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1 1) 대한한방부인과학회지 THE JOURNAL OF ORIENTAL OBSTETRICS & GYNECOLOGY VOL.21 NO.3 : (2008) 천련자메탄올추출물이 Bcl-2 발현억제를통해유방암세포의자멸사에미치는영향 대구한의대학교한의과대학한방부인과학교실 윤우경, 김동철 ABSTRACT Toosendan F ructus Induces Apoptotic Cell Death in MCF-7 Cell, Via the Inhibition of Bcl-2 Expression Woo-Kyeong Y oon, Dong-Chul Kim Dept. of Gynecology, College of Oriental Medicine, Daegu Haany University Purpose: The research is to investigate the effect of TFE on apoptosis of human-derived breast cancer cells, to find out the relationship with apoptosis. Methods: Human-derived breast adenocarcinoma cell line, MCF-7 cells were treated by TFE with various concentration. The inducement effect of TFE on cell apoptosis was observed with MTT assay and the relationship between the treatment and apoptosis was investigated with FACS analysis, TUNEL assay and DNA laddering assay and the change in the protein levels of PARP and caspase-3 activities were also observed. The release of cytochrome-c was observed to find out the pathway of apoptosis induced by TFE. Results: The cell apoptosis was significantly induced in MCF-7 cells treated with TFE in concentration-dependent and time-dependent manner. It was verified by FACS anaylsis, TUNEL assay, DNA laddering assay that cell-death was caused not by necrosis but by apoptosis. The activity of PARP and caspase were increased concentration-dependently. The release of cytocrome-c was decreased in proportion to the concentration of the fruit extract. It therefore demonstrated that mitochondria were involved in apoptosis induced by TFE. The appearance of Bcl-2 protein was decreased concentration-dependently. Conclusion: The treatment by TFE induced apoptosis of human breast adenocarcinoma cell line, MCF-7. It seems likely that cell-death was caused by apoptosis and mitochondria were involved in it. The mechanism of protein change causing apoptosis seems related to the inhibition of Bcl-2 protein, the promotion of inversion from cytochrome-c into cytosol, the activation of caspase and the promotion of PARP cleavage. Key Words: Toosendan Fructus, apoptosis, caspase-3, Bcl-2, cytochrome-c, human breast adenocarcinoma 교신저자 ( 김동철 ) : 경북포항시남구대잠동 대구한의대부속포항한방병원 전화 : 이메일 : kdc072@hanmail.net 18

2 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.21 No.3 August 2008 Ⅰ. 緖論 유방암은세계적으로가장빈번한여 성의사망원인질환중의하나이며, 매 년약 100 만명이상의환자가발생한다 1). 우리나라에서도유방암은여성암중 자궁암, 위암다음으로많은비중을차 지하고있다 1). 특히, 유방암은 2002 년새 로발생한암환자중에서증가율이가장 높아, 1995 년과비교하면 166% 의급격한 증가세를보이고있으며, 또한사망자수 에있어서도급격한증가세를보이고있 다 2). 유방암과유사한한의학적질환으로는 石癰 3), 乳巖 4), 奶巖 5), 番花奶 6), 巖 7) 등 이있다. 증상으로는乳房腫塊. 不痛, 不 痒, 不赤하고, 或內熱, 夜熱, 五心煩熱, 肢體倦瘦, 月經不調등이나타나기도하 며 4,8), 病因으로肝鬱氣滯 4), 憂怒抑鬱 9), 憂鬱傷肝 10), 思慮傷肝 10) 등의七情所傷과, 이것이오래되어氣血損傷 4) 4), 衝任失調 되어장부기능이실조된것으로볼수 있다. 