(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C07K 16/28 (2006.01) A61K 39/00 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) (52) CPC 특허분류 C07K 16/28 (2013.01) A61K 39/3955 (2013.01) (21) 출원번호 10-2017-7026686( 분할 ) (22) 출원일자 ( 국제 ) 2009 년 12 월 08 일 심사청구일자 없음 (62) 원출원특허 10-2011-7013128 원출원일자 ( 국제 ) 심사청구일자 2014 년 12 월 08 일 (85) 번역문제출일자 2017 년 09 월 21 일 (86) 국제출원번호 PCT/US2009/067104 (87) 국제공개번호 WO 2010/077634 국제공개일자 (30) 우선권주장 2010 년 07 월 08 일 2009 년 12 월 08 일 61/121,092 2008 년 12 월 09 일미국 (US) (11) 공개번호 10-2017-0113681 (43) 공개일자 2017년10월12일 (71) 출원인 제넨테크, 인크. 미합중국캘리포니아 ( 우편번호 94080-4990) 사우쓰샌프란시스코디엔에이웨이 1 (72) 발명자 어빙, 브라이언 미국 94107 캘리포니아샌프란시스코아칸소스트리트 587 청, 잔느 미국 94158 캘리포니아샌프란시스코베리스트리트 300 유닛 807 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 양영준, 이귀동 전체청구항수 : 총 1 항 (54) 발명의명칭항 -PD-L1 항체및 T 세포기능을향상시키기위한그의용도 (57) 요약 본출원은항 -PD-L1 항체, 이를코딩하는핵산, 이의치료조성물, 및 T 세포기능을향상시켜세포매개면역반응을상향조절하고감염 ( 예를들어, 급성및만성 ) 및종양면역을비롯한 T 세포기능이상장애를치료하기위한이의용도에관한것이다. 대표도 - 1 -
(52) CPC 특허분류 C07K 16/2827 (2013.01) A61K 2039/505 (2013.01) A61K 2039/507 (2013.01) (72) 발명자 치우, 헨리 미국 94116 캘리포니아샌프란시스코 20 번애비뉴 2334 레하르, 소피, 엠. 미국 94037 캘리포니아몬타라어빙스트리트 945 맥커, 헤더 미국 94303 캘리포니아팔로알토로마베르데애비뉴 733 씨 마리아타산, 산지브 미국 94030 캘리포니아밀브레엔시나드라이브 1291 유, 얀 미국 94404 캘리포니아포스터시티블라이드스트리트 1160-2 -
명세서청구범위청구항 1 T 세포기능을향상시켜세포매개면역반응을상향조절하고, 감염및종양면역을비롯한 T 세포기능이상장애를치료하기위한항-PD-L1 항체의용도. 발명의설명 [0001] [0002] [0003] [0004] 기술분야관련출원본원은 35 USC 119(e) 하에서 2008년 12월 9일자로출원된미국가출원제61/121092호에대한우선권의이익을주장하며, 상기문헌의개시내용은그전문이본원에참고로포함된다. 기술분야본발명은일반적으로면역기능및세포매개면역반응을상향조절하는것을비롯하여 T 세포기능을향상시키는것, 및 T 세포기능이상장애를치료하는것에관한것이다. [0005] [0006] [0007] 배경기술 T 세포에대한공동자극또는그에대해 2 개의구분되는신호를제공하는것은항원제시세포 (APC) 에의한휴면 T 림프구의림프구활성화의널리허용되는모델이다. 문헌 [Lafferty et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 53: 27-42 (1975)]. 이모델은추가로비-자기및면역내성으로부터자기를구별하는것을제공한다. 문헌 [Bretscher et al., Science 169: 1042-1049 (1970)]; [Bretscher, P.A., P.N.A.S. USA 96: 185-190 (1999)]; [Jenkins et al., J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987)]. 최초신호, 또는항원특이적신호는, 주요조직적합성복합체 (MHC) 에의해제시된외래항원펩티드의인식이후에 T 세포수용체 (TCR) 를통해변환된다. 제2 또는공동자극신호는항원제시세포 (APC) 상에서발현된공동자극분자에의해 T 세포로전달되고, T 세포가클론증식, 시토카인분비및이펙터기능을촉진하도록유도한다. 문헌 [Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14:233 (1996)]. 공동자극이없으면, T 세포는항원자극에대해불응성이될수있고, 효과적인면역반응을시작하지않을수있으며, 추가로외래항원에대해탈진상태가되거나내성을가질수있다. TCR 신호의강도는 T 세포활성화및분화에대해실제로정량적인영향을갖기때문에단순한 2 신호모델은지나친단순화일수있다. 문헌 [Viola et al., Science 273: 104-106 (1996)]; [Sloan-Lancaster, Nature 363: 156-159 (1993)]. 게다가, T 세포활성화는 TCR 신호강도가높다면심지어공동자극신호가존재하지않는경우에도일어날수있다. 보다중요하게는, T 세포는양성및음성 2차공동자극신호를둘모두받는다. 그러한양성및음성신호의조절은면역내성을유지하고자가면역을방지하면서숙주의보호면역반응을최대화하는데중요하다. 음성 2차신호는 T 세포내성을유도하는데필요한것으로보이는반면, 양성신호는 T 세포활성화를촉진한다. 단순한 2 신호모델이나이브림프구에대해서는여전히유효한설명을제공하지만, 숙주의면역반응은동적과정이고, 공동자극신호는또한항원-노출된 T 세포에도제공될수있다. 공동자극신호를조작하는것은세포기초면역반응을향상시키거나종결시키는수단을제공하는것으로보이기때문에, 공동자극메카니즘은치료상관심대상이다. 최근, T 세포기능이상또는무반응이억제수용체, 프로그램화된사멸 1 폴리펩티드 (PD-1) 의유도발현및지속발현과함께일어나는것으로밝혀졌다. 그결과, PD-1 및 PD-1과의상호작용을통해신호를전달하는다른분자, 예컨대프로그램화된사멸리간드 1 (PD-L1) 및프로그램화된사멸리간드 2 (PD-L2) 를치료상표적으로하는것이집중관심영역이다. PD-L1 신호전달의억제는암 ( 예를들어종양면역 ) 및감염 ( 급성및만성 ( 예를들어지속 ) 감염둘모두를포함함 ) 을치료하기위해 T 세포면역을향상시키기위한수단으로서제안되어왔다. 그러나, 이러한경로에서표적에대해지시된 - 3 -
최적의요법이아직상업화되지않았기때문에, 상당히충족되지않은의학적필요가존재한다. 발명의내용 [0008] 해결하려는과제본발명은항-PD-L1 항체 ( 그러한항체를코딩하는핵산및그러한항체를함유하는조성물을포함함 ), 및 T 세포기능을향상시켜세포매개면역반응을상향조절하고, 감염 ( 예를들어급성및만성 ) 및종양면역을비롯한 T 세포기능이상장애를치료하기위한그의용도를제공한다. [0009] [0010] 과제의해결수단한실시양태에서, 본발명은 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을포함하는단리된중쇄가변영역폴리펩티드를제공하며, 여기서 : (a) HVR-H1 서열은이고 ; [0011] [0012] [0013] [0014] (b) HVR-H2 서열은이고 ; (c) HVR-H3 서열은이며 ; 추가로 X 1 은 D 또는 G이고 ; X 2 는 S 또는 L이고 ; X 3 은 T 또는 S이다. 한특정측면에서, X 1 이 D이고 ; X 2 가 S이고 ; X 3 이 T이다. 또다른측면에서, 폴리펩티드는식 : (HC-FR1)-(HVR- H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4) 에따라 HVR 사이에병렬된가변영역중쇄프레임워크서열을추가로포함한다. 또다른측면에서, 프레임워크서열은인간컨센서스프레임워크서열로부터유래된다. 추가측면에서, 프레임워크서열은 VH 하위군 III 컨센서스프레임워크이다. 또다른추가측면에서, 프레임워크서열중적어도하나는다음과같다 : [0015] [0016] HC-FR1 은이고, HC-FR2 는이고, [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] HC-FR3은 이고, HC-FR4는 이다. 또다른추가측면에서, 중쇄폴리펩티드는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을포함하는가변영역경쇄와추가로조 합되고, 여기서 : (a) HVR-L1 서열은 이고 ; (b) HVR-L2 서열은 이고 ; (c) HVR-L3 서열은 이며 ; 추가로 X 4 는 D 또는 V이고 ; X 5 는 V 또는 I이고 ; X 6 은 S 또는 N이고 ; X 7 은 A 또는 F이고 ; X 8 은 V 또는 L이고 ; X 9 는 F 또는 T 이고 ; X 10 은 Y 또는 A 이고 ; X 11 은 Y, G, F 또는 S 이고 ; X 12 는 L, Y, F 또는 W 이고 ; X 13 은 Y, N, A, T, G, F 또는 I 이고 ; X 14 는 H, V, P, T 또는 I 이고 ; X 15 는 A, W, R, P 또는 T 이다. [0024] 또다른추가측면에서, X 4 는 D 이고 ; X 5 는 V 이고 ; X 6 은 S 이고 ; X 7 은 A 이고 ; X 8 은 V 이고 ; X 9 는 F 이고 ; X 10 은 Y이고 ; X 11 은 Y이고 ; X 12 는 L이고 ; X 13 은 Y이고 ; X 14 는 H이고 ; X 15 는 A이다. 또다른추가측면에서, 경쇄는식 : (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4) 에따라 HVR 사이에병렬된가변영역경쇄프레임워크서열을추가로포함한다. 또다른추가측면에서, 프레임워크서열은인간컨센서스프레임워크서열로부터유래된다. 또다른추가측면에서, 프레임워크서열은 VL 카파 I 컨센서스프레임워크이다. 또다른추가측면에서, 프레임워크서열중적어도하나는다음과같다 : - 4 -
[0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] LC-FR1은 이고, LC-FR2는 이고, LC-FR3은 이고, LC-FR4는 이다. 또다른실시양태에서, 본발명은중쇄및경쇄가변영역서열을포함하는단리된항-PD-L1 항체또는항원결 합단편을제공하고, 여기서 : (a) 중쇄는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을포함하며, 추가로 : (i) HVR-H1 서열은 이고, [0032] [0033] [0034] [0035] (ii) HVR-H2 서열은 이고, (iii) HVR-H3 서열은 이며, (b) 경쇄는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을포함하고, 추가로 : (i) HVR-L1 서열은 이고, [0036] [0037] [0038] (ii) HVR-L2 서열은이고, (iii) HVR-L3 서열은이다. 여기서추가로 X 1 은 D 또는 G 이고 ; X 2 는 S 또는 L 이고 ; X 3 은 T 또는 S 이고 ; X 4 는 D 또는 V 이고 ; X 5 는 V 또는 I 이 고 ; X 6 은 S 또는 N 이고 ; X 7 은 A 또는 F 이고 ; X 8 은 V 또는 L 이고 ; X 9 는 F 또는 T 이고 ; X 10 은 Y 또는 A 이고 ; X 11 은 Y, G, F 또는 S 이고 ; X 12 는 L, Y, F 또는 W 이고 ; X 13 은 Y, N, A, T, G, F 또는 I 이고 ; X 14 는 H, V, P, T 또는 I 이고 ; X 15 는 A, W, R, P 또는 T 이다. [0039] 특정측면에서, X 1 은 D 이고 ; X 2 는 S 이고 ; X 3 은 T 이다. 또다른측면에서, X 4 는 D 이고 ; X 5 는 V 이고 ; X 6 은 S 이고 ; X 7 은 A 이고 ; X 8 은 V 이고 ; X 9 는 F 이고 ; X 10 은 Y 이고 ; X 11 은 Y 이고 ; X 12 는 L 이고 ; X 13 은 Y 이고 ; X 14 는 H 이고 ; X 15 는 A 이다. 또다른측면에서, X 1 은 D 이고 ; X 2 는 S 이고 ; X 3 은 T 이고, X 4 는 D 이고 ; X 5 는 V 이고 ; X 6 은 S 이고 ; X 7 은 A 이 고 ; X 8 은 V 이고 ; X 9 는 F 이고 ; X 10 은 Y 이고 ; X 11 은 Y 이고 ; X 12 는 L 이고 ; X 13 은 Y 이고 ; X 14 는 H 이고 X 15 는 A 이다. [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] 추가측면에서, 중쇄가변영역은 (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4) 로서 HVR 사이에병렬된하나이상의프레임워크서열을포함하고, 경쇄가변영역은 (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR- L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4) 로서 HVR 사이에병렬된하나이상의프레임워크서열을포함한다. 또다른추가측면에서, 프레임워크서열은인간컨센서스프레임워크서열로부터유래된다. 또다른추가측면에서, 중쇄프레임워크서열은카바트하위군 I, II, 또는 III 서열로부터유래된다. 또다른추가측면에서, 중쇄프레임워크서열은 VH 하위군 III 컨센서스프레임워크이다. 또다른추가측면에서, 하나이상의중쇄프레임워크서열은다음과같다 : HC-FR1은이고, HC-FR2는이고, HC-FR3은이고, HC-FR4는이다. 또다른추가측면에서, 경쇄프레임워크서열은카바트카파 I, II, II 또는 IV 하위군서열로부터유래된다. 또다른추가측면에서, 경쇄프레임워크서열은 VL 카파 I 컨센서스프레임워크이다. 또다른추가측면에서, - 5 -
하나이상의경쇄프레임워크서열은다음과같다 : [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] LC-FR1은 이고, LC-FR2는 이고, LC-FR3은 이고, LC-FR4는 이다. 추가의특정측면에서, 항체는인간또는뮤린불변영역을추가로포함한다. 또다른추가측면에서, 인간불 변영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로이루어진군으로부터선택된다. 추가의특정측면에서, 인간불변 영역은 IgG1이다. 또다른추가측면에서, 뮤린불변영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로이루어진군으로부 터선택된다. 또다른추가측면에서, 뮤린불변영역은 IgG2A이다. 추가의특정측면에서, 항체는감소되거 나또는최소한의이펙터기능을갖는다. 추가의특정측면에서, 최소한의이펙터기능은 " 비-이펙터 Fc 돌연 변이 " 또는비글리코실화로부터유래된다. 또다른추가실시양태에서, 비-이펙터 Fc 돌연변이는불변영역에 서의 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다. 또다른실시양태에서, 본발명은중쇄및경쇄가변영역서열을포함하는항-PD-L1 항체를제공하고, 여기서 : (a) 중쇄는, 및 에대해각각 85% 이상 의서열동일성을갖는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을추가로포함하거나, 또는 (b) 경쇄는, 및 에대해각각 85% 이상의서열 동일성을갖는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을추가로포함한다. [0054] [0055] 특정측면에서, 서열동일성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% 또는 100% 이다. 또다른측면에서, 중쇄가변영역은 (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC- FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4) 로서 HVR 사이에병렬된하나이상의프레임워크서열을포함하고, 경쇄가변영역은 (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4) 로서 HVR 사이에병렬된하나이상의프레임워크서열을포함한다. 또다른측면에서, 프레임워크서열은인간컨센서스프레임워크서열로부터유래된다. 또다른추가측면에서, 중쇄프레임워크서열은카바트하위군 I, II 또는 III 서열로부터유래된다. 또다른추가측면에서, 중쇄프레임워크서열은 VH 하위군 III 컨센서스프레임워크이다. 또다른추가측면에서, 하나이상의중쇄프레임워크서열은다음과같다 : HC-FR1은이고, [0056] HC-FR2 는이고, [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] HC-FR3은이고, HC-FR4는이다. 또다른추가측면에서, 경쇄프레임워크서열은카바트카파 I, II, II 또는 IV 하위군서열로부터유래된다. 또다른추가측면에서, 경쇄프레임워크서열은 VL 카파 I 컨센서스프레임워크이다. 또다른추가측면에서, 하나이상의경쇄프레임워크서열은다음과같다 : LC-FR1은이고, LC-FR2는이고, LC-FR3은이고, LC-FR4는이다. 추가의특정측면에서, 항체는인간또는뮤린불변영역을추가로포함한다. 또다른추가측면에서, 인간불변영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로이루어진군으로부터선택된다. 추가의특정측면에서, 인간불변 - 6 -
영역은 IgG1이다. 또다른추가측면에서, 뮤린불변영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로이루어진군으로부터선택된다. 또다른추가측면에서, 뮤린불변영역은 IgG2A이다. 추가의특정측면에서, 항체는감소되거나또는최소한의이펙터기능을갖는다. 추가의특정측면에서, 최소한의이펙터기능은 " 비-이펙터 Fc 돌연변이 " 또는비글리코실화로부터유래된다. 또다른추가실시양태에서, 비-이펙터 Fc 돌연변이는불변영역에서의 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다. [0065] [0066] 또다른추가실시양태에서, 본발명은중쇄및경쇄가변영역서열을포함하는단리된항 -PD-L1 항체를제공 하고, 여기서 : (a) 중쇄서열은중쇄서열 : [0067] [0068] 거나, 또는 (b) 경쇄서열은경쇄서열 : 에대해 85% 이상의서열동일성을갖 [0070] 는다. 에대해 85% 이상의서열동일성을갖 [0071] [0072] 특정측면에서, 서열동일성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% 또는 100% 이다. 또다른측면에서, 중쇄가변영역은 (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC- FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4) 로서 HVR 사이에병렬된하나이상의프레임워크서열을포함하고, 경쇄가변영역은 (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4) 로서 HVR 사이에병렬된하나이상의프레임워크서열을포함한다. 또다른측면에서, 프레임워크서열은인간컨센서스프레임워크서열로부터유래된다. 추가측면에서, 중쇄프레임워크서열은카바트하위군 I, II 또는 III 서열로부터유래된다. 또다른추가측면에서, 중쇄프레임워크서열은 VH 하위군 III 컨센서스프레임워크이다. 또다른추가측면에서, 하나이상의중쇄프레임워크서열은다음과같다 : HC-FR1 [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] HC-FR2 HC-FR3 HC-FR4. 또다른추가측면에서, 경쇄프레임워크서열은카바트카파 I, II, II 또는 IV 하위군서열로부터유래된다. 또다른추가측면에서, 경쇄프레임워크서열은 VL 카파 I 컨센서스프레임워크이다. 또다른추가측면에서, 하나이상의경쇄프레임워크서열은다음과같다 : LC-FR1 LC-FR2 [0079] [0080] [0081] LC-FR3 LC-FR4. 추가의특정측면에서, 항체는인간또는뮤린불변영역을추가로포함한다. 또다른추가측면에서, 인간불변영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로이루어진군으로부터선택된다. 추가의특정측면에서, 인간불변영역은 IgG1이다. 또다른추가측면에서, 뮤린불변영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로이루어진군으로부터선택된다. 또다른추가측면에서, 뮤린불변영역은 IgG2A이다. 추가의특정측면에서, 항체는감소되거나또는최소한의이펙터기능을갖는다. 추가의특정측면에서, 최소한의이펙터기능은원핵세포에서의생 - 7 -
산으로부터야기된다. 추가의특정측면에서, 최소한의이펙터기능은 " 비 - 이펙터 Fc 돌연변이 " 또는비글리코 실화로부터야기된다. 또다른추가실시양태에서, 비 - 이펙터 Fc 돌연변이는불변영역에서의 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다. [0082] [0083] [0084] [0085] 또다른추가실시양태에서, 본발명은상기기재된임의의항-PD-L1 항체를하나이상의제약상허용되는담체와함께포함하는조성물을제공한다. 또다른추가실시양태에서, 본발명은항-PD-L1 항체의경쇄또는중쇄가변영역서열을코딩하는단리된핵산을제공하며, 여기서 : (a) 중쇄는, 및과각각 85% 이상의서열동일성을갖는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을추가로포함하고, (b) 경쇄는, 및와각각 85% 이상의서열동일 성을갖는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을추가로포함한다. [0086] [0087] [0088] 특정측면에서, 서열동일성은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% 또는 100% 이다. 측면에서, 중쇄가변영역은 (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR- H3)-(HC-FR4) 로서 HVR 사이에병렬된하나이상의프레임워크서열을포함하고, 경쇄가변영역은 (LC-FR1)- (HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4) 로서 HVR 사이에병렬된하나이상의프레임워크서열을포함한다. 또다른측면에서, 프레임워크서열은인간컨센서스프레임워크서열로부터유래된다. 추가측면에서, 중쇄프레임워크서열은카바트하위군 I, II 또는 III 서열로부터유래된다. 또다른추가측면에서, 중쇄프레임워크서열은 VH 하위군 III 컨센서스프레임워크이다. 또다른추가측면에서, 하나이상의중쇄프레임워크서열은다음과같다 : HC-FR1 HC-FR2 [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] HC-FR3 HC-FR4. 또다른추가측면에서, 경쇄프레임워크서열은카바트카파 I, II, II 또는 IV 하위군서열로부터유래된다. 또다른추가측면에서, 경쇄프레임워크서열은 VL 카파 I 컨센서스프레임워크이다. 또다른추가측면에서, 하나이상의경쇄프레임워크서열은다음과같다 : LC-FR1 LC-FR2 LC-FR3 LC-FR4. 추가의특정측면에서, 항체는인간또는뮤린불변영역을추가로포함한다. 또다른추가측면에서, 인간불변영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로이루어진군으로부터선택된다. 추가의특정측면에서, 인간불변영역은 IgG1이다. 또다른추가측면에서, 뮤린불변영역은 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3으로이루어진군으로부터선택된다. 또다른추가측면에서, 뮤린불변영역은 IgG2A이다. 추가의특정측면에서, 항체는감소되거나또는최소한의이펙터기능을갖는다. 추가의특정측면에서, 최소한의이펙터기능은원핵세포에서의생산으로부터야기된다. 추가의특정측면에서최소한의이펙터기능은 " 비-이펙터 Fc 돌연변이 " 또는비글리코실화로부터야기된다. 또다른추가측면에서, 비-이펙터 Fc 돌연변이는불변영역에서의 N297A 또는 D265A/N297A 치환이다. 또다른추가측면에서, 핵산은앞서기재한임의의항-PD-L1 항체를코딩하는핵산의발현에적합한벡터를추가로포함한다. 또다른추가의특정측면에서, 벡터는핵산의발현에적합한숙주세포를추가로포함한다. - 8 -
또다른추가의특정측면에서, 숙주세포는진핵세포또는원핵세포이다. 또다른추가의특정측면에서, 진핵세포는포유동물세포, 예컨대차이니즈햄스터난소 (CHO) 이다. [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] [0107] [0108] 또다른추가실시양태에서, 본발명은앞서기재한임의의항-PD-L1 항체또는항원결합단편을코딩하는핵산을발현에적합한형태로함유하는숙주세포를상기항체또는단편이생산되는데적합한조건하에서배양하는단계, 및항체또는단편을회수하는단계를포함하는, 항-PD-L1 항체또는그의항원결합단편을제조하는방법을제공한다. 또다른추가실시양태에서, 본발명은본원에서제공하는바와같은항-PD-L1 항체또는그의항원결합단편및하나이상의제약상허용되는담체를포함하는조성물을제공한다. 또다른추가실시양태에서, 본발명은본원에서개시하는조성물의치료유효량을담은용기및 T 세포기능이상장애의치료를위한용도를나타낸포장삽입물을포함하는제조품을제공한다. 또다른추가실시양태에서, 본발명은상기기재한임의의항-PD-L1 조성물을하나이상의 BNCA 분자와함께포함하는제조품을제공한다. 한측면에서, BNCA 분자는항체, 항원결합항체단편, BNCA 올리고펩티드, BNCA RNAi 또는 BNCA 소분자이다. 또다른측면에서, B7 음성공동자극분자는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7.1, B7-H3 및 B7-H4로이루어진군으로부터선택된다. 또다른추가실시양태에서, 제조품은상기기재한임의의항-PD-L1 조성물과함께화학요법제를포함한다. 한측면에서, 화학요법제는겜시타빈이다. 또다른추가실시양태에서, 본발명은상기기재한임의의항-PD-L1 항체와함께하나이상의양성공동자극분자인효능제를포함하는제조품을제공한다. 한측면에서, 양성공동자극분자는 B7 패밀리공동자극분자이다. 또다른측면에서, 양성공동자극분자는 CD28, CD80, CD86, ICOS/ICOSL로이루어진군으로부터선택된다. 또다른측면에서, 양성공동자극분자는 TNFR 패밀리공동자극분자이다. 추가측면에서, TNFR 공동자극분자는 OX40/OX40L, 4-1BB/4-1BBL, CD27/CD27L, CD30/CD30L 및 HVEM/LIGHT 및그의가용성단편, 구축물및효능제항체로이루어진군으로부터선택된형태이다. 또다른추가실시양태에서, 본발명은상기기재한임의의항-PD-L1 항체와함께하나이상의항생제를포함하는제조품을제공한다. 한측면에서, 항생제는항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제, 항-원생동물작용제로이루어진군으로부터선택된다. 또다른측면에서, 항바이러스제는역전사효소억제제, 프로테아제억제제, 인테그라제억제제, 진입또는융합억제제, 성숙억제제, 바이러스방출억제제, 면역반응향상제, 항바이러스성상승작용향상제, 백신, 간효능제및약초제로이루어진군으로부터선택된다. 또다른측면에서, 조합물은하나이상의항바이러스제카테고리를포함한다. 또다른추가실시양태에서, 본발명은상기기재한임의의항-PD-L1 항체와함께하나이상의백신을포함하는제조품을제공한다. 또다른추가실시양태에서, 본발명은상기기재한임의의항-PD-L1 항체또는조성물의유효량을투여하는것을포함하는, T 세포기능을향상시키는방법을제공한다. 한측면에서, 항-PD-L1 항체또는조성물은기능이상 T 세포를비-기능이상으로만든다. 또다른추가실시양태에서, 본발명은상기기재한임의의항-PD-L1 항체또는조성물의치료유효량을투여하는것을포함하는, T 세포기능이상장애를치료하는방법을제공한다. 한특정측면에서, T 세포기능이상장애는감염또는종양면역이다. 또다른측면에서, 감염은급성또는만성이다. 또다른측면에서, 만성감염은지속적이거나, 잠재적이거나또는느리다. 또다른측면에서, 만성감염은박테리아, 바이러스, 진균및원생동물로이루어진군으로부터선택된병원체로부터야기된다. 추가측면에서, 숙주내의병원체수준은감소된다. 또다른추가측면에서, 상기방법은백신으로치료하는것을추가로포함한다. 또다른추가측면에서, 상기방법은항생제로치료하는것을추가로포함한다. 또다른추가측면에서, 병원체는박테리아이고, 상기방법은항박테리아제를투여하는것을추가로포함한다. 또다른추가측면에서, 박테리아는미코박테리움종 (Mycobacterium spp.), 살모넬라종 (Salmonella spp.), 리스테리아종 (Listeria spp.), 스트렙토코쿠스종 (Streptococcus spp.), 헤모필루스종 (Haemophilus spp.), 네이세리아종 (Neisseria spp.), 클레브시엘라종 (Klebsiella spp.), 보렐리아종 (Borrelia spp.), 박테로이데스프라길리스 (Bacterioides fragillis), 트레포네마종 (Treponema spp.), 및헬리코박터피롤리 (Helicobacter pylori) 로이루어진군으로부터선택된다. - 9 -
또다른추가측면에서, 병원체는바이러스이고, 상기방법은항바이러스제를투여하는것을추가로포함한다. 또다른추가측면에서, 바이러스는간염 -B, -C, 단순포진바이러스 -I, -II, 인간면역결핍바이러스 -I, -II, 시토메갈로바이러스, 엡스타인바르바이러스, 인간파필로마바이러스, 인간 T 림프구친화성바이러스, -I, -II, 바리셀라조스터로이루어진군으로부터선택된다. 또다른추가측면에서, 병원체는진균이고, 상기방법은항진균제를투여하는것을추가로포함한다. 또다른추가측면에서, 장애는아스페르길루스증, 블라스토미세스증, 칸디다증알비칸스, 콕시디오이데스진균증이미티스, 히스토플라스마증, 파라콕시디오이데스진균증, 미포자충증으로이루어진군으로부터선택된다. 또다른추가측면에서, 병원체는원생동물이고, 상기방법은항-원생동물작용제를투여하는것을추가로포함한다. 또다른추가측면에서, 장애는리슈마니아증, 플라스모디오시스 (plasmodiosis) ( 즉, 말라리아 ), 크립토스포리디아증, 톡소플라스마증, 트리파노소마증, 및흡충류 ( 예를들어, 주혈흡충증 ), 촌충류 ( 예를들어, 포충증 ) 및선충류 ( 예를들어, 선모충증, 회충증, 사상충증및분선충증 ) 로부터야기된감염을비롯한연충감염으로이루어진군으로부터선택된다. [0109] 또다른추가측면에서, T 세포기능이상장애는종양면역이다. 또다른추가측면에서, PD-L1 항체또는조성물은방사선요법, 화학요법, 표적화요법, 면역요법, 호르몬요법, 혈관신생억제및완화치료로이루어진군으로부터선택된전통요법을추가로포함하는치료섭생과조합된다. 추가의특정측면에서, 화학요법치료는겜시타빈, 시클로포스파미드, 독소루비신, 파클리탁셀, 시스플라틴으로이루어진군으로부터선택된다. 추가의특정측면에서, 종양면역은유방암, 폐암, 결장암, 난소암, 흑색종, 방광암, 신장암, 간암, 침샘암, 위장암, 신경교종, 갑상선암, 흉선암, 상피암, 두경부암, 위암및췌장암으로이루어진군으로부터선택된암으로부터야기된다. [0110] 도면의간단한설명 도 1 은세포표면분자인 B7 패밀리에의한 T 세포의공동자극을도시한그래프적설명이다. 도 2는 PMEL/B16 T 세포자극검정의실험설계를나타낸개략도이다. 도 3은멜라닌세포펩티드 gp100에반응하여 PMEL CD8+ T 세포에서의 IFN-γ 생산이향상되는것을통한, 항원특이적 T 세포기능에의항-PD-L1 Ab의효과를보여주는막대그래프이다. IFN-γ를생산하는 CD8+ T 세포및 IFN-γ 생산수준백분율은둘모두항-PD-L1 항체의존재하에서자극하는동안증가되었다. 도 4는 Ova-펄스된 A20 B 세포 /mpd-l1 APC에의한 2차자극에있어서항-PD-L1 Ab YW243.55.S1에의해 Ova-특이적 CD4+ T 세포의증식이향상되는것을통한, 항원특이적 T 세포기능에대한항-PD-L1 Ab의효과를보여주는막대그래프이다. 도 5는혼합림프구반응에서항-PD-L1 항체 YW243.55S1에의해인간 CD8 T 세포의증식이향상되는것을보여주는일련의 FACS 플롯이다. CFSE의강도를희석시켜측정한증식세포의퍼센트를또한보고한다. 도 6은만성 LCMV를키메라형태의항-PD-L1 Ab YW243.55S70으로치료하는것에대한실험설계의개략도이다. 화살표는 2 x 10 6 pfu 클론 13 LCMV에의한감염 14일후에시작된항-PD-L1의 6 투약시점을나타낸다. 도 7A 및 7B는항-PD-L1 Ab, YW243.55.S70에의한만성 LCMV 감염의생체내치료이후에생체외세포에서향상된 CD8 이펙터기능을보여주는그래프이다. YW243.55.S70에의한 PD-L1의차단은 CD8 + T 세포의탈과립화를증가시켰고 ( 표면 CD107A의증가로판단함 ) ( 도 7A), LCMV 펩티드 gp33에반응하여 IFN-감마생산세포 % 를증가시켰다 ( 도 7B). gp33-특이적세포의빈도는 H2-Db gp33 오량체로염색하여밝혀내었다. 도 8A 및 8B는만성 LCMV 감염에있어서항-PD-L1 항체로생체내치료한이후에혈액및조직 LCMV 역가가감소된것을보여준다. 도 8A에서, 다양하게나타낸조직으로부터의바이러스역가를제 21 일및제 28 일, Ab 치료후 1 주및 2 주째에각각분석하였다. 도 8B에서는, 제 0 일에 LCMV를접종하고제 14 일에치료를시작하여제 0 일, 제 7 일, 제 14 일, 제 21 일및제 28 일에혈청바이러스역가를분석하였다. 도 9A는확립된종양을요법상치료한이후에 ( 종양이 250 mm 3 일때, 제 14 일에치료를시작함 ) 항-PD-L1 항체를적용한결과로서 MC38.Ova 결장암종종양성장에있어서의현저한감소를보여준다. 도 9B는유동세포계수법으로측정한, 조직배양물중 MC38.Ova 세포상에서의 PD-L1 발현의표면수준을보여주는히스토그램이다. PD-L2는 MC38.Ova 세포에의해발현되지않았다. 도 10은 C57BL/6 마우스에서의 MC38.Ova 종양의성장에대한 PD-L1 차단치료의단독효과및항-VEGF 또는겜 - 10 -
시타빈과의조합치료의효과를보여주는그래프이다. 도 11A-B 는각각파지디스플레이에의해확인된 11 항 -PD-L1 항체의중쇄및경쇄가변영역서열이다. 음영 처리된막대는다양한정의를갖는 CDR 을나타내고, 박스처리된영역은 HVR 의범위를보여준다. [0111] 발명을실시하기위한구체적인내용 바람직한실시양태의상세한설명 [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] [0122] 본원에언급된모든참조문헌은구체적으로참고로포함된다. 일반적기술달리언급하지않는한, 본발명의실시는당업계기술에속하는분자생물학 ( 재조합기술포함 ), 미생물학, 세포생물학, 생화학및면역학의통상적인기술을이용할것이다. 그러한기술은문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989)]; [Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; [Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)]; [Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds 1987, 및주기적인업데이트 )]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., ed., 1994)]; [A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988)]; [Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001)] 과같은문헌에충분히설명되어있다. I. 숙주면역 A. 림프구발생및활성화인간에서 2가지주요유형의림프구는 T ( 흉선유래 ) 및 B ( 골수유래 ) 이다. 이들세포는림프구양발생경로에관련된골수및태아간의조혈줄기세포로부터유래한다. 이들줄기세포의자손은 B 또는 T 림프구로성숙하기위해분기하는경로를따른다. 인간 B 림프구발생은전적으로골수내에서일어난다. 반면에, T 세포는골수를벗어난미성숙전구체로부터발생하고혈류를통해흉선으로이동하여, 여기서성숙 T 림프구로증식하고분화한다. 흉선또는골수에서빠져나오는성숙림프구는정지또는 " 휴지 " 상태이고, 즉, 유사분열상불활성이다. 혈류내로분산될때, 이들 " 나이브 " 또는 " 버진 (virgin)" 림프구는다양한 2차또는말초림프장기, 예를들어비장, 림프절또는톤실로이동한다. 대부분의버진림프구는수명이본래짧고, 골수또는흉선을떠난후수일내에사멸한다. 그러나, 그러한세포가항원의존재를가리키는신호를받으면, 이들은활성화되고연속적인라운드의세포분열을겪을수있다. 이어서, 생성되는자손세포중일부는휴지상태로되돌아가기억림프구 ( 본질적으로자극알레르겐과의다음마주침을위해제조된 B 및 T 세포 ) 로된다. 활성화된버진림프구의다른자손은이펙터세포이고, 이들은수일동안만생존하지만, 특이적인방어활동을수행한다. 림프구활성화는휴지림프구가자극될때통과하여분할하고자손을생산하고, 이들중일부는이펙터세포로되는질서정연한일련의사건을나타낸다. 완전한반응은세포증식 ( 유사분열 ) 의유도및면역학적기능의발현을모두포함한다. 림프구는특이적리간드가그의표면상의수용체에결합할때활성화된다. 리간드는 T 세포및 B 세포에대해상이하지만, 생성되는세포내생리학적메카니즘은유사하다. 일부외래항원자체는림프구활성화를유도할수있고, 특히큰중합체항원은 B 세포상에서표면이뮤노글로불린, 또는 T 세포상에서다른당단백질과가교결합한다. 그러나, 대부분의항원은중합체가아니고, 심지어 B 세포에직접결합한다수의경우에도활성화를일으키지못한다. 이러한보다흔한항원들은이들이거의활성화된헬퍼 T 림프구와공동자극될때 B 세포를활성화한다. 그러한자극은 T 세포에의해분비된림포킨으로부터일어날수있지만, B 세포와특정 B 세포표면수용체와상호작용하여 2차신호를생성하는 T 세포표면단백질과의직접접촉에의해가장효율적으로전달된다. B. T 세포 [0124] T 림프구는이뮤노글로불린을발현하지않지만, 대신 T 세포수용체 (TCR) 로불리는표면단백질에의해외래 물질의존재를검출한다. 이들수용체는직접접촉에의해또는다른면역세포의활성에영향을미침으로써 - 11 -
