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1 곰팡이독소안전관리와분석법 대구지방식품의약품안전청 유해물질분석과 조태용

2 발표내용 1 곰팡이독소의개요 2 곰팡이독소의분류와종류 3 곰팡이독소의관리동향 4 14 곰팡이독소분석법

3 곰팡이독소의개요

4 곰팡이에의한질병유형 곰팡이에의한질병유형 진균증 (Medical mycosis) 생체세포에직접기생하여진균증유발 알레르기 특정곰팡이의흡입또는접촉을통해알레르기유발 곰팡이독소중독증 (Mycotoxicosis) 곰팡이가생산한독성대사물질을식품등을통해섭 취함으로유발

5 곰팡이독소란? 곰팡이독소 (Mycotoxin) 곰팡이가생산하는 2차대사산물로서사람이나가축, 어류등의생물에대하여급성또는만성의생리적또는병리적장애를일으키게하는물질 Mycotoxicosis: 곰팡이독소를병인으로하는질병 주로탄수화물이풍부한곡류에서생성됨

6 곰팡이독소의생성 곰팡이부착곰팡이증식곰팡이독소생성곰팡이사멸 곰팡이 온도 / 습도온도 / 습도가열 식품환경변화곰팡이독소잔존

7 곰팡이의특성 다종의곰팡이가다양한독소를생산한다. 농작물의재배중에광범위하게오염된다. 수확, 저장, 유통중에도오염된다. 다양한독성작용과만성독성 ( 발암, 유전독성, 면역억제등 ) 을 나타낸다. 독소의분해나제거가힘들다 사료로부터축산물 ( 유, 식육등 ) 에이행할수있다 곰팡이의분포와독소의오염간에는지리적연관성이있다

8 곰팡이독소의주요대상식품 곰팡이독소곰팡이주요대상식품들 아플라톡신오크라톡신파튤린시트리닌푸모니신트리코테센제랄레논 Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Aspergillus ochraceus Penicillium spp. P. expansum P. Citrunum P. verrucosum F. Verticillioides F. proliferatum Fusarium graminearum F. sporotrichioides Fusarium graminearum, Fusarium culmorum 곡류, 땅콩, 향신료, 유제품 곡류, 커피, 포도주, 식육제품 사과제품들등 밀, 보리, 호밀, 귀리, 옥수수, 쌀등 옥수수및옥수수를이용한식품및사료, 맥주 밀, 옥수수, 보리, 켜, 맥아, 커피, 맥주등 옥수수, 보리, 귀리, 밀, 쌀, 사탕수수, 맥주, 육류, 우유, 계란등

9 곰팡이독소의위해도 Acute Microbiological Phycotoxins Some phytotoxins Mycotoxins Anthropogenic contaminants Pesticide residues Food additives H I G H L O W Chronic Mycotoxins Anthropogenic contaminants Some phytotoxins Unbalanced diet Phycotoxins Food additives Pesticide residues Microbiological

10 곰팡이독소의독성 곰팡이독소 단위 섭취 한계량 IARC 등급 아플라톡신 B1 Not established Group 1 아플라톡신 M1 Not established Group 2B 오크라톡신 A PTWI(ug/kg bw/week) 1.0 Group 2B 푸모니신 2.0 Group 2B 파튤린 0.4 Group 3 데옥시니발레놀 PMTDI(ug/kg bw/day) 1.0 Group 3 제랄레논 0.5 Group 3 HT-2, T-2 toxin 0.06 Group 3 PTWI : Provisional Tolerable Weekly Intake PMTDI : Provisional Maximum Tolerable Daily Intake

11 독소생성곰팡이의생육에따른분류 Field fungi Storage fungi - 재배중작물에곰팡이번식 - 재배후저장중곰팡이번식 - Pre Harvest - Post Harvest - 수분함량 : 20 ~ 21% - 수분함량 : 13 ~ 18% -종류 -종류 - Fusarium - Aspergillus - Alternaria - Penicillium - Clodosporium * 덮고건조한조건에서는 Aspergillus 및 Penicillium속도재배중번식가능함 * 운송, 저장중에 Fusarium 속도번식가능함

12 곰팡이독소의발생범위

14 곰팡이독소중독발생사례 맥각중독증 (Ergotism) 중세유럽에서 Claviceps purpurea 에감염된호밀, 보리등을섭취하여발병 Salem 마녀재판등 14 세기 ~ 17 세기마녀사냥을유발시킴 성안토니우스의시련 (Matthias Grünewald, 1515 년 )

