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FIRI 연구동향 사료원료중 T-2 및 HT-2 독소동시분석법정립및원료별모니터링결과 홍현진 한국사료협회사료기술연구소책임연구원 ( 차장 ) 1. 서론 가. T-2 및 HT-2 소개곰팡이독소 (Mycotoxin) 는곡류, 두류, 서류등농산물의생산, 수확저장유통과정에서생성되는곰팡이에의해생성되는 2차대사산물로써사람과동물에게급성또는만성장해를일으키는유해물질이다.

1 FIRI 연구동향 사료원료중 T-2 및 HT-2 독소동시분석법정립및원료별모니터링결과 홍현진 한국사료협회사료기술연구소책임연구원 ( 차장 ) 1. 서론 가. T-2 및 HT-2 소개곰팡이독소 (Mycotoxin) 는곡류, 두류, 서류등농산물의생산, 수확저장유통과정에서생성되는곰팡이에의해생성되는 2차대사산물로써사람과동물에게급성또는만성장해를일으키는유해물질이다. 이들대부분은 Aspergillus(A.) 속, Penicillium (P.) 속및 Fusarium (F.) 속곰팡이에의해주로생성되는 Aflatoxin 류 Fumonisin류등이있다. T-2 와 HT-2 는옥수수, 밀, 보리, 귀리, 쌀등의원료곡물과이를이용한가공식품에서기온, 강수량, 상대습도등기후조건과곡물 의손상, 수분함량및온도등의조건에따라 F. sporotrichioides, F. poae, F. nivale, F. oxysporum, F. solani, F.acuminatum등붉은 Fusarium 속곰팡이에의해주로생성되며, Trichoderma sp. 나 Myrothecium sp. 와같은곰팡이에의해서도생성된다. <Fig.1> 기후대별발생범위 68 한국사료협회

사료원료중 T-2 및 HT-2 독소동시분석법정립및원료별모니터링결과 T-2, HT-2는 A type Trichothecene으로 B type Trichothecene(DON, NIV 등 ) 보다독성이강하며, T-2 독소는생체내에서주요대사산물인 HT-2 독소및다른대사산물로빠르게대사되는데, T-2 독소그자체보다대사산물들이더독성이높거나동등한독성을나타내기도한다.

2 사료원료중 T-2 및 HT-2 독소동시분석법정립및원료별모니터링결과 T-2, HT-2는 A type Trichothecene으로 B type Trichothecene(DON, NIV 등 ) 보다독성이강하며, T-2 독소는생체내에서주요대사산물인 HT-2 독소및다른대사산물로빠르게대사되는데, T-2 독소그자체보다대사산물들이더독성이높거나동등한독성을나타내기도한다. 과거 1930년구소련에서 Alimentary toxic aleukia (ATA) 라불리는식중독성 져있다. 즉, T-2 와 HT-2 독소와같은 trichothecene은 180 에서도비교적안정하며, 210 에서는 30~40분이내에파괴된다. 또한, 빛에도안정적이나, 강산과알칼리조건에서는파괴된다고알려져있다. 그러나중성이나산성조건에서는안정된상태를유지하기때문에섭취후위장에서가수분해되지않는것으로알려져있다4). 무백혈구증과같은중독사고와, 1987 년 인도와 1993년중국에서 trichothecene 곰팡이독소에오염된밀가루나쌀등의곡물섭취로인해복통 (abdominal pain), 구역질 (nausea), 어지러움 (dizziness), 설사 (diarrhea), 혈변 (blood instools) 및구토 (vomiting) 등의중독증상이나타났다. 나. T-2, HT-2 Toxin 설정기준곰팡이독소의위해성으로인하여세계각국은자국민의건강에미치는영향을최소화하기위하여곰팡이독소에대한기준치를설정하여관리하고있다. T-2, HT-2 toxin의경우우리나라, EU, 캐나 다등대부분의국가에서권고또는관리의수준으로기준치를설정하고있다 (Table 1~3). <Fig. 2> T-2 및 HT-2의분자구조 ( 아세틸기가붙으면 T-2 독소, 수산화기가붙으면 HT-2 독소 ) T-2와 HT-2 독소는일반적으로매우안정된화합물이므로끓이기, 발효, 제빵, 튀김등의식품조리및가공처리, 저장이나분쇄를하는동안의높은온도에서도화학적으로쉽게분해되지않는다고알려 <Table 1> 우리나라의사료관리법중사료등의기준및규격 [ 별표16] 2의 2. 관리를추천하는곰팡이독소 ( 신규 ) 유해물질명 T-2/ HT-2 배합사료 단미사료 사료의종류 전체배합사료 권고기준 250ppb 귀리, 귀리가공품및 2,000ppb 싸라기기타식물성, 혼합성 ( 식물성이 500ppb 혼합된것에한함 ), 남은음식물사료 호격월간사료 69

