효율적인공동연구가필요한실정이다. 3. A ptamer 의국외연구동향 12

15 본과제의핵심기술인 SELEX 기술은 1990 년미국 Colorado 대학의 Larry Gold 박사에의해처음으로고안되었다. 그후핵산결합단백질또는여러다양한임상적으로질환에관련되는분자및금속이온등의저분자들을표적으로한핵산 aptamer 의개발은 Colorado 의 SomaLogic 회사를중심으로활발히보고되고있다. 4. A ptamer 의유전자치료제로서의현황 유전자치료제로서의 aptamer 개발은미국 Boston 의 Archemix 회사가가장활발히수행하고있다. 특히 RNA의 sugar 부위의 2 부위를 fluoro 기나아미노기로변형을통해환자혈청내의안정성을 10,000 배이상증가시킨 RNA aptamer 들이개발되었으며이러한변형 RNA aptamer 에 BSA 등과같은고분자량을가진분자들을 conjugate 시킴으로써 blood 내에서의 RNA aptamer 의 rapid clearance 가능성을줄여준 RNA aptamer 가개발되었다. 변형된 aptamer 가 animal model 에서표적단백질의기능을억제할수있음이보고되고있고주로혈청에존재하는단백질을표적으로한핵산 aptamer 들의임상시험이활발히진행중이다. 특히 Eyetech ( 현재는 OSI Phar.) 과 Pfizer 의 VEGF에대한 aptamer (Macugen) 가 2004 년 12월노인성황반병성치료제로서 FDA 승인을받아현재환자에적용되고있다. 5. A ptamer 의표적화도구로서의현황 최근전립선암세포표면에서특이적으로발현되는 PSMA에대한 RNA aptamer 를 prostate cancer 특이적으로항암제를전달하거나 sirna를전달하는매개체로서활용한보고가발표되었다. 특히 aptamer 의높은특이성및친화력, 제조비용의경제성등으로인해임상적으로중요한질환의표적단백질을인식하는분자인식체로활발히개발되어진단용체및표적화용도구로서개발되고있다. 그러므로 aptamer 를활용한암표적화연구는향후투자가치기높은분야라고할수있다. 제 2 절연구결과의국내 외기술개발현황위치 1. 본연구팀의펩타이드연구실적 본연구팀은 1997 년부터파아지발현펩타이드라이브러리, biopanning 방법을이용하여표적단백질에결합하는펩타이드를선별하고이의효능을세포내에서검증하는방식으로다양한표적타겟형펩타이드를성공적으로개발하여논문을발표하였거나 (chemokine; FEBS Letters, 2005, apoptosis 관련단백질 ; BBRC, 2006, 암세포표면특이 ; J. Am. Chem. Soc., 2002) 특허를등록하였다 ( 대한민국특허출원 13

16 3건, 대한민국특허등록 1건, 미국특허등록 1건 ). 특히본연구자는선별한펩타이드서열을반복적으로활용함으로써결합력과선택력이증가한다는사실을밝혀낸바가있으므로, 이를바탕으로기존의펩타이드선택방법외에도 optimization 에기여하였다. 2. 본연구팀의재조합아데노부속바이러스벡터 (ra A V) 연구실적 본연구팀은혈청형 raav2 벡터를기반으로암성장에관련되어있는 VEGF isoform cdna를 antisense 방향으로삽입한벡터와두종류의 truncated soluble VEGF 수용체를발현하는벡터또한함께개발하여현재사용되고있는우수한 taxol계항암제인 paclitaxel 보다암성장억제효능이 1.5 배이상되는 in vivo 항암효능결과를획득하였고 ( 특허등록번호제 호, PCT출원 PCT/KR2005/002561), 또한 raav2 벡터를기반으로 ANG1 cdna를함유한벡터를제작하여우수한 in vivo angiogenesis 효능을보이는혈관질환유전자치료제개발에적용가능한성과를국제학회및논문으로발표하였다 (Mol. Therapy, 2003; Exp. Mol Med, 2007). 또한각종인체종양세포에 scaav2를투여하면 long-term gene expression 이유도됨 (Onc. Rep, 2005) 을확인하였고, 이러한 long-term gene expression 은난치성질환치료에크게도움이될수있음을동물모델을이용확인 (Gene Ther, 2005) 한바있다. 3. 본연구팀의암표적화및암치료제용소재개발연구실적 본연구팀은암세포의특성을분석하고특이적으로발현하는분자를표적으로하는다양한기법을활용하였다. 그결과본과제의 1단계사업을통하여세계최고암학회인미국암학회 (American Association for Cancer Research, AACR) 에서발행하는 Cancer Research 에 2006 년과 2007 년에두편의논문을연속적으로발표하였다. 또한 AACR에서발간하며암치료목적의연구결과를주로게재하는 Molecular Cancer Therapeutics 에 2006 년에논문을발표하기도하였다. 관련된연구의결과는 Oxford University Press 에서발간하는 Nucleic Acids Research 에 2006 년과 2007 년에연속적으로두편의논문으로발표하였다. 본과제에서발생한결과는대한민국특허출원 3건, 대한민국특허등록 1건, PCT 출원 1건등이며, 현재미국특허출원을준비중이다. 14

17 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절이론적 실험적접근방법 본과제에서이용한방법은다양한조합율을가진라이브러리로부터표적분자에결합하는분자를선택하는방법이다. 특히 12개의 peptide로구성된 peptide library 는각위치에임의로아미노산을삽입하였기때문에이론상으로는 개 (4.1 x 개 ) 의가능한아미노산서열을가지고, 실지로본과제에서이용한 Ph.D-12 Phage Display Peptide Library Kit (New England Biolabs, Inc.) 는 1.9 x 10 9 개의독자적인클론을가지고있다. 이 library 는기존의 synthetic random peptide library 와는달리 peptide 가 grid나 solution 에존재하는것이아니라 M13 filamentous phage의 coat protein 의일부로들어가도록고안되어있다. 그러므로 random peptide 를 phage 표면에발현하는다양한 phage clone 으로구성되어있어기존의방법보다장점이많다. 먼저, coat protein 의한부분으로 random peptide 가존재하므로 synthetic peptide와는달리 conformation 을형성할수있고두번째장점은 biopanning 방법에의해표적분자에결합한 phage particle 을간단히분리할수있다는것이다. 즉, microtiter plate 표면에표적분자를부착하고 phage library 를투여한후결합하지않은 phage는간단히씻어내고결합한 phage는 elution 시켜선택하는방법으로표적에결합하는 peptide 를비교적간단히선택하였다. ( 그림 1) Biopanning 방법의도식화 : Binding-W ashing-repeat 15

18 바이러스벡터 tropism 변형의필요성및 Transductional Retargeting 바이러스는표적세포의표면에존재하는특정단백질또는당분자를인식하여세포내로침투하게되고아데노바이러스경우는세포표면의 Coxsackie and adenovirus receptor (CAR) 를일차인식부위로이용하는데많은인체암세포가종양화과정을겪으면서 CAR 의발현이저해되어아데노바이러스에대한감염능이떨어지게된다. 이러한것이아데노바이러스벡터를이용한암유전자치료기술의문제점으로많이보고되어있다. 현재유전자치료기술개발에많이사용되고있는 recombinant Adeno Associated Virus 2 (raav2) 의경우세포표면의 heparan sulfate proteoglycan (HSPG) 을인식하는것을알려져있으며, 이러한특성은 raav2 의암특이적유전자전달에저해요소로작용하는것으로할것이다. 그러므로항암유전자를원하는암조직으로효율적으로전달하기위해서는유전자전달체바이러스의트로피즘을변형시키는방법이필요하다. AAV permissive cell의경우 endosome 으로들어가서핵으로들어갈수도있으나 non-permissive cell에서는 proteolysis 되어제거되기가쉽다. 다른수용체와결합하도록 retargeting 된 AAV는 co-receptor dependent interaction 으로바이러스가세포안으로 internalize 될수있다. 그리하여 proteolysis 되지않고핵으로이동하도록조절한경우이다. 본과제에서는단순히표적세포인암세포로의접합력만증가시키는것이아니라 non-permissive cell에서도감염과정이원활히진행되어치료제유전자를안전히세포에안착시키는데기여하고자한다. Dual Targeting 벡터의장점 본연구에서는 1단계연구를통하여암조직주변에발현되는당과단백질을특이적으로인식하는펩타이드를발굴하여암세포특이적 transductional targeting 의기틀을마련하였다. 또한정상세포에비하여암세포에서과다발현되는프로모터를발굴하여암세포특이적 transcriptional targeting 의소재로활용하였다. 그러므로본 2 단계연구에서는 transductional targeting 과 trnascriptional targeting 기법을 AAV 에적용하여 dual targeting 벡터를개발하고자한다. 이벡터는항암유전자및 aptamer 등을장착할기본벡터로서암표적화의근간이되는유전자전달체가될것이다. 16

19 ( 그림 2) Establishment of dual targeting gene delivery vectors 17

20 제 2 절연구내용및방법 1. Tenascin C (TNC) 단백질준비 Chemicon 으로부터 Human tumor cell line 에서분리한 280 KDa 크기의단백질을 구입하였음. 2. Phage display Phage display peptide library kit (New England Biolabs, Inc.) 를구입하였음. 이 kit에는 개의독자적인클론을가진 12개의펩타이드라이브러리를가지고있음. 96-well plate well 하나에는 100 μg / ml TNC 단백질이포함된용액을첨가하고, 다른하나의 well에는 5 mg / ml BSA가포함된 blocking buffer 를넣고 4 에서하룻밤방치하였음. 용액을제거하고 TBST 완충용액으로 6번씻어낸후 pfu/ ml파아지를 BSA가고정된 well에넣고 30분두어 BSA에결합하는 phage를제거한후 TNC에고정된 well로옮겨 30분두었음. TNC에결합하지않은파아지는 TBST 완충용액으로 10번씻어주어완전히제거하고 low ph 용액으로 TNC에친화력이높은파아지를 well에서추출해내었음. 추출해낸파아지를 ER2738 배양액에서증폭시키고 PEG/NaCl 용액을이용하여침전한후다음 round에사용하였음. 이와같은과정을 3번반복하여 TNC에결합하는파아지를선별해내었음. 3 round 후에생긴파아지플라그를취해 ER2738 배양액에서증폭시키고요오드완충용액과 ethanol 을이용하여침전한후 3차증류수에녹여단일가닥의파아지 DNA를얻었음. 파아지 DNA, -96 gⅢ reverse primer, autosequencing mixture를혼합하여 PCR 반응하여 ABI 373 Automatic DNA Sequencer 로염기서열을분석하였음. 3. 선택한펩타이드합성 많은빈도를보인펩타이드서열을 C-terminal 말단은 amidation, N-terminal 말 단은 biotin 을고정시킨형태로합성하였음. 4. Surface Plasmon Resonance Dextran 이돌출되어있는 CM5 sensor chip 표면을 NHS/EDC로활성화시킨후두개의 flow-cell 에 fibronectin 을아민결합반응을이용하여고정화시키고 ethanolamine 으로불활성시켰음. Fibronectin 을고정한하나의 flow-cell 에는 TNC 를고정화시키고다른하나의 flow-cell 에는 buffer 를고정화시켰음. 바이오틴이 conjugate 되어있는 #2 펩타이드를 biotin에강하게결합하는 streptavidin 이 conjugate 되어있는 quantum-dot (1 nm) 과결합시켰음. Fibronectin 단백질과 fibronectin/tnc 단백질이고정화되어있는 flow-cell 에 #2 펩타이드 /quantum-dot 을주입하여농도가증가함에따라결합이증가하는지를확인하고여러농도에서의 18

21 결합정도를분석하여 Kd 값을결정하였음. 5. Immunocytochemistry Immunocytochemistry 를이용하여 TNC 단백질과합성한펩타이드의세포내표적화정도를측정하였음. Coverslip 에 24시간세포를배양하고 3.7% paraformaldehyde 로세포를고정한후 PBS로씻어내고 0.5% Triton X-100 용액에 5분간두어세포투과성을주었음. 10% calf serum으로 blocking한후, 선택한단일클론항체나펩타이드와결합시키고나머지분자는제거하였음. 항체를이용한경우에는형광물질로표지한이차항체를이용하고, 펩타이드를이용한경우에는펩타이드의 biotin에강하게결합하는 streptavidin 에형광표지를하여이를형광현미경을이용하여관찰하였음. 6. Immunohistochemistry Immunohistochemistry 를이용하여 TNC 단백질과합성한펩타이드의조직내표적화정도를측정하였음. Nude mouse에 U118MG 또는 HT29 세포를피하주입하여 xenograft 고형암동물모델을구축하였다. 종양이 9-10 mm에도달하였을때, 마우스를희생시키고, 종양조직을얻은다음 -80 에서동결보관하였음 μm의두께의동결섹션을절단하고 3.7% paraformaldehyde 로세포를고정하였음. PBS로씻어내고 0.5% Triton X-100 용액에 5분간두어조직투과성을주었음. 조직을세척하고 10% FBS, 10% nonfat dry milk, 3% BSA 용액으로 2시간동안실온에서 blocking 한후, 선택한단일클론항체나펩타이드와결합시키고나머지분자는제거하였음. 항체를이용한경우에는형광물질로표지한이차항체를이용하고, 펩타이드를이용한경우에는펩타이드의 biotin에강하게결합하는 streptavidin 에형광표지를하여이를형광현미경을이용하여관찰하였음. 7. Tissue microarray Lung tissue microarray 는 36 adenocarcinoma, 15 squamous cell carcinoma, 1 bronchioloalveolar carcinoma 및 1 normal lung 조직으로구성되어있음. 조직단면의 wax를 xylene 으로제거하고농도별에탄올을첨가하여수화시켜준후, 항원회복을위하여 Tris/EDTA (ph 9; Dako) 에서 20분간가열해주었음. 염색은 TNC 특이단일클론항체또는펩타이드와반응시키고, 세척을하였음. 항체를이용한경우에는형광물질로표지한이차항체를이용하고, 펩타이드를이용한경우에는펩타이드의 biotin에강하게결합하는 streptavidin 에형광표지를하여이를형광현미경을이용하여관찰하였음. 8. raav 의생산과역가산출 AAV 바이러스를생산하는방법으로는 viral vector (original: U. of North 19

