<BFACB1B8C0DAB7E C8A F6B696E696EC0C75FBAD0C0DABBFDB8AEC7D0292E687770>

Transcription

1 Cytokinin KOREA FOREST RESEARCH INSTITUTE

2

3 발 간 사 식물생명공학은 무성증식과 세포 재분화를 근간으로 하고 유용 유전자 분리 조작 및 이용을 큰 수단으로 삼고 있는 응용기술입니다. 1983년 우리나라가 유 전공학 원년을 선포할 당시에 우리에게는 위의 어느 기술도 궤도에 올라 선 것 이 없었습니다. 국립산림과학원의 산림생명공학연구는 그 후 끊임없는 투자와 기술개발로 조직배양과 유전자 조작분야의 두 마리 토끼를 다 잡아 내었습니 다. 지금의 국립산림과학원의 산림생명공학과의 조직배양연구는 생물반응기를 이용한 세포 및 기관배양, 체세포배 유도 기술을 이용한 클론임업 시도 수준으 로 올라섰으며 유전자 조작연구는 자체 DNA chip 개발에서부터 다양한 형질 전환체 개발 분야와 LMO 현장 식재시험에 이르기까지 그 영역을 확대하고 있 습니다. 이러한 왕성한 확장의 기반은 무엇보다도 오랜 경험이 누적된 세포로부터의 식물체 재분화 기술이라고 할 수 있습니다. 그리고 이러한 식물체 재분화의 기 본 도구가 바로 식물생장조절 호르몬들입니다. 식물호르몬은 기본적인 생장 및 형태 조절 외에도 녹색 유지, 바이오매스 증산, 환경 스트레스 저항성 등 앞으 로의 적용가능성이 무한한 생명공학분야의 블루오션이라고 할 수 있습니다. 그러나 오랫동안 사용하던 중요한 재료인 식물호르몬이지만 식물체내에 미량 으로 존재하고 이러한 미량으로도 식물에 큰 반응을 일으키기 때문에 그 세세 한 기능을 연구하기가 어려웠던 것도 사실입니다. 최근 분석 장비가 발달하면 서 극미량 수준까지 정량이 가능하도록 분석기술이 발달하여 그동안 경험적으 로만 그 효과를 어림하던 호르몬의 작용들의 유형을 처음부터 정리하고 따져볼 수 있는 기틀이 마련되었습니다. 자세한 호르몬 분석기술은 산림생명공학과의 또 다른 연구진들에 의하여 지난해에 먼저 출간되었습니다. 따라서 이번 연구 자료집에서는 우선 식물 생장호르몬 중 발생학적으로 가장 중요하다고 여겨지는 호르몬의 하나인 싸이토키닌에 대한 지금까지의 연구동향 이 정리되었습니다. 싸이토키닌의 발견, 구조, 세포내 변환과정, 대사과정, 조절 과정을 유전자 발현의 측면에서부터 고려하고 있기 때문에 하나의 식물호르몬 인 싸이토키닌에 대한 이해를 높일 좋은 자료가 될 것으로 기대합니다. 끝으로 본 자료가 나오기 까지 수고한 산림생명공학과 형질전환연구실 직원 들의 노력을 치하하는 바입니다. 2010년 5월 국립산림과학원장

4

5 머 리 말 산림생명공학은 농작물이 아닌 임목을 대상으로 한 독특한 식물생명공학의 한 분야이지만 이용목적이 다를 뿐 식물체에 대한 시험관조작 과정과 유전자도 입을 위한 벡터개발기술 등을 다른 식물생명공학분야와 기반기술로 공유하고 있습니다. 특히 세대가 길어서 접목 및 삽목이라는 독특한 무성증식 체계에 의 존도가 높은 임목의 생명공학에서 세포 및 조직배양의 중요성은 말할 나위가 없습니다. 비록 조직배양이 아직도 trials and errors를 통하여 많은 진보가 이루 어지고 있는 것은 사실이지만 그동안 밝혀진 많은 과학적 사실들을 잘 정리하 여 돌아볼 경우 앞으로의 연구접근 방법을 결정하거나 결과에 대한 해석을 내 려야 할 때 우리의 판단력을 개선시킬 것은 부정할 수 없을 것입니다. 그런 의미에서 여기서는 우선 가장 중요한 식물 생장조절 호르몬인 싸이토키 닌의 생리 및 분자생물학을 다루었습니다. 1940년대 그 존재에 대한 심증이 확 실한 증거로 우리의 눈앞에 오기까지는 많은 세월과 우여곡절이 있었습니다. 우연이라는 행운도 작용했지만 무엇보다도 미량으로 존재하는 이 호르몬에 대 한 미세분석기술이 부족하였기 때문이었을 것입니다. 그동안 우리가 알고 있었던 줄기발생, 노화지연, 스트레스 내성을 조절하는 이 호르몬의 다양한 모습을 정리하였습니다. 세포내 활성조절을 위한 당과의 결합(conjugation), cytokinin oxidase에 의한 분해, 뿌리로부터 수송되어 오는 싸이토키닌의 항상성(homeostasis) 유지를 위한 신호, 최근의 형질전환체를 이 용한 싸이토키닌의 기능의 이해와 상업적 이용가능성을 정리하였습니다. 최근 microarray 등의 기술과 대사유전체학의 기술이 등장하면서 세포생리에 대한 우리의 이해도 증가하고 있습니다. 앞으로 이러한 주변 기반기술의 발전 으로 싸이토키닌에 대한 우리의 이해가 더욱 높아질 것으로 기대합니다.

6

7 목 차 제1장. 식물호르몬 Overview 1 1. 생장과 식물 호르몬 1 2. 주요 식물 호르몬 1 제2장. 싸이토키닌(Cytokinin)의 발견 및 구조 동정 4 1. 싸이토키닌의 발견 4 2. 싸이토키닌의 구조와 활성 5 3. 세포내 싸이토키닌의 두 가지 형태 7 4. trna와 싸이토키닌의 관련성 8 제3장. 싸이토키닌 합성 및 합성회로 9 1. 식물의 싸이토키닌 합성 장소 9 2. 싸이토키닌 합성과 무기양료 효과 싸이토키닌 합성회로 11 제4장. 싸이토키닌의 이동 및 작용부위 싸이토키닌의 이동 및 종착점 싸이토키닌 수용체 Two component system 세포내 함량유지 기작 20 제5장. 싸이토키닌의 기능 싸이토키닌 작용 순서 세포주기 진행 기관형성 싸이토키닌의 생리적인 효과 신호물질로서의 싸이토키닌 29

8 제6장. 싸이토키닌 생산 효소 및 유전자의 발견 미생물의 싸이토키닌 합성 유전자 식물의 싸이토키닌 생합성 유전자의 탐색 식물의 싸이토키닌 합성 유전자들의 발현특성 다른 식물 유래의 ipt 유전자들 34 제7장. 싸이토키닌 유전자 발현의 표현형 형질전환 기법의 이용 비정상적인 표현형 문제 노화지연 Stress 저항성과의 연관 39 제8장. 싸이토키닌의 대사 농도유지를 위한 대사작용 싸이토키닌의 당화(glycosylation)와 항상성의 조절 싸이토키닌 대사회로의 단계 확인 Cytokinin oxidase에 의한 싸이토키닌의 분해와 그 기능 DNA microarray 이용연구 46 제9장. 결 론 51 참고문헌 52 부 록 63

9 제1장 식물호르몬 Overview 1 제1장 식물호르몬 Overview 1. 생장과 식물 호르몬 모든 생명체는 하나의 세포에서 시작되어 분열되며 그 세포는 발달하여 다양한 역할을 하는 세포 혹은 조직으로 분화된다. 이러한 식물의 생장과 발달은 유전적 요인, 외부환경 요인 그리고 식물 내부의 화학적 호르몬의 영향을 받는다. 식물은 빛, 중력, 수분, 무기양분 및 온도와 같은 많은 환경적인 요인들에 대하여 반응한 다. 식물의 호르몬은 식물로 하여금 그 환경에 반응하는 능력에 영향을 끼치는 화 학적인 신호이다. 호르몬은 저농도에서 효과가 나타나는 유기화합물이다. 보통 식 물의 한쪽에서 합성되어 다른 곳으로 수송되어 작용한다. 이들은 특별한 표적 조직 과 상호작용을 하여 생장이나 과실 성숙 같은 생리적인 반응을 일으킨다. 이러한 각 생리적인 반응들은 두 가지 이상 호르몬의 상호작용의 결과인 경우가 많다. 따 라서 이러한 호르몬들은 필요한 시기에 필요한 곳에 필요한 양만큼 존재해야 식물 이 정상적으로 발달할 수 있다. 호르몬들이 식물의 생장을 촉진시키거나 억제하기 때문에 식물 생장조절 물질이 라고 한다. 지금은 많은 호르몬들의 인공 합성이 가능하기 때문에 이를 이용한 기 능구명이 어렵지 않게 이루어지고 있다. 통상 식물호르몬은 크게 6개 주요 그룹으로 나누는데 여기에는 옥신류(auxins), 지 베렐린류(gibberellins), 에틸렌(ethylene), 싸이토키닌류(cytokinins), 앱시식산(abscisic acid) 그리고 최근에 호르몬으로 인정된 브라시노스테로이드(Brassinosteroids)를 포 함시킬 수 있다. 2. 주요 식물 호르몬 2.1. 옥신류(Auxins) 옥신 즉, IAA(indole-3-acetic acid)는 결국 모든 식물생장 및 발달 측면에 영향을 끼치는 필수적인 다기능 식물호르몬이다. 비록 옥신 의존적인 생장이 모든 식물에 서 뚜렷하지만 이 호르몬은 식물의 정아부에서 형성되어 다른 곳으로 극성을 띠며 수송된다. 옥신이 뿌리 정단부분에 도달하면 다시 뿌리 끝에서 cortical 및 표피조

10 2 Cytokinin의 분자 생리학 직을 통하여 재배분된다(Lomax, 1995). 영양생장에서 옥신은 식물의 줄기 및 뿌리 의 한쪽 면으로 수송된다. 그 결과 재배치되는 바로 아래의 줄기 및 뿌리부분의 세 포들이 신장된다. 그 결과는 빛, 중력 끌림 혹은 잠재적인 부착지점을 향한 굽힘이 다. 생명공학연구를 비롯한 실제 응용연구나 현장 적용시험에서 값이 비싸고 열에 불안정한 IAA가 사용되는 경우는 거의 없다. 인공합성 옥신인 IBA, NAA, 2,4-D가 삽목발근, 조직배양시 캘러스 유도 등에 주로 사용된다 지베렐린류(Gibberellins: GA) 1920년대 일본의 과학자들이 곰팡이 Gibberella에서 생산되는 물질이 식물을 비정상 적으로 크게 신장시키는 것을 발견하였다. 그 물질인 지베렐린(gibberellins)이 나중에 발견되었고 식물자체도 이 물질을 생산한다는 것이 밝혀졌다. 이 물질은 식물에 여러 가지 효과를 내고 있지만 가장 큰 특징은 개화 및 신장생장을 촉진한다는 것이다. GA 대사의 중요 단계를 Hedden과 Phillips(2000)는 다음과 같이 요약하였다. 많은 GA 중 에서 생물학적 활성의 열쇠는 GA 19 가 GA 20 으로 GA 24 가 GA 9 으로 전환되면서 생기는 lactone 고리의 폐쇄 여부이다. 즉, 활성의 증가는 효소 20-oxidase의 작용과 관련이 있 다. 다양한 기능을 가진 3-oxidase가 생물학적으로 활성이 없는 GA 20 혹은 GA 9 을 GA 5 및 GA 6 같은 생물활성이 높은 GA와 3-hydroxylated GA 1, GA 3 및 GA 4 로 전환을 시킨 다. 비활성화 단계에는 OH기를 C-2 위치에 첨가하여 GA 8, GA 29 혹은 GA 34 를 만들어 내는 2-oxidase가 관여한다. 1980년대 중반부터 서로 다른 GA가 개화유도와 줄기신장 에 미치는 영향이 연구되기 시작하였다. 그 결과 GA 8 및 GA 9 같은 어떤 GA는 두 과 정 모두에 전혀 관여하지 않으며 16, 17-Dihydro GA 5 는 개화는 촉진하는 반면 줄기신 장은 억제하며 GA 1 과 GA 3 은 둘 다를 촉진시킨다는 사실이 확인되었다 에틸렌(Ethylene) 에텔렌은 과실의 성숙과 관련이 있으며 유일하게 가스(gas) 상태의 호르몬이다. 고등식물에서 에틸렌은 메티오닌(L-methionine)에서 부터 비롯된다. 메티오닌이 ATP에 의하여 S-adenosyl methionine으로 전환되고 이것이 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid(acc)를 거쳐서 에틸렌이 된다. 에틸렌이 ACC로부터 만들어지는 반응은 완전 히 산소 의존적이어서 공기(산소)가 없는 경우에 에틸렌 합성은 완전히 억제된다. 식물에서 에틸렌의 농도는 생합성되는 속도와 이 가스(gas)의 확산속도에 따라 달 라진다. 에틸렌은 활발하게 수송되지도 않고 잘 분해되지도 않는다. 죽거나 상처받

11 제1장 식물호르몬 Overview 3 거나 병든 잎이 건강한 잎을 가리거나 병을 옮기기 전에 빨리 떨어뜨려 수분손실 을 막거나 병드는 것을 방지시키는 것도 에틸렌의 역할이다 싸이토키닌류(Cytokinins) 싸이토키닌은 식물의 세포분열을 촉진시킨다. 싸이토키닌은 발달하는 잎, 뿌리, 과실, 종자 등에서 생산된다. 천연적으로 나타나는 싸이토키닌은 adenine에서 유래 된 것으로 추정되고 N 6 말단에 방향족 혹은 이소프렌(isoprenoid)에서 유도된 측쇄 를 가지고 있다. 여기에 반해 인공 싸이토키닌은 기본적으로 diphenylurea 계통이 다. 현재 싸이토키닌은 2종류로 분류되는데 그 하나는 방향족(aromatic)이며 두 번 째가 이소프렌 계통의 싸이토키닌이다. 식물에서 가장 흔한 천연 싸이토키닌은 trans-zeatin 이며 지금까지 식물 조직은 인공 싸이토키닌보다 zeatin 같은 천연 싸 이토키닌에 더 잘 반응하는 것으로 알려지고 있다. 싸이토키닌은 조직배양에 없어 서는 안 될 생장조절제이다. 옥신과 싸이토키닌의 비율에 따라 뿌리, 캘러스 및 줄 기발생이 결정된다 앱시식산(Abscisic Acid: ABA) 앱시식산(Abscisic acid: ABA)은 보통 IAA 같은 다른 호르몬의 작용을 억제한다. 초기에는 ABA가 잎을 떨어지게 한다고 생각하였으나, 지금은 에틸렌이 그 역할을 하는 것이 밝혀졌으며 ABA는 식물의 눈(bud)의 휴면을 일으키고 종자에서 휴면 (dormancy)을 유지시킨다고 알려져 있다. ABA는 또한 건조에 반응하여 기공을 닫 는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 수분 스트레스를 받는 잎은 많은 양의 ABA 를 만들어내고 이 ABA가 K + 이온을 공변세포로 수송시키고 그 때문에 기공이 닫 히고 잎에서 수분손실이 더 이상 진행되지 않는다는 사실이 밝혀졌다 브라시노스테로이드(Brassinosteroids: BRs) 처음으로 분리된 BR인 Brassinolide는 1979년 유채(Brassica napus)의 화분 (pollen)에서 정제되었다. BR은 줄기절편에 세포분열과 신장을 일으키며 뿌리생장 을 억제하고 굴지성(gravitropism)을 증가시키며, 목부조직(xylem)의 분화를 촉진하 고 잎의 이층형성(abscission)을 지연시킨다. BR은 콩의 하배축에서 옥신과 별개로 유전자 발현과 신장에 영향을 줄 수 있다.

