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1 Kor. Turfgrass Sci., 23(2):307~316, Creeping bentgrass(agrostis palustrics Huds.) 품종별 SCAR markers 개발 장덕환 * 정승호 한국잔디연구소 Development of SCAR markers in Creeping bentgrass (Agrostis palustrics Huds.) cultivars Duk-Hwan Jang* and Seung-Ho Jung Korea Turfgrass Research Institute, Seongnam , Korea ABSTRACT Creeping bentgrass (Agrostis palustrics Huds.) is cool season turfgrasse that is used for putting green in golf course. Creeping bentgrass cultivars are difficult to distinguish with the same species because of similar morphological characters and low level of genetic diversity. The SCAR markers using the specific DNA can be useful for differentiating between creeping bentgrass cultivars. Five RAPD primers were used for specific band detection among creeping bentgrass cultivars, penncross, penn A-4, crenshaw, L-93, CY-2, T-1. The pairs of SCAR primers for six cultivers were designed by the specific sequences of the bands that amplified by RAPD. Three of the six SCAR primers could not make the use as SCAR primers because the specific false bands were detected in all cultivars. The remaining pairs of SCAR primer, CY850F/R, T700F/R, L2900F/R, amplified the specific band at expected size for three cultivars, CY-2, T-1, L-93, respectively. The CY850F/R primer amplified a band of 850bp in CY-2 cultivar, the T700F/R primer amplified a band of 700bp in T-1 cultivar, and the L2900F/R primer amplified a band of 2.9kb in L-93 cultivar. In this study we developed the SCAR markers to identify and distinguish the inerseeded creeping bentgrass cultivars in a golf course green. Key words : RAPD, SCAR marker, PCR, Creeping bentgrass *Corresponding author. Tel : pbori@hanmail.net Received : Sep., 1, 2009, Revised : Nov., 15, 2009, Accepted : Nov., 22, 2009

2 308 한국잔디학회지제 23 권제 2 호 (2009) 서론 미국에서이용하고있는벤트그래스종 (species) 은 5개로크리핑벤트그래스 (creeping bentgrass, A. palustrics), 콜로니얼벤트그래스 (colonial bentgrass, A. capillaris), 밸벳벤트그래스 (velvet bentgrass, A. canina), 래드톱 (redtop, A. alba), 드라이랜드 (dryland, A. castellana) 다. 이들중크리핑벤트그래스와콜로니얼벤트래스가그린, 티, 페어웨이등에가장많이이용되고있다 (Elizabeth et al., 2003). 일반적으로크리핑벤트그래스는강한포복경생장, 낮은예고에대한저항성등의특성을가지고있어골프코스의그린, 티등에가장많이이용하고있다. 주로서늘한기후에잘적응하지만높은퍼팅품질로인해전이지대에서의이용이증가하고있다 (Cacler와 Duncan, 2003). 전이지대에위치한국내골프장의골프코스내그린은모두크리핑벤트그래스로조성되어있다. 크리핑벤트그래스품종들중에가장많은비율을차지하는것은 penncross 품종이며, 다음으로 L-93, penn-a4 순이였다 ( 한국잔디연구소, 최근골프장수의급격한증가와골프플레이어들의퍼팅그린스피드향상요구등으로인해신품종에대한요구가점차적으로증가하고있다. 그린전체를신품종으로전면교체하는것은많은인력, 시간, 경비등이소요되므로신품종을인터씨딩 (inter-seeding) 하여점진적으로교체하는방안들이검토되고있다 (Rossi, 1999). 인터씨딩후기존잔디품종에대한신품종으로의전환율은대부분형태적특성만으로조사하기때문에전환율에대한정확한검증이어렵다. 따라서전환율을보다정확히검증하기위해서는 DNA 분석방법의도입이필요할것으로판단된다. 하지만크리핑벤트그래스품종간의유전적근연관계가매우가 까워유전적인표지인자 (genetic markers) 에의한구별이어렵다 (Rossi, 1999). 여러가지방법들이벤트그래스종 (species) 간, 품종간구별을위해이용되어져왔다. Wilkinson과 Beard(1972) 는 Acrylamide gel disk 전기영동방법을이용하여크리핑벤트그래스품종들에대한구별을실시하였다. 또한 Isozyme 전기영동방법에의해서크리핑벤트그래스품종간에유전적인다양성등을조사하였다 (Warnke 등, 1997). 그러나 Jones(1983) 은저장후 isozyme의안정성에문제제기를통한분석의한계성을제시하였다. Huff와 Palazzo(1998) 은 Laser flow cytometry을이용하여파인훼스큐 (fine fescue) 초종을염색체별로분류하였으며, Bonos 등 (2002) 은벤트그래스의종 (species) 간배수체 (ploidy) 의상이성을이용하여검정하였다. 하지만최근에는 DNA를이용하여유전자지도 (genetic mapping) 를작성하고, 품종간구분등을실시하고있다. Caceres 등 (2000) 은 RFLP(restriction fragment length polymorphic) marker를이용하여크리핑벤트그래스품종들을구분하였고, Yaneshita(1997) 은한국잔디의유전적다양성과중간잡종성을구분하였다. 이런분석방법은방사선동위원소를이용하여야하며, 결과를얻기위해서는많은시간과노력이필요하다. 따라서유전자분석을위해시간과노력을절감할수있는방법으로 PCR를근거로한분류방법들이개발되었는데, Casler 등 (2003) 과 Hollman 등 (2005) 은벤트그래스영양체 (clones) 들간 RAPD(random amplified Length polymorphic DNA) marker를이용하여유전적인다양성과종 (species) 들을분류하였다. 하지만 PCR를근거로한 RAPD방법은신속하고, 적은비용이소요되는장점이있지만