22 Carolina 의 Dr. Samulski로부터확보한 phpa-trs-sk, 이후그특성이개선된독자적인벡터가개발 ) 혹은 paav 플라스미드 (AAV2 ITR-CMV promoter- 치료유전자 cdna-sv40 poly(a)-aav2 ITR), prepcap (U. of Penn. 의 Dr. High로부터획득, pseudotyped raav 벡터생산시 AAV2 게놈을근간으로각혈청형의캡시드를가진바이러스파티클생산용플라스미드사용 ), phelper 를사용한 triple transfection 을이용하였음. Transfection 은 Ca method 를사용하였고상기플라스미드를 molar ratio로 1:1:1 취하여 10 cm dish (~80-90% confluence) 에총 30 ug를처치하였다. 바이러스정제를위해서는 two-step CsCl gradient 법을취하였으며, total particle 이나 infectious particle 이확인된 fraction 을취하여이들을 dialysis (2% sorbitol 이포함된 Tris buffer 사용 ) 한후 aliquot 한후 -80 o C에보관하였음. Transcriptional target raav 벡터생산을위해서는상기 paav 플라스미드 DNA 에있는 CMV promoter 와 enhancer 대신 htert (1695~3356 nts, AB016767), 3E-hTERT-TPL (1721~1339 nts 부위, 3 tandem repeat enhancer 와 subgroup C human adenovirus tripartite leader 염기서열, AF098956), BIRC5 (844~2813 nts, U75285), RRM2 (82~1176 nts, AF149206), PRC1 (85000~83254 nts, AC068831) 프로모터부위를삽입하였음. Reporter 유전자로는 GFP 혹은 Firefly luciferase cdna를삽입하여새로운 paav 플라스미드 DNA를제작하였으며, 암조직특이적인프로모터활성연구및유전자전달효율성을분석하는 in vitro와 in vivo 연구에이용하였음. 바이러스의역가는바이러스게놈에대한 real-time 이나, viral particle 을인식할수있는 ELISA kit을이용하여분석하였음. 한편 infectious particle 은대부분의경우 HeLa 세포주를감염하여확인하였으나, 바이러스의특성에따라 U87-MG (TNC 바이러스 ), TK 바이러스의경우 TK 특이적 immunocytochemistry 를통해산출하기도하였음. Retargeted 바이러스생산의경우상기벡터중 prepcap5 의 Cap5의 444 또는 578 위치에결과에상술한 homing peptide 를분자생물학적기법으로삽입하여 seq 분석을통해재확인한후 prepcap5 대신사용하였음. 9. ra A V 를이용한세포수준유전자전달대상세포들이 ~50-80% 증식하였을때확보한 raav들을다양한형태의세포에감염시킨후, 대부분의경우이틀후유전자의발현을확인하였음. 경우에따라서는 raav 감염시 human adenovirus 5 (had5) 를세포주에따라 MOI=5 ( 이경우 infectous titer; 293 세포주에서산출 ) 내외로처치한후그결과를분석하기도하였음. FC 기법은표지유전자 GFP의발현효율, 단위세포당 GFP 발현정도를정량화할때사용되었음. 이때는 raav 처치된세포들을 trypsin 처리로떼어준후 4% para-formaldehyde 로처치하여 GFP의발현정도를분석하는방식을취하였음. 20

23 10. Integrin/TNC 의존성유무검증위한 competition assay 우선세포주 (U87-MG 등 ) 을 48-well 에분주하여세포를 RGDS 또는 RGES 200, 100, 50, 20, 10 μm씩 RT 30분간 2% serum 이들어있는배지에서처치하였음. 또는 lectin 을다음원하는바이러스를투여한후 4시간동안 37 incubator 에서보관하였음 ( 이때필요에따라 had5를동시투여하기도하였음 ). 한편 TNC 바이러스의 TNC 의존성유무검증은 TNC 특이항체를일련의희석배수를이용상기기술한바와유사하게처치하였음. 이후세포를 PBS로세척하고이틀후에잔존하는유전자발현능 (GFP) 를현미경하에서관찰하거나, FC를이용하여정량적으로분석하였음. 11. ra A V 벡터의 in vivo 유전자전달효율성평가 5~6 주령누드마우스수컷 (BABL/c nu/nu mouse, ( 주 ) 중앙실험동물, Japan SLC, Inc.) 에 U87-MG, Sk-Hep1, HeLa, MDA-MB-231, A549 등다양한인간유래암세포주 10 7 cells/mouse 을견부아래쪽피하에주입하여 xenograft 고형암동물모델을제작하였고, 1주일후종양크기가 50~100 mm 3 되면각종 raav 혈청형벡터 1.5 x virus particles(v.p.)/mouse 를미정맥주사 (tail vein injection, IV) 방법, 복강투여 (intra-peritoneal injection, IP), 혹은암조직에직접투여하는방법 (intra-tumoral injection, IT) 으로투여하였음. 일정기간후 in vivo 유전자전달효율성및암조직특이적유전자발현정도를평가하기위해 reporter 유전자에따라다음과같이수행하였음. 일반상태및폐사의관찰 - 투여후생존확인및기타임상증상을관찰하였으며, 그후 6주간매일 2회마우스의생존및이상유무를관찰하였음. 부검및 GFP 발현분포확인 - 6주간의실험기간동안마우스를 2주와 6주에각각 2마리씩 xylazine과 ketamine 으로마취한후, 수컷의경우심장, 폐, 간, 신장, 비장, 고환, 부고환및종양을적출하여, -70 에보관한후 cryotome (Leica, CM1850, 독일 ) 으로동결절편하였고, 동결된절편의 GFP의발현을미세영상분석기 (Confocal Imaging System; Leica, TCS SP2, Germany, excitation 파장은 488 nm) 로관찰하여각장기에분포된 GFP의발현을평가함으로써 in vivo 유전자전달효율성을평가하였음. Bioluminescence in vivo imaging 시스템을통한암조직특이적발현분석및유전자전달효능확인 - LivingImage TM 프로그램을포함한 IVIS 시스템 (Xenogen Corp., CA, USA) 을이용하여실시하였음. raav 벡터투여후일정기간이경과하면 xenograft 누드마우스를 2% isofluorane/air 혼합물로마취시키고, 생리식염수로희석시킨 D-luciferin potassium salt (MIPS, USA) 기질을 150 mg/kg 용량만큼복강투여하였음. raav 벡터의생체내전달및유전자발현정도를나타내는마우스각부위에서발현된 luciferase 활성은마취상태를유지하면서마우스각부위에서발생하는총 photon counts 를일정시간동안 (1분~10 분 ) 획득하여정량적인 21

24 pseudocolor image 로얻어분석하였음. 각시간별로얻은 image 에대한표준화를 통해시간의존적인발현변화도분석하였음. 본연구는원자력의학원 (KIRAMS) 및춘천기초연이보유한장비를이용하여실시하였음. 12. HSV-TK/PET 영상기법 HSV-TK 의존적비침습적인영상분석은우선종양의크기가약 300mm 3 정도되었을때시행하였음. 실험동물은마취후 200uCi (~3.7MBq) 의생물표지자 18F-FHBG 를 tail vein으로투여하였음. 생물표지자투여 1시간후에이미지를 10 분간득하였고, 이미지의 reconstruction 은 three-dimensional sonogram 을이용하여확보하였음. 18F-FHBG 의종양섭취정도는 ROI (region of interest) 를확정한후 vendor software (AST Pro 1.1; Concord Microsystems) 를사용하여정량적으로측정하였음. ganciclovir 는복강내로 200mg/kg 로종양이식 9일후부터 23일까지매일지속적으로투여되었음. 13. raav5의표면단백 Tyr/Lys이변형및 RGD, TnC 모티브가삽입된 retargeted 바이러스제작 Tyrosine mutant raav5의생산방법은먼저이미알려져있는 tyrosine kinase signaling in ubiquitination of AAV2 capsids(zhong L, etal.(2007) M olther15: ) 를토대로 ' Pymol(coputer modeling)' 을이용하여 AAV5 capsid 의부분을확인하였음. 총 27개의 tyrosine residues 존재를확인하였고, 그중 surface 에존재할것으로예상되는 candidate 18개 tyrosine 을파악하였음. 이중 242, 502, 521, 719 를선택하여 single mutant raav5를제작하였음. 유사하게 Lys 형도분석하고제작하였음. single 및 double, Triple( ) mutant AAV5는 psp72-r2c5 를 template plasmid로사용하고, ( 주 ) 솔젠트에의뢰하여제작하였고, 염기서열확인또한 ( 주 ) 솔젠트에서하였음. 한편 Triple 및 Quad mutant raav5는미국 Epoch Biolabs 사에 521, 719 부분의 tyr을 phe로 mutant시킨 vector 와 502, 521, 719 부분을 mutant시킨 vector 를제작하여우리가이미가지고있는 psp72-r2c5-y242f 를 vector 로사용하여 cloning 을실시하여 psp72-r2c5-y242f-y521f-y719f, psp72-r2c5-y242f-y502f-y521f-y719f 를만들었음. 염기서열분석은 ( 주 ) 바이오닉스 에서하였으며, 염기서열이확인된 plasmid 를이용하여 virus를생산하였음. 바이러스생산에는 phpa-trs-sk, phelper, cloning 을통해새롭게만든 plasmid 가사용되며, Transfection 은 Ca method 또는 PEI method 를사용하였음. PEL의경우, 상기 plasmid 를 molar ratio로 1:1:1 를취하여 6 well plate(~80-90% confluence) 에총 3.1ug 를처치하였음. Tyr/Lys의변형및 RGD 또는 TNC 변형을모두포함한 retargeted raav5 형을제작하기위하여미국 Epoch Biolabs 사에 502, 719 부분의 tyr을 phe로 mutant시킨 22

25 vector, 521, 719 부분의 tyr을 phe로 mutant시킨 vector, 502, 521, 719 부분을 mutant 시킨 vector 에각각 RGD와 TNC을삽입한 plasmid 를제작하여우리가이미가지고있는 psp72-r2c5-y242f 를 vector 로사용하여 cloning 을실시하였음. 이를통해각종돌연변이형들을만들었고, 염기서열을분석하고, 바이러스를생산하고그특성을규명하는것은다른바이러스들과동일한실험기법을통해수행하였음. Triple 및 Quad RGD, TnC mutant raav5(rgd, TnC mutant로명명함 )(502, 719 부분의 tyr을 phe로 mutant시킨 vector, 521, 719 부분의 tyr을 phe로 mutant시킨 vector, 502, 521, 719 부분을 mutant시킨 vector 에각각 RGD와 TNC을삽입한 plasmid) 를미국 Epoch Biolabs 사에서제작하여우리가이미확보한 psp72-r2c5-y242f vector 에 cloning 을하였음. 이를통해만들어진각각의 plasmid 는 ( 주 ) 마크로젠에서염기서열을분석한후 ( 주 )SCT에서 purify 바이러스를생산하였음. 바이러스파티클정량 (titration) 은 real-time PCR 방법을수행하였음. 14. raav5에 M3와 PRL 삽입바이러스생산 ( 주 ) 바이오니아에서 pgem-t easy vector 에우리가원하는 M3-PRL 이삽입된 plasmid 를제작하여우리가이미확보한 psp72-xp7-scaav2 vector 에 cloning 을하였음. 이를통해만들어진 plasmid 를 psp72-r2c2-m3-prl 로명명하고, ( 주 ) 마크로젠에서염기서열이확인된 plasmid 를이용하여바이러스를생산하였음. 바이러스생산은 prep2cap5(pr2c5), phelper, cloning 을통해새롭게만든 plasmid(psp72-r2c2-m3-prl) 를사용하여 triple transfection(pei method) 를하였음. 상기 plasmid 를 molar ratio로 1:1:1 를취하여 6well plate(~80-90% confluence) 에총 3.1ug 를처치하였음. 처치 24시간후새로운 media 로바꿔준후다시 24시간배양하였음. 배양하는동안수시로 CPE(cytopathic effect) 를확인하였음. 그후 harvest 하여 aliquot 한후 -80 o C에보관하였음. 바이러스역가분석 (titration) 은 real-time PCR 방법을수행하였음. 15. anti-angiogenesis 유전자 PRL 선정, 발현및기능분석 anti-angiogenesis 유도를위해 PRL 유전자의 truncated form PRL-16K ( 이후 PRL로명명 ) 을확보하였음. 즉 ( 주 )BeneBio 에서 full-length human prolactin 을구입하여 NCBI(BC015850) Sequence 와비교후사용하였음. PLR을본연구수행중에제작완료한 praav2-cmv 벡터에 subcloning 하였고, 유전자발현은일차항체로 ( 주 )R&D에서구입한 Goat polyclonal anti-hprl lgg를사용하여 WB, ICC로각각확인하였음. PRL의 anti-angiogenesis 활성유무를확인하는방법으로 in vitro antiogenesis assay kit를이용하여 HUVEC 세포의 tube formation 을유도하였을때, Matri-gel, Diluent solution 을첨가하여시간이지남에따른변화를관찰하는방법과세포밖으로방출된 PRL을 HeLa cell 에 raav-prl으로감염시킨이틀후에메디아를회수하여확보하고, 배양용기에배양중이던 HUVEC cell 을피펫 23

26 팁으로긁어일부세포를제거한후이들회수한메디아를처치한다음, 제거된부 분에세포가증식하여빈공간이채워지는정도를관찰하는방법을사용하였음. 16. 조직특이적발현프로모터를함유한 ra A V2벡터들의생체내발현및암조직특이적발현분석가. 시험계획 1 계통및종 ( 공급원 ) : BABL/c nu/nu mouse ( 중앙실험동물, Japan SLC, Inc.) 2 시험계선정이유 : 본시험에사용될 mouse는 BALB/C 인브리드누드와 NIH(S) 아웃브리드누드마우스간의우연한교배로부터유래된것으로아웃브리드를배경으로하며, 국립암연구소 (NCI) 에서연구뿐만이아니라많은제약회사와기관들의종양학스크리닝프로그램에있어서표준모델로사용이되고있으므로참고할많은자료가축적되어있어선정하였음. 3 검역및순화기간 : 동물입수시모든동물의일반건강상태에대해수의학적검역을실시하였음. 시험을실시하는데적합하고건강한동물을선별하기위하여 1주일간의순화기간을두었음. 4 개체식별 : 개체식별은이어펀칭법으로사육상자에는시험번호, 동물번호, 투여량, 투여액량, 동물시험기간및시험책임자명을기재한라벨을첨부하였음. 나. 시험환경 1 환경조건본시험은온도 23 ± 2, 상대습도 55±5%, 환기횟수 10~12 회 /hr, 조명시간 12 시간 (07:00~19:00), 조도 150~300Lux 로설정된충북대학교수의과대학실험동물연구지원센터에서실시하였음. 2 사육상자, 사육밀도및사육상자의식별순화기간및시험기간중에마우스는 polycarbonate 상자 (260W 420L 180 mm, 명진기계제작 ) 에사육상자당 4마리를넣어사육하였음. 사육상자에는시험번호, 동물번호및투여량을기입한라벨을붙였음. 3 사료및음수의급여법사료는실험동물용멸균고형사료 (( 주 ) 샘타코바이오코리아, 경기도오산 ) 를자유섭취시켰으며, 음수는멸균정제된물을자유섭취시켰음. 4 음용수의중금속및미생물의확인음용수에대하여서는충청북도보건환경연구소 ( 충북청주시송정동 ) 에의뢰하여검사한결과시험에영양을미치는요인인중금속은수은, 카드늄, 비소등이불검출되었고미생물에있어서는일반세균, 대장균, 분원성대장균, 대장균군 24

