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민규 종
5 years ago
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1 저작자표시 - 비영리 - 변경금지 2.0 대한민국 이용자는아래의조건을따르는경우에한하여자유롭게 이저작물을복제, 배포, 전송, 전시, 공연및방송할수있습니다. 다음과같은조건을따라야합니다 : 저작자표시. 귀하는원저작자를표시하여야합니다. 비영리. 귀하는이저작물을영리목적으로이용할수없습니다. 변경금지. 귀하는이저작물을개작, 변형또는가공할수없습니다. 귀하는, 이저작물의재이용이나배포의경우, 이저작물에적용된이용허락조건을명확하게나타내어야합니다. 저작권자로부터별도의허가를받으면이러한조건들은적용되지않습니다. 저작권법에따른이용자의권리는위의내용에의하여영향을받지않습니다. 이것은이용허락규약 (Legal Code) 을이해하기쉽게요약한것입니다. Disclaimer

2 工學碩士學位請求論文 중국산민물어류의플루오로퀴놀론계항균제잔류량조사 Investigation of Fluoroquinolones residues in Fresh-Water Fish imported from China 2010 年 8 月仁河大學校大學院生物工學科 ( 生物工學傳攻 ) 朴銀敬

3 工學碩士學位請求論文 중국산민물어류의 Fluoroquinolones 계항균제잔류량조사 Investigation of Fluoroquinolones residues in fresh-water fish imported from China 2010 年 8 月指導敎授蘇在成 이論文을工學碩士學位論文으로提出함 仁河大學校大學院生物工學科 ( 生物工學傳攻 ) 朴銀敬

4 Investigation of Fluoroquinolones residues in fresh-water fish imported from China By Eun-kyeong Park A THESIS Submitted to the faculty of INHA UNIVERSITY In partial fulfillment of the requirements For the degree of MASTER OF SCIENCE Department of Biological Engineering August 2010

5 이論文을朴銀敬의碩士學位論文으로認定함 2010 年 8 月主審 : 副審 : 委員 :

6 요약 본연구는시중에서유통되고있는중국산민물어류의 Fluoroquinolone 계항균제인 Ciprofloxacin(CIP) 와 Enrofloxacin(ENR) 의잔류량을 HPLC를이용하여측정하였다. 연중 Fluoroquinolone 계항균제의잔류량을측정한결과대체로 3-5월에잔류량이높게나타났다. 그렇지만시중에유통되고있는중국산민물어류 9종, 총 460건의 CIP와 ENR의합을측정한결과모두허용잔류기준미만이었다. 따라서시중에유통되는중국산민물어류는 CIP와 ENR의잔류에대해안전성을확보하고있다고볼수있다. - i -

7 중국산민물어류의플루오로퀴놀론계항균제잔류량조사 Investigation of Fluoroquinolones residues in Fresh-Water Fish imported from China Abstract Investigation of residual concentration is essential to protect consumers. This study was carried out to detect two fluoroquinolones(enrofloxacin, Ciprofloxacin) residues in muscle of the fresh-water fish imported from China. Fluoroquinolones were determined with high performance liquid chromatography(hplc) with fluorecence detector. For this survey, 29 samples of snake head, 151 samples of bull head, 21 samples of far eastern catfish, 130 samples of chinese muddy loach, 42 samples of eel, 32 samples of crucian carp, 11 samples of mandarin fish, 16 samples of leather carp, and 28 samples of carp were gathered in Incheon for one year in The recoveries of enrofloxacin and ciprofloxacin in spiked samples between ppm were 94.3%~96.7% and 90.6%~92.4% respectively. The range of the sum of fluoroquinolne(ciprofloxacin, Enrofloxacin) residual concentration were 0~0.079ppm. Being compared the average contents of the fluoroquinolone of those fresh-water fish, catfish, leather carp, and carp were higher than others. The average contents of fluoroquinolones fluctuated according to the season. Relatively fluoroquinolones were detected - ii -

8 a lot in the spring. Overall the fluoroquinolone residues in the tested samples were with in the maximum residue limit. Key words: Fluoroquinolone, residue, fresh-water fish, HPLC - iii -

9 목차 요약 ABSTRACT 목차그림목차표목차 ⅰ ⅱ ⅳ ⅴ ⅵ Ⅰ. 서론 1 Ⅱ. 연구목적 6 Ⅲ. 재료및방법 7 1. 대상항균제및표준용액의제조 대상항균제 표준용액의제조 8 2. 시료전처리 9 3. HPLC 분석조건 11 Ⅳ. 결과및고찰 표준검량곡선의상관성, 회수율, 검출한계및정량한계 CIP 와 ENR 의잔류량 15 Ⅴ. 참고문헌 21 - iv -