치료로는초기에肝氣鬱結로인한 때는疏氣行血, 疏肝解鬱하는치법을 이용하였고 10), 氣血虧損할때는大補氣 血하는치법을이용하였다 4). 유방암에관해국내연구발표된단일 약재로는, 鬼箭羽 11), 黃芩 12), 半枝蓮 13), 槲寄生 14), 三稜 15), 탕약으로는抗癌丹 16), 加味雙和湯 17), 淸肝解鬱湯 18), 歸朮破癥湯 19), 活絡交靈丹 20), 益氣養榮湯 21), 橘葉散 變方 22) 등이있으며, 蜂毒藥鍼液 23) 을이 용한연구도보고되고있다. 川楝子 (Toosendan Fructus) 는苦寒有 小毒하며, 肝胃小腸經으로入하고, 胸脇 痛, 脘腹脹痛, 疝痛, 蟲積腹痛을치료한 다 24). 현재까지천련자에대한연구로는, 주로천련자의毒性에관한연구 25) 및천련자가肝膽에미치는영향에대한약리학적연구 26,27) 및전립선에미치는영 향 28) 등이보고된바있으나천련자에 대한항암효과와기전연구는부족한편이다. 이에본연구자는천련자를인간유래 breast adenocarcinoma cell line인 MCF-7 cell의 apoptosis 에미치는영향을알아보고자본연구를시행하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. Ⅱ. 材料및方法 1. 재료 DMEM(Dulbecoo' s Modified Eagle' s Medium) 과 fetal calf serum 은 BioWhittaker (Walkersville, MD, USA) 와 Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) 로부터구입하여사용하였다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide(mtt) 와기타다른 reagent 는 Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA) 에서구입하여사용하였다. 2. 천련자추출물의제조천련자추출물 (Toosendan Fructus Extract, TFE) 은대원약업사 (Daegu, Korea) 에서구입한천련자 (Toosendan Fructus) 200g 을 1 L의메탄올에 72 시간추출한후에여과농축하여동결건조하였다. 천련자의최종수율은 7.34% 이었으며 Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA) 로부터구입한 DMSO(Dimethyl Sulfoxide) 에녹여 0.2 μm filter (Millipore Corporation, 19

3 천련자메탄올추출물이 Bcl-2 발현억제를통해유방암세포의자멸사에미치는영향 Bedford, MA, USA) 로여과하여사용하였다. 3. 세포배양인간유래 breast adenocarcinoma cell line인 MCF-7 cell 은한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea) 으로부터구입하였으며, 10% fetal calf serum, 50 units/ ml penicillin 과 50 mg / ml streptomycin 이포함된 DMEM 배지에서 37 의온도와 5% 의 CO 2 가유지되는환경에서배양하였다 cells 개의 MCF-7 cells 을 10 cm 2 plastic dish에 24시간배양하여 (80% 이상의 confluence 를유지 ), 24 시간배지를고갈한뒤, MCF-7 cells 에지정된시간동안 TFE를농도별로처치하였다. 4. MTT 세포생존율측정 96 well plate의 well당 개의 MCF-7 cells 을배양하여 confluency 가 80% 이상이된경우, 24시간배지를고갈한다음, TFE를농도별 ( mg / ml ), 시간별 (24, 48 h) 로처치하여, TFE 의세포생존율을측정하였다. 세포배양후생존한세포를 0.5 mg / ml의 MTT로처치한후, 4시간 incubation 하였다. 그후배지를제거하고생성된 formazan crystals 에 200 μl의 DMSO를가하여용해하였다. 흡광도는 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL, USA) 를사용하여 540 nm에서측정하였다. 세포생존율은어떠한처치도가하지않은 control cells 과의비율로나타내었다. [ 즉, viability (% control) = 100 x (absorbance of treated sample)/(absorbance of control)] 5. Flow cytometric analysis 붉은색형광염색약인 propidium iodide (PI) 와초록색형광염색약인 FITC annexin V (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 를사용하여 apoptotic cell 을분석하였다 개의 cells 를 10 cm 2 plastic plate에깔고 70-80% 의 confluence 를유지하였다. 먼저 cells 에 24시간배지고갈을하고, 다음 24 시간동안 TFE를농도별로처치하였다. 부착된 cells 를 trypsin 으로처치하여회수하였고부유 cells 과 trypsin 처치 cells 는모두 70% ethanol 로 resuspension 하여 -20 에서 overnight 하여고정시켰다. 고정된 cell 은 개 / ml의농도로 PBS에 suspension 시킨후, FITC annexin V와 PI를처리하여얼음위에서 20 분간반응시켜 flow cytometer (Particle Analysis System, Partec GmbH, Münster, Germany) 로분석하였다. 