도1 색인어 뉴캐슬병, 백신, 바이러스, 감염 명세서 기술분야 본 발명은 가금( 家 禽 )의 뉴캐슬병 바이러스 감염에 관한 것이다. 배경기술 뉴캐슬병 바이러스 (NDV)는 가장 다양하고 그리고 치명적인 조류의 병원체중의 하나이다. 몇몇의 상이한 지리학적 위치들에의 분명

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1 (19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) (51)Int. Cl. 7 C12N 15/37 (11) 공개번호 특 (43) 공개일자 2001년06월25일 (21) 출원번호 (22) 출원일자 2000년12월18일 번역문제출일자 2000년12월18일 (86) 국제출원번호 PCT/NL1999/00377 (87) 국제공개번호 WO 1999/66045 (86) 국제출원출원일자 1999년06월17일 (87) 국제공개일자 1999년12월23일 (81) 지정국 AP ARIPO특허 : 케냐 레소토 말라위 수단 스와질랜드 우간다 시에라리 온 가나 감비아 짐바브웨 EA 유라시아특허 : 아르메니아 아제르바이잔 벨라루스 키르기즈 카자흐 스탄 몰도바 러시아 타지키스탄 투르크메니스탄 EP 유럽특허 : 오스트리아 벨기에 스위스 독일 덴마크 스페인 프랑스 영국 그리스 아일랜드 이탈리아 룩셈부르크 모나코 네덜란드 포르투 칼 스웨덴 핀랜드 사이프러스 OA OAPI특허 : 부르키나파소 베넹 중앙아프리카 콩고 코트디브와르 카 메룬 가봉 기네 말리 모리타니 니제르 세네갈 차드 토고 기네비쏘 국내특허 : 알바니아 아르메니아 오스트리아 오스트레일리아 아제르바이 잔 보스니아-헤르체고비나 바베이도스 불가리아 브라질 벨라루스 캐나 다 스위스 중국 쿠바 체코 독일 덴마크 에스토니아 스페인 핀랜드 영국 그루지야 헝가리 이스라엘 아이슬란드 일본 케냐 키르기즈 북 한 대한민국 카자흐스탄 세인트루시아 스리랑카 라이베리아 레소토 리투아니아 룩셈부르크 라트비아 몰도바 마다가스카르 마케도니아 몽 고 말라위 멕시코 노르웨이 뉴질랜드 슬로베니아 슬로바키아 타지키 스탄 투르크메니스탄 터어키 트리니다드토바고 우크라이나 우간다 미 국 우즈베키스탄 베트남 폴란드 포르투칼 루마니아 러시아 수단 스 웨덴 싱가포르 아랍에미리트 남아프리카 그레나다 가나 감비아 크로 아티아 인도네시아 인도 시에라리온 유고슬라비아 짐바브웨 (30) 우선권주장 년06월19일 EP(EP) (71) 출원인 아이디-렐리스타드, 인스티투트 부우르 디에르호우데리지 엔 디에르게존트하 이드 비. 브이. 네덜란드, 8219 피에이치 렐리스타드, 에델헤르트베그 15 (72) 발명자 피터스,베르나르더스,페트러스,후베르터스 네덜란드,엔엘-8241에이비이렐리스타드,골프파크18 드리우,올라브,스벤 네덜란드,엔엘-1318씨씨알메레,요한웨스테르벨트스트라아트4 코프,구우스 네덜란드,엔엘-8222에이지렐리스타드,윌드바안12 지엘켄스,아르노우드,네오나르드,요셉 네덜란드,엔엘-8242씨엘렐리스타드,보이에르04-76 (74) 대리인 김윤배, 이세진 심사청구 : 없음 (54) 뉴캐슬병 바이러스 감염성 클론, 백신 및 진단 분석방법 요약 본 발명은 클론된 전체-길이 CDNA로부터 전체적으로 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV)을 산출하는 방법 및 상 기 방법으로부터 생산되고 유래된 백신들의 용도 및 진단 방법에 관한 것이다. 이 방법은 유전학적 변형 에 의한 NDV 게놈을 변형할 가능성을 제공하고 그리고 돌연변이, 결실 및/또는 삽입의 도입을 허용한다. 이 방법은 NDV의 독성을 변형하기 위해 사용될 수 있어서 향상된 특성들을 갖는 신규한 약독화된 생백신 들을 생산한다. 이 방법은 NDV의 항원성 구성을 변형하기 위해 사용되어서, NDV 야외 균주들로부터 혈청 학적으로 구별될 수 있는 생 NDV 마커 백신들을 생산하게 한다. 대표도 59-1

2 도1 색인어 뉴캐슬병, 백신, 바이러스, 감염 명세서 기술분야 본 발명은 가금( 家 禽 )의 뉴캐슬병 바이러스 감염에 관한 것이다. 배경기술 뉴캐슬병 바이러스 (NDV)는 가장 다양하고 그리고 치명적인 조류의 병원체중의 하나이다. 몇몇의 상이한 지리학적 위치들에의 분명한 새로운 질환으로서 뉴캐슬병의 거의 동시적인 발생 및 그 질환의 타입 및 가 혹도에서의 큰 변이는 명명법에 몇가지 문제를 야기했다. 그 질환은 가성 닭 페스트, 가성 가금 페스트, 조류 페스트, 조류 디스템퍼 및 조류 뉴모엔세팔리티스 (pneumoencephalitis)로 칭해졌다. 이 질환의 중요성은 우선 20세기 동안 국가들간의 막대한 무역에 의 존한 고 효율의 국제적인 산업으로의 가금 산업의 발달에 기인한다. 뉴캐슬병의 첫번째 발발은 인도네시아의 자바 및 영국의 뉴캐슬-우폰 타이네에서 1926년에 일러났다고 일 반적으로 추정된다 (Kraneveld, 1976:Doyle, 1927). 뉴캐슬병의 이름은 다른 질환들과 혼동될 수 있는 묘사적인 이름을 피하기 위하여 일시적인 이름으로 Doyle에 의해 붙여진 것이었다. 다른 덜 가혹한 질병 들이 NDV와 구별이 되지 않는 바이러스들에 의해 야기되었음이 후에 분명해졌다. 미국에서 비교적 순한 호흡기 질환이 조류 뉴모엔세팔리티스로 칭해졌고 그리고 NDV에 의해 야기됨이 밝혀졌다 (Beach, 1944). 몇년 이내에, 닭에서 극히 순한 질환을 야기하거나 또는 질환을 야기하지 않는 수많은 NDV 단리체들이 세 게 도처에서 달성되었다. 하기의 방법들이 그 질환의 확산에 연루되어 왔다: 1) 살아있는 새들의 이동; 2) 인간 및 장비들의 이동; 3) 가금 생산품의 이동; 4) 풍매( 風 媒 ) 확산; 5) 오염된 가금 사료; 6) 오염된 물; 7) 불완전하게 비활성 화된 또는 이종성의 백신들. OIE에 따르면, 뉴캐슬병은 햇병아리에서 0.7 또는 그 보다 큰 뇌내 병원성 지수 (ICPI)를 갖는 조류 파라미쏘바이러스(paramyxovirus) 세로타입(serotype) 1(APMV-1)의 바이러스에 의해 야기되는 가금의 질환이다. 전염성 바이러스는 또한 F2 단백질의 C-말단의 다중 기본 아미노산들 및 F1 단백질의 N-말단의 F(페닐라닌)의 존재에 의해 확인될 수 있다. 이 아미노산 서열을 증명하는 것 의 실패는 ICPI 테스트에 의한 특징화를 요구할 것이다. 용어 '가금'은 사육되는 또는 기르기, 소비용 고기 또는 알의 생산을 위해 또는 게임의 방류 공급을 위해 강금된 닭, 칠면조, 기니아닭, 오리, 거위, 메추라기, 비둘기, 꿩, 목도리뇌조 및 주금류의 새를 말한다. Alexander(1988)에 따르면, 그 질환의 첫번째 인식 이래로, 세번의 대유행성의 뉴캐슬 질환이 발발하였다. 첫번째는 그 질환의 1차 발발을 나타냈고 그리고 남동 아시아에서 발생한 것처럼, 즉 1926 년 영국에서의 것과 같이 격리된 발발로 보여, 아시아를 통하여 유럽으로 천천히 이동한 메카니즘 전의 도입의 기회였다. 두번째 대유행은 1960년 후반에 중동에서 시작한 것으로 보이고 1973년까지 대부분의 국가들에 이르렀다. 두번째 대유행의 더 빠른 확산은 아마도 상당한 국제적인 무역의 가금 산업의 주요 혁명에 의해 기인한 것이었다. 세번째 대유행은 초기에는 비둘기와 같은 길들여진 새들에게 영향을 미쳤다 (Vindevogel and Duchatel, 1988). 이 질환은 분명히 1970년대 후반에 중동에서 발생하였다. 1981년까지 유럽에 이르고 그리고 나 서 경주 및 진열에서 새들간의 접촉 및 그러한 새들의 국제적인 무역의 결과로서 광범위하게 세계 도처로 급속히 확산되었다. 오늘날, 뉴캐슬병은 아시아, 아프리카, 아메리카 및 유럽의 많은 나라들에서 여전히 만연되어 있다. 단 지 오세니아의 국가들만이 비교적 그 질환으로부터 자유로운것 처럼 보인다 (Spradbrow, 1988). NDV는 Momonegavirales 목, Paramyxoviridae 과, Paramyxovirinae 아과, Rubulavirus 속에 속한다. 일 반적으로 조류 파라미쏘바이러스 타입-1으로 불리는 NDV와는 별도로, 조류 파라미쏘바이러스 타입-2 내지 -9로 명명된 8개의 다른 세로타입들이 적혈구 응집-저해 테스트 및 혈청 중화 테스트에서 그들의 항원 연 관성을 기초로 하여 구별될 수 있다 (Alexander, 1993). 혈청학적 그룹화의 일치성에도 불구하고, 다른 세로타입들의 바이러스들간에는 몇몇의 교차-관계가 있다. NDV의 게놈은 바이러스 단백질들을 코드하는 전령 RNA들에 상보적인 음(-) 극성의 단일-가닥 RNA 분자이 다. RNA 게놈은 크기로 대략 15,200 nt이고 그리고 다음의 유전자 생성물들을 코드한다 (게놈 RNA의 3' 말단 내지 5' 말단으로 나열된): 뉴클레오캡시드 단백질 (NP), 포스포프로테인 (P), 매트리스 단백질 (M), 융합 단백질 (F), 적혈구 응집소-뉴라미니다제 (HN), 및 대 폴리머라제 단백질 (L) (Chambers et al., 1986). 이 RNA는 M 단백질에 의해 내부에 늘어선 엔벨로프에 의해 둘러싸인 리보뉴클레오캡시드 입자 (RNP)를 형 성하기 위해 NP, P 및 L과 복합체를 형성한다. 이 엔벨로프는 숙주 세포의 부착 및 침투에 관련된 F 및 HN 단백질을 함유한다. NDV의 복제는 다른 파라미쏘비리네에 사용되는 전략과 비슷하다. 1차 단계는 HN 단백질에 의해 중재되는 59-2