항원을인식한다. 대식세포와함께, T 세포는세포매개면역에관여하는주요세포형이다. [0125] [0126] B 세포와는달리, T 세포는특이적인맥락에서만외래물질을검출할수있다. 특히, T-림프구는먼저작은펩티드로절단된후, 항원제시세포 (APC) 로불리는제2 숙주세포의표면상에나타나는경우에만외래단백질을인식할것이다. 많은유형의숙주세포가일부조건하에서항원을제시할수있지만, 특정유형은그러한목적을위해보다특이적으로개작되고, 이는대식세포및다른 B 세포를비롯해서 T 세포활성을제어하는데특히중요하다. 항원제시는제시세포의표면상의주요조직적합성복합체 (MHC) 단백질로불리는특정단백질에부분적으로의존한다. 따라서, 세포매개면역을자극하기위해, 외래펩티드는 MHC 펩티드와조합되어 T 세포에제시되어야하고, 상기조합은 T 세포수용체에의해인식되어야한다. 2가지중요한 T 세포하위세트 : 세포독성 T 림프구 (T c 세포또는 CTL) 및헬퍼 T 세포 (T H ) 세포가존재하고, 이들은마커 CD8 및 CD4의세포표면발현에기초하여대략확인될수있다. T c 세포는바이러스성방어에중요하고, 특정세포표면발현된바이러스성펩티드를인식함으로써바이러스를직접치사시킬수있다. T H 세포는다른세포형의증식, 성숙및면역기능을촉진하고, 예를들어 B 세포, 대식세포및세포독성 T 세포의활성을제어하도록림포킨분비를촉진한다. 버진및기억 T-림프구은통상휴지상태로남아있고, 이상태에서유의한헬퍼또는세포독성활성을나타내지않는다. 활성화되면, 이들세포는수라운드의유사분열을겪어딸세포를생산한다. 이들딸세포의일부는기억세포로서휴지상태로되돌아가지만, 다른것은헬퍼또는세포독성활성을활발하게나타내는이펙터세포가된다. 이들딸세포는그의모세포를닮는다 : CD4+ 세포는단지 CD4+ 자손만을생산하는한편, CD8+ 세포는단지 CD8+ 자손만을생산할수있다. 이펙터 T 세포는휴지 T 세포상에서발현되지않는세포표면마커, 예컨대 CD25, CD28, CD29, CD40L, 트랜스페린수용체및클래스 II MHC 단백질을발현한다. 활성화자극이없어지면, 이펙터세포는사멸하거나휴지상태로되돌아가므로세포독성또는헬퍼활성은수일의기간에걸쳐점차감퇴한다. [0127] [0128] [0129] [0130] [0131] B 세포활성화와유사하게, 대부분의항원에대한 T-림프구반응은또한 2가지유형의동시자극을필요로한다. 첫번째자극은항원이고, 이는항원제시세포상의 MHC 단백질에의해적절하게표시되면 T 세포수용체가이를인식하고결합할수있다. 상기항원-MHC 복합체가세포내부로신호를보내지만, 이는보통 T 세포활성화를일으키기에는불충분하다. 헬퍼 T 세포에서발생하는것과같은완전한활성화에는항원제시세포의표면상에발현되는공동자극자로불리는다른특이적리간드에의한공동자극이필요하다. 그반면에, 세포독성 T 세포의활성화는일반적으로활성화된헬퍼 T 세포에의해분비된시토카인 IL-2를필요로한다. C. 면역반응다른신체방어와구분되는포유동물면역계의 3가지주요기능적특성은다음을포함한다 : (1) 특이성 - 막대한수의표적분자들사이에서개별적으로인식하고반응하거나반응하지않는능력, (2) 식별 - 모든무수한단백질및다른유기물질과평화롭게공존하지만, 신체로도입되는외래물질에대해여전히격렬하게반응하도록비-자기로부터자기를결정하는능력, 및 (3) 기억 - 특정외래병원체와후속적인마주침이최초마주침에서발생한것보다더신속하고격렬한반응을유발시킬, 경험에의해형성된능력. 하나이상의이러한기능에문제가생기면, 병리학적상태가야기된다. 버진림프구는 1차림프장기로부터말초내로계속방출되고, 각각은항원결합을가능하게하는표면수용체를보유한다. B 세포에서항원결합은표면결합된이뮤노글로불린을통해매개되는반면, T 세포에서는 T 세포수용체에의해매개된다. 버진림프구가활성화될경우, 이들은증식하여딸세포를생성하고, 이들은이어서추가의활성화및증식사이클을겪을수있다. 주어진항원에대한반응의속도및강도는주로클론선택에의해결정되고 : 특정항원에특이적인딸세포또는클론집단이클수록, 면역반응에서인식및참여할수있는세포의수가더많다. 모든면역반응은복합적이고, 몇몇세포형를포함한복잡하게조절되는사건의연속이다. 이는면역원이신체에들어와서항원제시세포 (APC) 로불리는특수한클래스의세포와마주칠때촉발된다. 이들 APC는소량의면역원을포획하여, 이를항원특이적헬퍼 T-림프구가인식할수있는형태로표시한다. 이어서, 헬퍼 T 세포는활성화되고, 다시다른클래스의림프구, 예컨대 B 세포또는세포독성 T 세포의활성화를촉진한다. 이어서, 활성화된림프구는증식하고그의특이적인이펙터기능을수행한다. 상기과정의각단계에서, 림프구및 APC는직접접촉을통해또는조절시토카인을분비함으로써서로소통한다. APC에의해포획된외인성항원은항원프로세싱이라불리는일련의변경을겪는다. 특히단백질성면역원의그러한프로세싱은변성및부분단백질분해적소화를포함하여, 면역원은짧은펩티드로절단된다. 이어서, 제한된수의생성된펩티드는클래스 II MHC 단백질과비공유적으로회합되고, APC 표면으로운반된다 ( 항원제 - 12 -
시로서공지된과정 ). APC 와직접접촉하는 CD4+ 헬퍼 T 림프구는활성화될수있지만, APC 가제시하는특정 펩티드 -MHC 복합체를인식하고결합할수있는 T 세포수용체단백질을발현하는경우에만활성화할것이다. [0132] 헬퍼 T (T H ) 세포는 2 개의다른림프이펙터세포 : 세포독성 T (T c ) 세포및항체분비형질세포의활성화를위 해필요하기때문에면역반응의주요조정자 (orchestrator) 이다. T H 활성화는면역반응에서초기에 일어나고, 적어도 2개의신호를필요로한다. 하나의신호는 CD3 단백질복합체를통해전달되는 APC 표면상의항원성펩티드-MHC 복합체에대한 T 세포항원수용체의결합에의해제공되는한편, APC를통한제2의공동자극신호는 APC 상에특이적리간드를갖는 T 세포표면상의별개의신호-전달단백질의결합으로부터생성되는것으로생각된다. 하나의공지된그러한상호작용은 T 세포단백질 CD28 및 B7로서공지된 APC 표면단백질의패밀리사이의상호작용이다. 다른표면단백질쌍들이또한공동자극을매개할수있다. 공동자극과정을이하에서보다상세하게기재한다. 본발명의항-PD-L1 항체는 PD-L1을통한신호전달에의해제공되는음성공동자극신호의길항작용을통해공동자극을향상시키는것으로여겨진다. [0133] 2개의신호는함께헬퍼 T 세포가시토카인인터류킨-2 (IL-2) 를분비하기시작하도록유도하고, 또한그의표면상에특이적인높은친화성 IL-2 수용체를발현하기시작하도록유도한다. IL-2는 T-림프구에대한매우강력한분열촉진인자이고, 활성화된 T 세포의증식반응에필수적이다. IL-2는그가분비된세포에대해작용한다 ( 자가분비효과로공지된현상 ). T 세포가두신호를모두받더라도, 그자신의표면 IL-2 수용체가차단되면증식하지않을것으로추가로밝혀졌다. IL-2는또한바로근접한세포에대해작용할수있다 ( 소위측분비 (paracrine) 효과 ). 상기효과는 Tc 세포를활성화하기위해특히중요하고, 이는일반적으로그자신의증식을자극하기위해충분한 IL-2를생산하지않는다. IL-2에추가로, 활성화된 T H 세포는다른시토카인을분 비하고, B 세포, 대식세포및다른세포형의성장, 분화및기능을촉진한다. [0134] APC 와항원특이적 T H 세포사이의접촉은또한 APC 에대해효과를가지며 - 가장중요한것중하나는 IL-1 의 방출이다. 이시토카인은자가분비방식으로클래스 II MHC 단백질및다양한부착분자의표면발현이증가되 도록작용하여, T H 세포의결합을강화하고항원제시를향상시키는것으로여겨진다. 동시에, IL-1 은측분비 방식으로 T H 세포에대해기능하여 IL-2 분비및 IL-2 수용체발현을촉진한다. [0135] 앞서설명된방식으로 T H 세포의활성화동안, 일부 B 세포는또한그의항원수용체를통해면역원에부착될수 있고, 이는그들이나중에분비할막-결합형의항체이다. T 세포와는달리, B 세포는면역원을그의유리비프로세싱형태로인식한다. 특이적항원결합은 B 세포활성화를일으킬수있는하나의유형의신호를제공한다. 두번째유형은활성화된 T H 세포에의해제공되고, 이는그의표면상의비-이뮤노글로불린수용체에결합함으로써 B 세포를활성화시키는것을돕는단백질을발현한다. 그의항원특이성에무관하게임의의 B 세포에대해작용하는이들 T H -유래된신호는헬퍼인자로서공지되어있다. 이들헬퍼인자는 IL-2, IL-4 및 IL-6을포함한다. 그러나, 도움은세포-세포접촉을통해보다효율적으로달성되고, 이는 T 세포표면상의단백질이 B 세포상의단백질에직접접촉하도록허용한다. 가장효과적인형태의접촉매개된도움은 T H 세포가활성화된후에만 T H 세포상에서발현되는 CD40 리간드 (CD40L) 로불리는단백질이 B 세포상의 CD40으로불리는단백질에결합할때발생한다. 방관자 (by-stander) 활성화로서공지된과정에서, 활성화된 B 세포와의접촉은그의표면이뮤노글로불린이항원내에연결되지않더라도휴지 B 세포를활성화시키기에충분할수있다. [0136] T c 림프구는그의표면상에외래항원을발현하는세포, 예컨대바이러스감염된숙주세포를근절시키는기능 을한다. 대부분의 T c 세포는 CD4보다는 CD8을발현하고, 따라서클래스 II MHC 단백질보다는클래스 I과회합된항원을인식한다. 체세포가바이러스로감염될때, 일부면역원성바이러스성단백질은세포내에서프로세싱을겪을수있고, 이어서생성되는펩티드는클래스 I MHC 분자와표면복합체로서보일수있다. 이어서, 이들펩티드-MHC 복합체는항원특이적클론의 T 세포수용체에의해인식될수있어서, T c 세포활성화를위해필요한 2개의신호중하나를제공한다. 상기제1 신호는단독으로 T c 세포상에고-친화성 IL-2 수용체를유도한다. 제2 신호는근처의활성화된 T H 림프구로부터분비된 IL-2에의해제공된다. 두신호를받으면, 활성화된 T c 세포는세포독성활성을수득하여, 그가결합하는세포뿐만아니라동일한펩티드-MHC 클래스 I 복합체를보유하는임의의다른세포를치사시킬수있다. 일부경우에, T c 가표적세포상으로특이적독소를방출하므로치사가일어나고 ; 다른경우에, T c 는표적세포가아폽토시스에의해자멸하도록유도한다. 활성화된 T c - 13 -
세포는또한증식하여, 동일한항원특이성을갖는추가의 T c 세포를생성시킨다. [0137] [0138] [0139] [0140] [0141] [0142] [0143] [0144] [0145] D. 이뮤노글로불린슈퍼패밀리에의한공동자극 : 1. B7.1/B7.2 - CD28/CTLA-4 아마도그특징이가장잘규명된 T 세포공동자극경로는 B7.1(CD80)/B7.2(CD86) - CD28/CTLA-4(CD152) 를통한신호중하나일것이다. 이신호전달경로는 T 세포활성화및내성에중요하다. 문헌 [Karandikar et al., J. Neuroimmunol. 89: 10-18 (1998)]; [Oosterwegal et al., Curr. Opin. Immunol. 11: 294-300 (1999)]; [Salomon et al., Annu. Rev. Immunol. 19: 225-252 (2001)]; [Sansom, D.M., Immunol. 101: 169-177 (2000)]; [Chambers et al., Annu. Rev. Immunol. 19: 565-592 (2001)]. B7.1 ( 문헌 [Freeman et al., J. Exp. Med. 174: 625-631 (1991)]; [Freedman et al., J. Immunol. 137: 3260-3267 (1987)]; [Yokochi et al., J. Immunol. 128: 823-827 (1982)]) 및 B7.2 ( 문헌 [Freeman et al., Science 262: 909-911 (1993)]; [Freeman et al., J. Exp. Med. 178: 2185-2192 (1993)]; [Azuma et al., Nature 366: 76-79 (1993)]) 는 2종의자극수용체 CD-28 및 CTLA-4에대해이중특이성을갖는다. 문헌 [Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 (1987)]; [Gross et al., J. Immunol. 144: 3201-3210 (1990)]. CD28은 T 세포의표면에서구성적으로발현되는반면에 ( 문헌 [Gross et al., J. Immunol. 149: 380-388 (1992)]), 더높은친화성수용체인 CTLA-4는 T 세포활성화이후에신속하게상향조절되는발현을갖는다. 문헌 [Peach et al., J. Exp. Med. 180: 2049-2058 (1994)]; [Linsley et al., J. Exp. Med. 176: 1595-1604 (1992)]; [Kinsley et al., Immunity 1: 793-801 (1994)]; [Linsley et al., Immunity 4: 535-543 (1996)]. 대부분의 APC 집단은 B7.2를구성적으로낮은수준으로발현하며, 이는신속하게상향조절되고, 한편 B7.1은활성화이후에더늦게유도적으로발현된다. 문헌 [Freeman et al., Science 262: 909-911 (1993)]; [Hathcock et al., J. Exp. Med. 180: 631-640 (1994)]. B7.2의이전발현및마우스넉아웃데이터는 B7.2가면역반응을개시하기위한보다중요한공동자극분자이지만, 한편으로는 2 분자는그기능이매우중복됨을시사한다. 문헌 [McAdam et al., Immuno. Rev. 165: 631-640 (1994)]. CD28는 B7.1 및 B7.2와상호작용하여신호를전달하고, 이는 TCR 신호와상승작용하여 T 세포활성화를촉진한다. 문헌 [Lenschow et al., Annu. Rev. Immunol. 165: 233-258 (1996)]; [Lanzavecchia et al., Cell 96: 1-4 (1999)]. TCR 신호의부재하에서, CD28 신호전달은생리학적중요성을갖지않는다. CD28 신호전달은 T 세포활성화를위한역치를조절하고, T 세포활성화에요구되는 TCR 부착개수를현저하게감소시킨다. 문헌 [Viola et al., Science 273: 104-106 (1996)]. CD28 활성화는 T 세포생존을촉진하여시토카인이 T 세포클론확장및분화를개시할수있게함으로써 T 세포반응을지속시킨다. 문헌 [Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1333-1337 (1989)]; [Lucas et al., J. Immunol. 154: 5757-5768 (1995)]; [Shahinian et al., Science 261: 609-612 (1993)]; [Sperling et al., J. Immunol. 157: 3909-3917 (1996)]; [Boise et al., Immunity 3: 87-98 (1995)]. CD28은또한이전에활성화된 T 세포의반응을최적화하여, 인터류킨 2 (IL-2) 생산및 T 세포생존을촉진한다. 몇몇반응은 CD28 비의존적인데, 이것이강력한항원자극으로인한공동자극비의존적인지또는다른, 공지되지않은공동자극경로에의존한결과인지는아직분명하지않다. CTLA-4 활성화는음성신호를유발하여, TCR- 및 CD-28 매개신호전달을억제한다. CTLA-4 부착은 IL-2 합성의억제, 세포주기를통한진행및 T 세포반응의종결을야기한다. 문헌 [Walunas et al., Immunity 1: 405-413 (1994)]; [Walunas et al., J. Exp. Med. 183: 2541-2550 (1996)]; [Krummel et al., J. Exp. Med. 182: 459-466 (1995)]; [Brunner et al., J. Immunol. 162: 5813-5820 (1999)]; [Greenwald et al., Immunity 14: 145-155 (2001)]. CTLA-4는말초 T 세포내성을비롯하여 T 세포반응을조절하는데중요한역할을한다. 신호전달이어떻게 CTLA-4 및 CD28을통해조정되는지분명하지않지만, 몇몇가능성에는면역억제시토카인의유도, CD28 신호전달의직접적인길항작용및 / 또는 TCR-매개신호전달에의해 CD28이 B7에의결합에대한경쟁에서제외되는것이포함된다. 그결과, CTLA-4의길항작용 ( 예를들어, 길항제항-CTLA 항체 ) 및또는 B7.1/B7.2/CD28 효능작응은감염 ( 예를들어, 급성및만성 ) 및종양면역을치료하는데있어서면역반응을향상시키는데유용할수있다. 2. ICOS/ICOSL 신호전달 : APC 및 T 세포사이의상호작용의또다른경로는 ICOS (CD278) 및 ICOSL (B7-H2, CD275) 을통해일어난다. ICOS/ICOSL 신호전달은 T 헬퍼세포분화및이펙터기능을촉진하고, 인터류킨-10 (IL-10) 생산을위해특히중요하지만, T 세포, T 세포내성및자가면역을조절하는것을비롯해서 T 세포확장및 IL-2 생산을조절하는 - 14 -
데보다적절한역할을한다. [0146] CD28과대조적으로, ICOS는나이브 T 세포에서구성적으로발현되지않지만, TCR 부착이후에 T 세포상에서신속하게유도된다. 문헌 [Hutloff et al., Nature 397: 263-266 (1999)]; [Yoshinaga et al., Nature 402: 827-832 (1999)]; [Beier et al., Eur. J. Immunol. 30: 3707-3717 (2000)]; [Coyle et al., Immunity 13: 95-105 (2000)]; [Mages et al., Eur. J. Immunol. 30: 1040-1047 (2000)]; [McAdam et al., J. Immunol. 165: 5035-5040 (2000)]. 이는 ICOS가활성화된 T 세포에공동자극신호를제공함을시사한다. CD28에의한공동자극이 ICOS 발현을향상시키고, ICOS 발현은 B7.1 및 B7.2의부재하에서감소되므로, ICOS는 CD28 신호에전적으로의존하지않는다. 문헌 [McAdam et al., J. Immunol. 165: 5035-5040 (2000)]; [Aicher et al., J. Immunol. 164: 4689-4696 (2000)]; [Kopf et al., J. Exp. Med. 192: 53-61 (2000)]. ICOS는초기단계의분화동안 T 헬퍼유형 1 및 2 (T H 1 및 T H 2) 세포둘모두에서상향조절되지만, T H 2 세포상에서는높은수준을유 지하고 T H 1 세포상에서는낮은수준을유지한다. T 세포상에서의 ICOS의발현패턴은배중심이다. 문헌 [Beier et al., Eur. J. Immunol. 30: 3707-3717 (2000)]; [Mages et al., Eur. J. Immunol. 30: 1040-1047 (2000)] 은 B 세포에대한 T 세포도움에있어서의 ICOS의역할을나타낸다. 기능연구를통해이를확인하였고, 심지어 ICOS의발현은래트 B 세포에서도확인되었지만, 다른종에서는그렇지않았다. 문헌 [Tezuka et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 276: 335-345 (2000: McAdam et al., Nature 409: 102-105 (2001)]; [Dong et al., Nature 409: 97-101 (2001)]; [Dong et al., J. Immunol. 166: 3659-3662 (2001)]; [Tafuri et al., Nature 409: 105-109 (2001)]. [0147] ICOS/ICOSL 신호전달의한가지역할은직전에활성화되었을뿐만아니라이펙터인 T 세포에의해시토카인생산 ( 예를들어, IL-4, IL-13) 을조절하는것으로보인다. 문헌 [Hutloff et al., Nature 397: 263-266 (1999)]; [Coyle et al., Immunity 13: 95-105 (2000)]; [Dong et al., Nature 409: 97-101 (2001)]. 알레르기성기도질환연구에서, T H 2 이펙터기능은 ICOS 차단에의해제공되지만 T H 2 분화는그렇지않았다. 문헌 [Tesciuba et al., J. Immunol. 167: 1996-2003 (2001)]. ICOS 가또한 T H 1 이펙터기능을조절할수있다는것은, 시험 관내에서의재활성화시에 T H 1 및 T H 2 시토카인둘모두의생산이 ICOS-Ig 융합단백질에의해억제될수있음을 나타낸다. 문헌 [Kopf et al., J. Exp. Med. 192: 53-61 (2000)]. [0148] ICOS 의또다른잠재적인역할은 T H 1 반응을지속시키는것과관련이있다. 다발성경화증에대한자가면역성 뇌척수염 (EAE) 실험모델에서, 미엘린특이적 CD4 + T 세포에의해매개되는 T H 1 질환은 ICOS 차단의결과가 T 세포초회감작에이은 EAE의이펙터기동안공동자극이차단될때분명해질수있음을보여준다. 문헌 [Dong et al., Nature 409: 97-101 (2001)]; [Rottman et al., Nature Immunol. 2: 605-611 (2001)]; [Sporici et al., Clin. Immunol. 100: 277-288 (2001)]. 미엘린희소돌기아교세포당단백질 (MOG) 에의해유도된 EAE는 ICOS -/- 넉아웃마우스에서매우악화되고 IFN-γ의생산이야생형에비해증가된다. 유사하게, EAE 유도동안의 ICOS 차단은또한 IFN-γ 생산을증가시켜질환을악화시킨다. 따라서, 초회감작동안의 ICOS 차단은반응의 T H 1 분극화를야기한다. 흥미롭게도, 시험관내 ICOS-Ig의존재하에서의미엘린-특이적 TCR 트랜스제닉 T 세포의초회감작은생체내에서관찰된 ICOS-Ig 차단결과와는극명하게대조적으로 EAE를유도하는그의능력을억제하였다. 문헌 [Sporici et al., 상기문헌 ]. 시험관내및생체내에서의반대되는결과의차이는아직분명하지않지만, 생체내 ICOS 차단동안의 IL-10 생산조절 T 세포, 뿐만아니라이펙터 T 세포에대한 ICOS의역할을반영할수있다. IL-10을통한공동자극은 IL-10 생산을향상시키는데매우효과적이며, CD28을통한공동자극에비해더효과적이다. 문헌 [Hutloff et al., 상기문헌 ]. IL-10 -/- 마우스가악화된 EAE를발생하기때문에 ( 그러나 IL4 -/- 마우스는그러하지않음 ) IL-10, IL-12 조절루프는 EAE를조절하는데있어서중요하다. 문헌 [Segal et al., J. Exp. Med. 187: 537-546 (1998)]. [0149] ICOS의또다른잠재적인역할은 T 세포의존성 B 세포체액반응을향상시키는것이다. ICOS -/- 및 ICOSL -/- 마우스는 ICOS가 T 세포의존성 B 세포반응에요구됨을나타내었다. 문헌 [Hutloff et al., Nature 397:263-66 (1999)]; [Chapoval et al., Nat. Immunol. 2:269-74 (2001)]; [Coyle et al., Immunity 13: 95-105 (2000)]; [McAdam et al., Nature 409: 102-5 (2001)]; [Tafuri et al., Nature 409: 105-9 (2001)]; [Suh et al., Nat. Immunol. 4:899-906 (2003)]. ICOS -/- 마우스는또한 1차면역화에반응하여감소된배중심, 2차접종에반응하여배중심형성의엄청난결손, 및 IgG 클래스전환에있어서의결손을나타낸다. T:B 세포상호작용에있어서의 ICOS의역할은성인발병성공통가변성면역결핍질환환자에서 T 세포에서의 ICOS의동질접합체손 - 15 -
실을확인한것에의해추가로밝혀졌다. 문헌 [Grimbacher et al., Nat. Immunol. 4: 261-68 (2003)]. [0150] [0151] [0152] 그결과, ICOS/ICOSL의효능작용 ( 예를들어, 효능제항-ICOS 항체, 가용성 ICOS/ICOSL 리간드 ) 은감염 ( 예를들어, 급성및만성 ) 및 / 또는종양면역을치료하는데있어서면역반응을향상시키는데유용할수있다. 3. PD-1 경로 : T 세포활성화를조절하는중요한음성공동자극신호는프로그램화된사멸 - 1 수용체 (PD-1)(CD279), 및그의리간드결합파트너 PD-L1 (B7-H1, CD274) 및 PD-L2 (B7-DC, CD273) 에의해제공된다. PD-1의음성조절역할 은자가면역되기쉬운 PD-1 넉아웃 (Pdcd1 -/- ) 에의해밝혀졌다. 문헌 [Nishimura et al., Immunity 11: 141-51 (1999)]; [Nishimura et al., Science 291: 319-22 (2001)]. PD-1은 CD28 및 CTLA-4와관련이있지만, 동종이량체화를가능하게하는막인접시스테인이결여되어있다. PD-1의세포질도메인은면역수용체티로신- 기재억제모티프 (ITIM, V/IxYxxL/V) 를함유한다. PD-1는 PD-L1 및 PD-L2와만결합한다. 문헌 [Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1-9 (2000)]; [Dong et al., Nature Med. 5: 1365-1369 (1999)]; [Latchman et al., Nature Immunol. 2: 261-268 (2001)]; [Tseng et al., J. Exp. Med. 193: 839-846 (2001)]. [0153] [0154] [0155] [0156] PD-1은 T 세포, B 세포, 자연살해 T 세포, 활성화된단핵구및수지상세포 (DC) 에서발현될수있다. PD-1은활성화된인간 CD4 + 및 CD8 + T 세포, B 세포및골수세포에의해서는발현되지만, 비자극된인간 CD4 + 및 CD8 + T 세포, B 세포및골수세포에의해서는그렇지않다. 이는보다제한된 CD28 및 CTLA-4 발현과대조적이다. 문헌 [Nishimura et al., Int. Immunol. 8: 773-80 (1996)]; [Boettler et al., J. Virol. 80: 3532-40 (2006)]. (i) 엑손 2, (ii) 엑손 3, (iii) 엑손 2 및 3 또는 (iv) 엑손 2 내지 4가결여된전사체를비롯하여, 활성화된인간 T 세포로부터클로닝된적어도 4 종의 PD-1 변이체가존재한다. 문헌 [Nielsen et al., Cell. Immunol. 235: 109-16 (2005)]. PD-1Δex3을제외하고, 휴지말초혈액단핵세포 (PBMC) 에서모든변이체는전장 PD-1과유사한수준으로발현된다. 모든변이체의발현은항-CD3 및항-CD28에의한인간 T 세포의활성화시에상당히유도된다. PD-1Δex3 변이체는막횡단도메인이결여되어있고, 자가면역에서중요한역할을하는가용성 CTLA-4와유사하다. 문헌 [Ueda et al., Nature 423: 506-11 (2003)]. 이변이체는류마티스관절염환자의활액및혈청에서풍부해진다. 문헌 [Wan et al., J. Immunol. 177: 8844-50 (2006)]. 2 종의 PD-1 리간드는그의발현패턴에있어서상이하다. PD-L1은마우스 T 및 B 세포, CD, 대식세포, 중간엽줄기세포및골수-유래비만세포에서구성적으로발현된다. 문헌 [Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002)]. PD-L1은넓은범위의비조혈세포 ( 예를들어, 각막, 폐, 혈관상피, 간비실질세포, 중간엽줄기세포, 췌장도세포, 태반융합세포영양막, 각질세포등 ) 에서발현되고 ( 문헌 [Keir et al., Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704 (2008)]), 활성화이후에다수의세포형에서상향조절된다. 유형 I 및유형 II 인터페론 (IFN) 은둘모두 PD-L1을상향조절한다. 문헌 [Eppihimer et al., Microcirculation 9: 133-45 (2002)]; [Schreiner et al., J. Neuroimmunol. 155: 172-82 (2004)]. 세포주에서의 PD-L1 발현은 MyD88, TRAF6 및 MEK가억제될경우감소된다. 문헌 [Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007)]. JAK2도또한 PD-L1 유도와관련이있다. 문헌 [Lee et al., FEBS Lett. 580: 755-62 (2006)]; [Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007)]. 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K) 및 Akt 신호전달을변형시키는세포성포스파타제인포스파타제및텐신상동체 (PTEN) 의손실또는억제는암에서전사후 PD-L1 발현을증가시킨다. 문헌 [Parsa et al., Nat. Med. 13: 84-88 (2007)]. PD-L2 발현은 PD-L1 보다제한적이다. PD-L2는 DC, 대식세포, 및골수유래비만세포에서유도적으로발현된다. PD-L2는또한 2/3의휴지복막 B1 세포의약절반에서발현되지만, 통상의 B2 B 세포에서는발현되지않는다. 문헌 [Zhong et al., Eur.J. Immunol. 37: 2405-10 (2007)]. PD-L2+ B1 세포는포스파티딜콜린에결합하고, 박테리아항원에대한선천적인면역반응에중요할수있다. IFN-γ에의한 PD-L2의유도는 NF-κB에부분적으로의존적이다. 문헌 [Liang et al., Eur. J. Immunol. 33: 2706-16 (2003)]. PD-L2는또한 GM-CF, IL-4 및 IFN-γ에의해단핵구및대식세포에서유도될수있다. 문헌 [Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002)]; [Loke et al., PNAS 100:5336-41 (2003)]. PD-1 신호전달은전형적으로세포증식보다시토카인생산에더큰효과를가지며, IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 생산에대해현저한효과를갖는다. PD-1 매개억제성신호전달은또한 TCR 신호전달의강도에의존적이며, 낮은수준의 TCR 자극에서큰억제가전달된다. 이러한감소는 CD28을통한공동자극에의해 ( 문헌 [Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000)]) 또는 IL-2의존재에의해 ( 문헌 [Carter et al., Eur. J. Immunol. - 16 -
32: 634-43 (2002)]) 극복될수있다. [0157] [0158] [0159] [0160] [0161] [0162] [0163] PD-L1 및 PD-L2를통한신호전달이양방향성일수있다는증거가갖춰지고있다. 즉, TCR 또는 BCR 신호전달을변형하는것에더하여, 신호전달은또한 PD-L1 및 PD-L2를발현하는세포로되돌려질수있다. 수지상세포를발덴스트롬마크로글로불린혈증환자로부터단리한천연인간항-PD-L2 항체로처리하는것에의해 MHC II 또는 B7 공동자극분자가상향조절되는것은발견되지않은반면, 그러한세포는전염증성시토카인, 특히 TNF-α 및 IL-6을대량으로생산하고, T 세포증식을자극한다. 문헌 [Nguyen et al., J. Exp. Med. 196: 1393-98 (2002)]. 마우스를이러한항체로처리하는것은또한 (1) 이식된 b16 흑색종에대한내성을향상시키고, 종양특이적 CTL을급속하게유도하였고 ( 문헌 [Radhakrishnan et al., J. Immunol. 170: 1830-38 (2003)]; [Radhakrishnan et al., Cancer Res. 64: 4965-72 (2004)]; [Heckman et al., Eur. J. Immunol. 37: 1827-35 (2007)]); (2) 알레르기성천식마우스모델에서기도염증성질환의발생을차단하였다. 문헌 [Radhakrishnan et al., J. Immunol. 173: 1360-65 (2004)]; [Radhakrishnan et al., J. Allergy Clin. Immunol. 116: 668-74 (2005)]. 수지상세포 ("DC") 로의역신호전달의추가의증거는가용성 PD-1 (Ig 불변영역에융합된 PD-1 EC 도메인 - "s-pd-1") 와함께배양한골수유래 DC의연구로부터나왔다. 문헌 [Kuipers et al., Eur. J. Immunol. 36: 2472-82 (2006)]. 상기 spd-1은항-pd-1의투여를통해가역적인방식으로 DC 활성화를억제하였고, IL-10 생산을증가시켰다. 또한, 여러연구는 PD-L1 또는 PD-L2 수용체가 PD-1에독립적임을보여준다. B7.1은 PD-L1 결합파트너로서이미확인되었다. 문헌 [Butte et al., Immunity 27: 111-22 (2007)]. 화학적가교연구는 PD-L1 및 B7.1이그들의 IgV-유사도메인을통해상호작용할수있음을시사한다. B7.1:PD-L1 상호작용은 T 세포에대해억제신호를유도할수있다. B7.1에의한 CD4+ T 세포상에의 PD-L1의라이게이션또는 PD-L1에의한 CD4+ T 세포상에의 B7.1의라이게이션은억제신호를전달한다. CD28 및 CTLA-4가결여된 T 세포는항-CD3 플러스 B7.1 코팅비드에의한자극시감소된증식및시토카인생산을보인다. B7.1에대한모든수용체 ( 즉, CD28, CTLA-4 및 PD-L1) 가결여된 T 세포에서, T 세포증식및시토카인생산은항-CD3 플러스 B7.1 코팅비드에의해더이상억제되지않는다. 이는 B7.1이 CD28 및 CTLA-4의부재하에 T 세포상의 PD-L1을통해특이적으로작용함을나타낸다. 유사하게, PD-1이결여된 T 세포는항-CD3 플러스 PD-L1 코팅비드의존재하에서의자극시에감소된증식및시토카인생산을나타내었는데, 이는 T 세포상의 B7.1에대한 PD-L1 라이게이션의억제효과를보여준다. T 세포에서 PD-L1에대한공지된모든수용체가결여된경우 ( 즉, PD-1 및 B7.1이없음 ), T 세포증식은더이상항-CD3 플러스 PD-L1 코팅비드에의해악화되지않는다. 즉, PD-L1은 B7.1 또는 PD-1을통해 T 세포에대해억제효과를발휘할수있다. B7.1 및 PD-L1 사이의직접상호작용은공동자극에대한현재의이해가불완전함을시사하며, T 세포상에서의이러한분자의발현에대한중요성을강조한다. PD-L1 -/- T 세포의연구는 T 세포상의 PD-L1이 T 세포시토카인생산을하향조절할수있음을보여준다. 문헌 [Latchman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691-96 (2004)]. PD-L1 및 B7.1이둘모두 T 세포, B 세포, DC 및대식세포에서발현되기때문에, 이들세포형에서 B7.1 및 PD-L1 사이의지향성상호작용에대한가능성이존재한다. 또한, 비조혈세포상의 PD-L1은 T 세포상의 B7.1 뿐만아니라 PD-1과도상호작용할수있는데, 따라서 PD-L1이이들의조절에관련이있는지여부가의문시된다. B7.1:PD-L1 상호작용의억제효과에대한한가지가능한설명은 T 세포 PD-L1이 APC B7.1을 CD28과의상호작용으로부터가두거나분리할수있다는것이다. 그결과, PD-L1을 PD-1, B7.1 또는둘모두와의상호작용으로부터차단하여 PD-L1이 T 세포및다른항원제시세포에음성공동자극신호를전달하는것을막는것을비롯한 PD-L1을통한신호전달의길항작용은감염 ( 예를들어, 급성및만성 ) 및종양면역에대한면역을향상시킬것이다. 또한, 본발명의항-PD-L1 항체는 PD- 1:PD-L1 신호전달의다른성분의길항제, 예를들어길항제항-PD-1 및항-PD-L2 항체와조합될수있다. 4. B7-H3 공동자극신호는또한림프양및비림프양조직에서널리발현되는 B7-H3 (B7RP-2, CD276, PRO352) 을통해제공된다. 문헌 [Chapoval et al., Nat. Immunol. 2: 269-74 (2001)]. 인간에서, B7-H3은 4Ig 및 2Ig 변이체를둘모두갖고 4Ig 형태가우세한반면, 마우스에서는 2Ig 변이체가우세하다. 문헌 [Sun et al., J. Immunol. 168: 6294-97 (2002)]; [Steinberger et al., J. Immunol. 172: 2352-59 (2004)]; [Ling et al., Genomics 82: 365-77 (2003)]. - 17 -
[0164] [0165] [0166] [0167] [0168] 최근의연구는 B7-H3이 T 세포반응의자극제이면서억제제임을보여준다. 자극활성화의증거는다음과같이제공된다 : (1) 항-CD3과조합되어, B7-H3/Ig 융합체는 CD4+ 및 CD8+ T 세포증식을공동자극하고, IFN-γ 및 CD8 용해활성을자극하였고 ( 문헌 [Chapoval et al., Nat. Immunol. 2: 269-74 (2001)]); (2) EL-4 림프종모델의종양에 B7-H3 발현플라스미드를주사한결과 50% 의종양이완전히퇴화되었다 (CD8+ T 세포및 NK 세포에의존적임 ). 그러나, 몇몇최근연구는이러한분자의억제역할을보여준다. B7-H3 -/- APC 넉아웃은 MLR 반응에서이형반응성 T 세포증식을 2배증가시키는것으로나타났다. 항-CD3 및항-CD28에의한 CD4 T 세포의활성화는 B7-H3 형태에의해형질감염된 HLA-DR2에서억제되었다. 문헌 [Ling et al., Genomics 82: 365-77 (2003)]. 그결과 IFN-γ, TNF-α, IL-10 및 GM-CSF의증식및생산이감소되었다. 이러한연구를조화시키는것은, CD28 및 CTLA-4가 B7.1 및 B7.2를통해어떻게신호전달을조절하는지와유사하게, 반대되는기능을갖는 B7-H3에대한 2종의수용체의존재하에서이루어질수있다. 그결과, B7-H3 신호전달의차단은본발명의항-PD-L1 항체와조합할경우감염및종양면역에대한면역반응을향상시키는데기여할수있다. 5. B7-H4 가장최근에 B7 패밀리에포함된것은 B7-H4 (B7x, B7-S1, B7-H.5, VTCN1, PRO1291) 로서, 이것은 T 세포반응의음성조절자이다. 문헌 [Zang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (18), 10388-10392 (2003)]; [Watanabe et al., Nat. Immunol. 4 (7), 670-679 (2003)]; [Prasad, et al., Immunity 18(6), 863-873 (2003)]; [Sica et al., Immunity 18 (6), 849-861 (2003)]. 인간및마우스 B7-H4는둘모두림프양 ( 비장및흉선 ) 및비림프양장기 ( 폐, 간, 고환, 난소, 태반, 골격근, 췌장및소장포함 ) 둘모두에서널리발현된다. B7-H4는 IHC 또는번역수준에서의 B7-H4의조절에의해서는정상인간조직에서검출되지않는다. IHC는 B7-H4가폐및난소종양에서고도로발현됨을나타내었고, 실시간폴리머라제연쇄반응 (PCR) 분석은마우스 B7-H4도역시전립선, 폐및결장암종세포주에서고도로발현됨을보여주었다. B7-H4는 CTLA-4, ICOS, PD-1 및 B7-H3에대한수용체와달리, 활성화되었지만나이브 T 세포가아닌, 아직알려지지않은수용체에결합한다. BTLA가 B7-H4에대한리간드인것으로처음에보고되었지만, 야생형 ( 그러나 BTLA -/- 세포는아님 ) 에대한 B7-H4/Ig 융합체의결합에대한보고는 HVEM이 B7-H4에대한특유한리간드이고 BTLA는그렇지않다는결론을내리게한다. 문헌 [Sedy et al., Nat. Immunol. 6: 90-98 (2004)]. B7-H4 형질감염체및고정된 B7-H4/Ig 융합체에의한연구는 B7-H4가 TCR-매개 CD4 + 및 CD8 + T 세포증식, G0/G1 상에서의세포주기진행, 및 IL-2 생산을억제하는신호를전달하는것으로밝혀내었다. 문헌 [Sica et al., Immunity 18: 849-61 (2003)]; [Zang et al., PNAS 100: 10388-92 (2003)]; [Prasad et al., Immunity 18: 863-73 (2003)]. B7.1 공동자극은 B7-H4/Ig 유도된억제를극복할수없다. 항-B7-H4 항체를차단하면시험관내 T 세포증식및 IL-2 생산이증가된다. 완전프로인트아주반트 (CFA) 중의키홀림펫헤모시아닌 (KLH) 의투여와상응하는생체내항-B7-H4 항체의투여는항-KLH 항체 IgM의생산을약간증가시켰고, 시험관내에서 KLH로재자극하면 T 세포증식및 IL-2 생산을 2배내지 3배증가시켰는데, 이는항-B7-H4의존재하에서생체내 T 세포초회감작이더높아짐을시사한다. 항-B7-H4 차단항체는항-B7-H4 처리된자가면역마우스모 델의뇌에서증가된 CD4 + 및 CD8 + T 세포및 CD11b + 대식세포에서 EAE의개시및중증도를현저하게가속화시켰다. B7-H4에대해이용가능한실험데이터를조합한것은이것이말초조직에서면역반응을하향조절할수있으며, T 세포내성을조절하는데소정의역할을한다는것을시사한다. B7-H4의발현은또한종양면역에있어서숙주면역반응의회피에소정의역할을할수있다. 문헌 [Choi et al., J. Immunol. 171: 4650-54 (2003)]. 그결과, B7-H4의길항작용은본발명의항-PD-L1 항체와조합될경우감염및종양면역에대한면역반응을향상시키는데유용할수있다. [0169] [0170] 6. BTLA: B7 패밀리구성원 BTLA (CD272, BTLA-1) 는 PD-1 및 CTLA와기능적으로유사하다. Th1 세포에대한선별마커로서초기에확인된 BTLA는림프구에서만발현된다. CTLA-4, ICOS 및 PD-1와유사하게, BTLA는활성화동안에 T 세포에서유도된다. 그러나, Th2-세포상에서상승된채로존재하지만 Th1 세포에서는하향조절되는 ICOS와대조적으로, BTLA는 Th1-세포에서발현된채로존재하지만 Th2-세포에서는그렇지않다. PD-1과유사하게, BTLA는또한 B 세포에서발현된다. 문헌 [Gavrieli et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 312: 1236-43 (2003)]. 그러나, BTLA는휴지및활성화 B 세포둘모두에서발현되지만, PD-1은활성화된 B 세포에서상향조 - 18 -