6. TUNEL assay MCF-7 cell 을 4 well chamber slide에 well당 개의농도가되게배양하고 TFE를농도별로 24 시간처리하였다. Cell은 PBS로 2회 washing 한후에 4% paraformaldehyde 로고정하여 Tunel (Terminal deoxynucleotidyl transferase -medited dutp -biotin nick end labeling) assay 에사용하였다. Tunel assay 는 In Situ cell death detection kit-pod (Roche, Mannheim, Germany) 를사용하여 kit에포함된 protocol 에맞춰분석하였다. 즉, paraformaldehyde 로고정된 cell 을 0.3% H 2O 2 를사용하여 blocking 시키고 0.1% 20

4 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.21 No.3 August 2008 triton X-100/0.1% sodium citrate 로 permeabilisation 상태로만든후에 TdTenzyme이처리된용액으로 labeling하였다. PBS로 2회 washing 한후에 converter -peroxidase(pod) 로 37 에서 30분간처리하고 DAB로발색하여 light microscope 로관찰하였다. 7. DNA laddering assay Cell은회수하여 PBS로 2회 washing 한후, 개의 cell 을 PBS 200 μl로 suspension 시켰다. DNA laddering assay 는 DNA purification kits (Nucleogen, Seoul, Korea) 를사용하여 agarose gel electrophoresis 를실시하여분석하였다. 즉, 개 /200 μl PBS로준비된 cell 에 proteinase K(100 μg/ ml ) 와 RNase A(20 μg/ ml ) 를첨가하고 kit에서제공되는 lysis buffer 를사용하여 56 에서 10분간반응시켰다. 400 μl의순수 ethanol 을가하여 vortexing 한후, kit에서제공되는 protocol 에따라 filtering 과 washing 과정을반복하여 genomic DNA를회수하였다. DNA 전기영동은 1.8% agarose gel 을사용하여 50 V에서 1시간동안전개시켰으며 ethilium bromide(0.5 μg/ ml ) 로염색하여 band를확인하였다. 8. Poly-ADP Ribose Polymerase(PARP) cleavage 세포핵추출은 Kim 등 29) 의방법에따라시행하였다. 즉, cell 을 ice-cold PBS 로 2회세척한후 PBS를가하여수거한다음 microtubes 에보관하였다. 그후 cells 을 2,000 g 에서 5분간원심분리하고, 10 mm의 HEPES (ph 7.9), 10 mm의 KCl, 0.1 mm의 EDTA, 0.5% 의 Nonidet P-40, 1 mm의 DTT와 0.5 mm의 phenylmethylsulfonyl fluoride 를함유한저장액의 buffer 를가하여세포를 rupture 시켰다. Cells lysates 를얼음위에 10분간방치한다음 7,200 g 로 5분간 4 에서원심분리하였다. Crude nuclei 를함유한 pellets 에 20 mm의 HEPES (ph 7.9), 400 mm의 NaCl, 1 mm의 EDTA, 10 mm의 DTT와 1 mm의 PMSF를함유한추출 buffer 를 50 μl를가하여현탁시킨후, 얼음에 30 분간방치하였다. 그후 15,000 g 에서 10 분간원심분리한후, nuclear fractions 을함유한상층액을얻었다. Nuclear fractions 50 μg을 7.5% SDS-polyacrylamide gels 을사용하여분해시키고, nitrocellulose membranes 에이전하였다. 이 membranes 을 5% 의 BSA를함유한 PBS tween 으로 4 에서 overnight 하여 blocking 하였다. 그후 anti-parp antibody (1:2000) 로실온에서배양하였다. 발색은 immunoblot analysis 에서기술한방법으로하였다. 9. Caspase-3 activity Caspase-3 activation 은 procaspase-3 로부터 proteolytic processing 에의해 cleaved 된 p17, p12 절편을만들어낸다. 따라서 cleaved caspase-3 sandwich ELISA kit(cell signaling, MA, USA) 를사용하여 caspase-3 의 activity를측정하였다. Kit에제공되는 cell lysis buffer 를이용하여 cell 을분쇄하여 15,000 g 에서 10 분간원심분리하여 cell lysates ( 상등액 ) 를준비하였다. Cell lysates 로부터 cleaved caspase-3 는제품에첨부된 protocol 에맞게 ELISA법으로분석하였다. 21