27 등이검출되지않았음. 다. X enograft 고형암동물모델의제작인간유래암세포주인 HeLa 또는 A549 세포주를 10 8 cells/ml 농도로누드마우스의견부아래쪽피하에주사기 (26-G) 를이용하여 0.1 ml 씩주입하여 Xenograft 모델을구축하였음. 라. 고형암동물모델의생체내발현분포와암특이적발현분석 HeLa 혹은 A549등의다양한인간유래암세포주를이식한 xenograft 마우스에다양한 raav2벡터 (3.5 x virus particles (v.p.)/mouse) 를미정맥주사방법 (tail vein injection, IV), 복강투여 (intra-peritoneal injection, IP), 혹은암조직에직접투여하는방법 (intra-tumoral injection, IT) 으로투여하였음. 일정기간후 Bioluminescence in vivo imaging (BLI) 시스템을이용하여 in vivo 유전자전달효율성, 유전자발현정도및벡터분포를평가하였음. BLI 시스템을통한암조직특이적발현분석및유전자전달효능확인 : LivingImage TM 프로그램을포함한 IVIS 시스템 (Xenogen Corp., CA, USA) 을이용하여실시하였음. 초기에는원자력의학원이보유한기자재를이용하였고, 기기고장발생후춘천기초연기기를이용하였으나비특이적인영상이감지되어최근충북대학교실험동믈지원센터가구입한 Xenogen IVIS 200 series 기종을사용하고있음. raav 벡터투여후일정기간이경과하면 xenograft 누드마우스를 2% isofluorane/air 혼합물로마취시키고, 생리식염수로희석시킨 D-luciferin potassium salt (MIPS, USA) 기질을 150 mg/kg 용량만큼복강투여하였음. raav 벡터의생체내전달및유전자발현정도를나타내는마우스각부위에서발현된 luciferase 활성은마취상태를유지하면서마우스각부위에서발생하는총 photon counts 를일정시간동안 (1분 ~10 분 ) 획득하여정량적인 pseudocolor image로얻어분석하였음. 17. Dual targeting raav 벡터기반의암치료용유전자치료제벡터제작및치료효능분석암조직특이적인강한발현이확인된프로모터를함유한 raav2 기반의 dual targeting raav2 벡터에 anti-angiogenesis 치료효능이기대되는 anti-sense human VEGF-A (nucleotide positions, -14~415), truncated soluble human VEGF receptor R1 (amino acid positions, 1-656) 및 truncated soluble human VEGF receptor R2 (amino acid positions, 1-804) cdna를삽입하거나, apoptosis 에의한암세포사멸효능이기대되는 human TRAIL (amino acid positions, 1-281), truncated soluble human TRAIL (amino acid positions, ), truncated soluble human TRAIL (amino acid positions, ) cdna를포함하는 9종의 raav2 25

28 벡터를제작하였음. 암조직특이적인치료효능을위해 PRC1 혹은 M3 프로모터 를포함하도록암치료용유전자치료제를개발하였음 18. 암치료용 dual targeting raav2 기반의유전자치료제벡터들의치료효능분석방법 TRAIL 유전자를포함한벡터들의암세포사멸효과를분석하기위해인간유래암세포주인 HeLa를 3x10 3 cells/well 조건으로 96-well culture plate에계대하였고, 20K 혹은 200K MOI 조건으로 HeLa를감염시키고 72시간이경과한후, 현미경관찰, X TT 분석 (Cell Proliferation Kit II, Roche, Cat # ) 을실시하여살아있는암세포의 mitochondrial dehydrogenase activity를 450 nm 흡광도에서측정함으로써세포사멸효능연구를수행하였음. 또한같은실험조건에서살아있는세포수를 Hemocytometer 로측정하였음. antisense-vegf-a 벡터에의한 VEGF 발현의억제효과는 Biotrak human VEGF ELISA 시스템 (A mersham) 을이용한 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent A ssay) 분석방법으로실시하였음. raav 벡터를 200K 감염조건으로처리한세포를 72시간이경과한후수거하여파쇄하였고, 10 μg의세포 lysate를 anti-human VEGF 항체가코팅된 plate에넣고상온에서 2시간동안반응시킨후 plate를세번씻었음. Biotinylated 2차항체를 plate에넣어 1시간반응시켰고, 2차항체를씻어낸다음 Streptavidin-HRP 을넣어다시한시간을처리한다음, HRP 효소의 substrate 용액을넣고분광광도계로 450 nm에서 OD를측정하여각세포에서발현한 VEGF 단백질을정량하였음. 한편, soluble VEGF-R1 및 VEGF-R2 수용체에의한 anti-angiogenesis 효능은 HUVEC 세포를이용한 HUVEC (W ound healing) migration assay 방법으로분석하였음. HUVEC 세포 (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., USA) 와같은내피세포를배양한뒤, 면도날을이용하여 plate의한부분을상처를낸후, VEGF 등과같은 angiogenic factors 등을포함하는용액을첨가하면세포가증식하면서상처가가해진부분이회복되고동시에세포가이동하는것을실시간 microscopy 를이용하여측정하였으며이동한세포수를세어분석하였음. 19. Dual targeting A A V 벡터기반의암치료용유전자치료제의 in vivo 치료효능연구가. 시험계획 1 계통및종 ( 공급원 ) : BABL/c nu/nu mouse ( 중앙실험동물, Japan SLC, Inc.) 2 시험계선정이유 : 본시험에사용될 mouse는 BALB/C 인브리드누드와 NIH(S) 아웃브리드누드마우스간의우연한교배로부터유래된것으로아웃브리드를배경으로하며, 국립암연구소 (NCI) 에서연구뿐만이아니라많은제약회사와기관들의종양학스크리 26

29 닝프로그램에있어서표준모델로사용이되고있으므로참고할많은자료가축적되어있어선정하였음. 3 검역및순화기간 : 동물입수시모든동물의일반건강상태에대해수의학적검역을실시하였음. 시험을실시하는데적합하고건강한동물을선별하기위하여 1주일간의순화기간을두었음. 4 개체식별 : 개체식별은이어펀칭법으로사육상자에는시험번호, 동물번호, 투여량, 투여액량, 동물시험기간및시험책임자명을기재한라벨을첨부하였음. 나. 시험환경 1 환경조건본시험은온도 23 ± 2, 상대습도 55±5%, 환기횟수 10~12 회 /hr, 조명시간 12 시간 (07:00~19:00), 조도 150~300Lux 로설정된충북대학교수의과대학실험동물연구지원센터에서실시하였음. 2 사육상자, 사육밀도및사육상자의식별순화기간및시험기간중에마우스는 polycarbonate 상자 (260W 420L 180 mm, 명진기계제작 ) 에사육상자당 4마리를넣어사육하였음. 사육상자에는시험번호, 동물번호및투여량을기입한라벨을붙였음. 3 사료및음수의급여법사료는실험동물용멸균고형사료 (( 주 ) 샘타코바이오코리아, 경기도오산 ) 를자유섭취시켰으며, 음수는멸균정제된물을자유섭취시켰음. 4 음용수의중금속및미생물의확인음용수에대하여서는충청북도보건환경연구소 ( 충북청주시송정동 ) 에의뢰하여검사한결과시험에영양을미치는요인인중금속은수은, 카드늄, 비소등이불검출되었고미생물에있어서는일반세균, 대장균, 분원성대장균, 대장균군등이검출되지않았음. 다. X enograft 고형암동물모델의제작인간유래폐암세포주인 NCI-H292 세포주를 10 8 cells/ml 농도로누드마우스의견부아래쪽피하에주사기 (26-G) 를이용하여 0.1 ml 씩주입하여 Xenograft 모델을구축하였음. 라. 시험물질투여량및투여방법 NCI-H292 암세포주를이식한 xenograft 마우스의종양체적이 100 mm 3 크기로성장하면군분리하여에다양한 raav2벡터 (1..5 x virus particles (v.p.)/mouse) 를미정맥주사방법 (tail vein injection, IV) 으로투여하였음. 기존항 27

30 암제인 Taxol (paclitaxel; Cat. No. T1912, sigma, USA) 는 200 μg /mouse 용량을 매주 1 회동일용량으로시험기간동안복강투여 (intra-peritoneal injection, IP) 하 였고, Tarceva (Erlotinib; Roche) 는 100 mg/kg 용량으로매일경구투여하였음. 마. 관찰및검사항목 1 일반상태및폐사의관찰음용수공급후 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 12시간까지생존확인및기타임상증상을관찰하였으며, 그후시험기간동안매일 2회마우스의생존및이상유무를관찰하였음. 2 체중변화및종양체적측정모든동물에체중에대하여주 2회에측정하였고, 종양의체적도주 2회간버니어캘리퍼스 (Vernier calipers) 를이용하여종양의체적을측정하였음. Tumor Volume(TV)= (W 2 *L) / 2*W : 단축길이, L: 장축길이 3 H&E Staining - 병리조직학적관찰주요장기를 Bouin' s solution 에고정한후조직처리과정을거쳐 H&E 염색을통하여조직병리학적검사를실시하였음. 20. ra A V 벡터의대량생산효율성및감염율비교연구생산세포주로는 ATCC에서구입한 HEK293(CRL-1573), 293T(CRL-11268) 혹은 U Penn에서얻은 UP-CVC-HEK293 을이용하여 raav 벡터생산효율성을연구하였음. 또한, transfection 후세포만을이용하거나세포및배지를모두수거하여생산율을비교하였음. Adherent cell culture는 293T 세포를 10% FBS가함유되어있는 DMEM을이용하여 transfection 하루전날 cell/100 mm의 density 가되도록계대하였고, suspension cell culture는 pluronic F-68 을 0.1% 농도혹은 pluronic F % 와 dextran sulfate 25 mg/l의농도로처리되어진 2% FBS DMEM을이용하여 transfection 하루전날 cell/10 ml의 density 가되도록분주하여 orbital shaker에서 100 rpm으로 stirring하면서부유배양하였음. 다음날 transfection 2 시간전에각각의배지조건에맞는 2% FBS DMEM 배지로교환하였고, 위의 raav벡터의생산방법과같이 1 paav2-gfp plasmid DNA, 2 AAV2 rep 부분과 cap 부분을발현시키는 AAV2 rep-cap plasmid DNA, 3 adenoviral helper plasmid 등의세가지 plasmid DNA를동시에 293T 동물세포에 transfection reagent Ca-P과 PEI를각각이용하여 triple co-transfection 을실시하였고, 형광현미경을이용한분석및 flow cytometry 방법 (FACS Calibur, Becton Dickinson) 으로 transfection 효율을분석하였으며, CsCl 밀도구배방법을이용하여정제한후생산효율성을비교하였음. 28

31 21. 대량생산된 raav벡터의정제및분석방법 Co-transfection 시킨후 48시간이경과하면세포와배지를동시에모아서 sonication 하였고, raav virus particle 은 CsCl density gradient 원심분리를 2번반복하여 RI (Refractive Index) 가 1.37~1.41 g/ml 부분을모아순수하게분리정제하거나, CsCl density gradient 원심분리방법을 1회실시한후 Centricon(Millipore, YM-100) 을이용한여과방법 (5,000 g, 20분, 4 ) 을실시하여작은크기오염물질을제거하는정제방법을실시하였음. 한편 Na-Phosphate buffer (ph 7.3) 및 acetate buffer (ph 5.0) 기반의이온교환수지크로마토그래피방법을실시한후 CsCl density gradient 원심분리방법을연이어진행하거나 PEG-8000 특이적흡착 reagent 를이용하여분리한후 CsCl density gradient 원심분리를 2번반복하여정제정도를향상시키는공정을개발하였음. 정제된 raav 벡터의순도를분석하기위해 12% SDS/PAGE로분리한후, Coomassie staining, Silver staining (Bio-Rad, Cat. No ) 혹은 anti-aav2 capsid polyclonal 항체 (PROGEN Cat. No ) 를이용한 western blot 분석실험을실시하였고, ECL kit (GE Healthcare Cat. No. RPN2108) 를이용하여 AAV2의 VP1, VP2, VP3 단백질을가시화하였음. 바이러스파티클정량 (titration) 은 real-time PCR 혹은 ELISA titration kit (PROGEN) 방법으로수행하였음. 22. 임상시험용의약품 raa V 벡터의생산및품질평가방법 ATCC에서새로구입한 293T 생산세포주 (ATCC CRL-11268) 의 master cell bank (MCB) 및 working cell bank (WCB) 확립을위한안전성평가및세포주특성확인시험을실시하였음. Sterility test 는검체 (MCB, WCB, 세포배양시사용되는 Media 를비롯한각종검체 ) 중의균의존재여부를확인하는시험방법으로대한약전등각종공정서나생물학적제제기준및시험방법을따라실시하였음. 무균시험은액상치오글리콜산배지 (Fluid Thioglycollate Medium, FTM) 와대두카제인소화액체배지 (Soybean Casein Digest Medium, SCDM) 를이용하여배양하는데, FTM 배지는호기조건과혐기조건에서세균의오염여부를확인하는것이며, SCDM 배지로는호기성균과진균의오염여부를확인하는데이용하는데, FTM은 30~35, SCDM은 20~25 배양기에서 14일이상배양하고적어도 5~9 일째에 1 회및배양최종일모두 2 회균의발육의유무를관찰하였음. 29

32 배지시험균주배양 액상티오글리콜산배지 대두카제인소화배지 Staphylococcus aureus (ATCC #6538) Pseudomonas aeruginosa (ATCC #9027) Clostridium sporogenes (ATCC #11437) Candida albicans (ATCC #10231) Aspergillus niger (ATCC #16404) 호기배양 호기배양 액상티오글리콜산배지 Clostridium sporgenes (ATCC #11437) 혐기배양 Mycoplasma test 는검체중의마이코플라스마세균오염여부를확인하는실험방법으로, 오염이발생하면 host 세포의형태적변화는관찰되지않으나, 마이코플라스마에감염된세포의성장, 생존력, 전반적인대사활성에심각한영향을초래하므로 e-myco TM Mycoplasma PCR Detection Kit (ATCC, Cat # 21081) 를이용하여프로토콜에서제시하는방법에따라주기적으로검체중의오염여부를확인하였음. MCB 및 WCB의마이코플라스마세균오염여부를분석할경우, 세포를 95 에서 10분간가열한후원심분리하여세포 lysate 상층액만분리하였고, 이를 PCR 시험의 template 로사용하여양성대조군 (M. fermentans-infected K562 DNA) 과함께증폭한후 1.4% TBE/agarose gel 전기영동방법으로분석하였음. Internal control 인 160-bp 가모든시험군에서나타나고, 마이코플라스마오염이있는경우와양성대조군에서는 260-bp DNA band가확인되었음. 세포특성을확인하는실험으로는세포형상을위상차도립현미경을이용하여관찰하였고, 세포분열시간을다양한 passage 에서연이어 5일간측정하였고세번이상반복하여세포분열평균값을확인하였음. 제 3 절연구결과 1. TNC에결합하는파아지클론의선택 Phage Display Peptide Library Kit (New England Biolabs, Inc.) 의 12개펩타이드를가진라이브러리를이용하였음. BSA 또는 TNC을첨가하여 96-well plate well에고정시켰음. 파아지라이브러리를 BSA에넣고 30분두어 BSA에결합하는파아지를제거한후 TNC에결합시켰음. TNC에결합하지않은파아지는씻어주어완전히제거하고 TNC에친화력이높은파아지를추출하였음. 추출한파아지를증폭시키고침전하여다음 round에사용하였음. 이와같은과정을 3번반복하여 TNC 에결합하는파아지클론을선별하였음. 2. 펩타이드의합성및안정화 높은빈도수를보인파이지서열 (#1; FHKPFFPKGSAR, #2; FHKHKSPALSPV, 30