10 그림목차 Fig. 1 Flow chart of sample preparation for analysis of the fluoroquinolones in fresh-water fish 10 Fig. 2 HPLC chromatogram of fluoroquinolone in standard solution 14 - v -

11 표목차 Table 1. Status of imports of Chinese fish 3 Table 2. Major importer of fish (2009) 4 Table 3. Annual imports of fresh water fish from China (ton) 5 Table 4. HPLC condition for five fluoroquinolones determination in fish 12 Table 5. Number of tested samples and means of CIP+ENR 18 Table 6. Seasonal difference of residue(cip+enr) 19 Table 7. Each means of CIP, ENR 20 - vi -

12 Ⅰ. 서론 우리나라는수산물수출국에서수산물수입국으로전환되고있으며, 수산물수요의절반가량을수입수산물이차지하고있다. 특히중국은지리적으로근접하여최대수산물수입대상국이되고있다. (Table 1, 2) 이러한시점에서중국산식품관련사건이지속적으로일어나고있어중국산식품전반에대한불신이확대되고있는현실이다. 따라서중국산수산물의안전성여부는국내수입수산물안전성문제와도밀접한관계가있다고할수있다. 또한중국산민물어류는여러종이지속적으로수입되고있어 (Table 3) 항균제안전성확보가필수적이다. Fluoroquinolone 계약물은 nalidixic acid 의 naphthyridine 핵의 fluorine 과 piperazine 의환이부착된것 (1) 으로세균의 topoisomerase 중 DNA gyrase 나 topoisomerase ⅳ에작용하여이들효소를억제하여항균작용을나타내는광범위합성항균제이다 (Figure 1)(2). Fluoroquinolne 은그람양성세균, 그람음성세균, Mycoplasma spp., Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp., Enterobacteriaceas, Streptococcus pneumoniae 등여러가지미생물에강한항균력을갖고있어사람과가축의치료및예방약제로널리사용되고있다 (3-5). 그러나최근미국에서 Fluoroquinolne 계저항성 Salmonella 속균 (6) 과 Campylobacter 속균 (7) 이검출되는등약물의잔류로인한약제내성균발생과인체전이에의한난치성감염질환과의상관관계에대한과학적증거가증가함에따라미국 (8), 캐나다 (9), 유럽 (10), 일본 (11) 등에서는규제를강화하고있다. 우리나라에서는수산물의최대잔류허용량 (MRS) 을식품중동물용의약품의잔류허용기준 ( 별표7)(12) 에따라 Enrofloxacin(ENR) 과 Ciprofloxacin(CIP) 의합으로 0.1mg/kg으로규정하고있다. Fluoroquinolone 계잔류시험법으로는 Immuno assay(13), 1

13 Thin layer chromatography(tlc)(14), High performance liquid chromatography(hplc)(15), High Performance liquid chromatography-mass spectrometry(16) 등의방법이있다. HPLC 에의한분석법은형광검출기 (FLD) 나 photodiode array detector(dad) 를이용함으로서감도가나아졌다. HPLC법의시료전처리법으로는액상추출법 (LPE)(16-17), 고체상추출법 (SPE)(18-19), 시료고체상분산처리법 (20-21) 등이있다. 본연구에서는중국에서양식되어 2008년인천내수산물시장및재래시장에서유통되고있는민물어류를대상으로 Fluoroquinolone항균제중에서많이사용되고문제가되고있는 Enrofloxain(ENR) 과 Ciprofloxacin(CIP) 의잔류실태를액상추출법과형광검출기를이용한액체크로마토그래피를사용하여조사하였다. 2

14 Number of Chinese imports 33,091 26,496 28,365 Number of overall imorts 100,342 82,016 80,792 Table 1. Status of imports of Chinese fish(24) 3

15 Importer Number of imports Taiwan 2,028 Russia 4,599 Malaysia 920 USA 2,464 Vietnam 6,230 North Korea 9,685 Indonesia 1,167 Japan 12,792 China 26,193 Canada 1,418 Thailand 2,778 Peru 1,016 Table 2. Major importer of fish (2009)(24) 4