3 숙주 세포 수용체들에 이 바이러스를 부착하는 것이다. 바이러스성 엔벨로프와 숙주세포 막의 융합은 HN 및 F 단백질 둘다의 작용에 의존적이고 그리고 바이러스 복제가 일어나는 세포질로 RNP의 방출을 초래한 다. 바이러스성 RNA-의존 RNA 폴리머라제 (RNP의 일부)는 mrna들로 작용하고 그리고 바이러스 단백질들의 합 성을 위한 세포의 번역 기구에 의해 사용되는 상보성 전사체들을 생성한다. NP 단백질의 축적 때문에, RNA 폴리머라제 복합체는 전체-길이 게놈성 및 항-게놈성 RNA 분자들의 합성을 초래케하는, 전사로부터 복제로 전환한다. 새롭게 형성된 RNP들은 M 단백질 및 세포성 혈장 막에 축적된 F 및 HN 단백질들의 작용에 의해 세포성 막 에 엔캡시스된다. 새롭게 형성된 바이러스 입자들은 발아 메카니즘에 의해 감염된 세포로부터 방출된다. NDV 복제에 대한 더 상세한 정보는 Peeples(1988)을 참조하라. 파라미쏘비리네의 분자생물학의 최근 검 토는 Lamb and Kolakofsky (1966)을 보라. 상업적인 가금류 (즉, 닭, 칠면조, 메추리, 기니아닭, 오리, 거위, 비둘기)와는 별도로, 이동성 물새를 포함하여 우리에 가둔, 반-가축 및 자유롭게 살아가는 광범위한 새들이 NDV에 걸리기 쉽고 1차 감염원일 수 있다 (Kaleta and Baldauf, 1988). NDV 균주들의 병원성은 숙주에 따라 크게 다르다. 대부분의 저항성 종들은 물새인 것으로 보이고, 반면 에 가장 감수서이 큰 것은 대부분의 영구적인 떼의 일시적인 형성을 하는 군거성 새들이다. 닭들은 매우 걸리기 쉬우나, 오리 및 거위는 감염될 수도 있고 그리고 닭에게는 치명적인 균주들 조차도 거의 또는 전 혀 임상적인 징후가 나타나지 않는다. 뉴캐슬병은 바이러스의 상이한 단리체들 및 균주들이 이 질환의 가혹도에서 막대한 변이를 도입할 수 있 다는 점에서 복잡하다. Bread와 Hanson(1984)은 NDV 균주들 및 단리체들을 완전히 걸리기 쉬운 닭들에서 보여지는 질환의 징후에 관련된 상이한 파쏘타입(phathotype)으로 그룹화했다: 1) 내장에서 출현 병변이 현저한 급성 치사 감염을 생산하는 내장향성 벨로제닉(velogenic) NDV; 그리고 내장 병변은 없고 호흡기 및 신경학적 징후가 전제되는 높은 치사율을 보이는 신경향성 벨로제닉 NDV; 2) 낮은 치사율, 일부 새들 에서 급성 호흡기 질환 및 신경성 징후를 생산하는 메소제닉(methogenic) NDV; 3) 순한 또는 분명하지 않 은 호흡기 감염을 생산하는 렌토제닉(lentogenic) NDV, 또는 심지어 무증상의 장내 NDV, 장관에서 1차 복 제하는 무발병성의 바이러스들. 이 상이한 그룹들에 관련된 징후들간에 일부 겹침이 보고되어 있다. 이 바이러스는 호흡기 및 장관을 통하여 또는 눈을 통하여 체내에 들어간다. 호흡관에서, 바이러스는 섬 모 작용에 의해 그리고 세포-대-세포 확산에 의해 확산된다. 도입 부위에서의 1차 다중화 후에, 바이러 스는 비라에미아(viraemia)의 증상발현 동안에 비장, 간, 신장 및 폐로 이동된다. 일부 균주들의 바이러 스는 간 및 신장과 같은 치명적인 기관에 이르러서 새들을 증상이 명백해지기 전에 죽게 한다. 대부분의 바이러스는 항체의 상당한 양이 존재하기 전에 혈액을 통하여 중추 신경계에 다다른다. 앵무새 (psittacines)에서 일어날 것으로 예상되는 긴, 무증상의 보균 상태는 가금 산업에 잠재적인 위협을 구성 한다. 렌토제닉 또는 벨로제닉 바이러스 둘다의 긴 보균 상태는 또한 닭에 존재한다 (Heuschele and Easterday, 1970). NDV의 복제 동안에, 감염성 자손 바이러스를 위한 F1 및 F2로 절단될 전구체 당단백질 Fo가 필요하다 (Rott and Klenk, 1988). 이 번역-후 절단은 숙주 세포 프로테아제들에 의해 중재된다. 만약 절단이 일 어나는 것이 실패되면, 비-감염성 바이러스 입자들이 생성되고 그리고 바이러스 복제가 진행할 수 없다. 독성 바이러스의 Fo 단백질은 광범위한 프로테아제에 의해 절단될 수 있으나, 낮은 독성의 바이러스들에 서 Fo 단백질들은 그들의 감수성에 제약되고 이들 바이러스는 단지 특정 숙주 세포 타입들의 생체내에서 만 생육하고 일반적으로 생체외에서는 생육될 수 없다. 렌토제닉 바이러스는 단지 호흡기 또는 장관과 같은 트립신-같은 효소들을 갖는 영역에서만 복제하는 반 면에, 독성 바이러스들은 치명적인 시스템적 감염을 초래하는 조직 및 기관의 범위에서 복제할 수 있다. Fo 전구체의 아미노산 사열화는 저-독성 바이러스들은 F2 및 F1 사슬을 연결하는 단일 아르기닌 (R)을 갖 는 반면에, 독성 균주들은 절단 부위에 K/R-X-K/R-R-F와 같은 두 쌍을 형성하는 추가의 기본 아미노산들 을 보유한다는 것을 보여주었다. 게다가, 독성 균주들의 F2 사슬은 일반적으로 페닐알라닌 잔기로 개시 하는 반면에, 비독성 균주들의 F2 사슬은 일반적으로 로이신으로 개시한다. NDV의 일부 균주들에서는 HN 단백질이 또한 생물학적으로 활성이 되기 위해서는 절단을 요구하는 전구체 로서 또한 생성된다 (Garten et al., 1980; Miller et al., 1988). F 및 HN 단백질들의 절단성 외에도, 다른 바이러스성 인자들이 병원성에 기여할 수 있다. Madansky 및 Bratt (1978, 1981a, 1981b)는 전사 및 번역에서의 변경들은 바이러스의 성장 및 세포-대-세포 확산 및/ 또는 사이토파소제니시티 (cytophathogenicity)를 변형할 수 있음을 밝혔다. NDV로 감염에 대한 1차 면역 반응은 세포 중재되고 그리고 생 백신 균주들로 감염시킨 후 2-3일 정도로 초기에 검출가능하다. 이것은 측정가능한 항체 반응이 가시화되기 전에 백신 접종된 새들에서 기록된 공 격(challenge)에 대한 1차 보호를 추측상 설명한다 (Gough and Alexander, 1973). 감염후 약 1주일경에, 순환 항체들은 재-감염으로부터 숙주를 보호할 수 있다. 초기 상에서는 IgM이 관 련되고, 이어서 IgG가 관련된다. 적정량(titres) 및 보호는 약 3주후에 최고점에 달하고 그리고 추가투 여(boosting)가 없으면 점차 줄어든다. 이것은 더 나이든 새들은 재-백신 접종이 필요함을 의미한다. 단지 호흡기를 통해 투여된 생백신만이 혈청뿐만 아니라 모든 점막 표면들에서 항체를 자극한다. 비활성 화된 백신은, 심지어 근육주사를 통해 적용되었을 때도, 혈청 항체의 고 농도에도 불구하고 호흡관에서 국소적 저항을 이끌러내지 않는다. 이것은 국소 및 시스템 면역 둘다를 유도하는 상부 호흡관에 바이러스성 항원을 존재하게 할 수 있는 생 백신의 중요성을 강조한다. 작은 비말(droplets)은 하부 호흡관으로 침투해서 주로 체액성 면역 반응을 59-3

4 야기하는 반면에, 굵은 비말은 상부 호흡관에서 국소적 면역을 자극한다. 그러므로 광범위한 크기의 비 말을 갖는 에어로졸이 가장 좋은 전반적인 국소 및 체액성 면역을 발생한다. 그러나 높은 수준의 항체 적정량을 만들어 내는 현행 백신으로 광범위한 백신 접종에도 불구하고, 바이러 스는 여전히 점막 표면으로부터 회복될 수 있음을 주지하여야 한다. 미국에서 뉴캐슬병의 동정은 비활성화된 백신의 사용을 이끌어 냈다 (Hofstad, 1953). 일부 동물 풍토병 바이러스가 단지 순한 질환을 생산했다는 관찰은 최초로 미소제닉 생 백신 Roakin의 개발의 결과를 가져 왔고 (Beaudette et al., 1949) 그리고 이어서, 더 순한 Hitchner B1 (Hitchner and Johnson, 1948) 및 LaSota (Goldhaft, 1980)의 개발을 가져왔다. NDV 생백신은 두 그룹, 렌토제닉 및 메소제닉으로 나뉠 수 있다. 메소제닉 균주들은 그들의 더 강력한 독성 때문에 새들의 단지 2차 백신 접종에 적합하다. 면역 반응은 생백신의 병원성의 증가에 따라 증가 한다. 그러므로, 심각한 반응없이 요구되는 보호 수준을 달성하기 위해서는, 점차 더 독성의 백신의 순 차적인 사용, 또는 생백신과 이어서 비활성화된 백신의 사용을 포함하는 최근 백신 프로그램이 사용된다. 생백신들의 주요한 이점중 하나는 비용이 싼 대량 적용 기술에 의해 투여될 수 있다는 것이다. 통상적 인 적용 방법은 물을 마시는 것을 통하는 것이다. 그러나, 물 마시기 적용은 바이러스가 과도한 열 및 빛에 의해 그리고 물속의 살-바이러스제 분순물에 의해 비활성화 될 수 있기 때문에 주의깊게 모니터되어 야 한다. 스프레이 및 에어로졸에 의한 생백신의 대량 적용은 많은 수의 새가 짧은 시간내에 백신 접종될 수 있다 는 용이성 때문에 또한 매우 인기가 좋다. 입자들이 발생되는 조들을 조절함에 의해 정확한 입자 크기를 달성하는 것이 중요하다. 최근 사용되는 생백신들은 몇가지 문제점을 가지고 있다. 이 백신은 여전히 환경 조건들 및 악화하는 감 염의 존재에 의존하는 질환 증후들을 유발한다. 그러므로, 1차 백신 접종을 위한 극히 순한 바이러스를 사용하는 것이 중요하고 그리고 대체로 다중 백신 접종이 주로 요구된다. 게다가, 모계로부터 물려받은 항체들이 렌토제닉 생백신들로의 1차 백십접종을 성공적으로 방어할 수 있다. 비활성화된 백신들은 바이러스를 죽이기 위해 포말린 또는 베타프로피오락톤으로 처리되고 적절한 보조제 와 혼합된 감염성 요낭액으로부터 보통 생산된다. 비활성화된 백신들은 근육 또는 피하 주사로 투여된다. 비활성화된 백신들은 생산하고 적용하는데 비용이 비싸다. 그러나, 비활성화된 오일-유제(emulsion) 백신들은 생백신 만큼 모계 면역에 의해 불리한 영향을 받지 않 고 그리고 이것들은 햇병아리에 사용될 수 있다. 비활성화된 백신들의 이점은 백신 접종된 새들에서 낮 은 수준의 부작용, 높은 수준의 방어 항체, 및 방어의 장기간이다. 상기 백신들의 어느 것도 야생형 NDV 와 혈청학적으로 상이할 수 없다. 재조합 바이러스성 백신들의 개발은 수 많은 세월동안 가금 산업에 흥미를 가졌다. 그 개념은 관심의 질 환 제제의 필수적인 면역화 에피토프의 유전자를 벡터 바이러스의 비필수적인 유전자로 삽입하는 것이다. 그래서 재조합 바이러스로 백신 접종하는 것은 관심의 질환 제제 뿐만아니라 벡터 바이러스 둘 다에 대한 면역화를 초래한다. 몇몇 타입의 백신들은 가금을 위한 잠재적인 생백신으로서 평가되어 왔다. 가장 주목을 받아온 두개의 조류 바이러스는 계두(fowlpox) 바이러스 (FPV) 및 칠면조의 헤르페스바이러스 (HVT)이다. 계두 바이러 스는 대( 大 ) 게놈을 갖는 DNA 바이러스이고 그런 연유로 외래 유전자를 지니는 충분한 공간을 갖는 것으 로 생각된다. 약독화된 경우, FPV는 임상적 질환을 일으키지 않고 그리고 통상적으로 닭에 백신으로 사용된다. HVT는 또한 DNA 바이러스이고 마레크(Marek) 질환 바이러스 (MDV) 과( 科 )의 세로타입 III으로서 분류된다. HVT 는 MDV에 대한 교차-방어적인 닭에 대해서는 비-병원성이고 그리고 보통 마레크 질환에 대해 닭을 백신 접종하기 위해 사용된다. 뉴캐슬병에 대한 방어는 재조합 HVT 및 FPV 백신을 사용하여 유도될 수 있음이 보여졌다 (Morgan et al., 1992, 1993; Heckert et el., 1996; Boursnell et al., 1990; Taylor et al., 1990). 그러나, NDV F 단백질 또는 F 및 HN 단백질 둘다를 발현하는 그러한 재조합 백신들로 백신 접종함에 뒤이 은 뉴캐슬병에 대한 방어의 개시는 종래의 생 또는 비활성화된 NDV 백신으로 백신 접종에 뒤이은 그것 보 다 상당히 지연되었다. 이것은 아마도 이 재조합 백신들은 재조합 백신에 의해 발현되거나 또는 면역 시 스템에 적절하게 존재하지 않는 NDV 단백질 상에 발견된 것들 이외의 항원적으로 관련 NDV 에피토프들의 충분히 넓은 면역학적 요인(spectre)을 제공하지 않기 때문일 것이다. 게다가, 국소 (점막, 호흡기 또는 장) 방어는 재조합체로 백신 접종된 새들에서 효과적으로 유도되지 않 았다. 이것은 호흡기 질환에 대한 1차 백신 접종을 위해 사용된 백신이 야외에서 사육된 닭을 감염시키 는 독성 바이러스의 감염 및 확산을 방어하는 국소 면역을 유도해야만 하는 중대한 결점이다. 숙주를 방어할 수 있는 NDV에 대한 항체들은 바이러스 중화 테스트에서 측정될 수 있다. 그러나, 중화 반응은 적혈구 응집 저해 (HI) 반응과 대등한 것으로 보이기 때문에, 후자의 테스트는 보호 반응을, 특히 백신 접종 후에 평가하기 위하여 자주 사용된다. F 및 HN 단백질 둘다에 대한 항체들은 NDV를 중화할 수 있다. 그러나, F 단백질에 대한 항체들은 생체내 및 생체외 테스트에서 HN에 대한 것들보다 더 큰 중화를 유도하는 것으로 보인다. 새의 혈청에서 NDV에 대한 특이적인 항체들의 존재는 NDV의 감염 균주에 대한 정보를 거의 주지 않으므로 진단 가치를 제한하였다. 대부분 국가들에서 새들에 레토제닉 NDV 균주들의 편재 및 적어도 혈청학적으로 야생 NDV로부터 구별될 수 없는 생백신의 거의 보편적인 사용은 감염의 단순한 증명이 거의 부과되는 조절 측정들을 위한 적절한 59-4