절된다. BTLA 는 2 개의 ITIM 모티프를갖는다. [0171] BTLA 는 B 및 T 림프구둘모두에대해억제효과를발휘한다. 문헌 [Watanabe et al., Nat. Immunol. 4: 670-79 (2003)]. BLTA -/- B 세포는항-IgM에대해미진한반응을나타내지만, 시험관내에서항-CD3에대해증가된반응을나타낸다. 극성 BTLA -/- Th1 세포는시험관내에서항원노출에반응하여증식이약 2배증가되는것으로나타났다. 생체내에서, BTLA -/- 마우스는합텐특이적항체반응에서 3배증가를나타내었고, EAE에대해향상된감수성을나타내었다. BTLA -/- 마우스의표현형은자가면역에대해증가된감수성을나타내는 PD-1 -/- 마우스의표현형과유사하였지만, CTLA-4 -/- 마우스에비해더감지하기어려운표현형이었다. 그러나, 음성조절자로서의그의역할을고려할때, BTLA의차단은본발명의항-PD-L1 항체와조합될경우감염및항종양면역에서의면역반응을향상시키는데유용한것으로판명될수있다. [0172] [0173] [0174] [0175] [0176] [0177] [0178] [0179] [0180] 흥미롭게도, Ig 슈퍼패밀리구성원 BTLA가또한 TNFR 패밀리구성원 HVEM와도상호작용하는것이최근에밝혀졌다. 문헌 [Sedy et al., Nat. Immunol. 6: 90-98 (2005)]; [Gonzalez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 1116-1121 (2005)]. HVEM은이하의 TNFR 패밀리공동자극제하에서고찰한다. E. TNFR 패밀리공동자극제 1.OX40/OX40L (CD134) OX40 (CD134, TXPG1L, TNFRSF4) 및 OX40L (CD134L, CD252, GP34, TNFSF4, TXGP1) 결핍마우스는바이러스성및공통단백질항원둘모두에대해그리고접촉과민반응에서감소된 1차 CD4+ T 세포반응을갖는다. 문헌 [Chen et al., Immunity 11: 689-698 (1999)]; [Kopf et al., Immunity 11: 699-708 (1999)]; [Murata et al., J. Exp. Med. 191: 365-374 (2000)]; [Gramaglia et al., J. Immunol. 165: 3043-3050 (2000)]. 1차반응에서낮은빈도의항원특이적이펙터 T 세포가나중에생성되고, 더적은개수의기억 T 세포가발생한다. 문헌 [Gramaglia et al., 상기문헌 ]. CD27 결핍 T 세포와대조적으로, OX40이결핍된나이브 CD4+ T 세포증식에서초기증식은손상되지않는다. 그러나, 활성화 4-5일후에감소된증식및뚜렷한아폽토시스성세포사멸이발생하며, T 세포가거의장기간생존하지못한다. 문헌 [Rogers et al., Immunity 15: 445-455 (2001)]. OX40-결핍 CD8+ T 세포에의해, 초기세포분열은영향을받지않지만, 1차이펙터세포의축적은항원과접촉하고 3-6일이후에현저하게감소된다. 문헌 [Croft et al., Nat. Immunol. 3: 609-620 (2003)]. 수지상세포또는 T 세포에의한 OX40L의트랜스제닉발현은항원-반응 CD4+ T 세포의개수를증가시키고, 이상 T 세포활성과관련이있는자가면역-유사증상을야기한다. 문헌 [Brocker et al., Eur.J. Immunol. 29:1610-1616 (1999)]; [Murata et al., J. Immunol. 169: 4628-4636 (2002)]. 면역화이후에, 효능제항- OX40 항체를주사하면 1차반응의정점에서보다많은개수의항원-반응성 CD4+ T 세포가축적되고, 생성되는기억 T 세포의개수가함께향상된다. 문헌 [Gramaglia et al., 상기문헌 ], [Bansai-Pakala et al., Nature Med. 7: 907-912 (2001)], [Maxwell et al., J. Immunol. 164: 107-112 (2000)]; [Weatherill et al., Cell. Immunol. 209: 63-75 (2001)]. 1차이펙터 CTL의향상된축적은항원-초회감작마우스를 OX40에대해특이적인효능제항체로처리한경우에발생한다. 문헌 [De Smedt et al., J. Immunol. 168: 661-670 (2002)]. OX40은 1차면역반응의정점에서새롭게생성된이펙터세포의생존을가능하게하는후기작용신호를제공하는것으로보인다. 또한, OX40이 CD28로부터하류에서기능한다는타당한증거가존재하며 - OX40의증가된발현이 CD28 신호에의해매개되는것에더하여, CD28 결핍대 OX40 결핍의기능분석으로초기 1차 T 세포반응이 CD28 신호의부재하에서현저하게손상되지만, 후기반응만은 OX40 신호의부재하에서손상되는것으로밝혀졌다. 문헌 [Rogers et al., Immunity 15: 445-455 (2001)]; [Bertram et al., J. Immunol. 168: 3777-3785 (2002)]. 그결과, 예컨대효능제항체를적용하는것을통한 OX40/OX40L의활성화는본발명의항-PD-L1 항체와조합될경우 T 세포기능이상장애를치료하는데유용할수있을것으로보인다. 2.4-1BB (CD137)/4-1BBL OX40/OX40L과유사하게, 4-1BB (CD137, TNFRSF9) 및 4-1BBL (TNFSF9) 이결핍된 T 세포는 4-1BBL의부재시에 1 차반응에서더적은항원-반응성 CD8+ T 세포축적및더적은기억 T 세포발생을나타낸다. 문헌 [DeBenedette et al., J. Immunol. 163: 4833-4841 (1999)]; [Tan et al., J. Immunol. 163: 4859-4868 (1999)]; [Tan et al., J. Immunol. 164: 2320-2325 (2000)]. 또한, 4-1BBL의차단은 CD8+ T 세포의초기증 - 19 -
식반응을변경시키지않지만, 3-6 일후의 1차반응의정점에서이펙터 CTL의축적을억제하는데, 이는수회분열된세포의아폽토시스로인한것이다. 문헌 [Cooper et al., Eur. J. Immunol. 32: 521-529 (2002)]. 효능제항-4-1BB 항체및항-4-1BBL-형질감염된 APC는또한유사한결과로생성되고 : CTL 및 CD4+ T 세포반응은생체내에서현저하게증가된다. 문헌 [Melero et al., Nature Med. 3: 682-685 (1997)]; [Melero et al., Eur. J. Immunol. 28: 1116-1121 (1998)]; [Takahashi et al., J. Immunol. 162: 5037-5040 (1999)]; [Guinn et al., J. Immunol. 162: 5003-5010 (1999)]; [Halstead et al., Nature Immunol. 3: 536-541 (2002)]; [Takahashi et al., Immunol. Lett. 76: 183-191 (2001)]; [Bansal-Pakala et al., J. Immunol. 169: 5005-5009 (2002)]. 4-1BB-특이적항체는초기증식반응을변경시키지않는데, 이는 4-1BBL 차단실험으로부터의결론을지지하며, 세포생존신호를공급하는데있어서 4-1BB의후기활성을나타낸다. [0181] [0182] [0183] [0184] [0185] [0186] [0187] [0188] [0189] [0190] OX40과같이, 4-1BB도 1차면역반응의정점에서새롭게생성된이펙터세포의생존을가능하게하는후기작용신호를제공하는것으로여겨진다. 또한, 4-1BB이 CD28 보다나중에기능한다는타당한증거가존재하며 - OX40 및 4-1BB의증가된발현이 CD28 신호에의해매개되는것에더하여, CD28 결핍대 4-1BB 결핍의기능분석으로초기 1차 T 세포반응이 CD28 신호의부재하에서현저하게손상되지만, 후기반응만은 OX40 신호의부재하에서손상되는것으로밝혀졌다. 문헌 [Rogers et al., Immunity 15: 445-455 (2001)]; [Bertram et al., J. Immunol. 168: 3777-3785 (2002)]. 효능제항-CD137 항체는 CD8+ CTL이중추적인역할을하는암에서종양퇴화를유도할수있다. 문헌 [Melero et al., Nat. Med. 3: 682-5 (1997)]; [Hirano et al., Cancer Res. 65(3): 1089-96 (2005)]. PD-L1의구성적및유도적발현은 PD-L1의차단에대해가역적인그러한종양에내성을부여한다. 문헌 [Hirano et al.]. 그결과, 예컨대효능제항체를적용하는것을통한 4-1BB/4-BBL의활성화는, 특히 PD-L1 길항제 ( 예를들어, 항-PD-L1 항체 ) 와조합되어 T 세포기능이상장애를치료하는데유용할수있을것으로보인다. 3.CD27/CD27L (CD70) T 세포반응의초기단계에서의 CD27 (TNFRSF7, S152) 및 CD27L (CD70, TNFSF7) 신호전달의중요성은 CD27/CD70 상호작용을방해한시험관내차단연구에서밝혀졌다. 문헌 [Oshima et al., Int. Immunol. 10: 517-526 (1998)]; [Agematsu et al., J. Immunol. 153: 1421-1429 (1994)]; [Hintzen et al., J. Immunol. 154: 2612-2623 (1995)]. CD27이결여된 T 세포는초기에는정상적으로분열되지만, 활성화되고 3일이상이지나면저조하게증식된다. 문헌 [Hendriks et al., Nature Immunol. 1: 433-440 (2000)]. 이는 CD27이 T 세포사멸을조기에억제하는것에의해또는활성화 2-3일이후에분열이지속되도록세포주기에작용하는것에의해나이브 T 세포집단의초기확장을촉진하는데관여함을나타낸다. 이는 CD27-결핍마우스의생체내연구에의해보강되며, 상기연구에서더적은수의항원특이적반응 (4-8 일 ) 및더적은기억 T 세포가 3 주이상에걸쳐발생한다. 문헌 [Hendriks et al., 상기문헌 ]. CD27의발현은 T 세포활성화직후에상향조절되는데, 이는그것이주로이펙터반응의정점이전에초기증식을유지시키는신호를전달함을시사한다. 그결과, 예컨대효능제항체를적용하는것을통한 CD27/CD27L의활성화는, 특히본원에기재된항-PD-L1 항체와조합되어 T 세포기능이상장애를치료하는데유용할수있을것으로보인다. 4.CD30/CD30L (CD153) CD30 (TNFRSF8, Ki-1) 및 CD30L (CD153, TNFSF8) 신호전달은시험관내에서몇몇 T 세포기능에대해공동자극을제공한다. 문헌 [Del Prete et al., J. Exp. Med. 182: 1655-1661 (1995)], [Bowen et al., J. Immunol. 156: 442-449 (1995)]. CD30L에대한차단시약은시험관내에서 Th2 세포의발생을억제하고, Th1 세포의발생을향상시킨다. 이러한활성은 CD30이 Th2 세포및유형 2 세포독성 Tc2 세포에의해우선적으로발현되는것을보여주는데이터와일치한다. 문헌 [Del Prete et al., 상기문헌 ], [Nakamura et al., J. Immunol. 158: 2090-2098 (1996)]. CD30은비극성 1차반응에서나이브 T 세포의활성화 3-4 일후에발현된다. 문헌 [Nakamura et al., 상기문헌 ] 은그역할이유형 2 시토카인-우세반응에국한되지않음을보여준다. CD30/CD30L 신호전달의정확한메카니즘은분명하지않지만, OX40 및 4-1BB와유사할수있는것으로제안되고있다. 입양전달된항원특이적 CD8+ T 세포를 CD30L-결핍마우스에전달한경우, 이들은 1차반응의정점에서많은수로축적되지않고, 더적은기억 T 세포가발생한다. 그결과, CD30도또한 1차반응의정점에서많은수의항원특이적 T 세포의생성을가능하게하는증식및 / 또는생존신호를제공할수있다. 그결과, 예컨대효능제항체를적용하는것을통한 CD27/CD27L의활성화는, 특히본원에기재된항-PD-L1 항체 - 20 -
와조합되어 T 세포기능이상장애를치료하는데유용할수있을것으로보인다. [0191] [0192] [0193] [0194] [0195] [0196] [0197] [0198] 5.HVEM/LIGHT T 세포공동자극에대한 HVEM (HVEA, ATAR, LIGHTR, TNFRSF14, PRO509) 및 LIGHT (CD258, HVEML, TR2, TNFSF14, PRO726) 의효과는 1) LIGHT가또한림프독소-β 수용체 (LTβR) 에결합할수있고, 2) HVEM이가용성 LTα3에결합하므로이에의해복잡하다. 이에따라, HVEM/LIGHT의효과의임의의연구는이러한신호전달시스템에대한다른결합파트너의효과를또한고려해야한다. LIGHT의차단은동종이형혼합-림프구반응 (MLR) 에서초기 T 세포증식및시토카인분비를억제할수있다. 문헌 [Tamada et al., J. Immunol. 164: 4105-4110 (2000)], [Kwon et al., J. Biol. Chem. 272: 14272-14276 (1997)]; [Harrop et al., J. Immunol. 161: 1786-1794 (1998)]; [Tamada et al., Nature Med. 6: 283-289 (2000)]. 전염증성시토카인의생산은 MHC-미스매칭된심장동종이식편에서 LIGHT가차단될경우에억제된다. 문헌 [Ye et al., J. Exp. Med. 195: 795-800 (2002)]. 게다가, 동종이형피부이식편은 LIGHT 및 CD28이둘모두결핍된수용자에서지연된역동학으로인해거부된다. 문헌 [Scheu et al., J. Exp. Med. 195: 1613-1624 (2002)]. 이식편거부를지연시킨다는것은 T 세포클론확장또는시토카인생산의초기억제를나타낼수있다. 이러한결론은 (i) LIGHT-결핍비장세포가동종항원에반응하여 TH1 및 TH2 시토카인둘모두의생산을감소시키고, 세포독성 T 림프구 (CTL) 활성의생성을약화시킴을보여주는시험관내연구 ( 문헌 [Sheu et al., 상기문헌 ]), 및 (ii) LIGHT 차단이동종반응성 CTL의생성을감소시킴을보여주는생체내연구에의해강화된다. 문헌 [Tamada et al., Nature Med. 6: 283-289 (2000)]. 그결과, HVEM/LIGHT는예컨대효능제항체를적용하는것을통해, 특히본원에기재된항-PD-L1 항체와조합되어 T 세포기능이상장애를치료하는데유용할수있을것으로보인다. II. 정의 " 알레르겐 " 또는 " 면역원 " 은면역반응을일으킬수있는임의의분자이다. 본원에서사용되는용어는, 항원분자그자체, 또는그의공급원, 예컨대꽃가루, 동물비듬, 곤충독또는식료품을포괄한다. 이는이뮤노글로불린또는 T 세포수용체에의해특이적으로인식될수있는분자를지칭하는용어항원과대조된다. 면역반응을유도할수있는임의의외래물질은잠재적인알레르겐이다. 천연및합성둘모두로부터기원된많은다양한화학물질들이알레르겐인것으로알려져있다. 복합천연유기화학물질, 특히단백질은항체-매개알레르기를유발하는것으로보이는한편, 단순유기화합물, 무기화학물질, 및금속은 T 세포매개알레르기를보다우세하게유발한다. 일부경우에서, 동일한알레르겐이한유형을초과하는알레르기의원인이될수있다. 알레르겐에의노출은흡입, 주사, 주사, 또는피부접촉을통해일어날수있다. 면역기능장애와관련하여 " 기능장애 " 란, 항원자극에대한반응성이감소된면역상태를지칭한다. 상기용어는항원인식이일어날수있지만후속면역반응이감염또는종양성장을제어하는데효과적이지않은탈진및 / 또는무반응둘모두의공통요소를포함한다. " 내성 " 또는 " 면역내성 " 은면역계가특정항원에대한방어적면역반응을개시하는데실패한것이다. 내성은자연적이거나자기일수있거나 ( 이때신체는그자신의단백질및항원을공격하지못함 ), 또는면역계를조작하는것으로부터유도될수있다. 중심내성은림프구발생동안에생기고, 흉선및골수에서작동된다. 이과정동안, 자기항원을인식하는 T 및 B 림프구는그것이완전한면역적격세포로발생되기이전에제거된다. 이과정은태아발생동안에가장활발하지만, 미성숙림프구가생성됨에따라생애에걸쳐계속된다. 말초 T 세포내성은말초조직에존재하는자기항원에대한기능적무반응을지칭하며, T 및 B 세포성숙및말초진입이후에생긴다. 이러한과정은 " 조절 " T 세포에의해자가반응세포가억제되고, 염증에수반되는공동자극신호의부재하에서항원과맞닥뜨린림프구에서저반응 ( 무반응 ) 이생성되는것을포함한다. " 후천적 " 또는 " 유도된내성 " 은다른환경에서는아마도세포매개또는체액성면역을유도할주어진항원에대한림프양조직의특이적비반응성을특징으로하는, 외부항원에대해면역계가적응한것을지칭한다. 성체에서, 내성은매우많은용량의항원, 또는면역반응을자극하는데요구되는역치미만의작은용량을예컨대정맥내또는가용성항원의설하투여를통해반복투여하여임상적으로유도할수있다. 면역억제는또한내성유도를용이하게한다. 자기내성의파괴는자가면역을야기할수있다. "T 세포기능을향상시키는것 " 은 T 세포가지속적이거나증폭된생물학적기능을갖도록유도하거나, 유발하거나, 또는자극하는것, 또는탈진되거나불활성인 T 세포를재생시키거나재활성화시키는것을의미한다. T 세포기능을향상시키는것의예에는 : CD8 + T 세포로부터 γ-인터페론의분비를증가시키는것, 증식을증가시키는 - 21 -
것, 항원반응성 ( 예를들어, 바이러스또는병원체제거 ) 을개입이전의수준에비해증가시키는것이포함된 다. 한실시양태에서, 향상수준은적어도 50%, 별법적으로 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200% 이다. 이러한향상을측정하는방법은당업자에게공지되어있다. [0199] [0200] [0201] [0202] [0203] "T 세포기능이상장애 " 는항원자극에대한반응성이감소된것을특징으로하는 T 세포의장애또는상태이다. 특정실시양태에서, T 세포기능이상장애는 PD-1을통한부적절한신호전달의증가와특이적으로관련된장애이다. 또다른실시양태에서, T 세포기능이상장애는 T 세포가무반응이거나또는시토카인분비, 증식, 또는세포용해활성을수행하는데있어서의능력이감소된장애이다. 특정측면에서, 감소된반응성은면역원을발현하는병원체또는종양을비효과적으로제어한다. T 세포기능장애를특징으로하는 T 세포기능이상장애의예에는미해결급성감염, 만성감염및종양면역이포함된다. " 만성감염 " 은감염된숙주에서감염원 ( 예를들어, 병원체, 예컨대바이러스, 박테리아, 원생동물성기생충, 진균등 ) 이면역반응을유도하지만, 급성감염동안에서와같이숙주에서소멸되거나제거되지않은감염을지칭한다. 만성감염은지속적이거나, 잠재적이거나또는느릴수있다. 급성감염이면역계에의해전형적으로수일또는수주이내에해소되는반면 ( 예를들어, 인플루엔자 ), 지속감염은비교적낮은수준에서수개월, 수년, 수십년, 또는평생지속될수있다 ( 예를들어, B형간염 ). 대조적으로, 잠재적인감염은급속하게증가하는고등급의감염기간에의해단절되고병원체수준이상승되는장기간의무증상활성을특징으로한다 ( 예를들어, 단순포진 ). 마지막으로, 느린감염은질환증상이점진적이고계속적으로증가되는것을특징으로하는것으로, 예컨대장기간인큐베이션된후임상적증상이개시된이후에장기적이고점진적인임상경과가시작된다. 잠재적및지속적감염과달리, 느린감염은급성바이러스증식기간과함께시작될수없다 ( 예를들어, 피코르나바이러스감염, 비스나바이러스, 스크래피, 크로이츠펠트야콥질환 ). 만성감염을유도할수있는예시적인감염원으로는바이러스 ( 예를들어, 시토메갈로바이러스, 엡스타인바르바이러스, B형간염바이러스, C형간염바이러스, 단순포진바이러스, I형및 II형, 인간면역결핍바이러스, 1형및 2형, 인간파필로마바이러스, 인간 T 림프구친화성바이러스, 1형및 2형, 바리셀라조스터바이러스등 ), 박테리아 ( 예를들어, 미코박테륨투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 리스테리아종, 클레브시엘라뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 스트렙토코쿠스뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae), 스타필로코쿠스아우레우스 (Staphylococcus aureus), 보렐리아종, 헬리코박터피롤리등 ), 원생동물성기생충 ( 예를들어, 리슈마니아종 (Leishmania spp.), 플라시모듐팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 쉬스토소마종 (Schistosoma spp.), 톡소플라즈마종 (Toxoplasma spp.), 트리파노소마종 (Trypanosoma spp.), 타에니아카르시셉스 (Taenia carssiceps) 등 ), 및진균 ( 예를들어, 아스페르길루스종 (Aspergillus spp.), 칸디다알비칸스 (Candida albicans), 콕시디오이데스이미티스 (Coccidioides immitis), 히스토플라스마카프술라툼 (Histoplasma capsulatum), 뉴모시스티스카리니 (Pneumocystis carinii) 등 ) 이포함된다. 추가의감염원으로는프리온또는미스폴딩된단백질이포함되며, 뇌또는뉴런구조에서단백질미스폴딩이추가로계속되는것에의해이들조직에영향을미치고, 아밀로이드플라크가형성되게하여세포사멸, 조직손상및궁극적으로는사망을유발한다. 프리온감염에의해유발되는질환의예로는크로이츠펠트야콥질환및그의변종, 게르스트만슈투로이슬러샤잉커증후군 (GSS), 치사성가족불면증 (sfi), 쿠루, 스크래피, 소에서의소해면상뇌병증 (BSE) (" 광우 " 병으로도알려짐 ), 및그밖의다양한동물의뇌병증형태 [ 예를들어, 전염성밍크뇌병증 (TME), 흰꼬리사슴, 엘크및뮬사슴에서의만성소모성질환 (CWD), 고양이해면상뇌병증, 니알라, 오릭스및그레이터쿠두에서의외래성유제류뇌병증 (EUE), 타조의해면상뇌병증 ] 이포함된다. " 종양면역 " 은종양이면역인식및제거를회피하는과정을지칭한다. 이에따라, 치료개념으로서종양면역은그러한회피가약화될때 " 치료 " 되고, 종양은면역계에의해인식되어공격받는다. 종양인식의예에는종양결합, 종양수축및종양제거가포함된다. "B7-음성공동자극길항제 " ("BNCA") 는 B7 패밀리의구성원에의해매개되는 T 림프구에서발현된세포표면단백질에의하거나또는그를통해매개되는음성공동자극신호를감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 없애거나, 방해하는작용제이다. 한측면에서, BNCA는단독으로또는본발명의항-PD-1 항체와조합되어기능이상 T 세포를비-기능이상으로만들수있다. 또다른측면에서, BNCA는 B7-음성공동자극분자의핵산또는단백질합성, 발현, 신호전달및 / 또는발현후프로세싱을억제하는작용제일수있다. 또다른측면에서, BNCA는 B7-음성공동자극분자에의한신호전달을감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 없애거나, 또는방해하는항체, 항원결합항체단편, BNCA 올리고펩티드, BNCA RNAi 또는 BNCA 소분자이다. B7 음성공동자극분자의예에는 CTLA-4, PD-L1, PD-1, B7.1 (T 세포상에서발현됨 ), PD-L2, B7-H3 및 B7-H4가포함된다. 양성공동자극효능제는 T 림프구상에서발현되는세포표면단백질에의하거나또는그를통해매개되는공동 - 22 -
자극신호를증가시키거나, 향상시키거나, 늘리거나, 또는용이하게하는분자이다. 한측면에서, 양성공동자극분자는양성공동자극경로를활성화하는세포외도메인, 가용성구축물또는효능제항체일수있다. 양성공동자극분자의예에는 B7 슈퍼패밀리분자, 예를들어, B7.1, B7.2, CD28 및 ICOS/ICOSL이포함된다. 추가의예에는 TNFR 패밀리공동자극분자, 예를들어, OX40/OX40L, 41-BB/41-BBL, CD27/CD27L, CD30/CD30L 및 HVEM/LIGHT가포함된다. [0204] [0205] [0206] [0207] [0208] [0209] [0210] " 소분자 " 또는 " 유기소분자 " 는분자량이약 500 달톤미만인것이다. " 간섭 RNA" "RNAi" 는표적유전자의발현을감소시키는, 길이가 10 내지 50 뉴클레오티드인 RNA로, 이때가닥의일부는충분히상보적이다 ( 예를들어, 표적유전자에대해적어도 80% 동일성을가짐 ). RNA 간섭방법은전사후수준 ( 예를들어, 번역 ) 에서일어나는유전자발현의표적특이적억제 ( 즉 " 유전자침묵 ") 를지칭하며, 유전자발현의 RNA 매개억제의모든전사후및전사메카니즘을포함한다 ( 예컨대문헌 [P.D. Zamore, Science 296: 1265 (2002)] 및 [Hannan and Rossi, Nature 431: 371-378 (2004)] 에기재되어있음 ). 본원에서사용되는 RNAi는소형간섭 RNA (sirna), 짧은헤어핀 RNA (shrna), 및 / 또는마이크로 RNA (mirna) 의형태일수있다. 그러한 RNAi 분자는종종, 별개의상보적인또는부분적으로상보적인 RNA 가닥의형태로발현될수있는이중가닥 RNA 복합체이다. 이중가닥 RNA 복합체를설계하는방법은당업계에널리공지되어있다. 예를들어, 적합한 shrna 및 sirna의설계및합성은문헌 [Sandy et al., BioTechniques 39: 215-224 (2005)] 에서찾아볼수있다. " 소형간섭 RNA" 또는 sirna는표적유전자의발현을감소시키는, 길이가 10 내지 50 뉴클레오티드인이중가닥 RNA (dsrna) 이중체로, 이때첫번째가닥의일부는충분히상보적이다 ( 예를들어, 표적유전자에대해적어도 80% 동일성을가짐 ). sirna는종종포유동물세포에서 RNAi의사용과관련된세포자살또는사멸을야기하는상승된인터페론합성, 비특이적단백질합성억제및 RNA 열화를특징으로하는항바이러스반응을회피하도록특이적으로설계된다. 문헌 [Paddison et al., Proc Natl Acad Sci USA 99(3):1443-8. (2002)]. 용어 " 헤어핀 " 은 7-20 뉴클레오티드의루프 RNA 구조를지칭한다. " 짧은헤어핀 RNA" 또는 shrna는표적유전자의발현을감소시키는헤어핀턴을특징으로하는, 길이가 10 내지 50 뉴클레오티드인단일가닥 RNA로, 이때 RNA 가닥의일부는충분히상보적이다 ( 예를들어, 표적유전자에대해적어도 80% 동일성을가짐 ). 용어 " 줄기루프 " 는짧은홑루프로끝나서이중헬릭스를형성하여막대사탕구조를제공하는, 동일한분자염기쌍의두영역사이에서의쌍형성을지칭한다. " 마이크로 RNA" 또는 "mirna" ( 종전에 strna로공지됨 ) 는초기에 " 줄기루프 " 구조를특징으로하는프리-miRNA 로서전사되는, 길이가약 10 내지 70 뉴클레오티드인단일가닥 RNA로, 이는 RNA-유도된침묵복합체 (RISC) 를통해추가로프로세싱된후성숙한 mirna로후속프로세싱된다. "BNCA 간섭 RNA" 또는 "BNCA RNAi" 는바람직하게는 BNCA 핵산에특이적으로결합하고, 그의발현을감소시킨다. 이는 BNCA RNAi가존재하지않는대조군에서의 B7 음성공동자극분자의발현과비교하여 BNCA RNAi가존재할때 B7 음성공동자극분자의발현이더낮아짐을의미한다. BNCA RNAi는공지된방법을이용하여확인및합성할수있다 ( 문헌 [Shi Y., Trends in Genetics 19(1): 9-12 (2003)], WO2003056012, WO2003064621, WO2001/075164, WO2002/044321). "BNCA 올리고펩티드 " 는바람직하게는본원에서기재하는바와같은 B7 음성공동자극펩티드, 예컨대수용체, 리간드또는신호전달성분에각각특이적으로결합하는올리고펩티드이다. 이같은올리고펩티드는공지된올리고펩티드합성방법을사용하여화학적으로합성될수있거나, 또는재조합기술을사용하여제조및정제될수있다. 상기올리고펩티드의길이는대체로적어도약 5개아미노산, 별법적으로길이가적어도약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개아미노산이다. 이같은올리고펩티드는주지된기술을사용하여과도한실험없이확인할수있다. 이와관련하여, 폴리펩티드표적에특이적으로결합할수있는올리고펩티드에대해올리고펩티드라이브러리를스크리닝하는기술이당업계에주지되어있는것으로인지된다 ( 예를들어, 미국특허제5,556,762호, 동제5,750,373호, 동제4,708,871호, 동제4,833,092 호, 동제5,223,409호, 동제5,403,484호, 동제5,571,689호, 동제5,663,143호 ; PCT 출원번호 WO 84/03506 및 WO84/03564; 문헌 [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)]; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)]; [Geysen et al., in Synthetic Peptides as - 23 -
Antigens, 130-149 (1986)]; [Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)]; [Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988)], [Cwirla, S. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378 (1990)]; [Lowman, H.B. et al. Biochemistry, 30:10832 (1991)]; [Clackson, T. et al. Nature, 352: 624 (1991)]; [Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]; [Kang, A.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363 (1991)], 및 [Smith, G. P., Current Opin. Biotechnol., 2:668 (1991)] 참조 ). [0211] [0212] [0213] "BNCA 소분자길항제 " 또는 "BNCA 소분자 " 는바람직하게는 B7 음성공동자극폴리펩티드를특이적으로억제하는, 본원에서정의하는올리고펩티드또는항체이외의유기분자이다. 그러한 B7 음성공동자극신호전달억제는바람직하게는기능이상 T 세포가항원자극에반응성이게한다. 예시적인 BNCA 소분자는공지된방법을이용하여확인가능하고, 화학적으로합성할수있다 ( 예를들어, PCT 출원번호 WO2000/00823 및 WO2000/39585 참조 ). 그러한 BNCA 소분자는통상적으로크기가약 2000 달톤미만이고, 별법적으로크기가약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤미만이며, 바람직하게는본원에서기재하는바와같은 B7 음성자극폴리펩티드에특이적으로결합할수있고, 널리공지되어있는기술을이용하여과도한실험없이확인가능하다. 이와관련하여, 폴리펩티드표적에결합할수있는분자에대해유기분자라이브러리를스크리닝하는기술이당업계에주지되어있는것으로인지된다 ( 예를들어, PCT 공개번호 WO00/00823 및 WO00/39585 참조 ). 용어 " 항생제 " 는미생물, 예컨대바이러스, 박테리아, 진균또는원생동물의성장을특이적으로억제하거나막지만, 투여되는농도및투약간격에서숙주에게치명적이지않은임의의분자를포함한다. 본원에서사용되는용어항생제에는항박테리아제, 항바이러스제, 항진균제및항-원생동물작용제가포함된다. 특정측면에서, 항생제는투여농도및투약간격에서숙주에게비독성이다. 항박테리아항생제또는항박테리아제는살균성 ( 즉직접사멸 ) 또는정균성 ( 즉분열방지 ) 으로넓게분류될수있다. 항-살균항생제는추가로협범위 ( 즉, 단지작은부류의박테리아하위세트, 예를들어그람-음성등에만영향을미치는것 ) 또는광범위 ( 즉, 넓은부류에영향을미치는것 ) 로세분될수있다. 항생제의예에는 (i) 아미노글리코시드, 예를들어아미카신, 겐타미신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 파로마이신, (ii) 안사마이신, 예를들어겔다나마이신, 헤르비마이신, (iii) 카르바세펨, 예를들어로라카르베프, (iv) 카르바페넴, 예를들어어터피넘, 도리페넴, 이미페넴 / 실라스타틴, 메로페넴, (v) 세팔로스포린 ( 제1 세대 ), 예를들어세파드록실, 세파졸린, 세팔로틴, 세팔렉신, (vi) 세팔로스포린 ( 제2 세대 ), 예를들어세파클러, 세파만돌, 세폭시틴, 세프프로질, 세푸록심, (vi) 세팔로스포린 ( 제3 세대 ), 예를들어세픽심, 세프디니르, 세프디토렌, 세포페라존, 세포탁심, 세프포독심, 세프타지딤, 세프티부텐, 세프티족심, 세프트리악손, (vii) 세팔로스포린 ( 제4 세대 ), 예를들어세페핌, (viii) 세팔로스포린 ( 제5 세대 ), 예를들어세프토비프롤, (ix) 글리코펩티드, 예를들어테이코플라닌, 반코마이신, (x) 매크롤리드, 예를들어아지트로마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 에리트로마이신, 록시트로마이신, 트롤레안도마이신, 텔리트로마이신, 스펙티노마이신, (xi) 모노박탐, 예를들어액스트리오넘, (xii) 페니실린, 예를들어아목시실린, 암피실린, 아즐로실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 메치실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린, 피페라실린, 티카르실린, (xiii) 항생제폴리펩티드, 예를들어바시트라신, 콜리스틴, 폴리믹신 B, (xiv) 퀴놀론, 예를들어시프로플록사신, 에녹사신, 가티플록사신, 레보플록사신, 레메플록사신, 목시플록사신, 노르플록사신, 오르플록사신, 트로바플록사신, (xv) 술폰아미드, 예를들어마페나이드, 프론토실, 술프아세트아미드, 술파메티졸, 술파닐아미드, 술파살라진, 술피속사졸, 트리메토프림, 트리메토프림-술파메톡사졸 (TMP-SMX), (xvi) 테트라시클린, 예를들어데메클로시클린, 독시시클린, 미노시클린, 옥시테트라시클린, 테트라시클린및 (xvii) 기타, 예컨대아르스페나민, 클로람페니콜, 클린다마이신, 린코마이신, 에탐부톨, 포스포마이신, 푸시드산, 푸라졸리돈, 이소니아지드, 리네졸리드, 메트로니다졸, 무피로신, 니트로푸란토인, 플라텐시마이신, 피라진아미드, 퀴누프리스틴 / 달포프리스틴, 리팜핀 / 리팜피신또는티니다졸이포함된다. 용어 " 항바이러스제 " 는바이러스의성장, 이환및 / 또는생존을억제하거나막는임의의분자를포함한다. 그러한것으로는항레트로바이러스약물, 예컨대 (1) 역전사효소억제제, 예를들어 : (a) 뉴클레오시드유사체역전 사효소억제제 (NRTI) ( 예를들어, 아시클로비르 / 아시클로비르 ( 조비락스, 조비르 ), 시도포비르, 아지도티미 딘 / 지도부딘 (AZT, 레트로비어 ), 디다노신 (ddi, 비덱스 ; 잘시타빈 (ddc, HIVID ); 스타부딘 (d4t, 제리트 ); 라미부딘 (3TC, 에피비르 ); 아바카비르 ( 지아젠 ); 엠트리시타빈 ( 엠트리바 ); 브리부딘 ( 헬핀 ); 엔테카 비르 ( 바라클루드 ); 이독수리딘 ; 비라미딘 ( 발린트파마슈티칼스 (Valeant Pharmacueticals) 의타리바비린 ), 시티딘뉴클레오시드유사체폴리머라제억제제 PCI-6130, 및파마셋 (Pharmasset)/ 로슈 (Roche) 의전구약물변이 체 ( 예를들어, R7128); 머크 (Merck)/ 이시스파마슈티칼스 (Isis Pharmaceuticals) 의뉴클레오시드유사체억제 - 24 -