33 scrambled; VSPKSHLKAHPF) 을 C-terminal 말단에염기서열 3 개 (GGG) 를추가 한후 amidation, N-terminal 말단은 biotin 을고정시킨형태로합성하여이후실 험에이용할수있게하였음. 3. 합성한펩타이드와 TNC와의결합정도분석선택한펩타이드와 TNC 단백질과의결합정도를분석하기위하여 Surface Plasmon Resonance (SPR) 방법을이용하였음. Fibronectin 및 TNC 단백질을 BIAcore chip에고정한후 biotin-#2 peptide/streptavidin-quantum-dot 복합체를흘려주었을때, 펩타이드농도별로결합이증가함을확인할수있었음 ( 그림 3). 반면 streptavidin-quantum-dot 과 TNC의결합은볼수없었음. #2 펩타이드와 TNC 단백질은 10-6 의 Kd를보이며이는선택한펩타이드와 TNC 단백질간의결합력이우수함을보여주는것임. ( 그림 3) Binding affinity between peptide #2 and TNC 4. TNC 타겟펩타이드의세포내표적화확인선택한펩타이드가세포내에서표적화가되는지를 immunocytochemistry 로확인하였음. TNC의 level 이높은 U251 세포를사용하여표적화정도를확인해본결과 #2 펩타이드가세포내에강하게표지되는것을확인할수있었음 ( 그림 4). 31

34 ( 그림 4) Specific detection of U251 cells with the biotin-peptide #2 5. TNC 타겟펩타이드의조직내표적화확인 Tumor 조직의 ECM에위치한 TNC 단백질과 #2 펩타이드의결합을확인하고자 immunohistochemistry 를수행하였음. Nude mouse에 U118MG 세포를피하주입하여 xenograft 고형암동물모델을구축하였음. 종양이 9-10 mm에도달하였을때, 마우스를희생시키고, 종양조직을얻은다음 -80 에서동결보관하였음 μm의두께의동결섹션을절단하고 3.7% paraformaldehyde 로세포를고정하였음. PBS로씻어내고 0.5% Triton X-100 용액에 5분간두어조직투과성을주었음. 조직을세척하고 10% FBS, 10% nonfat dry milk, 3% BSA 용액으로 2시간동안실온에서 blocking 한후, 선택한 TNC 항체나펩타이드와결합시키고나머지분자는제거하였음. 항체를이용한경우에는형광물질로표지한이차항체를이용하고, 펩타이드를이용한경우에는펩타이드의 biotin에강하게결합하는 streptavidin 에형광표지를하여이를형광현미경을이용하여관찰하였음. TNC 단백질은핵의바깥쪽, ECM에서강하게표지되었음 ( 그림 5). ( 그림 5) Specific detection of U118MG xenograft model with the anti-tnc antibody 32

35 흥미롭게도, #2 펩타이드역시 TNC 단백질과동일한염색패턴을나타내었음. 펩타이드를처리하지않거나또는스크램블펩타이드를이용한경우에는염색이거 의되지않았음 ( 그림 6). ( 그림 6) Specific detection of U118MG xenograft model with the biotin-peptide #2 6. Tissue microarray를이용한 TNC 타겟펩타이드의폐암환자조직내표적화확인 #2 펩타이드가암환자조직의 TNC 단백질을표적화할수있는지확인하기위하여, 52명의폐암환자 (36 adenocarcinoma, 15 squamous cell carcinoma, bronchioloalveolar carcinoma) 및정상인 1명으로부터조직을분리하여 tissue microarray 를제작하였음. 조직단면의 wax를 xylene 으로제거하고농도별에탄올을첨가하여수화시켜준후, 항원회복을위하여 Tris/EDTA (ph 9; Dako) 에서 20분간가열해주었음. 염색은 TNC 특이단일클론항체또는펩타이드와반응시키고, 나머지분자는제거하였음. 항체를이용한경우에는형광물질로표지한이차항체를이용하고, 펩타이드를이용한경우에는펩타이드의 biotin에강하게결합하는 streptavidin 에형광표지를하여이를형광현미경을이용하여관찰하였음. 항-TNC 항체를이용한경우, 세포의바깥쪽, ECM에서 TNC 단백질의확연한발현을확인하였고, 특히 adenocarcinoma 및 squamous cell carcinoma 에서강한시그널이관찰되었으며, bronchioloalveolar carcinoma 에서도몇몇의 spot이관찰되었음. #2 펩타이드역시항체에서얻은염색패턴과동일한양상을보였음. 이러한펩타이드와항체의염색패턴유사성은본연구에서발굴한펩타이드가높은특이성을갖는다는것을보여주는것임. 정상조직에서는항-TNC 항체와 #2 펩타이드모두관찰되지않았음 ( 그림 7). 33

36 ( 그림 7) Specific detection TNC by the biotin-peptide #2 to lung cancer patient tissues 7. RGD 펩타이드혹은 TNC 항체를이용한 competition assay 1단계에확보한 retargeting raav5들의표적특이성을확실히검증하고자 competition assay 를수행하였음. 이를위해 raav5-rgd 는 RGDS ( 특이적 ) / RGES ( 비특이적 ) 펩타이드, raav5-tnc 는 TNC를인식하는항체를이용하여실험을수행하였음 (n 3). 그림 8에서와같이 RGD 바이러스그리고 TNC 바이러스는각각상응하는표적 ( 종양특이적 ) 들에의존적인유전자발현을유도함을알수있었음. 34

37 ( 그림 8) Analysis in target specificity on tumor surface of targeting raavs 한편 raav5는원래세포표면의 sialic acid를인식하여형질도입을하는것으로알려져있으나 retargeting raav5는 sialic acid 인식능은현저히떨어져있음을 sialic acid-negative cell line CHO-Lec2 세포주에 raav5 또는 raav5-rgd 를도입함으로써확인할수있었음. 즉 integrin 이과발현되있는 CHO-Lec2 세포주는 raav5에의해서는유전자도입이어려우나, raav5-rgd 바이러스에의해선형질도입이용이함을알수있었음 ( 그림 9). 35

38 ( 그림 9) Sialic acid-independency of ra A V5-RGD 즉이러한결과들은 retargeting raav5의경우, parental type 바이러스와는달리, 바이러스의표면에신규삽입된펩타이드에상응하는세포수용체의존적인유전자발현특이성을유도함을다시한번확인할수있었음. 나아가이들펩타이드는종양특이펩타이드로써 retargeting raav5의종양친화력을더불어시사하는긍정적인결과임. 8. HDA C inhibitor 처치가유전자전달효율성및항종양효과에미치는긍정적인효과검증 retargeting raav5에의한유전자전달효율성은종양특이적이기는하였으나, 야생형바이러스대비전체적으로유전자발현율이저하되어있음을알수있었으며, 실제적인항종양효과의획득을위해서는극복해야할문제점임. 이를극복하는방안의하나로최근아데노바이러스등의유전자발현유도능을항진시킴과동시에항종양효과를증진시키는것으로알려진 HDAC 저해제의유용성을규명해보고자하였음. 이를위해바이러스처치하루전에 SAHA를 U87-MG 세포주에그림 10과같은농도로처치하고, 바이러스를감염시킨후표지유전자인 GFP의발현정도를 TE (Transduction efficiency) 및 MFI (mean of transduction efficiency) 로분석한결과 SAHA의처치는 retargeting raav5에의한유전자전달능을증대시키는효과가있음을보여주었음. 이는 SAHA가항종양치료제로이미임상시험중에있음을감안할때, retargeting raav5의항종양제제개발시병합치료에의한치료효과의극대화에적극응용될수있음을예견하여줌. 36

39 ( 그림 10) Enhanced gene transfer by raav5 in the presence of SAHA 9. 인체종양세포를도입한종양모델확보 : 다양한인체암세포유래종양형성을위한 nu/nu vivo 모델을확보 Hela ( 자궁암세포주 ), SK-Hep1 ( 간암세포주 ), U87-MG ( 뇌암세포주 ) 를포함한다양한인체종양세포주들 (PBS에희석 ) 을 5-6 주령의 nu/nu 마우스에 subcutaneous 하게투여하였으며, 매일쥐의상태및종양형성정도를관찰하고종양형성성공여부, 성장속도등을분석하였음. 상기세포주들은 2-5x10 6 의세포를사용하는경우재현성있게종양을형성하였으며, 세포의종류에따라성장속도및특성에는차이가있었음. 즉 HeLa는 SH-Hep1 에비해상대적으로종양형성속도가유의하게매우빨랐으며, U87-MG 의경우초기종양형성은상대적으로다소늦었으나, 일정수준의크기에이르면매우급속도로성장함을알수있었음. 본연구에서는이들모델을이용하여 retargeting raav5의유용성을영상을통해검증하고자하였음. 37

40 ( 그림 11) Tumor growth after subcutaneously inoculating various human cancer cells 10. HSV-TK 유전자를발현하는 ra A V 를이용하여 vivo 유전자도입후실시간유전자발현모니터링 HSV-TK는항종양유전자의대표주자임 ( 치료전구물질 ganciclovir; GCV와동시처치시 ) 과동시에적절한생물표지자와사용하는경우비침습적실시간, 반복적, 정량적영상이가능한매우유용한유전자임 ( 그림 12). 38

41 ( 그림 12) HSV-TK in cancer gene therapy & non-invasive imaging by micro-pet 본연구에서는기존에암유전자치료의치료 / 영상유전자로잘알려진 HSV-TK보다기능성측면에서우수성이보고된 TK 돌연변이형 sc39tk (by Dr. Kohn, USA) 를이용하고자하였음. sc39tk 의특성규명을위해 TK 특이적인 western-blotting, immunocytochemistry 을우선확인하였음 ( 그림 13). ( 그림 13) W estern-blot (L) and immunocytochemistry (R) specific to TK 다음 sc39tk 의항종양효과를세포수준에서검증한결과, 돌연변이형 sc39tk 는 야생형 TK 에비해약 100 배의종양효과우수성을유도함을확인할수있었음 ( 그 림 14). 39

42 ( 그림 14) Cytotoxicity induced by GCV under the expression of TK 이에본연구에서는 TK 대신 sc39tk 를치료 / 영상유전자로선정하였음 ( 이후 TK 로명함 ). 동물모델을이용한 vivo 실험들은목적에따라다소의차이는있으나, 대체적으로그림 15 과같은실험스케줄에따라진행되었음. ( 그림 15) A nimal experimental scheme 우선 raav에의한장기적인유전자발현과비침습적인영상이가능한지를확인하기위하여확보한 Hela 또는 SK-Hep1 유래종양모델 ( 이경우 ex vivo에서 raav-tk 처치 ) 을일주일간격으로실시간이미징한결과 ( 생물표지자 : 18F-FHBG), 사용한세포의종류에따라다소차이는있으나, 6-7 주까지도 TK 의존적인영상이가능함을확인할수있었음 ( 그림 16). 40

43 ( 그림 16) M icro-pet imaging in Hela tumor model: TK/18F-FHBG 이러한사실은 raav 에의한유전자발현은어느정도장기적으로유도됨을시 사하는것으로, raav 를이용한종양특이장기적항종양효과를기대할수있음을 지지하고있음. 11. 종양을포함각종장기에서유전자발현정량분석 raav에의한유전자전달후각종장기에서의 raav 게놈존재여부는 raav 의프로모터부위를인식하는 real-time PCR 기법을통해검증하기위하여실험기법을확립하였음. 또한유전자발현의경우, 조직에대한 immunochytochemistry 또는확보한조직을 primary culture 한후 GFP의발현을직접확인하거나, immunochytochemistry 를통해 TK의발현을확인하고자하였음. 하지만 retargeting raav에의한유전자전달을시사하는긍정적인결과를아직확보하고있지못한상태임. 이는차기년도수행을통해해결해야할문제임. 12. Ganciclovir에의한치료효과예측가능성검증 raav에의한 TK의발현이 GCV 처치하에서만항종양효과를유도하고이러한치료효과를 micro-pet 이미징을통해예측할수있는지를 Hela-based 동물모델에서확인한결과, 예상한대로 GCV의처치는 TK 의존적인치료효과를유발하였고 ( 종양생장곡선 ), 이는바로이미징에반영되었음 ( 그림 17). 41

44 ( 그림 17) A nti-tumoral effect of GCV monitored by micro-pet 따라서상기결과들을모두종합하여보면종양세포 / 조직에서 raav 에의한장기 적인치료유전자발현이가능하고, TK/GCV 시스템의도입은장기적인치료효과 는비침습적인이미징을통해예측할수있음을확실히알수있었음. 13. 항암유전자 PRL (PRL16-kd, 이후 PRL로명명 ) 을확보하고발현및활성확인 ( 주 )BeneBio 에서구입한 Human prolactin 을 backbone 으로하여 PRL을확보하고, 이를 praav 발현 plasmid (scaav형) 에 subcloning 하여염기서열을재분석한후유전자의발현을확인하여 PRL 제작을완료하였음. 유전자는 CMV 프로모터에의해발현조절되는형태이고, 음성대조군으론 GFP가발현되는벡터를사용하여비교분석하였음. 벡터제작은그림1과같이 PRL 유전자는동일하나, poly A tail이두개또는한개있는형태로우선제작되었음. 향후바이러스생산능등기본특성차이의분석을통해 poly A tail이한개만있는형태로제작한것을원하는 construct 로선정하게되었음. ( 그림 18) PRL 유전자를확보하여발현벡터제작 42

45 14. ra A V-PLR 바이러스 (sca A V 형 ) 의생산및특성분석우선 raav-prl 바이러스즉 scaav2-prl 및대조군바이러스 (GFP 발현 ) 를생산하였음. 바이러스는대조군 raav-gfp와유사한정도의역가로 (TP) 로생산가능하였음 (data not shown). 즉 PRL유전자발현이바이러스생산능에는영향을주지않음을확인하였음. 다음생산한바이러스를이용 PRL의발현정도및세포밖방출능을확인하기위하여우선역가가확인된 raav 를 MOI가 10^3, 10^4 되도록처치하고이틀후 cell pellet 및배양액을회수 ( 배양액은농축 ) 하여 Western-blotting 을시도하였음. 이를통해 cell pellet 및배양액모두에서 PRL 이존재함을확인할수있었음. 즉발현된 PRL은세포밖으로효과적으로방출됨을알수있었음. 동시에 poly A tail 이두개또는한개있는형태모두에서유사한특성을확인하였는데, 이를근거로향후연구에는 poly A tail이한개만있는형태를연구에사용하기로하였음. 더불어 PRL의세포내발현은 PRL특이적인 immunocytochemistry 를통해서도재차확인되었음 ( 그림 19). ( 그림 19) PRL 발현확인 : western-blotting ( 좌 ), immunocytochemistry ( 우 ) 발현된 PRL의 anti-angiogenesis 유도능여부를확인하기위하여우선 Hela 세포를 MOI 1000 으로처치하고이틀후에배양액을회수하고이를 PRL 용액으로생각하여다음과같은실험을수행하였음. 즉 In vitro antiogenesis assay kit 를이용하여 HUVEC 세포의 tube formation 을유도하되이때 PRL 용액을처치하여 tubule 형성이저해되는지를확인하여 PRL의활성을검증하고자하였음. 이를위해위에서와같이준비한 PRL 용액처리군과대조군바이러스처리용액 ( 음성대조군 ) 처리군을준비하여 tube formation 에어떤변화가있는지를확인하였음. 그결과아래결과에서보듯이 Matri-gel, Diluent solution 을첨가하고 4시간후부터 tube formation 이일어나기시작함을확인하였고, 또한 24시간후엔음성대조군에서도형성된 tublule의변형이생겨음성대조군대비실험군사이의차이를제대로관찰할수없었음 ( 그림 20). 43