5 원인이 아니다 라는 것을 의미한다. 야외 질환은 바이러스의 진정한 감염성의 신뢰할 수 없는 측정일 수 있기 때문에, 발견된 바이러스를 더 특징화하는 것이 필요하다. 현재, 감염화 균주의 특징화를 가능케하는 뉴캐슬병 진단의 유일한 방법은 바이러스 단리와 뒤이은 병원 성 테스트이다. 현재, 3개의 생체외 테스트가 이 목적을 위하여 사용된다: 1) 알에서 평균 사멸 시간 (MDT); 2) 1일-햇병아리에서 뇌내 병원성 지수 (ICPI); 3) 6일된 새에서 정맥내 병원성 지수 (IVPI). 이 테스트들은 동물의 유용성, 미약한 재현성, 및 테스트의 비교적 장기간과 같은 수많은 결점을 갖고 있 다. 마지막으로 말하지만 결코 가볍게 볼것은 아닌데, 이 테스트들은 백신으로 백신 접종된 또는 야생형 균주로 감염된 가금의 시료 혈청확적 확인을 허용하지 않는다. 생체내 테스트의 대안으로서, 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)은 독성과 비-독성 단리체들을 구별하기 위해 성 공적으로 사용되어 왔으나 (Stauber et al., 1995; Kant et al., 1997), 그러나 역시 혈청학적 구별화는 불가능하다. 가금의 사육 및 그 제품들의 무역은 이제 국제적으로 빈번히 다국적 회사들의 관리로 조직화되어 있다. 뉴캐슬병의 위협은 그러한 무역에 큰 제약을 가져왔다. 뉴캐슬병의 성공적인 조절은 모든 국가들이 발발을 보고할때 만이 달성될 것이다. 그러나, 국제적 의정 서는 상이한 나라들에서 질환 감시의 범위에서 막대한 차이 때문에 단순하지 않다. 일부 국가들은 백신 접종된 가금이 야생형 NDV에 감염된 것들과 구별될 수 없기 때문에 가축 가금에 백신 접종 및 어떤 형태 의 NDV의 도입도 원하지 않는다. 나머지 나라들은 단지 특정의 생백신의 사용만을 허용하고 다른 백신들은 수용할 수 없는 독성으로 간주 한다. 아직 나머지 나라들은 매우 독성의 바이러스 순환의 연속된 존재에 직면하는데, 분명한 질환이 백 신 접종에 의해 차단되기 때문에, 이것은 그 자체로 인정되지 않는다. 많은 국가들에서 입법화가 일어날 수 있는 뉴캐슬병 발발을 조절하기 위해 존재한다. 국가적 조절 수단 들은 도입 및 확산의 방어에 향해 있다. 대부분의 나라들은 가금 생산품, 알 및 살아있는 가금의 무역에 제약을 갖고 있다. 대부분의 나라들은 수입, 특히 앵무새들에 대한 검역 과정을 수립하고 있다. 일부 나라들은 감염된 새들, 그들의 접촉동물들 및 제품들의 강제적인 도축의 박멸 정책을 적용하여 왔다. 다른 나라들은 심지어 발병이 없을지라도 새들의 예방적 백신 접종을 요구하는 반면에, 일부 나라 들은 완충 지대를 수립하기 위하여 발발 주위에 링(ring) 백신접종의 정책을 갖고 있다. 분명히, 뉴캐슬병을 조절하는데에 사용될 수 있는 더 나은 백신 및 더 나은 진단방법이 요구되고 있다. 생백신의 대량 적용 동안에 개개의 새등에 의해 수용되는 용량에서의 큰 차이와 어린 닭들에서 모계 면역 의 수준의 차이 때문에, 생백신으로 후-백신 반응이 피할 수 없다. 이것은 백신 접종이 강제적인 나라들 에서 농부들의 주요 관심중의 하나이다. 게다가, 많은 백신들이 부차-집단(sub-population)들의 혼합물이다. 클론된 경우, 이 부차-집단들은 면 역원성 및 병원성에서 서로서로 상당히 상이하다 (Hanson, 1988). 그러나, 현재 사용되는 생백신 및 비활성화된 백신의 가장 큰 결점은 백신 접종된 동물들은 적혈구 응집- 저해 또는 바이러스 중화 테스트와 같은 현재 사용되는 선별 기술들로 감염된 동물들로부터 구별해 낼 수 없다는 사실이다. 독성 야외-바이러스는 질환 증상들이 백신 접종에 의해 가려지기 때문에 백신 접종된 떼들에서 여전히 확 산할 것이다. 생체내 기술들에 의한 바이러스 단리 및 독성의 특징화는 대규모에서 실행할 수 없기 때문 에, 야외-바이러스들로부터 혈청학적으로 구별될 수 있는 신규하고 그리고 효과적인 약독화된 생백신들에 대한 큰 요구가 있다. 항원성으로 관련한 NDV 에피토프들의 가장 가능성의 면역학적 요인을 제공해야 하고 그리고 야생형 NDV와 혈청학적으로 달라야 하는, 소위 NDV 마커 백신들 (및 진단방법 및 키트들을 동반하는)이라 불리는 그런 백신들은 아직 이용가능하지 않다. 발명의 상세한 설명 본 발명은 유적학적인 변형에 의한 조류-파라미쏘바이러스 게놈을 변형하는 방법을 제공하고, 유전적으로 변형된 조류-파라미쏘바이러스 및 조류-파라미쏘바이러스 마커 백신을 제공한다. 현대 분자생물학 기술의 출현은 음(-)가닥 RNA 바이러스들을 포함하여 많은 RNA 바이러스의 유전학적 변 형을 가능케 하였다. 이 기술은 종종 "역 유전학"으로 종종 불린다. 하나는 우선 바이러스성 RNA의 (전 체-길이) cdna 복사체를 제공하고, 뒤에 하나는 감염성 바이러스 입자들을 생산하기 위해 다시 복제할 수 있는 감염성 RNA를 생성하기에 용이한 세포들에서 이 DNA를 전사한다. 일반적으로, 기준 분자생물학 기술로 cdna의 이전 변형에 의해, 유전학적으로 변형된 RNA 바이러스들 수 득하는 것이 가능하였다. 그러나, 이것은 NDV 또는 다른 조류-파라미쏘바이러스에 대해서는 결코 실현되 지 않았었고, 심지어 조류-파라미쏘바이러스의 복제를 연구하여 감염성 복사체 바이러스를 어떻게 축조하 는 가에 대한 이해하기 위한 미니게놈 단편들 또는 조류-파라미쏘바이러스 게놈 단편들의 플라스미드들을 발생하는 것도 가능하지 않았다. 놀랍게도, 비록 기재일지라도, 조류-파라미쏘바이러스의 게놈은 지금까지 모든 서열화된 파라미쏘바이러 스 게놈중 가장 작은 것이고, 특히 NDV 게놈의 5' 말단 서열은 다른 Paramyxoviridae와 비교하여 이전에 수립되고 예측되었던 것 보다 훨씬 더 길다. 본 발명은 이제 최초로 조류-파라미쏘바이러스 게놈의 전체 서열을 제공하고 그리고 그러한 바이러스의 전체-길이 또는 미니게놈 길이 cdna를 제공한다. 본 발명은 이것과 함께 적어도 조류-파라미쏘바이러스의 감염성 복사체를 발생하는 조류-파라미쏘바이러 스 게놈의 5'-말단에 대응하는 핵산서열을 포함하는 조류-파라미쏘바이러스 cdna를 제공하고, 상기 cdna 59-5

6 는 바람직하게는 전체-길이 cdna를 포함한다. 그러나, 본 발명은 또한 적어도 조류-파라미쏘바이러스 게 놈의 5'-말단에 대응하는 핵산 서열을 포함함에 의해 조류-파라미쏘바이러스 미니게놈의 복제를 발생케 하는 cdna를 제공한다. 그러한 미니 게놈들은 유익하게도 RNA를 전사및/또는 변형된 핵산 서열로부터 단 백질을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 적어도 부분적으로 뉴캐슬병 바이러스로부터 유래된 본 발명에 따른 cdna를 제공하는데, 예를들면 상기 뉴캐슬병 바이러스는 렌토제닉 바이러스이고, 바람직 하게는 LaSota 균주 ATCC VR-699와 같은 백신 균주로부터 유래된다. 또한 본 발명은 추가로 결실, 삽입, 돌연변이, 역위와 같은 변형이 핵산에 제공되는 본 발명에 따른 cdna 를 제공한다. 예를들면, 상기 변형이 변형된 프로테아제 절단 부위를 코드화하는 핵산을 포함하고, 예를 들면 상기 절단 부위가 융합 (F) 단백질의 프로테아제 절단 부위인 cdna가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 변형이 본 발명의 실험부에 기재된 바와 같이 하이브리드 적혈구 응 집 (HN) 단백질과 같은 하이브리드 바이러스성 단백질을 코드화하는 핵산을 포함하는 본 발명에 따른 cdna를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 변형이 매트리스 (M) 단백질과 같은 바이러스성 단백질을 코드화 하는 핵산에서 결실을 포함하는 본 발명에 따른 cdna를 제공한다. 본 발명은 추가로 이종성 항원을 코드화하는 핵산이 제공된, 바람직하게는 예를들면 하기에 기재된 바와 같이 상기 항원이 가금 병원체로부터 유래되는 본 발명에 따른 cdna를 추가로 제공한다. RNA 및 본 발명 에 따른 cdna로부터 수득되는 그것의 유래된 단백질이 또한 제공된다. 최근 몇년에, 수 많은 비-절편화된 음-가닥 RNA 바이러스가 충분히 특징화되었고 그리고 그들의 게놈의 복제 및 발현에 대한 기초적 연구가 상기 바이러스의 클론된 cdna로 세포들을 트랜스펙션함에 의해 전체 적으로 감염성 바이러스를 산출하는 능력에서 정점에 달했다 (reviewed by Conzelmann, 1996). 지금까지, 비-절편화된 음-가닥 RNA 바이러스들의 감염성 바이러스는 예를들면 광견병 바이러스 (Schnell et al., 1994, Conzelmann; EP A1), 소포 구내염 바이러스 (Lawson et al., 1995, Whelan et al., 1995), 샌다이 바이러스 (Garci et al., 1995), 홍역 바이러스 (Radecke et al., 1995; Schneider et al., 1997; EP A1), 인간 인간 호흡기 신시티얼(syncytial) 바이러스 (Collins et al., 1995), 우 역 바이러스 (Baron and Barrett, 1997), 및 인간 유사인플루엔자 바이러스 타입 3 (Hoffman and Banerjee, 1997, Conzelmann; P A1), (Schnell et al., 1994; EP A1)의 클론된 cdna로부터 생산되어 왔다. 그러나, 상기 감염성 복사체 바이러스들 모두는 적절한 세포주 상에서 감염성 입자들의 용이한 cdna 트랜 스팩션 및 복제 및 생산을 가능케 하는, 숙주, 조직 또는 다양한 기원의 세포들에서 생체외에서 뿐만아니 라 생체내에서도 생육할 수 있다. 그러한 가능성은 NDV, 분명히 백신을 제공할 수 있는 렌토제닉 NDV 균주들에 대해서는 존재하지 않는다. 그러한 NDV 균주의 독성은 독성 균주들은 생체외 및 생체내에서 용이하게 복제할 수 있는 반면에, 백신 균주들은 단지 생체내에서만 복제할 수 있다는 사실에 의해 반영된, 광범위한 세포들에서 복제하는 그것 의 능력에 관련된다. 그래서, NDV로 캐치(catch) 22 상황이 분명하다. 예를들면 감염성 cdna로부터 감염성 복사체 바이러스을 산출하려는 시도들이 가능하게 감염성 바이러스를 초래할 수 있는 반면에, 그러한 바이러스는 그렇게 발 생된 감염성 바이러스가 백신으로 사용되기에는 너무 독성이 강해서 결격되기 때문에 일반적으로 백신으 로서 사용에 적절하지 않다; 그것이 세포주 상에 cdna의 트랜스팩션 후 생산되고 그리고 복제될 수 있다 는 사실은 Fo 단백질의, 상기에서 토의된 바와 같이 NDV의 독성의 검증마크인, F1 및 F2로의 그것의 용이 한 절단성을 반영한다. cdna에 대한 친( 親 ) 물질로서 백신 균주의 사용은 이 문제를 해결하지 못할 것이다: 백신 균주, 특히 렌 토제닉 타입은 용이하게 전달할 수 있는 Fo 단백질을 함유하지 않는데 이것은 제1 세대 바이러스가 복제 를 계속하는 것이 불가능함을 말해 준다. 트랜스펙션에 사용된 세포는 단순히 비-절단된 Fo 단백질을 갖 는 백신-타입 바이러스의 한번 이상의 복제 라운드를 뒷받침할 수 있는 것은 아닐 것이다. 이제 본 발명은 훌륭하게 이 문제점의 해결책을 제공하고, 그리고 그와 함께 예를들면 백신에 사용을 위 한 감염성 복사체 NDV를 제공한다. 본 발명은 감염성 복사체 뉴캐슬병 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 바이러스 RNA와 복합체화하기 위한 바이러스성 NP, P 및 L 단백질들을 발현할 수 있는 세포들을 상기 바이러스의 클론된 전체-길이 또는 게놈-길이 cdna로 트랜스팩션하는 단계를 포함하고 그리고 상기 세포를 상기 바이러스의 Fo 단백질의 절단을 허용하는 단백질가수분해 활성을 포함하는 배양 배지에서 인큐베이트 하는 단계를 더 포함한다. 본 시스템에서, NP를 발현하는 플라스미드의 공-트랜스펙션은 생략될 수 있다. NP 유전자는 항-게놈성 RNA의 5 말단뒤의 첫번째 유전자이기 때문에, NP는 완전한 길이의 cdna로부터 발현될 수 있다. 진핵세포 의 mrna는 보통 단일시스트론성이기때문에, 말단 유전자의 발현은 기대할 수 없다. 그러나, NDV 유전자 의 상대적 위치가 바뀐 전체 길이의 cdna를 생성하는 것이 가능하다. 이 cdna의 첫번째 유전자가 P 또는 L인 경우, 공-트랜스펙트된 플라스미드로부터 상응하는 유전자를 발현시킬 필요가 반드시 있는 것은 아니 다. 전체 길이의 cdna를 사용의 대안으로, 둘 이상의 cdna를 사용하여 반응력 있는 서브게놈성 RNA에 해당하 는 복제를 할 수 있고, 조류-파라믹소바이러스 단백질의 전체 보완물(complement)을 발현시킬 수 있다. RNA가 개별적으로 패키징된 경우에서도, 결과물인 바이러스성 입자는 공-감염과 유전자 기능의 보완에 의 해 연속적인 복제 라운드에 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 단백질 분해활성이 트립신 같은 효소에서 유래하거나 또는 상기 단 백질가수분해 활성을 가진 조성물에서 유래하는 방법을 제공한다. 더 바람직한 구체예에서는, 상기 성장 배지는 단백가수분해 활성을 갖는 요낭액을 포함한다. Fo 단백질의 분해는 감염성 바이러스의 생성에 필 59-6