3 Creeping bentgrass(agrostis palustrics Huds.) 품종별 SCAR markers 개발 309 PCR반응온도조건에너무민감하게반응하여재현성이떨어지는문제가있다 (Skroch와 Nienhuis, 1993). 또한 Vergara 와 Bughrara(2004) 은벤트그래스의유전적인다양성을분석하기위해 AFLP(amplified fragment length polymorphism) 를이용하였으며, Cai 등 (2004) 은 AFLP를근거로한국잔디의연관지도를작성하였다. 또한재현성이매우높으며, 특정유전자를분석할수있는 SCAR(sequence characterized amplified region) marker를개발하였다 (Paran와 Michelmore, 1993). SCAR marker는 RAPD primer에서증폭된특이적 band들을이용하여만들며, 대략 20개의특이적염기서열로구성된다 (Elizabeth 등, 2003). 특이적염기서열수가증가할수록재현성이더욱높아진다 (Hernandez 등, 1999). 따라서본연구에서는유전적인다양성이매우낮은크리핑벤트그래스품종들에대한유전분석을위해품종별 SCAR marker를개발하고, 이를이용하여인터씨딩 (inter-seeding) 률이나품종간유연관계등을분석하는데활용하고자수행하였다. 재료및방법 DNA 추출 크리핑벤트그래스품종별 SCAR markers 을개발하기위해서총 6개의공시품종을이 용하였다 ( 표 1). 이들품종의 DNA를추출하기위해서는모래로조성된포트 (15cm 15cm 20cm ) 에품종당 20립정도를파종하여잔디잎이 4~5엽기에식물체를채취하였다. 공시품종별 Genomic DNA 추출은 CTAB 방법 (Murray와 Thompson,1980) 을변형하여사용하였다, 채취한잔디식물체 1~2g 정도를 2.0 ml tube에넣고, CTAB extraction buffer (Buffer content : 100 mm Tris-HCl, ph 8.0, 1.4 M NaCl, 20 mm EDTA, 2% CTAB, 1% b- mercaptoethanol) 700 ul 를넣어준후 Retsch Mixer Mill MM301를이용하여식물체를마쇄하였다. 이후 65 에서 90분간 incubation한후 CTAB extraction buffer와동량의 phenol : chloroform : isoamylalchol (25 : 24 : 1) 넣었다. 10분동안다시 incubation 시킨후 4 에서 14,000 rpm (Eppendorf centrifuge 5415R) 으로 20분간원심분리한후 1.5 ml tube에상등액을취하였다. Chloroform : isopropanol (24 : 1) 을이용하여 2회정제한후상등액을취하였다. 상등액과동량으로 100% ethanol을넣고 10%(v/v) 의 3M sodium acetate를첨가한후 1분간 incubation시켰다. 4, 14,000 rpm에서 15 분간원심분리하여 DNA를침전시킨다음 70% ethanol 800 ul을넣고다시 4 에서 14,000 rpm에서 5분간원심분리하여응집된 DNA를세척하였다. DNA을건조시켜 Table 1. Cultivars, year released, and source of creeping bentgrass Cultivar Year of release Source Penncross 1955 Standard entry CY Snow Brand Seed Co. & Chiba-Prefecture Agr. Exp. Station Crenshaw 1993 Loft's Seed, Inc. L Loft's Seed, Inc. Penn A Tee-2-Green Corp. T Jacklin Seed by Simplot