15 곰팡이독소중독발생사례 Stachybotryotoxicosis 1930 년대소련에서말에집단발생한진균성사료중독증 Stachybotry chartarum 가습기가많은사료에발생, 수천두의군마폐사 식중독성무백혈구증 (Alimentary toxic aleukia, ATA) 1944 년동부시베리아 Obenburg bu 지방에서주민 10% 발생, 그중 60% 사망 수확하지못하고겨울을넘긴수수에기생한 Fusarium 속에의해독소 (T-2) 발생 붉은곰팡이식중독증 일본에서옛날부터알려져있는식중독의하나로붉은곰팡이 (Fusarium i graminearum) 가감염된맥류를원료로만든국수 ( 우동 ) 을섭취하여발생 발칸신염 (Balkan endemic nephropathy) 유고슬라비아, 루마니아, 불가리아의지방풍토병으로알려진신질환 역학적으로 Aspergillus ochraceus가생성한오크라톡신 A가원인으로추정 황변미중독 (Yellow rice toxicosis) ) 곰팡이에오염되어황색을나타내기때문에황변미 1940년대만쌀에서분리한 Penicillium toxicarium 독소 (Citreovirdin) 1951 년태국쌀에서분리한 Penicillium citrinum 독소 (Citrinin) 1947년이집트쌀에서분리한 Penicillium islandium이생성한황색색소 (Luteoskylin, islanditoxin)

16 곰팡이독소의 분류와종류

17 주요장애부위에따른분류 발병부위증상종류 간장독 (Hepatotoxin) 신장독 (Nephrotoxin) 신경독 (Neurotoxin) 광과민성피부염물질기타유연물질발정유인물질조혈기능장애 동물에간경변, 간종양또는간세포괴사를일으키는물질군 급성또는만성의신장장애를일으키는물질군 뇌와중추신경계에장애를일으키는물질군 독소섭취후햇빛을쬐면피부염, 특히안면습진을일으키는물질 Aflatoxin, rubratoxin 류, strigmatocystin, luteoskyrin, ochratoxin, islanditoxin Citrinin, citreomycetin, kojic acid Patulin, maltoryzine, citreovirdin, cyclopiazonic acid Sporidesmin류 Psoralen류 Slaframine Zealalenone Fusarium 독소류

18 주요곰팡이종류에따른분류 속구분 종류 Aspergillus 속 Aflatoxin Ochratoxin Penicillium 속 Fusarium 속 NIV : Nivalenol DON : Deoxynivalenol Ochratoxin Patulin Citrinin Fumonisin Zeralenon Trichothecenes (NIV, DON, T-2 toxin, HT-toxin)

19 1. Aflatoxin (Aspergillus 속독소 ) 1960년영국에서곰팡이로오염된땅콩사료먹은칠면조 10 만마리집단폐사 (Turkey X disease) Aspergillus flavus 와 Aspergillus parasiticus 에서생성됨 물에는녹지않고, 메탄올, 아세톤, 클로르포름에녹으며 280~300 로가열하여야분해 독성은 B1(M1)>G1>M2>B2>G2 강력한발암물질 -> : IARC Group 1( 인체발암물질 ) 로분류

20 아플라톡신의발암분류 Mycotoxin Aflatoxins (Naturally occurring mixture) Aflatoxin M1 Ochratoxin A Fumonisin B1, B2 Fusarin C IARC grade Group 1 Group 2B Group 2B Group 2B Group 2B Zearalenone Group 3 Deoxynivalenol Group 3 Nivalenol Group 3 Fusarenone X Group 3 T-2 toxin Group 3 Patulin Group 3

21 국제암연구소 (IARC) 발암등급 등급분류기준주요물질 Group 1 Carcinogenic to human 인체발암물질 ( 인체발암성에충분한근거가있음 ) 아플라톡신, 벤젠, 벤조피렌, 다이옥신, Alcohol, Smoking, 석면 ( 흡입시 ) 2A 2B Probably Carcinogen to human 인체발암추정물질 ( 인체발암성자료는제한적이지만실험동물자료가충분함 ) Possibly Carcinogen to human 인체발암가능물질 ( 인체발암성자료가제한적이고실험동물자료도충분하지않음 ) 에틸카바메이트, 클로람페니콜, 아크릴아미드, 무기납화합물, 질산염 / 아질산염 오크라톡신, 푸모니신, DDT, 클로로포름, 페놀프탈레인, 퓨란 3 Not classifiable as to Carcinogen to human 인체발암물질로분류할수없는물질 ( 인체나실험동물자료가불충분함 ) 멜라민, 카페인, 콜레스테롤, 싸이클라메이트