7 수적이다. 외인성 단백질가수분해 활성을 첨가하지 않고도 렌토제닉 균주로부터 감염바성 바이러스를 생 성하는 것이 가능하다. 트랜스펙트된 세포의 상징액을 발육란(embryonated)의 요낭강에 접종시켜, 요낭 액에 존재하는 단백질가수분해 활성으로 Fo 단백질을 분해하여 융합 F1-F2 복합체를 생성할 수 있다. 이 런 활성화된 Fo 단백질을 가진 바이러스들은 감수성 있는 세포를 감염시킬 수 있고, 요구하는 단백질가수 분해 활성를 나타내는 세포에서이 복제는 감염성 자손들을 생성한다. 요구하는 단백질가수분해 활성을 트랜스펙트된 세포의 상징액에 제공하는 대안으로서, 예를들면, NDV를 허용하고, 상기 단백질가수분해 활 성을 이미 발현하는 세포를 사용하는 것이 가능하다. 이런 세포주는 외인성 단백질가수분해 활성을 첨가 하지 않고 감염성 렌토제닉 NDV을 생성하는데 쓰일 수 있다. 이런 세포주는 또한 상기 활성을 구체화하 는 유전자로 세포주를 안정하게 트랜스팩트시켜 생성될 수 있다. 더우기, 바이러스 엔벨로프에서 야생형 F 단백질을 발현하는 안정하게 트랜스팩트된 세포주를 생성하는 것이 가능함에 의해, 세포안으로 들어가 는 수단으로 감염성 입자들(야생형 F 단백질을 코드화하는 유전적 정보를 그 자체로는 제공하지 않는)을 생산하는 것이 가능하다. 감염성 렌토제닉 바이러스의 구출은 NDV 헬퍼바이러스로 트랜스팩트된 세포를 감염시켜서 할 수 있다. 이런 헬퍼바이러스에 대한 필수적인 요구사항은 예를들면, 헬퍼바이러스를 제거 하고 렌토제닉 바이러스와 반응하지 않는 항체들을 중화하는 방법으로 선별될 수 있다. 결론적으로, 3가 지 기본적 NDV 단백질(NP, P, L) 중 한개, 두개 또는 세개를 발현하는 안정하게 트랜스펙트된 세포주를 축조할 수 있다. 이런 세포주들은 3가지 기본 단백질의 서브세트 만의 공-발현을 요구하거나 또는 감염성 복사체 바이러스 생성을 도와주는 공-발현을 전혀 요구하지 않는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 트랜스팩팅에 사용되는 상기 세포들이 닭 1차 또는 2차 세포 또는 세포 주에서 유래되는 방법을 제공한다. 본 명세서는 일반적으로 대부분의 생체외 세포들로, LaSota 균주 같 은 NDV의 Fo 단백질의 절단에 요구되는 적절한 단백질가수분해 효소가 결여된, 예를들면 CER 또는 CER 세 포를 제공한다. 그러나, 다른 조류에서 유래된 세포들도 사용될 수 있다. 본 발명은 세포를 예를들면 도 3에서 나타낸 상기 바이러스의 클론된 전체 길이 또는 게놈성 길이 cdna를 트랜스펙션하는 단계를 포함하고 그리고 상기 바이러스의 Fo 단백질을 절단할 수 있는 단백질가수분해 활 성이 있는 성장배지에서 상기 세포를 배양하는 단계를 더 포함하고, 상기 세포를 배양하여 감염성 바이러 스를 회수하고, 상기 배양된 세포에서 유래된 물질을 발육란의 요막 강에 접종하는 단계를 더 포함하는, 감염성 복사체 뉴캐슬병 바이러스를 생성하는 방법을 제공한다. 예를들면, 상기 물질은 세포 또는 세포 조각, 또는 상기 세포 배양물에서 유래된 (채취되거나 또는 동결-해동된) 상징액으로 구성된다. 예를들어, 본 발명은 감염성 바이러스를 회수하는 방법을 기재하고 있는데, 이 방법에서 트랜스펙트된 CEF 단층의 상징액은 발육란의 요막 강에 접종된다. 4일 후에, 요막액을 채취하여 적혈구 응집 분석법으 로 분석한 후에, 발육란에서 더 계대배양한다. 또한, 본 발명은 요막액을 수확하고 발육란을 재접종하여 상기 감염성 복사체 뉴캐슬병 바이러스를 계대 시키는 단계를 더 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서는, 이 방법에서 상기 바이러스가 렌토제닉 바이러스, 예를들면 NDV의 비- 독성 야외에서 유래되거나, 또는 NDV LaSota 균주 같은 NDV의 백신으로부터 유래된 바이러스이다. 더우 기, 이 방법은 한개 이상의 변이, 결실, 및/또는 삽입 또는 다른 변형들의 도입을 허용하는 유전학적 변 형에 의해 조류-파라미쏘바이러스 게놈을 변형하는 방법이다. 예를들면, 이 방법은 예를들어 V 단백질 같은 바이러스 단백질을 코드화하는 cdna를 변형하고 그리고 상기 변형된 cdna를 전체 길이의 cdna로 클 론하고 상기 전체 길이의 cdna로부터 감염성 복사체 바이러스를 생성하여, 새로운 NDV 균주들 또는 향상 된 특성들을 가진 새로운 약독화된 생백신을 생성하여 조류 파라미쏘바이러스의 독성을 약화시키거나 변 형시키는 방법이다. 유전자 생성물을 변형하여 약독화시키는 것과 별개로, 전사 및/또는 복제에 관련된 핵산을 변형하여 조류 -파라믹소 바이러스를 약독화시키는 것이 또한 가능하다. 이런 변형들은 광범위한 세포에서 생체외 및 생체내 모두에서 절단성이고 그리고 결과적으로 종래 백신균주 보다 더 면역원성인 F 단백질 같은 야생형 을 발현하는 약독화된 균주를 만들 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서는, 본 발명은 뉴캐슬병 바이러스 같은 조류 바이러스의 독성을 약화시키거나 변형시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 하기 절단 부위를 코드화하는 cdna를 변형하여 바이러스 단백 질의 프로테아제 절단 부위를 변형하는 단계를 포함하고, 또한 상기 cdna를 예를들어 뉴캐슬병 바이러스 의 게놈길이 cdna로 클론하고, 감염성 복사체 뉴캐슬병 바이러스를 생성하는 단계를 포함한다. 상기 절 단 부위는 예를들면 뉴캐슬병 바이러스의 F 또는 NH 단백질에서 프로테아제 절단부위이다. 일반적으로 약독화는 독성의 감소로 국한되지만, NDV의 상대적으로 비독성 균주를 사용하고, 이런 균주의 자손에 예 를들어, 강한 독성을 특정화된 세포타입에서 증가된 복제 경향을 제공함에 의해 독성을 제공하는 것이 가 능하다. 따라서, 분명한 독성 특징을 NDV에 제공하는 것이 이제 가능하다. 본 발명은 뉴캐슬병 바이러스 같은 조류 파라미쏘바이러스를 항원적으로 변형하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 적어도 한개의 면역지배적 에피토프를 장착하는 바이러스성 단백질의 적어도 일부를 코드화하는 cdna를 변형시키는 단계를 포함하고, 상기 cdna를 뉴캐슬병 바이러스의 게놈길이 cdna에 클론시키고, 감 염성 복사체 뉴캐슬병 바이러스를 생성시키는 단계를 더 포함한다. 본 발명은 예를들면 NDV(백신)의 감염성 복사체를 생산하는 방법을 사용하여 NDV를 변형시키는 방법을 제 공하고, 재조합 마커 NDV 백신을 생산하는 방법을 제공하며, 이 마커 백신은 완전히 가능하거나 또는 요 구되는 항원적으로 관련된 NDV 에피토프의 면역원성 스펙트럼을 포함하고, 그리고 혈청학적으로 관련된 에피토프 또는 마커가 재조합 기술로 제거되었기 때문에 야생형 NDV를 혈청학적으로 구분된다. 본 발명 은 NDV 같은 조류 파라미쏘바이러스의 항원성 구성을 변형하는 방법을 제공하여, 예를들어 조류 파라미쏘 바이러스 야외 균주들과 혈청학적으로 구별될 수 있는 생 NDV 마커 백신의 생산을 가능하게 한다. 한 구체예에서, 본 발명은 감염성 복사체 NDV를 제공하는데, 여기서 NDV의 NH 단백질은 예를들어 타입 2 또는 타입 4 조류 파라미쏘바이러스로부터 유래된 NH 단백질의 일부를 코드화하는 cdna와 상기 NH 단백질 의 일부를 코드화하는 cdna를 재조합함으로서 변형된다. 상기 하이브리드 HN 단백질은 그래서 얻어진 감 염성 복사체 NDV 균주에 대한 혈청학적 마커로서 작용하고, 따라서 조류 파라미쏘바이러스의 향성을 다른 59-7

8 세포 및/또는 조직으로 변화시키는 역활을 할 수 있다. 본 발명에 따른 이런 마커 균주들은 세계적인 상 업적 집단에서 NDV의 유행을 판단하는 귀중한 도구인 백신의 생산을 가능하게 한다. 더우기, 이런 마커 백신들을 대규모로 적용하여 감염된 집단들의 집중적인 스크리닝 및 박멸 공정에 의해 완전히 NDV를 없앨 수 있게 한다. 또한, 본 발명은 한개 이상의 다른 병원체에 대한 항원을 발현하고 그리고 다중 질병들에 대한 백신 접종 에 사용될 수 있는 감염성 복사체 NDV 균주를 생성하는 방법을 제공한다. 이런 감염성 NDV 바이러스는 예를들면 조류 인플루엔자(AI) (적혈구 응집소 (H5 및 H7), 뉴라미니다제), 조류 백혈증 바이러스(ALV) (env 단백질(gp85)), 닭 빈혈 바이러스(CAV) (VP1+VP2), 마레크 병 바이러스(MDV) (당단백질 B (gb), gh), 감염성 라린고트라케이티스 바이러스 (ILT) (gb, gh, gd), 감염성 부르살(brusal)병 바이러스(IBDV) (VP2 및 VP3), 칠면조 리노트라케이티스 바이러스 (TRT) (융합 (F) 단백질), 조류 파라미쏘바이러스-2,- 3,-6,(PMV) (F-단백질, 적혈구응집소 뉴라미니다제(HN),또는 기타 감염성 기관지염증 바이러스(IBV) (페 플로머 단백질, 뉴클레오프로테인), 레오바이러스(시그마 단백질), 아데노바이러스, 뉴모바이러스, 살모 넬라 장염 바이러스, 캄피로박터 제쥬니, 대장균, 보데텔라 아비움(종전의 알칼리 대변균), 헴피루스 파 라갈리나룸, 서역균, 오니토박테리움 리노트라케알레, 리에멜라(종전의 파스테렐라) 아나티페스티퍼, 미 코플라스마타 (엠. 갈리셉티쿰, 엠. 시노비에, 엠. 메레아그리디스, 엠. 아이오와에) 또는 아스퍼길리(에 이. 플라버스, 에이. 퓨미가투스)에서 얻어진 이종성 단백질를 코드화하는 이종성 cdna를 포함한다. 본 발명은 다른 가금류 병원체 유래의 항원 발현을 위해 백신 벡터로서 사용될 수 있는 조류 파라미쏘바 이러스 또는 그것의 유래된 균주들을 제공한다. 몇몇 특성들은 NDV를 호흡기 또는 장 질환에 대한 백신 접종을 위한 이상적인 백신 벡터로 만든다. 1) NDV는 발육란에서 높은 역가로 쉽게 배양될 수 있다. 2) 발육란에서 대량으로 NDV를 배양하는 것은 것은 비교적 비용이 싸다. 3) NDV 백신은 비교적 안정되고, 물 주기 또는 스프레이, 에어로졸 형성과 같은 대량 적용법으로 단순하게 투여될 수 있다. 4) NDV의 자연적 감염 경로는 호흡기 및/또는 소화기이고, 이것은 또한 많은 다른 가금류 병원체의 주요한 천연 감염경로 이다. 5) NDV는 순환하는 모계 항체가 존재함에도 불구하고 국소적인 면역성을 유도해 낼 수 있다. NDV는 강력한 항암효과(antineoplastic) 뿐만아리라 면역 자극 특징을 가지고 있다고 알려져 있다 (Schirrmacher et al., 1998) [Schirrmacher, V., Ahlert, T., Steiner, H.H., Herold-Mende, C., Gerhards, R. and Hagmuller E. (1998) Immunization with virus-modified tumor cells Seminars in Oncology 25: ]. NDV는 정상 인간세포에서는 생산적으로 복제를 할 수 없지만, 인간의 암세포를 선택적으로 NDV-매개하여 죽이는 것은 보고되었다. 국소적 NDV 치료후에, 바이러스 종양과 인간 종양 이 종이식편이 경감하는 것이 누드 마우스에서 관찰되었다. 이것은 종양 치료에서 NDV를 사용할 수 있게 한 다. 그러나, 문제는 이런 적용는 국소 치료에 제한된다는 것이다. NDV 감염은 인터페론, 케모킨, 다른 잠재적으로 중요한 유전자 생성물을 유도하고, 다형질 발현성 (pleiotropic) 면역-자극 특성을 종양세포에 도입한다. 이 개념은 NDV로 감염된 새로운 작용 표본으로 이루어진 자가 종양 세포 백신을 생산하는데 사용되고 있다. 이런 종류의 백신은 자가 종양 백신-NDV 또 는 ATV-NDV로 불리어진다(Schirrmacher et al., 1998). NDV 감염된 세포는 세포분열를 방해하는 감마선 조사로 비활성이 되지만, 감염된 세포의 세포질에서는 NDV 복제를 가능하게 한다. ATV-NDV를 환자에게 접 종한 후에, T-세포는 NDV로 유도된 케모킨을 통해서 모아진다. 이들 T-세포의 일부는 세포 표면에서 조 직적합성 복합체 클래스 I 분자와 복합체에서 종양-관련 항원 유래의 펩티드와 상호작용할 수 있는 T-세 포 수용체를 발현할 수 있다. 이 상호작용은 결과적으로 자가 종양세포을 특이적으로 사멸할 수 있는 세 포독성 T-세포 반응의 유도를 가져온다. 본 발명은 NDV 감염으로 유도된 케모킨과 면역자극 단백질의 레파토리와 양을 조절할 수 있게 한다. 본 발명은 이종 유전자를 삽입시키고 발현하기 위해 변형된 재조합 NDV를 생성하는 방법을 제공한다. 이런 재조합 NDV는 감염된 세포에서 면역 자극 단백질의 레파토리와 양을 변형시키는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 인간 인터페론, 케모킨, 또는 다른 면역 자극 단백질들을 코드화하는 유전자를 혼 입하고 발현하는 재조합 NDV를 제공한다. 상기 재조합 NDV는종래의 ATV-NDV 보다 훨씬 강력한 ATV-NDV를 생성하는데 사용된다. 예를들면: 사이토킨 INF-α, -β, TNF- α, IL-1, IL-6, 케모킨 RANTES IP-10; HSP, ACTH, 엔돌핀, inos, EPA/TIMP, NFkB 등의 다른 유전자이다. NDV의 다형질 발현성 면역 자극 특성 들은 감염성 질환에 대한 동물과 인간 백신 접종의 보조제로 사용될 수 있는 것이다. 본 발명의 한 구체 예에서, 감염 제제의 적절한 항원을 코드화하는 외래 유전자는 NDV게놈에 도입되고, 감염된 세포로 항원 및 면역 자극 단백질의 동시 발현은 감염성 제제에 대한 강력한 면역 반응을 유도할 것이다. 본 발명의 다른 구체예에서, NDV의 면역 자극 특성은 항원과 특이적인 면역 자극 단백질을 동시에 발현시키는 NDV 재조합제를 사용함에 의해 더욱 강화될 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서는, 본 발명은 인간 면역 결 핍 바이러스의 적당한 항원을 발현하는 NDV 재조합제를 단독으로 또는 면역 자극 단백질과 조합하여 사용 하여 AIDS 백신을 생성하는데 이용될 수 있다. NDV는 또한 감염성 질환에 대한 동물과 인간의 백신 접종 보조제로서 사용될수 있다. 본 발명의 한 구체 예에서, 감염성 제제의 적당한 항원을 코드화하는 이종 또는 외래 유전자는 NDV 게놈에 도입되고, 그리고 감염된 세포들에 의한 항원 및 면역 자극 단백질의 동시발현은 감염 제제에 대한 강력한 면역 반응을 유 발할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, NDV의 면역 자극 특징은 항원 및 특이 면역 자극 단백질을 동시에 발현하는 NDV 재조합체를 사용하여 더욱 강화될 수 있다. 더욱 바람직한 구현에세서, 본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스에 적당한 항원을 발현하는 NDV 재조합체를 단독으로 또는 면역 자극 바이러스와 조합시켜 사용하여 AIDS 백신을 생성하는데 사용될 수 있다. 또한 자가-제한 비-독성 (담체) 백신으로서 사용될 수 있는 조건부 치사 NDV 결실 돌연변이체를 생성하는 방법이 제공된다. NDV 결실 돌연변이체는 내부 세포막에서 NDV의 발아에 관련된 매트릭스(M) 단백질을 발현할 수 없도록 생성된 것이다. 본 발명은 여전히 세포를 감염시키고 그리고 세포-대-세포 전이를 통 하여 전염시킬 수 있는 M 단백질을 발현할 수 없는 표현형적으로 보완(complemented) NDV 균주를 제공한 다. 그러나, 돌연변이 바이러스는 비-보완 세포에서 감염성 자손을 생성할 수 없다. 이것은 표현형적으 로 보완 NDV 결실 돌연변이체가 환경에 전파될 수 없는 안전한 자가-제한 백신으로 사용될 수 있음을 보 여준다. 이 비-전파성 백신은 생백신의 가장 중요한 장점(예, 약효)을 사멸된 백신의 가장 중요한 장점 59-8