3 <Table 2> EU guidance values (2006/576/EC) T-2 and HT-2 Products intended for animal feed-guidance value Compound feed for cats 0.05 ppm 사료중수분함량이 12% 로가정한상대적인최대함량임 <Table 3> Indicative levels(2013/165/eu) Indicative levels for the sum of T-2 and HT-2(ug/kg) from which onwards/above investigations should be performed T-2 and HT-2 Compound feed, with the exception of feed for cats 250 ppb 다. T-2, HT-2 toxin 분석법곰팡이독소의분석법으로곰팡이독소의존재유무를신속하게모니터링하는신속분석법과정량적으로분석하는기기분석법이있다. 신속분석법으로는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assays), Dipstick tests, FPIA (Fluorescence polarization immunoassay), Immunofiltration assays, Biosensor assays 등특이적항체를이용한효소면역학적방법과 TLC(Thin layer chromatography) 등의정성적분석방법이있다. 정량분석으로는 GC(electron capture : ECD, Flame-ionization:FID), HPLC (UV diode array : DAD), Fluorescence : FLD) 및질량분석기 (mass spectrometry : MS) 등의다양한검출기가사용되고있다. 기기분석법중 GC 및 HPLC 분석법은 T-2와 HT-2 독소를높은감도로분석할수있지만비용이많이들고전처리단계가복잡하며, 전처리중에발생하는 T-2 의 HT-2로대사또는시료를유도체화하는중에발생하는여러가지문제때문에회수율에영향을줄수있다. MS를이용한분석법은시료의유도체반응을거의필요하지않는장점이있다. 본모니터링분석에서는면역친화컬럼 (Immunoaffinity Column, IAC) 를이용하여시료를정제하고 LC/MSMS 를이용하여시료중 T-2, HT-2의총량을정량하였다. 그리고이분석법을이용하여국내수입되는사료원료중대표적인옥수수, 대두박, 소맥등을분석하여 T-2, HT-2의오염상태를조사하였다. 본고의오염수준조사결과자료가사료공장의 HACCP 적용에있어서 CCP 등의설정에유용한기초자료로사용하였으면한다. 2. 재료및방법 가. 시료시료는 2016년 1~8월중수입된원료중귀리 3점, 단백피 6점, 대두박 4점, 소맥 4점, 옥수수 5점, 야자박 3점, 옥수수글루텐밀 3점, DDGS 4점, 케놀라박 4점, 팜 70 한국사료협회