5 천련자메탄올추출물이 Bcl-2 발현억제를통해유방암세포의자멸사에미치는영향 10. Cell lysates의준비 Cells 은 10 mm의 Tris (ph 7.4), 100 mm 의 NaCl, 30 mm의 sodium pyrophosphate, 1 mm의 EGTA, 0.5% 의 Triton X-100, 10% 의 glycerol, 1 mm 의 phenylmethylsulfonyl fluoride 와 100 μm의 sodium orthovanadate 를함유한 buffer로녹였다. Cell lysates 는매 5분마다 vortexing 하면서 30분간얼음에방치한후, 15,000 g 에서 15 분간원심분리하여찌꺼기를제거하고상등액을취하여 total cell lysates 로사용하였다. 11. Immunoblot analysis SDS-PAGE 전기영동과 immunoblot analyses 는 Kim 등의방법 28) 에따라시행하였다. 단백질을 12% gel에전기영동으로분리하고, 이것을 nitrocellulose paper 로이전하였다. Nitrocellulose paper 에 Bad, Bcl-2,, Bcl- XL, Bax, Actin (Zymed Laboratory, San Francisco, CA, USA), caspase-9, caspase-3 (Pharmingen, San Diego, CA, USA) 등의 antibody 를가하여배양하였다. 면역반응성단백질은 ECL chemiluminescence detection kit (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) 를사용하여발색하였다. 12. Cytosolic fraction 에서 cytochrome-c analysis MCF-7 cell 은 PBS로 2회 washing 한후, lysis buffer (250 mm sucrose, 20 mm Hepes, 10 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 1 mm dithiothreitol, protease inhibitors) 에 resuspension 시켰다. 얼음위에서 20 분간 incubation 한후, Dounce homogenizer (Wheaton, Millville, NJ) 를사용하여세포를 homogenization (15 strokes) 시켰다. Homogenates 는 1,000 g 에서 10분간원심분리한후, 상등액만을취하여 15,000 g 에서 20 분간더원심분리하였고회수된 cytosolic fraction ( 상등액 ) 을 cytochrome-c 분석에사용하였다. Cytosolic fractions 20 μg을 12.5% SDS-polyacrylamide gels 을사용하여전개시키고, nitrocellulose membranes 에이전하였다. 이 membranes 을 5% 의 BSA를함유한 PBS tween 으로 4 에서 overnight 하여 blocking 하였다. 그후 anti-cytochrome-c antibody (1:2000) 로실온에서배양하였다. 발색은 immunoblot analysis 에서기술한방법으로하였다. 13. Statistical analysis 실험결과는 mean ± S.D. 로나타내었으며, student t-test 통계처리방법으로유의성을검정하였다. 유의수준은 p<0.05 로하였다. 통계프로그램은 spss 11.0 을사용하였다. Ⅲ. 結果 1. 천련자가 MCF-7 cell의세포생존율에미치는영향다른농도에서의천련자추출물 (TFE) 이 MCF-7 cell의생존율에미치는영향을분석하기위하여, MCF-7 cell 에 24시간배지고갈을한후, TFE 를 mg / ml의농도로 시간처치하였다. 그결과대조군은 0 h에서 ±0.0524, 24 h 에서 ±0.0376, 48 h에서 ± 으로시간의경과에따른세포의증식을나타내었다. 그러나 TFE 0.03 mg / ml을 22

6 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.21 No.3 August 2008 처리한경우는 24 h에서 ±0.0575, 48 h에서 ± 으로유의하게감소하였다 (P< 0.01). TFE 0.10 mg / ml을처리한경우에는 24 h에서 ±0.0154, 48 h에서 ± 으로유의하게감 소했으며 (P< 0.01), TFE 0.30 mg / ml을처리한경우에는 24 h에서 ±0.0247, 48 h에서 ± 로유의하게감소하였다 (P< 0.01). Cell Viability (Relative to 0 h Control) CONTROL TFE 0.03 mg/ml TFE 0.10 mg/ml TFE 0.30 mg/ml ** ** ** ** ** 0 h 24 h 48 h INCUBATION TIME Fig. 1. The effects of TFE on the changes of cell viability. MCF-7 cells were exposed to TFE ( mg / ml ) for h. Cell viability was assessed by MTT assay. Data represent the mean ±S.D. with eight separate experiments. significance was compared with untreated control at the same treated time, **P < 0.01, (TFE; Toosendan Fructus Extract) ** 2. 천련자가 MCF-7 cell 의 cell membrane 변화에미치는영향 TFE가 mg / ml의농도에서 24, 48 h에서유도한세포사가세포자멸사에의한것인지를알아보기위해서, 붉은색형광염색약인 PI와초록색형광염색약인 FITC annexin V를사용하여 apoptotic cell 을분석하였다. FACS analysis 결과 TFE의농도가증가할수록세포외막으로돌출된 PS와결합한 FITC annexin V의증가로세포자멸사의분율이각각의농도에서유의하게증가하였다 (P< 0.01)(Fig. 2). TFE가 MCF-7 cell을 mg / ml의농도에서유도한세포자멸사를세포의형태학적특징인 cendensed nuclei 를관찰하기위하여 TUNEL assay 를실시하였다. 대조군에서는 TUNEL stain에양성인 MCF-7 세포가많이나타나지않았으나, TFE를처치한경우에는 TUNEL stain 에양성인세포가농도에따라증가하였다 (Fig. 3). DNA laddering 실험에서도 TFE의농도의존적으로 DNA의 fragmentation 이증가하는것으로나타났다 (Fig. 4). 3. 천련자가 MCF-7 cell 의 DNA 분절 에미치는영향 23