9 (예, 안전성)과 결합시킨다. 본 발명은 예를들면 발육란 또는 적절한 세포에 계대하여 또는 더 배양시킴에 의해 뉴캐슬병 바이러스, 또는 본 발명에서 제공하는 방법으로 얻을 수 있는 감염성 복사체 바이러스에서 유래된 그것의 유래 균주 를 제공한다. 예를들어, 독성을 약화시커거나 변형되거나, 항원적으로 변형된 이종성 한원을 발현하는 또는 비전염성이 거나 또는 그들의 조합의 감염성 복사체 뉴캐슬병 바이러스를 생성하는 적어도 한가지 방법을 변형된 NDV 가 제공된다. 여기서 본 발명은 분명한 독성 또는 항원적 특징들을 가진 것으로 특징지어진 NDV 백신을 제공하며, 이는 마커 백신 목적 및/또는 다른 병원체에서 유래된 이종 항원을 발현하고, 독성 및/또는 비-전파성 형태이 다. 그러한 백신은 사멸 또는 생백신일 수 있다. 바람직하기는 그러한 백신이 생백신이나, 본 발명에서 제공 하는 사멸 백신은 예를들면 무역의 제한이나 또는 질병 조절 당국에 의한 다른 제재 때문에, 생백신이 적 용될 수 없거나 또는 거의 적용되지 않는 조건에서는 바람직하다. 여기서 본 발명은 상기 혈청학적으로 적절한 면역 에피토프 또는 마커에 대한 항철를 검출하는 진단 방법 및 상응하는 테스트 키트를 제공하여, 가금류에서 다른 가금류 질환 및/또는 NDV를 조절 및/또는 박멸법 을 실행하는 수단과 방법을 제시한다. 본 발명은 야외 바이러스 및 종래-타입 백신에서 혈청학적으로 구 별될 수 있는 새롭고 효과적인 백신을 제공한다. NDV 마커 백신으로 불리우는 그러한 새로운 백신은 항 원적으로 적당한 NDV 애피토프의 완전히 가능한 면역원성 스펙트럼을 제공하고, 그리고 진단방법과 키트 를 동반하여 적용하여 야생형 NDV와 혈청학적으로 구별된다. 본 발명은 백신접종 되지 않은 동물과 본 발명에 따른 NDV 백신으로 백신 접종된 동물을 야생형 NDV에 감 염되거나 또는 변형되지 않은 메소제닉 또는 렌토제닉 NDV-백신 균주로 백신 접종된 동물들을 구별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 동물에서 적어도 하나의 시료(예를들면, 혈청, 혈액, 알 또는 누액) 취하고 그리고 상기 시료에서 야생형 또는 변형되지 않은 NDV로 발현되지만 본 발명에 따른 백신으로는 발현되지 않는 면역지배적 에피토프에 대한 항체 또는 마커의 존재를 검출하는 것으로 이루어진다. 본 발명은 상기 항체가 NDV의 HN 또는 F 단백질에 대한, 예를들어 본 명세서의 실험부에 기재된 하이브리 드 단백질인 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 예를들면, 가금류 특히 닭으로 이루어진 그룹에서 상 기 동물이 선택되는 진단 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 동물들을 혈청학적으로 구별하는 방법에 사용할 수 있는 진단 키트를 제공한다. 본 발명 의 한 구체예에서, 단순하고 빠른 적혈구 응집-저해(HI) 테스트는 백신 접종된 동물과 감염된 동물을 구 별하는데 사용된다. NDV의 HN의 완전한 구형 헤드가 다른 세로타입의 HN에 상응하는 부분으로 대체된 마 커 백신으로 백신처리한 동물은 항체를 NDV의 HN을 유도시키지 않으므로, NDV 비리온에 의한 적혈구 응집 반응을 억제하지 않는다. HI 테스트에서 마커 백신 비리온을 사용함에 의해, 하이브리드 HN 단백질에 대한 항체가 검출되고 그리고 백신 접종후 효율성의 측정에 사용될 수 있다. 대체물로서, NDV의 F 단백질에 대한 항체를 검출하는 ELISA가 백신 접종의 효율성을 측정하는 데 사용된다. HI 테스트와는 별도로, ELISA는 NDV의 HN에 대한 항체들의 존재를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 그러 한 테스트에 사용될 항원은 예를들면 재조합 DNA 기술들에 의해 발현된 NDV의 HN 또는 NDV의 HN 유래의 보존된 펩티드이다. 블로킹 ELISA가 또한 사용될 수 있다. 이 경우에, NDV의 HN의 보존된 에피토프들에 대한 하나 이상의 모노클로날 항체들은 경합하는 항체들이 백신 접종된 동물로부터의 시료들에 존재하는 지 아닌지를 결정하기 위해 사용된다. ELISA 테스트는 만약 마커 백신이 단지 키메라 HN 단백질을 함유 한다면 또는 NDV의 HN의 몇몇 에피토프들이 대체된 경우에 유익하게 사용될 수 있다. 본 발명은 제한할 의도 없이 하기의 실험부(실시예)에 의해 더 설명된다. 도면의 간단한 설명 도 1 전사벡터 poltv5는 Pattnaik et al.(1992)에 의해 기재된 전사벡터의 유도체이다. 상세한 구조는 텍스트 를 참조하라. 이 플라스미드는 T7 DNA-의존 RNA 폴리머라제 프로모터(고딕체)와 뒤이은 독특한 StuⅠ 및 SmaⅠ 제한 부위 및 헤파티티스 델타 바이러스(HDV)로부터의 자동촉매 리보자임을 함유한다. DNA 단편은 StuⅠ 및 SmaⅠ 부위 사이에 클론되며 T7 RNA 폴리머라제를 사용함에 의해 생체외 또는 생체내에서 전사 될 수 있다. 생성되는 전사물의 5' 말단은 삽입물에 의해 코드화 되지 않는 2개의 여분 G-잔기를 함유한 다. 리보자임의 작용으로, 전사물의 3' 말단은 삽입물의 마지막 뉴클레오티드에 정확히 대응한다. 도 2 미니게놈 플라스미드 poltv535(도 2a) 및 poltv553(도 2b)의 구조이다. 미니게놈 플라스미드는 전사 플라 스미드 poltv5(도 1)를 기초로 하며, 그리고 분비된 알카리성 포스파타제 (SEAP)를 코드화하는 유전자에 접하는 NDV 균주 LaSota 3' 영역(nt 1-119) 및 5' 영역 (nt )을 포함한다. T7 RNA 폴리머라 제에 의한 poltv535의 전사는 항-게놈성 RNA(또는 [+]-RNA)를 생성하는 반면, poltv553의 전사는 게놈성 RNA(또는 [-]-RNA)를 생성한다. 바이러스 전사 개시 및 종결 신호인 개시(S) 및 끝(E) 박스를 표시하였다. SEAP 유전자의 개시 코돈은 밑줄을 그었다. 또한, 길이가 각각 1 nt 다른 미니게놈 플라 스미드 (각각 poltv535n0-n5 및 poltv553n0-n5)를 생성하는 ClaⅠ-부위에 삽입(N0-M5) 서열을 나타내었다. 도

10 NDV 균주 LaSota의 게놈의 뉴클레오티드 서열 및 NDV 유전자의 추론된 아미노산 서열이다. 나타낸 서열 은 항-게놈성 가닥에 대응하며 ssdna 형태로 5' 에서 3' 방향으로 도시되어 있다. 본 도에 나타난 서열 은 전체 NDV 게놈에 산재하는 중복된 서브게놈성 cdna들의 두개의 독립 세트를 완전하게 서열화함으로써 결정된 컨센서스의 서열이다. 나머지 불명확함(아마도 PCR 오류의 결과로서)은 세번째의 독립 세트의 관 련된 부분을 서열화함으로써 해결할 수 있다. 중복된 서브게놈성 cdna 클론(도 4)으로부터 조립된 전체-길이 cdna 클론 pndfl+의 서열은 하기의 위치에 서 컨센서스 NDV 서열의 것과는 다르다(괄호안의 컨센서스 서열). nt 1755, G (A); nt 3766, A (G); nt 5109, G (A); nt 6999, T (C); nt 7056, G (A); nt 9337, G (A); nt 9486, A (T); nt 10195, T (C); nt 13075, A (G). 이들 차이는 3 아미노산을 변경을 가져온다 (괄호안의 컨센서스 서열); F 단백질, R 189 (Q); HN 단백질 S 200 (P) L-단백질 N 369 (I). 도 4 (A) 서브게놈성 중복 cdna 클론으로부터 전체-길이 NDV cdna를 조립하는데 사용되는 전체적인 전략. cdna는 NDV 균주 LaSota의 3' 및 5' 말단을 이미 포함하는 플라스미드 poltv535에 조립되었다(도 2 참 조). pndfl+로 명명된 생성된 플라스미드를 감염성 NDV의 생성에 사용하였다. (B) 서브게놈성 중복 cdna 클론으로부터 전체-길이 NDV cdna를 조립하는데 사용되는 상세한 콜로닝 방법. Cm은 표현형적 태그로서 일시적으로 도입된 클로람페니콜-내성 유전자를 표시한다(상세한 것은 텍스트를 참조). (C) 유전적으로 변형된 전체-길이 NDV cdna를 생성하기 위한 상세한 콜로닝 방법. 변형은 F 유전자에 도 입되고 그리고 F 단백질의 단백질가수분해 절단 부위의 아미노산 서열의 변형을 가져오는 3 뉴클레오티드 변경으로 이루어져 있다 (상세한 것은 텍스트를 참조). 도 5 (A) poltv535-시리즈 T7 RNA 폴리머라제에 의한 전사는 세포에 의해 SEAP 단백질로 직접 번역될 수 있는 항-게놈성 RNA (또는 [+]-RNA)를 생성한다. 헬퍼 바이러스로 세포를 감염시킨 후(또는 NP, P 및 L로 코드화한 플라스미드의 공-트랜스펙션 후), 항-게놈성 RNA를 게놈성 RNA(또는 [-]-RNA)의 합성을 위한 바이러스성 폴리머라제 복 합체에 의해 사용된다. 그리고 나서, 게놈성 RNA를 mrna(특이적 전사 개시(S) 및 끝(E) 박스를 사용함에 의해) 및 항-게놈성 RNA 모두를 합성하기 위한 바이러스성 폴리머라제 복합체에 의해 사용된다. (B) poltv553-시리즈 T7 RNA 폴리머라제에 의한 전사는 SEAP 단백질로 번역될 수 없는 게놈성 RNA (또는 [-]-RNA)를 생성한다. 헬퍼바이러스로 세포를 감염시킨 후(또는 NP, P 및 L로 코드화한 플라스미드의 공-트랜스팩션 후), 게놈 성 RNA는 mrna(특이적 전사 개시(S) 및 끝(E)박스를 사용함에 의해) 및 항-게놈성 RNA 모두를 합성하기 위한 바이러스성 폴리머라제 복합제에 의해 사용된다. 도 6 NDV LaSota 및 기타 파라미쏘바이러스의 헥산 서열 5' 말단의 배열이 Rubulavirus 속의 4 멤버, Paramyxovirus 속의 3 멤버, 및 Morbillivirus 속의 3 멤버와 NDV의 서열 비교로서 제시하였다. 서열을 L 유전자 말단 박스에서부터 5' 말단으로 (3' - 5' cdna) 제시하였다. NDV, 뉴캐슬병 바이러스; hpiv2, 인간 유사인플루엔자 바이러스 2; MuV, 이하선염 바이러스; SV5 및 SV41, 각각, 심미안(simmian) 바이러스 5 및 41; SeV, 센다이 바이러스; bpiv3, 및 hpiv3 각각, 소 및 인 간 파라인플루엔자 바이러스; CDV, 개 디스템퍼 바이러스; MeV 마진 바이러스; RPV, 우역 바이러스. 전체 게놈 뉴클레오티드(nt) 서열을 다음과 같이 얻었다 (수탁번호); NDV(AF077761); hpiv2(x57559); MuV(AB000388); SV5(AF052755); SV41(X64275); bpiv3(d84095); hpiv3(z11575): CDV(L13194); MeV(X16565); RPV(Z30697). 실시예 실험부 재료 및 방법들 표준 클로닝 과정들은 다른 언급이 없다면 Sambrook et al. (1989)에 따라 수행하였다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의하여 생산된 DNA 단편들을 포함하는 모든 축조는 서열 분석에 의해 증명하였다. 하기에 주어진 프라이머 서열들에서, 밑줄친 뉴클레오티드들은 NDV 서열들에 대응하고 그리고 NDV 게놈내의 위치 가 지적되어 있다. 클로닝에 사용된 제한 부위들의 뉴클레오티드 서열은 굵은 활자로 표시되어 있다. 세포 및 바이러스 CER 세포들 (Smithe et al., 1976)은 5% 태아 소 혈청 및 1000U/ml 페니실린, 1000μg/ml 스트렙토마이신, 20μg/ml 펀자존(Fongizone), 500μg/ml 폴리마이신 B 및 10μg/ml 카나마이신을 함유한 2% 항생제 혼합물을 함유하는 GMEM/EMEM(1:1)에서 배양되었다. QT35 세포들(Moscovici et al., 1977; Cho, 1982)은 5% FCS 및 2% 항생제 혼합물로 보충된 GibcoBRL/Life Technolohies (cat.no ; Fort Dodge의 독점 조성 물)에 의해 공급되는 배지에서 배양되었다. QM 세포들(Antin and Ordahl, 1991)은 10% 트립토스 인산염 브로스, 10% FCS 및 2% 항생제 혼합물로 보충된 M199 배지에서 배양되었다. NDV 균주 LaSota는 ATCC (ATCC VR-699)로부터 수득되었고 그리고 발육란에서 두번 계배배양 하였다. 우 리가 cdna의 축조 및 클로닝을 시작하기 전에, 이 바이러스는 초기 닭 배아 피브로블라스트 (CEF)상에