22 아플라톡신의대사

23 간암발생위험도

24 국가별간암발생률비교 국가 간암발생률 (incidence/100,000/year) 000/year) 남자여자 영국프랑스미국캐나다일본중국태국인도네시아한국

25 아플라톡신주요검출식품 유럽 RASFF(Rapid Alert for Food and Feed), 2008 년도 호두 1% 헤즐넛 7% 건과류 1% 견과류가공품 1% 건고추 1% 옥수수 2% 피스타치오 16% 땅콩 14% 아몬드 3% 씨앗 1% 무화과 53%

26 아플라톡신오염된옥수수낱알

27 2. Ochratoxin (Aspergillus 속및 Penicillium 속독소 ) Aspergillus ochraceus, Penicillium verrucosum 에의해생성 독소는 Ochratoxin A, B, C 형이있음 독성 : Ochratoxin A 의 LD50=0.5mg/kg (in duckling, oral) B, C 는 A 의 1/1000 이하 간장 ( 지방변성, glycogen 합성효소저해 ), 신장독성 ( 특히, 발간신염 ) Ochratoxin A : IARC Group 2B( 인체발암가능물질 ) 로분류 < 오크라톡신 A 의구조 >

28 오크라톡신주요검출식품

giganteus 등에의해생성 Gram 양성및음성균에대한항생물질로발견, 이후동물과사람에대한독성이밝혀짐 저온살균과정중에는파괴되지않으나,

29 3. Patulin (Penicillium 속독소 ) Penicillium expansum, Pen. urticae, Pen. patulin, Asp. clavatus, Asp. terreus, Asp. giganteus 등에의해생성 Gram 양성및음성균에대한항생물질로발견, 이후동물과사람에대한독성이밝혀짐 저온살균과정중에는파괴되지않으나, 발효과정중에는파괴됨 가장흔히발견되는식품은사과로서주스등의제조공정상소실되지않고상당량존재함 과실로만든알코올음료및식초등에는발견되지않음 IARC Group 3( 인체발암물질로분류할수없는물질 ) 로분류 < 파튤린의구조 >

가주요독소이며이중FB1이가장오염빈도가높고독성이강함 수용성이며 100~120 에서는거의감소하지않으나 175 이상에서는 70% 정도소실됨 국제암연구소 (IARC) 는인체발암가능물질

30 4. Fumonisin (Fusarium 속독소 ) Fusarium moniliforme, F. proliferatum 등에의해생성되는독소 Fumonisin 은 8 종류가알려져있으나자연계에서주로발견되는 B1(FB1), B2(FB2), B3(FB3) 가주요독소이며이중FB1이가장오염빈도가높고독성이강함 수용성이며 100~120 에서는거의감소하지않으나 175 이상에서는 70% 정도소실됨 국제암연구소 (IARC) 는인체발암가능물질 (Group 2B) 로분류 Fumonisin B1 : R1= OH; R2= OH; R3= OH Fumonisin B2 : R1= H; R2= OH; R3= OH Fumonisin B3 : R1= OH; R2= OH; R3= H Fumonisin B4 : R1= H; R2= OH; R3= H 옥수수중에는배아에가장많이존재

Fumonisin은말의뇌백질연화증 (equine-leukoencephalomalacia), 돼지의폐부종 (porcine pulmonary odema) 유발함 사람에서는지역적으로관계없이옥수수, 밀등을주식으로하고, 미네랄및비타민이결핍된집단에서푸모니신과식도암 (oesophageal cancer) 발생의상관이있는것으로추정됨

31 Fumonisin은말의뇌백질연화증 (equine-leukoencephalomalacia), 돼지의폐부종 (porcine pulmonary odema) 유발함 사람에서는지역적으로관계없이옥수수, 밀등을주식으로하고, 미네랄및비타민이결핍된집단에서푸모니신과식도암 (oesophageal cancer) 발생의상관이있는것으로추정됨 간암과도연관이있을것으로추정되나아플라톡신, 데옥시니발레놀의영향도있을수있어확실하지않음 선천성질환인신경관장애 (neural tube defects) 및급성증상으로설사등을유발할수있음 Rat 에서신장독에대한 NOEL 은 0.2 μg/kg bw/day 이고안전계수 100 을감안하여, PMTDI 는 FB1, BB2, FB3 단독또는합으로서 2 μg/kg bw person/day 로설정함 (JECFA, 2001) Leukoencephalomalacia Fusarium ear rot