16 Sample 가물치 (snake head) 동자개 (bullhead) 메기 (cat fish) 미꾸라지 (loach) 뱀장어 (eel) 붕어 (crucian carp) Year 쏘가리 (mandarin fish) 이스라엘잉어 (leather carp) 잉어 (carp) , ,900 22, , , , ,006 5,842-9,412,927 9,647,976 8,943, ,864 2,431,231 1,753,684 3,916,407 2,324,819 2,056,860 95,759 76,118 76,182 2,121,174 1,298,581 1,319,825 1,907,518 1,347,091 1,057,322 Table 3. Annual imports of fresh water fish from China (ton)(24) 5

17 Ⅱ. 연구목적 플루오로퀴놀론은수산물양식시에도사용되고있고중국산수산물중민물어류의비중도높은관계로플루오로퀴놀론의잔류량을조사함으로서안전성여부를확인하려는목적으로연구를하게되었다. 6

18 Ⅲ. 재료및방법 2008년 1월부터 12월까지인천내수산물시장및재래시장에서유통되고있는중국산민물어류 9종 ( 가물치, 동자개, 메기, 미꾸라지, 뱀장어, 붕어, 쏘가리, 이스라엘잉어, 잉어 ), 총 460건을수집하여시료로사용하였다. 7

19 1. 대상항균제및표준용액의제조 1.1 대상항균제 Fluoroquinolones 계항균제중에서 Enrofloxacin 과 ciprofloxacin 2 종으로하였다. 1.2 표준용액의제조 Enrofloxacin 과 Ciprofloxacin 표준물질을각각 10mg 씩취 하여 methanol 을가해완전히녹여 100 μg /ml 농도로만들어 표준원액으로하였다. 8

20 2. 시료전처리 어체의근육을마쇄한후 5g을취하여이동상 (0.4% 트리에틸아민과 0.4% 인산혼합액 : 아세토나이트릴 = 920 : 80) 과아세토나이트릴을 1:1로섞은혼합액 40ml을가하여 2분간균질화시켰다. 이액을 80 에서 10분간열처리하여방냉한후에 3000G에서 10분간원심분리하여상등액을취하였다. 얻어진상등액은분액여두로옮겨핵산 50ml을가하여액층이분리될때까지정치하였다. 분리된하층액은 40 에서잔사만남을때까지감압농축하고이건고물을이동상 (0.4% 트리에틸아민과 0.4% 인산혼합액 : 아세토나이트릴 = 920 : 80) 2.5mL을가하여충분히용해시킨다음 0.2μm멤브레인필터 (Millipore, USA) 로여과후 HPLC분석에사용하였다 (Fig 1). 9

21 Take 5g of ground fish meat in 50ml centrifuge tube Add 40ml of mobile phase + acetonitrile(1:1,v/v) Shake for 2min 80 for 10min Centrifuge 3000G, 10min Transfer supernatant and add 50ml hexane and mix Take acetonitrile layer and dry under stream of nitrogen at 40 Dissolve residue with 2.5ml of mobile phase Filtrate with 0.45μm membrane filter Inject 40μl of sample solution into HPLC Figure 1. Flow chart of sample preparation for analysis of the fluoroquinolones in fresh-water fish 10

22 3. HPLC 분석조건 분석은형광검출기가장착된 HPLC(SIMADZU(JP/LC-20AD)), 칼럼은 Shiseido UG-120 type C18 (4.6mm ID 250nm) 를사용하였다. 형광기의검출파장은여기파장 278nm, 측정파장 455nm였으며, 이동상은 0.4% 트리에틸아민과 0.4% 인산혼합액 : 아세토나이트릴의비율을 920 : 80 으로하였다. 유속은 1.0mL/min 으로하였으며 run time 은 30분으로하였다 (Table 3). Enrofloxacin 과 Ciprofloxacin 의표준물질은 Sigma 제품 (St. Louis, MO, USA) 을, 유기용매는 HPLC 급으로 J.T. Baker(USA) 제품을사용하였다. 11

23 Item Analyte condition HPLC system Mobile phase SIMADZU(JP/LC-20AD) D.W(0.4%triethylamine and 0.4% phosphoric acid): acetonitrile = 920:80 Detector Fluorescence Ex. 278nm, Em. 455nm Colume Shiseido UG-120 type C18 4.6mm ID 250nm Colume temp 30 Flow rate Injection volume 1mL/min 40 μl Table 4. HPLC condition for five fluoroquinolones determination in fish 12