제 - MK-0608, (b) 뉴클레오티드유사체역전사효소억제제 (NtRTI) ( 예를들어, 테노포비르 ( 바이리드 ); 아데포비르 ( 프레베온, 헵세라 ); 포미비르센 ( 비트라벤 ); (c) 비-뉴클레오시드역전사효소억제제 (NNRTI), 에파비렌즈 ( 수스티바, 스토크린 ); 네비라핀 ( 비라문 ), 델라비르딘 ( 리스크립터 ), 에트라바이린 ( 인텔렌스 ), 로비리드 ; 비로켐파마 (ViroChem Pharma) 의 HCV RNA-의존성 RNA 폴리머라제의비-뉴클레오시드억제제 - VCH-759, 화이자 (Pfizer) 의 HCV 폴리머라제억제제의비-뉴클레오시드억제제 - PF-868554; 및 (d) 폴리머라제억제제, 예를들어 : 베링거잉겔하임 (Boehringer Ingelheim) 의 C형간염바이러스의 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 - BILB-1941, 로슈의 RNA 폴리머라제억제제 - R1626; ACH-0137171 아킬리온파마슈티칼스 (Achillion Pharmaceuticals) 의레플리카제억제제, R7128 - 로슈 / 파마셋의폴리머라제억제제, ABT-333, 및 ABT-072 - 애보트 (Abbott) 의폴리머라제억제제, BI 207127 - 베링거잉겔하임의폴리머라제억제제, PSI-7851 - 파마셋의폴리머라제억제제, ANA598 - 아나디스파마슈티칼스 (Anadys Pharmaceuticals) 의폴리머라제억제제, MK-3281 - 머크의폴리머라제억제제, IDX184 - 이데닉스 (Idenix) 의폴리머라제억제제, GSK 625433 - 글락소스미스클라인 (Glaxo Smith Kline) 의폴리머라제억제제, INX-189 - 인히비텍스 (Inhibitex) 의폴리머라제억제제, NM283 - 이데닉스의폴리머라제억제제, HCV796 - 와이어쓰 (Wyeth) 의폴리머라제억제제, GL60667 및 GS9190 - 길리아드 (Gilead) 의폴리머라제억제제, PF-00868554 0 화이자의폴리머라제억제제, VCH759, VCH916, VX222 및 VX759 - 비로켐 (Virochem) 의폴리머라제억제제, IDX184 및 IDX375 - 이데닉스의폴리머라제억제제, BMS650032 - 브리스톨마이어스스퀴브 (Bristol Myers Squibb) 의폴리머라제억제제 ; (2) 프로테아제억제제, 예를들어 : 사퀴나비르 ( 포로바세 / 인비라세 ), 리토나비르 ( 노르비르 ), 인디나비르 ( 크릭시반 ), 넬피나비르 ( 비라셉트 ), 암프레나비르 ( 아제너라제 ), 로피나비르 ( 칼레트라 ), 아타자나비르 ( 레야타즈 ), 포삼프레나비르 ( 렉시바 ), 티프라나비르 ( 아프티부스 ), 다루나비르 ( 프레지스타 ), 텔라프라비르 (VX-950); 베르텍스파마슈티칼스 (Vertex Pharmaceuticals) 의제2 세대 HCV 프로테아제억제제 - VX-500 및 VX-813; 인터뮨 (Intermune)/ 로슈의 NS3/4A 프로테아제억제제 - ITMN-191/R-7227, 보세프레비르, 쉐링플라우 (Schering- Plough) 의프로테아제억제제 - SCH 503034, 메디비르 (Medivir)/ 티보텍 (Tibotec) 의 HCV NS3/4A 프로테아제억제제 - TMC435/TMC435350, ACH-1625 아킬리온파마슈티칼스의프로테아제억제제, ACH-806 - 아킬리온 / 길리아드의프로테아제억제제, BI201335 및 BILN 2061 - 베링거잉겔하임의프로테아제억제제, SCH 900518/SP900518 ( 나를라프레비르 ) - 쉐링플라우의프로테아제억제제, MK-7009 - 머크의프로테아제억제제, BMS-650032, BMS-790052 및 BMS-791325 - 브리스톨마이어스스퀴브의프로테아제억제제, R7227 - 로슈의프로테아제억제제, PHX1766 - 페노믹스 (Phenomix) 의프로테아제억제제, AVL-181 - 아빌라테라퓨틱스 (Avila Therapeutics) 의프로테아제억제제, 담녹소, CTS-1027 로슈바이오사이언시즈의프로테아제억제제, VX985 - 베르텍스의프로테아제억제제, VCH-759 및 VCH-917 - 비로켐 / 베르텍스의프로테아제억제제, IDX-136 및 316 - 이데닉스의프로테아제억제제, ABT-450 - 애보트의프로테아제억제제, VBY 376 - 비로베이 (Virobay) 의프로테아제억제제 ; (3) 인테그라제억제제, 예를들어 : 랄테그라비르 ( 이센트레스 ), 엘비테그라비르 ; (4) 뉴클레오시드유사체 / 뉴클레오티드유사체억제제의혼합요법, 아트리플라 ( 테노포비르 + 엠브리시타빈 + 에파비렌즈 ), 컴비버 ( 라미부데인 + 지도부딘 ), (5) 진입또는융합억제제, 예를들어 : 마라비록, 엔푸비르티드, 도코사놀, 항-CD4 항체, 항-gp120 항체, 항-CCR5 항체, HCV NS5a 길항제 : (a) 애로우테라퓨틱스 (Arrow Therapeutics) 의 A-831, A-689 및 AZD 2836, (b) 브리스톨마이어스스퀴브의 BMS-790052 및 BMS-824393, (c) 글락소스미스클라인의 GSK-625433, (d) NS4a 길항제 ACH-1095; (5) 성숙억제제, 예를들어 : 베비리마트및비베콘 ; (6) 바이러스방출억제제, 예를들어 : 자나미비르 ( 릴렌자 ), 오셀타미비르 ( 타미플루 ), 알비돌 ; (7) 면역반응향상제, 예를들어인터페론-α ( 예를들어, 바이오렉스테라퓨틱스 (Biolex Therapeutics) 의 BLX-883 및 BLX 883 CR, 노틸러스바이오테크 (Nautilus Biotech) 의벨레로폰, LG 라이프사이언시즈 (LG Life Sciences) 의지속작용 IFN-α, IFN-α SR, 플라멜테크놀로지스 (Flamel Technologies) 의지속작용 IFN-α2b CR 및 IFN-α2b XL, PEG화 IFN-α ( 예를들어, PEG-IFN-α-2a, 페가시스 ; PEG-IFN-α-2b, 페그인트론 ), IFN-a2b-인간혈청알부민융합단백질 ( 알부페론 ); 인터페론-β, 예를들어 IFN-β-1b ( 베타세론 ), 인터페론-γ, 인터페론-λ, PEG 화인터페론-λ ( 예를들어, 지모게네틱스 / 노보노르디스크 (ZymoGenetics/Novo Nordisk) 의 PEG-rIL-29), 인터페론-ω/ 백혈구 II 인터페론 ( 예를들어, 인타르시아테라퓨틱스 (Intarcia Therapeutics)), 아나디스파마슈티칼스의톨유사수용체 7 효능제, 예를들어이미퀴모드, 이사토리빈및그의전구약물변이체 ( 예를들어, ANA-975 및 ANA-971), 임플리시트바이오사이언스 (Implicit Bioscience) 의오글루파니드 (IM862, L-Glu-L-Trp- - 25 -
OH) 및그의지질- 또는 -글리코실접합변이체, NOV-205 ( 예를들어, 몰릭산 - 노벨로스테라퓨틱스, 인크.(Novelos Therapeutics, Inc.) 의펩티드성항바이러스 ), 엔조바이오켐 (Enzo Biochem) 의항바이러스 EHC18, 감마-D-글루타밀-L-트립토판 ( 예를들어, SCV-07, 사이클론파마슈티칼스 / 베르타 (SciClone Pharmaceuticals/Verta)), 알로페론 ( 예를들어, 알로페론-1-HGVSGHGQHGVHG, 알로페론-2-GVSGHGQHGVHG), CPG 10101 - 콜리파마슈티칼스 / 액틸론 (Coley Pharmaceuticals/Actilon) 의 TLR-9 효능제 ; (8) 항바이러스성상승작용향상제, 즉단독으로는항바이러스특성이거의또는전혀없지만, 다른항바이러스제의효과를향상시키는것 - 예를들어, 클로로퀸, 자몽주스, 히드록시우레아, 레플루노미드, 미코페놀산, 레스베라트롤, 리토나비 ; 뿐만아니라그밖의항바이러스성약물, 예컨대아만타딘, 에독수딘, 팜시클로비르 ( 팜비르 ), 펜시클로비르, 파스카르넷, 포스포넷, 간시클로비르 ( 시토벤, 시메벤, 비트라세르트 ), 갈다실, 이바시타빈, 이뮤노비르, 몰옥시딘, 넥사비르, 페라미비르, 플레코나릴, 포도필로톡신, 리바비린, 리만타딘, 트리플루리딘, 트리지비르, 트로만타딘, 트루바다, 발라시클로비르, 발간시클로비르, 비다라빈, 및인터페론향상제, 예컨대트랜지션테라퓨틱스 (Transition Therapeutics) 의 EMZ702, 히스타민디히드로클로라이드 ( 예를들어, 세플렌 + IFN-α); 및 (9) 그밖의또는분류되지않은항바이러스제, 예컨대 : 케민파마슈티칼스 (Kemin Pharmaceuticals) 의 KPE- 02003002 ( 알테니몰 ), 미토퀴논 - 안티포딘파마슈티칼스 (Antipodean Pharmaceuticals) 의조효소 Q10 항-산화제효능제, 알파-글루코시다제 I 억제제 ( 예를들어, MX-3253 - 미제닉스파마슈티칼스 (Migenix Pharmaceuticals) 의셀고시비르, 카스타노스퍼민, 글루코코르티코이드길항제 ( 예를들어, HCV IRES 억제제, 미페프리스톤, VGX 파마슈티칼스의 VGX-410C), 간효능제 ( 예를들어, 피노바파마슈티칼스 (Phynova Pharmaceuticals) 의 PYN17), 종래약초제로부터유래된항바이러스제, 예를들어피노바파마슈티칼스의 PYN18, 카스파제억제제 ( 예를들어, LB-84451 - LG 라이프사이언시즈, 엠리카산 - 화이자의 PF-03491390/IDN-6556), 시클로필린 A에의결합을막아바이러스복제를억제하는시클로스포린유사체 ( 예를들어, 노파르티스 (Novartis) 의 SDZ NIM 911, 데바이오팜 (Debiopharm) 의 Debio-025) 가포함된다. [0214] 용어 " 항진균제 " 는진균의성장, 이환및 / 또는생존을억제하거나막는임의의분자를포함한다. 그러한것으 로는예를들어 (1) 폴리엔항진균제, 예컨대나타마이신, 리모시딘, 필리핀, 니스타틴, 암포테리신 B, 칸디신 ; (2) 이미다졸, 예컨대미코나졸, 케토코나졸 ( 로트리민 ), 에코나졸, 비포나졸, 부타코나졸, 펜티코나졸, 이소코나졸, 옥시코나졸, 세르타코나졸 ( 에르탁조 ), 설코나졸, 티오코나졸, (3) 트리아졸, 예컨대플루코나졸, 이트라코나졸, 이사부코나졸, 라부코나졸포사코나졸, 보리코나졸, 테르코나졸 ; (4) 알릴아민, 예컨대테르비나핀 ( 라미실 ), 아모로핀, 나프티핀 ( 나프틴 ), 부테나핀 ( 로트리민울트라 ); (5) 에키노칸딘스, 예컨대아니둘라펀진, 카스포펀진, 미카펀진, 및기타항진균특성을갖는물질, 예컨대벤조산, 시클로픽스, 플루시토신, 그리세오풀빈, 젠티안바이올렛, 할로프로진, 톨나프테이트 ( 티낙틴, 데세넥스, 아프타테 ), 운데실렌산, 티트리오일 -- ISO 4730 ( 멜라류카 (Melaleuca) 의오일, 테르핀넨-4-올유형 ) 시트로넬라오일, 레몬그라스, 오렌지오일, 팔마로사오일, 파출리, 레몬머틀, 니임종자오일, 코코넛오일이포함된다. [0215] 용어 " 항 - 원생동물작용제 " 또는 " 항 - 원생동물성작용제 " 는원생동물유기체의성장, 이환및 / 또는생존을억제 하거나막는임의의분자를포함한다. 항 - 원생동물작용제의예에는, (1) 항 - 말라리아작용제, 예를들어, 퀴 닌, 퀴니맥스, 퀴니딘, 퀴니맥스, 클로로퀸 ( 아랄렌 ), 히드록시클로로퀸 ( 플라퀘닐 ), 아모디아킨, 피리메타민 ( 다라프림 ), 술파독신, 프로구아닐, 메플로퀸 ( 라리암 ), 할로판트린, 프리마퀸, 아르테미시닌및그의유도체 ( 예를들어, 아르테메테르, 아르텐수네이트, 디히드로아르테미시닌, 아르테에테르 ), 클린다마이신및그의조합물 ; (2) 프로테아제억제제, 및약물, 벤즈니다졸, 부파르바쿠온, 카바르손, 클리오퀴놀, 디술피람, 에플로르니틴, 에메틴, 푸라졸리돈, 메글루민안티모니에이트, 멜라르소프롤, 메트로니다졸 ( 플라질 ), 밀테포신, 니푸르티목스, 니타족사나이드, 오르니다졸, 파로모마이신술페이트, 펜타미딘, 피리메타민 ( 다라프림 ), 세크니다졸, 티니다졸이포함된다. [0216] 본원에서사용되는용어 " 백신 " 은숙주에접종하였을때특정병원체에대해보호적면역을유도하는임의의비병원성면역원을포함한다. 백신은많은형태를취할수있다. 백신은병원체와중요한항원을공유하지만, 병원체그자체는아닌전체유기체일수있다 ( 예를들어, 우두 ). 또한백신은사멸된것 ( 예를들어, 소크소아마비백신 ) 또는약독화된것 ( 질환생성능을잃은것 - 예를들어, 사빈소아마비백신 ) 으로부터제조될수있다. 백신은또한병원성유기체로부터단리된정제된거대분자로부터제조될수있다. 예를들어, 불활 - 26 -
성형태의가용성박테리아독소를함유하는톡소이드백신 ( 예를들어, 파상풍및디프테리아 ) - 항-독소항체를생성하지만, 무손상박테리아에대해서는면역을생성하지않는다. 서브유닛백신 ( 예를들어, B형간염 ) 은관심병원체로부터단리된단일의면역원성단백질만을함유한다. 합텐접합체백신은관심병원체로부터단리된특정탄수화물또는폴리펩티드에피토프를면역원성운반체, 예컨대파상풍톡소이드에부착시킨것이다. 이러한전략은본질적으로항체생산을유도하기위한합텐으로서에피토프를사용하며, 이어서항체는천연병원체에서동일한에피토프를인식한다. 그러나, 최대한효과적이기위해서는, 그러한백신에는 B 및 T 세포에피토프가둘모두혼입되어야하고, T 세포에피토프는그것이숙주개체의면역계에의해인식되고, 제시되고, 반응될수있는것이보장되도록선택해야한다. [0217] [0218] DNA 백신은숙주세포가근육내로주사되는병원성단백질을코딩하는 DNA를받아들여발현하는능력을이용한다. 본원에서기재하는방법을위해항-PD-L1 항체와조합하여사용할수있는항바이러스백신의예에는페비온바이오테크.(Pevion Biotech.) 의 HCV 백신 ( 비라섬 ), NS3, NS4 및 NS5B에대한세포성 ( 세포독성 T 림프구 CD4+ 및 CD8+) 면역반응을향상시키도록설계된 TG4040 ( 트랜스진비리온 (Transgene viron) 의 MVA-HCV), 크론백 - 이노비오바이오메디칼 (Inovio Biomedical) 의코돈최적화된 NS3/4a DNA 백신, 노파르티스의 HCV/CpG 백신, GI-5005 - 글로베이뮨 (Globeimmune) 의 HCV 백신, IC41 인터셀 (Intercell) 의폴리-L-아르기닌과함께 HCV CD4 및 CD8 T 에피토프를갖는합성펩티드의혼합물이포함된다. [0219] [0220] 면역원에대한숙주반응은아주반트와의혼합물로투여할경우향상될수있다. 면역아주반트는하나이상의다음과같은방식으로기능한다 : (1) 면역원의잔류를연장시키거나, (2) 효과적인면역원크기를증가시키거나 ( 그래서식세포작용및대식세포에의제시를촉진하거나 ), (3) 주사부위로대식세포또는다른면역세포의유입을자극하거나, 또는 (4) 국소시토카인생산및다른면역학적활성을촉진시키는방식. 아주반트의예에는완전프로인트아주반트 (CFA), 알루미늄염, 및마이코박테리아유래단백질, 예컨대뮤라밀디- 또는트리-펩티드가포함된다. 용어 " 항체 " 는모노클로날항체 ( 예를들어, 이뮤노글로불린 Fc 영역을갖는전장항체 ), 다중에피토프특이성을갖는항체조성물, 다중특이적항체 ( 예를들어, 이중특이적항체 ), 디아바디및단일쇄분자뿐만아니라항체단편 ( 예를들어, Fab, F(ab') 2 및 Fv) 를포함한다. 용어 " 이뮤노글로불린 " (Ig) 은본원에서 " 항체 " 와상 호교환적으로사용된다. [0221] 기본 4쇄항체단위는 2개의동일한경쇄 (L) 및 2개의동일한중쇄 (H) 로이루어진이종4량체당단백질이다. IgM 항체는 J 사슬로불리는추가의폴리펩티드와함께 5개의기본이종4량체단위로이루어지고 10개의항원결합부위를함유하는한편, IgA 항체는중합화하여 J 사슬과의조합으로다가어셈블리를형성할수있는 2-5개의기본 4쇄단위를포함한다. IgG의경우, 4쇄단위는일반적으로약 150,000 달톤이다. 각각의 L 쇄는 1 개의공유디술피드결합에의해 H 쇄에연결되지만, 2개의 H 쇄는 H 쇄이소형에따라 1개이상의디술피드결합에의해서로연결된다. 또한, 각 H 쇄및 L 쇄에는일정한간격을두고이격된쇄내디술피드브릿지가존재한다. 각각의 H 쇄는 N-말단에가변도메인 (V H ) 을갖고, 그뒤에 α 및 γ 쇄각각의경우에는 3개의불변 도메인 (C H ), μ 및 ε 이소형의경우에는 4 개의 C H 도메인을갖는다. 각각의 L 사슬은 N- 말단에서가변도메인 (V L ) 을갖고, 이어서, 그의다른말단에서불변도메인을갖는다. V L 은 V H 와정렬되고, C L 은중쇄의제 1 불변 도메인 (C H 1) 과정렬된다. 특정아미노산잔기가경쇄및중쇄가변도메인사이의계면을형성한다고 여겨진다. V H 및 V L 의쌍형성은함께단일항원-결합부위를형성한다. 상이한클래스의항체의구조및특성에대해서는예를들어문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6] 을참조한다. 임의의척추동물종의 L 쇄는이들의불변도메인의아미노산서열을기초로하여카파및람다라고불리는명백히상이한 2가지유형중하나에배정될수있다. 이뮤노글로불린은중쇄의불변도메인 (CH) 의아미노산서열에따라상이한클래스또는이소형으로배정될수있다. 5가지클래스의이뮤노글로불린 : 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로표기되는중쇄를갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이존재한다. γ 및 α 클래스는 CH 서열및기능에서비교적작은차이에기초하여서브클래스로추가로분류되고, 예를들어인간은다음서브클래스 : IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를발현한다. [0222] " 단리된 " 항체는그의생산환경 ( 예를들어, 천연또는재조합 ) 의성분으로부터확인, 분리및 / 또는회수된항 - 27 -
체이다. 바람직하게는, 단리된폴리펩티드에는그의생산환경의다른모든성분과의회합이존재하지않는다. 그의생산환경의오염성분, 예를들어재조합형질감염된세포로부터생성되는것은대개항체에대한연구, 진단또는치료용도를저해할물질이고, 효소, 호르몬및다른단백질성또는비-단백질성용질을포함할수있다. 바람직한실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 예를들어로우리방법으로측정시에항체의 95 중량 % 를초과하는정도로, 일부실시양태에서는 99 중량 % 를초과하는정도로 ; (2) 스피닝컵서열분석기를사용하여 N- 말단또는내부아미노산서열의적어도 15개의잔기를얻기에충분한정도로, 또는 (3) 쿠마시블루또는바람직하게는은염색을이용한환원또는비-환원조건하에서의 SDS-PAGE에의해균일한정도로정제될것이다. 단리된항체는재조합세포내의계내항체를포함하는데, 이는항체천연환경의 1종이상의성분이존재하지않을것이기때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된폴리펩티드또는항체는적어도하나의정제단계에의해제조될것이다. [0223] [0224] [0225] 항체의 " 가변영역 " 또는 " 가변도메인 " 은항체의중쇄또는경쇄의아미노-말단도메인을지칭한다. 중쇄및경쇄의가변도메인은각각 "VH" 및 "VL" 로서칭할수있다. 이들도메인은일반적으로항체의최대가변부분이고 ( 동일한클래스의다른항체에비해 ), 항원결합부위를함유한다. 용어 " 가변 " 은가변도메인의특정분절의서열이항체마다크게상이하다는사실을지칭한다. V 도메인은항원결합을매개하고, 그의특정항원에대한특정항체의특이성을규정한다. 그러나, 가변성은가변도메인의전체범위에걸쳐균등하게분포되지않는다. 대신에, 가변성은경쇄및중쇄가변도메인모두에서초가변영역 (HVR) 으로불리는 3개의세그먼트에농축된다. 가변도메인의보다고도로보존된부분은프레임워크영역 (FR) 이라불린다. 천연중쇄및경쇄의가변도메인은각각주로베타-시트형태의 4개의 FR 영역을포함하는데, 이것은상기베타-시트구조를연결하고일부경우에는베타-시트구조의일부를형성하는루프를형성하는 3개의 HVR에의해연결된다. 각사슬내의 HVR은 FR 영역에의해매우근접하게함께유지되고, 다른사슬의 HVR과함께항체의항원결합부위의형성에기여한다 ( 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조 ). 불변도메인은항원에대한항체의결합에직접관여하지않지만, 다양한이펙터기능, 예컨대항체의존성세포독성에서항체의참여를나타낸다. 본원에서사용되는용어 " 모노클로날항체 " 는실질적으로균질한항체들의집단으로부터수득한항체를지칭하고, 즉, 이러한집단을구성하는개개의항체는소량으로존재할수도있는, 가능한자연발생돌연변이및 / 또는번역후변형 ( 예를들어, 이성질체화, 아미드화 ) 을제외하고는동일하다. 모노클로날항체는단일항원부위에대해지시되며고도로특이적이다. 전형적으로상이한결정자 ( 에피토프 ) 에대해작용하는상이한항체를포함하는폴리클로날항체제제와대조적으로, 각각의모노클로날항체는항원상의단일결정자에대해작용한다. 이러한특이성이외에도, 모노클로날항체는하이브리도마배양에의해합성되고, 다른이뮤노글로불린에의해오염되지않는다는점에서유리하다. 수식어 " 모노클로날 " 은항체의특징을실질적으로균일한항체들의집단으로부터수득된것으로나타내고, 임의의특정방법에의한항체의생산을요구하는것으로해석되지않아야한다. 예를들어, 본발명에따라서사용될모노클로날항체는다양한기술, 예를들어하이브리도마방법 ( 예를들어, [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)]; [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)], [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 ( 예를들어, 미국특허제4,816,567호참조 ), 파지-디스플레이기술 ( 예를들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)] 참조 ) 및인간이뮤노글로불린유전자좌또는인간이뮤노글로불린서열을코딩하는유전자의일부또는전부를갖는동물에서인간또는인간-유사항체를생성하는기술 ( 예를들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국특허제5,545,807호 ; 동제5,545,806호 ; 동제5,569,825호 ; 동제 5,625,126호 ; 동제5,633,425호 ; 및동제5,661,016호 ; [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)]) 로제조될수있다. - 28 -
[0226] [0227] [0228] 용어 " 네이키드 (naked) 항체 " 는세포독성모이어티또는방사성표지에접합되지않은항체를지칭한다. 용어 " 전장항체 ", " 무손상항체 " 또는 " 전체항체 " 는항체단편에반대되는, 그의실질적으로무손상형태의항체를지칭하는것으로상호교환가능하게사용된다. 구체적으로, 전체항체는 Fc 영역을포함하는중쇄및경쇄를갖는것을포함한다. 불변도메인은천연서열불변도메인 ( 예를들어, 인간천연서열불변도메인 ) 또는그의아미노산서열변이체일수있다. 일부경우에, 무손상항체는하나이상의이펙터기능을가질수있다. " 항체단편 " 은무손상항체의일부, 바람직하게는무손상항체의항원결합및 / 또는가변영역을포함한다. 항체단편의예는 Fab, Fab', F(ab') 2 및 Fv 단편 ; 디아바디 ; 선형항체 ( 미국특허제5,641,870호의실시예 2; 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]] 참조 ); 단일쇄항체분자및항체단편으로부터형성된다중특이적항체를포함한다. 항체를파파인소화시키면 "Fab" 단편이라불리는 2개의동일한항원결합단편, 및나머지 "Fc" 단편 ( 이명칭은쉽게결정되는능력을반영함 ) 을생성시킨다. Fab 단편은 H 쇄의가변영역도메인 (V H ) 및 1개중쇄의제1 불변도메인 (C H 1) 및 L 쇄전체로이루어진다. 각 Fab 단편은항원결합에대해 1가이고, 즉, 단일항원-결합부위를갖는다. 항체를펩신처리하면상이한항원결합활성을갖는 2개의디술피드연결된 Fab 단편에대략상응하는단일의큰 F(ab') 2 단편을생성시키고, 여전히항원에가교결합할수있다. Fab' 단편은항체힌지영역으로부터의하나이상의시스테인을포함하는 C H 1 도메인의카르복시말단에서몇개의잔기가추가된점에서 Fab 단편과상이하다. 본원에서, Fab'-SH는불변도메인의시스테인잔기 ( 들 ) 이유리티올기를보유하는 Fab' 에대한명칭이다. F(ab') 2 항체단편은원래 Fab' 단편들사이에힌지시스테인을갖는, Fab' 단편들의쌍으로서생성되었다. 항체단편의다른화학적커플링도공지되어있다. [0229] [0230] [0231] Fc 단편은디술피드에의해함께결합되어있는 H 쇄 2개모두의카르복시-말단부분을포함한다. 항체의이펙터기능은 Fc 영역내의서열에의해결정되고, 이영역은또한특정유형의세포상에서발견되는 Fc 수용체 (FcR) 에의해인식된다. "Fv" 는완전한항원-인식부위및항원-결합부위를함유하는최소항체단편이다. 이단편은 1개의중쇄가변영역도메인및 1개의경쇄가변영역도메인이단단하게비-공유적으로회합된이량체로이루어진다. 이들 2 개도메인이폴딩되어 6개의초가변루프 (H 쇄및 L 쇄로부터각각 3개의루프 ) 가형성되는데, 상기루프는항원결합을위한아미노산잔기를제공하고항체에항원결합특이성을부여한다. 그러나, 단일가변도메인 ( 또는항원에특이적인 3개의 HVR만을포함하는 Fv의절반 ) 일지라도전체결합부위보다친화성이낮긴하지만항원을인식하고결합하는능력을갖는다. "sfv" 또는 "scfv" 로도약칭되는 " 단일쇄 Fv" 는단일폴리펩티드쇄로연결되어있는 V H 및 V L 항체도메인을포 함하는항체단편이다. 바람직하게는, sfv 폴리펩티드는 sfv가항원결합을위한목적하는구조를형성할수있도록하는, V H 및 V L 도메인사이의폴리펩티드링커를추가로포함한다. sfv에관해서는문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 을참조한다. [0232] [0233] 본발명의항체의 " 기능적단편 " 은무손상항체의일부, 예를들어일반적으로무손상항체의항원결합또는가변영역, 또는변형된 FcR 결합능력을보유하거나갖는항체의 Fc 영역을포함한다. 항체단편의예는선형항체, 단일쇄항체분자및항체단편으로부터형성된다중특이적항체를포함한다. 용어 " 디아바디 " 는 V 도메인의사슬간이아닌사슬내쌍형성이달성되어 2가단편, 즉, 2개의항원결합부위를갖는단편을생성하도록, V H 및 V L 도메인사이에짧은링커 ( 약 5-10개잔기 ) 를사용하여 sfv 단편 ( 상기단락 참조 ) 을구성함으로써제조된작은항체단편을지칭한다. 이중특이적디아바디는 2개항체의 V H 도메인및 V L 도메인이상이한폴리펩티드쇄에존재하는 2개의 " 가교 " sfv 단편으로이루어진이종이량체이다. 디아바디는예를들어 EP 404,097; WO 93/11161; 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)] 에보다상세하게기재되어있다. [0234] 구체적으로, 본원에서의모노클로날항체는중쇄및 / 또는경쇄의일부가특정종으로부터유래되거나특정항체 클래스또는하위클래스에속하는항체의상응하는서열과동일하거나상동성이고, 쇄 ( 들 ) 의나머지부분은또 다른종으로부터유래되거나또다른항체클래스또는하위클래스에속하는항체의상응하는서열과동일하거 - 29 -
나상동성인 " 키메라 " 항체 ( 이뮤노글로불린 ), 및또한원하는생물학적활성을나타내는한은이러한항체의단편을포함한다 ( 미국특허제4,816,567호 ; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]). 본원에서의관심키메라항체는프리마티즈드 항체를포함하고, 여기서항체의항원결합영역은예를들어마카쿠원숭이를관심항원으로면역화하는것에의해생산된항체로부터유래한다. 본원에서사용되는, " 인간화항체 " 는 " 키메라항체 " 의하위세트로사용된다. [0235] [0236] [0237] [0238] 비-인간 ( 예를들어, 뮤린 ) 항체의 " 인간화 " 형태는비-인간이뮤노글로불린에서유래된최소서열을함유하는키메라항체이다. 한실시양태에서, 인간화항체는수용자의 HVR ( 이하정의됨 ) 로부터의잔기가비인간종 ( 공여자항체 ), 예를들어목적하는특이성, 친화성및 / 또는능력을갖는마우스, 래트, 토끼또는비-인간영장류의 HVR로부터의잔기로대체된인간이뮤노글로불린 ( 수용자항체 ) 이다. 일부예에서, 인간이뮤노글로불린의프레임워크 ("FR") 잔기를상응하는비-인간잔기로대체한다. 추가로, 인간화항체는수용자항체또는공여자항체에서는발견되지않는잔기를포함할수도있다. 상기변형은항체성능, 예를들어결합친화성을보다개량하기위해이루어질수있다. 일반적으로, 인간화항체는적어도하나의, 일반적으로 2개의가변도메인을실질적으로모두포함할것이고, 모든또는실질적으로모든초가변루프는비인간이뮤노글로불린서열의그것에대응하고, 모든또는실질적으로모든 FR 영역은인간이뮤노글로불린서열의것이지만, FR 영역은항체성능, 예를들어결합친화성, 이성질체화, 면역원성등을개선시키는하나이상의개별적인 FR 잔기치환을포함할수있다. FR 중이들아미노산치환의수는전형적으로 H 쇄에서 6 이하, L 쇄에서는 3 이하이다. 또한, 인간화항체는임의로이뮤노글로불린불변영역 (Fc) 중적어도일부, 전형적으로는인간이뮤노글로불린불변영역의적어도일부를포함할것이다. 추가의세부사항에대해서는, 예를들어문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)] 을참조한다. 또한, 예를들어문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및미국특허제6,982,321호및동제7,087,409호도참조한다. " 인간항체 " 는인간에의해생산되고 / 되거나본원에개시되는임의의인간항체제조기술을사용하여제조된항체에대응하는아미노산서열을갖는항체이다. 인간항체의이러한정의는비-인간항원-결합잔기를포함하는인간화항체는명확하게제외한다. 인간항체는파지-디스플레이라이브러리를포함한당해분야에공지된각종기술을사용하여생성할수있다. 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 또한, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)] 에기재된방법도인간모노클로날항체의제조에이용가능하다. 또한, 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)] 을참조한다. 인간항체는항원시험접종에반응하여이러한항체를생성하도록변형되었으나내인성유전자좌는무력화시킨트랜스제닉동물, 예를들어면역화된제노마우스 (xenomice) 에게항원을투여하여제조될수있다 ( 예를들어, 제노마우스 (XENOMOUSE) 기술에관한미국특허제6,075,181호및동제6,150,584호참조 ). 또한, 예를들어인간 B 세포하이브리도마기술을통해생성된인간항체에관한문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)] 도참조한다. 용어 " 초가변영역 ", "HVR", 또는 "HV" 는본원에서사용될때서열에서초가변이고 / 이거나구조상규정된루프를형성하는항체가변도메인의영역을지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR - VH 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3) 를포함한다. 천연항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서가장높은다양성을나타내고, 특히 H3은항체에정밀한특이성을부여하는데특유의역할을수행한다고여겨진다. 예를들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)]; [Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)] 을참조한다. 실제로, 중쇄만으로이루어진자연발생카멜리드 (camelid) 항체는경쇄의부재하에기능적이고안정적이다. 예를들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]; [Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)] 을참조한다. 많은 HVR 설명이사용되고있고본원에포함된다. 카바트상보성결정영역 (CDR) 은서열가변성에기초한것이며, 가장흔히사용되고있다 ( 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 대신, 코티아 (Chothia) 는구조적루프의위치를지칭한다 ( 문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM HVR은카바트 HVR과코티아구조적루프사이의절충안을나타내고, 옥스포드몰레큘라 (Oxford Molecular) 의 AbM 항체모델링소프트웨어에의해사용된다. " 접촉 " HVR은이용가능한복합결정구조의분석을기초로 - 30 -
한다. 이들 HVR 각각으로부터의잔기가다음에제시된다. [0239] [0240] [0241] [0242] [0243] [0244] HVR은다음과같이 " 연장된 HVR" 을포함할수있다 : VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변도메인잔기는각각의상기정의에대해문헌 [Kabat et al., 상기문헌 ] 에따라넘버링된다. 표현 " 카바트에서와같은가변도메인잔기넘버링 " 또는 " 카바트에서와같은아미노산위치넘버링 " 및이것의변형형태는문헌 [Kabat et al., 상기문헌 ] 에서항체편집 (compilation) 의중쇄가변도메인또는경쇄가변도메인에사용된넘버링시스템을지칭한다. 이러한넘버링시스템을이용하여, 실제선형아미노산서열은가변도메인의 FR 또는 HVR의단축또는이것으로의삽입에상응하는보다적은또는추가의아미노산을함유할수있다. 예를들어, 중쇄가변도메인은 H2의잔기 52 후에단일아미노산삽입 ( 카바트에따른잔기 52a), 및중쇄 FR 잔기 82 후에삽입된잔기 ( 예를들어, 카바트에따른잔기 82a, 82b 및 82c 등 ) 를포함할수있다. 잔기의카바트넘버링은항체서열의상동성영역에서 " 표준 " 카바트넘버링된서열과정렬함으로써주어진항체에대하여결정할수있다. " 프레임워크 " 또는 "FR" 잔기는본원에서규정되는 HVR 잔기이외의다른가변도메인잔기이다. " 인간컨센서스프레임워크 " 또는 " 수용자인간프레임워크 " 는인간이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크서열의선택시에가장흔하게발생하는아미노산잔기를나타내는프레임워크이다. 일반적으로, 인간이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의선택은가변도메인서열의하위군으로부터행한다. 일반적으로, 서열의하위군은문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5 th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 에서와같은하위군이다. 예에는, VL의경우하위군이문헌 [Kabat et al., 상기문헌 ] 에서와같이하위군카파 I, 카파 II, 카파 III 또는카파 IV일수있는것이포함된다. 추가로, VH의경우하위군은문헌 [Kabat et al., 상기문헌 ] 에서와같이하위군 I, 하위군 II, 또는하위군 III일수있다. 별법적으로, 인간컨센서스프레임워크는공여자프레임워크서열을다양한인간프레임워크서열의집합과정렬하여인간프레임워크잔기를공여자프레임워크에대한상동성에기초하여선택하는경우에서와같이상기특정잔기로부터유래될수있다. 인간이뮤노글로불린프레임워크또는인간컨센서스프레임워크 " 로부터유래된 " 수용자인간프레임워크는그의동일한아미노산서열을포함할수있거나, 또는이미존재하는아미노산서열변화를함유할수있다. 일부실시양태에서, 이미존재하는아미노산변화의수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. "VH 하위군 III 컨센서스프레임워크 " 는문헌 [Kabat et al., 상기문헌 ] 의가변중쇄하위군 III 내의아미노산서열로부터수득된컨센서스서열을포함한다. 한실시양태에서, VH 하위군 III 컨센서스프레임워크아미노산서열은각각의하기서열의적어도일부또는전부를포함한다 :,,,. [0245] "VL 카파 I 컨센서스프레임워크 " 는문헌 [Kabat et al., 상기문헌 ] 의가변경쇄카파하위군 I 내의아미노산 서열로부터수득된컨센서스서열을포함한다. 한실시양태에서, VH 하위군 I 컨센서스프레임워크아미노산 서열은각각의다음서열의적어도일부또는전부를포함한다 :,,,. - 31 -
[0246] [0247] [0248] [0249] [0250] [0251] [0252] 예를들어 Fc 영역의특정위치에서 " 아미노산변형 " 은특정잔기의치환또는결실또는특정잔기에인접한적어도하나의아미노산잔기의삽입을지칭한다. 특정잔기에 " 인접한 " 삽입은그의 1 또는 2개의잔기내의삽입을의미한다. 삽입은특정잔기에대해 N-말단또는 C-말단일수있다. 본원에서바람직한아미노산변형은치환이다. " 친화성성숙 " 항체는변경 ( 들 ) 을갖지않는모항체에비해항원에대한항체의친화성을개선시키는, 그의하나이상의 HVR에하나이상의변경을갖는항체이다. 한실시양태에서, 친화성성숙항체는표적항원에대한나노몰또는심지어피코몰의친화성을갖는다. 친화성성숙항체는당업계에공지된절차에의해생성된다. 예를들어, 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)] 에서는 VH 및 VL 도메인셔플링 (shuffling) 에의한친화성성숙을기재하고있다. HVR 및 / 또는프레임워크잔기의무작위돌연변이유발에대해서는, 예를들어문헌 [Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)] 에기재되어있다. 본원에서사용되는용어 "~ 에특이적으로결합한다 " 또는 "~ 에특이적인 " 은생물분자를포함하는이종분자집단의존재하에서표적의존재를결정할수있는것으로, 측정가능하고재생가능한상호작용, 예컨대표적및항체사이의결합을지칭한다. 예를들어, 표적 ( 에피토프일수있음 ) 에특이적으로결합하는항체는다른표적에결합하는것에비해이표적에더높은친화성, 결합성, 더큰용이성, 및 / 또는더긴기간동안결합하는항체이다. 한실시양태에서, 비관련표적에항체가결합하는정도는, 예를들어방사선면역검정 (RIA) 으로측정시, 표적에대한항체의결합의약 10% 미만이다. 특정실시양태에서, 표적에특이적으로결합하는항체의해리상수 (Kd) 는 1 μm, 100 nm, 10 nm, 1 nm, 또는 0.1 nm이다. 특정실시양태에서, 항체는상이한종으로부터의단백질사이에보존된단백질상의에피토프에특이적으로결합한다. 또다른실시양태에서, 특이적결합에는배타적인결합이포함될수있지만, 배타적인결합이요구되는것은아니다. " 차단 " 항체또는 " 길항제 " 항체는그가결합하는항원의생물학적활성을억제하거나감소시키는항체이다. 일부실시양태에서, 차단항체또는길항제항체는항원의생물학적활성을실질적으로또는완전히억제한다. 본발명의항-PD-L1 항체는 T 세포에의한기능적반응이항원자극에대해기능이상상태로부터회복되도록 PD-1을통한신호전달을차단한다. " 효능제 " 또는활성화항체는그것이결합하는항원에의한신호전달을향상시키거나개시하는것이다. 일부실시양태에서, 효능제항체는천연리간드없이신호전달을유발하거나활성화한다. 용어 " 고체상 " 은본발명의항체가부착될수있는비수성매트릭스를의미한다. 본원에포함되는고체상의예는부분적으로또는전적으로유리 ( 예를들어, 공극이제어된유리 ), 폴리사카라이드 ( 예를들어, 아가로스 ), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐알콜및실리콘으로형성된것을포함한다. 특정실시양태에서, 문맥에따라고체상은검정플레이트의웰을포함할수있으며 ; 다른실시양태에서고체상은정제칼럼 ( 예를들어, 친화성크로마토그래피칼럼 ) 이다. 상기용어는또한미국특허제4,275,149호에기재된것과같은별개입자의불연속고체상도포함한다. " 항체이펙터기능 " 은항체의 Fc 영역 ( 천연서열 Fc 영역또는아미노산서열변이체 Fc 영역 ) 에서기인한생물학적활성을지칭하며, 항체이소형에따라다양하다. 항체이펙터기능의예에는 C1q 결합및보체의존성세포독성 ; Fc 수용체결합 ; 항체 - 의존성세포매개세포독성 (ADCC); 식세포작용 ; 세포표면수용체 ( 예를들어, B 세포수용체 ) 의하향조절 ; 및 B 세포활성화가포함된다. " 감소되거나최소화된 " 항체이펙터기능이란야생형또는비변형항체로부터적어도 50% ( 별법적으로 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99%) 만큼감소된것을의미한다. 항체이펙터이펙터기능의판단은당업자가용이하게판단및측정가능하다. 바람직한실시양태에서, 보체결합, 보체의존성세포독성및항체의존성세포독성의항체이펙터기능이영향을받는다. 본발명의일부실시양태에서, 이펙터기능은글리코실화를제거하는불변영역에서의돌연변이, 예를들어 " 비-이펙터돌연변이 " 를통해제거된다. 한측면에서, 비-이펙터돌연변이는 CH2 영역에서의 N297A 또는 DANA 돌연변이 (D265A + N297A) 이다. 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (9): 6591-6604 (2001)]. 별법적으로, 감소되거나제거된이펙터기능을야기하는추가의돌연변이에는 K322A 및 L234A/L235A (LALA) 가포함된다. 별법적으로, 이펙터기능은생산기술, 예컨대글리코실화되지않거나 ( 예를들어, 이. 콜라이 ) 또는이펙터기능을촉진하는데효과가없거나덜효과적인변경된글리코실화패턴을야기하는숙주세포에서의발현을통해감소시키거나제거할수있다 ( 예를들어, 문헌 [Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (2003)]). - 32 -