11 라운드 플라크 정제에 의해 정제된 플라크였다. 이 때문에, 이 바이러스는 5% 태아 소 혈청, 2% 항생제 혼합물, 5% 요낭액, 30mM MgCl 2, 200μg/ml DEAE-덱스트린 (Sigma) 및 0.8% 한천 Nobel (Difco)를 함유하는 GMEM/EMEM(1:1)에서 배양된 CEP 세포들 위로 적정하였다. 플라크 정제의 세번째 라운드로부터의 바이러 스 (클론 E13-1로 지정된)를 발육란에서 배양하였고 그리고 접종 4일 후, 요낭액을 수확하고 -70 에서 분취량으로 저장하였다. T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 계두 재조합 바이러스 fpeflt7pol (Britton et al., 1996; 이후부터는 FPV-T7로 칭함)은 Michael Skinner 박사로부터 제공되었고 QT135 세포상에서 배양 하였다. 바이러스성 RNA의 단리 모든 조작은 RNase가 없는 유리제품 및 플라스틱 제품에서 수행되었고 그리고 모든 용액들은 1% 디에틸- 피로카보네이트 (DEPC)로 처리되고 오토클레이브로 살균된 RNase-없는 물로 구성되었다. 바이러스를 Beckman SW40 로터에서 40, 21000rpm에서 70분간 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 이 펠렛을 균질화 완 충액 (50mM Tris HCl ph7.5, 50mM EDTA, 0.5% SDS)에 재현탁했고 일정한 교반을 하면서 37 에서 90분간 프로테아제 K(200μg/ml)로 처리하였다. 용균물(lysate)을 ph 5.4의 페놀/클로로포름 (1:1)의 동일 용량 으로 두번 그리고 클로로포름의 동일 용적으로 한번 추출하였다. 바이러스성 RNA를 ph 5.3의 3M NaOAC 0.1 용량 및 100% 에탄올 2.5 용량의 첨가로 수(')상으로부터 침전하였다. 침전물을 원심분리로 모았고, 70% 에탄올로 한번 세척하였고, 물에 재현탁했고 그리고 -70 에서 분취량으로 저장하였다. 역 전사 바이러스성 RNA(1.5μg)을 12μl 용적에서 500ng의 프라이머와 혼합했고 그리고 70 에서 10분간 배양하였 다. 5 RT 완충액 4μl (250mM Tris-HCl, ph 8.3, 375 mm KCl, 15mM MgCl 2 ; GibcoBRL/Life Technologies), 0.1M DTT 2μl 및 10mM dntp들(각각 2.5mM) 2μl을 첨가했고 혼합물을 42 에서 2분간 배양하였다. 역 전 사는 최종 20μl 용적에서 역 전사효소 (Superscript II; GibcoBRL/Life Technolohies)의 200 유니트를 첨 가하고 42 에서 60분간 인큐베이트함에 의해 수행하였다. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) NDV 게놈의 3' 및 5' 말단을 결정하기 위해 사용되었던 모든 PCR 반응들을 (하기 참조) Taq DNA 폴리머라 제 (Perkin Elmer)를 사용함에 의해 수행하였다. 개개의 NDV 유전자들 및 대 서브게놈성의 cdna들을 클 로닝하기 위하여, 교정(proofreading) DNA 폴리머라제 Pwo, 또는 Taq 및 Pwo의 혼합물들 (Expand High Fidelity Kit 또는 Expand Long Template Kit)을 공급자의 지시에 따라 사용하였다 (Boehringer Mannheim). 모든 시료들을 PCR 사이클의 지시된 수를 시작하기 전에 94 에서 2분간 인큐베이트 하였다. 지시된 수의 PCR 사이클 후에, 시료들을 적어도 3 PCR 사이클의 신장시간 동안 신장온도에서 인큐베이트 하였다. PCR 단편들을 고 순도 PCR 생성물 정제 키트 (Boehringer Mannheim)를 사용함에 의해 또는 아가 로스 겔 전기영동 후에 공급자들에 의해 기재된 바와 같이 QiaexII 추출 키트 (Qiagen)을 필수적으로 사 용함에 의해 직접적으로 정제하였다. 서열 분석 모든 서열은 PRISM Ready Reaction Dye Deoxy 터미네이터 사이클 서열화 키트 (Perkin Elmer)를 이용하여 결정하였다. 반응 혼합물들(5μl)은 GeneAmp2400 열순환기에서 25 사이클의 선형 증폭(94 에서 10초, 50 에서 5초, 및 60 에서 4분)을 했다. 연이어서, 이 반응 혼합물들을 에탄올로 침전시키고, 70% 에탄올 로 한번 세척하고, 15μl TSR 완충액(Perkin Elmer)에 재현탁하고, 그리고 Applied Biosystems AB310 자동 서열화기에 로딩하기 전에 94 에서 2분간 가열하였다. NDV 균주 LaSota의 완전 게놈을 서열화하기 위해 사용된 프라이머들의 뉴클레오티드 서열들은 공개된 서 열들 또는 서열화 프로젝트 동안에 수립된 서열들로부터 유래된 것이었다. 이 프라이머들은 표1에 도시 되어 있다. NDV 균주 LaSota 게놈의 3' 및 5'의 클로닝 및 서열화 NDV 게놈의 3' 및 5' 말단의 뉴클레오티드 서열을 RACE 과정들 (cdna 말단들의 신속한 증폭)을 사용하여 결정하였다. NDV RNA를 NDV의 L-유전자의 공개된 서열로 (Yousoff et al., 1987)부터 유래된 프라이머 p360(5'-ggcgatgtaatcagcctagt-gctt-3', nt )을 사용하여 20μl의 최종 용량으로 역전사 반응 에 이용였다. 단일-가닥 cdna (RT 혼합물 2.5μl)를 8pmol 앵커프라이머(anchorprimer) ALG3 (5'- CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC-3')에 첨가하였고, Tessier 등(1986)에 의해 기재된 바와 같이, 실온에 서 50mM Tris-HCl ph 8.0, 10mM MgCl 2, 10μg/ml BSA, 25% PEG, 1mM HCC, 20μM ATP 및 T4 RNA 리가제 10 유니트 (New England Biolabs)을 함유하는 반응 혼합물 20μl에서 밤새 연결시켰다. 연결 반응물 1μl를 프라이머 p375 (5'-CAATGAATTCAAAGGATATTACAGTAACT-3'; nt ) 및 ALG4 (5'-GAAGGATCCA- GAATCGATAG-3')를 이용하는 PCR 반응에서 주형으로 사용하였다. 후자의 프라이머는 앵커프라이머 ALG3에 상보적이다. PCR 조건 (40 사이클)은 다음과 같다: 94 에서 1분, 55 에서 1분, 및 72 에서 2분. PCR 생성물들은 정제하고 T-벡터 pbluescriptii-tsk에서 클론하였다 (Inchihara and Kurosawa, 1993). 또한, 정제된 PCR 생성물들을 블런트 말단을 만들기 위하여 Klenow DNA 폴리머라제 I으로 처리하고 플라스미드 pgem4z의 HincII-부위에 클론하였다 (Promega). 13개의 독립 클론들 (8 pbleuscriptii-tsk 및 5 pgem4z)를 NDV 균주 LaSota 게놈의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 서열화했다. 3' 밀단 의 뉴클레오티드 서열은 두개의 독립된 방법으로 결정했다. 방법 I에서, 프라이머 ALG3이 Schutze 등 (1995)에 의해 기재된 바와 같이 T4 RNA 리가제를 사용함에 의해 바이러스성 RNA의 3' 말단에 연결되었다. 반응 혼합물 (최종 용량 10μl)은 2.5μg NDV RNA, 100pmol ALG3, 1μl 10 T4 RNA 리가제 완 충액 (500mM Tris-HCl ph 7.8, 100mM MgCl 2, 100mM DTT, 10mM ATP), 1μl DMSO, 1μl 10μM 헥사민-코발트클 로라이드, 1μl RNasin (Promega) 및 T4 RNA 리가제 10 유니트 (New England Biolabs)를 함유했다. 이 혼 합물을 실온에서 밤새 인큐베이트했고 연결 혼합물 5μl를 ALG4를 프라이머로 사용함에 의한 역 전사 반응 에서 주형으로 사용하였다. RT-반응의 1μl를 프라이머 ALG4 및 NDV의 3' 말단의 공개된 서열로부터 유래 된 p376 (5'-GAGCCTTAAGGAGCTGC-TCGTACTGATC-3'; nt )를 사용함에 의한 PCR 반응에 사용하였다 59-11

12 (Ishida et al., 1986). PCR 조건은 5' RACE에 대해 상기에서 언급한 바와 같다. 방법 II에서, NDV RNA 의 3' 및 5' 말단을 상기 방법 I에서 기재된 바와 같은 동일한 조건들을 이용하는 T4 RNA 리가제를 사용 함에 의해 서로서로 연결하였다. 이 연결 혼합물 5μl를 프라이머 p360을 사용함에 의한 역 전사 반응에 서 주형으로 사용하였다. RT-반응물의 1μl를 프라이머 p375 및 p376을 사용하는 PCR 반응에 사용하였고 PCR 조건은 5'-RACE에서 언급한 바와 같았다. PCR 생성물들을 블런트 말단을 만들기 위하여 Klenow DNA 폴리머라제 I으로 처리하고 플라스미드 pgem4z의 HinDII-부위에 클론하였다 (Promega). 10개의 독립 클 론들 (방법 I에서 4개 및 방법 II에서 6개)을 NDV 균주 LaSota 게놈의 3' 말단의 뉴클레오티드 서열을 결 정하기 위해 서열화했다. 전사 벡터의 축조 저-복사-수 전사 벡터를 기본 리플리콘으로서 플라스미드 pok12 (Vieira and Messing, 1991)을 사용하여 축조하였다. 플라스미드 pok12을 PvuII로 소화했고 복제 기원 및 카나마이신-내성 유전자를 함유하는 DNA 단편을 분리하였다. 이 DNA 단편을 전사 벡터 2.0 (Andrew Ball 박사의 선물; Pattnaik et al., 1992)의 유래의 Eco47III-AflII 단편 (AfIII 부위는 Klnenow DNA 폴리머라제 I을 사용하여 블런트로 만들 었다)에 연결하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드으로부터 XbaI-NheI 단편을 가능한한 더 독특한 제 한 부위들을 제거하기 위하여 삭제하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드를 poltv5로 명명하였다 (도5 참조). 전사 벡터 poltv5는 T7 DNA 의존 RNA 폴리머라제 프로모터와 뒤이은 독특한 StuI 및 SmaI 제한 부위들, 헤파티티스 델타 바이러스 (HDV) 유래의 자동촉매성 리보자임 및 박테리오파지 T7 유래의 전사 종결 시그널을 함유한다. StuI 및 SmaI 제한 부위 사이에 클론된 DNA 단편들은 T7 RNA 폴리머라제를 사 용하여 생체외 또는 생체내에서 정사될 수 있다. 전사 후, 결과적으로 생성되는 전사체들의 5' 말단은 플라스미드에 의해 코드화되는 두개의 G 잔기를 함유한다. HDV 리보자임의 자동촉매 작용때문에, 이 전 사체들의 3'-말단은 클론된 DNA 단편의 정확한 말단 뉴클레오티드에 대응한다 (Pattnaik et al., 1992). 미니게놈 플라스미드의 축조 NDV의 복제 및 전사를 위한 요구조건들을 시험하기 위하여, 모든 NDV 유전자들을 대체한 리포터 유전자에 접하는 NDV의 3' 및 5' 말단 영역들을 함유한 미니게놈 플라스미드들을 축조하였다 (도 2). NDV의 3' 및 5' 말단 영역에 상응하는 DNA 단편들을 Pwo DNA 폴리머라제 (30 사이클: 94 에서 15초, 50 에서 30초, 및 72 에서 30초)을 사용하여 그리고 주형으로서 3' 및 5' RACE 단편들을 함유하는 플라스미드들을 사용 하여 PCR에 의하며 생산했다 (상기 참조). 3' 영역 (nt 1-119)을 프라이머 3UIT (5'-ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3', nt 1-27) 및 SEAP3 (5'- ATCGATACTGGTCAGCATGCTGGCAGAAGGCTTTCTCG-3', nt )를 사용함에 의해 생산했다. 5' 영역 (nt )을 프라이머 SEAP5 (5'-GC-ATGCTGACCAGTATCGATATTACAGTAACTGTGACT-3', nt ) 및 5NDV (5'-ACCAAAC-AAAGATTTGGTGAATGACGA-3', nt )를 사용함에 의해 생산했다. 두 개의 DNA 단편들을 프라이머 3UIT 및 5NDV를 사용하여 중복 PCR (중복은 상기에서 도시된 프라이머 서열들에서 이 탤릭자로 도시되어 있다)에서 합쳤다. 결과적으로 생성되는, 20 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있는 NDV 의 3' 및 5' 말단의 융합인 DNA 단편을 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 처리함에 의해 인산화하였고 그리 고 StuI 및 SmaI으로 절단하고 송아지 장내 포스파타제로 탈안산화된 (Boehringer Mannheim) 전사 플라스 미드 poltv5 (도 1)에서 양 방향으로 클론하였다. 마지막으로, SEAP-유전자 (분비된 알카리성 포스파타 제)를 SphI 및 ClaI으로 소화함에 의해 플라스미드 pseap-basic(clonetech)으로부터 회수했고 그리고 NDV 의 3' 및 5' 말단 사이의 SphI와 ClaI 부위 사이에 클론하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드들을 각 각 poltv535 및 poltv553으로 명명하였다. 플라스미드 poltv535의 T7 RNA 폴리머라제를 사용하는 생체내 또는 생체외 전사는 항-게놈성 RNA([+]-RNA)를 발생하는 반면에, 플라스미드 poltv553의 전사는 게놈성 RNA([-]-RNA)를 발생한다. 플라스미드 poltv535no 내지 -N5 및 poltv553n0 내지 -N5를 각각 poltv535 및 poltv553내의 SEAP-유전자 와 NDV의 5' 말단 사이에 위치된 ClaI-부위에 자기-상보적 올리고뉴클레오티드를 삽입함에 의해 생산하였 다 (도 2 참조). 사용된 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다: NO, 5'-CGCGAGCTCG-3'; N1, 5'- CGCGAGSCTCG-3'; N2, 5'-CGCGAGCGCTCG-3'; N3, 5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; N4, 5'-CGCGAGCATGCTCG-3'; N5, 5'- CGCGAGCASTGCTCG-3' (W=A 또는 T; S=C 또는 G). 플라스미드 poltv535 및 poltv553내의 T7 프로모터의 변형 NDV의 진정한 5' 및 3' 말단을 함유하는 전사체들을 생체외 또는 생체내에서 생산하기 위하여, 플라스미 드 poltv535 및 poltv553의 T7 프로모터를 전사가 NDV의 3' 또는 5' 말단의 첫번째 뉴클레오티드에서 개 시하도록 변형하였다. 프라이머들은 다음을 함유하게 디자인했다: 1) BglI-제한 부위, 2) T7 프로모터의 말단의 두개의 G 잔기들이 A 잔기로 대체되게 변형된 T7 프로모터의 서열 (이탤릭체로 도시됨), 및 3) NDV의 3' (nt 1-21) 또는 5' 말단 (nt ). 프라이머 BGL3F2 (5'- GATATGGCCATTCAGGCTTAATACGACTCACTATAACCAAACAGAGAATCCGTGAG-3') 및 SEAP3 (상기 참조)를 변형된 T7 프로 모터 및 poltv535의 SEAP 유전자의 개시점까지 NDV의 3' 말단 전체를 함유하는 DNA 단편을 생산하기 위해 사용하였다. 유사하게, 프라이머 BGL5F2 (5'- GATATGGCCATTCAGGCTTAATACGACTCACTATAACCAAACAAAGATTTGGTGAATG-3') 및 SEAP5를 사용함에 의해 변형된 T7 프로모터 및 poltv553의 SEAP 유전자의 끝까지 NDV의 5' 말단 전체를 함유하는 DNA 단편을 생산하였다. 결과적으로 생성되는 단편들을 각각 BglI 및 SphI (3' 말단) 또는 BglI 및 ClaI (5' 말단)으로 소화하였 고, 그리고 poltv535의 BglI-SphI 단편 또는 poltv553의 BglI-ClaI 단편을 대체하기 위하여 사용하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드들을 각각 poltv735 및 poltv753으로 명명하였다. 플라스미드 poltv735n3 및 poltv753n3을 각각 poltv735 및 poltv753에서 SEAP-유전자 및 NDV의 5' 말단 사이에 위치 한 ClaI 부위에 자기-상보적인 올리고뉴클레오티드 (5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; W=A 또는 T)를 삽입함에 의해 생산하였다. SEAP-리포터 플라스미드의 축조 플라스미드 pcineoseap를 진핵 발현벡터 pcineo (Promega)의 XhoI 및 SmaI 부위들 사이에 플라스미드 pseap-basic (Clontech) 유래의 SEAP-유전자를 함유하는 XhoI-ClaI 단편 (ClaI-부위는 Klenow DNA 폴리머 59-12