32 5. Trichothecene (Fusarium 속독소 ) Trichothecene류는 Fusarium graminearum, F. sporotrichioides, F. equiseti 등의 Fusarium 속에의해생성되는유사한화학구조를갖는독소총칭 C12, C13 에 epoxy 환과 C9, C10 에이중결합을가지고있는 4 환구조임 종류 : Deoxynivalenol(DON), nivalenol(niv), T-2 toxin, HT toxin 1940년전후구소련연방에서발생한 ATA증, 1950년대보리의붉은곰팡이병의원인물질 구토, 설사, 출혈등소화기계에영향을주거나면역기능억제작용 Trichothecene 류의기본구조

33 Deoxynivalenol 의구조 Nivalenol 의구조 T-2 toxin 및 HT-2 toxin 의구조 T-2:R1=OAc HT-2:R1=OH

34 6. Zearalenone (Fusarium 속독소 ) Fusarium graminearum, Fusarium culmorum 등이생산하는독소 1962 년북아메리카의중서부지방에서돼지불임증, 외음질염, 정소의위축등의발생으로처음보고 내분비계장애물질로서에스트로겐 (estrogen : 여성호르몬의일종 ) 과비슷한성질을가지고있어발정효과및과에스트로겐증이유발되어그결과자궁확대, 불임증이나타남 건조가불충분하여수분함량이많은곡물에서잘생성되는데주로옥수수, 맥류등에서검출 Zearalenone 의구조

35 F-2 Toxin, Fusarium toxin 또는 fermentation estrogenic substance(fes) 로불리워지기도하며 20 여종의이성체가있으나 trans-α-zearalenone 이주로자연계에서곡류에발생 동물실험결과, 쥐에경구투여로 20,000 ug/kg body weight를투여하여도폐사하지않아서급성독소는아닌것으로분류되며내분비교란물질로서중요 가축의성장촉진호르몬제제라놀의전구체

36 곰팡이독소의안전관리

37 곰팡이독소안전관리의목표및필요성 사회적측면

38 경제적측면

년에는아플라톡신이 902 건으로다시상승 RASFF 에서보고되는위해요소정보사항중약 10% 정도가곰팡이독소이며, 08 년

39 곰팡이독소안전관리의중요성 Mycotoxins 은 RASFF( 유럽신속정보체계 ) 에서통보건수가가장많은위험카테고리임 2007 년 RASFF 는마이코톡신관련총 754 건중 705 건이아플라톡신으로, 2005 년에비해약 10% 감소된수치이나, 2008 년에는아플라톡신이 902 건으로다시상승 RASFF 에서보고되는위해요소정보사항중약 10% 정도가곰팡이독소이며, 08 년 Border reject 된위해요소중 56% 가곰팡이독소임 Aflatoxin 40% Patulin 4% Ochratoxin 21%

40 CODEX 기준설정현황 대상독소대상물질기준 ( μg / kg ) 아몬드, 헤즐넛, 피스타치오넛 ( 가공 ) 10 Aflatoxin (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) 아몬드, 헤즐넛, 피스타치오넛 ( 비가공 ) 15 땅콩 ( 가공하지아니한것 ) 15 Aflatoxin M 1 우유 0.5 Ochratoxin A 밀, 보리, 호밀 5 Patulin 사과주스 50

41 제외국의기준설정현황 (1) 국가명대상독소대상물질기준 ( μg / kg ) 미국 (Action level) 미국 (Guidance level) 캐나다 일본 Aflatoxin (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) 브라질넛, 식품, 땅콩과그가공품, 피스타치오 20 Aflatoxin M 1 우유 0.5 Fumonisins (B 1 +B 2 +B 3 ) 옥수수제품 2,000 ~ 4,000 Deoxynivalenol 최종밀제품들 1,000 Aflatoxin (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) 땅콩제품 15 Deoxynivalenol 연질밀 2,000 Aflatoxin B 1 피스타치오, 아몬드, 브라질넛, 케슈너트, 헤즐넛, 마카다미아호두, 옥수수 10 땅콩및그가공품 10 Deoxynivalenol 밀 1,100 Patulin 사과주스및원료용사과즙 50 호주 Aflatoxin (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) 땅콩, 견과류 15