12 4 Cytokinin의 분자 생리학 제2장 싸이토키닌(Cytokinin)의 발견 및 구조 동정 1. 싸이토키닌의 발견 1950년대 부터 주목을 받은 조직배양 기술은 생물체의 조직의 일부를 떼어내어 무균적으로 배양하는 기술이다. 배양이란 결국 세포분열을 유도시켜 생물체의 일부 를 원래 생물과 단절된 환경에서 계속 자라게 유도하는 기술이다. 그 당시 이 기술 이 주목을 받은 이유는 이를 이용하여 조직이나 기관의 영향을 받지 않으면서 세 포의 생장 및 분화 과정을 연구할 수 있으라는 기대 때문이었다. 현대 식물생명공 학은 그 뿌리가 단연 이 조직배양기술이라고 할 수 있다. 그러나 세포나 조직은 그 냥 자라는 것이 아니라는 사실이 곧 밝혀지면서 세포나 조직의 분열을 야기할 여 러 가지 무기양분과 생장촉진 화학물질이 탐색되기 시작하였다. 따라서 식물유전공 학의 바탕이 된 이러한 기반기술도 오랜 시도와 실패 끝에 얻어진 경험의 산물이 다. 이러한 시도는 조직배양 연구의 초기부터 오늘날까지 계속되고 있지만 지금처 럼 많은 자료가 축적되지 않았던 초기에는 대단히 어려운 도전이었을 것이다. 1950년대 초반 Skoog 교수의 그룹은 화학물질 처리로 배양중인 담배줄기의 절편 에서 새로운 줄기를 발생시키는 연구를 하고 있었다. 이들은 온실에서 자란 식물의 줄기조각을 무균으로 건전한 상태로 얻는데 어려움을 많이 겪은 것 같다. 우리는 지금도 야외에서 자란 포플러나 자작나무의 무균배양체를 얻는데 상당한 주의를 기울여야 한다. 그 당시에는 아마 야외 재료의 선택, 소독 방법, 배양환경 등이 지 금처럼 잘 확립되지 않아서 더 어려웠을 것이다. 이들은 배양 조직들을 한정된 시 간 동안 자라게 할 수는 있었으나 꾸준한 생장이나 유지, 혹은 완전한 식물체의 재 생에는 실패하였다. 많은 첨가물이 시험되었는데 그 중 코코넛 밀크가 배지에 첨가 되었을 때 까마중(Solanum nigrum)의 어린 배가 생장하는 것이 다른 그룹에 의하 여 그 이전에 확인된 바 있었다(van Overbeek 등, 1941). 이후 코코넛 밀크에 식물 의 생장을 자극하는 물질이 있음을 인식한 Miller 등(1956)에 의해 이 물질이 싸이 토키닌 임이 확인되었다. Skoog와 Miller(1957)는 담배세포의 조직배양시 yeast extract와 청어 정소 DNA에서도 역시 세포 분열을 자극하는 물질이 존재한다는 것 을 확인하였다. 그들은 활성이 있는 물질을 화학적으로 분석하고 동정하였으며 인 공적으로 합성이 가능함을 확인하고 kinetin이라 명명하였다. 흥미 있는 점은 신선

13 제2장 싸이토키닌(Cytokinin)의 발견 및 구조 동정 5 한 청어 정소 DNA는 생장촉진 효과가 전혀 없으며 반드시 고압멸균(autoclave)을 해서 파괴시켰을 경우에만 활성이 나타난다는 점이다. 따라서 kinetin은 자연계에 존재하는 물질이 아니라 인위적으로 파괴시켰을 때에만 나오는 부산물이다. 이러한 발견은 세포분열에 활성이 있는 다른 화합물을 찾게 만들었는데 그 근거는 물질의 구조와 활성간의 어떤 관계가 있을 것이라는 생각일 것이다. 분명히 천연 싸이토키 닌은 kinetin과 비슷한 구조를 가지고 있을 것이기 때문이다. 곧이어 van Staden(1974)은 yeast와 malt extract로 부터 생장촉진 활성물질을 분리 하고 이물질이 zeatin riboside임을 확인하였다. 그는 1974년 Physiologia Plantarum 의 논문에서 몰트 추출물 및 코코넛 우유에서 지극히 활성이 있는 알려지지 않은 물질이 존재함이 밝혀졌다. 이 화합물이 diphenylurea가 아니라는 징후가 있다 라고 쓰고 있다. 그 당시의 증거는 거기까지였던 것 같다. 이러한 선구적인 연구들이 싸이토키닌 연구의 길을 열었다고 할 수 있다. Skoog 박사는 2001년 92세를 일기로 세상을 떠났고 학술지 Journal of Plant Growth Regulation은 2002년 그를 추모하기 위하여 Cytokinin Biology 특집호(Vol. 21)를 발행하여 그의 업적을 기렸다. 2. 싸이토키닌의 구조와 활성 <그림 1>은 자연계에서 발견되는 여러 가지 싸이토키닌의 형태를 보여주고 있다. 자연계에는 이소프레노이드(isoprenoid) 형과 방향족(aromatic) 형의 싸이토키닌이 존재한다. 제일 먼저 활성이 있는 싸이토키닌으로 동정된 것은 어린 옥수수(Zea mays)의 알갱이에서 분리되었다. 따라서 이때 분리된 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2- butenylamino) purin을 옥수수의 속명인 Zea를 따서 zeatin이라 명명하게 되었다. 이 후 담배 수(pith)조직의 생물검정을 통하여 그것이 가장 활성이 있는 싸이토키닌 임 이 증명되었다(Letham 등, 1963; Skoog 등, 1967). Leonard 등(1969)은 zeatin의 활 성은 측쇄(side chain)의 OH기(hydroxyl group)의 위치에 따라 달라지는 것을 확인 하였고, 그 중에서도 측쇄의 네 번째 탄소를 OH기로 치환시키면 활성이 증가되는 반면 2 또는 4번째 탄소를 치환시키면 활성이 감소되는 것을 관찰하였다. 싸이토키 닌 활성은 N 6- adenine 형과 non-n 6 -adenine 형 모두에 존재하는 것으로 확인되었다. non-n 6 -adenine 형 싸이토키닌인 N,N'-disubstituted urea와 일부 azanaphtalene는 담 배 식물의 캘러스 생물검정에서 약간의 활성이 감지되었다(Nishikawa 등, 1986).

14 6 Cytokinin의 분자 생리학 <그림 1> 자연에서 발견되는 다양한 싸이토키닌류의 호르몬: 이스프레노이드 (isoprenoid) 및 방향족(aromatic) 싸이토키닌이 존재한다. (출처:

15 제2장 싸이토키닌(Cytokinin)의 발견 및 구조 동정 7 3. 세포내 싸이토키닌의 두 가지 형태 아래 <그림 2>에서처럼 천연 싸이토키닌 riboside들은 당에 결합되어 싸이토키닌 활성이 없거나 감소된 glycoside를 형성한다. 식물은 당을 절단해내서 싸이토키닌 활성을 복구할 수 있는 효소를 생산한다. 이처럼 식물세포에서는 당과 결합하거나 거꾸로 결합된 상태에서 복원이 가능하다. 그러나 riboside 자체들도 일종의 결합인 것이 사실이다. 오늘날까지 모든 연구들은 그 화합물들이 어떤 확실한 활성을 보이 기 위해서는 당으로부터 떨어져 나와야 됨을 가리키고 있다. 식물들은 이러한 반응 을 빠르고 편리하게 수행하며 그래서 riboside들도 자체의 활성이 있는 것 같지만 이것은 인공물이다. 배양중인 세포는 자유로운 상태의 싸이토키닌이 필요하다. 이 것은 어떤 때는 ribose를 잘라낼 효소가 없는 경우가 있어서 그럴 경우 배지에 free base 싸이토키닌을 반드시 첨가해 주어야 한다. 원래 자연계의 싸이토키닌들은 RNA와 DNA strand의 변형된 염기로 출현하기도 한다. 실제로 cis-zeatin(덜 활성적 인 형태)은 모든 생물의 살아있는 세포 안에서 많은 trna분자 안에서 발견된다. Free cytokinin pool이 다른 nucleotide들과의 결합으로 바뀌는 정도와 nucleotide polymer들로부터 방출되는 정도는 아직 확실하게 알려지지 않았다. 식물마다 출현 하는 싸이토키닌의 주종은 다를 수 있어서 벼에서는 cis-zeatin이 많은 반면 애기장 대에서는 trans-zeatin이나 ip가 주종을 이룬다. 방향족 싸이토키닌도 식물체간에 변 이가 나타나기 때문에 수용체들과 상호작용을 하는 isoprenoid 및 aromatic 측쇄의 구조적 변이가 종마다 싸이토키닌의 활성과 특이성에 차이를 만들어내는 것으로 생각된다. trans-zeatin O-glucosyl-trans-zeatin <그림 2> 싸이토키닌류의 세포내 2가지 형태. 독립형과 결합형이 있으 며 독립형이 활성이 있으며 이 두형태는 효소에 의하여 상호 전환이 가능하다.

16 8 Cytokinin의 분자 생리학 4. trna와 싸이토키닌의 관련성 식물에서 싸이토키닌 합성 경로는 아직도 완전하게 밝혀지지 않았다. 싸이토키닌 이 발견된 초창기에서는 trna와 싸이토키닌이 구조적으로 매우 유사하여 trna가 어떠한 형태이건 싸이토키닌의 생합성과 관련이 있을 것이라는 추측이 있었다. 싸 이토키닌 구조를 가진 부분이 모든 생물의 trna에서 발견된다. 식물의 trna는 ipado, cis-zeatin riboside(cis-zr), trans-zr, 2-methylthio-iPA 및 2-methylthio-ZR 등을 가지고 있는 것으로 보고되었다(Horgan, 1984). 그러므로 이러한 trna가 이 소펜테닐화된 측쇄의 변형일 것이라는 설이 제시되었다(Cherayil과 Lipsett, 1977). 그러므로 하나의 가설은 싸이토키닌을 함유하는 trna의 분해 산물이 식물의 싸이 토키닌 재료로 이용될 것이라는 것이다. 먼저 Fox와 Chen(1967)이 6-benzyladenine 이 trna로 유입된다고 보고하였으나, 곧이어 Kende와 Tavares(1968) 등 여러 그룹 이 동위원소 3 H-labelled 6-benzyladenine와 6-benzyl-9-butyladenine을 이용하여 조 사한 결과 이것은 사실이 아니라고 결론을 내렸다. 최근 애기장대의 유전체가 밝혀 지면서 박테리아 유전자와의 비교를 통하여 더 많은 유전자들이 밝혀지고 있어서 싸이토키닌 합성 회로에 대한 이해는 급속도로 증가하고 있다. Golovko 등(2002)은 애기장대에서 Atipt2는 trna-ipt를 암호화하고 Atipt9는 cyanobacterial trna-ipt와 유사한 단백질 생산에 관여할 것이라고 제안하였다. 그러나 trna의 전환속도를 고 려한다면 trna를 경유하는 싸이토키닌 생산은 기껏해야 40% 정도이며 따라서 싸 이토키닌을 함유하는 trna는 중요치 않은 역할을 하거나 전구체를 제공하는 수준 일 것이라고 제시하고 있다(Barnes 등, 1980).

17 제3장 싸이토키닌 합성 및 합성회로 9 제3장 싸이토키닌 합성 및 합성회로 1. 식물의 싸이토키닌 합성 장소 식물에서 원래 주요한 싸이토키닌 합성장소는 뿌리 끝으로 알려져 있으나 최근 이러한 이론은 바뀌고 있다. 즉, 줄기 끝부분, 어린 잎, 꽃의 원기, 과실 안에서 발달 중인 종자 등 여러 곳에서 합성되며 장거리 신호와 국부적인 신호 모두에서 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 뿌리에서 생산된 싸이토키닌은 꼭지방향과 줄기 끝으로 수송되어 절단된 줄기에서 배어 나오는 물관액에서 분리해낼 수 있으며 이것은 활성이 적은 zeatin riboside의 형태를 띠고 있는 것으로 밝혀졌다. Salama과 Wareing(1979)은 식물체에 붙어있는 잎은 뿌리로부터 분비되는 싸이토키닌에 의존 하며 떨어진 잎은 인위적인 영양분이 공급될 때 싸이토키닌 합성이 가능하다고 보 고하였다. 식물에서 싸이토키닌 분포 유형을 조사하기 위하여 Emery 등(2000)은 GC-MS를 이용하여 생장하고 있는 루핀(Lupinus albus)의 물관과 체관 조직의 다양한 싸이토 키닌을 정량화하였다. 개화 10일 이후 싸이토키닌은 씨방에 축적됨이 관찰되었다. 흥미롭게도 초기의 cis-ck : trans-ck 이성체들의 비율은 10 : 1이었다. 그러나 그 비율은 점차적으로 감소하여 1 : 1 이하로 떨어졌다. 개화 후 40일에서 46일이 되면 배가 형성되고 종자에 배유가 채워질 때, 단지 1~14%의 싸이토키닌 만이 식물의 다른 부분으로부터 배유로 이동하는 것으로 나타났는데 이것은 종자 발달의 특별한 단계에서 싸이토키닌이 합성됨을 암시한다. 지금부터 10여 년 전 단자엽 및 쌍자엽 식물의 색소체(plastid)내에서 싸이토키닌 이 존재함이 밝혀졌다(Eva Benkova 등, 1999). 밀(wheat)과 담배(tobacco) 잎에서 엽록체를 분리하고 HPLC로 싸이토키닌의 함량을 정량화한 결과를 보면, 엽록체에서는 명반응보다 암반응에서 더 많은 종류의 싸이토키닌이 축적되며 세포질에서 발견되는 모든 종류의 싸이토키닌이 존재하고 각 싸이토키닌 대사를 위한 효소들도 존재한다. 엽록체에서 발견된 싸이토키닌으로 free base로는 zeatin과 isopentenyladenine (ipa), riboside로는 zeatin riboside 및 isopentenyladenosine riboside, ribotide로는 isopentenyladenosine-5-monophosphate, zeatin riboside-5-monophosphate 및 dihydrozeatin riboside-5 monophosphate 그리고 N-glucoside로는 zeatin-n9-glucoside, dihydrozeatin- N9-glucoside, zeatin-n7-glucoside 및 isopentenyladenine-n-glucosides가 확인되었다.