4 310 한국잔디학회지제 23 권제 2 호 (2009) ethanol을제거하고 20 μl의 TE buffer를넣어응집된 DNA를녹인후 RNase처리를하였다. DNA농도를정량하기위해 20, 50, 100, 250, 500 ng의 λdna을이용하였고, 공시품종별로 DNA농도를 10 ng/ μl로희석하여 SCAR marker 제작에이용하였다. RAPD 분석크리핑벤트그래스품종별특이적인 SCAR marker를개발하기위하여 Random Primer (Qiagen) 을이용하였다 (Table 2). 공시품종별 PCR 반응농도는 DNA 20ng, 2.5mM dntp, 10pMol Primer, 0.75unit ExTaq polymerase (TAKARA) 이고, 멸균수를이용하여총량 25ul 로맞추었다. PCR 조건은 Johns 등 (1997) 의방법을변형하여사용하였다. DNA 증폭은 PCR기기 (ASTEC PC802) 를이용하여 94 에서 1분간 denaturation, 37 에서 1분간 annealing, 72 에서 2분간 extension의과정을총 30회반복하여수행하였다. SCAR Marker 제작을위한 cloning SCAR marker 제작을위해서는크리핑벤트그래스품종별특이적 band를선발하여 cloning하였다. PCR 반응에의해생성된 PCR product들은 1.0% agarose gel에서전기영동을하여특이적 band를확인하였다. PCR product 중에품종별로특이적 DNA band를선택하여오려내어 target DNA band를 pgem-t-easy vector(promega) 에넣었다. 이 Vector를이용해서 E. coli DH5α 를형질전환하였으며, LB-amp 배지에서배양후 Target DNA를추출하였다. SCAR primer 제작및분석추출한 DNA의염기서열분석은 Microgen ( 사에의뢰하여실 시하였다. 염기서열분석에필요한 primer는 pgem T-Easy vector(promega) 에있는 T7, SP6 primer를사용하였다. 또한크리핑벤트그래스공시품종별특이적인 SCAR primer 제작은 Microgen사의 DNA 염기서열분석결과를근거로하였다. Target DNA의염기서열에서 GC함량을고려하여공시품종별특이적염기서열을작성하였고, 공시품종별 Forward(F) 와 Reverse(R) 를한쌍으로 SCAR primer를제작하기위해 bioneer ( 사에의뢰하였다 ( 표 2). 6개공시품종별로제작한 SCAR primer에대해특이적 band의발현여부를검정하였다. 결과및고찰 SCAR marker 변환을위한 RAPD band 선발 크리핑벤트그래스 6개품종별특이적인 SCAR marker 개발을위해서표 2의 Random Primer(Qiagen) 를이용하였다. RAPD band를선발하여 SCAR marker로변환하고자 RAPD PCR의 annealing 온도를 37 로 PCR 반응을실시하였다. 5개 primer 모두에서 band수가평균 18~25개정도비교적많은다형현상을보였다. 하지만공시품종모두에서특이적 band가보이지않았는데, 이는크리핑벤트그래스종내유전적인다양성이낮아보다많은 RAPD primer를이용해야품종별특이적 bend를선발할수있을것으로판단된다. Warnke 등 (1994) 의연구결과에서도크리핑벤트그래스품종간유전적인다양성이낮음을보고하였는데, 이들은 isozyme polymorphism 방법에의해크리핑벤트그래스 19개품종간유연관계를조사하여유전적인다양성을보고하였다. 특히, 본연구의공시품종인 penncross와 crenshaw의유전적인