7 천련자메탄올추출물이 Bcl-2 발현억제를통해유방암세포의자멸사에미치는영향 A) CONTROL TFE 0.03 mg / ml TFE 0.10 mg / ml TFE 0.30 mg / ml B) (Relative to control) Apoptotic Cell Number ** ** ** Control Fig. 2. Flow cytometric profile of green versus red fluorescence of MCF-7 cells stained with FITC Annexin V and PI. MCF-7 cells were treated with TFE for 24 h. The population was separated into three groups: live cells showing only a low level of fluorescence, apoptotic cells showing green fluorescence and necrotic cells showing both red and green fluorescence (A), and the fold increase of apoptotic death cell was calculated (B). Data represent the mean ± SD of six separate experiments. **Significant at P<0.01 compared with vehicle treated. (TFE; Toosendan Fructus Extract) 3. 천련자가 MCF-7 cell 의 DNA 분절에 미치는영향 TFE 가 MCF-7 cell 을 mg / ml 의농도에서유도한세포자멸사를세포 의형태학적특징인 cendensed nuclei 를 관찰하기위하여 TUNEL assay 를실시 24

8 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.21 No.3 August 2008 하였다. 대조군에서는 TUNEL stain에양성인 MCF-7 세포가많이나타나지않았으나, TFE를처치한경우에는 TUNEL stain 에양성인세포가농도에따라증가하였 다 (Fig. 3). DNA laddering 실험에서도 TFE의농도의존적으로 DNA의 fragmentation 이증가하는것으로나타났다 (Fig. 4). CONTROL TFE 0.03 mg / ml TFE 0.10 mg / ml TFE 0.30 mg / ml Fig. 3. TUNEL assay of TFE-treated MCF-7 cells MCF-7 cells treated with mg / ml of TFE for 24 h. The TUNEL assay confirms that the TFE treatment induces apoptotic cell death. The dark violet spots are condensed nuclei. (TFE; Toosendan Fructus Extract) Fig. 4. DNA Laddering of MCF-7 cells exposed to TFE TFE induces internucleousmal DNA fragmentaion. MCF-7 cells treated with TFE for 24 h. M is the maker of size. CON is untreated control. (TFE; Toosendan Fructus Extract) 4. 천련자가 MCF-7 cell 의 PARP 분할 및 Caspase에미치는영향. Flow cytometric analysis 와 DNA laddering 으로확인된 TFE의세포사멸유도결과와관련하여, 세포내 apoptosis 관련단백질중의하나인핵내의 PARP 의변화를핵분획에서관찰하였다. 본실험에서는농도가증가할수록 cleaved PARP가유의하게증가함을보여주었고 (Fig. 5A), procaspase 가감소하는것을보여주었다 (Fig. 5B). Cleaved caspase-3 kit를사용하여 caspase-3 의활성형을측정한결과에서도 TFE 농도의존적으로활성이증가되었다 (Fig. 5C). 25

9 천련자메탄올추출물이 Bcl-2 발현억제를통해유방암세포의자멸사에미치는영향 C) Fold Increase (Relative to Control) Cleaved Caspase Fig. 5. The effects of TFE on the levels of proteins associated with apoptosis. MCF-7 cells were exposed to TFE ( mg / ml ), for 24 h. PARP was immunoblotted using the PARP antibodies in the nuclear fractions and procaspase-3 and -9 were immunoblotted in total cell lysate. Actin was used as a loading control (A). The density of proteins was calculated using densitometer (B). Cleaved caspase-3 was detected by sandwich ELISA kit of cleaved caspase-3 (C). The 1 is control, 2 is 0.03 mg / ml of TFE, 3 is 0.10 mg / ml of TFE, and 4 is 0.30 mg / ml of TFE. (TFE; Toosendan Fructus Extract) 5. 