18 10 Cytokinin의 분자 생리학 비록 싸이토키닌이 엽록체와 관련된 많은 과정들에 영향을 끼치지만 엽록체가 싸이 토키닌을 함유하며 싸이토키닌 oxidase도 존재하는 것으로 보아 싸이토키닌 농도가 엽록체 내에서 지속적으로 유지됨을 암시하고 있다. 색소체에서 싸이토키닌이 합성된다는 증거는 더 많이 볼 수 있다. Sakakibara 등(2005)은 아그로박테리아의 T-DNA에서 암호화된 싸이토키닌 생합성 효소가 감염된 식물의 엽록소로 지향되고 거기서 기능을 하는 것을 증명하였다. Tmr 유 전자는 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate(HMBDP)을 기질로 사용하 여 새로운 싸이토키닌 생합성 bypass를 만들어내는 일종의 adenosine phosphateisopentenyl transferase(ipt)이다. 보통 식물의 싸이토키닌 생합성 회로와는 다르게 P450 monooxygenase-mediated hydroxylation이 필요없이 trans-zeatin-type 싸이토키 닌들이 직접 만들어진다. Tmr이 색소체에 존재하는 것과 일치하여 HMBDP는 색소 체에 위치한 공통적인 isoprenoid 전구물질들을 만드는 통로인 methylerythritol phosphate pathway의 중간 생성물이다. 이 결과는 아그로박테리아가 기주식물의 색 소체에 중요한 효소를 보내서 싸이토키닌 생산을 변경시켜 종양을 발생케 한다는 것이다. 2. 싸이토키닌 합성과 무기양료 효과 무기양료도 식물체의 싸이토키닌 함량에 영향을 끼치는 것으로 밝혀졌다. Salama 와 Wareing(1979)은 해바라기를 이용한 실험에서 식물의 체내 싸이토키닌 함량 의 농도에 끼치는 무기양료의 효과를 연구하였다. 그 결과 저농도의 질소는 잎, 뿌리 및 뿌리 삼출액에서 추출가능한 싸이토키닌의 농도를 급격하게 감소시켰고 인산결핍 상황에서도 비슷한 효과가 관찰되었으나 싸이토키닌 농도에 대한 칼륨 결핍 효과는 뚜렷하지 않았다. 식물의 잎의 싸이토키닌 함량은 질소를 암모니아태 (ammonium sulphate 나 ammonium nitrate)로 공급할 때보다 질산태(nitrate) 형태로 공급할 때 더 높았다. Takei 등(2001)은 질소가 결핍된 상태에서 재배된 옥수수에 질소가 공급될 때 목 부수액 그리고 뿌리 등에서 여러 가지 싸이토키닌의 시간적 공간적 분포를 조사하 였다. 뿌리와 줄기간의 의사소통 물질의 관점에서 축적되고 있는 증거들은 질산자체 가 일차적인 신호분자로서 질산 동화 유전자들 및 그 관련 유전자들의 전사가 활성 화되도록 촉발시킨다는 것이다. 이와는 반대로 광합성, 세포주기, 번역도구(translation

19 제3장 싸이토키닌 합성 및 합성회로 11 machinery)에 관련된 유전자들의 일부도 적어도 부분적으로는 질산태 질소와 다른 질소원에 의하여 조절되며 어떤 경우에서 이 효과는 싸이토키닌 처리로도 비슷하게 만들어 낼 수 있는 것으로 알려졌다. 옥수수에서 질산태 질소를 재공급하는 것에 반 응하여 싸이토키닌이 다른 부위로의 이동하고 축적되는 변화에 관한 시간적 공간적 연구에 의하면 뿌리, 체관부 액 및 잎에서 다양한 종류의 싸이토키닌이 순서대로 축 적됨을 보여주고 있다. 애기장대에서 질산태 질소를 재공급해주는 것에 반응하여 trans-zeatin riboside-5'-monophosphate와 trans-zeatin riboside가 뿌리에서 축적된다. 이러한 연구들은 싸이토키닌 대사와 수송은 고등식물에서 질소의 가용성에 의하여 보통 조절됨을 시사한다. 따라서 Takei 그룹은 질산태 질소 외에 싸이토키닌이 뿌리 에서 줄기에 질소의 가용성 여부를 알려주는 또 다른 신호일 수 있으며, 싸이토키닌 중에서 trans-zeatin 형태가 뿌리로부터 식물의 모든 다른 부분으로 이동될 수 있는 형태의 싸이토키닌일 것으로 추측하고 있다. 3. 싸이토키닌 합성회로 3.1. 식물의 싸이토키닌 합성 회로의 상류 식물에서 싸이토키닌 생합성의 주요 회로는 AMP(ATP/ADP) 생합성 경로이며 iprmp 의존적인 회로이다(그림 3). 싸이토키닌의 아데닌 측쇄의 전구물질은 보통 이소프렌(isoprene)이어서 터펜 생 합성 회로는 부분적으로 지베렐린류(gibberellins)와 공유된다. 이 경우 이용되는 재 료는 isopentenyl pyrophosphate이다. 박테리아에서 비교적 소상하게 알려진 싸이토 키닌 합성반응은 식물에서는 초기단계가 잘 밝혀지지 않고 있다. 현재 싸이토키닌의 1차 생합성 반응은 AMP같은 adenine nucleotide가 dimethylallyl pyrophosphate(dmapp)와 반응하는 isopentenylation 이라고 생각되고 있다. 이 화합물 들의 생리학적 중요성에도 불구하고 여러 해 동안 고등식물에서 이 반응을 촉매하는 효소의 특성이 밝혀지지 않았다. 식물에서 DMAPP:AMP isopentenyltransferase(ipt) 효 소 활성은 싸이토키닌 독립영양의 담배 배양 세포(Chen과 Melitz, 1979)와 옥수수 의 알곡(Blackwell과 Horgan, 1994)에서 그 존재가 확인되었으나 그 효소는 오랫동 안 분리되지 않았다.

20 12 Cytokinin의 분자 생리학 <그림 3> 현재 식물의 싸이토키닌 생합성 경로모델(Hwang 및 Sakakibara, 2006) nucleotides, nucleosides 및 nucleobases(즉. iprmp, ipr 및 ip)간의 상호전환은 퓨린 재활용 대사회로의 효소들에 의하여 촉매된다(Mok과 Mok, 2001 Sakakibara, 2005). DZ 종을 제외한 싸이토키닌 nucleobase 및 nucleoside들은 CKX에 의하여 대사되어 adenine(ade)이나 adenosine으로 각각 바뀌게 된다. cz, tz 및 riboside들은zeatin cis/trans isomerase에 의하여 상호변환이 가능하다(Bassil 등, 1993). 색깔이 있는 화살표의 두께는 대사흐름의 강도를 나타낸다. 검은 화살표로 표시된 흐름들은 아직 까지도 잘 구명되지 않은 부분들이다. 회색배경에 검은색 점선으로 나타낸 trna 분 해로부터의 싸이토키닌 합성과 cis-trans isomerization은 식물에서는 실험적으로 밝 혀진 것이 없다. czr, cz riboside; czrmp, cz riboside 5'-monophosphate; DZR, DZ riboside; DZRMP, DZ riboside 5'-monophosphate; ip, N6-(D2-isopentenyl)adenine; ipr, ip riboside; iprmp, ip riboside 5'-monophosphate; tzr, tz riboside; tzrdp,tz riboside 5'-diphosphate; tzrmp, tz riboside 5'-monophosphate; tzrtp, tz riboside 5'-triphosphate.

21 제3장 싸이토키닌 합성 및 합성회로 13 trans zeatin riboside TP trans zeatin riboside trans zeatin <그림 4> 식물에서 작동될 것으로 예상되는 싸이토키닌 합성회로 3.2. 싸이토키닌 생합성 회로의 2번째 단계 효소 ipt 최근 생물정보학이 발달하고 애기장대 유전체 염기서열 구명이 완결되면서 이 문 제를 해결할 기반이 마련되어 ipt homologous 유전자들이 발견되었다(Kakimoto 등, 2001; Sun 등, 2003; Takei 등, 2001a). Sakakibara와 Takei(2002)의 연구에 의하여 싸이토키닌 생합성 효소는 박테리아의 adenylate ipt 효소 및 trna ipt 효소와 구 조적으로 유사한 하나의 작은 multigene family에 의하여 암호화된다는 것이 밝혀 졌다. 싸이토키닌 생합성의 첫 번째 반응속도를 제한하는 단계(rate-limiting step)를 촉매하는 문제의 이 식물 효소 ipt는 ATP, ADP 혹은 AMP와 DMAPP 및 HMBDP 모두를 기질로 사용하여 N 6 -(D2-isopentenyl)adenine(iP) nucleotide와 trans-zeatin (tz) nucleotide를 각각 생성한다(Krall 등, 2002; Sakakibara, 2004). HMBDP는 박 테리아나 색소체에서 methylerythritol phosphate(mep) 대사회로로부터 유도되는 대

22 14 Cytokinin의 분자 생리학 사물질이다. DMAPP는 MEP 대사회로나 mevalonate(mva) 대사회로를 경유하여 진핵생물의 세포질에서 생성된다(Lichtenthaler, 1999; Rohmer, 1999). 흥미있는 점 은 DMAPP의 isopentenyl 부분을 AMP의 N 6 position에 이전시키는 박테리아의 효 소와는 달리 식물효소는 DMAPP의 isopentenyl 부분을 AMP 보다는 ATP와 ADP 에 옮기는 것을 선호한다. isopentenyl화된 측쇄는 OH기가 붙어서 zeatin-type의 싸 이토키닌이 된다. 따라서 OH기가 붙은 측쇄가 직접 adenine 부분의 N 6 position에 첨가되는 대체 회로가 존재할 가능성이 제시되었다 싸이토키닌 생합성 회로의 3번째 단계 효소 cyp 식물에서 주요 싸이토키닌의 생합성 경로는 ip-type 싸이토키닌의 trans-hydroxylation 를 경유한다. trans-hydroxylation 반응단계는 P450 monooxygenase인 CYP735A에 의 해 촉매된다(Chen과 Leisner, 1984; Takei 등, 2004a). Takei 등(2004)은 애기장대에 CYP7735A1와 CYP735A2 cytokinin trans-hydroxylases가 존재함을 보고하였다. 벼 의 유전체에서 tz 생합성에 관련된 것과 비슷한 CYP735A3와 CYP735A4가 존재한 다는 것이 확인되었다(Nelson 등, 2004). Takei 등(2004)은 애기장대의 CYP735A가 ip-nucleotide을 이용하지만 nucleoside나 free base는 이용하지 않으며 iprtp 보다 는 iprmp 혹은 iprdp을 선호함을 증명하였다 AMP 사용 tmr 회로 그러나 여전히 식물의 ipt가 HMBDP를 측쇄공여자로 이용하는지에 대한 여부는 명확히 알려져 있지 않다. 담배(Redig 등, 1996; Faiss 등, 1997; McKenzie 등, 1998)와 애기장대에서 (A stot 등, 2000) tmr 유전자의 과발현은 zeatin-type 싸이토 키닌들이 증가하였지만 ip-형싸이토키닌은 거의 증가되지 않았다고 보고되고 있다. 그에 반하여 ip형 싸이토키닌은 애기장대의 Atipt8(Sun 등, 2003) 또는 페튜니아의 SHO 유전자를 과발현 시켰을 때 증가되는 것이 관찰되었다(Zubko 등, 2002). SHO 는 일종의 식물 내생 싸이토키닌 생합성 ipt 유전자이다. 이 결과는 적어도 식물의 ipt 유전자(즉, 페튜니아의 SHO와 애기장대의 Atipt8)는 측쇄공여자로 DMAPP를 더 선호함을 암시한다. 비록 아그로박테리아의 tmr 유전자가 acceptor로서 AMP를 이용하는 것으로 알려 져 있고 in vitro에서 donor 기질로 HMBDP와 DMAPP를 이용한다 하더라도 in vivo 상태에는 기질로 HMBDP를 이용하여 고활성 싸이토키닌인 trans-zeatin을 숙주 식

23 제3장 싸이토키닌 합성 및 합성회로 15 물의 색소체에서 생산한다(Sakakibara 등, 2005). 그러나 아그로박테리아가 어떻게 HMBDP를 선택적으로 이용하는지에 대한 보고는 아직 없다 AMP 사용 tzs 회로 iprmp 독립회로는 원핵생물 아그로박테리아(A. tumefaciens)의 tzs(trans-zeatin secretion)와 수도모나스(Pseudomonas syringae)의 ptz(pseudomonas trans-zeatin producing)를 이용하는 대사경로와 유사하다(Beaty 등, 1986; Powell과 Morris, 1986; Akiyoshi 등, 1987). 이들 원핵생물들은 isopentenyladenine hydroxylase 효소와 이것 에 의한 ipmp 독립회로를 가지고 있다. 최근의 보고는 정제된 tzs 단백질이 HMBDP 로부터 AMP로 hydroxylated side chain이 이동하는 반응을 촉매하여 ZMP를 생산 함이 보고되었다(Krall 등, 2002). 따라서 tzs도 tmr과 같은 형의 효소로 원핵생물 특유의 기질선택을 하는 것으로 생각된다 식물의 iprmp-독립적인 대사회로 iprmp-독립적인 대사회로는 애기장대에서 A stot 등(2000)에 의해 발견되었는데, 이들은 DMAPP를 기질로 사용하는 AMP(ATP/ADP) 회로와 달리 여기서는 측쇄공 여자로 대신 HMBDP를 사용하며 애기장대에서 iprmp-독립회로가 더 중요한 역할 을 한다고 보고하였다. 그들은 iprmp 독립회로는 4-hydroxy-3-methyl-2(E)-butentl diphosphate(hmbdp)를 측쇄공여자로 제안하였으며 trans-zeatin은 OH기가 붙은 측 쇄의 직접적 첨가에 의해 합성 될 것이라고 제시하였다. HMBDP는 DMAPP와 dd3-isopentenyldiphosphate(ipp)를 생산하는 deoxyxylulose(dxp) 대사경로의 중간 산물이다.