42 국가명대상독소대상물질 기준 ( μg / kg ) B1 B1+B2+G1+G2 M1 유럽연합 Aflatoxin Ochratoxin A 땅콩, 견과류, 건조과실류, 곡류, 옥수수, 향신료등 2.0 ~ ~ 우유류 영유아용곡류가공품및이유식 0.1 영유아용제품 곡류, 건조과실, 커피콩, 포도주, 포도주스등 2.0 ~ 10.0 영유아용제품 0.5 Patulin 과일주스, 사과제품등 25 ~ 50 영유아용제품 10 비가공곡류제품등 1,250 ~ 1,750 Deoxynivalenol l 빵등곡류가공제품 500 ~ 750 영유아용제품 200 Zearalenone Fumonisins (B1 + B2) T-2 andht-2 toxin (sum) 옥수수제품 50 ~ 200 영유아용제품 20 옥수수제품 200 ~ 2,000 비가공곡류및곡류가공식품 -

43 국내곰팡이독소기준설정현황 대상독소대상물질기준 ( μg / kg ) 설정현황 곡류, 두류, 땅콩, 견과류및그단순 가공품 ( 분쇄, 절단등 ) 곡류가공품및두류가공품 ( 규격외일반가공식품 ) 장류 ( 메주제외 ), 고춧가루및카레분 ( 공통규격 ) 고시완료 Aflatoxin (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) 과자류 ( 땅콩또는견과류함유식품 ), 메주 15 기타식품류 ( 찐쌀, 팜콘용옥수수가공품, 땅콩및견과류가공 ( 단, B1 으로서품 ) 10) 육두구, 심황 ( 강황 ), 건조고추, 건조파프리카및이를함유한천연향신료 행정예고 ( ) 밀가루고시완료 ( ) 건조과실류고시완료 ( 10 ( ) 06 Aflatoxin M 1 제조, 가공직전의원유및우유류 0.5 고시완료 Patulin 사과주스, 사과주스농축액 ( 원료용포함, 농축배수로환산하여 ) 50 고시완료

44 대상독소대상물질기준 ( μg / kg ) 설정현황 밀, 호밀, 보리 5 커피콩, 볶은커피 5 고시완료 Ochratoxin A 인스턴트커피 10 메주 20 고춧가루 7 포도주, 포도주스 2.0 건포도 10.0 고시완료 ( ) 고시완료 ( 10 ( ) 06 곡류및단순가공품 5.0 고시완료 ( ) Fumonisins (B1 + B2) 옥수수 4,000 고시완료 옥수수단순가공품 ( 분쇄, 절단등 ), 옥수수가루 2,000 옥수수, 옥수수단순가공품또는옥수수가루를합하여 50% 이상 함유한곡류가공품및시리얼류 1,000 고시완료 ( 10 ( ) 04 팝콘용옥수수가공품, 과자류 ( 옥수수 50% 이상함유제품 ) 곡류및그단순가공품 ( 옥수수및그단순가공품제외 ) 1,000 고시완료 ( ) Deoxynivalenol 옥수수및단순가공품 2,000 고시완료 ( 10 ( ) 06 16) 씨리얼 500 고시완료 ( ) Zearalenone 곡류및그단순가공품 200 고시완료 ( ) 과자류 50 고시완료 ( )

45 국내생약의곰팡이독소기준 기준 : 아플라톡신 B1 10 ug/kg 이하

46 각국기준의다양성

47 곰팡이독소안전관리방향 국제조화및시험법개선 아플라톡신 B1 -> 총아플라톡신 (B1+B2+G1+G2) 기준 면역친화성컬럼등을이용하여신속하고효율적인분석방법으로시험법개선 기후변화및곡물수입처의다변화에따른곰팡이독소안전관리대책필요 기후변화로인한곡물재배및유통중곰팡이독소생성양상변화가능성 곡물가격의상승등영향으로곡물수입국의다변화에따라다 곡물가격의상승등영향으로곡물수입국의다변화에따라다양한종류의곰팡이독소에노출가능성

48 곰팡이독소의 분석법

49 곰팡이독소분석법 곰팡이독소의일반적분석법 Thin Layer Chromatography Gas Chromatography High Performance Liquid Chromatography Mass Spectroscophy p Immunoassay (ELISA, LFICS, IAC)

50 주요곰팡이독소분석법 분석법 곰팡이독소 정제 유도체화 검출기 비고 아플라톡신 IAC PCD LC/FLD AOAC CC TFA LC/FLD 식품공전 파튤린분배 * LC/UVD AOAC 분배 * LC/UVD 식품공전 LC,GC 오크라톡신분배 + CC * LC/FLD AOAC IAC * LC/FLD Eskola,2002 DON Quick-Sep 4-DMAP GC/ECD AOAC 푸모니신 SPE OPA LC/FLD AOAC 제랄레논분배 * LC/FLD AOAC HPTLC 아플라톡신 CC * ELISA densitomete r AOAC 아플라톡신 * * ELISA KIT AOAC 제랄레논 * * ELISA KIT AOAC LC/MS 푸모니신 * * LC/MS/MS 오크라톡신 * * LC/MS/MS