천련자가 MCF-7 cell의 pro/anti -apoptotic protein에미치는영향. TFE가유도하는세포자멸사에관여하는 protein 을알아보기위하여, proapoptotic protein 인 Bad, Bax, antiapoptotic protein 인 Bcl-2, Bcl- 30,31) XL 의발현을total lysate로분석하였다. 실험결과 TFE는 pro-apoptotic protein 인 Bad와 Bax의발현에는영향을미치지않았으며, anti-apoptotic protein 인 Bcl-2 의발현을농도의존적으로감소하는경향을보였다. Bcl- XL 의발현은대조군에비해감소했으나유의한수준의결과는나타나지않았다 (Fig. 6). 26

10 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.21 No.3 August 2008 A) Bad Bax Bcl-2 Bcl- XL Fig. 6. The effects of TFE on the levels of pro/anti-apoptotic proteins. MCF-7 cells were exposed to TFE ( mg / ml ), for 24 h. Bcl-2, Bcl- XL, Bax and Bad proteins were immunoblotted using the respective antibodies in the total lysate. Bad is a loading control (a). The density of proteins was calculated using densitometer (b). The 1 is control, 2 is 0.03 mg / ml of TFE, 3 is 0.10 mg / ml of TFE, and 4 is 0.30 mg / ml of TFE. (TFE; Toosendan Fructus Extract) 6. 천련자가 MCF-7 cell 의 cytochrome-c 에미치는영향. TFE 가 Bcl-2 의발현을농도의존적으로 감소시킨것과관련하여미토콘드리아를 제거한 cytosolic fraction 에서 cytochrome-c 의발현을분석하였다. 대조군에서는세포질내에 cytochrome-c 의양이적었으나, TFE 를 0.30 mg / ml을 처치한경우는세포질내의 cytochrome-c 가 2 배이상증가하였다 (Fig. 7). Fold Increse Cytochrome-c (Relative to Control) CON TFE ( mg / ml ) Fig. 7. The effects of TFE on the levels of cytochrome-c protein associated with apoptosis. MCF-7 cells were exposed to TFE ( mg / ml ) for 24 h. Cytochrome-c was immunoblotted using the cytochrome-c antibody in the cytosolic fraction. The density of cytochrome-c was calculated using densitometer. (TFE; Toosendan Fructus Extract) Ⅳ. 考察 유방암은세계적으로가장빈번한여 성의사망원인질환중의하나이며, 매 년약 100 만명이상의환자가발생한다 1). 최근우리나라에서도각종암의발생 률이증가하여암으로인한사망률이전 체사망률의 24.4% 를차지하여사망원인 1 위를차지하게되었다 1,32). 우리나라에 서의유방암은여성암중자궁암, 위암 다음으로많은비중을차지하고있다 1). 특히, 유방암은 2002 년새로발생한암환 자중에서증가율이가장높아, 1995 년과 비교하면 166% 의증가세를나타내고있 다 33). 통계청자료에의하면, 1994 년에 27

11 천련자메탄올추출물이 Bcl-2 발현억제를통해유방암세포의자멸사에미치는영향 비해 2004 년의경우여성인구 10 만명당 유방암으로인한사망자수가 3.8 명에서 6.2 명으로급격하게증가하는추세인데, 이는자궁암으로인한사망자수가 6.8 명에서 5.5 명으로줄어든것에비교하면, 사망자의증가추세가급격함을잘나타 내고있다 2). 유방암과유사한한의학적질환으로는 石癰 3), 乳巖 4), 奶巖 5), 番花奶 6), 巖 7) 등 이있다. 증상으로는乳房腫塊. 不痛, 不 痒, 不赤하고, 或內熱, 夜熱, 五心煩熱, 肢體倦瘦, 月經不調등이나타나기도하 며 4,8), 病因으로肝鬱氣滯 4), 憂怒抑鬱 9), 憂鬱傷肝 10), 思慮傷肝 10) 등의七情所傷과, 이것이오래되어氣血損傷 4) 4), 衝任失調 되어장부기능이실조된것으로볼수 있다. 치료로는초기에肝氣鬱結로인한 때는疏氣行血, 疏肝解鬱하는치법을 이용하였고 10), 氣血虧損할때는大補氣 血하는치법을이용하였다 4). 유방암에관해국내연구발표된단일 약재로는, 鬼箭羽 11), 黃芩 12), 半枝蓮 13), 槲寄生 14), 三稜 15), 탕약으로는抗癌丹 16), 加味雙和湯 17), 淸肝解鬱湯 18), 歸朮破癥湯 19, 活絡交靈丹 20), 益氣養榮湯 21), 橘葉散 變方 22) 등이있으며, 蜂毒藥鍼液 1 23) 을 이용한연구도보고되고있다. 천련자 (Toosendan Fructus) 는멀구슬 나무과 (Meliaceae) 에속한낙엽관목인천 련 ( 참멀구슬나무 ; Melia toosendan Sieb. er Zucc) 의성숙한과실을건조한것으 로, 苦寒有小毒하며, 肝胃小腸經으로入 하며, 舒肝行氣止痛驅蟲作用으로, 胸 脇痛, 脘腹脹痛, 疝痛, 蟲積腹痛을치료 한다 34). 