24 16 Cytokinin의 분자 생리학 제4장 싸이토키닌의 이동 및 작용부위 1. 싸이토키닌의 이동 및 종착점 싸이토키닌은 특정 세포 및 조직에서 합성된 후 작용부위로 이동하여야 한다. 싸 이토키닌의 이동은 싸이토키닌 특이적인 운송체계에 의하여 이동되거나 확산으로 이동되는 것으로 생각된다. 선택적인 싸이토키닌 운송 시스템이 존재한다는 증거는 trans-zeatin이 목부조직에 축적되고 ip가 사부조직에서 과량 발견된다는 점 때문이다. 식물에서 싸이토키닌은 퓨린이나 nucleoside들을 운반하는 같은 수송체계를 이용한 다는 것을 보여준다. 색소체에서 세포질로 어떻게 싸이토키닌이 수송되는지에 대한 기작은 잘 밝혀지지 않고 있다. 수송되는 싸이토키닌의 주요 형태는 nucleoside인 것으로 생각되고 있다. 싸이토키닌의 생합성과 항상성 유지는 질소나 다른 호르몬 농도에 크게 의존하는 것으로 알려져 있다. Dewitte 등(1999)은 잎과 꽃을 형성하는 기관형성은 싸이토키닌 함량 증가와 연 관이 있으나 꽃눈의 형성 등과 같은 전이단계에서는 싸이토키닌의 함량은 매우 낮 음을 보고하였다. 그들 역시 dihydrozeatin과 isopentenyladenine은 주로 세포질에 존 재하는 반면 zeatin은 핵과 관련이 있음을 발견하고 이들은 각기 다른 종류의 싸이 토키닌이 대사과정의 각기 다른 과정에서 또는 다른 세포내 구획에서 역할을 할 것이라고 제안하였다. 유사한 결과를 Redig 등(1996)도 발표하였는데 이들은 동조 시킨 담배 BY-2 현탁배양 세포를 이용하여 세포주기(cell cycle) 진행과 세포내 식 물 호르몬 사이의 관계를 조사하였다. 그 결과 zeatin과 dihydrozeatin이 S-phase의 끝에 나타나며 각각 다른 형태의 싸이토키닌이 세포주기의 각각 다른 단계(step)에 서 역할을 할 것이라는 가설을 지지하였다. Emery등(2000)은 생장중인 루핀(Lupinus albus)의 목부와 사부 조직에서 GC-MS 를 이용하여 다양한 싸이토키닌을 정량하였다. 개화시기부터 시작하여 꼬투리형성, 배발생을 거쳐 개화 후 77일에 걸쳐서 생리적으로 종자가 성숙단계에 이를 때까지 분석한 결과 개화후 처음 10일간에는 수정된 자방에서 싸이토키닌이 축적되는데 cis-ck:trans-ck isomer의 비율이 처음에는 10:1이 되다가 점차 1:1이 안되게 감소 하였다. 제대로 성숙하지 못하고 쭉정이가 된 자방에서 cis-isomer와 trans-isomer 비율은 떨어지지 않고 높은 상태를 유지하였다. 꼬투리가 형성되기 시작할 때 자방 당 30~40 pmol의 싸이토키닌(이중 90% 이상이 cis-isomer)이 축적되는 것은 목부

25 제4장 싸이토키닌의 이동 및 작용부위 17 와 사부를 통한 이동 때문이라고 설명된다. 종자에서 배가 발생되고 종자의 내용물 이 차기 시작할 때인 개화 후 40~46일 후에는 배유의 싸이토키닌의 1%에서 14% 만이 다른 곳에서 수송되어 온 것으로 나타나 이 단계에서는 종자 자체에서 싸이 토키닌이 합성되는 것 같다고 보고하고 있다. 종자에서 싸이토키닌 함량이 높은 것 도 잠시여서 종자가 생리적으로 성숙하면서 급격히 감소하여 최대함량일 때의 1% 수준으로 떨어진다고 한다. 이러한 결과는 생식생장에서 싸이토키닌 합성의 위치와 시기, 타기관에서의 수송의 중요성을 일깨워준다. 2. 싸이토키닌 수용체 Erion과 Fox(1981)는 퓨린의 6번째 탄소가 치환된 싸이토키닌 형태에 비교적 높 은 친화성을 가지고 부착되는 단백질을 밀의 생식질에서 정제하고 이것을 cytokininbinding protein(cbf-1)으로 명명하였다. 이 단백질은 4개의 상이한 소단위체(subunit) 를 가지고 있으며 SDS PAGE를 이용하여 분석한 결과, 분자량이 183,000으로 확인 되었는데 4개의 subunit(tetramer) 당 하나의 싸이토키닌 분자로 saturated 되며 BAP 에 대한 K d 는 molar이었다. 이 단백질은 ribosome 상이나 세포질에 자유로 운 상태로 존재하였고 ribosome 상에 있는 것과 자유로운 상태의 것들의 비율은 약 3:1이었다. Affinity chromatography 연구 결과와 cross-linking 실험은 CBF-1의 특이 한 부착부위는 ribosome 상에 나타남을 강력히 시사하고 있다고 하였다. Kulaeva등(2000)도 보리의 성숙 잎에서 분리한 단백질 nuclear 67이라는 cytokininbinding protein(cbp)을 분리하여 trans-zeatin과 nuclear protein의 상호작용을 ELISA 기법으로 증명하였다. Nuclear 67 단백질은 trans-zeatin과 함께 RNA polymerase I과 관련된 transcription elongation을 활성화시켰다. 핵에서와 별개로 엽록체에서도 다른 CBP가 보리에서 분리되었다. 따라서 핵과 엽록체의 전사기구들이 싸이토키닌에 의 하여 특별한 핵 및 엽록체의 싸이토키닌 부착 단백질(CBP)에 의하여 조절되며 이 단백질들은 전사과정의 mrna 신장을 조절하는 싸이토키닌 수용체로 간주되고 있다. 3. Two component system 싸이토키닌에 반응하여 식물의 유전자 발현은 크게 바뀔 수 있어서 싸이토키닌을 처리할 경우 특정 전사체의 증가 혹은 감소가 야기된다. Hwang 등(2001)은 싸이토

26 18 Cytokinin의 분자 생리학 키닌 신호전달에서 two-component signaling 단백질들이 관련되었을 것이라고 제안 하고 있다(그림 5). 이들의 가설에 의하면 싸이토키닌 신호는 원핵생물의 두 요소 시스템(two-component system)과 비슷한 다단계 phosphorelay라고 할 수 있는 two-component system에 의하여 핵으로 전달되어 여기서 목표 유전자가 활성화된 다. Two-component system은 많은 원핵생물과 일부 진핵생물에서 신호를 감지하는 하나의 histidine protein kinase와 신호를 내보내는 하나의 반응조절자(response regulator)로 구성되어 신호전달을 조절하는 것으로 알려져 있다. <그림 5> 싸이토키닌 신호전달을 설명하는 두요소 시스템(Two component system) (출처: Auxin_Cyto/circuity.jpg) 싸이토키닌에 의해 유도되는 유전자들의 up-stream 지역을 분석한 결과를 보면 공통적인 motif는 type-a ARR의 전사(transcription)와 type-b ARRs의 최적 부착부 위(optimum binding site)를 자극하는 ARR1/ARR2와 높은 상동성을 가진 것으로 나 타났다. 기능상실 돌연변이체들에 대한 분자 유전학적 분석에 의하면 싸이토키닌 신호전달에 관련된 이 two-component의 요소들은 중복되고 중첩된 기능을 하고 있 다. 따라서 이러한 가설에 의하면 싸이토키닌에 대한 식물의 반응도 싸이토키닌에 의하여 조절되는 하나의 histidine protein kinase sensor가 자신의 보존된 histidine residue를 인산화시켜 인산을 반응조절자의 하나의 보존된 aspartate residue로 이전 시키면서 시작된다고 한다.

27 제4장 싸이토키닌의 이동 및 작용부위 년 Inoue 등은 싸이토키닌의 수용체를 발견하였다고 보고하였다. 그들은 cre1(cytokinin response 1) 돌연변이체를 확인하였는데 이것은 싸이토키닌에 대하여 반응이 둔감하다. 돌연변이된 유전자 CRE1은 histidine kinase를 암호화하는데 CRE1 발현은 내부 histidine kinase SLN1이 없는 효모 돌연변이체에서 발현시키면 싸이토키닌 의존적인 표현형을 가지게 하여 CRE1이 싸이토키닌 수용체라는 직접 적인 증거를 보여주었다. 또한 싸이토키닌이 CRE1을 활성화시키면 phosphorelay 신호가 시작된다는 증거도 제시하였다. 애기장대에서 싸이토키닌의 반응이 결손된 돌연변이체가 선발되었는데 이것들은 조직배양에서 세포증식이 빠르고 줄기형성이 촉진되는 것들이다. 이중 한 돌연변이체를 분리하여 cytokinin response 1-1(cre1-1) 로 명명하였는데 이 돌연변이체를 조직배양에서 NAA와 kinetin을 사용하여 옥신과 싸이토키닌에 대한 반응을 조사한 결과, 야생형 식물은 kinetin에 반응하여 빠른 생 장, 녹색화, 줄기형성 등 반응을 보였으나 cre1-1에서는 그러한 싸이토키닌 반응이 뚜렷하지 않았다고 한다. 즉, 싸이토키닌은 식물의 생장 및 발달과정의 중요한 과 정들을 조절하는데 싸이토키닌 수용체들이 이 과정에서 중요한 역할을 한다는 것 이다. 지금까지 결과들을 종합한다면 싸이토키닌, 당, 인산 결핍 신호 사이에 다방 향 연락체계가 존재하며 식물의 대사와 발달의 조절에서 인산결핍 신호가 상대적 으로 중요하며 양분을 감지하는데 있어서도 싸이토키닌 신호의 역할이 중요하다는 것이다(Franco-Zorrilla 등, 2005). 싸이토키닌의 수용체에 관한 또 다른 연구는 Yonekura-Sakakibara(2004) 등에 의 한 옥수수의 싸이토키닌 반응 His-protein kinases(zmhk1, ZmHK2 및 ZmHK3a)의 분리이다. 이 유전자들을 rcsc 및 cps::lacz 배경을 가진 대장균에서 발현시킨 결과 lacz 발현을 싸이토키닌으로 유도할 수 있었다. 재조합 대장균 시스템에서 ZmHK1 및 ZmHK3a는 free-base 싸이토키닌에 그에 상당하는 nucleosides보다 더 민감하였 다. isopentenyladenine이 ZmHK1에 가장 효과적이었고 ZmHK2는 trans-zeatin과 그 riboside에 더 민감한 것으로 나타났다. 애기장대의 알려진 싸이토키닌 수용체 (AHK4/CRE1/WOL)와는 대조적으로 모든 ZmHKs는 활성이 없거나 아주 약한 cis-zeatin(cz)에도 반응하며 배양된 옥수수 세포에서 싸이토키닌에 의하여 유도되는 반응조절자인 ZmRR1의 발현은 trans-zeatin뿐만 아니라 cis-zeatin에 의하여도 유도 되었다. 이 결과는 싸이토키닌 수용체는 ligand 선호성에 차이가 있으며 적어도 옥 수수에서는 cis-zeatin도 활성 싸이토키닌임을 암시한다. 이러한 사실은 식물마다 출 현하는 싸이토키닌의 주종은 다를 수 있어서 벼에서는 cis-zeatin이 많은 반면 애기 장대에서는 trans-zeatin이나 ip가 주종을 이루는 것과 일치되는 결과라고 할 수 있

28 20 Cytokinin의 분자 생리학 다. 따라서 싸이토키닌의 형태가 식물종간에 차이가 있는 것은 수용체들과 상호작 용을 하는 isoprenoid 및 aromatic 측쇄의 구조적 변이가 종마다 달라서 싸이토키닌 의 활성과 특이성에 차이를 만들어내는 것으로 생각된다. Rieflera 등(2006)은 싸이토키닌 수용체(cytokinin receptor)로 알려진 애기장대의 histidine kinases, AHK2, AHK3 및 CRE1/AHK4 기능소실 돌연변이체를 이용하였다 (그림 5). 돌연변이체의 종자들은 더 빨리 발아하고 발아하는데 빛의 요구량이 적 고 적외선 민감성이 감소되어 종자발아 조절에 싸이토키닌의 역할을 밝혀주고 있 다. 3중 돌연변이체는 야생형보다 두 배 큰 종자를 가졌다. 유전분석 결과 싸이토 키닌 의존적인 배유 즉, 모계에 의하여 배의 크기가 조절됨을 암시하였다. 하배축 신장 돌연변이체가 적색광에 대한 민감성이 변하지 않은 것으로 보아 이전에 보고 되었던 A-type response regulator에 의한 적색광 신호의 변조는 싸이토키닌에 의존 적이 아닐 수도 있음을 가리킨다. AHK2 및 AHK3을 둘 다 소실하게 되면 영양 생 장하는 동안 더 뚜렷한 변화가 나타난다. ahk2 ahk3 돌연변이체들의 잎은 세포숫자 가 더 적고 엽록소 함량도 적고 싸이토키닌에 의존적인 어둠에 의해 유도되는 엽 록소 소실 억제 기능이 없어서 잎의 발달에서 AHK2의 뚜렷한 역할 특히 AHK3의 역할이 있음을 가리킨다. ahk2 ahk3 이중 돌연변이체들은 1차 뿌리가 더 빨리 생 장하고 더 중요하게는 뿌리가 가지를 발생하게 하여서 강한 뿌리체계를 발달시켰 다. 이러한 결과들은 뿌리 생장조절에서 싸이토키닌이 부정적인 조절 역할을 함을 지지한다. 수용체 돌연변이체들의 싸이토키닌 함량이 증가된 것은 신호를 통하여 일정한 싸이토키닌의 수준을 유지하려는 homeostatic control이 있음을 가리킨다. 따 라서 싸이토키닌 수용체들의 부분적인 중복기능과 AHK2/AHK3 수용체 조합이 뿌 리와 줄기에서 반대의 조절기능을 하면서 식물의 기관생장의 양적 조절에 역할을 하는 것으로 보인다. 4. 세포내 함량유지 기작 식물세포에서 싸이토키닌 농도는 싸이토키닌 합성 그리고/혹은 외부에서의 흡수, 대사적 상호전환, 비활성화 및 분해에 의하여 유지된다(그림 6). Kaminek 등(1997)은 싸이토키닌의 극성(polarity)이 다른 화합물로 전환되는 것이 세포내 및 세포내 구획에 이들을 갇혀 있게 하는 결정적인 역할을 하며 대사적 안 정성에 영향을 끼치는 것 같다고 고찰하고 있다. 흡수에 의한 것이든 내부 생산에 의해 초래된 것이든 싸이토키닌 농도의 증가는 싸이토키닌으로 시작된 생리적 과