51 박층크로마토그래피 정성분석 Direction 1 Standard B1 Directio on 2 B2 G1 G2 Standard Sample

52 기체크로마토그래피의예 곰팡이독소분석법 분석물질 : Trichothecen 계 (DON, NIV, HT-2, T-2) 검출기 : FID, ECD 유도체화 : Trimethylsilylation(FID), Trifluoroacylation(ECD) Trichothecen 계 GC 크로마토그램 (DTMC 유도체화 /FID)

53 액체크로마토그래피 Step Sample Preparation Contents ts Grind Sample Extraction Filteration(Dilution) Clean-Up (Solid Phase Column Chromatography) HPLC Analysis Loading Washing Elution (Derivatization) FL / UV Detection

54 IAC 를이용한정제 곰팡이독소분석법 최근에는 Immunoaffinity column(iac) 사용추세

ELISA 곰팡이독소분석법 Veratox for Mycotoxin ELISA 법을이용한정량, 정성분석용 Kit -Veratox

-Veratox for Zearalenone -Veratox for T-2 Toxin -Veratox for Ochratoxin

Aflatoxin -Agri Agri-Screen for Vomitoxin(DON) in(don) -Agri-Screen for

55 ELISA 곰팡이독소분석법 Veratox for Mycotoxin ELISA 법을이용한정량, 정성분석용 Kit -Veratox for Aflatoxin -Veratox for Vomitoxin(DON) -Veratox for Fumonisins -Veratox for Zearalenone -Veratox for T-2 Toxin -Veratox for Ochratoxin Agri-Screen for Mycotoxin ELISA 법을이용한정성분석용 Kit -Agri-Screen for Aflatoxin -Agri Agri-Screen for Vomitoxin(DON) in(don) -Agri-Screen for Fumonisins Reveal for Mycotoxin ELISA 법을이용한정성분석용 Kit -Reveal for aflatoxin -Reveal for DON

56 IAC-HPLC 정제를이용한아플라톡신분석 Step Contents Sample Preparation 25g ground sample Extraction with 100mL 70% MeOH(containing 1% NaCl) for 5min using homogeniger Filteration with filter paper Dilute 10mL with 30mL of 1% tween 20 and filter with microfiber glass filter Clean-Up Load 20ml onto immunoaffinity column(iac) Wash colimn with 10ml D.W. Elute AF toxins from IAC using 3ml acetonitrile HPLC Analysis Dry the eluate under N2 Add 200ul TFA to the residues and stand for 15min(dark pl.) Dilute 800ul ACN-D.W(2:8) HPLC-FLD analysis

57 전처리법검토 (1) 1. Spiked standard 100 ppb 1mL to sample 2. Extraction with 70% MeOH(containing 1% NaCl) 100mL for 5min using homogenizer 10mL + 30mL 20mL 3. Filteration with whatman No ml 15mL 20mL 4. Dilute 10mL with 20mL water and filter with microfiber glass filter Loading 5. Load 15mL onto immunoaffinity column(iac) 6. Wash column with 10ml D.W. 20 ml B1+B2+G1+G2 7. Elute AF toxins from IAC using 3ml acetonitrile 23% 17% MeOH G2

Filteration with Advantec No.1 1% Tween 20 4.

58 전처리법검토 (2) 1. Spike standard 100 ppb 1mL to sample 2. Extraction with 70% MeOH(containing 1% NaCl) 100mL for 5min using blender 3. Filteration with Advantec No.1 1% Tween Dilute 10mL with 30mL water and filter with microfiber glass filter 물불용물생성 ( 후추, 육두구, 심황 ) 5. Load 20 ml onto immunoaffinity column(iac) 6. Wash column with 10ml D.W. 7. Elute AF toxins from IAC using 3ml acetonitrile

59 회수율 ( 건조과실류및향신료 ) Item Recovery(%) ± Standard deviation B1 B2 G1 G2 Blank 98.9±3.19±3 96.5± ± ±5.13±5 Dried mango 82.4± ± ± ±2.4 Dried figs 83.7± ± ± ±5.3 Dried berries 82.1± ± ± ±3.0 Dried apricot 86.1± ± ± ±4.5 Dried prune 86.2± ± ± ±5.4 Dried kiwi 85.2± ± ± ±1.6 Dried papaya 84.0± ± ± ±1.9 Raisins 86.3± ± ± ±3.5 Dried persimmon 79.3± ± ± ±3.2 Red pepper 85.7± ± ± ±3.3 3 Red pepper powder 83.9± ± ± ±2.0 Shredded redpepper 91.0± ± ± ±3.6 Paprika powder 82.1± ± ± ±3.0 Spice formula(dadaeki) 85.0± ± ± ±2.9 Dried ginger 81.2± ± ± ±4.8 Turmeric powder 82.5± ± ± ±5.2 Curry powder 80.2± ± ± ±4.6 Nutmeg 80.1± ± ± ±3.3 Pepper 80.7± ± ± ±2.4