24 Ⅳ. 결과및고찰 1. 표준검량곡선의상관성, 회수율, 검출한계및정량한계 Enrofloxacin(ENR) 과 Ciprofloxacin(CIP) 의 2종혼합표준용액을 0.01~0.1ppm의농도범위로형광검출기가장착된 HPLC 에주입하여여기파장 278nm, 측정파장 455nm에서측정하였을때 ENR과 CIP에서모두 r²=0.999이상의양호한상관성을나타냈다. CIP와 ENR의 retention time은각각 분, 분이었다 (Figure 2). 항생물질이잔류되지않은어체의음성대조시료에 CIP와 ENR 표준물질을각각 ppm의농도로첨가한후정확도와정밀도를측정하였다. 항생물질별회수율은 3번반복시험하였고 ENR 은 94.3%~96.7%, CIP은 90.6%~92.4% 였다. 이결과는 CODEX 에서정한권장회수율 (0.01~0.1ppm 일경우 70~110%, 0.1ppm 이상 80~110%) 을만족하였다. 최 (22) 는 ENR 84.8~95.5%, CIP 77.8~85.7% 의회수율을보고했다. Schneider 와 Donoghue(25) 는 Fluoroquinolone 계항균제 6종 (Norfloxacin, Ciprofloxacin, Sarafloxacin, Enrofloxacin, Danofloxacin, Desethylene ciprofloxacin) 에대해회수율 66~110% 를보고했다. Fluoroquinolone 계항생물질 (CIP,ENR) 의검출한계와정량한계는각각 ppm 와 ppm 였다. Son(23) 은 CIP와 ENR의검출한계와정량한계를각각 0.005ppm 와 0.01ppm 으로보고하였으며 Schneider 와 Donoghue(25) 는정량한계로서 ENR 이 0.001ppm CIP가 0.002ppm 이었다고보고했다. 13

25 Figure 2. HPLC chromatogram of fluoroquinolone in standard solution 14

26 2. CIP 와 ENR 의잔류량 측정된잔류량은식품중동물용의약품의잔류허용기준에따라 CIP와 ENR의합으로나타내었다 (Table 5,6). 가물치 (snake head) 는총 29건중에서 CIP 또는 ENR 이 10건이검출되어 34% 의검출률을나타냈으며 CIP와 ENR의합의평균잔류량은 ppm이었으며, CIP와 ENR의합의검출범위는 0~0.012ppm이었다. 가물치는가을에높을잔류량을나타내었다. 동자개 (bullhead) 는총 151건중에서 CIP 또는 ENR 이 47 건이검출되어 31% 의검출률을나타냈으며 CIP와 ENR의합의평균잔류량은 0.007ppm 이었으며, CIP와 ENR의합의검출범위는 0~0.045ppm였다. 동자개는봄에높은잔류량을보였다. 메기 (cat fish) 는총 21건중에서 CIP 또는 ENR이13건이검출되어 62% 의검출률을나타냈으며 CIP와 ENR의합의평균잔류량은 0.011ppm이었으며, CIP 와 ENR 의합의검출범위는 0~0.068ppm이었다. 메기는봄에높은잔류량을나타내었다. 미꾸라지 (loach) 는총 130건중에서 CIP 또는 ENR 이 105 건이검출되어 81% 의검출률을나타냈으며 CIP와 ENR의합의평균잔류량은0.002ppm 이었으며, CIP와 ENR의합의검출범위는 0~0.057ppm의잔류량을나타내었다. 미꾸라지는봄에높은잔류량을나타내었다. 뱀장어 (eel) 는총 42건중에서 CIP 또는 ENR 이 17건이검출되어 40% 의검출률을나타냈으며 CIP 와 ENR 의합의평균은 0.003ppm이었으며, CIP와 ENR의합의검출범위는 15

27 0~0.04ppm의잔류량을나타내었다. 뱀장어는다른종과는달리여름에높은잔류량을나타내었다. 붕어 (crucian carp) 는총 32건중에서 CIP 또는 ENR 이 26 건이검출되어 81% 의검출률을나타냈으며 CIP와 ENR의합의평균은 0.01ppm이었으며, CIP와 ENR의합의검출범위는 0~0.05ppm의잔류량을나타내었다. 붕어는봄에높은잔류량을보였다. 쏘가리 (mandarin fish) 는총 11건중에서 CIP 또는 ENR 이 5건이검출되어 45% 의검출률을나타냈으며 CIP와 ENR 의합의평균잔류량은 0.001ppm이었으며, CIP와 ENR의합의검출범위는 0~0.005ppm이었다. 쏘가리는겨울에높은잔류량을나타냈다. 이스라엘잉어 (leather carp) 는총 16건중에서 CIP 또는 ENR이 13건이검출되어 81% 의검출률을나타냈으며 CIP와 ENR의합의평균잔류량은 0.011ppm이었으며, CIP와 ENR의합의검출범위는0~0.079ppm이었다. 이스라엘잉어는봄에높은잔류량을나타냈다. 잉어 (carp) 는총 28건중에서 CIP 또는 ENR이 17건이검출되어 61% 의검출률을나타냈으며 CIP와 ENR의합의평균잔류량은 0.011ppm이었으며, CIP와 ENR의합의검출범위는 0~0.054ppm이었으며여름에높은잔류량을나타내었다. 계절별로봤을때겨울과봄의잔류량이상대적으로높게검출되었다. 한편 CIP, ENR 의각각의잔류량평균을봤을때대부분 CIP 에비해서 ENR 의잔류량평균이높았으나미꾸라지의경 우에는 CIP 의잔류량평균값이더높게나타났다 (Table 7). 16