29 제4장 싸이토키닌의 이동 및 작용부위 21 정들의 유도에 역할을 할 수 있도록 싸이토키닌의 자체 농도를 더 증가시킬 수도 있다. 그러나 축적된 싸이토키닌들은 거꾸로 싸이토키닌의 농도를 결과적으로 감소 시킬 cytokinin oxidase를 유도할 수도 있다. 이것은 일시적인 싸이토키닌 축적으로 유도되는 생리적 사건들을 더 진전 시키는데 필요한 싸이토키닌 항상성(homeostasis) 의 유지나 재확립의 기작인 것으로 보인다. 옥신도 싸이토키닌 생합성을 억제하거나 싸이토키닌 분해를 촉진시킴으로써 싸이토키닌 농도에 영향을 끼칠 수도 있다. <그림 6> 세포내 싸이토키닌 활성의 항상성 유지 기작 싸이토키닌이 뿌리에서 합성되어 상층부로 이동한다는 것은 잘 알려진 사실이다. 그러나 식물체 전체 혹은 일부 조직의 싸이토키닌 항상성이 어떻게 유지가 되는지 는 아직 확실한 증거가 부족하다. 목부수액(xylem sap)의 싸이토키닌 농도조절은 거꾸로 줄기로부터 뿌리로 이동하는 장거리의 피드백에 의지한다는 가설이 있다. Foo 등(2007)은 싸이토키닌 생산 돌연변이체를 정상식물체와 접목함으로써 이 가 설을 조사하였다. 목부수액에서 주요 싸이토키닌인 zeatin riboside, zeatin 그리고 isopentenyl adenosine이 야생종의 식물과 비교하여 감소된 식물체를 야생종에 접목 하면 야생종 뿌리의 유전형에도 불구하고 수액의 농도는 똑같이 유지됨이 확인되 었다. 이러한 긴 피드백 매카니즘은 적어도 완두콩(pea)과 애기장대(Arabidopsis)에 서는 보존된 것으로 보인다. 뿌리에서 생성된 싸이토키닌이 상부로 이동되는 것을 조절하는 것은 억제신호가 상부에서 내려오는 것으로 판단되고 이러한 신호는 각 줄기들 모두에서 비롯되어 아래로 전달되는 것으로 보인다. 비록 뿌리로부터 방출 되는 싸이토키닌이 거꾸로 줄기에서 오는 장거리 feedback 신호조절을 위해 필수적 이고 줄기가 체내 싸이토키닌을 적정수준으로 유지시키는데 필요한 강력한 항상성

30 22 Cytokinin의 분자 생리학 유지 기구를 소유하고 있음을 암시하지만 아직 그 신호물질이 무엇인지는 밝혀지 지 않았다. 다만 목부의 주요 싸이토키닌이 trans-zeatin type이고 사부의 주요 싸이 토키닌이 ipa type인 것으로 미루어 역시 대사로 인하여 변형된 싸이토키닌이 그 후보물질 중 하나로 생각된다. 합성과 결합 말고도 싸이토키닌의 pool은 분해로 변 동이 생긴다. <그림 6>는 어떻게 하나의 천연 싸이토키닌이 비활성이 되는 가를 보여준다. 이처럼 싸이토키닌의 항상성은 생산 부위로부터 운송억제, 각 조직에서 의 새로운 합성과 분해, 당화 등을 통한 비활성 등으로 유지되는 것으로 생각된다.

31 제5장 싸이토키닌의 기능 23 제5장 싸이토키닌의 기능 1. 싸이토키닌 작용 순서 싸이토키닌의 역할은 이름 그대로 세포분열(cytokinesis)과 분화을 유도하여 줄기 눈을 터지게 하고 뿌리 발생을 억제시키며 노화지연 효과 외에도 영양신호 전달, 뿌리와 줄기의 균형 조절 기능을 들 수 있다. 이러한 효과가 가장 뚜렷하게 드러나 는 실험은 조직배양이라고 할 수 있는데 많은 식물에서 BAP, kinetin 등이 캘러스 에서 줄기를 발생시키거나 줄기배양에서 부정아를 유도시킨다. 또한 싸이토키닌 과 발현 식물에서는 많은 줄기발생이 일어나고 뿌리형성은 억제되는 현상이 다양한 식물군에서 공통으로 나타난다. 줄기와 잎들은 또한 부가적인 엽록소를 더 많이 만 들어 내고 상처가 생기면 새로운 가지가 돋아나기도 한다. 정아 우세는 사라지고 줄기를 삽목하면 삽수들은 천천히 부정근들을 생산하며 제대로 뿌리가 나오려면 옥신처리가 필요하다. 마디에서 캘러스 같은 종양조직이 생길 수도 있으며 세포주 기가 변경되기도 한다. 싸이토키닌이 식물에 작용하게 되는 순서는 다시 두 요소 시스템을 반복 설명하 는 것이니 자세한 것은 생략한다(그림 5참조). 처음에는 싸이토키닌 신호가 수용체 의 domain에 달라붙는다. 이렇게 되면 곧 단백질의 인산화작용의 cascade가 건드려 지고 결국에는 하나의 shuttle 단백질인 AHP의 인산화로 끝을 맺을 것이다. 인산화 된 AHP 단백질은 핵으로 들어가서 type B ARR 단백질들을 인산화 시키며 이 단 백질들은 다시 type A ARR 단백질의 합성을 시작하게 한다. 이 유전자 산물들이 다시 인산화되면 이들이 다른 effector들에 영향을 끼쳐서 싸이토키닌 반응을 유도 해 낸다. 또한 여기에는 인산화된 충분한 ARR이 존재할 경우 이 시스템을 닫게 할 하나의 negative feedback loop가 있다. 2. 세포주기 진행 Redig 등(1996)은 세포주기 진행과 체내 식물호르몬 농도의 상관관계를 동조된 담배의 BY-2 세포현탁 배양체를 이용하여 연구하였다. 16종의 싸이토키닌, IAA, ABA를 분리 정제하여 정량하였다. IAA 및 ABA에 대하여는 아무런 상관관계도 나 타나지 않았다. 반대로 감수분열기 및 S phase의 마지막에 특정 싸이토키닌(zeatin

32 24 Cytokinin의 분자 생리학 및 dihydrozeatin-type)의 sharp peak들이 나타났다. Zeatin의 N- 및 O-glucosides 등 분석된 다른 싸이토키닌의 농도는 낮은 상태로 변함이 없어서 당화되지 않은 (non-glucosylated) 형태는 새로이 합성되어 증가했을 가능성을 암시한다. 이러한 발견은 zeatin 및 dihydrozeatin-type 싸이토키닌이 식물 세포주기의 진행 에 특정한 조절역할을 하며 다양한 조직과 세포에서 합성되지만 잎, 특히 엽록체에 서 합성됨을 암시한다. 3. 기관형성 식물 기관(plant organ)은 분열조직에서 계속적으로 예측 가능한 방식으로 생산된 다. 식물 호르몬과 전사인자들은 분열조직을 유지하고 기관을 생산하는데 균형을 맞추려고 협력하고 있다. 최근 이러한 협력 작용 밑에 깔려있는 기작에 대한 실마 리가 제공되었다. KNOTTED1-like homeobox(knox)와 WUSCHEL(WUS) 전사인자 들은 줄기 정단 분열조직(SAM)에서 싸이토키닌 활성을 촉진시키는 반면 높은 농 도의 GA 및 옥신은 SAM 작용부위의 측면에서 측면 기관들의 생성을 촉진시킨다. 비록 다른 식물 생장 조절호르몬이 식물 생장과 발달을 조절하는 상호작용에 관여 한다고 하더라도 싸이토키닌 보다 더 현저한 효과를 나타내는 것은 없다. 싸이토키 닌이 발견된 이후 세포 분열을 자극하다는 것은 잘 알려져 있다. 그러나 여전히 왜 그것이 식물의 특정한 부분을 자극하여 한 방향으로 생장을 유도하는지에 대한 원 인은 밝혀지지 않고 있다. 이러한 목적을 위하여 가장 연구하기 편리한 체제는 아 마 물질 및 환경조절이 쉬운 조직배양 식물체일 것이다. 싸이토키닌은 조직배양에 서 줄기형성을 초래하는 복잡한 유전자 발현 프로그램을 펼쳐내게 한다. 과거 10여 년 동안 싸이토키닌 신호에 대하여 많이 밝혀졌다. 지금 해결할 문제는 어떻게 싸 이토키닌 신호전달의 단계들이 식물체와 배양체에서 줄기발달과 연관을 짓게 되는 가를 알아내는 것이다. 싸이토키닌이 요구되는 단계를 돌아가거나(bypass) 혹은 차 단하는 여러 가지 방법들이 발견되었고 이러한 발견으로 인하여 줄기 발달과정에 서의 중요한 조절단계들이 밝혀졌다. 최근 Kurakawa 등(2007)은 분열조직 특이 활성에 의해 싸이토키닌이 분열조직 활성을 조절하는 새로운 조절 기작을 보고하였다. 쌀에서 LONELY GUY(LOG) 유 전자의 발현은 분열조직의 활력을 유지하는데 요구된다. LOG 유전자는 새로운 싸 이토키닌을 활성화시키는 효소이며 cytokinin-phosphoribohydrolase 활성에 의해 비 활성 싸이토키닌 nucleotide를 생물활성이 있는 free-base 형태로 전환시킨다. LOG

33 제5장 싸이토키닌의 기능 25 mrna는 줄기분열조직의 끝 부분에서 관찰되었으며 싸이토키닌을 활성화시키는 효 소는 생체활성 싸이토키닌을 분열조직의 미세한 지역에서 미세수준으로 조절하고 거기에 따라 분열조직 활성이 조절됨을 보고하였다. 유사한 결과가 Ioio 등(2007)의 보고에 의해서도 제시되었다. 그들은 싸이토키닌은 histidine kinase와 전사요인 신 호전달회로(transcription factor signaling pathway)라는 2개의 구성 수용체를 경유하 여 분열조직 세포의 분화를 조절하고 뿌리 분열조직의 크기를 결정한다고 하였다. 예를 들어 benzyladenine(ba)은 명상태와 암상태에서 애기장대 뿌리의 신장을 저해 하는데 이것은 싸이토키닌이 역시 줄기와 뿌리의 분열조직에서 중추적 역할을 담 당하며 뿌리와 줄기에서 반대의 역할을 함을 드러낸다(Cary 등, 1995). 최근 면역화학방법(immunocytochemistry)이나 양적질량 분석기(quantitative tandem mass spectrometry)를 이용한 분석결과들을 살펴보면 식물의 조직 혹은 기관별 미 세한 싸이토키닌 함량변화를 추적하고 있다. 담배식물을 이용한 발달 단계별 싸이 토키닌 분석 결과에 의하면 영양생장을 하는 줄기정단부와 생식생장을 하는 화아 는 싸이토키닌 함량으로 구별이 된다고 한다(Dewitte 등, 1999). 영양생장을 하는 정아에는 아무런 싸이토키닌(zeatin, dihydrozeatin 혹은 isopentenyladenine)이 탐지 되지 않으며 영양생장에서 생식생장(화아)으로 전이가 되는 동안에는 싸이토키닌 riboside(zeatin riboside, dihydrozeatin riboside 및 isopentenyl adenosine)의 함량이 3배 감소하지만 일단 화아로 분화되면서 싸이토키닌의 함량이 급격하게 증가한다. 이것은 싸이토키닌이 영양생장에서 생식생장으로의 전환에는 뚜렷한 역할을 하지 않음을 시사한다. Che 등(2002)은 oligonucleotide array 분석으로 애기장대의 줄기 발달동안 유전자 발현을 분석하였다. 줄기는 옥신이 풍부한 캘러스 유도배지(CIM)에 뿌리절편을 미 리 배양한 후 싸이토키닌이 풍부한 줄기유도배지(SIM)로 옮기면 발생한다. 이때 절 편은 줄기발생이 되도록 변하며 결국 줄기를 형성한다. 8,000개의 애기장대 유전자 에서 줄기발생 동안 얻어진 oligonucleotide array data에 대한 주요인 분석을 실시 한 결과, 줄기발생동안 유전자 발현의 변이의 주 요인은 여러 그룹의 유전자로 구분 이 되었는데 각 그룹은 단 하나의 발달 단계에서만 발현이 증가한다. 분석된 8,000개 의 애기장대 유전자중 2~3%가 줄기발생의 어느 한 단계에서 발현량이 4배 혹은 그 이상 증가하였다. 발현양이 증가된 유전자와 감소된 유전자들을 기능별로 분류하니 많은 호르몬 반응 유전자들이 캘러스 유도배지(CIM)에 전배양(preincubation)을 하는 동안 발현이 증가하였다. 신호 및 전사에 관련된 유전자 그룹들은 줄기발생이 결정 되기 이전이나 당시에 유도되었고 광합성 기구의 요소들을 암호화하는 유전자들은