46 (그림 20) PRL 활성 분석: "in vitro antiogenesis assay kit" 이용법 이에 본 연구기법이 PRL 기능 분석에 적합지 못하다는 판단 하에 다른 연구기법 을 찾기 시작하였고, 아래와 같은 연구기법을 수행하였음. 즉 PRL의 세포증식 저해 능에 따른 anti- angiogenesis 저해정도를 확인하는 방법으로, 배양한 HUVEC cell 을 피펫 팁으로 긁어 일부 세포를 제거한 후 세포가 다시 증식하여 세포가 긁어진 부분을 다시 채우는지를 관찰하는 방법을 취하였음. 그 결과 GFP 바이러스 배양액 이 처치된 대조군의 경우에는 시간이 지남에 따라 세포가 제거된 빈 공간을 모두 채워버리는 반면, PRL 용액 처치군에서는 HUVEC 세포의 증식이 저해되어 빈공간 이 대조군에 비해 잘 채워지지 않았음. 이러한 결과는 신생혈관 유도를 저해하는 PRL 인자가 효과적으로 생산하고, 분비되었음을 의미하는 것으로, raav-plr의 활성이 확인 된 것임 (그림 21). 결론적으로 anti-angiogenesis 저해용 치료유전자로 본 연구에서 선정한 PRL이 장착된 raav 벡터는 성공적으로 제작되었고, 이는 본 연구에서 개선된 형질이 확 인된 retargeting vector 및 그 유도체에 장착 준비가 완료된 상태임. 44

47 ( 그림 21) PRL 활성분석 : 세포증식저해능분석법 15. raav5 바이러스표면단백에 Tyr/Lys 유전변이형을제작하고특성규명 : single mutation 유도과거본연구진이그항종양특이성을확인한 retargeting vector 즉 raav5의표면단백에 RGD 및 TNC 모티프를삽입한벡터들이표적특이적항종양성은확보되었으나야생형인 parental type 즉 raav에비해유전자전달효능이저하된약점을보강하기위해다음과같은연구배경하에표면단백에존재하는 Tyr/Lys 을 Phe/Arg으로치환하고자하였음. 이를위해우선 single mutation을유도하고자하였으며, 변이형의생산능을분석하고선택적유전자발현능이개선되는지를확인코자하였음. 이와같은연구에대한배경을좀더상세히살펴보면다음과같음. 즉최근 raav2의 capsid 표면단백의아미노산서열중외부에노출된 Tyr를 Phe로바꾸면세포내에서바이러스의 degradation 이저하되어결국유전자전달효율성이개선된다는논문이보고된바있음. 즉이들에따르면바이러스표면의 Tyr의 OH 잔기는바이러스가세포막에서수용체와반응후세포안으로들어올때세포막에존재하는 EGFR의효소반응으로인산화가되며, 이는 ubiquitination pathway 의초기반응으로궁극적으론바이러스가 ubiquitin-proteasome 반응으로분해된다는것임. 이를극복하기위해 Tyr을 OH 잔기가없는 Phe으로치환하면바이러스가온전히핵까지전달될수있어유전자전달효율성이증대된다는것임 ( 그림 22). 45

48 ( 그림 22) M ol. Ther. 15:1323-, 2007 ( 좌 ), PNA S, 105:7827-, 2008 ( 우 ). 이에본연구에서개발한 retargeting raav5의형질개선을위해 raav5의 Tyr 을 Phe으로치환하고자하였음. 이를위해우선 raav 혈청형들의표면단백의아미노산서열을 Tyr 및 Lys을중심으로분석하였고, 또한이중서열정보가혈청형간에어느정도보존적인지를확인하고또한동시에바이러스표면의어느부위에즉표면에노출되어있을지를컴퓨터모델링을통해분석하여보았음 ( 그림 23). ( 그림 23) raav5 포함다양한혈청형 raav 표면단백아미노산서열분석 : Tyr 중심 이를통해아미노산서열 242, 502, 521, 719 에있는 Tyr (Y) 과 251, 451 의 Lys (K) 가가능성이있다고판단하여이들을각각 Phe (F) 및 Arg (R) 로치환하기로 46

49 하였고, 이를추진하였음 ( 그림 24, 25). ( 그림 24) raav5 바이러스표면단백에 Tyr/Lys 유전변이형제작위해선정한 Tyr/Lys 위치 ( 그림 25) 선정한 Tyr/Lys ra A V5 표면단백의삼차구조상위치분석 우선이들잔기가유전적으로변형된벡터는 (single mutant 총 6종류 ) 모두제작할수있었고, 이를이용바이러스를생산하여본바모두바이러스생산에는문제가없음을확인할수있었음 ( 그림 26). 하지만실망스럽게도유전자전달효능은 parental type인 raav5와별반다르지않았음 (data not shown). 47

50 ( 그림 26) Single Tyr/Lys mutant ra A V5 바이러스들의바이러스생산능 16. raav5 표면단백에 Tyr 유전변이형을제작하고특성규명 : multiple mutation 유도 single mutation 의유전자전달효능이예상보다저조하여잔기가여러군데모두치환된 multiple mutation 형을제작하고자하였음. 즉 single mutation 결과는 Lys 치환은오히려유전자전달효율성에부정적인효과를보이는것으로생각되어이는제외하고 Tyr 242, 502, 521, 719 를 double, triple, quadruplet 형으로조합하여제작하였음. 그결과 multiple 돌연변이형들도모두바이러스생산에는좋다는긍정적인결과를획득하였음 ( 그림 27). 48

51 ( 그림 27) M ultiple Tyr mutant ra A V5 바이러스들의바이러스생산능 하지만이들바이러스들도유전자전달효능은 parental type인 raav5에비해크게증대되지는않았음 ( 그림 28). 그럼에도불구하고이들을 parental type인 raav5이아닌 retargeting raav5 즉 RGD, TNC형에삽입하는경우다른결과를획득할수도있을것이라기대됨. 49

52 ( 그림 28) Multiple mutant raav5 바이러스의유전자전달효능확인 (TE, MFI) 17. EGFR, PDGFR 수용체의암세포주발현정도분석 Tyr/Lys 유전변이형이암세포특이적으로개선된유전자전달효능을보이게되는생물학적인근거는이들종양세포에서 EGFR, PDGFR 수용체와같은막단백질이상대적으로과발현되어있기때문이라는가정이있기때문임. 이를확인해보기위해 EGFR은 western-blotting 으로 PDGFR의경우 immunocytochemistry 법을통해발현정도를확인하여보았음. 즉아래결과와같이다양한조직유래인체종양세포들에서양적차이는다소있지만이들 EGFR, PDGFR 수용체가대부분과발현되어있음을확인하였음 ( 그림 29, 30). 이러한사실은본연구성과물인 Tyr 변이형 retargeting raav의개선된항종양유전자전달효율성이가능할것임을강력히시사하는것임. ( 그림 29) 각종암세포주의 EGFR 발현정도분석 : W estern-blotting ( 그림 30) 각종암세포주의 PDGFR-α, β 발현정도분석 : immunocytochemistry 18. retargeting ra A V5 바이러스 (RGD, TNC 형 ) 표면단백에 Tyr 유전변이형을제작하고특성규명 Tyr 유전변이를 raav5이아닌 retargeting raav5 즉 RGD, TNC형에적용하는경우유전전달효율성이증대될수있을수있음. 이에 RGD, TNC형에 Tyr 50

53 multiple mutation 을시도하기로하고이를진행중에있음 ( 그림 29). ( 그림 31) Multiple mutant retargeting raav5 바이러스즉 RGD/ TNC 형제작 19. RGD, TNC를삽입된 raav5의표면단백 Tyr/Lys 유전적변형형 (multi mutant) plasmid를확보하고, RGD, TNC mutant virus의생산능및유전자발현확인미국 Epoch Biolabs 사에서제작한 RGD, TNC를삽입된 raav5의표면단백 Tyr/Lys 유전적변형형 (multi mutant) plasmid 를확보하고, 이를 psp72-r2c5-y242f vector 에 subcloning 하여 ( 주 ) 마크로젠에서염기서열을분석하였음. ( 그림 32) RGD, TNC mutant plasmid 의생산방법 51

54 purify virus 의생산은 ( 주 )SCT 에서하였으며, 생산된 purify virus 역가분석은 Real-time PCR 을이용하였음. 그결과각각의 RGD, TNC mutant virus 와 wild type virus 의생산능에는큰차이를보이지않는것을확인하였음. ( 그림 33) RGD, TNC mutant virus 의 virus 생산량 역가분석후각종세포주에감염하여 Flowcytometer 로 TE 및 M.F.I 측정을통해유전자발현을확인하였음. 각종세포주에따라차이를보였으나 RGD type의경우 wild type+rgd 에비해 raav5의표면단백 Tyr/Lys 유전적변형형 (multi mutant)+rgd 에서조금더높은유전자발현을 TE 및 M.F.I로확인. 하지만 wild type AAV5에비해서는조금낮은유전자발현을나타냄. TNC type의경우전체적으로매우낮은유전자발현을나타내어비교하기가어려움. 52

55 ( 그림 34) HeLa 에서의유전자전달효능확인 (TE, M.F.I) ( 그림 35) U87-M G 에서의유전자전달효능확인 (TE, M.F.I) 20. 암특이적 promoter(m 3) 와 anti-angiogenesis 치료용유전자 (PRL) 가삽입된 ra A V5의 plasmid를확보하고, virus의생산여부확인및역가분석 pgem-t easy vector 에우리가원하는 M3-PRL 이삽입된 plasmid 를 ( 주 ) 바이오니아에서제작하여우리가이미확보한 psp72-xp7-scaav2 vector 에 cloning 을하였음. 이를통해만들어진 plasmid 를 psp72-r2c2-m3-prl 로명명하고, ( 주 ) 마크로젠에서염기서열을분석하였음. ( 그림 36) pm 3-PRL 삽입 plasmid 의생산방법 바이러스생산여부확인을위해 Crude virs를생산하였음. 바이러스생산방법은 prep2cap5(pr2c5), phelper, cloning 을통해새롭게만든 plasmid(psp72-r2c2-m3-prl) 를사용하여 triple transfection(pei method) 을하였음. 6well plate(~80-90% confluence) 에상기 plasmid 를 molar ratio로 1:1:1 를취하여총 3.1ug 를처치하였음. 처치 24시간후새로운 media 로바꿔준후다시 24시간배양하였음. 배양하는동안수시로 CPE(cytopathic effect) 를확인하였음. 그후 harvest 하여 aliquot 한후 -80 o C에보관하였음. Real-time PCR 방법을수행하여바 53

56 이러스역가분석 (titration) 한결과 wild type AAV5 와 scaav5-cmv-prl 에비해 scaav5-m3-prl 의생산능이조금낮은것으로확인되나실험에는문제가없을 것으로생각됨. ( 그림 37) pm 3-PRL 삽입 ra A V5 virus 의 virus 생산량 즉 multiple mutant raav5 벡터에이미특성을규명한 RGD (RGD1) 와 TNC (TNC4) 모티프를유전적으로삽입하였고, plasmid 는확보하여현재 ( 주 ) 바이오닉스에 sequence 확인을의뢰한상태로 3월중에는바이러스생산및역가분석, 유전자전달효능 (TE, MFI) 확인이마무리될것으로예상됨. 21. mtor 발현저해를통한세포수준항암효능분석종간교차활성을가지는 mtor sirna의 mtor expression 저해효과규명을위해여러가지서열의보존적인부분을일차스크리닝후 sirna 를디자인할수있는프로그램인 CAPSID 를이용하여종간교차활성을지니는 mtor sirna 가제작되었음 (CAPSID reference : BBRC 2009). sirna design 을위해사용된 sequence 는 Human, Mouse, Rat의 mtor 염기서열을이용하였고, 여기에서 design 된 sirna 는 Monkey 에도보존적인염기서열임을확인하였음. 이렇게제작된 sirna를 Human, Monkey, Rat 을대표하는 HeLa, Vero, H9C2 세포에 lipofectamine 2000 을이용하여 transfection 시켰다. 그후 24 hour 에세포를거두어단백질을추출하여 mtor에대한항체를이용하여 Western blotting 을한결과세가지의세포모두에서 mtor 발현이감소됨을확인하였음 ( 그림 38). 54

57 ( 그림 38) 각종암세포주의 mtor sirna 효능분석 scaav2-mtor shrna 제작을위해선 mtor sirna에의한 mtor 발현저해를좀더오랜기간동안효과적으로유도하기위하여 shrna를계속적으로발현시킬수있는벡터시스템에위의 mtor sirna 염기서열을적용하였음. 벡터시스템은 ph1 promoter 이하 shrna가발현되고, CMV promoter 이하 GFP가동시에발현되어 GFP signal을통해 shrna 발현정도를확인할수있는시스템을사용하였음 ( 그림 39). ( 그림 39) sca A V2-mTOR shrna 벡터시스템 mtor shrna가발현되는 scaav2 virus를생산하기위해 PEI를이용한방법과 CaP 이용한방법을모두이용하였음. 그림 40의 GFP 사진과같이 transfection 후시간이지남에따라 GFP signal이강해지면서 shrna가생산되고있음을예측할수있었음. 즉 PEI method 와 CaP method 를이용하여 scaav2-mtorshrna, scaav2-scramble shrna를제작하였을때 10^9~10^10 TP/ml 의 crude stock 을얻을수있었음. 55

58 ( 그림 40) sca A V2-mTORshRNA virus 의 virus 생산량 scaav2-mtor shrna에의한 mtor 발현저해효과분석을위해선 scaav2-mtor shrna를 HeLa cell 에감염시킨후 2일, 4일, 6일에각각세포를거두어 western blotting을실시하였음. Total mtor는 scaav2-mtor shrna 감염후 2일부터저해되기시작하였으며이는 6일까지지속되었음. Phospho mtor는 scaav2-mtor shrna 감염후 4일부터저해됨을관찰하였고, 이러한현상은 Rapamycin treat (20nM, R 로표기 ) 시에는관찰되지않았음. mtorc1 의 direct down stream 인 p70 S6K 는 4일째에가장큰저해현상을볼수있었으나, 6일째에는세포의노화를전반적인 p70 S6K 의발현정도를관찰하지못하였음 ( 그림 41). ( 그림 41) sca A V2-mTOR shrna 에의한 mtor 발현저해효과분석 22. mtor 발현저해를통한세포및동물수준항암효능분석 Xenograft model 을이용하여 2 단계연구사업으로다른시험군벡터와함께암성 56