4 사료원료중 T-2 및 HT-2 독소동시분석법정립및원료별모니터링결과 유박 4점등총 10종 40점을분석하였다. 나. 시약및장비표준물질 (T-2, HT-2 각 5ml) 은 biopure 사제품이며, 추출을위해메탄올, 아세토나이트릴, 이동상으로 Ammonium acetate, Acetic acid를사용하였다. 정제를위하여면역친화컬럼 (Immunoaffinity column : Romer 사, VICAM 사 ) 를사용하여시료를정제하였다. 전처리장비로왕복식진탕기, 원심분리기등을사용하였다. Phenomenex 사 Kinetic( , 2.1u) 를사용하여 T-2, HT-2 를분리하였으며, Thermo 사의 HPLC(Ultimate 3000) 가연결된질량분석기 (TSQ Endura) 로정량하였다. 다. 전처리시료 5g을 50ml centrifuse tube(p.p.) 에정밀히달아 20ml의 80% 메탄올을넣은후 1시간동안진탕하여 T-2, HT-2 를추출하였다. 3000rpm 에서원심분리후상층액 5ml을취하여 20ml DW로희석하여그중 10mL을면역친화컬럼에로딩하여천천히 (2-3 drop/sec) 흘려주었고, 10ml DW로 2번면역친화컬럼을천천히 (2-3 drop/sec) 세척하였다. 감압장치를이용하여물을제거한후, ACN 1mL로 3번용출하여질소건고기로농축한다. 건고한시료를 20% 메탈올로재용해한후질량분석을위한시액으로사용하였다. 라. 분석조건 1) HPLC Condition Flow rate : 0.4mL/min Injection : 5 ul Column Temp. : 40 Sample Temp. : 20 A : 5mM Ammonium acetate + 0.2% Acetic acid in DW B : 5mM Ammonium acetate + 0.2% Acetic acid in in MeOH min A B ) MS Condition Ion Source HESI Spray Voltage +3.8 kv Sheath Gas(Arb) 35 Aux Gas(Arb) 141 Sweep Gas(Arb) 1 Ion transfer Tube Temp.( ) 375 Vaporizer Temp.( ) 375 CID Gas(m Torr) 1.5 Com pound Pre cursor (m/z) HT T Product (m/z) Collision Energy (V) RF Lens (V) 호격월간사료 71

5 3) 검량선작성각각의 T-2, HT-2 표준품을메탄올로희석하여 10ppm Stock sol. 을만들고 20% 메탄올로 2.5, 5, 10, 50, 100ug/kg으로희석하여검량선을작성하였다 (Fig. 3). ( 맨위 ) 과각각의 toxin 이온의 RT 값을나타낸다. 5) 회수율측정 T-2 및 HT-2 toxin의회수율을측정하기위해두가지독소에오염되지않은옥수수에각각의농도가 250ug/kg 의표준물질을첨가하고추출후정제하였으며회수율측정결과는 Table 4와같다. <Table 4> T-2 및 HT-2의회수율 평균 (ug/kg) 회수율 (%) T-2(n=2) HT-2(n=2) <Fig. 3> T-2 및 HT-2 의검량선 4) 검출한계및정량한계피크크기의 Signal/noise 의 3배, 10배일때를각각검출한계, 정량한계로설정하였고, HT-2 Toxin의경우검출한계 6.16ug/kg, 정량한계를 18.68ug/kg으로 T-2 toxin 의경우검출한계를 1.38ug/kg, 정량한계를 4.18ug/kg으로산출하였다. Fig. 4는 50ug/kg 의표준물질에대한 LC/MSMS의 chromatogram으로 T-2 및 HT-2 toxin의모화합물의총이온값 <Fig. 4> T-2, HT-2 toxin의 standard solution LC/MSMS chromatogram (50ug/kg) 3. 분석결과 2016년 1~8월수입된시료중옥수수를포함한시료총 10종 40개샘플에대하여모니터링을실시한결과는 table 5와 72 한국사료협회