13 라제 I에 의해 블런크로 만들었다)을 클로닝함에 의해 축조하였다. 후자의 박테리오파지 T7 프로모터에 더하여 인간 시토메갈로바이러스 (hcmv)을 함유한다. 단지 T7 프로모터로부터 생산된 전사체들에 의한 SEAP 발현을 시험하고 정량하기 위하여, 또 다른, hcmv 프로모터가 부족한 플라스미드를 축조하였다. 이 때문에, hcmv 프로모터를 HindIII로 부분적으로 소화하고 이어서 BglII로 완전히 소화함에 의해 pcineo로 부터 제거하였다. hcmv 프로모터가 제거된 DNA 단편(Clontech의 번호에 따르면 nt )을 단리하고, 블런트 말단을 만들기 위해 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고 그리고 T4 DNA 리가제를 사용함에 의해 재원형화하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드를 pcineod로 명명하였다. 마지막으로, SEAP 유 전자를 MluI-AccI 단편으로서 pseap-basic으로부터 회수했고, 그리고 pcineod의 MluI 및 ClaI 부위 사이 에 클론하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드를 pcineod SEAP로 명명했다. 트랜스팩션 세포들을 24-웰 배양 디쉬에 접종하고 60-80% 컨플루언시(confluency)로 밤새 배양하고 그기고 37 에서 1시간 동안 FPV-T7를 가지고 1 m.o.i로 감염시켰다. 이 세포들을 기본적으로 공급자 (GibciBRL/Life Technologies)에 의해 기재된 바와 같이 LipofectAMINE TM 3μl 및 OptiMem을 사용함에 의하여 0.5μg 미니게 놈 플라스미드 DNA로 트랜스펙트시켰다. 37 에서 4시간 (CER 세포들) 또는 16시간 (QM5 세포들)동안 인 큐베이트한 후, 세포들을 NDV (네덜런드 감염성 단리체 nr ;웰당 200μl)를 가지고 1시간 동안 5 m.o.i.로 감염시키거나 또는 감염되지 않는채로 남겨두었다. 접종물을 흡입기로 빨아내고 완전 배지 1ml 로 대체했고 그리고 세포들을 37 에서 더 인큐베이트하였다. 공-트랜스펙션을 의하여, 세포들을 6-웰 배양 디쉬에서 배양하였고 그리고 상기에서 언급된 바와 같이, FPV-T7로 감염시켰다. 세포들을 8μl의 LipofectAMINE 또는 9μl의 FuGene TM 6 (Boehringer Mannheim)을 이용함에 의해 0.25μg 미니게놈 플라스미 드 DNA, 0.4μg pcineonp, 0.2μg pcineop 및 0.2μg pcineol(c) 또는 pcineo로 공-트랜스펙트하였다. 감염 성 바이러스를 생산하기 위하여, 미니게놈 플라스미드를 전체-길이 NDV cdna를 함유한 전사 플라스미드에 의해 대체하였다. SEAP 활성의 정량화 트랜스펙트된 세포의 배지로 분비된 SEAP의 양을 분비된 기본적으로 공급자(Tropix)에 의해 기재된 바와 같이 알카리성 포스파타제 키트를 위한 Phospha-Light TM Chemiluminescent Reporter Assay를 이용함에 의 해 일회용 96-웰 플레이트에서 측정하였다. 화학발광을 액체 섬광 계수기 (Wallac 1450 microbeta PLU S)를 사용하여 정량하였다. NDV 균주 LaSota의 전체 게놈에 산재하는(spanning) cdna들의 클로닝 및 서열화 NDV 균주 LaSota의 전체 게놈을 클론하고 서열화하기 위하여, 대( 大 ) 서브게놈성 cdna 클론들을 RT-PCR에 의해 생산하고 pgem-t에 클론하였다. 첫번째 가닥 cdna 합성을 상기에 언급된 바와 같이 프라이머 3UIT 를 사용하여 수행하였고, 그리고 RT반응물 1μl를 Expand Long Template PCR 키트 (Boehringer Mannheim) 을 사용함에 의한 PCR 반응에 사용하였다. PCR은 94 에서 10초, 58 에서 30초 및 68 에서 6분의 5 사 이클, 뒤이어 94 에서 10초, 58 에서 30초, 및 68 에서 6분의 10 사이클로 구성되었고, 여기서 68 에 서 연장 시간이 사이클마다 20초로 증가했다. PCR 단편들을 기본적으로 공급자 (Promega)에 의해 기재된 바와 같이 pgem-t 클로닝 키트를 사용함에 의해 pgem-t에 클론했다. 연결 혼합물들을 E. coli 균주 SURE II (Stratagene)으로 형질전환했다. 두개의 독립된 RT-PCR 반응 (A 및 B)을 수행했고 그리고 각각 유사 세트의 cdna 클론들을 산출했다. 서브게놈성 cdna 클론들의 뉴클레오티드 서열을 NDV-특이적 프라이머들 (표1)을 사용함에 의해 그리고 삽입체들에 접해있는 프라이머들에 의해 결정했다. A 및 B 시리즈의 클론 들의 뉴클레오티드 서열을 비교후, 남아있는 불명료함은 세번째 독립된 시리즈 (C 시리즈)의 cdna들의 관 련 영역을 서열화함에 의해 해결되었다. NDV 균주 LaSota의 뉴클레오티드 서열은 도3에 도시되어 있다. NDV의 전체 길이 게놈성 cdna의 축조 전체-길이 NDV cdna를 개시 플라스미드로서 poltv535를 사용함에 의해 전사 플라스미드 poltv5에 조립하 였다. DNA 단편들을 도4에 도시된 바와 같이 통상의 제한효소들을 사용하여 중복에 연결했다. 시리즈의 클로닝 단계들에서, 위치 3512 및 12355의 ClaI-부위들을 연결하여 생성된 ClaI-부위에 의해 분리된 뉴클 레오티드 및 을 함유하는 플라스미드 (p535-di로 명명된)를 축조했다. 또 다른 시리 즈의 클로닝 단계들에서, 뉴클레오티드 (ClaI 단편)을 포함하는 NDV 게놈의 일부를 함유하는 플라스미드 (pgem-b로 명명됨)을 축조하였다. 클로닝을 촉지하기 위하여, 후자의 ClaI 단편을 플라스미 드 pacyc184 (Chang and Cohen, 1978) 유래의 클로람페니콜 내성(Cm) 유전자로 태그하였다. 이 때문에, Cm-유전자를 프라이머 CAT-F (5'-GCGTACGTCTAGACTGGTGTCCCTGTTGATACCGG-3') 및 CAT-R (5'- GCTCTAGACGTACGACCCTGCCCTGAACCGACG-3')를 사용함에 의한 PCR에 의하여 pacyc184로부터 회수하였다. 이 PCR은 Pwo DNA 폴리머라제로 수행하였고 94 에서 30초, 60 에서 45초 및 72 에서 60초의 30 사이클로 구성되었다. 결과적으로 생성되는 PCR 단편들은 BsiWI로 소화하였고 pgem-b(cat)를 산출하는 pgem-b의 독특한 BsiWI 부위에 클론했다. pgem-b(cat) 유래의 ClaI 단편을 pndfl(cat)를 산출하는 p535-di의 독특 한 ClaI 부위에 클론했다. 마지막으로, Cm-유전자를 BsiWI로 소화함에 의해 뒤이어 재연결 및 E.coli 균주 DH5a의 형질전환에 의해 이 플라스미드로부터 제거하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드를 pndfl+로 명명했고 T7 프로모터 사이에 클론된 전체 NDV cdna 및 전사 플라스미드 poltv5의 HDV 리보자임 을 함유한다. 개개의 NDV 유전자의 클로닝 및 발현 각각의 NDV 균주 LaSota 유전자들을 함유하는 DNA 단편들을 RT-PCR에 의해 생산하고 pcineo에 클론했다. 클로닝 후, 모든 단편들을 삽입체들에 접해있는 프라이머들을 이용함에 의해 그리고 유전자-특이적 프라 이머들을 이용함에 의해 서열화했다. NP-유전자:프라이머 386 (5'-GAGCAATCGAAGTCGTACGGGTAGAAGGTG-3', nt 40-69)를 역 전사를 위해 사용하였다. 프라이머 365 (5'-GTGTGAATTCCGAGTGCGAGCCC-GAAG-3'; nt 77-94) 및 892 (5'-TTGCATGCCTGCAGGTCAGTACCCCCAGTC-3'; nt )을 Pwo DNA 폴리머라제를 사용함에 의 한 PCR을 위해 사용했다. 다음의 PCR 프로파일 (30사이클)을 사용하였다: 95 에서 30초, 65 에서 40초 59-13