59 장억제효능을분석하였고그결과는현재문서 79~84 쪽에다른시험군결과와함 께분석평가됨. 23. 암조직특이적발현프로모터를삽입한 10종의 dual-target raav 벡터구축 (1) paav2-prc1-luc construct (2) paav2-m1-luc construct (3) paav2-m2-luc construct (4) paav2-m3-luc construct (5) paav2-m4-luc construct (6) paav2-prc1-ires2-luc construct (7) paav2-m1-ires2-luc construct (8) paav2-m2-ires2-luc construct (9) paav2-m3-ires2-luc construct (10) paav2-m4-ires2-luc construct ( 그림 42) Schematic maps of raav2-luc vectors containing PRC1 and its 57

60 deleted mutant promoters 24. 암조직특이적발현프로모터를함유한 raav2 벡터들의 in vitro 유전자발현효율성분석 raav2 벡터를기반으로암치료용고효율, 무독성및타겟형유전자전달체를개발하기위해, 암조직에특이적으로높게발현되는 PRC1, BIRC5, RRM2 프로모터를연구한결과 PRC1이가장암조직특이적으로강한발현을하는것을확인하였고, PRC1 프로모터를점차적으로 deletion 시킨 4 종류의 deleted mutants 프로모터및프로모터에 IRES 절편 (661-bp) 을삽입한 raav2 벡터를구축하였음. PRC1 프로모터는 in vitro 연구결과정상세포에서는매우약한프로모터활성을보인반면, 유방암세포주및폐암세포주에서 CMV 만큼강한암특이적인발현을하는것으로확인하였음. 그러나 BLI 시스템을이용한 in vivo 유전자발현연구 (HeLa를이식한 xenograft 마우스, 미정맥주사방법으로 raav 벡터주입 ) 에의하면암조직에서가장강한발현을하지만간에서도약한발현을하는결과를얻었음. 따라서, PRC1 프로모터를 5 말단으로부터점차적으로 deletion 한 mutant 프로모터를제작하였고, 바이러스게놈크기를조절하여 packaging 이효율적으로될수있게 IRES 절편을프로모터와 reporter 유전자인 luciferase cdna 사이에삽입한벡터를구축하였음. 이렇게구축된 raav2 벡터의암조직특이적인유전자발현효율성을 in vitro 연구를통해분석하였음. (1) Deleted mutants 프로모터만을함유하는 ra A V2벡터의 in vitro 유전자발현효율성평가 Deleted mutants 프로모터만을함유하는 raav2 벡터를 293T 및 UP-CVC-HEK293 생산세포주를이용하여생산한후, HeLa 암세포주에감염 (MOI 10,000 혹은 100,000) 시켜 luciferase 효소활성을측정함으로써 in vitro 유전자발현효율성을분석하였음. 각시험군에동일한감염율을적용하기위해 raav2-cmv-gfp 벡터 (MOI 1,000) 를 co-infection 하였고, FACS로분석한감염율을이용하여 normalization 하였음. 그림 43의결과는 293T 에서생산한 raav2 벡터를 HeLa 세포에 MOI 100,000(100K) 처리한후, 72 시간이경과하면 harvest 하여시험군당 lysate 의동일한총단백질양 (10 μg) 이가진 luciferase 활성을측정함으로써프로모터활성을분석하였음. 결과를정리하면, PRC1 wild type 프로모터활성에비해 M1 mutant 프로모터의활성은거의비슷하였고, M2는 32.27% 정도로매우낮은활성을나타내었음. 반면, M3와 M4는 wild type과비교할때각각 % 및 % 정도로활성이다소증대하였음. 한편, 이러한활성들을조직비특이적이고강한발현을하는 CM V 프로모터활성 ( 그래프, positive) 과비교하였는데 PRC1 프로모 58

61 터활성에비해 19.80% 정도로매우낮은프로모터활성을나타내었고, 이대조군을통해 PRC1이암조직에서강한발현을하는것을재확인할수있었음. 그래프에서 control 은음성대조군으로, mock infection 을하였던세포의 lysate를가지고 luciferase 활성을측정하였음. 예상과는아주다르게 PRC1 wild type 프로모터에 IRES 절편을삽입한벡터의활성은 1.11% 정도로너무낮은활성을보였음. 프로모터활성은상대적으로 M4 > M3 > PRC1 > M1 > > M2 > > CMV > > PRC1-IRES2 순으로평가됨. Infection of raavs (MOI 100K) Luciferase activity (total protein 10μg ) 상대값 (%) raav2-prc1-luc ± raav2-m1-luc ± raav2-m2-luc ± raav2-m3-luc ± raav2-m4-luc ± raav2-prc1-ires2-luc 5.10 ± raav2-cmv-luc (positive) ± Luc. activity control PRC1-Luc M1-Luc M2-Luc M3-Luc M4-Luc PRC1- IRES-Luc positive ( 그림 43) Promoter activities of raav2-luc vectors containing PRC1 and its deleted mutants 그림 44 의결과는 UP-CVC-HEK293 에서생산한 ra A V2 벡터를 HeLa 세포에 M OI 100,000(100K) 으로처리하였고감염율을동일하게 normalization 하기위해 ra A V2-CM V-GFP 벡터 (M OI 1K) 를 co-infection 하였음. 감염후 72 시간이경과하면 harvest 하여동일한총단백질양 (10 μg) 이가진 luciferase 활성을측정함으로써프로모터활성을분석하였음. 본실험은이전실험과비교하기위해생산세포주를변경하였고, 각시험군세포에대한감염율을동일하게 normalization 할수있도록 raav2-cmv-gfp 를시험군벡터감염에영향을주지않을정도인 MOI 1K 조건으로 co-infection 하였음. 감염율은 FACS cytometry 결과를 luciferase 활성에 normalization 함으로써동일한조건으로하였고프로모터 59

62 활성만을비교하는조건으로평가하였음. 그결과, 이전실험결과와다소다르기는하지만상대적인프로모터활성경향은유사한경향을보이는것으로평가하였음. PRC1 wild type 프로모터활성에비해 M1 mutant 프로모터의활성은 68.07% 로다소낮았고, M2는 46.82% 정도로매우낮은활성을나타내었음. 반면, M3와 M4 는 wild type과비교할때각각 79.80% 및 99.55% 정도의활성을보였음. 그래프에서 control 은음성대조군으로, mock infection 을하였던세포의 lysate를가지고 luciferase 활성을측정하였음. 이전실험결과와같이예상과는아주다르게 PRC1 wild type 프로모터에 IRES 절편을삽입한벡터의활성은 1.22% 정도로너무낮은활성을보였음. 실제로는 IRES 절편의삽입으로프로모터활성이다소증대하거나암조직특이적인강한발현증대를보일수도있으리라예상하였었음. 정리하면, 프로모터활성은상대적으로 PRC1 = M4 > M3 > M1 > > M2 > > > PRC1-IRES2 순으로평가됨. Co-Infection of raavs (MOI 100K) with raav2-cmv-gfp (MOI 1K) Luciferase activity (total protein 10 μg ) 상대값 (%) raav2-prc1-luc ± raav2-m1-luc ± raav2-m2-luc ± raav2-m3-luc ± raav2-m4-luc ± raav2-prc1-ires2-luc 7.34 ± Luc. activity control PRC1-Luc M1-Luc M2-Luc M3-Luc M4-Luc PRC1-IRES- Luc ( 그림 44) Promoter activities of raav2-luc vectors containing PRC1 and its deleted mutants 그림 45의결과는 293T 에서생산한 raav2 벡터를 HeLa 세포에 MOI 10,000(10K) 으로처리하였고감염율을동일하게 normalization 하기위해 ra A V2-CM V-GFP 벡터 (M OI 1K) 를 co-infection 하였음. 감염후 72 시간이경과하면 harvest 하여동일한총단백질양 (10 μg) 이가진 luciferase 활성을측정함 60

63 으로써프로모터활성을분석하였음. 본실험은첫번째 in vitro 실험을반복하면서이전실험을보강하기위해두가지조건을약간달리하였음. 처리하는 raav2 벡터양의과포화상태를방지하여프로모터활성차이에대한분석을정확히할수있도록 MOI 100K 를 10K 로감소하였고, 각시험군세포에대한감염율을동일하게 normalization 할수있도록 raav2-cmv-gfp 를시험군벡터감염에영향을주지않을정도인 MOI 1K 조건으로 co-infection 하였고, FACS cytometry 결과를이용하여 luciferase 활성을 normalization 하였음. 그결과, 이전실험결과와약간차이가있기는하지만상대적인프로모터활성경향은매우유사한것으로평가하였음. PRC1 wild type 프로모터활성에비해 M1 mutant 프로모터의활성은약간낮았고, M2는 46.93% 정도로매우낮은활성을나타내었음. 반면, M3와 M4는첫번째실험결과와거의유사하게각각 % 및 % 정도로활성이높은것으로평가되었음. 그래프에서 control 은음성대조군으로, mock infection 을하였던세포의 lysate를가지고 luciferase 활성을측정하였음. 반복적으로이번실험에서도예상과는아주다르게 PRC1 wild type 프로모터에 IRES 절편을삽입한벡터의활성은 1.40% 정도로너무낮은활성을보였음. 정리하면, 프로모터활성은상대적으로 M4 > M3 > PRC1 > M1 > > M2 > > > PRC1-IRES2 순으로평가됨. Co-Infection of raavs (MOI 10K) with Luciferase activity raav2-cmv-gfp (MOI 1K) (total protein 10μg ) 상대값 (%) raav2-prc1-luc ± raav2-m1-luc ± raav2-m2-luc ± raav2-m3-luc ± raav2-m4-luc ± raav2-prc1-ires2-luc 0.99 ± Luc. activity control PRC1-Luc M1-Luc M2-Luc M3-Luc M4-Luc PRC1- IRES2-Luc ( 그림 45) Promoter activities of raav2-luc vectors containing PRC1 and its deleted mutants 61

64 결론적으로, 생산세포주에거의무관하게프로모터활성은상대적으로 M4 > M3 > PRC1 > M1 > > M2 > > > PRC1-IRES2 순인것으로평가되었고, CMV 프로모터가 PRC1에비해매우낮은활성을보이는것을통해 PRC1이암조직특이적으로강한발현을하는프로모터임이재확인되었음. 또한 293T 세포에서생산한 raav2 벡터를감염조건 MOI 100K 혹은 10K 에서실시한것이거의유사한프로모터활성경향을보였으므로어느감염조건도바이러스벡터가과포화상태가아님을증명할수있었음. 예상과는다르게반복적으로 PRC1에비해 PRC1-IRES2 활성이매우낮은경향을보였는데, 유전자발현율을강하게저해하는원인이무엇인지를분석하고있음. (2) Deleted mutants 프로모터에 IRES 절편을삽입한 raav2벡터의 in vitro 유전자발현효율성평가 인간유래정상세포주 W I38과암세포주인 HeLa, A549, NCI-H460, HT1080 등에 IRES 절편을프로모터바로뒤에삽입한 ra A V2-Luc 벡터를감염시켜프로모터활성과 in vitro 유전자발현정도를평가하였음. 생산은 293T 세포주를이용하였고, M OI 100K 조건에서감염한후 72 시간이경과하면 harvest 하여동일한총단백질양 (10 μg) 이가진 luciferase 활성을측정함으로써 in vitro 유전자발현정도를분석하였음. Infection of raavs (MOI 100K) WI38 HeLa A549 NCI-H460 HT1080 raav2-prc1-ires2-luc 0.30 ± ± ± ± ± 0.08 raav2-m1-ires2-luc 0.97 ± ± ± ± ± 2.39 raav2-m2-ires2-luc 0.34 ± ± ± ± ± 0.17 raav2-m3-ires2-luc 0.65 ± ± ± ± ± 1.42 raav2-m4-ires2-luc 0.62 ± ± ± ± ± 1.59 raav2-cmv-ires2-luc ± ± ± ± ± WI HeLa Luc. activity control PRC1-IRES2 M1-IRES2 M2-IRES2 M3-IRES2 M4-IRES2 CMV-IRES2 Luc. activity control PRC1-IRES2 M1-IRES2 M2-IRES2 M3-IRES2 M4-IRES2 CMV -IRES2 62

65 Luc. activity A549 control PRC1-IRES2 M1-IRES2 M2-IRES2 M3-IRES2 M4-IRES2 CMV-IRES2 Luc. activity NCI-H460 control PRC1-IRES2 M1-IRES2 M2-IRES2 M3-IRES2 M4-IRES2 CMV-IRES2 HT1080 Luc. activity control PRC1-IRES2 M1-IRES2 M2-IRES2 M3-IRES2 M4-IRES2 CMV-IRES2 ( 그림 46) Promoter activities of raav2-ires2-luc vectors containing PRC1 and its deleted mutants in various cancer cells and normal cells 이전실험에서얻은결과대로정상세포및여러종류의암세포주에서도 IRES 절편을삽입한 raav2 벡터의활성은매우낮았음. 그러나, raav2-cmv-ires2-luc 벡터의활성은 IRES 삽입여부에상관없이 in vitro 유전자발현에저해를받지않았음 ( 그림 46). IRES 절편이삽입된벡터들의염기서열분석결과, raav2-cmv-ires2-luc 를제외하고는 subcloning 과정에서정상적인 ORF의 upstream 부위에또다른 ATG start codon 이형성됨을확인하였고, 이것이유전자발현을저해할가능성이매우높은것으로분석되었음. 현재 Quick-Change TM 방법 (Stratagene, USA) 을이용한 site-directed mutagenesis 가진행되고있으므로문제점을해결할가능성이높음. 25. Dual targeting ra A V2 5종류벡터의암조직특이적발현 in vitro 프로모터활성분석암조직특이적프로모터를포함한 dual targeting raav2-luc vectors 와대조군으로는대부분모든조직에서강하게발현을하는 CMV 프로모터를포함한 raav2-cmv-luc 벡터를 293T 에서생산하였고, CsCl density gradient 원심분리방법으로정제하여프로모터활성연구에사용하였음. 생산된 raav2 벡터는 A549, HeLa 및 HCT116 등세종류의암세포주에 MOI 10,000(10K) 감염조건으로처리하였고 normalization 하여동일한조건에서비교분석하기위해 raav2-cmv-gfp 벡터 (MOI 1K) 를 co-infection 하였음. 감염후 72시간이경과하면 harvest 하여동일한총단백질양 (10 μg) 이가진 luciferase 활성을측정함으로써프로모터활성을분석하였음. 각시험군세포에대한감염율을동일하게 63