5 Creeping bentgrass(agrostis palustrics Huds.) 품종별 SCAR markers 개발 311 유연관계가 0.043으로매우가까웠다고하였다. 또한 AFLP를이용하여크리핑벤트그래스품종간유전적인다양성을조사한 Vergara와 Bughrara(2004) 의연구에서도유사한결과를보고하였다. 따라서본연구에서도 RAPD PCR에의해서품종별특이적 band가보이지않은원인은크리핑벤트그래스품종간유전적인다양성이낮기때문인것으로판단된다. Table 2. OPB primer list used to SCAR marker selection OPB primer No. a 5' to 3' Sequence 7 GGTGACGCAG 8 GTCCACACGG 9 TGGGGGACTC 10 CTGCTGGGAC 11 GTAGACCCGT a RAPD primers purchased by Operon Inc. 37 의 annealing 온도에서는공시품종별로특이적 band가나타나지않아 negative band를점차적으로줄이면서특이적 band를선발하기위해 annealing 온도를 1 씩올려가며특이적 band를선발하였다. OPB-7 primer에서 annealing 온도에따라총 3개의공시품종에대한특이적 band를선발하였는데, T-1품종은 annealing 38 에서 0.7kb 크기의 band, crenshaw, L-93 품종은 43 에서각각 0.5kb, 2.9kb 크기의 band를선발하였다. OPB-8 primer는 annealing 39 에서만 2개품종에대한특이적 band를선발하였는데, CY-2 품종은 0.9kb 크기의 band, penncross 품종은 1.2kb 크기의특이적 band 를선발하였다. Penn A-4 품종은 OPB-10 primer의 annealing 38 에서 3.0kb 크기의특이적 band를선발하였다 ( 표 1). SCAR primer 제작및검정 크리핑벤트그래스공시품종별로 SCAR primer를제작하기위해표 2의 primer들을이용하여 PCR을실시하였고, PCR product 들을 1.0% agarose gel에서전기영동을하였다. 공시품종별로선발된특이적 band를 agarose gel에서오려내어염기서열을분석하였다. 염기서열을분석하여제작한 SCAR primer들은표 3과같았다. SCAR primer의 CY850F/R에서앞영문대문자 CY는 CY-2 품종, 850은 850bp 크기의특이적 band를뜻하였다. 또한 L2900F/F2900R에서앞영문대문자 L은 L-93품종, 2900은 2.9kb크기의특이적 band를뜻하였다. F와 R은 SCAR primer 한쌍으로 F는 Forward, R은 Reverse를의미하였다. 6개품종별로 target DNA를 cloning하여 SCAR primer를제작한후검정한결과, penncross, penn A-4, crenshaw품종을대상으로제작한 3개 SCAR primer들은 6개공시품종에서모두 band가나타나 SCAR primer로활용이불가능하였다. 이는 target DNA의높은 GC함량과크리핑벤트그래스품종간유전적인다양성이낮은것에기인하는것으로판단된다. Dieffenbach 등 (1993) 은최적의결과를얻기위해서는 PCR primer의 GC함량을이상적으로유지하여야한다고보고하였다. PCR 과정에서충분한 annealing 이이루어지기위해서는 melting point(t m) 가 56~62 정도이며, 이를위해서는 G+C 함량이 50% 인 20개의 oligonucleotides가적합하다고하였다. T m 의온도가너무낮은경우에는특이성이결여되며, 너무높을경우에는특이적지역외에서상보성결합이높아져비특이적결과물들이증가한다고하였다. 따라서본연구의공시품종대부분은 target DNA의염기서열내 GC함량이높았고, SCAR primer 제작시 GC함량이상대적으로높았다. 이로인해 Foward와 Reverse간의 T m 의온도차이

312 한국잔디학회지제 23 권제 2 호 (2009) Table 3. Creeping bentgrass specific SCAR primer pair sequence derived from cloned RAPD fragments.

CACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCG T700F CACTAGTGAATTCGCGGCCGC T700R CTGGCGTAATAGCGAAGAGGC Annealing temperature b The numbers preceding the R(Reverse) and F(Forward) refer to the approximate size of the SCAR

또한 target DNA와 SCAR primer사이에비특이적결합이증가하여원하지않은지역에서증폭이일어나 SCAR primer로써의이용이불가능하였던것으로판단된다. 또한 6개공시품종모두에서 target DNA 의염기서열내 GC함량이높은것은크리핑벤트그래스품종간유전적인다양성이낮은것이원인인것으로판단된다.