일반적으로, 川楝子는玄胡索과 배합되어서는金鈴子散 ( 素問病機氣宜 保命集 ) 을이루어肝氣鬱滯로인한胸 脇腹痛을치료하며, 小茴香木香吳茱萸등과배합되어서는導氣湯 ( 沈氏尊生書 ) 을이루어寒疝氣通을치료한다 24,34,35). 천련자의성분으로서는 (+)-α, β, γ-pinene, β-sitosterol, eugenol 등이함유되어있는것으로알려져있다 36). 현재까지천련자에대한연구로는, 서 25) 의천련자의毒性에관한연구와천련자가肝膽에미치는영향에대한약리학적연구 26,27) 및전립선에미치는영향 28) 등이보고되고있다. 본연구자는천련자가胃經으로도入하며, 行氣止痛하는효능이있으며, 胸脇痛및脘腹脹痛을치료하는것에근거하여 34), 천련자를인간유래 breast adenocarcinoma cell line인 MCF-7 cell 의 apoptosis 에미치는영향을알아보고자본연구를시행하였다. Apoptosis 는외부인자의자극이나, 내적인변화에의해서원래가지고있던세포사멸의경로가활성화되어그세포가자발적으로죽음으로써개체의항상성유지와손상된세포의제거를효율적으로수행하는자발적이고능동적인죽음의기전이다 37). 이러한세포자멸사는일련의생화학적, 형태학적특징을가진세포사의과정으로 38,39), 세포의발생, 분화, 성장및노화등의전과정을통하여세포의생존과사멸은균형을이루며, 개체의항상성을유지하게하는데, apoptosis 가여러가지원인에의해통제되지못할경우, cancer 등을유발하기도한다 40-44). 실제로항암제, γ선조사, immunotherapy 등과같이종양세포를살해하는것들은대다수목적세포들을 apoptosis 로유도매개하는것이밝혀져있다 45). 즉, 종양 28

12 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.21 No.3 August 2008 의치료에서중요목표중의하나는종양세포에특이적인세포자멸사를유도하는것이고 46-48), 또한많은 anticancer drug들은 apoptosis inducer 로작용한다 49-51). 이에저자는천련자가인간유래 breast adenocarcinoma cell line인 MCF-7 cell 의 apoptosis 에어떠한영향을미치는지를평가하고, 그와관련된단백질의변화를관찰하여유의한결과를얻어보고하는바이다. 먼저, 세포생존율실험결과대조군은 0 h 에서 ±0.0524, 24 h에서 ±0.0376, 48 h에서 ± 로나타났다. 반면에 TFE 0.03 mg / ml을처리한경우는 24 h에서 ±0.0575, 48 h에서 ±0.0063, TFE 0.10 mg / ml을처리한경우에는 24 h에서 ±0.0154, 48 h에서 ±0.0016, TFE 0.30 mg / ml을처리한경우에는 24 h에서 ±0.0247, 48 h에서 ± 을나타내었다 (P< 0.01). 따라서 TFE는농도및시간의존적으로유의하게세포사를유도하는것을확인하였다. 다음으로는, 농도와시간의변화에따른세포의죽음과 apoptosis 와의관련성을관찰하기위하여 MCF-7 cell 에 TFE 를처치한후 propidium iodide (PI) 와초록색형광염색약인 FITC annexin V 를사용하여 cell 의 membrane 변화를 FACS로관찰하였다. 실험결과 TFE의농도가증가할수록세포외막으로돌출된 PS와결합한 FITC annexin V는증가하였다 (P< 0.01). 이러한결과는 TFE가유도하는세포사에는세포사멸이연관되어있음을나타내는결과로사료된다. PS의세포막외로의돌출외에, 세포자멸사의또다른특징의하나인 DNA 분 절을관찰하기위하여 TUNEL assay 와 DNA laddering assay 를실시하였다. 두가지의확인방법모두, control 보다 TFE 를처치한경우에는 DNA의분절이증가하였다. 이러한결과는 FACS analysis 의결과와더불어 TFE가 MCF-7 cell 을세포자멸사로유도한다는것을나타낸다. FACS, TUNEL, DNA Laddering 으로확인된 TFE의세포사멸유도결과와관련하여, 세포내 apoptosis 관련단백질중의하나인 PARP 및 caspase-3 의변화를관찰하였다. 일반적으로 apoptosis 가유도될때에는핵내에서 PARP의분할이일어나고, 이러한 PARP의분할은 DNA fragmentation 과 chromosome condensation 을유도하면서, 세포사멸을일으키는것으로알려져있다 52). 본실험에서는농도가증가할수록 cleaved PARP가증가함을보여주었다. 이러한 PARP의분할을촉진하는상위단백질은주로 caspase 로서, 대부분의 apoptosis signaling pathway 는 cysteine protease family인 caspase 의 activation 에의한결과이다 53). Caspase 는일반적으로세포자멸사를억제하고있는단백질들을분해하여세포자멸사를진행시키는역할을한다. 현재까지알려진 caspase 중 caspase-3 가다양한세포자멸사자극에의하여공통적으로활성화될수있으며, 활성화된 caspase-3 는 PARP의 cleavage 에관여한다 54). 본연구에서도 TFE는다른세포자멸유도물질 29,55) 과마찬가지로농도의존적으로 caspase-3 의활성을증가시켰다. 한편, caspase-3 는 extrinsic pathway (death ligand delivered to death receptor) 와 intrinsic pathway(mithocondria assembly 29