[0253] [0254] [0255] [0256] [0257] [0258] [0259] " 항체의존성세포매개세포독성 " 또는 ADCC는특정세포독성의세포 ( 예를들어자연살해 (NK) 세포, 호중구및대식세포 ) 에존재하는 Fc 수용체 (FcR) 에결합된분비된 Ig가, 상기세포독성의이펙터세포가항원보유표적세포에특이적으로결합한후, 표적세포를세포독소로사멸시키도록만드는세포독성의한형태를지칭한다. 항체는세포독성세포를 " 무장 " 시키고, 상기메카니즘으로표적세포를치사시키는데필요하다. ADCC를매개하는주요세포인 NK 세포는 FcγRIII만을발현하는반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을발현한다. 조혈세포상의 Fc 발현은문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)] 의 464 페이지표 3에요약되어있다. 관심분자의 ADCC 활성을평가하기위해, 시험관내 ADCC 검정, 예를들어미국특허제5,500,362호또는동제5,821,337호에기재된검정을수행할수있다. 이러한검정에유용한이펙터세포는말초혈액단핵세포 (PBMC) 및자연살해 (NK) 세포를포함한다. 별법적으로, 또는추가로, 관심분자의 ADCC 활성은생체내에서, 예를들어문헌 [Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)] 에개시된동물모델에서평가할수있다. 본원에서달리나타내지않는한, 이뮤노글로불린중쇄내잔기의넘버링은문헌 [Kabat et al., 상기문헌 ] 에서와같은 EU 색인의넘버링이다. " 카바트에서와같은 EU 색인 " 은인간 IgG1 EU 항체의잔기넘버링을지칭한다. 본원에서의용어 "Fc 영역 " 은이뮤노글로불린중쇄의 C-말단영역, 예를들어천연서열 Fc 영역또는변이체 Fc 영역을정의하기위하여사용된다. 이뮤노글로불린중쇄의 Fc 영역의경계는달라질수있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은일반적으로위치 Cys226 또는 Pro230의아미노산잔기로부터이것의카르복실말단까지의스트레치인것으로정의된다. Fc 영역의 C-말단리신 (EU 넘버링시스템에따른잔기 447) 은예를들어항체의생성또는정제동안또는항체의중쇄를코딩하는핵산의재조합조작에의해제거될수있다. 따라서, 무손상항체의조성물은모든 K447 잔기가제거된항체집단, K447 잔기가제거되지않는항체집단, 및 K447 잔기가존재하거나존재하지않는항체들의혼합물을갖는항체집단을포함할수있다. 본발명의항체에사용하기적합한천연서열 Fc 영역은인간 IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4를포함한다. "Fc 수용체 " 또는 "FcR" 은항체의 Fc 영역에결합하는수용체를기재한다. 바람직한 FcR은천연서열인간 FcR 이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 ( 감마수용체 ) 에결합하는것이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위클래스의수용체의대립유전자변이체및선택적스플라이싱된형태를비롯한상기수용체를포함하며, FcγRII 수용체는 FcγRIIA (" 활성화수용체 ") 및 FcγRIIB (" 억제수용체 ") 를포함하고, 이들은그의세포질도메인에서주로상이한유사한아미노산서열을갖는다. 활성화수용체 FcγRIIA는그의세포질도메인에면역수용체티로신-기재의활성화모티프 (ITAM) 를함유한다. 억제수용체 FcγRIIB는그의세포질도메인에면역수용체티로신-기재의억제모티프 (ITIM) 를함유한다. ( 문헌 [M. Daeeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조 ). FcR은문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)] 에서고찰된다. 추후에확인될것을포함하는기타 FcR이본원의용어 "FcR" 에포함된다. 용어 "Fc 수용체 " 또는 "FcR" 은또한모체 IgG의태아로의전달을담당하는신생아의수용체인 FcRn을포함한다. 문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]. FcRn에대한결합을측정하는방법은공지되어있다 ( 예를들어, 문헌 [Ghetie and Ward, Immunol. Today 18:(12):592-8 (1997)]; [Ghetie et al., Nature Biotechnology 15(7):637-40 (1997)]; [Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6 (2004)]; WO 2004/92219 (Hinton et al.) 참조 ). 생체내에서 FcRn에대한결합및인간 FcRn 높은친화성결합폴리펩티드의혈청반감기는예를들어인간 FcRn을발현하는트랜스제닉마우스또는형질감염된인간세포주에서, 또는 Fc 변이체영역을갖는폴리펩티드가투여된영장류에서검정될수있다. WO 2004/42072 (Presta) 에는 FcR에대한결합이개선또는감소된항체변이체가기재되어있다. 또한, 예를들어문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 을참조한다. " 이펙터세포 " 는 1종이상의 FcR을발현하고이펙터기능을수행하는백혈구이다. 한측면에서, 이펙터세포는적어도 FcγRIII를발현하고 ADCC 이펙터기능을수행한다. ADCC를매개하는인간백혈구의예는말초혈액단핵세포 (PBMC), 자연살해 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포및호중구를포함한다. 이펙터세포는천연공급원, 예를들어혈액으로부터단리할수있다. 이펙터세포는일반적으로이펙터기와관련된림프구이고, 시토카인을생산하거나 ( 헬퍼 T 세포 ), 병원체에의해감염된세포를사멸하거나 ( 세포독성 T 세포 ), 항체를분비하는 ( 분화된 B 세포 ) 기능을한다. " 보체의존성세포독성 " 또는 "CDC" 는보체존재하에의표적세포의용해를지칭한다. 고전적보체경로의활 - 33 -
성화는동족항원에결합된항체 ( 적절한하위클래스의항체 ) 에대한보체시스템제1 성분 (C1q) 의결합으로개시된다. 보체활성화를평가하기위하여, 예를들어문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)] 에기재된바와같은 CDC 검정을수행할수있다. Fc 영역아미노산서열이변경되고 C1q 결합능이증가또는감소된항체변이체가미국특허제6,194,551B1호및 WO99/51642에기재되어있다. 이러한특허공보의내용은본원에참고로명확하게포함된다. 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)] 을또한참조한다. [0260] [0261] [0262] IgG의 N-글리코실화부위는 CH2 도메인에서 Asn297이다. 본발명은또한, 이펙터기능이감소되거나없는 Fc 영역을갖는항원-결합, 인간화항체조성물을제공한다. 이것을달성할수있는한가지방법은 A297N 치환으로, 이것은종전에항-CD20 항체에서보체결합및이펙터기능을없애는것 (" 비-이펙터 Fc 돌연변이체 ") 으로밝혀졌다. 문헌 [Idusgie et al., 상기문헌 ]. 이러한돌연변이결과, CHO와같은포유동물세포에서이러한 Fc 돌연변이를함유하는본발명의항-PD-L1 항체의생산은어떤글리코실화도갖지않을것이고, 그결과이펙터기능은감소되거나또는최소화될것이다. 별법적으로, 항체이펙터기능은 CH2 치환없이, 이. 콜라이와같은비포유동물세포에서발현시키는것에의해제거될수있다. " 결합친화성 " 은일반적으로분자 ( 예를들어, 항체 ) 의단일결합부위와그의결합파트너 ( 예를들어, 항원 ) 사이의비공유상호작용의총합의강도를지칭한다. 달리지시되지않는한, 본원에서사용된 " 결합친화성 " 은결합쌍의구성원들 ( 예를들어, 항체및항원 ) 간의 1:1 상호작용을반영하는고유결합친화성을지칭한다. 파트너 Y에대한분자 X의친화성은일반적으로해리상수 (Kd) 로표시될수있다. 친화성은본원에기재된방법을포함하는당업계공지의통상의방법으로측정할수있다. 낮은친화성항체는일반적으로항원과서서히결합하고쉽게해리되는경향이있는반면, 높은친화성항체는일반적으로항원과보다신속하게결합하고보다오랫동안결합된상태를유지하는경향이있다. 결합친화성을측정하는다양한방법이당업계에공지되어있고, 본발명의목적상, 이들중임의의방법이사용될수있다. 결합친화성측정을위한구체적이고예시적인실시양태를아래에기재한다. 본발명에따른 "Kd" 또는 "Kd 값 " 은한실시양태에서표지되지않은항원의적정시리즈의존재하에 ( 125 I)-표지된항원의최소농도로 Fab를평형화시킨후, 항-Fab 항체-코팅된플레이트를사용하여결합된항원을포획함으로써항원에대한 Fab의용액결합친화성을측정하는하기검정에서설명되는바와같이, 항체의 Fab 버전및항원분자를사용하여수행된방사성표지된항원결합검정 (RIA) 에의해측정된다 ( 문헌 [Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]). 이러한검정에대한조건을확립시키기위해, 마이크로타이터플레이트 ( 다이넥스 (Dynex)) 를 50 mm 탄산나트륨 (ph 9.6) 중의 5 μg /ml의포획성항-fab 항체 ( 카펠랩스 (Cappel Labs)) 로밤새코팅한후, 실온 ( 대략 23 ) 하에 2 내지 5 시간동안 PBS 중의 2% (w/v) 소혈청알부민으로 차단시킨다. 비흡착플레이트 ( 눈크 #269620) 에서, 100 pm 또는 26 pm [ 125 I]-항원을관심 Fab의연속희석물과혼합한다 ( 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599)] 의항-VEGF 항체, Fab-12의평가와일치함 ). 이어서, 관심 Fab를밤새인큐베이션하되 ; 그러나, 평형이도달하는것을확실하게하기위해더오랜시간 ( 예를들어, 65 시간 ) 동안계속인큐베이션할수있다. 그후, 혼합물을포획플레이트로옮겨실온에서 1 시간동안인큐베이션한다. 이어서, 용액을제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 트윈-20으로 8회세척하였다. 플레이트를건조시킬때, 150 μl / 웰의섬광제 ( 마이크로신트-20; 팩카드 ) 를첨가하고, 플레이트를탑카운트감마계수기 ( 팩카드 ) 상에서 10 분동안계수한다. 최대결합의 20% 이하를제공하는각 Fab의농도를선택하여경쟁적결합검정에사용한다. [0263] 또다른실시양태에따르면, Kd 는약 10 의반응단위 (RU) 로고정된항원 CM5 칩을사용하여 25 에서비아코어 -2000 또는비아코어 -3000 기기 ( 비아코어, 인크., 뉴저지주피스카타웨이소재 ) 를사용하는표면플라즈몬공명검정을사용하여측정한다. 간략하게, 카르복시메틸화덱스트란바이오센서칩 (CM5, 비아코아, 인크.) 을공급업체의지침에따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필 )-카르보디이미드히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 로활성화시킨다. 항원을 10 mm 아세트산나트륨 (ph 4.8) 을사용하여 5 μg /ml ( 약 0.2 μ M) 로희석한후, 커플링된단백질의약 10 반응단위 (RU) 를달성하도록 5 μl / 분의유속으로주입한다. 항원주입후, 미반응기를차단하기위해 1 M 에탄올아민을주입한다. 역학측정을위해, Fab의 2배연속희석물 (0.78 nm 내지 500 nm) 을대략 25 μl / 분의유속으로 25 에서 0.05% 트윈 20 계면활성제를함유하는 PBS (PBST) 중에주입한다. 단순한일대일랭뮤어결합모델 ( 비아코어 평가소프트웨어버전 3.2) 을사용하여회합및해리센서그램을동시에핏팅시킴으로써회합율 (k on ) 및해리율 (k off ) 을계산한다. 평형해리상수 (K - 34 -
d) 는 k off /k on 의비로계산한다. 예를들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)] 을참조한다. 온-레이트 (on-rate) 가상기표면플라즈몬공명검정에의해 10 6 M -1 s -1 을초과하면, 온-레이트는분광계, 예를들어정지유동설치분광광도계 ( 아비브인스트루먼츠 (Aviv Instruments)) 또는교반큐벳이구비된 8000-시리즈 SLM-AMINCO 분광광도계 ( 써모스펙트로닉 (ThermoSpectronic)) 에서측정할때증가하는농도의항원의존재하에, PBS (ph 7.2) 중 20 nm의항-항원항체 (Fab 형태 ) 의 25 에서의형광방출강도 ( 여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드통과 ) 의증가또는감소를측정하는형광켄칭기술을사용하여결정할수있다. [0264] 본발명에따른 " 온 - 레이트 ", " 회합속도 ", " 회합율 ", 또는 "k on " 은또한 25 에서약 10 반응단위 (RU) 로고 정된항원 CM5 칩과함께비아코어 -2000 또는비아코어 -3000 시스템 ( 비아코어, 인크., 뉴저지주피스카타웨이소재 ) 을사용하여상기한바와같이측정할수있다. 간략하게, 카르복시메틸화덱스트란바이오센서칩 (CM5, 비아코어인크.) 을공급업체의지침에따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필 )-카르보디이미드히드로클로라이드 (ECD) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 로활성화시킨다. 항원을 10 mm 아세트산나트륨 (ph 4.8) 을사용하여 5 mg/ml ( 약 0.2 mm) 로희석한후, 커플링된단백질의약 10 반응단위 (RU) 를달성하도록 5 ml/ 분의유속으로주입한다. 항원주입후에, 미반응기를차단하기위해 1 M 에탄올아민을첨가한다. 역학측정을위해, Fab의 2배연속희석물 (0.78 nm 내지 500 nm) 을대략 25 μl / 분의유속으로 25 에서 0.05% 트윈 20을함유하는 PBS (PBST) 중에주입한다. 단순한일대일랭뮤어결합모델 ( 비아코어평가소프트웨어버전 3.2) 을사용하여회합및해리센서그램을동시에핏팅시킴으로써회합율 (k on ) 및해리율 (k off ) 을계산한다. 평형해리상수 (Kd) 는 k off /k on 의비로계산하였다. 예를들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881] 을참조한다. 그러나, 온-레이트가상기표면플라즈몬공명검정에의해 10 6 M -1 s -1 을초과하면, 온-레이트는바람직하게는분광계, 예를들어정지유동설치분광광도계 ( 아비브인스트루먼츠 ) 또는교반큐벳이구비된 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 ( 써모스펙트로닉 ) 에서측정할때증가하는농도의항원의존재하에, PBS (ph 7.2) 중 20 nm의항-항원항체 (Fab 형태 ) 의 25 에서의형광방출강도 ( 여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드통과 ) 의증가또는감소를측정하는형광켄칭기술을사용하여결정할수있다. [0265] [0266] [0267] 본원에서사용되는어구 " 실질적으로감소된 " 또는 " 실질적으로상이한 " 은당업자가 2개의수치값 ( 일반적으로, 하나는분자와관련이있고, 다른하나는참조 / 비교분자와관련이있음 ) ( 예를들어, Kd 값 ) 에의해측정된생물학적특징과관련하여이들 2개값사이의차이를통계적유의성이있는것으로간주할정도의, 상기값사이의충분히높은정도의차이를나타낸다. 상기 2개값사이의차이는참조 / 비교분자에대한값의함수로서예를들어약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과및 / 또는약 50% 초과이다. 본원에서사용되는용어 " 실질적으로유사한 " 또는 " 실질적으로동일한 " 은당업자가 2개의수치값 ( 예를들어, 하나는본발명의항체와관련이있고, 다른하나는참조 / 비교항체와관련이있음 ) ( 예를들어, Kd 값 ) 에의해측정된생물학적특징과관련하여이들 2개값사이의차이를생물학적및 / 또는통계적유의성이거의또는전혀없는것으로간주할정도의, 상기값사이의충분히높은정도의유사성을나타낸다. 상기 2개값사이의차이는참조 / 비교값의함수로서예를들어약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만및 / 또는약 10% 미만이다. 펩티드, 폴리펩티드또는항체서열에대한 " 아미노산서열동일성퍼센트 (%)" 및 " 상동성 " 은서열을정렬시키고필요한경우최대서열동일성퍼센트를달성하도록갭 (gap) 을도입한후, 특정펩티드또는폴리펩티드서열내의아미노산잔기와동일한후보서열내의아미노산잔기의백분율로서본원에서정의되고, 임의의보존적치환은서열동일성의일부로간주하지않는다. 아미노산서열동일성퍼센트를결정하기위한정렬은당업자에게공지된다양한방법, 예를들어공개적으로입수가능한컴퓨터소프트웨어, 예를들어 BLAST, BLAST- 2, ALIGN, 또는 MEGALIGN (DNASTAR) 소프트웨어를사용하여달성할수있다. 당업자는비교될전장서열에대한최대정렬을달성하는데필요한임의의알고리즘을비롯하여정렬결정에적절한파라미터를정할수있다. 그러나, 본원의목적상, 핵산서열동일성 % 값은제넨테크, 인크. 가저작권자인서열비교컴퓨터프로그램 ALIGN-2를이용하여생성한다. ALIGN-2의소스코드는미국저작권청 ( 미국 20559 워싱턴디. 씨.) 에사용자문서로제출되어있고, 미국저작권등록번호 TXU510087로등록되어있다. ALIGN-2 프로그램은제넨테크, 인크. ( 캘리포니아주사우스샌프란시스코소재 ) 로부터공개적으로입수가능하다. ALIGN-2 프로그램은유닉스운영체제, 바람직하게는디지털유닉스 V4.0D에서사용되도록컴파일해야한다. 모든서열비교파라미터는 ALIGN-2 프로그램에의해설정되어있으며변하지않는다. - 35 -
[0268] 아미노산서열비교를위해 ALIGN-2가사용되는상황에서, 주어진아미노산서열 B에, 또는주어진아미노산서열 B와, 또는주어진아미노산서열 B에대한주어진아미노산서열 A의 % 아미노산서열동일성 ( 별법적으로, 주어진아미노산서열 B에, 또는주어진아미노산서열 B와, 또는주어진아미노산서열 B에대해특정 % 아미노산서열동일성을갖거나포함하는주어진아미노산서열 A라는어구로표현될수있음 ) 은다음과같이계산된다 : [0269] [0270] [0271] [0272] [0273] [0274] [0275] [0276] 여기서, X는 A와 B의프로그램정렬에서서열정렬프로그램 ALIGN-2에의해동일한매치 (match) 로스코어링되는아미노산잔기의수이고, Y는 B에있는아미노산잔기의총수이다. 아미노산서열 A의길이가아미노산서열 B의길이와동일하지않은경우에는 B에대한 A의 % 아미노산서열동일성이 A에대한 B의 % 아미노산서열동일성과동일하지않을것임을이해할것이다. 달리구체적으로언급하지않는다면, 본원에서사용되는모든 % 아미노산서열동일성값은바로앞단락에서기재한바와같이 ALIGN-2 컴퓨터프로그램을사용하여구한다. 본원의항체를코딩하는 " 단리된 " 핵산분자는예를들어그것이생산되는환경에서그와통상적으로회합되는적어도하나의오염핵산분자로부터확인되고분리된핵산분자이다. 바람직하게는, 단리된핵산은생산환경과관련된모든성분과의회합이존재하지않는다. 본발명의폴리펩티드및항체를코딩하는단리된핵산분자는자연에서발견되는형태또는세팅이아닌형태이다. 따라서, 단리된핵산분자는세포에서천연으로존재하는본원의폴리펩티드및항체를코딩하는핵산과는구별된다. 용어 " 제어서열 " 은특정숙주유기체에서작동가능하게연결된코딩서열의발현에필요한 DNA 서열을지칭한다. 원핵세포에적합한제어서열은, 예를들어프로모터, 임의로오퍼레이터서열및리보솜결합부위를포함한다. 진핵세포는프로모터, 폴리아데닐화신호및인핸서를이용하는것으로공지되어있다. 핵산은다른핵산서열과기능적관계로배치될때 " 작동가능하게연결 " 된다. 예를들어, 예비서열또는분비리더용 DNA는폴리펩티드의분비에참여하는예비단백질로서발현되는경우에폴리펩티드용 DNA에작동가능하게연결되거나 ; 프로모터또는인핸서는서열의전사에영향을주는경우에코딩서열에작동가능하게연결되거나 ; 또는리보솜결합부위는번역을촉진하도록배치되는경우에코딩서열에작동가능하게연결된다. 일반적으로, " 작동가능하게연결된 " 은연결되는 DNA 서열이인접함을의미하고, 분비리더의경우인접하고리딩상으로존재한다. 그러나, 인핸서는반드시인접하여위치할필요가없다. 연결은편리한제한부위에서의라이게이션을통해달성된다. 이러한부위가존재하지않는경우에는합성올리고뉴클레오티드어댑터또는링커를통상적인관행에따라사용한다. 본원에서사용되는용어 " 에피토프태그가부착된 (tagged)" 은 " 태그폴리펩티드 " 에융합된본원에설명된폴리펩티드또는항체를포함하는키메라폴리펩티드를지칭한다. 태그폴리펩티드는항체가생성될수있는에피토프를제공할만큼충분한잔기를갖지만그와융합될폴리펩티드의활성을방해하지않을정도로충분히짧다. 또한, 태그폴리펩티드는항체가다른에피토프와는실질적으로교차반응하지않도록아주독특한것이바람직하다. 일반적으로, 적합한태그폴리펩티드는적어도 6개의아미노산잔기, 통상적으로는약 8개내지 50개의아미노산잔기 ( 바람직하게는, 약 10개내지 20개의아미노산잔기 ) 를갖는다. 본원에서사용되는용어 " 이뮤노어드헤신 " 은이뮤노글로불린불변도메인의이펙터기능과이종단백질 (" 어드헤신 ") 의결합특이성을겸비한항체유사분자를지칭한다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은항체의항원인식및결합부위이외 ( 즉, " 이종 ") 의원하는결합특이성을갖는아미노산서열과이뮤노글로불린불변도메인서열의융합체를포함한다. 이뮤노어드헤신분자의어드헤신부분은전형적으로수용체또는리간드의적어도결합부위를포함하는인접한아미노산서열이다. 이뮤노어드헤신내의이뮤노글로불린불변도메인서열은임의의이뮤노글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2 ( 예를들어 IgG2A 및 IgG2B), IgG-3 또는 IgG-4 하위유형, IgA ( 예를들어, IgA-1 및 IgA-2), IgE, IgD 또는 IgM으로부터수득될수있다. Ig 융합체는바람직하게는 Ig 분자내의하나이상의가변영역대신본원에기술된폴리펩티드또는항체도메인의치환을포함한다. 특히바람직한실시양태에서, 이뮤노글로불린융합체는힌지, CH2 및 CH3, 또는힌지, IgG1 분자의 CH1, CH2 및 CH3 영역을포함한다. 이뮤노글로불린융합체의생산에대해서는또한미국특허제5,428,130호 (1995년 6월 27일허여됨 ) 를참조한다. 예를들어, 본원에서조합요법에유용한제2 의약으로서유용한이뮤노어드헤신은이뮤노글로불린서열의불변도메인에융합된, PD-L1 또는 PD-L2 또는그반대의세포외또는 PD-1 결합부분을포함하는폴리펩티드를포함한다. - 36 -
[0277] [0278] [0279] [0280] [0281] [0282] [0283] " 융합단백질 " 및 " 융합폴리펩티드 " 는함께공유연결된 2개의부분을갖는폴리펩티드이고, 여기서각각의부분은상이한특성을갖는폴리펩티드이다. 성질은생물학적성질, 예컨대시험관내또는생체내활성일수있다. 또한, 특성은간단한화학적또는물리적특성, 예를들어표적분자에대한결합, 반응의촉매작용등일수있다. 2개의부분은단일펩티드결합에의해직접연결될수있거나또는펩티드링커를통해서로리딩프레임으로연결될수있다. " 안정한 " 제제는보관시그안의단백질이그의물리적및화학적안정성, 및일체성을본질적으로유지하는것이다. 단백질안정성을측정하기위한다양한분석기술들이당업계에서사용될수있고, 문헌 [Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, New York, Pubs.(1991)] 및 [Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90(1993)] 에검토되어있다. 안정성은선택된시간동안선택된온도에서측정될수있다. 신속한스크리닝을위해제제를 40 에서 2주내지 1개월동안보관할수있고, 이때안정성을측정한다. 제제를 2-8 에서보관할경우에는, 통상적으로제제는 30 또는 40 에서 1개월이상보관시안정해야하고 / 하거나, 2-8 에서 2년이상보관시안정해야한다. 제제를 30 에서보관할경우에는, 통상적으로제제는 30 에서 2년이상안정해야하고 / 하거나 40 에서 6개월이상안정해야한다. 예를들어, 보관동안의응집정도는단백질안정성의지표로서사용될수있다. 따라서, " 안정한 " 제제는제제에서약 10% 미만, 바람직하게는약 5% 미만의단백질이제제내에응집체로서존재하는것일수있다. 기타실시양태에서, 제제를보관하는동안응집체형성이증가하는지를측정할수있다. " 재구성된 " 제제는단백질이전체적으로분산되도록동결건조된단백질또는항체제제를희석제에용해시켜제조된것이다. 재구성된제제는관심단백질로치료될환자에게투여 ( 예를들어, 피하투여 ) 하기에적합하고, 본발명의특정실시양태에서는비경구또는정맥내투여에적합한것일수있다. " 등장성 " 제제는본질적으로인간혈액과동일한삼투압을갖는것이다. 등장성제제는일반적으로약 250 내지 350 mosm의삼투압을가질것이다. 용어 " 저장성 (hypotonic)" 이란인간혈액의삼투압미만의삼투압을갖는제제를나타낸다. 따라서, 용어 " 고장성 (hypertonic)" 은인간혈액의삼투압을초과하는삼투압을갖는제제를기술하는데사용된다. 예를들어, 증기압또는빙냉유형삼투압측정기를사용하여등장성을측정할수있다. 본발명의제제는염및 / 또는완충액을첨가한결과로서고장성이다. 본원에서사용된 " 담체 " 는사용되는투여량및농도에서이에노출되는세포또는포유동물에비독성인제약상허용되는담체, 부형제또는안정화제를포함한다. 종종, 생리적으로허용되는담체는수성 ph 완충용액이다. 생리적으로허용되는담체의예는완충액, 예컨대포스페이트, 시트레이트, 및기타유기산 ; 항산화제, 예를들어아스코르브산 ; 저분자량 ( 약 10개잔기미만 ) 폴리펩티드 ; 단백질, 예를들어혈청알부민, 젤라틴또는이뮤노글로불린 ; 친수성중합체, 예를들어폴리비닐피롤리돈 ; 아미노산, 예를들어글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌또는리신 ; 모노사카라이드, 디사카라이드및기타탄수화물, 예를들어글루코스, 만노스또는덱스트린 ; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당알콜, 예컨대만니톨또는소르비톨 ; 염형성반대이온, 예컨대나트륨 ; 및 / 또는비-이온성계면활성제, 예컨대트윈, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 및플루로닉스 를포함한다. 용어 " 포장삽입물 " 은적응증, 사용, 용량, 투여에대한정보, 금기사항, 포장제품과함께조합되는다른의약및 / 또는상기의약의사용에대한경고등을포함하는, 의약의상업적포장에통상적으로포함되는사용지시서를지칭한다. " 제약상허용되는산 " 은제제화된농도및방식에서비독성인무기산및유기산을포함한다. 예를들어, 적합한무기산은염산, 과염소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 황산, 술폰산, 술핀산, 술파닐산, 인산, 탄산등을포함한다. 적합한유기산은직쇄및분지쇄알킬, 방향족, 시클릭, 지환족, 아릴지방족, 헤테로시클릭, 포화, 불포화, 모노, 디- 및트리-카르복실산을포함하고, 예를들어포름산, 아세트산, 2-히드록시아세트산, 트리플루오로아세트산, 페닐아세트산, 트리메틸아세트산, t-부틸아세트산, 안트라닐산, 프로판산, 2-히드록시프로판산, 2-옥소프로판산, 프로판디온산, 시클로펜탄프로피온산, 시클로펜탄프로피온산, 3-페닐프로피온산, 부탄산, 부탄디오산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일 ) 벤조산, 2-아세톡시-벤조산, 아스코르브산, 신남산, 라우릴황산, 스테아르산, 뮤콘산, 만델산, 숙신산, 엠본산, 푸마르산, 말산, 말레산, 히드록시말레산, 말론산, 락트산, 시트르산, 타르타르산, 글리콜산, 글리콘산, 글루콘산, 피루브산, 글리옥살산, 옥살산, 메실산, 숙신산, 살리실산, 프탈산, 팔모산, 팔메산, 티오시안산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄디술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, 4-클로로벤젠술폰산, 나프탈렌-2-술폰산, p-톨루엔술폰산, 캄포르술폰산, 4-메틸비시클로 [2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-3-( 히드록시-2-엔-1-카르복실산 ), 히드록시나프토산이포함된다. - 37 -
[0284] " 제약상허용되는염기 " 는제제화된농도및방식에서비독성인무기염기및유기염기를포함한다. 예를들어, 적합한염기는무기염기형성금속, 예를들어리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄, N-메틸글루카민, 모르폴린, 피페리딘, 및 1급, 2급및 3급아민, 치환된아민, 시클릭 + 아민및염기성이온교환수지 [ 예를들어, N(R') 4 ( 여기서, R' 는독립적으로 H 또는 C1-4 알킬, 예를들어암모 늄, 트리스임 )] 를비롯한유기비독성염기, 예를들어이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디에틸아미노에탄올, 트리메타민, 디시클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민수지등으로부터형성된것을포함한다. 특히바람직한유기비독성염기는이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리메트아민, 디시클로헥실아민, 콜린, 및카페인이다. 본발명에서사용할수있는추가의제약상허용되는산및염기는아미노산, 예를들어히스티딘, 글리신, 페닐알라닌, 아스파르트산, 글루탐산, 리신및아스파라긴으로부터유래된것을포함한다. [0285] [0286] " 제약상허용되는 " 완충액및염은상기기재한산및염기의산및염기부가염으로부터유래된것을포함한다. 구체적인완충액및 / 또는염은히스티딘, 숙시네이트및아세테이트를포함한다. " 제약상허용되는당 " 은관심있는단백질과조합될경우, 보관시단백질의화학적및 / 또는물리적불안정성을현저하게억제하거나감소시키는분자이다. 제제가동결건조된다음재구성되는경우에는, " 제약상허용되는당 " 을 " 동결건조보호제 " 로이해할수도있다. 예시적인당및그의상응하는당알콜은아미노산, 예를들어모노나트륨글루타메이트또는히스티딘 ; 메틸아민, 예를들어베타인 ; 친액성염, 예를들어황산마그네슘 ; 폴리올, 예를들어 3가또는보다고분자량의당알콜, 예를들어글리세린, 덱스트란, 에리트리톨, 글리세롤, 아 라비톨, 크실리톨, 소르비톨및만니톨 ; 프로필렌글리콜 ; 폴리에틸렌글리콜 ; 플루로닉스 ; 및그의조합을포함한다. 추가의예시적인동결건조보호제는글리세린및젤라틴, 및당멜리비오스, 멜레지토스, 라피노스, 만노트리오스및스타키오스를포함한다. 환원당의예는글루코스, 말토스, 락토스, 말툴로스, 이소-말툴로스및락툴로스를포함한다. 비-환원당의예는당알콜및기타직쇄폴리알콜로부터선택된폴리히드록시화합물의비-환원글리코시드를포함한다. 바람직한당알콜은모노글리코시드, 특히락토스, 말토스, 락툴로스및말툴로스와같은디사카라이드의환원에의해수득되는화합물이다. 글리코시드측기는글루코시드또는갈락토시드일수있다. 당알콜의추가적인예는글루시톨, 말티톨, 락티톨및이소-말툴로스이다. 바람직한제약상허용되는당은비-환원당트레할로스또는수크로스이다. 제약상허용되는당은단백질이보관동안 ( 예를들어, 재구성및보관후 ) 본질적으로그의물리적및화학적안정성및일체성을유지하는양을의미하는 " 보호량 " 으로 ( 예를들어, 동결건조전에 ) 제제에첨가된다. [0287] [0288] [0289] [0290] 본원에서관심 " 희석제 " 는제약상허용되고 ( 인간투여에안전하고비독성임 ) 액체제제, 예를들어동결건조후재구성된제제의제조에유용한것이다. 예시적인희석제에는무균수, 주사용정균수 (BWFI), ph 완충용액 ( 예를들어포스페이트-완충염수 ), 무균성염수용액, 링거 (Ringer) 용액또는덱스트로스용액이포함된다. 별도의실시양태에서, 희석제는염및 / 또는완충액의수용액을포함할수있다. " 보존제 " 는세균활성을감소시키기위해본원의제제에첨가될수있는화합물이다. 보존제의첨가는예를들어, 다용도 ( 다용량 ) 제제의생산을촉진할수있다. 가능한보존제의예로는옥타데실디메틸벤질암모늄클로라이드, 헥사메토늄클로라이드, 벤즈알코늄클로라이드 ( 알킬기들이장쇄화합물인알킬벤질디메틸암모늄클로라이드들의혼합물 ), 및벤즈에토늄클로라이드가포함된다. 또다른유형의보존제에는방향족알콜예컨대페놀, 부틸및벤질알콜, 알킬파라벤예컨대메틸또는프로필파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥사놀, 3-펜타놀, 및 m-크레졸이포함된다. 본원에서가장바람직한보존제는벤질알콜이다. " 치료 " 는치료되는개체또는세포의자연적과정을변경시키려는임상시술을나타내고, 임상질병의예방을위해또는질병과정동안수행될수있다. 바람직한치료효과는질병의발생또는재발억제, 전이억제, 질병진행속도의감소, 질병상태의개선또는호전, 및완화또는개선된예후를포함한다. 일부실시양태에서, 본발명의항체는질병또는질환의발생을지연시키기위해사용된다. 대상체는예를들어 T 세포기능이상장애와연관된하나이상의증상이완화되면본발명의아폽토시스성항-PD-L1 항체에의해성공적으로 " 치료된 " 것이다. " 유효량 " 은적어도필요한용량에서필요한기간동안치료또는예방결과를포함하여목적하는또는지시된효과를달성하기위해효과적인양을지칭한다. 예를들어, 본발명의항-PD-L1 항체의유효량은 T 세포상의 PD-1 또는다른 APC 상의 B7.1을통해또는그둘모두를통해 PD-L1으로부터의신호전달을억제하는적어도최 - 38 -
소한의농도이다. [0291] [0292] [0293] [0294] [0295] [0296] [0297] [0298] [0299] " 치료유효량 " 은적어도특정질환의측정가능한개선또는예방에필요한최대농도이다. 치료유효량은본원에서환자의질병상태, 연령, 성별, 및체중, 및개체에서목적하는반응을유도하는항체의능력과같은요인에따라변할수있다. 또한, 치료유효량은항체의임의의독성또는유해한효과를치료상유용한효과가능가하는양이다. 예를들어, 본발명의항-PD-L1 항체의치료유효량은 T 세포기능이상장애의하나이상의증상을억제하는적어도최소한의농도이다. " 예방유효량 " 은필요한투여량에서필요한기간동안목적하는예방결과를달성하기위해효과적인양을나타낸다. 예를들어, 본발명의항-PD-L1 항체의예방유효량은 T 세포기능이상장애의하나이상의증상의발생을방지하거나약화시키는적어도최소한의농도이다. " 만성 " 투여는장기간동안초기의치료효과 ( 활성 ) 를유지하기위해의약 ( 들 ) 을급성방식과달리연속적으로투여하는것을의미한다. " 간헐적 " 투여는중단없이연속적으로행해지지는않지만특성상주기적인치료법이다. 치료를위한 " 포유동물 " 은인간, 가축및농장동물, 및동물원, 스포츠, 또는애완동물, 예를들어개, 말, 토끼, 소, 돼지, 햄스터, 게르빌루스쥐, 마우스, 흰족제비, 래트, 고양이등을포함하여포유동물로서분류된임의의동물을의미한다. 바람직하게는, 포유동물은인간이다. 용어 " 제약제제 " 는활성성분의생물학적활성이효과를보이도록하는형태이고제제가투여되는대상에게허용되지않은독성을보이는추가의성분을함유하지않는제제를의미한다. 상기제제는멸균상태이다. " 멸균 " 제제는무균상태이거나또는모든살아있는미생물및이들의포자가존재하지않는것이다. 본원에서사용된용어 " 약 " 은이러한기술분야의당업자에게용이하게공지된각각의값에대한일반적인오차범위를지칭한다. " 자가면역질환 " 은개체자신의조직또는장기또는그의공동-분리또는징후또는그로부터생성된상태로인한, 그에대한질환또는장애이다. " 자가면역질환 " 은장기-특이적질환 ( 즉, 면역반응은내분비계, 조혈계, 피부, 심폐계, 위장관계및간계, 신장계, 갑상선, 귀, 신경근육계, 중추신경계등과같은장기계에대해특이적으로작용함 ) 또는다수의장기계에영향을줄수있는전신질환 ( 예를들어, 전신홍반루푸스 (SLE), 류마티스성관절염 (RA), 다발성근육염등 ) 일수있다. 바람직한상기질환은자가면역류마티스장애 ( 예를들어, RA, 쇼그렌증후군, 공피증, 루푸스, 예를들어 SLE 및루푸스신장염, 다발근육염-피부근육염, 한랭글로불린혈증, 항-인지질항체증후군, 및건선성관절염 ), 자가면역위장및간장애 ( 예를들어, 염증성장질환 ( 예를들어, 궤양대장염및크론질병 ), 자가면역위염및악성빈혈, 자가면역간염, 원발성담즙성간경화, 원발성경화성담관염, 및셀리악질환 ), 혈관염 ( 예를들어, ANCA-음성혈관염및 ANCA-연관혈관염, 예를들어처그-스트라우스혈관염, 베게너육아종증, 및현미경적다발성혈관염 ), 자가면역신경장애 ( 예를들어, 다발성경화증, 눈간대경련근육간대경련증후군, 중증근무력증, 시신경척수염, 파킨슨병, 알츠하이머병, 및자가면역다발성신경병증 ), 신장장애 ( 예를들어, 사구체신염, 굿패스쳐증후군, 및버거병 ), 자가면역피부장애 ( 예를들어, 건선, 두드러기, 심상성천포창, 수포성유천포창, 및피부홍반성루푸스 ), 혈액장애 ( 예를들어, 혈소판감소성자색반증, 혈전성혈소판감소성자색반증, 수혈후자색반증, 및자가면역용혈빈혈 ), 죽상경화증, 포도막염, 자가면역청력질환 ( 예를들어, 내이질환및난청 ), 베체트병, 레이노드증후군, 장기이식, 및자가면역내분비장애 ( 예를들어, 당뇨병-관련자가면역질환, 예를들어인슐린-의존성당뇨병 (IDDM), 애디슨병, 및자가면역갑상선질환 ( 예를들어, 그레이브스질환및갑상선염 )) 을포함한다. 보다바람직한상기질환은예를들어 RA, 궤양대장염, ANCA-연관혈관염, 루푸스, 다발성경화증, 쇼그렌증후군, 그레이브스질환, IDDM, 악성빈혈, 갑상선염, 및사구체신염을포함한다. 본원에서사용된바와같이, 용어 " 세포독성제 " 는세포의기능을억제또는저해하고 / 하거나세포의파괴를야 기하는물질을지칭한다. 상기용어는방사성동위원소 ( 예를들어 At 211, I 131, I 125, Y 90, Re 186, Re 188, Sm 153, Bi 212, P 32 및 Lu의방사성동위원소 ), 및독소, 예를들어소분자독소또는세균, 진균, 식물또는동물기원의효소활성독소, 및그의단편을포함한다. [0300] " 화학요법제 " 는암치료에유용한화학적화합물이다. 화학요법제의예는알킬화제, 예컨대티오테파및시클 로포스파미드 ( 시톡산 ); 알킬술포네이트, 예컨대부술판, 임프로술판및피포술판 ; 아지리딘, 예컨대벤조도 파, 카르보쿠온, 메투레도파및우레도파 ; 에틸렌이민및메틸라멜라민, 예컨대알트레타민, 트리에틸렌멜라민, - 39 -