66 normalization 할수있도록 raav2-cmv-gfp 를시험군벡터감염에영향을주지않을정도인 MOI 1K 조건으로 co-infection 하였고, FACS cytometry 결과를이용하여 luciferase 활성을 normalization 하였음. 아래결과를정리하면, 암세포주에따라 CMV 활성에는다소차이가있지만, CMV에대한 5 종류암조직특이적프로모터들의상대적인프로모터활성경향은매우유사한것으로평가하였음. 다양한인간유래암세포주, 즉폐암세포주 A549, 자궁경부암세포주 HeLa와대장암세포주 HCT116 에서 PRC1, M1~M4 등모든 5 종류암조직특이적발현프로모터들의활성은 CMV에비해매우강한발현을나타내었고, 수배 ~ 수십배강한발현을하는것으로반복실험을통해확인하였음. 한편, PRC1과삭제변이를통해제작된프로모터간의활성차이는암세포주에따라다소차이가있었으나, 그상대적인경향은모든암세포주에서매우유사한것으로분석되었음. 가장강한프로모터활성을갖는것은 M3와 M4로 M3가약간프로모터활성이높으나실험오차범위정도이고거의비슷한활성을갖는것으로분석되었음. M1, M2 및 PRC1는서로간에는매우유사한활성을보였으며, M3와 M4에비해서는 50% 정도의낮은활성을나타내었음. 반면, 대조군세포주인 HEK293 세포주에서는 CMV 프로모터활성이가장강한발현을하는것으로분석되었고, 나머지프로모터들은낮은활성을나타내었으며특히 M1, M2 및 PRC1는 CMV에비해 30% 정도로매우낮은활성을보였음 ( 그림 47). 64

67 ( 그림 47) Tumor-specific expressions of dual targeting raav2-luc vectors containing PRC1 and its deleted mutants (M1~M4) in HeLa, A549, HCT116 and HEK293 cell lines 정리하면, PRC1 및 M1~M4 프로모터는시험에사용된모든암세포주에서강한암조직특이적인발현을하는것으로평가되었고, 대조군프로모터인 CMV에비해수배 ~ 수십배강한발현을하는것으로분석되었음. 그상대적인프로모터활성에대한순서는 M3 M4 > > M1 PRC1 M2 > > > > > CMV 로평가되었음 ( 특허출원 ). 26. PRC1 기반의암조직특이적프로모터를함유한 ra A V2 벡터의 in vivo 유전자발현분석 Xenogen IVIS 기기를이용한 BLI 생체영상시스템으로 raav2 벡터의 in vivo 생체내분포및유전자발현정도를분석하였음. 이전에보고하였듯이 HeLa 암세포를이식한누드마우스에 raav2-prc1-luc 벡터 3x10 11 virus genomes(v.g.)/ 마우스를미정맥주사한후 BLI 분석을수행하였고, 정확히어느장기에벡터가분포하고있는지를장기적출후 BLI를재실시하여확인하였음. 그림 48의오른쪽패널결과와같이 IV 투여한 raav2 벡터는주로종양과간부위에분포되어발현하는것으로관찰되었고, 적출한장기의분석을통해이를확인할수있었음 ( 그림 48 왼쪽패널 ). 65

68 ( 그림 48) I n vivo distribution of raav2-prc1-luc vectors in HeLa-implanted nude mice HeLa 암세포를이식한누드마우스에 PRC1 wild type 프로모터이외에 deleted mutant 프로모터만을 (M1~M4) 포함한 raav2-luc 벡터 3x10 11 virus genomes(v.g.)/ 마우스를미정맥주사 (IV투여) 하였고, BLI 분석을통해 raav2 벡터의생체내분포및 in vivo 유전자발현정도를분석하였음. 아래그림에서와같이 PRC1 wild type ( 그림 49, WT) 의유전자발현은이전연구에서장기적출을통해확인하였듯이종양부위와간조직에서강하게발현하였음. 벡터주입후 2일째인 Day2 에서는 in vitro 프로모터활성결과와는다르게 deleted mutant 프로모터들이 WT에비해약한발현을보였으나, 시간이경과함에따라 Day7 에서는 in vitro 활성과유사하게 M3 및 M4의활성이 WT보다강하였고, in vitro 결과와는상이하게 M2의활성도 M4 정도로높았음. 특히 Day7 에서의 M2 및 M3 프로모터의유전자발현은강함과동시에대부분종양부위에서만발현되는듯한 BLI 결과를얻었음. 바로장기를적출하여확인하는실험을실시하였으나활성이약하여감지되지않았음. 66

69 ( 그림 49) I n vivo distribution of raav2-prc1(or M1-M4)-Luc vectors in HeLa-implanted nude mice HeLa 암세포를이식한누드마우스에 raav2-cmv-luc 벡터 3x10 11 virus genomes(v.g.)/ 마우스를복강투여 (IP) 혹은미정맥투여 (IV) 방법으로주사하였고, 시간에따른 in vivo 발현양상을 BLI 분석을통해그림 50과같은결과 (Top & Bottom panel) 를얻었음. 각시험군당 2마리씩준비하여실시하였음. Top panel 결과에의하면이전결과와같이시간이경과함에따라유전자발현정도가지속적으로증대하였고, IP 투여에의한발현이 IV 투여방법보다훨씬강한발현을보였음. Day18 분석후시험군중 IP 투여한 1 set 마우스의장기를바로적출하여재분석을실시한결과아래그림 50 (Bottom panel) 에서와같이강한발현을보이는장기가부고환과신장인것을확인할수있었음. 67

70 ( 그림 50) I n vivo distribution of raav2-cmv-luc vectors in HeLa-implanted nude mice monitored by a Xenogen IVIS BLI system (Chungbuk National University) 27. Dual targeting ra AV2-Luc 벡터의암조직특이적발현및 in vivo 프로모터활성분석 PRC1과 M1~M4 의암조직특이적인발현을세종류의암세포주에서확인한후, 생체내에서의조직특이적인발현및프로모터활성을분석하기위해, HeLa 혹은 A549 세포 (1.0 x 10 7 cells/mouse) 를이식한 5주령누드마우스를이용하여연구하였음. 이식한암세포가종양으로자라기시작하면 raav2-cmv-luc 벡터를투여한시험군을대조군으로하여 5종의 raav2-luc 벡터를 3 x virus genomes(v.g.)/ 마우스조건으로미정맥주사 (tail-vein injection) 하였고, BLI 분석 (Xenogen IVIS 200 series, 충북대실험동물연구지원센터 ) 을통해생체내발현양상및정도를확인하였음. 바이러스벡터를투여한시점을 Day0로지정하여 24시간 68

71 후를 Day1 로하였고, HeLa 를이식한마우스는 Day1, Day3, Day5, Day7, Day9, Day11 에발현분석을하였고, HeLa 보다종양이느리게성장하는 A549 의경우는 Day1, Day4, Day6, Day8, Day10, Day12 에 BLI 분석을실시하였음. ( 그림 51) I n vivo promoter activities and expression profiles of ra A V2-(PRC1, M 1~M 4 and CM V) in HeLa-implanted nude mice 상기그림 51의결과와같이 HeLa 암세포를이식한누드마우스에서는 raav 벡터를투여한후 24시간부터강한발현을측정할수있었고 Day11 까지지속적으로발현강도가증가되었음. 괴사로인하여실험이중단되었지만 AAV 벡터의장점과같이장기간동안강한발현이지속되는것을확인할수있었음. 암조직특이적인 In vitro 프로모터활성이 in vivo 에서도확인되었는데, in vivo 생체내에서도상대적인프로모터활성에대한순서가 M3 M4 > > M1 PRC1 M2 > > > > > CMV 로평가되었음. 단지 tail-vein 투여방식으로체순환에의한생체내표적화연구를실시하므로, 투여한모든벡터는 portal vein을거쳐일단간을경유하게되므로, 종양에서강한발현을하는반면, 간에서도강한발현을하는것 69

72 이관찰되었음. 이러한생체이미지결과를장기에서확인하기위해 Day11 시험완료후, 마우스가마취에서깨어나면바로 D-luciferin potassium salt (MIPS, USA) 기질을재투여하였고, 10분경과후장기를빠르게적출하여 6-well plate에간장, 비장, 신장, 고환, 부고환, 폐장, 심장, 종양 ( 오른쪽 ), 종양 ( 왼쪽 ) 조직을위치하게한후동일한방법으로 IVIS 200 series 로발현정도를분석하여그림 52와같은결과를얻었음. ( 그림 52) Tissue expression profiles of raav2-(prc1, M1~M4 and CMV) in HeLa-implanted nude mice 모든종류시험군의장기는그림 52 아래중앙에표기한순서대로 6-well plate에넣어 BLI분석을하였음. 예상과는달리왼쪽상단에있는 6-well plate인 PRC1 시험군의장기에서만활성이감지되었고오른쪽하단에크게확대하였듯이양쪽종양에서만강한발현을하는것으로평가되었음. HeLa 암세포를이식한누드마우스에서는암종양이빠르게성장하는반면, A549 를이식한종양은매우느리게성장하였음. 상기결과와같이 HeLa를이식한마우스에비해 A549 를이식한마우스에서의 raav 벡터발현은전반적으로약한편이었음. raav 벡터를투여한후 24시간부터 M1, M3, M4 가유사한발현을보이다가 Day12 에서는상대적인프로모터활성에대한순서가 M3 M4 >> M1 PRC1를보이는것으로평가되었고 M2와 CMV에서는발현이거의감지되지않았음 ( 그림 53). 70

73 ( 그림 53) I n vivo promoter activities and expression profiles of ra A V2-(PRC1, M 1~M 4 and CM V) in A 549-implanted nude mice 71

74 28. Dual targeting raav 벡터기반의 9종암치료용유전자치료제벡터제작및치료효능분석상기에서암조직특이적인강한발현이확인된프로모터를함유한 raav2 기반의 dual targeting raav2 벡터에 anti-angiogenesis 치료효능이기대되는 anti-sense human VEGF-A (nucleotide positions, -14~415), truncated soluble human VEGF receptor R1 (amino acid positions, 1-656) 및 truncated soluble human VEGF receptor R2 (amino acid positions, 1-804) cdna를삽입하거나, apoptosis 에의한암세포사멸효능이기대되는 human TRAIL (amino acid positions, 1-281), truncated soluble human TRAIL (amino acid positions, ), truncated soluble human TRAIL (amino acid positions, ) cdna를포함하는 9종의 raav2 벡터를제작하였음. 암조직특이적인치료효능을위해 PRC1 혹은 M3 프로모터를포함하도록암치료용유전자치료제를개발하였음 ( 그림 54). ( 그림 54) Schematic maps of dual targeting raav2-(prc1 or M1) vectors containing various therapeutic cdna s 우선 CMV 프로모터를포함한 raav2 antisense human VEGF-A cdna를포함하는벡터의 VEGF 단백질발현억제효능을분석하였음. 그림 55와같이각종암세포주에 MOI 200K 조건으로감염한후 72시간이경과하면세포를수거하여 cell lysate를이용하여 Biotrak ELISA 시스템으로 VEGF 단백질을정량하였음. 암세포주종류에따라 in vitro efficacy 의차이가많았고, 인간유래대장암세포주인 T84에서 VEGF 단백질발현억제효능이 56% 이상으로가장우수하였음. 72

75 ( 그림 55) In vitro efficacy of raav2-cmv-ashvegf-a vectors by suppression of hvegf-a protein expressions In vitro efficacy 효능을 VEGF 단백질발현양이높은조건에서연구하기위해다양한인간유래암세포주의 VEGF 단백질발현양을 ELISA 방법으로분석하였음. 가장높은발현을하는 HT1080 세포주를포함하여이번에는동일한감염조건으로 raav2-prc1-ashvegf-a 벡터를처리하였고감염후 72시간이경과하면세포를수거하여 VEGF 단백질을정량하였음 ( 그림 56). ( 그림 56) In vitro efficacy of raav2-prc1-ashvegf-a vectors by suppression of hvegf-a protein expressions 73

76 Truncated soluble human VEGF receptor R1과 R2를포함하는 raav2-cmv 벡터의 in vitro efficacy 는 HUVEC (wound healing) migration assay 방법으로분석하였음. HUVEC에 wound를만든후 VEGF angiogenic factor 를처리하였고, 대조군에비해치료용벡터에감염된 HUVEC(MOI 200K, 72시간감염 ) 이동능력을분석하였음. 아래결과를정리하면, 대조군 HUVEC 세포 ( 음성대조군및 GFP 유전자를발현하는 raav 벡터에감염된세포 ) 에서비하여 raav2-cmv-tshvegf-r1 혹은 R2에의해감염된 HUVE 세포들은이동하는정도가각 26.6%, 46.6% 정도감소하였고, 두종류의벡터를함께처리하면시너지효과보다는중간정도의이동억제효능을나타내었음 ( 그림 57). ( 그림 57) In vitro efficacy of raav2-cmv-tshvegf-r1/r2 vectors by suppression of HUVE cell migration 한편, 암조직특이적인강한발현을하는 raav2-prc1 벡터에 truncated soluble human VEGF receptor R1과 R2 cdna가포함된벡터를 MOI 200K 감염조건으로 HUVEC에처리하고동일한방법으로 in vitro efficacy 를분석하면, 아래결과와같이 raav2-prc1-gfp 에감염된대조군에비하여 ra A V2-PRC1-TShVEGF-R1 혹은 R2에의해감염된 HUVE 세포들의이동하는능력은각 59.0%, 65.1% 정도로크게감소하였고, 두종류의벡터를함께처리하면이번에는약간의시너지효과를나타내어 67.4% 정도로 cell migration 능력이매우억제되었음 ( 그림 58). 74

77 ( 그림 58) In vitro efficacy of raav2-prc1-tshvegf-r1/r2 vectors by suppression of HUVE cell migration 이러한 cell migration 억제효능이 raav2-prc1-tshvegf-r1 와 R2의발현에의한효과인것을증명하기위해동일하게감염처리된시험군들의세포들로부터 total RNA를추출하여 RT-PCR 방법으로각 cdna의염기서열특이적프라이머를이용하여확인하였음. RT-PCR에이용한 cdna 양을 normalization 하기위해리보솜 RNA의 L32 프라이머를이용하여함께 PCR을실시함 ( 그림 59). ( 그림 59) RT-PCRs of the expressed truncated soluble human VEGF receptor-1 (R1) and receptor 2 (R2) in HUVEC infected with ra A V2-PRC1-TShVEGF-R1/R2 Human TRAIL 은 full length (amino acids, 1~281), 두종류의 truncated soluble 형태 (amino acids, 95~281 또는 114~281) 로발현되는 raav2 벡터를제작하였고, 75

78 PRC1 이나 M3 프로모터를삽입하여총 6종류의 raav2 벡터를제작한후, 각벡터의암세포를사멸하는효능을분석하였음. 우선은 raav2-prc1(m3)-htrail, TShTRAIL(95-281), TShTRAIL( ) 각벡터를 MOI 20K 혹은 200K 감염조건으로 HeLa 세포에처리한후 96시간경과하면살아있는세포를 Hemocytometer 로 counting 하여각벡터들의암세포사멸효능을분석하였음. 예상과는달리 PRC1 프로모터에의한효능이 M 3 보다우수하였고, 그중에서도특히 raav2-prc1-htrail 을 MOI 200K 조건으로감염한 HeLa의세포사멸효능은대조군에비하여 71.8% 증대하였음 ( 그림 60). ( 그림 60) Relative cell deaths in HeLa cells infected with raav2-prc1(m3)-htrail, TShTRAIL(95-281) or TShTRAIL( ) counted by a hemocytometer 암세포사멸효능을다양한방법으로확인분석하기위하여 PRC1 프로모터를가진 raav2 벡터만을이용하여현미경분석및 MTT assay 방법으로다음과같이수행하였음. 그림 61의결과는동일한감염조건으로 raav 벡터에감염된 HeLa 세포를감염후 96 시간이경과하면위상차도립현미경으로암세포사멸정도를관찰하였음. 76