60 1. 추출 아플라톡신시험법

61 정제

62 2. 정제 유도체화

63 3. 유도체화

64 아플라톡신크로마토그램 총아플라톡신 B1 Standard G1 B2 G2 Sample

65 TFA 에의한유도체화

66 PHRED 에의한유도체화

67 PHRED 의모식도

68 PHRED 의구조

69 TFA 와 PHRED 유도체화비교 Relative standard deviation(rsd, %) Derivative Aflatoxin B 1 Aflatoxi n B 2 Aflatoxi n G 1 Aflatoxi n G 2 TFA PHRED Analyte LOD (μg/kg) TFA LOQ (μg/kg) LOD (μg/kg) PHRED LOQ (μg/kg) Aflatoxin B Aflatoxin B Aflatoxin G Aflatoxin G

70 HPLC 조건 Item TFA PHRED Instrument Shiseido Nanospace SI-20 Shiseido Nanospace SI-20 Detector Fluorescence Ex. 360 nm/em. 450 nm Fluorescence Ex. 365 nm/em. 435 nm Column Shiseido UG-120 (4.6 mm 150 mm, 0.5 μm) Shiseido UG-120 (4.6 mm 150 mm, 0.5 μm) Mobile phase 25% Acetonitrile Acetonitrile : Methanol : Water (15:30:55) Flow rate 1.0 ml/min 1.0 ml/min

71 Kobra cell 에의한유도체화 HPLC column + - Pump Injector KOBRA Detector CELL Aflatest Mobile Phase Sample

72 LU Af flatoxin G Af flatoxin G Aflatox xin B Aflatoxin B min μm λ nm λ nm μl l ml μl

73 아플라톡신의확인 LC-MS/MS 확인 STD Sample

74 LC-MS/MS 조건 Parameter Optimum value Column Shiseido MG II C 18 (2.0 mm x 150mm, 5 μm ) Mobile solvent A: 0.1% Formic acid in Water B: 0.1% Formic acid in Methanol Gradient Time B(%) A(%) Init Flow rate Injection volume Ionization Spray voltage 0.3 ml/min 10 μl ESI positive 4,500 V Capillary temperature 350 Sheath gas pressure 40 Auxillary gas pressure 20 Collision gas pressure 1.5 mtorr Collision energy 22~36 V Tube lens offset MS operation mode 89~123 V SRM(Selected Reaction Monitoring)

75 LC-MS/MS 확인및정량이온 Analyte Transition Precursor Product Scan Collision Tube lens Ion(m/z) Ion(m/z) time(s) Energy (V) offset (V) Quantification Aflatoxin B 1 Confirmatory Quantification Aflatoxin B 2 Confirmatory Aflatoxin G 1 Quantification Confirmatory Aflatoxin G 2 Quantification Confirmatory

76 IAC-HPLC 를이용한푸모니신분석 Step Sample Preparation Clean-Up Contents 20g ground sample Extraction with 100mL ACN/MeOH/D.W.(25/25/50) for 5 min homogenizer Filteration with Watman No.2 Dilute 10ml with 40mL PBS buffer(7.0) Filteration with microfiber glass filter(whatman GF/A) Load 10mL onto immunoaffinity column(iac) Wash colimn with 10mL D.W. Elute FBs from IAC using 1.5mL MeOH HPLC Analysis Dry the eluate under N2 at 60 Reconstitute dried elute with 0.2mL ACN/D.W.(50/50) Derivatize the 50uL sample with 50uL OPA reagent HPLC-FLD analysis

77 HPLC 조건 Item Parameter Instrument Agilent 1100 Detector Fluorescence Ex. 335 nm / Em. 440 nm Column Shiseido UG-120 (4.6 mm 150 mm, 0.5 μm) Mobile phase MeOH : 0.1M NaH 2 PO 4 * 인산으로 ph 3.35 조정 (77 : 23) Flow rate 1.0 ml/min