34 26 Cytokinin의 분자 생리학 줄기가 나오기 전인 발달 단계후기에 발현양이 증가하였다. Aux/IAA유전자 같은 1차적인 호르몬 반응유전자들은 auxin-rich CIM에 전배양을 하는 동안 발현양이 증가하였고 싸이토키닌 반응 반응조절자(cytokinin-responsive response regulator) 유 전자들은 싸이토키닌이 풍부한 줄기유도배지에 배양하면서 발현양이 증가하였다. type-a 반응조절 유전자인 ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR 5의 발현은 줄 기발생이 결정된 시기에 발현양이 증가하였고, 그 발현은 줄기가 형성될 예정인 곳 에 제한적으로 나타났다. 여러 식물 호르몬들이 식물의 생장과 발달과정에서 상호작용을 한다. 특정 형태 의 조직 혹은 특정 발달 단계에서 다양한 호르몬들의 역할을 밝히는 것은 외부에 서 처리를 하든지 항시적으로 발현시키는 방법으로는 어려운 일이다. Huang 등 (2003)은 싸이토키닌 분해 유전자 CKX1과 GA 신호전달에 관여하는 유전자 gai을 조직 특이적으로 발현시키는 프로모터를 이용하여 웅성기관(male organ) 발달에서 싸이토키닌과 GA의 역할을 연구하였다. 형질전환 옥수수의 생식조직에서 CKX1의 축적은 웅성불임 식물을 만들어 내었다. 이 식물들의 웅성발달은 kinetin과 thidiazuron 을 처리함으로써 회복되었다. 이와 비슷하게 담배 및 애기장대의 약과 화분에서 gai의 발현은 이러한 조직의 발육부전을 야기시켰다. gai로 유도된 형질전환 식물 의 웅성불임 표현형은 외부에서 kinetin을 처리함으로써 역전시킬 수 있었다. 이 결 과는 웅성발달에서 싸이토키닌과 지베렐린이 관련 있다는 증거로서 웅성발달은 다 양한 호르몬의 협력하에 조절된다는 가설을 지지한다. 백일초 세포현탁 배양체를 이용하여 Papon 등(2003)은 trans-zeatin이 여러 monoterpenoid indole alkaloid의 생합성을 촉진시킨다고 보고하였다. 그들은 싸이토키닌 신호에 관련된 다단계 인산화과정의 요소들을 암호화하는 여러개의 cdna를 밝혀내었다. 여기에 는 싸이토키닌 수용체를 대표하는 하나의 잡종 histidine kinase로서 CrCKR1, 하나 의 histidine을 포함하는 인산전이 domain인 CrHPt1, type-b transcription factor로서 CrRR5 그리고 싸이토키닌으로 유도가능한 type-a 반응조절자로서 CrRR1이 포함된 다. 프로모터 서열에는 많은 전사인자들의 잠재적인 target-site가 존재하여 싸이토 키닌에 의한 유전자 발현을 특이하게 조절하는 도구로 사용될 수 있다. Werner 등(2003)은 6개의 서로 다른 애기장대의 cytokinin oxidase/dehydrogenase (AtCKX) 유전자를 과발현시킨 형질전환 애기장대를 만들어 표현형 분석을 실시하 였다. 형질전환 식물은 야생형식물에 비하여 30~45% 싸이토키닌을 함유하고 있어 서 싸이토키닌 분해가 일어나고 있음을 나타내었고 cytokinin reporter 유전자인 ARR5:GUS(β-glucuronidase)의 발현도 감소하였다. 싸이토키닌 결핍으로 영양 및 화

35 제5장 싸이토키닌의 기능 27 기 줄기 정단부와 잎의 원기의 활성이 사라지게 되어 싸이토키닌이 식물의 생장 및 발달에 호르몬이 절대적으로 필요함을 나타내고 있다. 이와는 대조적으로 싸이 토키닌은 뿌리생장 및 측근 형성에 부정적으로 작용하였다. promoter::gus fusion 유전자의 분석에 의하면 식물의 발달과정에서 AtCKX 유전자는 차등발현하며 그 활성은 활발하게 자라는 지점에 거의 제한적으로 나타난다. 따라서 이러한 결과는 싸이토키닌이 뿌리 및 줄기의 분열조직에서 중심적인 역할을 하며 뿌리와 줄기에 서는 반대의 역할을 하고 미세하게 조절되는 대사작용은 싸이토키닌의 기능을 적 절하게 수행하도록 하는 역할을 하는 것을 가리킨다. 4. 싸이토키닌의 생리적인 효과 싸이토키닌의 발견 이후, 싸이토키닌은 세포의 분열을 자극하여 식물의 생장과 관련이 있는 것으로 알려져 왔다(Letham 등, 1963). 그러나 싸이토키닌은 그 외에 도 식물의 생활주기에서 휴면타파, 눈의 발달과 분화, 잎의 노화, 개화 유도 등 많 은 다른 역할을 한다. 두 종류의 각기 다른 싸이토키닌이 세포내 환경에서 존재한 다. 즉 unbound와 bound 형태의 zeatin이다(rupp 등, 1999). Bound 형태 zeatin은 대부분 N-conjugated glucoside들이다. 이것은 실생 식물의 biomass를 증가시키는 것으로 알려져 있어서 이것이 활성있는 싸이토키닌 형임을 증명한다. 4.1 싸이토키닌과 노화 지연 노화는 식물 발달과정에서 가장 잘 조절된 단계이다. 노화와 관련된 저장물질의 이용은 식물발달의 중심적인 요소이며 스트레스 완화를 위한 기본 전략이며 여기 에는 싸이토키닌이 큰 역할을 하고 있다. 이 노화과정을 통하여 식물은 양분을 재 순환시킨다. 따라서 노화의 개시 단계부터 엽록소가 파괴되고 광합성 능력은 급격 하게 저하되며 세포질 구조와 거대분자들이 계속 분해 되어 식물의 다른 부분으로 옮겨진 후 식물은 죽음에 이른다(Nooden, 1988). 따라서 노화가 일어나는 것을 알 수 있는 지표중의 하나는 엽록소 및 RNA가 분해되어 사라진다는 특징이다. 이러한 일련의 사건은 단순한 몰락이 아니며 세포, 조직 및 기관 수준에서 유전 적으로 잘 조정된 일종의 실용적인 사형집행이다(Thomas 등, 1980). 싸이토키닌은 이러한 식물노화 과정에서 가장 중요한 역할을 담당한다. 싸이토키닌 발견의 초창 기인 1957년 Richmond와 Lang은 도꼬마리(Xanthium strumarium)에서 분리된 잎의

36 28 Cytokinin의 분자 생리학 노화가 외부에서 싸이토키닌을 처리하였을 때 지연됨을 발견하였다. 다른 연구자들 도 싸이토키닌을 처리하면 일시적으로 핵산 및 엽록소의 붕괴를 억제시킬 수 있다 고 보고하고 있다(Dryer와 Osborne, 1971). 그러나 싸이토키닌 처리에도 불구하고 일단 파괴된 엽록소를 복구시키지는 못하기 때문에 황화된 잎이 녹색으로 돌아가 지는 못한다. Tetley와 Thimann(1974)은 싸이토키닌인 Kinetin, BA, 2ip 및 Zeatin 모두가 호흡작용을 억제함으로써 귀리의 잎의 노화를 지연시킴을 확인하였다. 따라 서 이러한 싸이토키닌의 노화지연 특성은 다양한 분류군의 식물에서 공통적인 사 항임을 알 수 있다. 최근 세포바깥의 invertase는 담배에서 노화지연에 관련된 필수 적인 요소라고 보고되었는데 싸이토키닌이 노화의 초기단계에서 이 invertase 효소 활성을 유도한다고 한다(Lara 등, 2004; Dale과 Neil, 2006). 1980년대에 발달된 chromatography 기술 등으로 식물체내 싸이토키닌의 정량이 가능해짐에 따라 노화관련 연구가 더욱 정교해지게 되었다. 대체로 노화 개시된 이 후 식물의 목부 수액의 싸이토키닌 함량은 빠르게 감소하고 있는데 이는 뿌리로부 터 줄기로 이동되는 싸이토키닌의 함량의 감소 때문임을 암시한다(Skene, 1975 Nooden 등, 1990). He 등(2003)은 서로 다른 노화과정을 보이는(senescence type) 옥수수에서 노화관 련 유전자들을 조사한 결과 한 종류의 노화형에서는 증가된 엽록소 및 질소함량과 광포화 광합성율이 더 높은 경우가 노화가 지연되는 것으로 나타난 반면 다른 종 류의 노화형을 보이는 유전형에서는 잎의 싸이토키닌(trans-zeatin riboside, t-zr; dihydrozeatin riboside, DHZR; isopentenyl adenosine, ipa)의 함량이 증가되고 ABA의 함량이 감소된 것을 확인하였다. 뿌리에서는 t-zr, DHZR 및 ABA의 함량 은 증가하였으나 ipa의 함량은 감소하였다한다. 따라서 이 유전형에서는 뿌리에서 합성되어 잎으로 이동한 싸이토키닌이 노화를 지연시키는 반면 뿌리에서 줄기로 ABA가 이동하는 것은 차단되는 것으로 생각된다. 이 유전자형은 이외에도 잎에 malondialdehyde(mda), catalase(cat)의 활성이 높으며 superoxide dismutase(sod) 의 함량이 높은 것으로 조사되었다. 싸이토키닌과 노화와의 관련에 관한 최근의 연구 경향은 형질전환 식물을 이용하 여 세포내 싸이토키닌 함량 조절에 초점이 맞추어져 있다. 대표적인 예가 싸이토키 닌 합성 유전자인 아그로박테리아(A. tumefaciens)의 ipt 유전자로 형질전환된 담배, 벼, 옥수수, 상추, 페튜니아, 양배추 및 이탈리안 라이그라스에서 형질전환된 식물 들이 유전자의 발현에 의해 노화가 지연되는 현상이다(Li 등, 1992; Fu 등, 1998; Robson 등, 2004; McCabe 등, 2001; Clark 등, 2004; Khodakovskaya 등, 2005; Li

37 제5장 싸이토키닌의 기능 29 등, 2004). 여기에 관한 자세한 사항은 뒤에 유전자발현 효과로서 노화지연 부분에 서 다시 다룬다 다른 식물호르몬과의 상호작용 대부분의 성장과 형태형성은 여러 가지 식물 호르몬의 연속적인 상호작용에 의해 이루어진다. 이러한 시스템에서 상당한 feedback 조절이 일어나는데 이러한 feedback 조절은 생물 시스템에서 흔한 현상이다. 그 이유는 시스템의 한 부분은 다른 부분 들과 상대적으로 조심스럽게 균형을 맞추고 있기 때문이다. 이처럼 싸이토키닌에 의해 자극되는 많은 생리적 형태학적 반응이나 발달과정은 다른 호르몬과의 상호 작용에 의해 이루어진다. 싸이토키닌은 애기장대의 유묘발달에 큰 영향을 끼쳐서 싸이토키닌인 BA는 유묘 의 뿌리 및 하배축의 신장을 억제하며 정아부분이 꼬부라지는 현상을 심화시키는 데 이 후자의 반응은 에틸렌에 대한 반응이다. Cary 등(1995)은 BA가 뿌리 및 하 배축 신장을 억제하는 효과를 에틸렌 작용의 억제제를 첨가하므로서 부분적으로 차단할 수 있었다. 여기서 에틸렌은 submicromolar 농도의 BA에 의하여 생산이 촉 진되며 뿌리 및 하배축 신장의 억제를 부분적으로 설명할 수 있었다. 이처럼 애기 장대에서 뿌리 및 하배축의 신장에 대한 싸이토키닌의 효과는 주로 에틸렌 생산에 의하여 중재되는 것으로 보인다. 싸이토키닌과 에틸렌 반응 사이의 coupling은 싸 이토키닌에 대한 저항성 돌연변이체 ckrl은 에틸렌에도 저항성이며 에틸렌 저항성 돌연변이체 ein2와는 대립형질이라는 발견으로 더 지지된다. 5. 신호물질로서의 싸이토키닌 오랫동안 식물 호르몬은 스트레스에 반응하는 것으로 알려져 왔다. 이러한 것의 전형적인 예는 수분 스트레스에 의한 세포내 ABA 수준의 변화이다. 초기 연구는 신호 분자들이 수분 결핍시 감지와 지상부로 전달하는 전달자로서의 역할에 집중 되어 연구 되었다. Itai 등(1991)은 가뭄, 염분, 홍수 그리고 뿌리의 산소 결핍과 같 은 여러 스트레스를 식물이 감지하여 뿌리와 줄기 사이의 정보교환이 중요한 요소 라고 보고하였으며 이러한 스트레스로 줄기에서 ABA 함량이 증가되며 뿌리로부터 줄기로 이동되는 싸이토키닌은 감소되어 호흡과 생장을 억제함을 발견하였다. 이러 한 결과들로 미루어 싸이토키닌이 신호물질 임을 제시하였다. Davis와 Zhang(1991)

38 30 Cytokinin의 분자 생리학 은 식물 호르몬 ABA, IAA 그리고 싸이토키닌이 기공 개폐를 조절하여 수분 스트 레스에 대한 반응을 조절한다. 이 경우에도 싸이토키닌은 신호물질과 조절물질로 작용한다고 하였다. Faiss 등(1997)은 싸이토키닌의 주요 생산 지점이며 잠재적인 신호 기관인 뿌리 에서 싸이토키닌의 증가된 생산이 식물의 줄기에서 잎의 노화, 측아 분열조직의 생 장같은 발생학적 사건들에 영향을 끼치는지 조사하였다. 이를 위해 조건부로 싸이 토키닌을 생산하는 형질전환 담배를 만들어 내었다. 이 식물은 테트라싸이클린 억 제 단백질의 농도가 높을 경우 발현이 억제되는 변형된 35S promoter의 조절을 받 는 ipt 유전자를 가지고 있다. 전사 억제를 풀면 호르몬 농도가 빠르게 50배 이상 증가한다. ipt 효소의 작용의 결과로 16종의 서로 다른 싸이토키닌 대사체의 농도 의 시간대별 변화를 서로 다른 조직에서 조사하였다. Zeatin riboside가 맨 처음 그 리고 가장 극적으로 증가되었고 zeatin, dihydrozeatin 및 glucosides 들이 나중에 축 적되었다. 싸이토키닌 농도가 증가된 결과는 호르몬 생산 위치에 주로 한정되어 나 타났다. 예를 들면 측아에서 ipt 유전자의 억제를 풀게되면 테트라싸이클린을 처리 한 곳에서 단 하나의 눈만 자라게 된다. 형질전환 식물의 줄기를 야생형에 접목하 거나 반대로 야생형의 줄기를 형질전환체에 접목하더라도 비형질전환 식물에서는 아무런 생물학적 싸이토키닌 효과 즉 측아 분열조직의 생장 혹은 잎이 순서대로 노화되는 것 같은 효과가 나타나지 않았다. 또한 싸이토키닌의 안정된 농도의 증가 는 증산 stream에서 zeatin riboside의 농도가 특이하게 증가됨에도 불구하고 형질전 환 식물 부분에만 제한적으로 나타났다. 이러한 결과는 담배의 잎의 순서대로 노화 되는 것과 정아우세의 조절에 관련된 뿌리에서 줄기로의 장거리 수송 신호물질로 서 싸이토키닌의 역할에 의문을 제기하며 이 호르몬이 paracrine 신호와 관련이 있 다는 가정을 지지한다.