28 이상과같이인천에서유통중인수입중국산민물어류 9종 460건의 CIP와 ENR의잔류실태를조사한결과모두잔류허용기준이하였다. 따라서플루오로퀴놀론에대해서중국산민물어류는안전성이확보되었다고볼수있다. 17

29 Sample Number of tested samples means of CIP+ENR(ppm) detection range(ppm) detection rate(%) 가물치 (snake head) ~ 동자개 (bullhead) ~ 메기 (catfish) ~ 미꾸라지 (loach) ~ 뱀장어 (eel) ~ 붕어 (crucian carp) 쏘가리 (mandarin fish) ~ ~ 이스라엘잉어 (leather carp) ~ 잉어 (carp) ~ Table 5. Number of tested samples and means of CIP+ENR 18

30 sample Spring (month: 3-5) (ppm) Summer (6-8) (ppm) Fall (9-11) (ppm) Winter (12-2) (ppm) 가물치 (Snake head) 동자개 (Bull head) 메기 (Catfish) 미꾸라지 (Loach) 뱀장어 (Eel) 붕어 (Crucian carp) 쏘가리 (Mandarin fish) 이스라엘잉어 (Leather carp) 잉어 (Carp) Table 6. Seasonal difference of residue(cip+enr) 19

31 Sample means of CIP(ppm) means of ENR(ppm) 가물치 (Snake head) 동자개 (Bull head) 메기 (Cat fish) 미꾸라지 (Loach) 붕어 (Crucian carp) 쏘가리 (Mandarin fish) 이스라엘잉어 (Leather carp) 뱀장어 (Eel) 잉어 (Carp) Table 7. Each means of CIP and ENR 20

32 Ⅴ. 참고문헌 1. Wolfson JS, Hooper DC Fluoroquinolones antimicrobial agents. Clin Micobiol Rev 2: Gellert M DNA topoismerase. Annu Rev Biochem 50: Hooper DC, Wolfson JS Minireview The fluoroquinolone; Pharmacology, clinical use and toxicities in human. Antimicrob Agents Chmother 28: Vancutsem PM, Bablish JG, Schwark WS The quinolone antimicrobials; Structure, antimicrobial activity, pharmacokinetics, clinical use in domestic animal and toxicity. Cornell Vet 80: Mitsuyama J Structure of existing and new quinolones and relationship to bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. J Anti Chem 44: Herikstad H, Hayes P, Mokhtar M, Fracaro ML, Threlfall EJ, Angulo FJ Emerging quinolone-resistant Salmonella in the United States. Emerging Infect Dis 3: Smith KE, Besser JM, Hedberg CW, Leano FT, Bender JB, Wicklund JH, Johnson BP, Moore KA, Osterholm MT. 21

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34 residue Ⅲ conference on residues of veterinary drugs in food, Veldhoven, The Netherlands, 6-8 May, Juhel GM, Abjeun JP Screenig of quinolones residues in pig muscle by planer chromatography. Chromatographia 47: Carlucci G Analysis of fluoroquinolones in biological fluids by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A 812: Donoghue DJ, Schneider MJ Comparison between a bioassay and liquid chromatography-fluoroscence for the determination of incurred enrofloxacin in whole eggs. JAOAC 86: McCracken RJ, Spence DE, Kennedy DG Comparison of extraction techniques for the recovery of veterinary drug residues from animal tissues. Food Addit Contam 17: Barron D, Jimenez-Lozano E, Bailac S Determination of difloxacin and sarafloxacin in chicken muscle using solid-phase extraction and capillary electrophoresis. J Chromarogr B 767: Van Hoof N, De Wasch K, Okerman L, et al. Quantification 23

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