트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드및트리메틸올로멜라민 ; 아세토게닌 ( 특히불라타신및불라타시논 ); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 ( 드로나비놀, 마리놀 ); 베타-라파콘 ; 라파콜 ; 콜히친 ; 베툴린산 ; 캄프토테신 ( 합성유사체토포테칸 ( 하이캄틴 ), CPT-11 ( 이리노테칸, 캄프토사르 ), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신포함 ); 브리오스타틴 ; 페메트렉세드 ; 칼리스타틴 ; CC-1065 ( 그의아도젤레신, 카르젤레신및비젤레신합성유사체포함 ); 포도필로톡신 ; 포도필린산 ; 테니포시드 ; 크립토피신 ( 특히크립토피신 1 및크립토피신 8); 돌라스타틴 ; 두오카르마이신 ( 합성유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함 ); 엘레우테로빈 ; 판크라티스타틴 ; TLK-286; CDP323, 경구알파-4 인테그린억제제 ; 사르코딕티인 ; 스폰지스타틴 ; 질소머스타드, 예컨대클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민옥시드히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실머스타드 ; 니트로스우레아, 예컨대카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴및라니무스틴 ; 항생제, 예컨대에네디인항생제 ( 예를들어, 칼리케아미신, 특히칼리케아미신감마1I 및칼리케아미신오메가 I1 ( 예를들어, 문헌 [Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33 : 183-186 (1994)] 참조 ); 다이네미신, 예컨대다이네미신 A; 에스페라미신 ; 뿐만아니라네오카르지노스타틴발색단및관련색소단백질에네디인항생제발색단 ), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조- 5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 ( 아드리아마이신, 모르폴리노-독소루비신, 사이아노모폴리노-독소루비신, 2- 피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀주사 ( 독실 ) 및데옥시독소루비신포함 ), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신 ; 항대사물, 예컨대메토트렉세이트, 겜시타빈 ( 겜자르 ), 테가푸르 ( 유프토랄 ), 카페시타빈 ( 젤로다 ), 에포틸론및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산유사체, 예컨대데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트 ; 퓨린유사체, 예컨대플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌 ; 피리미딘유사체, 예컨대안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘및이마티닙 (2-페닐아미노피리미딘유도체 ), 뿐만아니라다른 c-키트억제제 ; 항-부신, 예컨대아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄 ; 엽산보충물, 예컨대프롤린산 ; 아세글라톤 ; 알도포스파미드글리코시드 ; 아미노레불린산 ; 에닐우라실 ; 암사크린 ; 베스트라부실 ; 비산트렌 ; 에다트락세이트 ; 데포파민 ; 데메콜신 ; 디아지쿠온 ; 엘포르니틴 ; 엘리프티늄아세테이트 ; 에토글루시드 ; 갈륨니트레이트 ; 히드록시우레아 ; 렌티난 ; 로니다이닌 ; 메이탄시노이드, 예컨대메이탄신및안사미토신 ; 미토구아존 ; 미톡산트론 ; 모피단몰 ; 니트라에린 ; 펜토스타틴 ; 페나메트 ; 피라루비신 ; 로속산트론 ; 2-에틸히드라지드 ; 프로카르바진 ; PSK 폴리사카라이드복합체 (JHS 내츄럴프로덕츠, 오리곤주유진소재 ); 라족산 ; 리족신 ; 시조피란 ; 스피로게르마늄 ; 테누아존산 ; 트리아지쿠온 ; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민 ; 트리코테센 ( 특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및안구이딘 ); 우레탄 ; 빈데신 ( 엘디신, 필데신 ); 다카르바진 ; 만노무스틴 ; 미토브로니톨 ; 미토락톨 ; 피포브로만 ; 가시토신 ; 아라비노시드 (" 아라-C"); 티오테파 ; 탁소이드, 예를들어, 파클리탁셀 ( 탁솔 ), 파클리탁셀의알부민조작된나노입자제제 ( 아브락산 ) 및도세탁셀 ( 탁소테레 ); 클로란부실 ; 6-티오구아닌 ; 메르캅토퓨린 ; 메토트렉세이트 ; 백금유사체, 예컨대시스플라틴및카르보플라틴 ; 빈블라스틴 ( 벨반 ); 백금 ; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드 ; 미톡산트론 ; 빈크리스틴 ( 온코빈 ); 옥살리플라틴 ; 류코보빈 ; 비노렐빈 ( 나벨빈 ); 노반트론 ; 에다트렉세이트 ; 다우노마이신 ; 아미노프테린 ; 이반드로네이트 ; 토포이소머라제억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대레티노산 ; 임의의상기한것의제약상허용되는염, 산또는유도체 ; 뿐만아니라상기한것중 2종이상의조합물, 예컨대시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴및프레드니솔론의조합요법에대한약어 CHOP, 및 5-FU 및류코보빈과조합된옥살리플라틴 ( 엘록사틴 ) 에의한치료섭생에대한약어 FOLFOX가포함된다. 특히종양면역의치료에있어서본발명의항-PD-L1 항체와조합하는데유용한특히바람직한화학요법제는겜시타빈이다. [0301] 또한, 상기정의에는암의성장을촉진할수있는호르몬의효과를조절하거나감소시키거나차단하거나억제하는작용을하고, 종종전신 (systemic 또는 whole-body) 치료의형태인항-호르몬제도포함된다. 이들은그자체가호르몬일수있다. 예로는타목시펜 ( 놀바덱스 타목시펜포함 ), 랄록시펜 ( 에비스타 ), 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤및토레미펜 ( 파레스톤 ) 이예를들어포함되는항-에스트로겐및선택적인에스트로겐수용체조절자 (SERM); 항-프로게스테론 ; 에스트로겐수용체하향-조절제 (ERD); 에스트로겐수용체길항제예컨대풀베스트란트 ( 파슬로덱스 ); 난소를저해하거나정지시키는기능을하는작용제, 예를들어, 황체형성호르몬-방출호르몬 (LHRH) 효능제, 예컨대류프롤리드아세테이 - 40 -
트 ( 루프론N 및엘리가드 ), 고세렐린아세테이트, 부세렐린아세테이트및트리프테렐린 ; 항-안드로겐제예컨대플루타미드, 닐루타미드및비칼루타미드 ; 및부신에서의에스트로겐생산을조절하는효소아로마타제를억제하는아로마타제억제제, 예를들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤아세테이트 ( 메가세 ), 엑세메스탄 ( 아로마신 ), 포르메스타니에, 파드로졸, 보로졸 ( 리비졸 ), 레트로졸 ( 페마라 ), 및아나스트로졸 ( 아리미덱스 ) 이포함된다. 또한, 상기화학요법제의정의에는비스포스포네이트, 예를들어클로드로네이트 ( 예를들어, 보네포스 또는오스탁 ), 에티드로네이트 ( 디드로칼 ), NE-58095, 졸레드론산 / 졸레드로네이트 ( 조메타 ), 알렌드로네이트 ( 포사맥스 ), 팔미드로네이트 ( 아레디아 ), 틸루드로네이트 ( 스켈리드 ), 또는리세드로네이트 ( 악토넬 ); 및트록사시타빈 (1,3-디옥솔란뉴클레오시드시토신유사체 ); 안티센스올리고뉴클레오티드, 특히부착성세포증식에연관되는신호전달경로에서유전자의발현을억제하는것, 예를들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및표피성장인자수용체 (EGF-R); 백신, 예를들어테라토프 백신및유전자요법백신, 예를들어, 알로벡틴 백신, 류벡틴 백신, 및백시드 백신 ; 토포이소머라제 1 억제제 ( 예를들어, 루르토테칸 ); 항-에스트로겐, 예를들어풀베스트란트 ; 키트억제제, 예를들어이마티닙또는 EXEL-0862 ( 티로신키나제억제제 ); EGFR 억제제, 예를들어에를로니팁또는세툭시맙 ; 항- VEGF 억제제, 예를들어베바시주맙 ; 아리노테칸 ; rmrh ( 예를들어, 아바렐릭스 ); 라파티닙및라파티닙디토실레이트 (ErbB-2 및 GW572016으로도공지된 EGFR 이중티로신키나제소분자억제제 ); 17AAG ( 열쇼크단백질 (Hsp) 90 독인겔다나마이신유도체 ), 및상기임의의물질의제약상허용되는염, 산또는유도체가포함된다. [0302] [0303] [0304] " 성장억제제 " 는시험관내또는생체내에서성장이수용체활성화에의존하는세포의성장을억제하는화합물또는조성물을의미한다. 따라서, 성장억제제는 S기에서수용체의존성세포의비율을유의하게감소시키는것을포함한다. 성장억제제의예는세포주기진행을 (S기이외의다른시기에 ) 차단하는물질, 예를들어 G1 정지및 M기정지를유도하는물질을포함한다. 전통적인 M기차단제는빈카및빈카알칼로이드 ( 빈크리스틴및빈블라스틴 ), 탁산및토포이소머라제 II 억제제, 예를들어독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드및블레오마이신을포함한다. G1을정지시키는작용제, 예를들어 DNA 알킬화제, 예를들어타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실및 ara-c는 S기정지로까지이어질수도있다. 추가의정보는문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히 p. 13] 에서찾을수있다. 탁산 ( 파클리탁셀및도세탁셀 ) 은둘다주목에서유래된항암약물이다. 유럽형주목에서유래된도세탁셀 ( 탁소테레, 론-프랑로러 (Rhone-Poulenc Rorer)) 은파클리탁셀 ( 탁솔, 브리스톨-마이어스스퀴브 ) 의반합성유사체이다. 용어 " 시토카인 " 은세포간매개자로서또다른세포에대해작용하는, 한세포집단에의해방출되는단백질에대한일반용어이다. 상기시토카인의예는림포킨, 모노킨 ; 인터류킨 (IL), 예를들어 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15...IL-35, 예를들어프로류킨 ril-2; 종양괴사인자, 예를들어 TNF-α 또는 TNF-β; 및다른폴리펩티드인자, 예를들어 LIF 및키트리간드 (KL) 이고, 용어 " 인터류킨 " 은현재본질적으로시토카인과동의어가되었다. 본원에서사용되는용어시토카인은천연공급원또는재조합세포배양물로부터의단백질및천연서열시토카인의생물학적활성등가물, 예를들어이것의합성생성된소분자및제약상허용되는유도체및염을포함한다. 시토카인은의도된표적의근접위치로분류될수있으며, 여기서자가분비는그것이분비된동일한세포에작용하는것을지칭하고, 측분비는시토카인이분비되는곳과가까운부근에한정되어작용하는것을지칭하며, 내분비는신체의먼영역에서작용하는것을지칭한다. 면역시토카인은또한그것이유형 I 반응을향상시키는지 ( 예를들어, IFN-γ, TGF-β 등 ) ( 세포면역을지지함 ) 또는유형 II 반응을향상시키는지 (IL-4, IL-10, IL-13 등 ) ( 항체또는체액성면역을지지함 ) 에따라분류될수있다. 면역시토카인은공동자극, 성숙, 증식, 활성화, 염증, 성장, 분화, 시토카인생산및분비, 다양한면역세포의생존에서소정의역할을한다. 용어 " 호르몬 " 은일반적으로관이있는선의장기에의해분비되는폴리펩티드호르몬을의미한다. 호르몬중에서, 예를들어, 성장호르몬예컨대인간성장호르몬, N-메티오닐인간성장호르몬, 및소성장호르몬 ; 부갑상선호르몬 ; 티록신 ; 인슐린 ; 프로인슐린 ; 릴랙신 ; 에스트라디올 ; 호르몬-대체요법 ; 안드로겐예컨대칼루스테론, 드로모스타놀론프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 또는테스토락톤 ; 프로릴랙신 ; 당단백질호르몬예컨대난포자극호르몬 (FSH), 갑상선자극호르몬 (TSH), 및황체형성호르몬 (LH); 프로락틴, 태반락토젠, 마우스성선자극호르몬-관련펩티드, 성선자극호르몬-방출호르몬 ; 인히빈 ; 액티빈 ; 뮬러관-억제물질 ; 및트롬보포이에틴이포함된다. 본원에서사용되는용어호르몬에는천연공급원으로부터또는재조합세포배양물로부터의단백질및천연서열호르몬의생물학적으로활성인등가물 ( 이의합성생산된소형-분자본 - 41 -
체및제약상허용되는유도체및염포함 ) 이포함된다. [0305] [0306] [0307] [0308] [0309] [0310] [0311] [0312] [0313] III. 본발명을수행하는방식 A. 파지디스플레이를이용한인간화본원에서기재하는초가변영역-이식된변이체는각각의초가변영역에대한별개의올리고뉴클레오티드를사용하여, 인간수용체서열을코딩하는핵산을쿤켈 (Kunkel) 돌연변이유발시킴으로써생성하였다. 문헌 [Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)]. 적당한초가변영역-항원상호작용을교정하고재정립하기위한통상적인기술을사용하여, 적당한변화를프레임워크및 / 또는초가변영역내에도입시킬수있다. 파지 ( 미드 ) 디스플레이 ( 본원에서또한파지디스플레이로지칭됨 ) 가서열무작위화에의해생성된라이브러리에서다수의상이한잠재적인변이체항체를생성시키고스크리닝하기위한편리하고신속한방법으로사용될수있다. 그러나, 변경된항체를제조하고스크리닝하기위한또다른방법들이당업자에게이용가능하다. 파지 ( 미드 ) 디스플레이 ( 본원에서일부정황에서는파지디스플레이로또한지칭됨 ) 가서열무작위화에의해생성된라이브러리에서다수의상이한잠재적인변이체항체를생성시키고스크리닝하기위한편리하고신속한방법으로사용될수있다. 그러나, 변경된항체를제조하고스크리닝하기위한또다른방법들이당업자에게이용가능하다. 파지 ( 미드 ) 디스플레이기술은리간드, 예를들어항원에결합하는신규한단백질을생성하고선택하기위한강력한도구를제공하였다. 파지 ( 미드 ) 디스플레이기술을사용함으로써, 표적분자에높은친화성으로결합하는서열에대해신속하게분류될수있는단백질변이체의큰라이브러리를생성할수있다. 변이체폴리펩티드를코딩하는핵산은바이러스코트단백질, 예컨대유전자 III 단백질또는유전자 VIII 단백질을코딩하는핵산서열에일반적으로융합된다. 단백질또는폴리펩티드를코딩하는핵산서열이유전자 III 단백질의일부를코딩하는핵산서열에융합된 1가파지미드디스플레이시스템이개발되었다. ( 문헌 [Bass, S., Proteins, 8:309 (1990)]; [Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)]). 1가파지미드디스플레이시스템에서는, 유전자융합체가저수준으로발현되고, 야생형유전자 III 단백질이또한발현되어입자의감염성이유지된다. 펩티드라이브러리의생성방법및이들라이브러리의스크리닝방법이많은특허에개시되어있다 ( 예를들어, 미국특허제5,723,286호, 미국특허제5,432,018호, 미국특허제5,580,717호, 미국특허제5,427,908호및미국특허제5,498,530호 ). 항체또는항원결합폴리펩티드의라이브러리를수많은방식으로제조하였는데, 이에는무작위 DNA 서열을삽입함으로써단일유전자를변경시키는방법또는관련유전자패밀리를클로닝하는방법이포함된다. 파지 ( 미드 ) 디스플레이를이용하여항체또는항원결합단편을디스플레이하는방법이미국특허제5,750,373호, 동제5,733,743호, 동제5,837,242호, 동제5,969,108호, 동제6,172,197호, 동제5,580,717호및동제5,658,727 호에기재되어있다. 이어서, 상기라이브리러리를대상으로하여목적하는특징을지닌항체또는항원결합성단백질의발현에관하여스크리닝한다. 선택된아미노산을주형핵산으로치환시키는방법은당해분야에널리정립되어있는데, 이들중의몇가지가본원에기재되어있다. 예를들어, 쿤켈방법을사용하여초가변영역잔기를치환시킬수있다. 예를들어, 문헌 [Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)] 을참조한다. 올리고뉴클레오티드의서열에는변경시키고자하는초가변영역잔기에대해설계된코돈세트중의하나이상이포함된다. 코돈세트는원하는변이체아미노산을코딩하는데사용된여러뉴클레오티드트리플릿 (triplet) 서열들의세트이다. 코돈세트는 IUB 코드에따라아래나타낸바와같이특정뉴클레오티드또는뉴클레오티드의등몰혼합물을지정하기위해기호를사용하여나타낼수있다. - 42 -
[0314] [0315] [0316] [0317] [0318] [0319] 표준방법을사용하여올리고뉴클레오티드또는프라이머세트를합성할수있다. 코돈세트에의해제공되는뉴클레오티드트리플릿의모든가능한조합을나타내고, 목적하는군의아미노산을코딩하는서열을함유하는올리고뉴클레오티드의세트는예를들어고체상합성에의해합성할수있다. 특정위치에선택된뉴클레오티드 " 퇴보 " 가있는올리고뉴클레오티드의합성은당업계에주지되어있다. 특정코돈세트를갖는뉴클레오티드들의이같은세트는시판되는핵산합성기 ( 예를들어, 어플라이드바이오시스템즈 (Applied Biosystems), 캘리포니아주포스터시티소재로부터입수가능 ) 를사용하여합성될수있거나, 또는상업적으로수득될수있다 ( 예를들어, 라이프테크놀로지스 (Life Technologies), 메릴랜드주록빌소재로부터수득 ). 따라서, 특정코돈세트를갖는합성된올리고뉴클레오티드세트는전형적으로, 상이한서열을갖는다수의올리고뉴클레오티드를포함하며, 그차이는전체서열내코돈세트에의해확립된다. 본발명에따라사용될때올리고뉴클레오티드는가변도메인핵산주형에혼성화를허용하는서열을갖고, 또한클로닝목적을위한제한효소부위를포함할수있다. 한방법에서, 변이체아미노산을코딩하는핵산서열이올리고뉴클레오티드- 매개돌연변이유발에의해생성될수있다. 상기기술은문헌 [Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10:6487-6504 (1987)] 에기재된바와같이당업계에잘공지되어있다. 간략하게, 변이체아미노산을코딩하는핵산서열은목적하는코돈세트를코딩하는올리고뉴클레오티드세트를 DNA 주형에혼성화함으로써생성되고, 여기서주형은가변영역핵산주형서열을함유하는단일가닥형태의플라스미드이다. 혼성화후, DNA 폴리머라제를사용하여주형의전체적인제2 상보적가닥이합성되고, 상기가닥에는따라서올리고뉴크레오티드프라이머가혼입될것이고, 올리고뉴클레오티드세트에의해제공된코돈세트를함유할것이다. 일반적으로, 길이가적어도 25 뉴클레오티드인올리고뉴클레오티드가사용된다. 최적의올리고뉴클레오티드에는돌연변이 ( 들 ) 를코딩하는뉴클레오디드 ( 들 ) 의어느한쪽측면상의주형에대해완전히상보적인 12개내지 15개의뉴클레오티드가있을것이다. 이는올리고뉴클레오티드가단일가닥 DNA 주형분자에정확하게혼성화될것을확실하게한다. 올리고뉴클레오티드는당업계에공지된기술, 예컨대문헌 [Crea et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978)] 에기재된바와같은기술을사용하여용이하게합성한다. DNA 주형은박테리오파지 M13 벡터 ( 시판용 M13mp18 및 M13mp19 벡터가적합함 ) 로부터유래된벡터또는문헌 [Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987)] 에의해기재된바와같은단일가닥파지복제기점을함유하는벡터에의해생성된다. 따라서, 돌연변이될 DNA가단일가닥주형을생성시키기위해이러한벡터들중하나내로삽입될수있다. 단일가닥주형의생산은상기문헌 [Sambrook et al.] 의섹션 4.21-4.41에기재되어있다. 천연 DNA 서열을변경시키기위해, 올리고뉴클레오티드를적절한혼성화조건하에단일가닥주형에혼성화시킨다. 이어서, DNA 폴리머라제, 보통 T7 DNA 폴리머라제또는 DNA 폴리머라제 I의클레나우 (Klenow) 단편을첨가하여, 합성을위한프라이머로서올리고뉴클레오티드를사용하여주형의상보성가닥을합성한다. 1개의 DNA 의가닥은유전자 1의돌연변이된형태를코딩하고, 다른가닥 ( 원래의주형 ) 은유전자 1의천연의변경되지않은서열을코딩하도록헤테로듀플렉스 (heteroduplex) 분자가이렇게하여형성된다. 그후, 이러한헤테로듀플렉스분자를적절한숙주세포, 일반적으로는원핵세포, 예컨대이. 콜라이 JM101 내로형질전환시킨다. 세포를성장시킨후아가로스플레이트상에플레이팅하고, 돌연변이된 DNA를함유하는박테리아콜로니를확인하기 위해 32 - 포스페이트로방사성표지된올리고뉴클레오티드프라이머를사용하여스크리닝한다. - 43 -
[0320] [0321] [0322] [0323] [0324] [0325] [0326] [0327] [0328] [0329] 플라스미드의양쪽가닥모두가돌연변이 ( 들 ) 를함유하는호모듀플렉스 (homoduplex) 분자가생성되도록바로위에서기술된방법이변형될수있다. 변형은하기와같다 : 단일가닥올리고뉴클레오티드를상기기재된바와같이단일가닥주형에어닐링시킨다. 데옥시리보아데노신 (datp), 데옥시리보구아노신 (dgtp), 및데옥시리보티미딘 (dtt) 의 3가지데옥시리보뉴클레오티드의혼합물을 dctp-(as) 로불리는변형된티오데옥시리보사이토신 ( 아머샴 (Amersham) 으로부터수득될수있음 ) 과조합한다. 이러한혼합물을주형-올리고뉴클레오티드복합체에첨가한다. 이러한혼합물에 DNA 폴리머라제를첨가하면, 돌연변이된염기를제외하고주형과동일한 DNA의가닥이생성된다. 또한, DNA의이러한새로운가닥은 dctp 대신 dctp-(as) 를함유할것이고, 이는제한효소소화로부터 DNA를보호하는작용을한다. 이중가닥헤테로듀플렉스의주형가닥을적절한제한효소로니킹 (nicking) 시킨후, 돌연변이유발될부위 ( 들 ) 를함유하는영역이아닌곳에서주형가닥을 ExoIII 뉴클레아제또는또다른적합한뉴클레아제로소화시켜절단할수있다. 그후, 반응을정지시켜, 부분적으로만단일가닥인분자를남긴다. 그후, 4가지모두의데옥시리보뉴클레오티드트리포스페이트, ATP, 및 DNA 리가제의존재하에 DNA 폴리머라제를사용하여완전한이중가닥 DNA 호모듀플렉스가형성된다. 그후, 이러한호모듀플렉스분자를적절한숙주세포내로형질전환시킨다. 앞서나타낸바와같이, 올리고뉴클레오티드세트의서열은주형핵산에혼성화하기에충분한길이이고, 반드시그럴필요는없지만, 제한부위를또한함유할수있다. 문헌 [Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (198 7)] 에기술된바와같이단일가닥파지복제기원을함유하는벡터또는박테리오파지 M13 벡터로부터유래된벡터에의해 DNA 주형이생성될수있다. 따라서, 돌연변이될 DNA가단일가닥주형을생성시키기위해이러한벡터들중하나내로삽입되어야한다. 단일가닥주형의생산이 [Sambrook et al., 상기문헌 ] 의섹션 4.21-4.41에기술되어있다. 다른방법에따르면, 각각의세트가상이한서열을갖는다수의올리고뉴클레오티드를갖는상류및하류올리고뉴클레오티드세트를제공함으로써라이브러리를생성시킬수있고, 상기상이한서열은올리고뉴클레오티드의서열내에제공된코돈세트에의해확립된다. 상류및하류올리고뉴클레오티드세트를가변도메인주형핵산서열과함께폴리머라제연쇄반응에사용하여 PCR 생성물의 " 라이브러리 " 를생성시킬수있다. 확립된분자생물학기술을사용하여다른관련된또는관련되지않은핵산서열, 예를들어, 바이러스코트단백질및이량체화도메인과융합될수있기때문에, PCR 생성물은 " 핵산카세트 " 로지칭될수있다. PCR 프라이머의서열에는초가변영역내의용매접근가능하고고도로다양한위치에대해설계된코돈세트중의하나이상이포함된다. 상기기술된바와같이, 코돈세트는원하는변이체아미노산을코딩하는데사용된여러뉴클레오티드트리플릿서열들의세트이다. 적당한스크리닝 / 선별단계를통하여선별된바와같은, 목적하는기준을충족시켜주는항체선별제는표준재조합기술을사용하여단리및클로닝할수있다. B. 재조합제제본발명은또한항-PD-L1 항체를코딩하는단리된핵산, 상기핵산을포함하는벡터및숙주세포, 및항체의생산을위한재조합기술을제공한다. 항체의재조합생성을위해, 이것을코딩하는핵산을단리하여추가의클로닝 (DNA의증폭 ) 또는발현을위해복제가능한벡터에삽입한다. 모노클로날항체를코딩하는 DNA는통상의절차를이용 ( 예를들어, 항체의중쇄및경쇄를코딩하는유전자에특이적으로결합할수있는올리고뉴클레오티드프로브를사용함 ) 하여쉽게단리되고서열분석된다. 다수의벡터가이용가능하다. 벡터의선택은부분적으로는사용되는숙주세포에따른다. 일반적으로, 바람직한숙주세포는원핵세포또는진핵세포 ( 일반적으로, 포유동물 ) 기원중하나이다. 1. 원핵세포에서의항체생산 a) 벡터구축본발명의항체의폴리펩티드성분을코딩하는폴리뉴클레오티드서열은표준재조합기술을사용하여얻을수있다. 목적하는폴리뉴클레오티드서열은항체생성세포, 예컨대하이브리도마세포로부터단리되어서열결정될수있다. 별법적으로, 폴리뉴클레오티드는뉴클레오티드합성기또는 PCR 기술을사용하여합성할수있다. 일단얻은후에, 폴리펩티드를코딩하는서열은원핵세포숙주에서이종폴리뉴클레오티드를복제및발현할수있는재조합벡터내로삽입된다. 입수가능하고당업계에공지된많은벡터를본발명의목적에사용할수있다. 적절한벡터의선택은주로벡터에삽입되는핵산의크기및벡터로형질전환되는특정숙주세포에따를것이다. 각각의벡터는그의기능 ( 이종폴리뉴클레오티드의증폭또는발현, 또는둘모두 ) 및벡터가존재하게되는특정숙주세포와의상용성에따라다양한성분을포함한다. 벡터성분은일반적으로복제 - 44 -
기점, 선별마커유전자, 프로모터, 리보솜결합부위 (RBS), 신호서열, 이종핵산삽입물및전사종결서열 을포함하지만, 이들로한정되는것은아니다. [0330] [0331] [0332] [0333] [0334] [0335] [0336] [0337] 일반적으로, 숙주세포와상용성인종으로부터유래된레플리콘및제어서열을함유하는플라스미드벡터가상기숙주와함께사용된다. 벡터는통상적으로복제부위, 및형질전환된세포에서표현형선별을제공할수있는마킹 (marking) 서열을포함한다. 예를들어, 이. 콜라이는전형적으로이. 콜라이종으로부터유래된플라스미드인 pbr322를사용하여형질전환시킨다. pbr322는암피실린 (Amp) 및테트라시클린 (Tet) 내성을코딩하는유전자를함유하고, 따라서형질전환된세포를확인하기위한용이한수단을제공한다. pbr322, 그의유도체, 또는다른미생물플라스미드또는박테리오파지또한내인성단백질의발현을위해미생물유기체에의해사용될수있는프로모터를함유하거나상기프로모터를함유하도록변형될수있다. 특정항체의발현을위해사용되는 pbr322 유도체의예는카터 (Carter) 등의미국특허제5,648,237호에상세하게기재되어있다. 또한, 숙주미생물과상용성인레플리콘및제어서열을함유하는파지벡터를상기숙주에대한형질전환벡터로서사용할수있다. 예를들어, 박테리오파지, 예컨대 GEM.TM.-11이이. 콜라이 LE392와같은감수성숙주세포의형질전환에사용될수있는재조합벡터의제조에이용될수있다. 본발명의발현벡터는각각의폴리펩티드성분을코딩하는 2종이상의프로모터-시스트론쌍을포함할수있다. 프로모터는시스트론의발현을조정하는, 시스트론의상류 (5') 에위치하는번역되지않는제어서열이다. 원핵세포프로모터는전형적으로두유형의프로모터, 즉유도가능및구성적프로모터로분류된다. 유도성프로모터는배양조건에서의변화, 예를들어영양소의존재또는부재또는온도에서의변화에응답하여이의제어하에있는시스트론의전사수준증가를개시시키는프로모터이다. 다양한가능한숙주세포에의해인식되는수많은프로모터가공지되어있다. 선택된프로모터는, 제한효소소화를통해공급원 DNA로부터프로모터를제거하고단리된프로모터서열을본발명의벡터내로삽입함으로써경쇄또는중쇄를코딩하는시스트론 DNA에작동가능하게연결될수있다. 천연프로모터서열및많은이종프로모터를둘다사용하여표적유전자의증폭및 / 또는발현을지시할수있다. 일부실시양태에서, 이종프로모터는일반적으로천연표적폴리펩티드프로모터에비해발현된표적유전자의보다큰전사및보다높은수율을가능하게하기때문에이것이이용된다. 원핵세포숙주에사용하기적합한프로모터에는 PhoA 프로모터, 갈락타마제및락토스프로모터시스템, 트립토판 (trp) 프로모터시스템및하이브리드프로모터, 예컨대 tac 또는 trc 프로모터가포함된다. 그러나, 박테리아에서기능적인다른프로모터 ( 예컨대, 다른공지의박테리아또는파지프로모터 ) 도적합하다. 그의뉴클레오티드서열은공개되어있고, 당업자는임의의요구되는제한부위를공급하도록링커또는어댑터를사용하여이들서열을표적경쇄및중쇄를코딩하는시스트론에작동가능하게라이게이션할수있다 ( 문헌 [Siebenlist et al., (1980) Cell 20: 269]). 한측면에서, 재조합벡터내의각각의시스트론은발현된폴리펩티드의막을가로지른전위를지시하는분비신호서열성분을포함한다. 일반적으로, 신호서열은벡터의한성분일수있거나, 또는벡터내에삽입되는표적폴리펩티드 DNA의일부일수있다. 본발명의목적을위해선별된신호서열은숙주세포에의해인식되고프로세싱 ( 즉, 신호펩티다제에의해절단 ) 되는것이어야한다. 이종성폴리펩티드에천연인신호서열을인식및프로세싱하지않는원핵생물숙주세포에대해서, 신호서열이알칼리성포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는열-안정성장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로이루어진군으로부터예를들어선택된원핵생물신호서열로치환된다. 본발명의한실시양태에서, 발현시스템의시스트론모두에사용되는신호서열은 STII 신호서열또는그의변이체이다. 또다른측면에서, 본발명에따른이뮤노글로불린의생성은숙주세포의세포질에서일어날수있으며, 따라서각시스트론내의분비신호서열의존재를요구하지않는다. 이와관련하여, 이뮤노글로불린경쇄및중쇄가발현되고, 폴딩되고, 어셈블리되어, 세포질내에서기능적이뮤노글로불린을형성한다. 특정숙주균주 ( 예를들어, 이. 콜라이 trxb - 균주 ) 는디술피드결합형성에유리한세포질조건을제공함으로써, 발현된단백질서브유닛의정확한폴딩및어셈블리를허용한다. 문헌 [Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995)]. 본발명은발현된폴리펩티드성분의정량적비율이분비되고적절하게어셈블리된항체의수율을최대화하도록조정될수있는발현시스템을제공한다. 이러한조절은폴리펩티드성분에대한번역강도의동시조절에의해적어도부분적으로달성된다. 번역강도의조절을위한한가지기술은시몬스 (Simmons) 등의미국특허제5,840,523호에개시되어있다. 이는시스트론내의번역개시영역 (TIR) 의변이체를이용한다. 소정의 TIR - 45 -
에대해, 일련의아미노산또는핵산서열변이체는일정범위의번역강도로생성됨으로써, 상기인자를특정사슬의목적하는발현수준을위해조정하는편리한수단을제공할수있다. TIR 변이체는아미노산서열을변경할수있는코돈변화를초래하는통상적인돌연변이유발기술에의해생성될수있지만, 뉴클레오티드서열의침묵변경이바람직하다. TIR의변경은예를들어신호서열의변경과함께샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열의수또는간격의변경을포함할수있다. 돌연변이체신호서열을생성하는한가지방법은신호서열의아미노산서열을변화시키지않는 ( 즉, 변화가침묵된 ) 코딩서열의시작점에서의 " 코돈뱅크 (codon bank)" 의생성이다. 이는각각의코돈의제3 뉴클레오티드위치의변화에의해달성될수있으며 ; 또한류신, 세린및아르기닌과같은일부아미노산은상기뱅크를제조하는데있어서복잡성을추가할수있는다수의제1 및제2 위치를갖는다. 상기돌연변이유발의방법은문헌 [Yansura et al., (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158] 에상세히기재되어있다. [0338] [0339] [0340] 바람직하게는, 그안의각각의시스트론에대한일정범위의 TIR 강도를갖는벡터의세트가생성된다. 상기제한된세트는각각의사슬의발현수준뿐만아니라다양한 TIR 강도조합하에서목적하는항체생성물의수율의비교를제공한다. TIR 강도는시몬스등의미국특허제5,840,523호에상세히기재된바와같이리포터유전자의발현수준을정량화함으로써측정될수있다. 번역강도비교를기초로하여, 본발명의발현벡터구조물에조합되도록목적하는개별 TIR을선택한다. b) 원핵숙주세포. 본발명의항체의발현에적합한원핵숙주세포에는원시세균및유박테리아, 예컨대그람-음성또는그람-양성유기체가포함된다. 유용한박테리아의예에는에스케리키아 (Escherichia) ( 예를들어, 이. 콜라이 ), 바실러스 (Bacilli) ( 예를들어, 비. 섭틸리스 (B. subtilis)), 엔테로박테리아 ), 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 ( 예를들어, 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa)), 살모넬라티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아마르세스칸스 (Serratia marcescans), 클레브시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 시겔라 (Shigella), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오실라 (Vitreoscilla) 또는파라코쿠스 (Paracoccus) 가포함된다. 한실시양태에서, 그람- 음성세포가사용된다. 한실시양태에서, 이. 콜라이세포가본발명에서숙주로서사용된다. 이. 콜라이균 주의예로는유전자형 W3110 ( 미국특허제5,639,635호 ) 을갖는균주 33D3을비롯한, 균주 W3110 ( 문헌 [Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC 기탁번호 27,325) 및그의유도체가포함된다. 다른균주및그의유도체, 예컨대이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 1776 (ATCC 31,537) 및이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608) 이또한적합하다. 이러한예는제한적인것이아니라예시적인것이다. 특정유전자형을갖는언급된박테리아의유도체중어느하나를제작하는방법은당업계에공지되어있으며, 예를들어문헌 [Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)] 에기재되어있다. 박테리아세포내의레플리콘의복제능을고려하여적절한박테리아를선택하는것이일반적으로필요하다. 예를들어, pbr322, pbr325, pacyc177, 또는 pkn410과같은널리공지된플라스미드를사용하여레플리콘을공급하는경우에는, 이. 콜라이, 세라티아, 또는살모넬라종이숙주로서적합하게사용될수있다. [0341] [0342] [0343] [0344] 전형적으로, 숙주세포는최소량의단백질분해효소를분비해야하며, 추가의프로테아제억제제는바람직하게는세포배양물에혼입될수있다. c) 항체생산숙주세포를상기기재된발현벡터로형질전환시키고, 프로모터를유도하거나, 형질전환체를선택하거나, 목적하는서열을코딩하는유전자를증폭시키기위해필요에따라변형된통상적인영양배지에서배양시킨다. 형질전환은 DNA가염색체외요소로서또는염색체통합체에의해복제가능하도록 DNA를원핵세포숙주내로도입하는것을의미한다. 사용되는숙주세포에따라, 형질전환은그세포에적절한표준기술을이용하여수행된다. 염화칼슘을사용한칼슘처리는실질적인세포벽장벽을함유하는박테리아세포에일반적으로사용된다. 또다른형질전환방법은폴리에틸렌글리콜 /DMSO를사용한다. 사용되는또다른기술은전기천공이다. 본발명의항체를생성하는데사용되는원핵세포를당업계에공지되고선택된숙주세포의배양에적합한배지에서성장시킨다. 적합한배지의예에는필수영양보충물이부가된루리아브로쓰 (luria broth; LB) 가포함된다. 일부실시양태에서, 배지는또한발현벡터를함유하는원핵세포의성장을선택적으로허용하는, 발현벡터의구조를기초로하여선택된선별제를함유한다. 예를들어, 암피실린은암피실린내성유전자를발현하는세포를성장시키기위한배지에첨가된다. - 46 -
[0345] [0346] [0347] [0348] [0349] [0350] 또한, 탄소, 질소및무기포스페이트공급원이외의임의의필요한보충물이, 단독으로, 또는복합질소공급원과같은또다른보충물또는배지와의혼합물로서도입되어적절한농도로포함될수있다. 임의로, 배양배지는글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨및디티오트레이톨로이루어진군으로부터선택되는 1종이상의환원제를함유할수있다. 원핵숙주세포를적합한온도에서배양한다. 이. 콜라이성장에대하여, 바람직한온도는예를들어약 20 내지약 39, 보다바람직하게는약 25 내지약 37, 보다더바람직하게는약 30 이다. 배지의 ph는주로숙주유기체에따라약 5 내지약 9 범위의임의의 ph일수있다. 이. 콜라이의경우, ph는바람직하게는약 6.8 내지약 7.4, 보다바람직하게는약 7.0이다. 유도가능프로모터가본발명의발현벡터에사용되는경우에, 단백질발현은프로모터의활성화에적합한조건하에서유도된다. 본발명의한측면에서, PhoA 프로모터가폴리펩티드의전사의제어에사용된다. 따라서, 형질전환된숙주세포는유도용의포스페이트-제한배지에서배양된다. 바람직하게는, 포스페이트-제한배지는 C.R.A.P 배지이다 ( 예를들어, 문헌 [Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147] 참조 ). 당업계에공지된바와같이, 사용되는벡터구조물에따라다양한다른유도제가사용될수있다. 본발명의발현된항체단백질은숙주세포의주변세포질로분비되고그로부터회수된다. 전형적으로, 단백질회수는일반적으로삼투성쇼크, 초음파처리또는용해와같은수단에의해미생물을분쇄하는것을포함한다. 세포가분쇄되면, 세포잔해또는전체세포를원심분리또는여과에의해제거할수있다. 단백질은예를들어친화성수지크로마토그래피에의해추가로정제할수있다. 별법적으로, 단백질을배양배지내로옮기고, 그안에서단리할수있다. 세포를배양물로부터제거하고, 배양상청액을여과하고농축하여생성된단백질을추가로정제할수있다. 발현된폴리펩티드를추가로단리하고, 폴리아크릴아미드겔전기영동 (PAGE) 및웨스턴블롯검정과같은통상적으로공지된방법을이용하여확인할수있다. 별법적으로, 항체생성은발효공정에의해대량으로수행된다. 다양한대규모유가식 (fed-batch) 발효절차가재조합단백질의생성에이용가능하다. 대규모발효는적어도 1000 리터의용량, 바람직하게는약 1,000 내지 100,000 리터의용량을갖는다. 상기발효기는산소및영양소, 특히글루코스 ( 바람직한탄소 / 에너지공급원 ) 를분배시키는교반기추진기를사용한다. 소규모발효는일반적으로, 용적이대략 100 리터이하인발효기내에서의발효를지칭하는데, 이는약 1 리터내지약 100 리터범위일수있다. 발효공정에서, 단백질발현의유도는전형적으로세포를적합한조건하에서목적하는밀도, 예를들어약 180-220의 OD 550 으로성장시킨후에개시되며, 이단계에서세포는초기정체기이다. 당업계에공지되고상기 기재된바와같이, 사용되는벡터구조물에따라다양한유도제를사용할수있다. 세포를유도전에보다짧 은기간동안성장시킬수있다. 세포를통상적으로약 12 내지 50 시간동안유도하지만, 보다길거나보다짧 은유도시간이사용될수도있다. [0351] [0352] [0353] 본발명의항체의생성수율및품질을향상시키기위해, 다양한발효조건을변형시킬수있다. 예를들어, 분비된항체폴리펩티드의적당한어셈블리와폴딩을개선시키기위해, 샤페론 (chaperone) 단백질, 예를들어 Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및 / 또는 DsbG) 또는 FkpA ( 샤페론활성을지니고있는펩티딜프롤릴시스, 트랜스-이소머라제 ) 를과다발현하는부가의벡터를사용하여숙주원핵세포를공동-형질전환시킬수있다. 샤페론단백질은박테리아숙주세포에서생성된이종단백질의적절한폴딩및가용성을용이하게하는것으로입증되었다. 문헌 [Chen et al., (1999) J Bio Chem 274:19601-19605]; 미국특허제6,083,715호 (Georgiou et al.); 미국특허제6,027,888호 (Georgiou et al.); [Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105]; [Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113]; [Arie et al., (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210]. 발현된이종단백질 ( 특히, 단백질분해에감수성인단백질 ) 의단백질분해를최소화하기위해, 단백질분해효소가결핍된특정숙주균주를본발명에사용할수있다. 예를들어, 숙주세포균주를변형시켜, 공지된세균성프로테아제, 예를들어프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및그의조합물을코딩하는유전자에서유전적돌연변이 ( 들 ) 를수행할수있다. 몇몇이. 콜라이프로테아제-결핍균주가이용가능하며, 예를들어, 문헌 [Joly et al., (1998), 상기문헌 ]; 미국특허제 5,264,365호 (Georgiou et al.); 미국특허제5,508,192호 (Georgiou et al.); [Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)] 에기재되어있다. 단백질분해효소가결핍되고 1종이상의샤페론단백질을과다발현하는플라스미드로형질전환된이. 콜라이균 - 47 -