39 제6장 싸이토키닌 생산 효소 및 유전자의 발견 31 제6장 싸이토키닌 생산 효소 및 유전자의 발견 1. 미생물의 싸이토키닌 합성 유전자 자연계에서 싸이토키닌의 효과가 극대화되어 나타난 경우는 토양세균(Agrobacterium tumefaciens)에 감염된 쌍자엽 식물이 만들어내는 근두암 종병의 증상인 crown gall 이라는 tumor라고 할 수 있다. 이 박테리아로 감염되면 종양조직이 잎, 줄기, 뿌리 등 식물의 어느 부위에서도 발생된다. 아그로박테리아에 의한 쌍자엽식물에 tumor 가 형성되는 이유는 T-DNA라는 박테리아 DNA의 특별한 조각이 식물체의 DNA 로 이전되면서 일어난다. 이 T-DNA는 식물 세포에서 활성이 있는 프로모터와 유 전자를 함유하고 있어서 세포의 호르몬 균형을 깨뜨리는 호르몬 생산 효소를 암호 화한다. 이러한 현상은 고등식물의 분화가 이미 끝난 조직의 세포들이 다시 분열조 직이 될 수 있는 전형성능(totipotency)을 가지고 있음을 보여준다. 이 종양세포들은 분화되지 않은 덩어리로 계속 자라게 된다. 이렇게 crown gall에서 식물호르몬이 과도하게 생산되는 것은 식물세포로 들어간 여러 개의 T-DNA 유전자들의 발현 때 문이다. 이러한 종양세포 중에서도 형태적으로 매우 다른 돌연변이체들이 발견되는 데 그 돌연변이체의 깨진 유전자들이 대부분 호르몬 생산 관련 유전자들이기 때문 이다. 그 중 어떤 것은 종양조직에서 뿌리가 발생(tmr 돌연변이체)하거나 줄기가 발생(tms 돌연변이체)하기도 한다. 그러한 돌연변이 종양조직의 싸이토키닌과 옥신 의 농도를 조사한 결과를 보면 IAA는 일반 담배 조직에서 128pmol/g인 반면 뿌리 가 발생되는 돌연변이체에서 129pmol/g 그리고 줄기생장 돌연변이체에서 70pmol/g 으로 나타난다(Akiyoshi 등 1983). trans-ribosylzeatin/iaa의 비율은 줄기생장 돌연 변이체에서 가장 높아서 24%를 기록하였고 뿌리생산 돌연변이체에서 가장 낮은 0.003% 이었다. 이 증거들은 종양세포 내의 식물호르몬 농도는 T-DNA안의 유전자 에 의해서 결정됨을 강력하게 시사한다. 이중 tmr 유전자는 싸이토키닌 생합성에 직접 관련된 효소인 dimethyl-allylpyrophosphate: AMP dimethylallyltransferase (DMA transferase)를 암호화하여 식물세포에서 싸이토키닌을 생산한다. 현재 crown gall에서 생산되는 싸이토키닌은 isopentenyladenine, isopentenyladenosine 및 isopentenyl adenosine 5'-monophosphate인 것으로 알려졌다.

40 32 Cytokinin의 분자 생리학 2. 식물의 싸이토키닌 생합성 유전자의 탐색 자연에서 발생하는 싸이토키닌은 adenine 유도체이며 N 6 -말단 측쇄를 가진 이소 프레노이드 싸이토키닌(isoprenoid cytokinin)과 방향족 싸이토키닌(aromatic cytokinin) 으로 분류된다(Strnad, 1997; Mok과 Mok, 2001). 지금까지 식물에서 발생하는 싸이 토키닌은 대부분 isoprenoid 형이다. 식물에 방향족 싸이토키닌이 존재하는 지에 대 한 여부는 아직도 명백하지는 않기 때문에 싸이토키닌 학자들은 isoprenoid 형 싸 이토키닌의 생합성 단계에 치중하여 왔다. 아직 싸이토키닌 생합성 단계가 완전히 밝혀지지 않고 있지만 지금까지 AMP(ATP/ADP) 회로, iprmp-independent 회로 그리 고 trna 회로라는 적어도 세 가지의 다른 생합성 회로가 밝혀졌다(Kakimoto, 2001; Takei 등, 2001; Åstot 등, 2000; Golovko 등, 2002). 이미 오래 전에 대장균이나 아메 바의 세포추출물을 이용하여 AMP와 dimethylallyl-pyrophosphate(dmapp)가 싸이토키 닌인 isopentenyladenosine-5'-mono-phosphate(ipmp)와 isopentenyl-adenosine(ipa)로 전 환되는 것이 확인되어 효소 DMAPP:AMP isopentenyl transferase가 존재할 것이라는 추측이 나온 바 있다(Taya 등, 1978). 그간 여러 사람들이 식물로부터 ipt 단백질을 분리하여 특성을 구명하고자 하였으 나 조직에서 효소의 매우 낮은 함량과 불안정성으로 인하여 성공할 수 없었다. 후에 Akiyoshi 등(1984)과 Barry 등(1984)은 아그로박테리아의 근두암종에서 DMAPP:AMP isopentenyltransferase(ipt)를 처음으로 발견하여 싸이토키닌 생합성의 새로운 전기를 마련하였다. 이러한 이유로 대부분의 연구자들이 노화의 지연과 같은 싸이토키닌과 식물 발달과의 연관성을 이해하기 위하여 아그로박테리아의 ipt 유전자를 이용하여 왔다(Medford 등, 1989; Faiss, 1997; Roeckel, 1997). 3. 식물의 싸이토키닌 합성 유전자들의 발현특성 고등식물에서 싸이토키닌의 합성의 첫단계는 AMP와 dimethylallylpyrophosphate (DMAPP)에서 isopentenyladenosine 5 -mono phosphate(ipmp)가 형성되는 것인데 이것은 효소 adenylate isopentenyltransferase(ipt)에 의하여 촉매되는 반응이다. 비록 싸이토키닌이 생장과 발달에 필수적인 호르몬이지만 고등식물에서 그 생합성에 대한 효소의 특성에 대하여는 알려지지 않았다. 생합성 경로에 관한 연구는 Kakimoto(2001) 와 Takei(2001)가 애기장대로부터 싸이토키닌 생합성 효소 isopentenyltransferase를 발 견하면서 속도가 붙기 시작하였다. Takei 등(2001)은 애기장대에서 Atipt1에서 Atipt8

41 제6장 싸이토키닌 생산 효소 및 유전자의 발견 33 까지로 명명된 잠재적인 ipt를 암호화하는 8개의 cdna를 애기장대에서 분리하였 다. 재조합단백질을 발현하는 대장균들은 하나의 잠재적인 trna ipt를 발현하는 형 질전환체를 제외하고는 모두 싸이토키닌류들을 배양배지로 배출하였다. 정제된 하 나의 재조합 AtIPT1은 DMAPP와 AMP에서 ipmp가 형성되는 것을 촉매하여 이 작은 multigene family가 싸이토키닌과 성숙한 trna를 합성할 수 있는 두 종류의 ipt를 모두 포함하고 있음을 가리킨다. 싸이토키닌 생합성의 가중 중요한 단계는 AMP의 6번째 질소(N 6 )에 5-carbon chain을 첨가시키는 반응이다. Kakimoto(2001)는 싸이토키닌의 isopentenyl 측쇄 형 성을 촉매하는 싸이토키닌 생합성 효소를 동정하기 위하여 ipt를 암호화하는 애기장 대의 유전체 서열을 탐색하여 ipt 효소들을 만들어 낼 것으로 예상되는 잠정적인 유 전자들을 동정하였다. 이중에 하나인 Atipt4를 자세히 분석한 결과 이 유전자의 과 발현은 캘러스에서 싸이토키닌과 무관하게 줄기를 형성시켰다. 이는 보통 캘러스에 서 줄기유도를 할 때 싸이토키닌이 필요하기 때문에 이 유전자 산물이 식물에서 싸 이토키닌 생합성을 촉매함을 암시한다. 재조합 Atipt14는 dimethylallyl diphosphate에서 ATP 및 ADP로 이전시키지만 AMP로는 이전시키지 않았다. Atipt4는 DMAPP:tRNA ipt 효소활성을 보이지는 않았다. 이 결과로 미루어 싸이토키닌들은 적어도 식물에 서는 ATP와 ADP에서부터 합성된다고 할 수 있다.. Kakimoto(2001)는 애기장대로부터 9개의 다른 ipt 효소를 분리하고 아미노산 구성 을 분석하였다. 그는 식물의 ipt는 미생물의 ipt DMAPP:AMP 그리고 DMAPP:tRNA ipt와 일반적인 특징을 공유한다고 보고하였다. 이 효소 중 Atipt4는 DMAPP로부터 ATP와 ADP로 isopentenyl 기를 이동시키는 반응을 중재함을 발견하였다. Takei 등 (2001)은 여덟 개의 각기 다른 ipt를 암호화하는 cdna를 애기장대에서 분리하여 애기장대에 발현시켜 AtIPT1이 DMAPP 및 AMP로부터 ipmp를 만드는 과정을 촉 매함을 확인하였다. Kasahara 등(2004)은 Atipt1, Atipt3, Atipt5 그리고 Atipt8이 색 소체에 위치함을 보고하였고 MEP 회로로부터 유도된 DMAPP를 사용하여 싸이토 키닌이 생합성되고 Atipt4 및 Atipt7은 세포질과 미토콘드리아에서 각각 발견되며 MVA 생합성 경로로부터 유도된 DMAPP를 이용하여 싸이토키닌을 생산함을 확인 하였다. Miyawaki 등(2004)은 애기장대에서 다른 ipt 유전자의 발현 유형을 조사하였다. 그들은 다른 Atipts 들과 비교하여 Atipt3과 Atipt5는 생장기관에서 강하게 발현되며, 또한 ip nucleotide 생합성을 위한 주요 장소가 색소체이며 이곳에서 Atipt 유전자가 발현됨을 확인하였다. Atipt promoter::reporter 유전자를 이용하여 Atipt3와 Atipt5는

42 34 Cytokinin의 분자 생리학 체관 companion 세포와 근원체(root primordia)에 각각 발현됨이 관찰되었고 Atipt4 및 Atipt8은 미성숙 종자의 배젖에서 발현되는 반면 AtIPT6은 종자 꼬투리(siliques) 에서 활발하게 발현됨을 확인하였다. 4. 다른 식물 유래의 ipt 유전자들 Sakano(2004)는 애기장대의 Atipt isozyme 들의 보존된 염기서열에 근거하여 호 프(Humulus lupulus L.)로부터 ipt 유전자를 cloning 하였다. 이것은 애기장대를 제 외하고 AIPT가 cloning된 첫 번째 식물이었다. 그는 애기장대의 Atipt4는 AMP보다 ADP와 ATP를 isopentenylation의 기질로 더 선호함을 증명하였다. 곧이어 Ye 등 (2006)에 의하여 잠재적인 isopentenyltransferase(ipt) 유전자가 콩의 EST database에 서 확인되어 RACE로 전체 서열이 클로닝 되었다. 이 유전자는 발현 profile과 서 열배열에서 애기장대의 ipt 유전자 Atipt5와 가장 유사하였다. Southern hybridization 결과 2 copy(isoforms)의 Gmipt가 콩의 유전체에서 확인되었다. 담배를 이용한 형질 전환 실험에서 Gmipt1 단백질은 식물에서 활성이 있는 싸이토키닌을 만들어 내었 다. RT-PCR에 의하면 Gmipt1 유전자는 여러 조직에서 항시적으로 발현한다. 비록 이들은 발현양이 낮아서 northern으로는 탐지되지 않았지만 Promoter::GUS fusion 에 의하면 Gmipt1의 발현 부위는 뿌리, 줄기 및 잎이었다. Gmipt1의 상류 조절부 위는 Atipts 및 Osipts의 조절 부위와 전사인자 공통 부착부위 motif를 가지고 있었 다. Gmipt1 발현은 quantitative PCR과 형질전환 애기장대의 GUS 활성조사에서 보 면 호르몬과 화학약품에 의하여 증가된다. 이것은 프로모터 지역에 있는 잠재적인 식물호르몬 및 stress-responsive motif들과도 일치한다.