6 사료원료중 T-2 및 HT-2 독소동시분석법정립및원료별모니터링결과 같다. 옥수수, 대두박등의대부분의시료에서 T-2, HT-2는검출되지않았거나검출한계수준이하였다. DDGS 샘플 2점에서검출한계수준이하의수치를보였으며, 1점에서는 T-2 toxin이 3.24ug/kg 검출되었고, 설정된검출한계를넘었으나, 정량한계 4.18ug/kg 보다낮은결과를보여주었다. 유럽연합에서 2003년도분석한 SCOOP (scientific co-operation) 에서조사된 T-2 toxin 데이터는옥수수 293개시료중 28% 가 3~255ug/kg, 밀 1,417 데이터중 21% 가 2~160ug/kg, HT-2 toxin은옥수수 261개시료중 24% 가 3~120ug/kg, 밀 1,213 데이터중 12% 가 3.3~50ug/kg 등으로조사되어 T-2 및 HT-2 toxin는낮은발생수치를보여주었다. 곰팡이독소의발생은열대지역과아열대지역에서두드러지게나타나지만 T-2 와 HT-2 독소의발생은날씨를포함한여러가지요인에의해서영향을받기때문에발생수준이나지역을일반화하기는어렵다. 따라서지금까지의조사결과에서는대부분불검출이거나검출한계또는정량한계이하였으며이후 T-2, HT-2 toxin에대한원산지및원료별모니터링을계속하여품질관리에활용할수있도록자료를제공하고자한다. <Table 5> 2016년 1~8월중수입원료의 T-2, HT-2 toxin 모니터링결과 Toxins 검출수 평균 농도 (ug/kg) 최고치표준편차 귀리 HT-2 0 N.D. N.D. N.D. (n=3) T-2 0 N.D. N.D. N.D. 단백피 HT-2 0 N.D. N.D. N.D. (n=6) T-2 0 N.D. N.D. N.D. 대두박 HT-2 0 N.D. N.D. N.D. 소맥 HT-2 0 N.D. N.D. N.D. 야자박 HT-2 0 N.D. N.D. N.D. (n=3) T-2 0 N.D. N.D. N.D. 옥수수 HT-2 0 N.D. N.D. N.D. (n=5) T-2 0 N.D. N.D. N.D. 옥수수글루텐밀 HT-2 0 N.D. N.D. N.D. (n=3) T-2 0 N.D. N.D. N.D. DDGS HT-2 0 N.D. N.D. N.D. (n=4) T 케놀라박 HT-2 0 N.D. N.D. N.D. 팜유박 HT-2 0 N.D. N.D. N.D. Total : 10 종 40 Samples 호격월간사료 73

7 4. 참고문헌 1. Paek OJ, Kang, TB. (2005). Survey and method validation of simultaneous quantitaive analysis of T-2 and HT-2 toxins in cereals. Korea J. Food Preserv. 22(4), EU(2006) Commission Regulation (EC) N0 401/2006. The methods of sampling and analysis for the official control of the levels of mycotoixns in foodstuffs, L70, p John H. Moncur. Analysis of Vomitoxin and T-2 toxin by LC/MS. Thermofisher Application note: Lee, S. Kim, M. Oh, S. (2012) Trends in Reseaches of Fusarium Mucotoxins, T-2 toxin and HT-2 toxin in Domestic and Foreigh Coountries. plssn J. of Fd Hyg. Safety Vol. 27, No. 1, pp V. Lippolis, M. Pascale, C. M. Maragos, A. Visconti. (2008) Improvement of detection sensitivity of T-2 and HT-2 toxins using different fluorescent labeling reagents by high-performance liquid chromatography/www. elservier. com/locate.talanta/. Talanta 74 page EC) SCF/CS/CNTM/MYC/25 Rev 6 Final. : Opinion of the Scientific Committee on Food on usarium toxins. Part 5 : T-2 toxin and HT-2 toxin (2001). 7. Li, Y., Wang, Z., Beier, R.C., Shen, J., Saeger, S.D., Smet, D.D. and Zhang, S. : T-2 toxin, a trichothecene mycotoxin: review of toxicity, metabolism, and analytical methods. J. Agric. Food Chem., 59, (2011). 8. Rocha, O, Ansari, K. and Doohan, F.M. : Effects of trichothecene mycotoxins on eukaryotic cells: a review. Food Addit. Contam, 22, (2005). 74 한국사료협회

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