14 및 72 에서 45초. 결과적으로 생성되는 DNA 단편을 EcoRI으로 소화했고 EcoRI 및 SmaI 부위들 사이에 pcineo에 클론했다. NP의 발현을 모노클로날항체 38(Russell et al., 1983)을 사용함에 의해 Peeters(1992) 등에 의해 기재된 바와 같이 이뮤노페록시다제 단층 분석(IPMA)로 입증하였다. P-유전자: 프라이머 prt1 (5'-CAAAGAATTCAGAAAAAAGTACGGGTAGAA-3'; nt )를 역 전사를 위해 사용 하였다. 프라이머 prt1 및 p2 (5'-GCAGTCTAGATTAGCC-ATTCACTGCAAGGCGC-3'; nt )를 Pwo DNA 폴 리머라제를 사용함에 의한 PCR을 위해 사용했다. 다음의 PCR 프로파일 (30사이클)을 사용하였다: 95 에 서 30초, 65 에서 40초 및 72 에서 60초. 결과적으로 생성되는 DNA 단편을 EcoRI 및 XbaI으로 소화했 고 EcoRI 및 XbaI 부위들 사이에 pcineo에 클론했다. P의 발현을 모노클로날항체 688(Russell et al., 1983)을 사용함에 의해 IPMA로 입증하였다. M-유전자: 프라이머 3UIT (5'-ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3'; nt 1-27)를 역 전사를 위해 사용하였다. 프라이머 NDV5M (5'-GGGTGCTAGCGGAGTGCCCCAATTGTGC-CAA-3'; nt ) 및 NDV3M (5'- TCTCCCCGGGGCAGCTTATTTCTTAAAAGGAT-3'; nt )를 Expand High Fidelity 키트를 사용함에 의한 PCR 을 위해 사용했다. PCR은 95 에서 15초, 55 에서 30초 및 68 에서 2분의 10 사이클과 뒤이은 68 에 서 연장 시간이 사이클마다 20초로 증가한 15사이클로 구성되었다. 결과적으로 생성되는 DNA 단편을 블 런트 말단을 형성하기 위하여 T4 DNA 리가제로 처리했고, NheI으로 소화했고 NheI 및 SmaI 부위들 사이로 pcineo에 클론했다. M 단백질의 발현을 모노클로날항체 424(Russell et al., 1983)을 사용함에 의해 IPMA로 입증하였다. F-유전자: 프라이머 3UIT (상기 참조)를 역 전사를 위해 사용하였다. 프라이머 NDV5F (5'- ACGGGCTAGCGATTCTGGATCCCGGTTGG-3'; nt ) 및 NDV3F (5'-ACTACCCGGGAAACCTTCGTTCCTCAT-3'; nt )를 M-유전자에 대해 상기에서 언급한 바와 같은 조건을 이용하는 Expand High Fidelity 키트를 사용함에 의한 PCR을 위해 사용했다. 결과적으로 생성되는 DNA 단편을 블런트 말단을 형성하기 위하여 T4 DNA 리가제로 처리했고, NheI으로 소화했고 NheI 및 SmaI 부위들 사이로 pcineo에 클론했다. F 단백 질의 발현을 모노클로날항체 8E12A8C3(ID-DLO, department of Avian Virology)을 사용함에 의해 IPMA로 입증하였다. HN-유전자: 프라이머 3UIT를 역 전사를 위해 사용하였다. 프라이머 NDV5HN (5'- GTAGGCTAGCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3'; nt ) 및 NDV3HN (5'-CGAGCCC-GGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG- 3'; nt )를 M-유전자에 대해 상기에서 언급한 바와 같은 조건을 이용하는 Expand High Fidelity 키트를 사용함에 의한 PCR을 위해 사용했다. 결과적으로 생성되는 DNA 단편을 블런트 말단을 형성하기 위하여 T4 DNA 리가제로 처리했고, XmaI으로 소화후, 블런트된 (Klenow DNA 폴리머라제 ) NheI 부위 및 SmaI 부위 사이로 pcineo에 클론했다. HN 단백질의 발현을 모노클로날항체 86(Russell et al., 1983)을 사용함에 의해 IPMA로 입증하였다. L-유전자: L-유전자를 SacII 및 SalI으로 소화하여 cdna 클론 pgem-l7a (도 4A)로부터 회수하였다. SalI 으로 소화하기 전에, SacII 부위를 T4 DNA 리가제로 처리하여 블런트로 만들었다. 결과적으로 생성되는 단편을 블런트된 (Klenow DNA 폴리머라제) NheI 부위 및 SalI 부위 사이로 pcineo에 클론했다. T 프로모 터와 L-유전자의 ATG 개시코돈 사이의 5' 비번역 영역은 L 단백질의 정확한 발현을 방해할 수 있는 2 프 래임외 ATG 코돈을 함유했다. 그러므로, 하기와 같이, 첫번째 ATG는 빼지고 그리고 두번째 ATG는 PCR 돌 연변이로 AAG로 치환된 새로운 플라스미드를축조하였다. 프라이머 5LE (5'- CAATGGAATTCAAGGCAAAACAGCTCAAGGTAAATAATACGGG-3'; nt ) 및 3LE(B) (5'- GTGAATCTAGAATGCCGGATCCGTACGTACGAATGC-3'; nt )를 주형으로 플라스미드 pgem-l7a(도 4)를 사용 하는 PCR에 사용했다. 이 PCR은 Pwo DNA 폴리머라제를 사용하여 수행했고 그리고 94 에서 30초, 60 에 서 45초 및 72 에서 40초의 30 사이클로 구성되었다. 결과적으로 생성되는 DNA 단편을 EcoRI 및 XbaI으 로 소화했고 EcoRI 및 XbaI 부위들 사이에 pcineo에 클론하여 플라스미드 pclneol(n)을 생산했다. 연이 어서, L-유전자의 잔존 부분 (nt )을 함유하는 pgem-l7a 유래의 BsiWI-SalI 단편을 BsiWI 및 SalI 부위들 사이로 pcineol(n)에 클론하여 플라스미드 pcineol(c)를 생산했다. L-단백질에 대한 항체들 을 이용할 수 없기 때문에, L의 발현은 면역화학으로 체크될 수 없었다. F-유전자에 유전학적 태그의 도입 감염성 바이러스가 클론된 전체-길이 cdna로부터 생산될 수 있음을 분명히 보이기 위해, 유전학적 태그를 PCR 돌연변이에 의해 F 유전자에 도입하였다. 이것 때문에, F-유전자는 두개의 중복되는 PCR 단편들을 사용하여 클론하였다. 첫번째 PCR 단편은 프라이머 NDV5F (상기 참조) 및 프라이머 F5R (5'- AAAGCGCCGCTGTCTCC-TCCCTCCAGATGTAGTCAC-3'; nt )를 사용하여 생산했다. 진하게 도시된 잔기들 은 NDV LaSota 균주의 것 (GGRQGR L)로부터 감염성 NDV 균주들 (GRRQRR F)에 대한 컨센서스 절단 부위 로 F1과 F2 사이의 단백질가수분해 절단 부위의 아미노산을 변경하기 위하여 프라이머에 도입된 치환들이 다. 두번째 PCR 단편은 프라이머 F3F (5'-GGAGGAGACAGCGGCGCTTTATAGGCGCCATTATTGG-3'; nt ) 및 IV09 (5'-CTCTGTCGACACAGACTACCAGAACTTTCAC-3'; nt )를 사용하여 생산했다. 이 PCR은 Pwo DNA 폴리머라제로 수행했고 그리고 94 에서 15초, 55 에서 30초 및 72 에서 2분의 25 사이클로 구성되었다. 두개의 중복하는 PCR 단편들 (중복은 프라이머 서열들에서 이탤릭체로 도시된다)을 프라이 머 NDV5F 및 IV09를 사용함에 의해 그리고 동일한 PCR 조건을 이용함에 두번째 PCR에서 연결하였다. F 유전자의 전체 ORF를 함유하고 독성 컨센서스 절단 부위를 코드화하는 결과적으로 생성되는 단편을 NheI 및 SalI으로 소화했고 NheI 및 SalI 부위들 사이로 pcineo에 클론하여 pcineof wt 를 생산했다. pcineof wt 유래의 StuI-NotI 단편 (nt )를 pgem-b 유래의 ClaI-ScaI (nt )를 ClaI 및 ScaI 부위 들 사이로 p535-di에 삽입함에 의해 축조된 플라스미드 p535-s에서 대응하는 단편을 대체하기 위해 사용 하였다 (도 4c 참조). 결과적으로 생성되는 플라스미드를 p535-s[f wt c]로 명명했다. pacyc184 유래의 Cm-내성 유전자를 함유하는 PCR 단편 (상기 참조)을 플라스미드 p535-s[f wt c]의 독특한 XbaI 부위 (NDV 서 열에서 위치 6172)로 XbaI 단편으로서 클론하여 플라스미드 p535-s[f wt c]cm을 산출했다. 연이어서, 이 플 라스미드의 Cm-태그된 ApaI-SpeI 단편 (nt )을 전체-길이 cdna 클론 pndfl+의 대응하는 단편을 대체하기 위해 사용하였다. 마지막으로, Cm-유전자를 XbaI으로 소화함에 의해 이 플라스미드로부터 제거 59-14

15 하고 뒤이더 T4 DNA 리가제를 사용하여 재원형화 하였다. 유전학적으로 태그된 전체-길이 NDV cdna를 함 유하는 결과적으로 생성되는 플라스미드를 pndfl+[f wt ]로 명명했다. 개개 NDV 유전자들을 발현하는 안정하게 형질전환된 세포주들의 산출 플라스미드 pcineonp, pcineop, pcineom, pcineof, pcineof wt, 및 pcineohn을 이 단백질들을 개개로 발현 하는 안정하게 형질전환된 세포주즐의 산출을 위해 사용하였다. 트랜스팩션 전날에, CER 세포들을 6cm 배양 디쉬에 접종했고 60-80%의 컨플루언시를 부여하도록 밤새 인큐베이트하였다. 세포들을 기본적으로 공급자 (GibciBRL/Life Technologies)에 의해 기재된 바와 같이 LipofectAmine 12μl 및 OptiMem을 사용함 에 의하여 2μg 플라스미드 DNA로 트랜스펙트시켰다. 48시간 후, 세포들을 트립신화하고 희석액을 G μg/ml를 함유하는 배지(Boehringer Mannheim)의 10cm 배양 디쉬에 접종하였다. 3일마다 배지를 G418 의 농도가 800μg/ml에 다다를때까지 양이 증가하는 (100μg/ml의 단계로) G418을 함유하는 새로운 배지로 대체했다. 세포들을 800μg/ml G418를 함유하는 배지로 유지하였고 트랜스펙션 3주 후에 개개의 콜로니들 을 들어내어 96-웰 배양 디쉬로 옮겼다. 클론된 세포주들을 순간 발현 연구를 위해 상기에서 언급된 바 와 같이, IPMA를 사용함에 의해 상대적인 NDV 유전자의 발현에 대해 실험하였다. 구성적으로 NP, P, M 또는 F를 발현한 세포주들이 확인되고 단리되었다. 그러나, 우리는 HN 단백질을 발 현한 세포주들을 산출할 수는 없었다. 아마도 HN의 구성적인 발현은 세포에게 독성인 둣 하다. T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 안정하게 형질전환된 세포주의 산출 T7 RNA 폴리머라제를 코드화하는 유전자를 플라스미드 prt7nt (Rene van Gennip, ID-DLO, Department of Mammalian Virology)를 EcoRI 및 SalI으로 소화함에 의해 회수하였다. 결과적으로 생성되는 단편은 바쿨 로바이러스 p10 프로모터 뒤에 위치한 T7 RNA 폴리머라제를 함유한다. 이 DNA 단편을 EcoRI 및 SalI 부 위 사이로 플라스미드 pcineo에 클론하여 플라스미드 pcineo107을 산출했다. 플라스미드 pcineo0은 T7 프로모터가 결여되어 있고 그리고 NheI으로의 절단과 뒤이은 ScaI으로 부분적인 절단하고, Klenow DNA 폴 리머라제로 스티키(sticky) 말단을 채우고 그리고 T4 DNA 리가제를 이용하여 재원형화함에 의해 pcineo으 로부터 유래하였다. 바쿨로바이러스 서열들을 EcoRI 및 PacI으로 소화하여 pcineo107로부터 제거하고 이 어서 T4 DNA 폴리머라제 처리에 의해 블런트 말단을 생산하고 재원형화했다. 결과적으로 생성되는 플라 스미드를 pcineo007로 명명하였다. T7 RNA 폴리머라제의 발현을 pcineo007 및 pprh01로 세포들을 공-트 랜스펙션함에 의해 증명하였다. 후자의 플라스미드는 T7 프로모터 뒤에 클론되고 내부 리보솜 입장 (entry) 부위 (Rene van Gennip, personal communication)을 함유하는 고전 돼지열 바이러스의 E2 단백질 을 함유한다. E2의 발현을 모노클로날 항체 V4 (Wensvoort et al., 1986)를 사용함에 의한 IPMA에서 결 정하였다. T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 안정하게 형질전환된 CER 세포주들을 생산했고 10cm 배양 디쉬 를 사용하고 그리고 세포들을 pcineo μg 및 LipofectAminme 25μl로 트랜스펙트한 것을 제외하고는 상기에서 언급한 바와 같이 단리했다. 발현 T7 RNA 폴리머라제에 대한 개개의 세포주들을 시험하기 위하 여, 그것들을 플라스미드 pprh01로 트랜스펙션했고 E2의 발현 (T7 RNA 폴리머라제에 의존적인)을 모노클 로날 항체 V4를 사용함에 의한 IPMA에서 결정하였다. T7 RNA 폴리머라제를 발현한 몇몇의 세포주들을 확 인하였다. CER-C9로 명명된 한 세포주를 연이은 실험들을 위해 사용하였다. HN-유전자들 및 하이브리드-HN 유전자들의 클로닝 및 발현 프라이머 3UIT를 상기에서 언급한 바와 같이 NDV의 단일-가닥 cdna 및 조류 파라미쏘바이러스 세로타입-2 및 -4 (APMV2 및 APMV4)를 합성하기 위해 사용하였다. 모든 연이은 PCR 반응들을 94 에서 15초, 55 에 서 30초 및 72 에서 2분의 25 사이클을 사용하여 수행하였다. APMV2의 HN-유전자의 전체 코딩 영역을 APMV2의 HN-유전자의 서열(GenBank accession number D14030)로부 터 유래된 프라이머 IV03 (5'-GGGGGAATTCCCCATT-CAATGAAGGGTCTAC-3') 및 IV05 (5'- GATCCCCGGGTCTTAAACCAGGCTTCGCAATG-3')를 사용하는 PCR로 회수하였다. APMV4의 HN-유전자의 전체 코딩 영역을 APMV4의 HN-유전자의 서열(GenBank accession number D14031)로부터 유래된 프라이머 IV06 (5'- GGGGGAATTCTGGTAGGGTGGGGAAGGTAGC-3') 및 IV08 (5'-ATTGCCCGGGGGGTAACTAATCAGGAT-CTCAG-3')를 사용하는 PCR로 회수하였다. 결과적으로 생성되는 PCR 단편을 EcoRI 및 XmaI로 소화했고 (직접적으로 또는 pgem-t 에 서브클로닝 후) 그리고 EcoRI 및 XmaI 부위 사이로 플라스미드 pcineo에 클론하였다. 결과적으로 생 성되는 플라스미드들을 각각 pcineohn2 및 pcineohn4로 명명했다. NDV 균주 Lasota의 HN-유전자와 APMV2 및 -4의 HN-유전자들간의 하이브리드들을 하기와 같이 중복 PCR로 축조하였다. NDV 균주 Lasota의 HN-유전자의 N-말단 부분 (aa 1-141)을 프라이머 IV01B (5'- GTAGGAATTCAAGAGGCCGCCCCTCAAT-3'; nt ) 및 IV10 (5'-AATGAGTTCTTTGCCTATCCCCCC-3'; nt )를 사용함에 의해 Pwo DNA 폴리머라제로 증폭하였다. APMV2의 HN-유전자의 C-말단 부분 (aa )을 프라이머 IV11B (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTCAAGGAGATGCATCTGCAGGC-3') 및 IV05를 사용함에 의 해 Pwo DNA 폴리머라제로 증폭하였다. 결과적으로 생성되는 PCR 단편들을 프라이머 IV01B 및 IV05를 이 용하여 그리고 Expand High Fidelity 효소 혼합물를 사용하여 중복 PCR (중복은 이탤릭체로 도시됨)에서 연결하였다. 결과적으로 생성되는 PCR 단편을 EcoRI 및 XmaI로 소화했고 (직접적으로 또는 pgem-t에 서 브클로닝 후) 그리고 EcoRI 및 XmaI 부위 사이로 플라스미드 pcineo에 클론하였다. 결과적으로 생성되는, NDV의 aa 및 APMV2의 aa 으로 구성되는 하이브리드 HN-유전자를 함유하는 플라스 미드들을 pcineohn1/2 141 로 명명했다. APMV4의 HN-유전자의 C-말단 부분 (aa )을 프라이머 IV14B (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3') 및 IV08을 사용함에 의해 증폭하였다. 이 단편을 프라이머 IV01B 및 IV08를 이용하여 중복 PCR 에서 NDV의 HN-유전자의 n-말단 부 분에 연결하였다. 결과적으로 생성되는 PCR 단편을 EcoRI 및 XmaI로 소화했고 (직접적으로 또는 pgem- T에 서브클로닝 후) 그리고 EcoRI 및 XmaI 부위 사이로 플라스미드 pcineo에 클론하였다. 결과적으로 생 성되는, NDV의 aa 및 APMV4의 aa 로 구성되는 하이브리드 HN-유전자를 함유하는 플라스미드 들을 pcineohn1/4 141 로 명명했다. 상기에 기재된 축조와 유사하게, NDV의 aa 및 APMV2의 aa 으로 구성되는 또는 NDV의 aa