주가본발명의항체를코딩하는발현시스템에있어서숙주세포로서이용될수있다. [0354] [0355] d) 항체정제추가적인검정및사용을위한실질적으로균질한제제를수득하기위해본원에서생산된항체단백질을추가로정제하였다. 당업계에공지된표준단백질정제방법이이용될수있다. 하기절차는적합한정제절차의예이다 : 면역친화성또는이온-교환칼럼상의분획화, 에탄올침전, 역상 HPLC, 실리카상또는 DEAE와같은양이온-교환수지상의크로마토그래피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 황산암모늄침전, 및예를들어세파덱스 (Sephadex) G-75를이용한겔여과. [0357] [0358] [0359] [0360] [0361] [0362] [0363] [0364] [0365] [0366] [0367] [0368] [0369] [0370] 한측면에서, 고체상에고정된단백질 A가본발명의전장항체생성물의면역친화성정제에사용된다. 단백질 A는높은친화성으로항체의 Fc 영역에결합하는스타필로코쿠스아우레아스 (Staphylococcus aureas) 로부터의 41 kd 세포벽단백질이다. 문헌 [Lindmark et al., (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13]. 단백질 A가고정되는고체상은바람직하게는유리또는실리카표면을포함하는칼럼, 보다바람직하게는제어된공극유리칼럼또는규산칼럼일수있다. 일부용도에서, 칼럼을글리세롤과같은시약으로코팅하여가능하게는오염물의비특이적부착을방지한다. 그후, 고체상을세척하여고체상에비-특이적으로결합된오염물을제거하였다. 최종적으로, 목적하는항체를용출에의해고체상으로부터회수한다. 2. 진핵세포에서의항체생산진핵세포발현을위해, 벡터성분은일반적으로하나이상의다음과같은신호서열, 복제기점, 하나이상의마커유전자, 인핸서성분, 프로모터및전사종결서열을포함하지만, 이들로한정되는것은아니다. a) 신호서열성분진핵숙주에사용하기위한벡터는또한신호서열, 또는성숙단백질또는폴리펩티드의 N-말단에특이적절단부위를갖는다른폴리펩티드를코딩하는삽입물을함유할수있다. 바람직하게선택된이종신호서열은숙주세포에의해인식및프로세싱 ( 즉, 신호펩티다제에의해절단 ) 되는것이다. 포유동물세포발현시에는, 포유동물신호서열및또한바이러스성분비리더, 예를들어단순포진 gd 신호가이용가능하다. 이러한전구체영역을위한 DNA는본발명의항체를코딩하는 DNA에리딩프레임으로라이게이션된다. b) 복제기점일반적으로, 복제기점성분은포유동물발현벡터에서는필요하지않다 ( 전형적으로, SV40 기점은단지초기프로모터를함유하기때문에사용될수있음 ). c) 선별유전자성분발현및클로닝벡터는선별가능한마커라고도불리는선별유전자를함유할수있다. 전형적인선별유전자는 (a) 항생제또는다른독소, 예를들어암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트또는테트라시클린에대한내성을부여하거나, (b) 영양요구성결핍을보완하거나, (c) 복합배지로부터이용가능하지않는중요영양분을공급하는단백질을코딩하고, 예를들어바실러스의경우에는 D-알라닌라세마제를코딩하는유전자이다. 선별계획의한예는숙주세포의성장을정지시키는약물을이용한다. 이종유전자로성공적으로형질전환된세포들은약물내성을부여하는단백질을생성하고, 따라서선별계획에서생존한다. 이러한우성선별의예는약물네오마이신, 미코페놀산및히그로마이신을사용한다. 포유동물세포에적합한선별가능마커의또다른예는본발명의항체를코딩하는핵산을능숙하게취하는세포의확인을가능하게하는것, 예컨대 DHFR, 티미딘키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는영장류메탈로티오네인유전자, 아데노신데아미나제, 오르니틴데카르복실라제등이다. 예를들어, DHFR 선별유전자로형질전환된세포는우선 DHFR의경쟁적길항제인메토트렉세이트 (Mtx) 를함유하는배양배지에서모든형질전환체를배양함으로써확인한다. 야생형 DHFR을사용할때의적절한숙주세포는 DHFR 활성이결여된차이니즈햄스터난소 (CHO) 세포주 ( 예를들어, ATCC CRL-9096) 이다. 또다른한편, 항체코딩 DNA 서열, 야생형 DHFR 단백질및또다른선별가능마커, 예를들어아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH) 로형질전환시켰거나공동-형질전환시킨숙주세포 ( 특히, 내인성 DHFR을함유하는야생형숙주 ) 는, 선별가능마커, 예를들어아미노글리코시드성항생제 ( 예를들어, 카나마이신, 네오마이 - 48 -
신또는 G418) 에대한선별제를함유하는배지에서세포성장시킴으로써선별할수있다. 4,965,199 호를참조한다. 미국특허제 [0371] [0372] [0373] [0374] [0375] [0376] [0377] [0378] [0379] [0380] [0381] d) 프로모터성분발현및클로닝벡터는통상적으로숙주유기체에의해인지되고목적하는항체서열을코딩하는핵산에작동가능하게연결된프로모터를함유한다. 실질적으로모든진핵유전자는전사가개시되는부위로부터대략 25개내지 30개염기상류에위치하는 AT-풍부영역을갖는다. 많은유전자의전사출발점으로부터 70개내지 80개염기상류에서확인되는또다른서열은 CNCAAT 영역 ( 여기서, N은임의의뉴클레오티드일수있음 ) 이다. 대부분의진핵세포의 3' 말단에는코딩서열의 3' 말단에폴리 A 테일의부가를위한신호일수있는 AATAAA 서열이존재한다. 이러한모든서열들이진핵발현벡터내로삽입될수있다. 원핵숙주에사용하기적합한그밖의프로모터는 phoa 프로모터, -락타마제및락토스프로모터시스템, 알칼리성포스파타제프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터시스템, 및하이브리드프로모터, 예를들어 tac 프로모터를포함한다. 그러나, 다른공지의박테리아프로모터도적합하다. 박테리아시스템에사용하기위한프로모터는또한항체폴리펩티드를코딩하는 DNA에작동가능하게연결된샤인-달가노 (S.D.) 서열도함유할것이다. 포유동물숙주세포에서벡터로부터의항체폴리펩티드전사는, 예를들어폴리오마바이러스, 계두바이러스, 아데노바이러스 ( 예컨대아데노바이러스 2), 소유두종바이러스, 조류육종바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형간염바이러스, 및가장바람직하게는원숭이바이러스 40 (SV40) 등의바이러스게놈으로부터수득한프로모터, 이종포유동물프로모터, 예를들어액틴프로모터또는이뮤노글로불린프로모터, 및열- 쇼크프로모터에의해제어될수있는데, 단이들프로모터는숙주세포시스템과상용가능하여야한다. SV40 바이러스의초기및후기프로모터는 SV40 바이러스성복제기점을또한함유하는 SV40 제한단편으로서편리하게수득하였다. 인간시토메갈로바이러스의극초기프로모터가 HindIII E 제한단편으로편리하게수득하였다. 소유두종바이러스를벡터로사용하여포유동물숙주에서 DNA를발현시키기위한시스템이미국특허제4,419,446호에개시되어있다. 이러한시스템의변형은미국특허제4,601,978호에기재되어있다. 또한, 단순포진바이러스로부터의티미딘키나제프로모터의조절하에마우스세포에서인간 -인터페론 cdna의발현에대해서는또한문헌 [Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982)] 을참조한다. 별법적으로, 라우스육종바이러스의긴말단반복체를프로모터로사용할수있다. e) 인핸서요소성분고등진핵생물에의해본발명의항체를코딩하는 DNA를전사하는것은종종, 인핸서서열을벡터내로삽입함으로써증가된다. 많은인핸서서열이현재포유동물유전자 ( 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질및인슐린 ) 로부터공지되어있다. 그러나, 전형적으로는진핵세포바이러스로부터의인핸서를사용할것이다. 이것의예는복제기점의하류쪽 (bp 100 내지 270) 의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스초기프로모터인핸서, 복제기점하류쪽의폴리오마인핸서및아데노바이러스인핸서를포함한다. 또한, 진핵프로모터의활성화를위한인핸서요소에대한문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)] 을참조한다. 인핸서는항체코딩서열에대한 5' 또는 3' 위치에서벡터내로분할될수있지만, 바람직하게는프로모터로부터 5' 부위에위치한다. f) 전사종결성분진핵숙주세포 ( 효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는다른다세포유기체로부터의유핵세포 ) 에사용되는발현벡터역시전사의종결및 mrna의안정화에필요한서열을함유할것이다. 이러한서열은진핵생물또는바이러스 DNA 또는 cdna의 5' 및때때로 3' 비번역영역으로부터통상적으로이용가능하다. 이들영역은항체를코딩하는 mrna의비번역부분에서폴리아데닐화단편으로서전사된뉴클레오티드절편을함유한다. 유용한전사종결성분중하나는소성장호르몬폴리아데닐화영역이다. WO 94/11026 및이에개시된발현벡터를참조한다. g) 숙주세포의선별및형질전환본원의벡터에서 DNA의클로닝또는발현에적합한숙주세포에는척추동물숙주세포를비롯하여본원에기재된보다고등한진핵세포가포함된다. 배양 ( 조직배양 ) 시척추동물세포의증식은일상적인방법이되었다. 유용한포유동물숙주세포주의예는 SV40으로형질전환된원숭이신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간배아신장세포주 (293 세포또는현탁배양으로성장시키기위해서브클로닝된 293 세포, 문헌 [Graham et - 49 -
al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼햄스터신장세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈햄스터난소세포 /-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스세르톨리세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이신장세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카녹색원숭이신장세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간자궁경부암종세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개신장세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로래트간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간폐세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스유방종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 ( 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포 ; FS4 세포 ; 및인간간종양세포주 (Hep G2) 이다. [0382] [0383] [0384] [0385] [0386] [0387] 숙주세포를상기기재된항체생산을위한발현또는클로닝벡터로형질전환시키고, 프로모터를유도하거나, 형질전환체를선별하거나, 목적하는서열을코딩하는유전자를증폭시키기위해적절하게변형시킨통상의영양배지에서배양한다. h) 숙주세포의배양본발명의항체를생성하는데사용되는숙주세포는다양한배지중에서배양될수있다. 시판배지, 예컨대햄 F10 ( 시그마 (Sigma)), 최소필수배지 (MEM) ( 시그마 ), RPMI-1640 ( 시그마 ) 및둘베코변형이글배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (DMEM) ( 시그마 ) 가숙주세포의배양에적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)], 미국특허제4,767,704호 ; 동제4,657,866호 ; 동제4,927,762호 ; 동제4,560,655호 ; 또는동제5,122,469호 ; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는미국특허 Re. 30,985에기재되어있는임의의배지를숙주세포용배양배지로사용할수있다. 임의의이들배지에는필요에따라호르몬및 / 또는다른성장인자 ( 예컨대인슐린, 트랜스페린또는표피성장인자 ), 염 ( 예컨대염화나트륨, 칼슘, 마그네슘및포스페이트 ), 완충액 ( 예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 ( 예컨대아데노신및티미딘 ), 항생제 ( 예컨대젠타마이신 약물 ), 미량원소 ( 통상적으로마이크로몰범위의최종농도로존재하는무기화합물로서정의됨 ) 및글루코스또는등가의에너지원이보충될수있다. 또한, 임의의다른필요한보충물을당업자에게공지된적절한농도로포함시킬수도있다. 배양조건, 예컨대온도, ph 등은발현을위해선택된숙주세포와함께이전에사용된것이고, 당업자에게명백할것이다. i) 항체의정제재조합기술을이용하는경우, 항체는세포내에서또는주변세포질공간내에서생성될수도있고, 또는배지로직접분비될수도있다. 항체가세포내에서생성되는경우, 제1 단계로서입자형잔해인숙주세포또는용해된단편을예를들어원심분리또는한외여과에의해제거하였다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)] 에는이. 콜라이의주변세포질공간에분비된항체를단리하는절차가기재되어있다. 간략하게, 세포페이스트를아세트산나트륨 (ph 3.5), EDTA 및페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF) 의존재하에약 30분에걸쳐해동시킨다. 세포잔해는원심분리로제거할수있다. 항체가배지로분비되는경우, 일반적으로는우선이러한발현시스템으로부터의상청액을시판되는단백질농축필터, 예를들어아미콘 (Amicon) 또는밀리포어펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과장치를사용하여농축시킨다. 단백질분해를억제하기위해프로테아제억제제, 예를들어 PMSF를임의의이전단계에포함시킬수있고, 우발적인오염물의성장을저해하기위해항생제를포함시킬수있다. 세포로부터제조된항체조성물은예를들어히드록실아파타이트크로마토그래피, 겔전기영동, 투석및친화성크로마토그래피를사용하여정제할수있고, 친화성크로마토그래피가바람직한정제기술이다. 친화성리간드로서의단백질 A의적합성은항체내에존재하는임의의이뮤노글로불린 Fc 도메인의종및이소형에따라달라진다. 단백질 A가 1, 2 또는 4 중쇄를함유하는인간이뮤노글로불린을기초로한항체를정제하기위해사용될수있다 ( 문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는모든마우스이소형및인간 3에대해추천된다 ( 문헌 [Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)]). 친화성리간드가부착되는매트릭스는가장흔하게는아가로스이지만, 다른매트릭스도이용가능하다. 기계적으로안정한매트릭스, 예를들어제어된공극유리또는폴리 ( 스티렌-디비닐 ) 벤젠이아가로스를사용하여달성될수있는것보다더빠른유동속도와더짧은처리시간을허용한다. 항체가 C H 3 도메인을포함하는경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX 수지 ( 제이. 티. 베이커 (J. T. Baker), 뉴저지주필립스버그소재 ) 가정제에유용하다. 회수할항체에따라, 단백질정제를위한다른기술, 예컨대이온-교환칼럼에서의분획화, 에탄올침전, 역상 HPLC, 실리카에서의크로마토그래피, 헤파린세파로스 에서의크로마토그래피, 음이온또는양이온교환수지 ( 예를들어폴리아스파르트산칼럼 ) 에서의크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및황산암모늄침전이이용될수도있다. - 50 -
[0388] [0389] [0390] [0391] 임의의예비정제단계 ( 들 ) 후에, 관심항체및오염물을포함하는혼합물로 ph 약 2.5 내지 4.5의용출완충액을사용하는, 바람직하게는낮은염농도 ( 예를들어약 0 내지 0.25 M 염 ) 에서수행되는낮은 ph 소수성상호작용크로마토그래피를실시할수있다. C. 항체제조 1) 폴리클로날항체폴리클로날항체는일반적으로관련항원및아주반트의다수회의피하 (sc) 또는복강내 (ip) 주사에의해동물에서생성시킬수있다. 2기능성작용제또는유도체화제, 예를들어, 말레이미도벤조일술포숙신이미드에스테르 ( 시스테인잔기를통한접합 ), N-히드록시숙신이미드 ( 리신잔기를통한 ), 글루타르알데히드, 숙신산무 수물, SOCl 2, 또는 R 1 N=C=NR ( 여기서, R 및 R 1 은독립적으로저급알킬기임 ) 을사용하여, 면역화되는종에면역원성인단백질, 예를들어키홀림펫 (keyhole limpet) 헤모시아닌 (KLH), 혈청알부민, 소티로글로불린또는대두트립신억제제에관련항원을접합시키는것이유용할수있다. 사용될수있는아주반트의예는프로인트완전아주반트및 MPL-TDM 아주반트 ( 모노포스포릴지질 A, 합성트레할로스디코리노미콜레이트 ) 를포함한다. 면역화프로토콜은과도한실험없이당업자가선택할수있다. [0392] 동물은예를들어 100 μg또는 5 μg의단백질또는접합체 ( 각각토끼또는마우스에대해 ) 를 3 부피의프로인트완전아주반트와합한후용액을다중부위에피내주사함으로써항원, 면역원성접합체, 또는유도체에대해면역화된다. 1개월후에, 프로인트완전아주반트중상기펩티드또는접합체의원래양의 1/5 내지 1/10 으로여러부위에피하주사함으로써상기동물을부스팅한다. 7일내지 14일후에, 동물에서채혈하여혈청의항체역가를분석한다. 역가가안정화될때까지동물을부스팅한다. 접합체는또한재조합세포배양물에서단백질융합체로서제조될수도있다. 또한, 면역반응을증강시키기위해응집제, 예를들어명반을적절하게사용한다. [0394] [0395] [0396] [0397] [0398] [0399] [0400] 2) 모노클로날항체모노클로날항체는실질적으로균질한항체집단으로부터수득하였다. 즉, 이러한집단을구성하는개개의항체는소량으로존재할수도있는, 가능한자연발생돌연변이및 / 또는번역후변형 ( 예를들어, 이성질체화, 아미드화 ) 을제외하고는동일하다. 따라서, 수식어구 " 모노클로날 " 은항체의특징을별개의항체의혼합물이아니라는것으로서표시하는것이다. 예를들어, 모노클로날항체는문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)] 에최초로기재된하이브리도마방법에의해제조할수도있고, 또는재조합 DNA 방법 ( 미국특허제4,816,567호 ) 으로제조할수도있다. 하이브리도마방법에서, 마우스또는다른적절한숙주동물, 예를들어햄스터는면역화에사용된단백질에특이적으로결합하는항체를생성하거나생성할수있는림프구를유발하기위해상기기재된바와같이면역화된다. 별법적으로, 림프구는시험관내면역화될수있다. 이어서, 림프구는하이브리도마세포를형성하기위해적합한융합제, 예를들어폴리에틸렌글리콜을사용하여골수종세포와융합된다 ( 문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]). 면역화제는전형적으로항원성단백질또는그의융합체변이체를포함할것이다. 일반적으로, 인간기원의세포가요구될경우말초혈액림프구 ("PBL") 가사용되거나, 비-인간포유동물공급원이요구될경우비장세포또는림프절세포가사용된다. 이어서, 림프구를적합한융합제, 예컨대폴리에틸렌글리콜을사용하여불멸화세포주와융합시켜, 하이브리도마세포를형성한다. 문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103]. 불멸화세포주는일반적으로형질전환된포유동물세포, 특히설치류, 소및인간기원의골수종세포이다. 통상적으로, 래트또는마우스골수종세포주가사용된다. 이와같이제조된하이브리도마세포는바람직하게는융합되지않은모골수종세포의성장또는생존을억제하는 1종이상의물질을함유하는적합한배양배지에접종하여성장시킨다. 예를들어, 모골수종세포에효소히포잔틴구아닌포스포리보실트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 가결핍된경우, 하이브리도마의배양배지는일반적으로히포잔틴, 아미노프테린및티미딘 (HAT 배지 ) 을포함할것이고, 이들물질은 HGPRT-결핍세포의성장을억제한다. 바람직한무한증식골수종세포는효율적으로융합하고, 선택된항체생산세포에의한항체의안정적인고수준 - 51 -
생성을지지하고, 배지, 예를들어 HAT 배지에민감한세포이다. 이중에서, 바람직한무한증식세포주는예를들어솔크인스티튜트셀디스트리뷰션센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국캘리포니아주샌디에고소재 ) 로부터얻을수있는 MOPC-21 및 MPC-11 마우스종양및아메리칸타입컬쳐컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국버지니아주매나사스소재 ) 으로부터얻을수있는 SP-2 세포 ( 및그의유도체, 예를들어 X63-Ag8-653) 와같은쥐골수종라인이다. 인간골수종및마우스-인간이종골수종세포주역시인간모노클로날항체생성과관련하여기재된바있다 ( 문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)], [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]). [0401] [0402] [0403] [0404] [0405] [0406] [0407] [0408] 하이브리도마세포가성장하는배양배지를항원에대한모노클로날항체의생성에대해검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마세포에의해생성된모노클로날항체의결합특이성을면역침전법으로결정하거나, 또는시험관내결합검정법, 예를들어방사성면역검정 (RIA) 또는효소결합면역흡착검정 (ELISA) 으로결정한다. 하이브리도마세포가성장하는배지는목적하는항원에대해작용하는모노클로날항체의존재에대해분석될수있다. 바람직하게는, 모노클로날항체의결합친화성및특이성은면역침전또는시험관내결합분석, 예를들어방사성면역검정 (RIA) 또는효소결합면역흡착검정 (ELISA) 에의해결정할수있다. 상기기술및검정은당업계에알려져있다. 예를들어, 결합친화성은문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)] 의스캐챠드 (Scatchard) 분석에의해결정할수있다. 목적하는특이성, 친화성및 / 또는활성의항체를생성하는하이브리도마세포가확인된후에, 클론은제한희석과정에의해서브클로닝하고표준방법 [Goding, 상기문헌 ] 으로성장시킬수있다. 이러한목적에적합한배양배지는예를들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를포함한다. 또한, 하이브리도마세포는포유동물에서종양으로서생체내에서성장시킬수있다. 서브클론에의해분비된모노클로날항체는통상적인이뮤노글로불린정제절차, 예를들어단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트크로마토그래피, 겔전기영동, 투석또는친화성크로마토그래피에의해배양배지, 복수액또는혈청으로부터적합하게분리된다. 또한, 모노클로날항체는재조합 DNA 방법, 예컨대미국특허제4,816,567호에기재되어있는방법, 및상기에서기재한것과같은방법으로제조할수도있다. 모노클로날항체를코딩하는 DNA는통상적인절차 ( 예를들어, 뮤린항체의중쇄및경쇄를코딩하는유전자에특이적으로결합할수있는올리고뉴클레오티드프로브사용 ) 를이용하여쉽게단리및서열분석된다. 하이브리도마세포는이러한 DNA의바람직한공급원으로작용한다. 일단단리된 DNA는발현벡터에삽입되고, 이벡터는재조합숙주세포에서모노클로날항체를합성하기위해본래이뮤노글로불린단백질을생성하지않는숙주세포, 예를들어이. 콜라이세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈햄스터난소 (CHO) 세포또는골수종세포를형질감염시킨다. 항체를코딩하는 DNA의박테리아에서의재조합발현에대한검토문헌으로는문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 [Plueckthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)] 이포함된다. 추가의실시양태에서, 항체는문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)] 에기재된기술을이용하여생성된항체파지라이브러리로부터단리될수있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)] 은파지라이브러리를사용한뮤린및인간항체각각의단리를기재한다. 후속간행물들에는사슬셔플링에의한높은친화성 (nm 범위 ) 인간항체의생산 ( 문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]), 뿐만아니라매우큰파지라이브러리를구축하기위한전략으로서의조합형감염및생체내재조합 ( 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)]) 이기술되어있다. 따라서, 이러한기술은모노클로날항체단리를위한전통적인모노클로날항체하이브리도마기술의실행가능한대안이다. DNA는또한예를들어상동성뮤린서열대신에인간중쇄및경쇄불변도메인에대한코딩서열을치환시키거나 ( 미국특허제4,816,567호, 문헌 [Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는이뮤노글로불린코딩서열에비-이뮤노글로불린폴리펩티드에대한코딩서열의전부또는일부를공유연결함으로써변형시킬수있다. 전형적으로, 이러한비-이뮤노글로불린폴리펩티드는항체의불변도메인대신사용되거나항체의한항원-결합부위의가변도메인대신사용되어, 항원에대한특이성을갖는하나의항원-결합부위및상이한항원에대한특이성을갖는또다른항원-결합부위를포함하는키메라 2가항체를생성시킨다. 본원에기재된모노클로날항체는 1가항체일수있고, 그의제조방법은당업계에공지되어있다. 예를들어, - 52 -
한방법은이뮤노글로불린경쇄및변형중쇄의재조합발현을수반하였다. 중쇄는중쇄가교를방지하도록일반적으로 Fc 영역내의임의의지점에서절단된다. 별법적으로, 관련시스테인잔기는다른아미노산잔기로대체되거나결실되어가교결합을방지한다. 1가항체를제조하기위해시험관내방법도적합하다. 그의단편, 특히 Fab 단편을생산하기위한항체의소화는당업계에공지된통상적인기술을사용하여달성할수있다. [0409] [0410] [0411] 또한, 키메라또는하이브리드항체는가교제의사용을포함하는합성단백질화학에공지된방법을이용하여시험관내제조될수도있다. 예를들어, 면역독소는디술피드-교환반응을사용하여또는티오에테르결합을형성하여제조할수있다. 상기목적에적합한시약의예로는이미노티올레이트및메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를들수있다. 3) 인간화항체. 본발명의항체는인간화또는인간항체를추가로포함할수있다. 비인간 ( 예를들어, 뮤린 ) 항체의인간화형태는비인간이뮤노글로불린에서유래한최소서열을포함하는키메라이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린사슬, 또는그의단편 ( 예를들어 Fv, Fab, Fab', F(ab') 2 또는항체의다른항원결합하위서열 ) 이다. 인간화항체 는수용자의상보성결정영역 (CDR) 의잔기 ( 본원에서 HVR로사용됨 ) 가목적하는특이성, 친화성및능력을갖는비인간종 ( 공여자항체 ), 예를들어마우스, 래트또는토끼의 CDR의잔기로대체된인간이뮤노글로불린 ( 수용자항체 ) 을포함한다. 일부예에서, 인간이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크잔기는상응하는비-인간잔기로대체된다. 또한, 인간화항체는수용자항체또는도입된 CDR 또는프레임워크서열어느것에서도발견되지않는잔기를포함할수도있다. 일반적으로, 인간화항체는적어도하나, 전형적으로 2개의가변도메인을실질적으로모두포함할것이고, 여기서모든또는실질적으로모든 CDR 영역은비인간이뮤노글로불린의 CDR 영역에대응하고, 모든또는실질적으로모든 FR 영역은인간이뮤노글로불린컨센서스서열의 FR 영역에대응한다. 또한, 인간화항체는이뮤노글로불린불변영역 (Fc) 의적어도일부, 전형적으로인간이뮤노글로불린의일부를최적으로포함할것이다. 문헌 [Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)]. [0412] [0413] [0414] 비-인간항체를인간화하는방법은당업계에널리공지되어있다. 일반적으로, 인간화항체는비-인간공급원으로부터도입된 1개이상의아미노산잔기를갖는다. 이들비-인간아미노산잔기는종종 " 유입 (import)" 잔기로서지칭되는데, 이는전형적으로 " 유입 " 가변도메인으로부터취한다. 인간화는본질적으로윈터 (Winter) 및동업자의방법, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)]) 을따라또는인간항체의대응하는서열을설치류 CDR 또는 CDR 서열로대체함으로써수행할수있다. 따라서, 이같은 " 인간화 " 항체는무손상인간가변도메인보다실질적으로더적은서열이비-인간종으로부터의상응하는서열로치환된키메라항체 ( 미국특허제4,816,567호 ) 이다. 실제로, 인간화항체는전형적으로일부 CDR 잔기및가능하게는일부 FR 잔기가설치류항체의유사부위로부터의잔기로치환된인간항체이다. 인간화항체의제조에사용되는인간가변도메인경쇄및중쇄둘다의선택은항원성감소에매우중요하다. 소위 " 베스트-핏 (best-fit)" 방법에따라, 설치류항체의가변도메인의서열을공지된인간가변-도메인서열의전체라이브러리에대해스크리닝한다. 설치류와가장근접한인간서열은이어서인간화항체의인간프레임워크 (FR) 로서허용된다. 문헌 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)]. 또다른방법은경쇄또는중쇄의특정하위군의모든인간항체의컨센서스서열로부터유래된특정프레임워크를사용한다. 여러다양한인간화항체에대해동일한프레임워크가사용될수있다. 문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)]. 추가로, 항체가항원에대해높은친화성을보유하고기타유리한생물학적특성을보유하도록인간화하는것이중요하다. 이를달성하기위해서, 바람직한방법에따라, 인간화항체는모서열및인간화서열의 3차원모델을이용하는모서열및다양한개념적인간화생성물의분석과정에의해제조된다. 3차원이뮤노글로불린모델은통상적으로이용가능하고, 당업자에게공지되어있다. 선택된후보이뮤노글로불린서열의가능한 3차원형태구조를예시하고디스플레이하는컴퓨터프로그램이이용가능하다. 이러한디스플레이를조사하면후보이뮤노글로불린서열의기능에있어서잔기의가능한역할의분석, 즉후보이뮤노글로불린이그의항원에결합하는능력에영향을미치는잔기의분석이가능하다. 이러한방식으로, FR 잔기는수용자서열및유입서열로부터선택및조합되어원하는항체특징, 예를들어표적항원 ( 들 ) 에대한친화성증가를달성할수있다. 일반적으로, 항원결합에대한영향에는 CDR 잔기가직접적이고가장실질적으로관여한다. - 53 -
[0415] [0416] [0417] 인간화항체의다양한형태가고려된다. 예를들어, 인간화항체는면역접합체를생성시키기위해서하나이상의세포독성제 ( 들 ) 과임의로접합된항체단편, 예를들어 Fab일수있다. 별법적으로, 인간화항체는무손상항체, 예를들어무손상 IgG1 항체일수있다. 4) 인간항체인간화에대한대안책으로서인간항체를생성할수있다. 예를들어, 면역화시에내인성이뮤노글로불린의생성없이인간항체의전체레퍼토리를생성할수있는트랜스제닉동물 ( 예를들어, 마우스 ) 을생성하는것이현재가능하다. 예를들어, 키메라및배선 (germ-line) 돌연변이체마우스내항체중쇄연결영역 (J H ) 유전 자의동형접합성결실이내인성항체생성을완전히억제시킨다고기재된바있다. 인간배선이뮤노글로불린유전자어레이를이러한배선돌연변이체마우스에게전달하면, 항원접종시에인간항체가생성될것이다. 예를들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 미국특허제5,591,669 호및 WO 97/17852를참조한다. [0418] [0419] [0420] [0421] [0422] [0423] 다르게는, 파지디스플레이기술을이용하여면역화되지않은공여자로부터의이뮤노글로불린가변 (V) 도메인유전자레퍼토리로부터인간항체및항체단편을시험관내생산할수있다. 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]; [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)]. 이러한기술에따라, 항체 V 도메인유전자를섬유상박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의주요또는소수의외피단백질유전자로인프레임클로닝하고, 파지입자의표면상에기능성항체단편으로서디스플레이한다. 섬유상입자는파지게놈의단일가닥 DNA 카피를함유하기때문에, 항체의기능적특성에기초한선별에의해이러한특성을나타내는항체를코딩하는유전자도선별된다. 따라서, 파지는 B 세포의특성중일부를모방한다. 파지디스플레이는예를들어문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Curr. Opin Struct. Biol. 3:564-571 (1993)] 에서고찰된다양한포맷으로수행할수있다. V-유전자절편의여러공급원이파지디스플레이에사용될수있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 은면역화된마우스의비장으로부터유래된 V 유전자의소규모무작위조합라이브러리로부터의항-옥사졸론항체의다양한어레이를단리하였다. 면역화하지않은인간공여자로부터의 V 유전자레퍼토리를구축할수있고, 다양한항원 ( 자기항원포함 ) 어레이에대한항체는본질적으로, 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)] 에기재된기술에따라서단리시킬수있다. 또한미국특허제5,565,332호및동제 5,573,905호를참조한다. 콜 (Cole) 등및보에르너 (Boerner) 등의기술도인간모노클로날항체의제조에이용될수있다 ( 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 [Boerner et al., J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991)]). 유사하게, 인간항체는트랜스제닉동물, 예를들어내인성이뮤노글로불린유전자가부분적으로또는완전히불활성화된마우스에인간이뮤노글로불린로커스를도입하여제조할수있다. 시험접종시에, 인간항체생산이관찰되고, 이것은유전자재배열, 회합및항체레파토리를포함하여모든면에서인간에서관찰되는것과매우유사하다. 이러한접근법은, 예를들어미국특허제5,545,807호 ; 동제5,545,806호, 동제5,569,825호, 동제5,625,126호, 동제5,633,425호, 동제5,661,016호및다음과같은과학간행물 : 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-13 (1994)], [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)], [Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)] 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 에기재되어있다. 마지막으로, 인간항체는또한시험관내에서활성화된 B 세포에의해생성될수있다 ( 미국특허제5,567,610 호및제5,229,275호참조 ). 5) 항체단편특정상황에서는, 전체항체보다항체단편을사용하는것이유리하다. 보다작은단편크기는신속한제거를가능하게, 충실성종양에대한접근성을개선시킬수있다. 항체단편생성을위한다양한기술이개발되었다. 전통적으로, 이들단편은무손상항체의단백질분해적소화를통해유도되었다 ( 예를들어, 문헌 [Morimoto et al., J Biochem Biophys. Method. 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조 ). 그러나, 이러한단편은이제재조합숙주세포에의해직접생성될수있다. Fab, Fv 및 scfv 항체단편은모두가이. 콜라이에서발현되어분비될수있고, 이에의해 - 54 -