79 ( 그림 61) Relative cell deaths in HeLa cells infected with raav2-prc1-htrail, TShTRAIL(95-281) or TShTRAIL( ) monitored by a microscopy 전반적으로 htrail 이암세포사멸효능이가장우수한데대조군보다 22% 정 도의암세포주사멸효능증대를보였고, 다른두종류의 truncated soluble TRAIL 은모두약한효과만을 MTT assay 결과확인하였음 ( 그림 62). ( 그림 62) Relative cell deaths in HeLa cells infected with raav2-prc1-htrail, TShTRAIL(95-281) or TShTRAIL( ) measured by an M TT assay 77

80 29. Dual targeting A A V 벡터기반의암치료용유전자치료제의 in vivo 치료효능분석 (1) 사망률시험전기간을통하여대조군및 dual targeting AAV 벡터및항암제투여군모두에서사망한사례는전혀관찰되지않았음. (2) 체중변화 대조군및 dual targeting AAV 벡터및항암제투여군간의이상체중변화는관 찰되지않았음. ( 그림 63) 체중변화 (3) 종양체적변화 Xenograft 동물모델 (NCI-H292 폐암세포주이식 ) 을이용한 dual targeting AAV 벡터의 in vivo 치료효능을분석한결과, raav2-prc1-tshvegf-r2, raav2-ph1-mtor 및 raav-prolactin 시험군의경우대조군에비하여각각 40%, 51%, 33% 이상의암성장억제효능을보였고, 항암치료제인 Tarceva 와 paclitaxel 의경우에는각각 85%, 48% 의암성장억제효능을나타내었음. 그리고 AAV벡터와항암제를병용하여투여한실험군에서는항암효능이개선되는결과를보이지는않았음. 본연구과제에서개발한 dual targeting AAV 벡터가기존에널리사용되고있는항암제인 paclitaxel 과비슷한항암효능을나타내는결과를볼때항암치료제개발의소재로써매우높은가능성을가지고있다고생각됨 ( 그림 64). 78

81 ( 그림 64) I n vivo anti-tumor efficacy of raav2 vectors in NCI-H292 implanted nude mice (4) 병리학적소견부검시육안소견으로는심장, 폐장, 간장, 신장, 비장, 고환및부고환의주요장기및그외에서의시험물질투여에기인한다고여겨지는특이적은소견이관찰되지않았으며조직병리학적검사를위해주요장기를 Bouin' s solution에고정한후조직처리과정을거쳐 H&E 염색을통하여조직병리학적검사를실시한결과도모든장기에있어서대조군와비교하여특이적인이상소견을발견할수없었음 ( 그림 65 72). 79

82 ( 그림 65) H&E Staining - Liver A : 대조군, B : AAV-CMV-Luc, C : AAV-SR2, D : Tarceva E : AAV-SR2 +Tarceva, F : AAV-SR2 +Paclitaxel G : Paclitaxel, H : AAV-mTOR, I: AAV-Prolactin ( 그림 66) H&E Staining - Heart A : 대조군, B : AAV-CMV-Luc, C : AAV-SR2, D : Tarceva E : AAV-SR2 +Tarceva, F : AAV-SR2 +Paclitaxel G : Paclitaxel, H : AAV-mTOR, I: AAV-Prolactin 80

83 ( 그림 67) H&E Staining - Kidney A : 대조군, B : AAV-CMV-Luc, C : AAV-SR2, D : Tarceva E : AAV-SR2 +Tarceva, F : AAV-SR2 +Paclitaxel G : Paclitaxel, H : AAV-mTOR, I: AAV-Prolactin ( 그림 68) H&E Staining - Spleen A : 대조군, B : AAV-CMV-Luc, C : AAV-SR2, D : Tarceva E : AAV-SR2 +Tarceva, F : AAV-SR2 +Paclitaxel G : Paclitaxel, H : AAV-mTOR, I: AAV-Prolactin 81

84 ( 그림 69) H&E Staining - Lung A : 대조군, B : AAV-CMV-Luc, C : AAV-SR2, D : Tarceva E : AAV-SR2 +Tarceva, F : AAV-SR2 +Paclitaxel G : Paclitaxel, H : AAV-mTOR, I: AAV-Prolactin ( 그림 70) H&E Staining - Testis A : 대조군, B : AAV-CMV-Luc, C : AAV-SR2, D : Tarceva E : AAV-SR2 +Tarceva, F : AAV-SR2 +Paclitaxel G : Paclitaxel, H : AAV-mTOR, I: AAV-Prolactin 82

85 ( 그림 71) H&E Staining - Epididymis A : 대조군, B : AAV-CMV-Luc, C : AAV-SR2, D : Tarceva E : AAV-SR2 +Tarceva, F : AAV-SR2 +Paclitaxel G : Paclitaxel, H : AAV-mTOR, I: AAV-Prolactin ( 그림 72) H&E Staining - Tumor A : 대조군, B : AAV-CMV-Luc, C : AAV-SR2, D : Tarceva E : AAV-SR2 +Tarceva, F : AAV-SR2 +Paclitaxel G : Paclitaxel, H : AAV-mTOR, I: AAV-Prolactin 83

86 30. ra A V 벡터생산세포주및 transfection 방법에따른대량생산효율성및감염율비교 1 HEK293, 293T 및 UP-CVC-HEK293 (U Penn의 Dr. KA High로부터얻은새로확립된세포주, 연구방법참조 ) 등세가지생산세포주를이용하여생산효율성을연구하였고, 2 triple co-transfection 후 harvest 할때세포만수거하여정제하는방법 ( 그림 73, Cell) 과세포와배지모두수거하여 ( 그림 73, Cell+Media) 정제한경우의생산효율성및감염율비교연구, 3 adherent 및 suspension 배양방법을비교하였고, transfection reagent (Ca-P 혹은 PEI) 에따른생산효율성도비교하였음. 이전연구를통해 transfection 후 48시간이경과하였을때가장생산효율성이높았으므로모든시험조건에서이조건을적용하였음. (1) HEK293 및 293T 세포주를이용하여세포만혹은세포와배지를모두이용한경우 의생산효율성평가 ( 그림 73) Production and infection efficiencies of raav2-cmv-gfp vectors from HEK293 and 293T producing cell lines raav2-cmv-gfp 벡터를 HEK293 및 293T 세포주를이용하여 Ca-P precipitation 방법으로 triple co-transfection 한후, 24 시간이경과하여형광현미경 84

87 으로분석하면그림 73의왼쪽 top panel 과같이 293T 세포가 transfection 효율성이매우우수하게평가되었음. Transfection 후 48 시간이경과하면세포만 (Cell) 혹은세포와배지를모두수거하여 (Cell+Media), CsCl gradient 밀도구배방법으로 raav2 벡터의정제를실시하였고, 생산한 total titer를정량하면오른쪽 top panel 그래프와같이 293세포가 HEK293 세포에비해 10배정도생산효율성이높은것을확인할수있었음. 또한, 세포만이용하는방법에비해세포와배지모두를이용하여정제한경우생산효율성도약간증대하였고감염율도매우높은것으로분석되었음 (Bottom panel). (2) HEK293, 293T, UP-CVC-HEK293 생산세포주를이용한생산효율성평가 ( 세포와배지모두이용 ) (1) 의연구결과에따라세포와배지를모두이용하는방법으로세가지생산세포주의생산효율성을분석하였음. raav2-cmv-gfp 벡터를 HEK293, 293T, UP-CVC-HEK293 세포주를이용하여 Ca-P precipitation 방법으로 triple co-transfection 한후, 24 시간이경과하여형광현미경으로분석하면그림 74 왼쪽 top panel과같이 293T 세포가 transfection 효율성이가장우수한것으로평가되었음. Transfection 후 48 시간이경과하여세포와배지를모두수거하였고, CsCl gradient 밀도구배방법으로 raav2 벡터를정제및생산하면, 정량한 total titer가오른쪽 top panel 그래프와같이 UP-CVC-HEK293 (1.7 x 10 5 v.g./cell) > 293T (1.5 x 10 5 v.g./cell) > HEK293 (1.1 x 10 4 v.g./cell) 순으로생산효율성차이를보였음. 또한각생산세포주에서생산한 raav2 벡터의감염율을분석한결과, bottom panel 양쪽결과 ( 형광현미경분석및 FACS cytometry 분석 ) 에서정제된 ra A V 벡터의감염율은생산세포주에관계없이거의비슷하였으나 293T 로부터생산한 raav2 벡터가가장감염율이높은것으로평가되었음. 85

88 ( 그림 74) Production and infection efficiencies of raav2-cmv-gfp vectors from HEK293, 293T and UP-CVC-HEK293 producing cell lines (3) 293T 를이용한 Adherent 혹은 suspension 배양방법, 또한 transfection reagent 차이에따른생산효율성평가 ( 세포와배지모두이용 ) (2) 의연구결과에따라세포와배지를모두이용하는방법으로가장생산효율성이좋고감염율도우수하며향후 Master 생산세포주를구축하는데유리한 293T 생산세포주를이용하여본실험을수행하였음. 우선 adherent 및 suspension 세포배양방법으로 transfection reagent 에따른생산효율성을연구하였는데, Ca-P, linear PEI, 혹은 Branched PEI를이용하여 triple co-transfection 을실시한그림 75와같이 Adherent 배양방법으로 Ca-P 및 linear PEI를이용하여 transfection 하는것이가장효율성이높았음. 반면 Branched PEI를이용하여 transfection 한경우아래현미경사진과같이세포손상이매우심하였고, 효율성도 57.38% 정도로매우낮은편이어서이후연구에서는시험조건에서제외하였음. 한편, suspension 세포배양방법에서는 linear PEI를이용하는 transfection 방법이가장높은효율성을나타내었음. 정리하면, 전반적으로 adherent 세포배양방법이 suspension 방법보다 transfection 효율성이높았고, Ca-P 및 linear PEI는거의비슷한효율성을나 86

89 타내었으나, linear PEI 가보다높은 transfection 효율성을나타내는것으로평 가됨. ( 그림 75) Production efficiencies of raav2-cmv-gfp vectors from 293T cells 상기의방법으로 transfection 한후 48시간이경과하면세포와배지를모두수거하여 CsCl gradient 밀도구배방법으로 raav 벡터를정제하였고, 정량한 total titer를그림 76과같이정리하였음. 결과를정리하면, transfection 효율성과유사하게 raav2 벡터생산효율성도 adherant 세포배양방법이우수하였고, PEI가 Ca-P 방법보다효율성이높은것으로분석되었음. 즉, 생산효율성순서는 adherent-pei > adherent-ca-p > suspension-pei > suspension-ca-p 로평가됨. 87

90 ( 그림 76) Summarized production and infection efficiencies of ra A V2-CM V-GFP from 293T 한편, 생산된벡터의감염율을 HeLa 암세포주를이용하여 MOI 2K 및 20K 로 처리하여분석하였는데, 형광현미경분석 ( 그림 77, 78) 및 FACS cytometry 분석결 과 ( 그림 74) 에의하면생산방법에관계없이거의유사한것으로분석되었음. ( 그림 77) Production and infection efficiencies of raav2-cmv-gfp vectors from 293T cells ( 그림 78) Production and infection efficiencies of raav2-cmv-gfp vectors from 293T cells 31. 임상시험용의약품 raa V 벡터대량생산및정제방법개발 raav-cmv-gfp 벡터를이용하여 293T 생산세포주에서대량생산을실시하였 음. 대량생산이후정제과정으로는, 1 CsCl density gradient 원심분리방법 2 회, 2 88

91 CsCl density gradient 원심분리 1회및 Centricon filtration 방법 (Millipore, YM-100) 을이용한저분자오염물질제거방법, 3 Na-Phosphate (ph 7.3) 혹은 acetate (ph 5.0) 기반의이온교환수지크로마토그래피방법을통해순수분리하게벡터를 CsCl density gradient 원심분리방법 4 PEG8000 흡착법과 CsCl density gradient 원심분리 2회를실시하는정제과정을진행하였음. 이렇게네가지방법으로정제한 raav 벡터는 12% SDS-PAGE 하여분리하였고, coomassie staining, silver staining, western blot 방법으로순수한정도를분석하였음. ( 그림 79) Coomassie staining of the purified raav-cmv-gfp vectors from 293T producing cell lines 그림 79의왼쪽패널결과와같이기존방법인 CsCl density gradient 원심분리를 2회실시한것에비하여 Centricon을통해 filtration까지포함하면많은오염물질들이제거되어정제정도가향상되는것을상기 coomassie staining 결과로확인할수있었음. 한편, 이온교환수지크로마토그래피방법또는 PEG8000 을이용한흡착법을병용하여정제한결과아래결과와같이 CsCl density gradient 원심분리방법만사용한경우에비해매우순수하게정제된주요세개의단백질밴드가보였고 (silver staining), 이들은 VP1, VP2, VP3에해당하는것으로 western blot 분석결과확인하였음 ( 그림 80). 89

92 ( 그림 80) W estern blot analysis and silver staining of the purified raav-cmv-gfp vectors from 293T producing cell lines 32. 임상시험용의약품 raav 벡터의생산기반구축 293T 세포주를 ATCC에서구입한후 master cell bank (MCB), working cell bank (WCB) 를확립하기위해, sterility test, mycoplasma test 등안전성평가시험을그림 81과같이실시하였음. 90

93 ( 그림 81) Sterility tests of 293T' s M CB and W CB 상기그림 81 의결과와같이새로구입하여구축한 293T 생산세포주의 MCB 및 WCB 에대한 sterility test 결과모두음성으로나타났으며미생물오염이없는것 으로평가되었음. 91

94 ( 그림 82) M ycoplasma tests of 293T' s M CB and W CB 상기그림 82의결과와같이새로구입하여구축한 293T 생산세포주의 MCB 및 WCB에대한 mycoplasma test 결과모두음성으로나타났으며 mycoplasma 오염이없는것으로평가되었음. 293T 세포주의 master cell bank (MCB), working cell bank (WCB) 를확립하기위해, 세포특성을평가하였음. 우선적으로세포분열시간과세포형상의현미경관찰을실시하여확인하였음. 92

95 ( 그림 83) Evaluation of cell doubling time for 293T' s M CB and W CB 상기그림 83 의결과와같이새로구입하여구축한 293T 생산세포주의 MCB (passage 6) 및 WCB (passage 12) 의세포분열시간은각기 시간, 시간 이었음. 93

96 ( 그림 84) Evaluation of cell morphology for 293T' s M CB and W CB 상기그림 84 의결과와같이새로구입하여구축한 293T 생산세포주의 MCB (passage 6) 및 WCB (passage 12 및 14) 의세포형상을현미경으로관찰한결과 예상되는전형적인형태인 fried egg 혹은 polygonal 형상을보이는것으로평가됨. 94