6 312 한국잔디학회지제 23 권제 2 호 (2009) Table 3. Creeping bentgrass specific SCAR primer pair sequence derived from cloned RAPD fragments. a b RAPD primer SCAR primer a 5'to3' Sequence of SCAR primers OPB-8 OPB-7 OPB-7 CY850F GGTGACGCAGAGCACGTGTTGATC CY850R GGTGACGCAGGAGCTTCAAAG L2900F CAATTCCACACAACATACGAGCCGG L2900R CACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCG T700F CACTAGTGAATTCGCGGCCGC T700R CTGGCGTAATAGCGAAGAGGC Annealing temperature b The numbers preceding the R(Reverse) and F(Forward) refer to the approximate size of the SCAR band in bp. "CY", "L", and "T" indicates marker for CY-2, L-93, and T-1. is optimal annealing temperatures for each set of SCAR primers 가커져, 최적의 annealing 온도조건에서 PCR 반응이일어나지않았다. 또한 target DNA와 SCAR primer사이에비특이적결합이증가하여원하지않은지역에서증폭이일어나 SCAR primer로써의이용이불가능하였던것으로판단된다. 또한 6개공시품종모두에서 target DNA 의염기서열내 GC함량이높은것은크리핑벤트그래스품종간유전적인다양성이낮은것이원인인것으로판단된다. Vergara와 Bughrara(2004) 는 AFLP방법에의해크리핑벤트그래스품종과레드톱 (red top) 에대한유전적인다양성을분석하였다. 이들은크리핑벤트그래스의신 구품종에대한유전적인차이는있었지만 penncross, crenshaw, penn A-4, L-93 품종등은다른유럽에서유래된품종들에비해유전적으로근연관계가가까웠다고보고하였다. 이는미국내에서육성된품종들간에는육성모본들이유사한결과라고보고하고있으며이로인해국내에도입된대 Fig 2. Bending pattern of SCAR markers for three creeping bentgrass cultivars, a T700F/R (SCAR primer pairs) for T-1, b L2900F/R for L-93, C CY850F/R CY-2. Creeping bentgrass cultivars indicated are penncorss(lane 1), CY-2(Lane 2), L-93(Lane 3), T-1(Lane 4), penna-4(lane 5), crenshaw(lane 6). M indicates 100bp marker.

7 Creeping bentgrass(agrostis palustrics Huds.) 품종별 SCAR markers 개발 313 부분품종들은유사한육성모본으로인해유전적인다양성이떨어지는것으로판단된다. OPB-7 primer에서선발하여제작한 SCAR primer인 L2900F/R은 2.9kb에서 L-93품종의특이적 band가나타났으며, T700F/R은 700bp에서 T-1의특이적 band가나타났다. 또한 OPB-10 primer에서선발하여제작한 SCAR primer인 CY850F/R은 850bp 에서 CY-2품종의특이적 bend가나타났다. L-93, CY-2, T-1 품종들은 1993년이후에육성 ( 표 1) 되어보급되고있는품종들로최근새롭게조성되고있는국내골프장에보급되고있다. 골프인구의증가보다는새롭게조성되고있는골프장의수가더많이증가함에따라상대적으로골프장운영을위한영업경쟁이더욱증가하고있다. 신설골프장의경우에는기존골프장과차별화된골프장설계및최근골프플레이어들의요구에부합하는그린스피드향상관리를실시하고있다. 기존골프장에서는이런문제를해결하기위해그린전체를개보수하기보다는골프장운영에미치는영향을최소화하기위해인터씨딩 (inter-seeding) 을선택하고있다. 하지만인터씨딩을실시한후신품종과기존품종간에우점율을조사하기위해형태적인특성만으로는크리핑벤트그래스품종간구분이어려우며, 유전적인 marker를이용할지라도품종간유전적인근연관계가가까워구분하기어렵다.(rossi, 1999). 따라서 penncross로조성된그린에 L-93, CY-2, T-1 품종들을인터씨딩한후이들신품종으로의전환율을품종간형태적인특성으로조사가불가능하므로본연구에서개발한 SCAR marker를이용하게되면보다빠르고, 정확한조사가가능할것으로기대되었다. 국문요약 크리핑벤트그래스는골프코스의퍼팅그린에서주로사용하고있는한지형잔디초종이다. 크리핑벤트그래스품종들은형태적인특성이나유전적인다양성이협소하여품종간구분이매우어렵다. 따라서이들품종간유전적인다양성이나골프코스그린의인터씨딩율에대한조사를위해 SCAR marker를개발하고자본연구를수행하였다. penncross, penn A-4, crenshaw, L-93, CY-2, T-1 공시품종들에대한 SCAR marker 개발을위해 5개 RAPD primer에대한품종간구분이가능한특이적 band를선발하였다. 선발한특이적 band의염기서열을분석하여품종별 SCAR primer를제작하였다. 각품종의 SCAR primer별로특이적 band가나타나는지에대한여부를검정한결과, penncross, penn A-4, crenshaw 품종의 SCAR primer 는 6개공시품종에서동일한크기의 band가나타나 SCAR marker로써활용이어려웠다. 하지만 CY-2의 CY850F/R primer는 850bp, T-1의 T700F/R primer는 700bp, L-93의 L2900F/R는 2.9kb에서특이적 band가나타나 3개품종별 SCAR marker로서활용이가능하였다. 따라서본연구에서개발한 3개품종별 SCAR marker를활용하여크리핑벤트그래스의품종별유전적다양및골프코스그린의인터씨딩율조사에활용이가능할것으로기대된다. 주요어 : 인터씨딩, 크리핑벤트그래스, RAPD, SCAR marker