78 푸모니신크로마토그램

79 푸모니신크로마토그램

80 푸모니신의직선성 Area Fumonisin B1 Calibration curve y = x R 2 = Conc.(ppm) Area Fumonisin B2 Calibration curve y = x R 2 = Conc.(ppm)

81 푸모니신 -OPA 유도체의안정성 Ar rea min

82 가수분해에의한푸모니신확인 IAC 추출액을 60 에서질소로건고 50% 아세토니트릴 0.5 ml, 2 N KOH 0.5 ml 가함 60 에서 1 시간반응 냉각 에틸아세테이트 2 ml 가하여 Vortex 로진탕 에틸아세테이트층을분취 60 에서질소로건고 50% 아세토니트릴 0.2 ml 재용해 OPA 유도체화

83 가수분해에의한푸모니신확인 STD Sample

84 데옥시니발레논 (DON) 분석 시료전처리 시료 20g 물 100mL 첨가후 5 분간균질화 원심분리 (6000rpm, 15min) 여과 (Whatman No.4) 추출액 2 ml 을 IA 칼럼에주입 물 5mL 로세척 물기제거 아세토니트릴 3mL 로용출 50C 에서건고 이동상 1mL 에용해

85 분석조건 Parameter Optimum value Column Shiseido UG C18 (4.5 mm 250mm, 5um) Mobile solvent ACN:DW(17:83) Flow rate 1.0 ml/min Injection volume 20 μl Detection(UV) 220nm TEM 35

86 제랄레논 (ZEN) 분석 시료전처리 시료 25g NaCl 2g, Tween 20 1mL, 75% ACN 100mL 가하고 5 분간균질화 여과 (Whatman No.4) 여액을물로 5 배희석 여과 (Whatman GF/A) 추출액 25 ml 을 IA 칼럼에주입 물 20mL 로세척 물기제거 메탄올 5mL 로용출 40C 에서건고 이동상 1mL 에용해

87 분석조건 Parameter Optimum value Column Shiseido UG C18 (4.6 mm 250mm, 5um) Mobile solvent ACN:MeOH:A:DW(10:55:35) Flow rate 1.0 ml/min Injection volume 20 μl Detection(FL) Ex : 275nm, Em : 450nm TEM 35

88 표준용액의검증 Beer s law A = ε l C Conc(ug/mL) = A: absorbance (0.2 ~ 0.8) ε: molar absorption coefficient mw : molecular weight l : light path length (cm) A: absorbance( 흡광도 ) = OD (optical density) ε: molar absorption coefficient ( 몰흡광계수 ) c: molar concentration ( 몰농도 ) l : light path length A mw 1000 ε l

89 곰팡이독소별몰흡광계수 곰팡이독소몰흡광계수 (ε) 측정파장분자량 acetonitrile Aflatoxin B1 Aflatoxin B methanol toluene/acetonitril(9:1) benzene/acetonitrile(98:2) acetonitrile methanol toluene/acetonitril(9:1) benzene/acetonitrile(98:2) acetonitrile near 350 nm methanol Aflatoxin G toluene/acetonitril(9:1) benzene/acetonitrile(98:2) acetonitrile methanol Aflatoxin G toluene/acetonitril(9:1) benzene/acetonitrile(98:2) Aflatoxin M acetonitrile benzene/acetonitrile(9:1) Ochratoxin A 6330 methanol 332 nm Patulin ethanol 275 nm Deoxynivalenol 6825 acetonitrile 217 nm Zearalenone acetonitrile 274 nm 318.4

90 데옥시니발레놀표준원액의검증 ( 예시 ) Concentration of the ca. 25 μg/ml / LDON in acetonitrile il solution will be: Conc (μg/ml) = A x x x l Where, A : the absorbance at 217 nm l : path length of quartz cell (cm)

91 곰팡이독소별시험법비교 곰팡이독소 시료채취량 (g) IAC 칼럼통과추출액부피 (ml) 용출액조성 용출액부피 (ml) 아플라톡신 아세토니트릴 3 오크라톡신 메탄올 1 푸모니신 메탄올 : 물 (8:2) 4 제랄레논 메탄올 5 데옥시니발레놀 20 2 아세토니트릴 3

92 감사합니다.!!

한약재품질표준화연구사업단 강활 ( 羌活 ) Osterici seu Notopterygii Radix et Rhizoma 생약연구과

한약재품질표준화연구사업단 강활 ( 羌活 ) Osterici seu Notopterygii Radix et Rhizoma 생약연구과 - 2 - - 3 - KP 11 Osterici seu Notopterygii Radix et Rhizoma Ostericum koreanum Maximowicz, Notopterygium incisum Ting, Notopterygium