43 제7장 싸이토키닌 유전자 발현의 표현형 35 제7장 싸이토키닌 유전자 발현의 표현형 1. 형질전환 기법의 이용 1980년대 중반은 식물 생명공학에 형질전환기법이 본격적으로 도입된 시기이며 아 그로박테리아 T-DNA의 옥신 및 싸이토키닌 합성 유전자는 식물호르몬 유전자의 발 현기작을 극명하게 보여준 예이며 이를 이용한 인위적인 유전자 발현에 의한 식물 호르몬 함량을 변화시키려는 시도가 시작되었다. 싸이토키닌 생합성의 첫 번째 단계 를 조절하는 ipt 유전자는 식물위 뿌리에 감염되어 크라운골 종양 조직(crown gall tumor)을 형성하는 아그로박테리아(A. tumefaciens)로부터 발견되었다(Akiyoshi 등, 1983; Barry 등, 1984). 종양조직을 생산하는 식물 조직에서 효소 dimethylallyl(dma) transferase가 싸이토키닌 생합성의 속도제한 단계(rate-limiting step)임을 밝힌 Akiyoshi (1983) 등은 tmr 유전자가 싸이토키닌 합성에 관여하는 DMA transferase를 암호화 하여 싸이토키닌 생산과 관련이 있음을 증명하였다(Akiyoshi 등, 1983; 1984). 이 tmr 과 ipt는 같은 유전자이다. 곧 이어 McGaw(1987)는 이 효소가 isopentenyl AMP(iPMP) 가 존재할 경우 isopentenyl pyrophosphate와 adenosine monophosphate의 축합반응을 촉매함을 증명하였다. 따라서 이 당시 싸이토키닌 생합성 경로는 완전히 밝혀지지 않았지만 적어도 거기에 ipt 유전자가 관여됨은 밝혀졌다. 이미 1989년 담배와 애 기장대에 도입된 ipt 유전자의 발현으로 싸이토키닌 함량의 증가 및 여러 가지 표 현형의 변화에 대한 결과가 보고되었다(Medford 등, 1989). 식물 유전공학에서 외래 유전자의 발현유도용으로 가장 많이 사용되는 CaMV의 35S promoter는 그 강력한 유도효과로 ipt 유전자의 발현에 부적합하다. 따라서 ipt 유전자를 식물에 발현시키기 위하여 다양한 프로모터들이 이용되어 다양한 식물에 서 그 표현형 발현이 보고 되었다. 2. 비정상적인 표현형 문제 ipt 유전자가 과발현된 대부분의 식물이 유전자 발현 효과로 인하여 비정상적 표 현형을 보임으로써 상업화 하는 데는 어려움이 있었다. 그 문제를 극복하기 위하여 많은 연구자들이 평소에는 발현되지 않다가 필요시에 자극을 줄 때만 발현되도록 하는 유도 가능한 프로모터(inducible promoter)를 사용하였다. 가장 자주 사용된 프

44 36 Cytokinin의 분자 생리학 로모터는 열에 의해 기능을 하는 heat shock 프로모터라고 할 수 있다(Medford 등, 1989; Smigocki, 1991; Ainley 등, 1993). 또 다른 프로모터가 상처에 의하여 유도되 는 상처유도 프로모터(Smigocki 등, 1993) 또는 빛에 의하여 유도되는 빛 유도 프로 모터(Thomas 등, 1995)이다. 그러나 그러한 유도가능 프로모터를 사용해서 어떠한 일시적인 자극이 주어져도 형질전환 식물에서 비정상적 형태적 변이가 발생하고 있 다. 따라서 최근의 추세는 노화 특이 프로모터 SAG12의 이용이라고 할 수 있다. SAG12 프로모터는 노화가 진행되는 과정에서만 유도된다. 그러므로 SAG12::ipt 유 전자의 발현에 의해 싸이토키닌의 축적이 이루어지고 노화가 지연된다. SAG12 프로 모터에 의해 유도되는 ipt는 벼(Fu 등, 1998), 양배추(Nguyen 등, 1998), 페튜니아 (Chang 등, 2003; Clark 등, 2004) 그리고 상추(McCabe 등, 2001)에서 성공적인 노 화지연 효과를 보였는데 그중 psag12-ipt 형질전환 상추는 주목할 만한 결과를 보 여주고 있다. 형질전환 되지 않은 상추와 비교하여 형질전환된 상추는 표현형의 변 이 없이 60일간 잎의 노화가 지연되었다(McCabe 등, 2001). 상업적 작물 생산의 경 우 노화의 지연은 수확된 줄기 부분의 저장기간을 연장시킴을 의미한다 가지 및 꽃대 수 증가 Roeckel 등(1997)은 ipt 유전자를 애기장대의 2S albumin AT2S1 유전자의 프로 모터의 조절을 받도록 조작한 후 이를 카놀라(Brassica napus)와 담배(Nicotiana tabacum)에서 발현시켜 식물에서 꽃대의 가지가 많이 생기고 capsule 및 silique의 평균 갯수는 각각 82.6 및 24.8% 더 많았다. 형질전환 식물체에서 싸이토키닌은 T1 AT2S1-ipt 카놀라 종자의 싸이토키닌 함량은 비교식물보다 2.2배 많았으며 T1 AT2S1-ipt 담배의 capsule은 비교식물의 capsule보다 2.6배 많은 싸이토키닌을 함유 하고 있었다. 담배에서 켑슐 당 평균 종자의 무게는 AT2S1-ipt 식물에서 더 낮은 반면 같은 유전자로 형질전환시킨 카놀라의 경우 silique 당 종자수와 평균 종자무 게는 바뀌지 않았다. 식물체당 평균 종자 생산은 AT2S1-ipt 담배나 카놀라 식물에 서 유의성 있게 증가되지는 않았다고 한다 잎면적 축소 및 뿌리발생 억제 Medford 등(1989)은 ipt 유전자를 조작하여 옥수수의 heat-inducible promoter (maize hsp70)의 조절을 받도록 하였다. 이 chimeric hsp70 ipt유전자를 담배와 애 기장대에 이식하였다. 형질전환체를 열로 유도한 결과 ipt mrna가 축적되었고

45 제7장 싸이토키닌 유전자 발현의 표현형 37 zeatin은 52배 증가하였으며 zeatin riboside는 23배, zeatin riboside 5 -monophosphate 는 2배 증가하였다. 비교로 사용된 온도조건에서는 형질전환체의 zeatin riboside와 zeatin riboside 5 -monophosphate는 야생형에 비하여 각각 3배와 7배 증가하였다. 이렇게 유도되지 않은 싸이토키닌의 증가는 발달과정에 여러 모로 영향을 끼쳤다. 담배에서 이 효과는 측아가 발생하고 잎면적이 작아지고 키가 작아지고 뿌리발달 이 미흡하였다. 애기장대에서는 뿌리생장 감소가 발견되기는 하였으나 애기장대나 담배 모두 개화시기에 있어서는 야생형과 차이가 없었다. 예상치 못한 것은 형질전 환 식물에서 열에 의한 싸이토키닌 유전자의 유도는 유도하지 않은 상태에서 보여 진 변화 외에 다른 변화가 나타나지 않았다는 것이다. 열에 의한 유도의 효과가 없 었던 것은 싸이토키닌 농도가 잠시 동안만 증가하였기 때문이거나 부정적인 요인 들을 직접 혹은 간접적으로 유도하였거나 그에 반응하여 나타나는 세포내 다른 요 소들의 농도가 낮았기 때문으로 생각된다. 전반적으로 열에 의하여 유도되지 않은 형질전환 식물의 내부 싸이토키닌 농도의 효과는 분화보다는 생장에 한정되는 것 으로 보인다. 증가된 싸이토키닌 함량에도 불구하고 예정된 분화 양상에서 아무런 변화도 발견되지 않았기 때문에 이러한 분화과정 등은 싸이토키닌 농도외에도 다 른 요인들에 의하여 조절될 지도 모른다고 제안하고 있다. 3. 노화지연 식물 노화는 에틸렌, ABA 그리고 싸이토키닌의 변화에 의하여 부분적으로 조정 되는 프로그램의 조절을 받는다. 노화가 지연되는 형질전환 식물은 이러한 신호간 의 상호작용을 연구하는데 유용하다. 아그로박테리아의 싸이토키닌 합성 유전자 ipt 를 노화관련 유전자(SAG12)의 프로모터의 조절을 받게 하여 발현시켜 노화를 지연 시키는 데 이용되고 있다. Chang 등(2003)은 petunia(petunia xhybrida cv V26)를 PSAG12-ipt로 형질전환시켰다. 꽃의 수명이 길어진 두 형질전환 계통을 이용하여 증가된 싸이토키닌의 함량이 페튜니아 꽃잎의 에틸렌 합성과 감수성 그리고 ABA 축적에 미치는 영향을 조사하였다. 이 계통들에서 꽃의 노화는 야생형에 비하여 6~10일 지체되었다. 전사체는 수분(pollination) 후에 증가되었는데 이때 싸이토키닌 축적도 함께 일어났다. 내부 에틸렌 생산은 야생형이나 형질전환체의 꽃 모두에서 수분에 의하여 증가되었으나 이 증가는 ipt 형질전환체에서는 지체되었다. ipt 형질 전환 식물의 꽃 들은 외부에서 처리한 에틸렌에 덜 민감하여 체내 에틸렌 생산, 꽃 잎의 노화 그리고 노화관련 Cys protease phcp1의 발현 증가를 위해서 외부 에틸렌

46 38 Cytokinin의 분자 생리학 처리를 더 오래 해줘야 했다. 또 다른 꽃의 노화를 조절하는 호르몬인 ABA의 축 적은 야생형의 꽃잎에서 뚜렷하게 많아서 ipt 식물에서 꽃의 노화가 지체됨을 증명 하고 있다. 이러한 결과는 꽃의 노화를 조절하여 꽃의 수명을 증가시키는 수단을 제공할 것이다. ipt 유전자의 과발현에 의한 노화 지연의 효과는 관상용 식물과 채소 그리고 과 일의 저장 기간을 증가 시킬 수 있을 것이라 생각되었다. Li 등(1992)은 ipt 유전자 가 과발현시킨 담배의 잘려진 잎이 오랫동안 엽록소를 유지하는 것을 확인 할 수 있었다. Pogańy 등(2004)은 CaMV 35S:ipt 유전자로 형질전환시킨 싸이토키닌 과발 현 담배의 tobacco necrosis virus(tnv) 감수성을 조사하였다. ipt 도입유전자로 인 한 과량의 싸이토키닌은 식물의 노화를 크게 지연시켰다. 바이러스로 인한 necrotic lesion의 수 및 coat protein 함량은 비교식물보다 크게 낮았다. TNV 접종시 싸이토 키닌 유전자 발현 담배의 leaf disc는 에틸렌과 에탄(ethane)을 덜 발생시켰는데 이 는 높은 스트레스 내성과 낮은 수준의 lipid peroxidation이 일어남을 가리킨다. 대 조계통과 비교할 때 형질전환체는 TNV를 감염 시킨 것이나 시키지 않은 것 모두 H 2 O 2 축적이 거의 일어나지 않았다. 대조식물과 비교할 때 형질전환 담배의 제초 제 파라쾃에 의하여 유도된 산화스트레스에 내성을 보이는 건전한 싸이토키닌 생 산 담배식물은 3종의 항산화 효소(ascorbate peroxidase, glutathione-s-transferase, catalase)의 활성과 비효소인 항산화제 ascorbic acid의 함량이 높았다. 그러므로 싸 이토키닌 유전자 도입에 의한 노화의 억제는 더 효과적인 활성산소 제거능력을 부 여하는데 이는 lipid peroxidation을 감소시키기 때문이며 그래서 TNV-유도 necrosis 발달에 내성을 보이는 것 같다고 보고하고 있다. McCabe 등(2001)은 애기장대의 노화 특이 SAG12 프로모터의 조절을 받게한 ipt 유전자(PSAG12-Iipt) 형질전환 유전자의 동형접합체 상치의 성숙한 head에서 발달 단계와 수확 후 잎이 노화를 크게 늦추었음을 보고하였다. 잎의 노화의 지체 말고 도 성숙한 60일 된 식물은 정상적인 형태를 보여 상추머리의 둘레, 잎과 뿌리의 생 중량에서 아무런 차이도 보이지 않았다. 질소결핍으로 인한 노화 유도는 형질전환 및 비교식물의 전체 질소량, 질산태 질소의 양 및 생장을 빠르게 감소시켰으나 엽 록소는 형질전환 식물의 하층부 잎에서 유지되었다. 수확된 PSAG12-ipt 식물의 head 역시 그 하부 잎에 엽록소를 유지하고 있었다. 형질전환체의 꽃대가 올라오고 (bolting) 꽃이 피기 전(preflowering)까지의 후기 생장 기간 동안 잎의 엽록소, 총단 백질, 광합성효소 rubisco 함량의 감소가 없어져서 이러한 요소들이 식물 전체에 골 고루 분포하게 만들었다. 동형접합 PSAG12-ipt 상치식물은 줄기대가 나오는 것이

47 제7장 싸이토키닌 유전자 발현의 표현형 39 약간(4~6일) 지체되고 개화와 상층부의 잎의 조기 노화는 심하게(4~8주) 지체되었 다. 이러한 변화는 발달 후기에 형질전환 식물의 상부 잎에서 싸이토키닌과 hexose 의 농도가 유의적으로 증가한 것과 상관이 있어서 노화에서 싸이토키닌과 헥소스 의 농도간에 관계가 있음을 암시한다. Robso 등(2004)는 잎의 노화를 지연시키려고 노화에 발현이 촉진되는 옥수수의 프로모터(P SEE1 )로 ipt 유전자를 사용하였다. P SEE1 로부터 ipt 유전자를 약하게, 중간 정 도 그리고 강하게 발현하는 형질전환 옥수수 3계통(Sg1, Sg2 및 Sg3)을 이용하여 노 화 지연의 관점에서 분석하였다. P SEE1Xba iptnos 도입 유전자의 존재의 유무로 분리되 는 여교배 집단은 동시에 노화형 표현형으로도 분리되었다. 이삭의 잎이 나오는 시기 에 도입유전자를 가지고 분리된 Sg1 및 Sg2 계통의 개체들은 도입 유전자가 없는 개 체들 보다 노화된 잎이 3장쯤 적었으며 ipt 전사 수준은 어린 잎보다 초기 노화 잎에 서 더 높았다. Sg3 형질전환 식물의 잎들은 대조 식물보다 훨씬 더 녹색이며 완전 녹색에서 중간에 노란색 단계를 거치지 않고 바로 탈색되어 죽었다. 이 계통에서 ipt 전사체의 수준은 노화의 시작과 관계가 없었다. 연장된 녹색상태의 유지는 잎의 연령 에 따른 광합성 능력의 손실의 지연을 동반하였다. 이러한 지연된 노화 형질은 형태 와 발달에 비교적 작은 변화만을 동반하였다. 이 표현형은 특히 질소 농도가 낮은 땅 에서 자랄 때 두드러진다. 극단적인 형질전환 계통 Sg3가 노화되는 잎으로부터 질소 를 재순환하여 사용하는 능력이 감소된 것은 식물이 빈약한 양료 조건에서 자랄 때 새로 나오는 잎에서 심한 백색화(chlorosis)가 진행되는 것을 설명해준다. 4. Stress 저항성과의 연관 여러 그룹에 의하여 ipt 형질전환 식물에서 스트레스 저항성과 싸이토키닌과의 관계 가 조사되었다. Synkova와 Valcke(2001)은 rbcs::ipt 형질전환 담배를 개발하고 건조처 리에 의한 항산화효소의 반응을 조사하였다. 그들은 형질전환 식물은 발달과정이나 처 리 과정에서 glutathione reductase활성의 어떠한 변화도 보이지 않는다고 결론지었다 침수 및 수분 스트레스 Huynh 등(2005)은 SAG12:ipt 유전자를 침수 스트레스(flooding stress)에 의하여 유도된 노화를 지연시키기 위하여 애기장대에 도입하였다. SAG12::ipt 및 야생형 식물을 완전히 물에 잠기게 하거나 뿌리를 물에 잠기게 하는 두 종류의 침수 스트