8 314 한국잔디학회지제 23 권제 2 호 (2009) 참고문헌 1. 한국잔디연구소 Bonos, S.A., K.A. Plumley, and W.A. Meyer Ploidy determination in Agrostis using flow cytometry and morphological traits. Crop Sci. 42: Caceres, M.E., Pupilli F., Piano E., and S. Arcioni RFLP markers are an effective tool for the identification of creeping bentgrass(agrostis stolonifera L.) cultivars. Genetic Resources and Crop Evolution 47: Cai, H., M. Inoue, N. Yuyama, and S. Nakayama An AFLP-based linkage map of Zoysiagrass(Zoysia japonica). Plant Breeding 123: Casler, M.D., and R.R, Duncan Turfgrass biology, geneitcs, and breeding. p 175. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey. 6. Casler, M.D., Y. Rangel, and J.C., Stier, and G., Jung PAPD marker diversity among creeping bentgrass clones. Crop Sci. 43: Dieffenbach, C.W., T.M. Lowe, and G.S. Dveksler General concepts for PCR primer design. Genome Res. 3:S30-S Elizabeth, A.S., M.D., Casler, and G., Jung Development of species-specific SCAR markers in bentgrass. Crop Sci. 43: Hernandez, P., A. Martin, and G. Dorado Development of SCARs by direct sequencing fo RAPD products: a practical tool for the introgression and marker-assisted selection of wheat. Mol. Breed. 5: Hollman, A.B., J.C. Stier, M.D. Casler, G. Jung, and L.A. Brilman Identification of putative velvet bentgrass clones using RAPD markers. Crop Sci. 45: Huff. D.R., and A.J. Palazzo Fine fescue species determination by laser flow cytometry. Crop Sci. 38: Johnes, M.A., P.W. Skroch, J. Nienhuis, P.Hinrichsen, G. Bascur, and C. Munoz-Schick Gene pool classification of common bean landraces from Chile based on RAPD and morphological data. Crop Sci. 37: Jones, T.W.A Instability during storage of phosphogluco-isomerase isoenzymes from ryegrass(lolium spp.). Physiol. Plant 58: Murray, M G; Thompson, W F Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic acids research,v.8 no.19 pp Paran, I, and R.W. Michelmore Development of reliable RCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Gen. 85: Rossi, F.S Interseeding bentgrasses into established turf. Golf

9 Creeping bentgrass(agrostis palustrics Huds.) 품종별 SCAR markers 개발 315 Course Management August p: Skroch, P., and J. Nienhuis Impact of scoring error and reproducibility of RAPD data on RAPD based estimates of genetic distance. Theor. Appl. Gen. 91: Vergara, G.V., and S.S. Bughrara Genetic differentiation of tetraploid creeing bentgrass and hexaploid redtop bentgrass genotypes by AFLP and their use in turfgrass breeding. Crop Sci. 44: Warnke, S.E., D.S. Douches, and B.E. Branham Relationships among creeping bentgrass cultivars based on isozyme polymorphism. Crop Sci. 37: Wilkinson, J.F., and J.B. Beard Electrophoretic identification of Agrostis palustris and Poa pratensis cultivars. Crop Sci. 12: Yamamoto, I., and J.M. Duich Electrophoretic identification of cross-pollinated bentgrass species and cultivars. Crop Sci. 34: Yaneshita, M., Nagasawa R., Engelke M.C., and Sasakuma T Genetic variation and interspecific hybridization among natural populations of zoysiagrasses detected by RFLP analyses of chloroplast and nuclear DNA. Genes Gener. Syst. 72:

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