13 천련자메탄올추출물이 Bcl-2 발현억제를통해유방암세포의자멸사에미치는영향 of pro-apoptotic factors) 의두가지경로에서활성화될수있으므로 56), capsaicin 유도 apoptosis 가 mitochondria 를경유하는지를밝히기위하여세포질에서의 cytochrome-c 의발현을관찰하였다. Cytochrome-c 는 mitochondria 에서세포질로분비되어 APAF-1 과 caspase-9 이합쳐져 apoptosome 57) 을구성하고, 이 apoptosome 은 caspase 를활성화한다 58). 본연구의결과에서 cytochrome-c 는처리한군이실험군에비하여증가하였다. 이러한결과는 TFE가유도하는 apoptosis 에는 mitochomdria 가관여됨을나타내는결과이다. 일반적인경우 mitochondria 의 cytochrome-c 는 Bcl-2, Bcl- XL 에의하여 cytosol 로 release 되는것이억제되어있지만, apoptosis 기작이활성화되면, cytosol 에서 단백질과결합되어있던 Bad 단백질이 단백질과분리되고, 분리된 Bad 단백질은 mitochondria 로이동하여 Bax 를활성화하게되고, Bax는 Bcl- XL 을억제하여, cytochrome-c 의방출을증가시켜, apoptosis 를유도한다. 또 mitochondria 로전위된 Bad는 Bcl-2 의활성을억제하여 cytochrome-c 가쉽게 cytosol 로유리되게한다 30,31). TFE는 pro-apoptotic protein 인 Bad와 Bax의발현에는영향을미치지않았으며, anti-apoptotic protein 인 Bcl-2 의발현을농도의존적으로감소시켰다. Bcl-2 는미토콘드리아에존재하며, Bcl- XL 과더불어미토콘드리아로부터 cytochrome-c 의분비를억제하여세포자멸사를억제하는역할을한다. 이상의연구결과를종합하여보면, 천련자메탄올추출물이 Bcl-2 단백질을억제하여, mitochondria 를경유하는 apoptosis 를유도함으로써유방암치료에유의한 효과를보이는것으로사료된다. 그러나, 앞으로유방암에대한천련자의임상적 용연구가충분히이루어져야할것이 며, 천련자의行氣止痛하는효능을고려 하여, 유방암뿐만아니라다른암종에 대한천련자의효과도고려해볼필요성 이있다하겠다. Fig. 8. TFE induces apoptosis via the inhibition of Bcl-2 expression. Ⅴ. 結論 천련자 (TFE) 를인간유래 breast adenocarcinoma cell line 인 MCF-7 cell 에처치하여, 이들의세포사멸과정을 MTT assay, Flow cytometric analysis, TUNEL assay, DNA laddering assay, ELISA kit, Immunoblot analysis 등으로 분석한결과다음과같은결론을얻었다. 1. TFE 는시간 (24-48 h) 및농도 (

14 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.21 No.3 August 2008 mg / ml ) 의존적으로유의하게세포사를유발하였다. 2. FACS, TUNEL, DNA laddering assay 결과, TFE는농도의존적으로세포자멸사를유도하였다. 3. TFE는 caspase 의활성을증가시켰고, caspase 의하위인 nuclear fraction 에서는 PARP의분할을증가시켰다. 4. TFE가유도하는세포자멸사는 Bcl-2 의발현감소와이에의한 cytochrome-c 의 mitochondria 부터 cytosol 로의분비에기인한다. 이상의실험결과로볼때, 천련자메탄올추출물은 Bcl-2 단백질을억제하여, mitochondria 를경유하는 apoptosis 를유도함으로써유방암치료에유의한효과를나타낼것으로사료된다. 투고일 : 2008 년 7월 24 일 심사일 : 2008 년 7월 29 일 심사완료일 : 2008 년 8월 8일 參考文獻 1. Kim JD et al. Capsaicin can alter the expression of tumor formingrelated genes which might be followed by induction of apoptosis of a Korean stomach cancer cell line, SNU-1. Cancer Lett. 1997;120(2) : 통계청. 보도자료. h t t p : / / w w w. n s o. g o. k r /newnso/notice/reportview.html/cont ent_id= 巢元方. 巢氏諸病源候論. 서울 : 대성문화사. 1992; 陳自明. 婦人良方大全. 서울 : 정담. 1993; 24, 虞博. 醫學正傳. 서울 : 성보사. 1986; 朱橚, 普濟方. 北京 : 북경출판사 ; 許浚. 東醫寶鑑. 서울 : 법인문화사 ;691, 783, 張介賓. 景岳全書. 상해 : 상해과학기술출판사. 1984; 朱震亨. 丹溪心法附與. 서울 : 대성문화사 1993; 陳實功. 外科正宗. 북경 : 인민위생출판사. 1964; 박영수. SKBR3 유방암세포주에대한귀전우메탄올추출물의성장억제및항산화효과. 동국대학교대학원 용형순, 고성규. 황금의유방암세포주에대한항암작용. 대한한방내과학회지. 2004;25(3): 권은정등. 황련이유방암에미치는영향에관한연구. 대한한방부인과학회지. 1999;12(2): 하정일, 정선형. 전이된유방암환자에대한미슬토를사용한면역요법의임상례. 대한한방부인과학회지 ;14(3): 정경아. 삼릉추출물의인간유방암세포생장억제효과. 동신대학교대학원 송기철등. 항암단을투여한유방암환자 60 예에대한임상보고. 대한한방내과학회지. 2001;22(4): 현동환등. 가미쌍화탕의유방암발생및전이억제에대한실험적연구. 대 31

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