다량의이들단편을쉽게생성할수있다. 항체단편은상기논의된항체파지라이브러리로부터단리될수있다. 별법적으로, Fab'-SH 단편은이. 콜라이로부터직접회수되고화학적으로커플링되어 F(ab') 2 단편을형성할수있다 ( 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또다른접근법에따라, F(ab') 2 단편을재조합숙주세포배양물로부터직접적으로단리할수있다. 생체내반감기가증가된 Fab 및 F(ab') 2 는미국특허제5,869,046호에기재되어있다. 다른실시양태에서, 선택된항체는단일쇄 Fv 단편 (scfv) 이다. WO 93/16185; 미국특허제5,571,894호및미국특허제5,587,458호를참조한다. 항체단편은또한예를들어미국특허제5,641,870호에기재된바와같이 " 선형항체 " 일수있다. 이러한선형항체단편은단일특이적또는이중특이적일수있다. [0424] [0425] [0426] [0427] [0428] [0429] [0430] 6) 항체의존성효소-매개전구약물요법 (ADEPT) 본발명의항체는또한전구약물 ( 예를들어펩티딜화학요법제, WO 81/01145 참조 ) 을활성항암약물로전환시키는전구약물-활성화효소에항체를접합시켜서 ADEPT에서사용할수도있다. 예를들어 WO 88/07378 및미국특허제4,975,278호를참조한다. ADEPT에유용한면역접합체의효소성분은전구약물을그의보다활성인세포독성형태로전환시키는방식으로전구약물에작용할수있는임의의효소를포함한다. 본발명의방법에유용한효소는글리코시다제, 글루코스옥시다제, 인간리소자임, 인간글루쿠로니다제, 포스페이트함유전구약물을유리약물로전환시키는데유용한알칼리성포스파타제 ; 술페이트함유전구약물을유리약물로전환시키는데유용한아릴술파타제 ; 비독성 5-플루오로시토신을항암약물인 5-플루오로우라실로전환시키는데유용한시토신데아미나제 ; 펩티드함유전구약물을유리약물로전환시키는데유용한프로테아제, 예를들어세라티아 (serratia) 프로테아제, 테르몰리신, 섭틸리신, 카르복시펩티다제 ( 예를들어, 카르복시펩티다제 G2 및카르복시펩티다제 A) 및카텝신 ( 예를들어, 카텝신 B 및 L); D-아미노산치환체를함유하는전구약물을전환시키는데유용한 D-알라닐카르복시펩티다제 ; 글리코실화된전구약물을유리약물로전환시키는데유용한탄수화물-절단효소, 예를들어 β-갈락토시다제및뉴라미니다제 ; β-락탐으로유도체화된약물을유리약물로전환시키는데유용한 β-락타마제 ; 및아민질소에서각각페녹시아세틸기또는페닐아세틸기로유도체화된약물을유리약물로전환시키는데유용한페니실린아미다제, 예를들어페니실린 V 아미다제또는페니실린 G 아미다제를포함하고, 이로제한되지않는다. 별법적으로, 효소활성을갖는항체 ( 당업계에서 " 아브자임 (abzyme)" 으로도알려짐 ) 가본발명의전구약물을유리활성약물로전환시키기위해사용될수있다 ( 예를들어문헌 [Massey, Nature 328: 457-458 (1987)] 참조 ). 항체-아브자임접합체는종양세포집단에아브자임을전달하기위해본원에기재된바와같이제조될수있다. 상기효소는당업계에잘공지된기술에의해, 예를들어상기논의된이종 2관능성가교결합제를사용하여본원에기재된폴리펩티드또는항체에공유결합될수있다. 별법적으로, 적어도본발명의효소의기능적활성부분에연결된본발명의항체의항원결합영역을적어도포함하는융합단백질은당업계에잘공지된재조합 DNA 기술을이용하여제작할수있다 ( 예를들어, 문헌 [Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)] 참조 ). 7) 이중특이적및다중특이적항체이중특이적항체 (BsAb) 는동일한또는다른단백질상의에피토프를포함하는적어도 2개의상이한에피토프에대한결합특이성을갖는항체이다. 별법적으로, 한아암은표적항원에결합할수있고, 다른아암은세포방어메카니즘을표적항원발현세포에집중시키고국한시키도록백혈구상의촉발분자, 예컨대 T 세포수용체분자 ( 예를들어, CD3), 또는 IgG에대한 Fc 수용체 (FcγR), 예컨대 FcγR1 (CD64), FcγRII (CD32) 및 Fcγ RIII (CD16) 에결합하는아암과조합될수있다. 상기항체는전장항체또는항체단편 ( 예를들어, F(ab') 2 이중특이적항체 ) 으로부터유도될수있다. [0431] [0432] 이중특이적항체는또한세포독성제를표적항원발현세포에편재하도록사용될수있다. 이들항체는목적하는항원에결합하는하나의아암및세포독성제 ( 예를들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카알칼로이드, 리신 (ricin) A 사슬, 메토트렉세이트또는방사성동위원소합텐 ) 에결합하는다른아암을갖는다. 공지의이중특이적항체의예는항-ErbB2/ 항-FcgRIII (WO 96/16673), 항-ErbB2/ 항-FcgRI (U.S.P. 5,837,234), 항-ErbB2/ 항- CD3 (U.S.P. 5,821,337) 을포함한다. 이중특이적항체의제조방법은당업계에공지되어있다. 전장이중특이적항체의전통적인제조는 2개의이뮤 - 55 -
노글로불린중쇄 / 경쇄쌍의동시발현에기초하고, 여기서 2개의사슬은상이한특이성을갖는다. 문헌 [Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)]. 이뮤노글로불린중쇄및경쇄의무작위분류로인해, 이들하이브리도마 ( 콰드로마 (quadroma)) 는 10종의상이한항체분자들의잠재적인혼합물을생성하며, 이중에서오직 1종만이정확한이중특이적구조를갖는다. 통상적으로친화성크로마토그래피단계에의해수행되는상기정확한분자의정제는다소성가시고생성수율이낮다. 유사한절차가 WO93/08829 및문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)] 에개시되어있다. [0433] [0434] [0435] [0436] 상이한접근법에따라, 원하는결합특이성 ( 항체-항원결합부위 ) 을갖는항체가변도메인을이뮤노글로불린불변도메인서열에융합시킨다. 바람직하게는, 융합은힌지의적어도일부, CH2 및 CH3 영역을포함하는이뮤노글로불린중쇄불변도메인에의한다. 경쇄결합에필요한부위를함유하는제1 중쇄불변영역 (CH1) 이융합체의적어도하나에존재하는것이바람직하다. 이뮤노글로불린중쇄융합체및원하는경우이뮤노글로불린경쇄를코딩하는 DNA를별개의발현벡터내로삽입하고, 적합한숙주유기체내로동시형질감염시킨다. 이는구축에사용된 3종의폴리펩티드쇄의불균일한비율이최적의수율을제공하는실시양태에서 3종의폴리펩티드단편의상호비율을조정하는데있어서높은유연성을제공한다. 그러나, 동일한비율의 2종이상의폴리펩티드쇄의발현이고수율을유도하거나상기비율이특별한유의성을갖지않는경우에는하나의발현벡터내에 2종또는 3종모두의폴리펩티드쇄의코딩서열을삽입하는것이가능하다. 이러한접근법의바람직한실시양태에서, 이중특이적항체는한쪽아암에제1 결합특이성을갖는하이브리드이뮤노글로불린중쇄, 및다른쪽아암에하이브리드이뮤노글로불린중쇄-경쇄쌍 ( 제2 결합특이성을제공함 ) 으로이루어진다. 이중특이적분자의반쪽에만이뮤노글로불린경쇄가존재하는것이손쉬운분리방법을제공하므로, 상기비대칭구조는원치않는이뮤노글로불린사슬조합물로부터목적하는이중특이적화합물의분리를용이하게하는것으로밝혀졌다. 이러한접근법은 WO 94/04690에개시되어있다. 이중특이적항체의생성에대한추가의상세한내용에대해서는, 예를들어문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)] 을참조한다. WO 96/27011 또는 U.S.P. 5,731,168에기재된다른방법에따라, 한쌍의항체분자들사이의계면은재조합세포배양물로부터회수되는이종이량체의비율을최대화하도록공학적으로처리될수있다. 바람직한계면은항체불변도메인의 CH3 영역의적어도일부를포함한다. 이러한방법에서, 제1 항체분자의경계면으로부터의 1 개이상의작은아미노산측쇄가보다큰측쇄 ( 예를들어, 티로신또는트립토판 ) 로대체된다. 큰아미노산측쇄를보다작은것 ( 예를들어, 알라닌또는트레오닌 ) 으로교체함으로써큰측쇄 ( 들 ) 에동일하거나유사한크기의보상적 " 캐비티 (cavity)" 가제2 항체분자의계면상에생성된다. 이는다른원치않는최종생성물, 예를들어동종이량체에비해이종이량체의수율을증가시키는메카니즘을제공한다. 항체단편으로부터이중특이적항체를생성하는기술은문헌에기재되어있다. 예를들어, 이중특이적항체는화학적연결을이용하여제조될수있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229: 81 (1985)] 은무손상항체를단백질가수분해로절단하여 F(ab') 2 단편을생성하는절차를기재한다. 이들단편은인접디티올을안정화시키 고분자간디술피드형성을방지하기위해디티올착화제인아비산나트륨의존재하에환원시킨다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로전환시킨다. 이어서 Fab'-TNB 유도체중하나는 Fab'- TNB 유도체로재전환되어이중특이적항체를형성한다. 생성된이중특이적항체는효소의선택적고정화를위한작용제로서사용될수있다. [0437] Fab' 단편은이. 콜라이로부터직접회수하고, 화학적으로커플링시켜이중특이적항체를형성할수있다. 문 헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)] 은완전히인간화된이중특이적항체 F(ab') 2 분자의 생성을기재한다. 각각의 Fab' 단편을이. 콜라이로부터따로분비시키고, 이중특이적항체를형성하도록시험관내유도화학커플링반응을실시하였다. 이로써형성된이중특이적항체는 ErbB2 수용체를과다발현하는세포및정상인간 T 세포에결합할수있을뿐만아니라, 인간유방종양표적에대한인간세포독성림프구의용해활성을촉발할수도있었다. [0438] 2가항체단편을재조합세포배양액으로부터직접제조하고단리하기위한다양한기술이또한설명되었다. 예를들어, 2가이종이량체는류신지퍼를사용하여생산되었다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의류신지퍼펩티드를유전자융합에의해 2개의상이한항체의 Fab' 부분에연결시켰다. 항체동종이량체를힌지영역에서환원시켜단량체를형성한후에재산화시켜서항체이종이량체를형성하였다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)] 에기재된 " 디아바디 " 기술은이중특이적 /2가항체단편제조를위한다른메카니즘을제공하였다. 상 - 56 -
기단편은동일쇄의 2개의도메인사이에쌍을형성하기에는지나치게짧은링커에의해경쇄가변도메인 (V L) 에연결된중쇄가변도메인 (V H ) 을포함한다. 따라서, 1개단편의 V H 및 V L 도메인은또다른단편의상보적 V L 및 V H 도메인과쌍을형성하게되어 2개의항원-결합부위가형성된다. 단일쇄 Fv (sfv) 이량체를사용한이중특이적 /2가항체단편의다른제조전략도보고된바있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 을참조한다. [0439] [0440] [0441] [0442] [0443] [0444] [0445] [0446] 2가초과의항체가고려된다. 예를들어삼중특이적항체를제조할수있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)]. 예시적인이중특이적항체는제시된분자상의 2개의상이한에피토프에결합할수있다. 별법적으로, 항-단백질아암은세포방어메카니즘을특정단백질을발현하는세포에집중시키도록백혈구상의촉발분자, 예를들어 T 세포수용체분자 ( 예를들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7), 또는 IgG에대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16) 에결합하는아암과조합될수있다. 이중특이적항체는또한세포독성제를특정단백질을발현하는세포에편재하도록사용될수있다. 이들항체는단백질결합아암및세포독성제또는방사성핵종킬레이터, 예를들어 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA에결합하는아암을갖는다. 관심있는다른이중특이적항체는관심있는단백질에결합하고, 조직인자 (TF) 에추가로결합한다. 8) 다가항체다가항체는항체가결합하는항원을발현하는세포에의해 2가항체보다신속하게내재화 ( 및 / 또는이화 ) 될수있다. 본발명의항체는 3개이상의항원결합부위가있는다가항체 (IgM 클래스이외의것 ) 일수있고 ( 예를들어 4가항체 ), 이는항체의폴리펩티드사슬을코딩하는핵산의재조합발현에의해쉽게생산될수있다. 다가항체는이량체화도메인및 3개이상의항원결합부위를포함할수있다. 바람직한이량체화도메인은 Fc 영역또는힌지영역을포함한다 ( 또는이것으로이루어진다 ). 이러한시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의아미노말단에 3개이상의항원결합부위를포함할것이다. 본원에서의바람직한다가항체는 3개내지약 8개, 그러나바람직하게는 4개의항원결합부위를포함한다 ( 또는이것으로이루어진다 ). 다가항체는적어도 1개의폴리펩티드쇄 ( 바람직하게는 2개의폴리펩티드쇄 ) 를포함하고, 여기서의상기폴리펩티드쇄 ( 들 ) 는 2개이상의가변도메인을포함한다. 예를들어폴리펩티드쇄 ( 들 ) 는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc ( 여기서, VD1은제1 가변도메인이고, VD2는제2 가변도메인이고, Fc는 Fc 영역의 1개의폴리펩티드쇄이고, X1 및 X2는아미노산또는폴리펩티드를나타내고, n은 0 또는 1임 ) 를포함할수있다. 예를들어폴리펩티드쇄 ( 들 ) 은 VH-CH1-가요성링커-VH-CH1-Fc 영역쇄 ; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역쇄를포함할수있다. 본원에서의다가항체는바람직하게는적어도 2개 ( 바람직하게는 4개 ) 의경쇄가변도메인폴리펩티드를추가로포함한다. 본원에서의다가항체는예를들어약 2개내지약 8개의경쇄가변도메인폴리펩티드를포함할수있다. 본원에서고려되는경쇄가변도메인폴리펩티드는경쇄가변도메인을포함하고, 임의로 CL 도메인을추가로포함한다. 9) 이종접합체항체이종접합체항체도또한본발명의범주에속한다. 이종접합체항체는 2개의공유결합된항체로구성된다. 예를들어, 이종접합체의항체중하나는아비딘에커플링되고, 다른하나는비오틴에커플링될수있다. 그러한항체는, 예를들어면역계세포를원치않는세포에표적화시키기위해 (U.S.P. 4,676,980), 및 HIV 감염의치료를위해제안되었다. WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 0308936. 항체는가교제를사용하는것을포함하는, 합성단백질화학에공지된방법을이용하여시험관내제조될수있는것으로고려된다. 예를들어, 디술피드교환반응을이용하거나티오에테르결합을형성하여면역독소를구축할수있다. 이러한목적에적합한시약의예는이미노티올레이트및메틸-4-메르캅토부티르이미데이트및, 예를들어미국특허제4,676,980호에개시된것을포함한다. 이종접합체항체는임의의편리한가교방법을이용하여제조될수있다. 다수의가교기술과함께적합한가교제가당업계에공지되어있고, 미국특허제4,676,980호에개시되어있다. 10) 이펙터기능조작본발명의항체를예를들어항체의항원-의존성세포매개세포독성 (ADCC) 및 / 또는보체-의존성세포독성 (CDC) 이변형 ( 예를들어, 향상또는제거 ) 되도록 Fc 이펙터기능에대해변형시키는것이바람직할수있다. 바람직한실시양태에서, 항-PD-L1 항체의 Fc 이펙터기능은감소되거나제거된다. 이것은항체의 Fc 영역에 1 개이상의아미노산치환을도입함으로써달성될수있다. 별법적으로또는추가로, 시스테인잔기 ( 들 ) 이 Fc 영역내에도입될수있어서, 상기영역내에사슬간디술피드결합형성이가능하다. 이로써생성된동종이량 - 57 -
체항체는개선된내재화능력및 / 또는증가된보체-매개세포사멸및항체-의존성세포성세포독성 (ADCC) 을가질수있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)] 을참조한다. 항종양활성이증강된동종-이량체성항체는문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)] 에기재된바와같이이종-이관능성가교결합제를사용하여제조할수도있다. 별법적으로, 이중 Fc 영역을갖는항체를조작할수있고, 이에의해항체의보체용해및 ADCC 능력이증진될수있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)] 을참조한다. [0447] [0448] [0449] [0450] [0451] [0452] 항체의혈청반감기를증가시키기위해, 예를들어미국특허제5,739,277호에기재된바와같이샐비지 (salvage) 수용체결합에피토프를항체 ( 특히, 항체단편 ) 에혼입시킬수있다. 본원에서사용된바와같이, 용어 " 샐비지수용체결합에피토프 " 는 IgG 분자의생체내혈청반감기증가를담당하는 IgG 분자 ( 예를들어, IgG 1, IgG 2, IgG 3 또는 IgG 4 ) 의 Fc 영역의에피토프를지칭한다. 11) 다른아미노산서열변형본원에기재된항체의아미노산서열변형 ( 들 ) 이고려된다. 예를들어, 항체의결합친화성및 / 또는다른생물학적특성을개선시키는것이바람직할수있다. 항체의아미노산서열변이체들은적절한뉴클레오티드변화를항체핵산내에도입함으로써, 또는펩티드합성에의해제조된다. 이같은변형에는, 예를들어, 항체의아미노산서열내잔기의결실및 / 또는삽입및 / 또는치환이포함된다. 최종구축물이원하는특징을갖는다면, 결실, 삽입및치환의임의의조합이최종구축물에가해진다. 아미노산변화는또한항체의번역-후과정을변경시킬수있으며, 예컨대글리코실화부위의개수또는위치를변화시킬수있다. 돌연변이유발의바람직한위치인항체의특정잔기또는영역의확인에유용한방법은문헌 [Cunningham and Wells in Science, 244:1081-1085 (1989)] 에기재된바와같은 " 알라닌스캐닝돌연변이유발 " 이다. 여기서, 표적잔기또는잔기의집단이확인되고 ( 예를들어, 하전된잔기, 예를들어 arg, asp, his, lys, 및 glu), 아미노산과항원의상호작용에영향을주기위해중성또는음으로하전된아미노산 ( 가장바람직하게는알라닌또는폴리알라닌 ) 으로치환된다. 이후, 치환에대한기능적감수성을나타내는아미노산위치를치환부위에서또는치환부위에대하여추가적인또는다른변이체를도입함으로써정련시킨다. 따라서, 아미노산서열변이를도입하기위한부위는미리결정되지만, 돌연변이자체의성질은미리결정할필요가없다. 예를들어, 소정의부위에서돌연변이의성능을분석하기위해, ala 스캐닝또는무작위돌연변이유발이표적코돈또는영역에서수행되고, 발현된변이체가원하는활성에대하여스크리닝된다. 아미노산서열삽입은길이가 1개잔기내지 100개이상의잔기를함유하는폴리펩티드까지의범위인아미노- 및 / 또는카르복실-말단융합체및또한단일또는다중아미노산잔기의서열내삽입을포함한다. 말단삽입의예로는 N-말단메티오닐잔기가있는항체또는세포독성폴리펩티드에융합된항체가포함된다. 항체분자의또다른삽입변이체에는항체의혈청반감기를증가시키는폴리펩티드또는효소 ( 예를들어 ADEPT용 ) 가항체의 N- 또는 C-말단에융합된것이포함된다. 또다른유형의변이체는아미노산치환변이체이다. 이러한변이체에서는항체분자내의 1개이상의아미노산잔기가상이한잔기로대체된다. 치환적돌연변이유발에대하여가장관심을갖는부위는초가변영역을포함하지만, FR 변경또한고려된다. 보존적치환은 " 바람직한치환 " 의표제하에표 A에나타낸다. 이같은치환으로생물학적활성이변하게되면, 표 A에서 " 예시적치환 " 으로명명된또는아미노산부류와관련하여하기에추가로기술되는바와같은더욱실질적인변화가도입될수있고, 생성물을스크리닝하게된다. - 58 -
[0453] < 표 A> [0454] [0455] [0456] [0457] [0458] [0459] [0460] [0461] [0462] [0463] [0464] 항체의생물학적특성의실질적인변형은, (a) 치환영역에서폴리펩티드주쇄의구조가예를들어시트또는나선형태로서유지되거나, (b) 표적부위에서분자의전하또는소수성이유지되거나, 또는 (c) 측쇄의크기가유지되는데미치는효과가유의하게상이한치환을선택함으로써수행된다. 자연발생잔기는공통적인측쇄특성에따라하기군으로나뉜다 : (1) 소수성 : 노르류신, met, ala, val, leu, ile; (2) 중성친수성 : cys, ser, thr; (3) 산성 : asp, glu; (4) 염기성 : asn, gln, his, lys, arg; (5) 쇄배향에영향을미치는잔기 : gly, pro, 및 (6) 방향족 : trp, tyr, phe. 비-보존적치환은이들부류중하나의구성원을또다른부류로교환하는것을수반할것이다. 항체의적절한입체형태를유지하는데관여하지않는임의의시스테인잔기가또한분자의산화적안정성을개선시키고비정상적가교결합을방지하기위해일반적으로세린으로치환될수있다. 반대로, 그의안정성을개선시키기위해시스테인결합 ( 들 ) 이항체에첨가될수있다 ( 특히항체가항체단편, 예를들어 Fv 단편인경우 ). 특히바람직한유형의치환변이체는모항체 ( 예를들어인간화또는인간항체 ) 의하나이상의초가변영역잔기를치환하는것을포함한다. 일반적으로, 추가의개발을위해선택된생성되는변이체 ( 들 ) 은이들이생성된모항체에비해개선된생물학적특성을가질것이다. 이러한치환변이체를생성하는편리한방법은파지디스플레이를사용한친화성성숙을수반하였다. 간략하게, 몇몇초가변영역부위 ( 예를들어 6-7개의부위 ) 가각부위에서모든가능한아미노치환을생성하도록돌연변이된다. 이로써생성된항체변이체를섬유상파지입자로부터각입자내에패키지된 M13의유전자 III 생성물에대한융합체로서 1가방식으로디스플레이시 - 59 -
킨다. 이어서, 파지-디스플레이된변이체를본원에개시된바와같이이들의생물학적활성 ( 예를들어, 결합친화성 ) 에대해스크리닝한다. 변형시킬후보초가변영역부위를확인하기위해, 알라닌스캐닝돌연변이유발을수행하여항원결합에유의하게기여하는초가변영역잔기를확인할수있다. 별법적으로또는추가적으로, 항원-항체복합체의결정구조를분석하여항체와그의표적 ( 예를들어, PD-L1, B7.1) 사이의접촉지점을확인하는것이유익할수있다. 이러한접촉잔기및이웃잔기가본원에서상술된기술에따라치환시킬후보이다. 일단이러한변이체가생성되면, 변이체의패널을본원에기재한바와같이스크리닝하고, 하나이상의관련검정에서우수한특성을갖는항체를추가개발을위해선택할수있다. [0465] [0466] [0467] [0468] [0469] [0470] [0471] [0472] 항체의또다른유형의아미노산변이체는, 항체의원래의글리코실화패턴을변경한것이다. 변경이란, 항체에서발견되는하나이상의탄수화물모이어티의결실및 / 또는항체에존재하지않는하나이상의글리코실화부위의첨가를의미한다. 항체의글리코실화는전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결된이란탄수화물모이어티가아스파라긴잔기의측쇄에부착된것을지칭한다. 트리펩티드서열아스파라긴-X-세린및아스파라긴-X-트레오닌 ( 여기서, X 는프롤린을외한임의의아미노산임 ) 이아스파라긴측쇄로탄수화물모이어티를효소적부착시키기위한인식서열이다. 따라서, 폴리펩티드내이들트리펩티드서열중하나의존재는잠재적인글리코실화부위를생성한다. O-연결된글리코실화는히드록시아미노산, 가장일반적으로는세린또는트레오닌으로의당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스또는크실로스중하나의부착을지칭하지만, 5-히드록시프롤린또는 5-히드록시리신이사용될수도있다. 항체에의글리코실화부위의첨가는아미노산서열이상기기재한하나이상의트리펩티드서열을함유하도록변경시키는것에의해편리하게달성된다 (N-연결된글리코실화부위의경우 ). 변경은또한본래항체의서열에하나이상의세린또는트레오닌잔기를첨가하거나또는그것으로치환하여행할수있다 (O-연결된글리코실화부위의경우 ). 본발명의항체에대한아미노산서열변이체를코딩하는핵산분자는당업계에공지된다양한방법에의해제조된다. 이러한방법에는천연공급원으로부터의단리 ( 자연발생아미노산서열변이체의경우 ), 또는앞서제조된변이체또는비-변이체버전의올리고뉴클레오티드- 매개 ( 또는부위-지정 ) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발및카세트돌연변이유발에의한제조가포함되지만, 이들로한정되는것은아니다. 12) 기타항체변형본발명의항체는당업계에공지되고용이하게입수가능한추가적인비단백질성모이어티를함유하도록추가로변형될수있다. 바람직하게는, 항체의유도체화에적절한모이어티는수용성중합체이다. 수용성중합체의비-제한적인예로는폴리에틸렌글리콜 (PEG), 에틸렌글리콜 / 프로필렌글리콜의공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌 / 말레산무수물공중합체, 폴리아미노산 ( 단독중합체또는무작위공중합체 ), 및덱스트란또는폴리 (n-비닐피롤리돈 ) 폴리에틸렌글리콜, 프로프로필렌글리콜단독중합체, 폴리프로필렌옥시드 / 에틸렌옥시드공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올 ( 예를들어글리세롤 ), 폴리비닐알콜및이들의혼합물을들수있으나, 이에제한되지는않는다. 폴리에틸렌글리콜프로피온알데히드는물에서의안정성으로인해제작에서의장점이있을수있다. 중합체는임의의분자량일수있고, 분지형또는비분지형일수있다. 항체에부착된중합체의수는변할수있고, 1개를초과하는중합체가부착될경우, 중합체들은동일하거나상이한분자일수있다. 일반적으로, 유도체화에사용되는중합체의수및 / 또는유형은개선될항체의특정성질또는기능, 항체유도체가한정된조건하에치료법에서사용될것인지여부등이포함되지만이에제한되지않는고려사항을기초로결정될수있다. 상기기술및다른적합한제제는문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Alfonso Gennaro, Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000)] 에개시되어있다. D. 제약제제치료제제는목적하는정도의순도를갖는활성성분을선택적인제약상허용되는담체, 부형제또는안정화제 ( 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wiklins, Pub., Gennaro Ed., Philadelphia, PA 2000]) 와혼합함으로써보관을위해제조한다. 허용되는담체, 부형제또는안정화제는사용된용량및농도에서수용자에게비독성이고, 완충액, 항산화제, 예를들어아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E, 메타중아황산나트륨 ; 보존제, 등장화제, 안정화제, 금속착체 ( 예를들어 Zn-단백질착체 ); 킬레이트화제, 예를들어 EDTA 및 / 또는비-이온성계면활성제를포함한다. - 60 -
[0473] [0474] [0475] [0476] [0477] [0478] [0479] 치료제가항체단편일때, 표적단백질의결합도메인에특이적으로결합하는최소억제단편이바람직하다. 예를들어, 항체의가변영역서열을기초로하여, 표적단백질서열에결합하는능력을보유한항체단편또는심지어펩티드분자를설계할수있다. 그러한펩티드는화학적으로합성할수있고 / 거나재조합 DNA 기술에의해생산할수있다 ( 예를들어문헌 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893] 참조 ). 완충액을이용하여, 특히안정성이 ph 의존적인경우치료유효성을최적화하는범위로 ph를조절한다. 완충액은바람직하게는약 50 mm 내지약 250 mm 범위의농도로존재한다. 본발명에사용하기위한적당한완충액은유기산및무기산모두및그의염을포함한다. 예를들어, 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트가있다. 추가로, 완충액은히스티딘및트리메틸아민염, 예를들어트리스를포함할수있다. 보존제는미생물성장을지연시키기위하여첨가되고, 통상적으로 0.2%-1.0% (w/v) 범위로존재한다. 본발명에사용하기위한적당한보존제는옥타데실디메틸벤질암모늄클로라이드 ; 헥사메토늄클로라이드 ; 벤즈알코늄할라이드 ( 예를들어클로라이드, 브로마이드, 요오다이드 ), 벤제토늄클로라이드 ; 티메로살, 페놀, 부틸또는벤질알콜 ; 알킬파라벤, 예를들어메틸또는프로필파라벤 ; 카테콜 ; 레소르시놀 ; 시클로헥사놀, 3-펜타놀및 m-크레졸을포함한다. 때로 " 안정화제 " 로공지된등장화제는액체조성물의등장성을조정하거나유지하기위해존재한다. 단백질및항체와같은크고대전된생체분자를이용하는경우, 이들은아미노산측쇄의대전된기와상호작용하여분자간및분자내상호작용가능성을줄일수있기때문에종종 " 안정화제 " 로지칭된다. 등장화제는다른성분의상대량을고려하여, 0.1 내지 25 중량 %, 바람직하게는 1 내지 5 중량 % 의양으로존재할수있다. 바람직한등장화제는다가당알콜, 바람직하게는 3가이상의당알콜, 예를들어글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨및만니톨을포함한다. 추가의부형제는다음중하나이상으로작용할수있는작용제를포함한다 : (1) 벌킹제, (2) 용해도향상제, (3) 안정화제및 (4) 변성또는용기벽에대한부착을방지하는작용제. 그러한부형제에는다가당알콜 ( 상기열거한것들 ); 아미노산, 예를들어알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌등 ; 유기당또는당알콜, 예를들어수크로스, 락토스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노스, 소르보스, 크실로스, 리보스, 리비톨, 미오이니시토스, 미오이니시톨, 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 시클리톨 ( 예를들어이노시톨 ), 폴리에틸렌글리콜 ; 황함유환원제, 예를들어우레아, 글루타티온, 티옥트산, 나트륨티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤및나트륨티오술페이트 ; 저분자량단백질, 예컨대인간혈청알부민, 소혈청알부민, 젤라틴또는다른이뮤노글로불린 ; 친수성중합체, 예를들어폴리비닐피롤리돈 ; 모노사카라이드 ( 예를들어, 크실로스, 만노스, 프룩토스, 글루코스 ); 디사카라이드 ( 예를들어, 락토스, 말토스, 수크로스 ); 트리사카라이드, 예를들어라피노스 ; 및폴리사카라이드, 예를들어덱스트린또는덱스트란이포함된다. 비이온성계면활성제또는세제 ( 또한 " 습윤제 " 로공지됨 ) 는치료제의가용화를돕고, 치료단백질을교반에의해유도되는응집에대해보호하기위해존재한다 ( 이는또한활성치료단백질또는항체의변성을유발하지않으면서제제가전단표면스트레스에노출되는것을허용한다 ). 비이온성계면활성제는약 0.05 mg/ml 내지약 1.0 mg/ml, 바람직하게는약 0.07 mg/ml 내지약 0.2 mg/ml의범위로존재한다. 적합한비이온성계면활성제는폴리소르베이트 (20, 40, 60, 65, 80 등 ), 폴리옥사머 (184, 188 등 ), 플루로닉 폴리올, 트리톤, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노에테르 ( 트윈 -20, 트윈 -80 등 ), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌수소화피마자오일 10, 50 및 60, 글리세롤모노스테아레이트, 수크로스지방산에스테르, 메틸셀룰로스및카르복시메틸셀룰로스를포함한다. 사용될수있는음이온성세제는나트륨라우릴술페이트, 디옥틸나트륨술포숙시네이트및디옥틸나트륨술포네이트를포함한다. 양이온성세제는벤즈알코늄클로라이드또는벤제토늄클로라이드를포함한다. [0480] [0481] 제제를생체내투여용으로사용하기위하여서는, 제제는멸균상태이어야한다. 제제는멸균여과막을통한여과에의해멸균될수있다. 본원의치료조성물은일반적으로멸균접근포트를갖는용기, 예를들어피하주사바늘에의해뚫을수있는마개를갖는정맥내용액백또는바이알에둔다. 투여경로는공지되고허용되는방법에따르고, 예를들어단일또는다회볼루스또는장시간에걸친주입으로적당한방식, 예를들어피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병변내또는관절내경로에의한주사또는주입, 국소투여, 흡입에의해서또는지속방출또는연장방출방식이다. - 61 -
[0482] [0483] [0484] [0485] 본원의제제는또한치료할특정적응증에필요한경우에는 1종초과의활성화합물, 바람직하게는서로유해한영향을미치지않는상보적활성을갖는화합물을함유할수있다. 별법적으로또는추가로, 조성물은세포독성제, 시토카인또는성장억제제를포함할수있다. 이러한분자는적합하게는의도된목적에효과적인양으로조합되어존재한다. 또한, 활성성분은예를들어코아세르베이션또는계면중합에의해제조된마이크로캡슐, 예를들어각각히드록시메틸셀룰로스또는젤라틴-마이크로캡슐및폴리-( 메틸메타크릴레이트 ) 마이크로캡슐에, 콜로이드성약물전달시스템 ( 예를들어리포좀, 알부민미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자및나노캡슐 ) 에, 또는마크로에멀젼중에봉입될수있다. 상기기술은상기한문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition] 에개시되어있다. 본원에기술된단백질및항체의안정성은비독성 " 수용성다가금속염 " 의사용을통하여증가될수있다. 예로는 Ca 2+, Mg 2+, Zn 2+, Fe 2+, Fe 3+, Cu 2+, Sn 2+, Sn 4+, Al 2+ 및 Al 3+ 를포함한다. 상기한다가금속양이온과수용성염을형성할수있는음이온의예로는무기산및 / 또는유기산으로부터형성된것을들수있다. 상기수용성염은물 (20 ) 중에서적어도약 20 mg/ml, 별법적으로적어도약 100 mg/ml, 별법적으로적어도약 200 mg/ml의용해도를갖는다. " 수용성다가금속염 " 을형성하는데사용될수있는적당한무기산은염산, 아세트산, 황산, 질산, 티오시안산및인산을포함한다. 사용될수있는적합한유기산은지방족카르복실산및방향족산을포함한다. 이러한정의내의지방족산은포화또는불포화 C 2-9 카르복실산 ( 예를들어지방족모노-, 디- 및트리-카르복실산 ) 으 로정의될수있다. 예를들어, 이러한정의내의예시적인모노카르복실산은포화 C 2-9 모노카르복실산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 카프로산, 에난트산, 카프릴산, 펠라르곤산및카프리온산, 및불포화 C 2-9 모노카르복실산, 아크릴산, 프로프리올산, 메타크릴산, 크로톤산및이소크로톤산을포함한다. 예시적인디카르복실산은포화 C 2-9 디카르복실산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산및피멜산을포함하고, 불포화 C 2-9 디카르복실산은말레산, 푸마르산, 시트라콘산및메사콘산을포함한다. 예시적인트리카르복실산은포화 C 2-9 트리카르복실산, 트리카르발릴산및 1,2,3-부탄트리카르복실산을포함한다. 추가로, 이러한정의의카르복실산은또한 1 또는 2개의히드록실기를포함하여히드록시카르복실산을형성할수있다. 예시적인히드록시카르복실산은글리콜산, 락트산, 글리세르산, 타르트론산, 말산, 타르타르산및시트르산을포함한다. 이러한정의내의방향족산은벤조산및살리실산을포함한다. [0486] [0487] [0488] [0489] [0490] [0491] 본발명의캡슐화된폴리펩티드를안정화시키는것을돕는데사용될수있는흔히채용되는수용성다가금속염으로는, 예를들어 (1) 할라이드 ( 예를들어, 염화아연, 염화칼슘 ), 술페이트, 니트레이트, 포스페이트및티오시아네이트의무기산금속염 ; (2) 지방족카르복실산금속염 ( 예를들어, 칼슘아세테이트, 아연아세테이트, 칼슘프로프리오네이트, 아연글리콜레이트, 칼슘락테이트, 아연락테이트및아연타르트레이트 ); 및 (3) 벤조에이트 ( 예를들어, 아연벤조에이트 ) 과살리실레이트의방향족카르복실산금속염이포함된다. E. 치료방법 : 질환의예방또는치료를위하여, 활성물질의적합한용량은상기정의한바와같은치료되는질병의유형, 질환의심각도및경과, 상기물질이예방또는치료목적으로투여되는지의여부, 선행요법, 환자의임상력및물질에대한반응, 및주치의의판단에의존할수있다. 상기물질은적합하게는환자에게 1회이상의일련의치료로서투여될수있다. 특정실시양태에서, 본발명은특히 PD-1 및 / 또는 B7.1에의결합을방지하는 PD-L1 항체를적용하는것에의해 PD-1을통한신호전달을악화시키는것으로부터야기되는공동자극에관한것일뿐만아니라 T 세포기능이상장애의치유적치료에관한것이다. 1. 감염 PD-1 및그의리간드 ("PD-1:PD-L") 는급성및만성감염을야기하는병원체에대해면역방어를조절하는데중요한역할을한다. PD-1:PD-L 신호전달은효과적인항균성면역방어및면역매개조직손상사이의균형을조절하는데있어서핵심역할을한다. 예를들어, PD-1 넉아웃마우스는그의야생형대응체에비해더신속하게아데노바이러스감염을제거하는반면, 보다심각한간세포손상을발생시킨다. 문헌 [Iwai et al., J. Exp. Med. 198: 39-50 (2003)]. 헤르페스기질각막염마우스모델에서, 항-PD-L1 항체를차단하는것은각막 - 62 -
염, HSV-1 특이적이펙터 CD4 T 세포확장및 IFN-γ 생산및생존의증가를악화시켰다. 문헌 [Jun et al., FEBS Lett. 579: 6259-64 (2005)]. [0492] 만성감염을유발하는미생물은숙주면역반응을회피하는 PD-1:PD-L 신호전달경로를이용하여만성감염을일으킨다. 만성감염을유발하는바이러스는바이러스-특이적 T 세포가비기능적이도록할수있고, 이에의해항바이러스 T 세포반응이침묵하게된다. 문헌 [Barber et al., Nature 439: 682-87 (2006)]; [Wherry et al., J. Virol. 78: 5535-45 (2004)]. T 세포의탈진또는 CD8 + T 세포의무반응은만성감염동안의비효과적인바이러스조절의중요한원인이고, 마우스에서의만성 LCMV 감염, 뿐만아니라인간에서의 HIV, HBV, HCV 및 HTLV 감염및영장류에서의 SIV 감염의특징이다. 탈진된바이러스-특이적 CD8 + T 세포의표현형에서, 먼저세포독성및 IL-2 생산이손실되고이어서이펙터시토카인이생산되는, 계층적이고점진적인기능의손실이있는것으로보인다. [0494] PD-1은활성화시에상향조절되고, 발현은 LCMV 만성감염된마우스에서탈진된 CD8 + T 세포에의해높은수준으로유지된다. 문헌 [Barber et al., 상기문헌 ]. PD-1:PD-L1 결합을차단하는항체의투여는 T 세포반응을향상시키고, 바이러스양을실질적으로감소시킨다. 비효과적인 CD4 + T H 반응을갖는지속적으로감염된마우스 에서, PD-1:PD-L1의차단은 CD8 + T 세포를기능이상상태로부터회복시켜, 증식, 시토카인의분비, 감염된세포의사멸, 및바이러스개수의감소를야기하는데, 이는이것이만성바이러스성감염의치료를위한치유적접근법임을강력하게시사한다. [0495] LCMV에서 PD-1:PD-L의역할의결과로서, 인간에서만성감염을치료하기위해이러한경로를표적화하는것에대한강한관심이나타났다. PD-1 발현은 HIV-특이적 ( 문헌 [Petrovas et al., J. Exp. Med. 203: 2281-92 (2006)]; [Day et al., Nature 443: 350-54 (2006)]; [Traumann et al., Nat. Med. 12: 1198-202 (2006)]), HBV-특이적 ( 문헌 [Boettler et al., J. Virol. 80: 3532-40 (2006)]; [Boni et al., J. Virol. 81: 4215-25 (2007)], 및 HCV-특이적 T 세포 ( 문헌 [Urbani et al., J. Virol. 80: 11398-403 (2006)]) 에서높다. PD-L1은 또한만성 HBV 감염환자의말초혈액 CD14 + 단핵구및골수성 DC ( 문헌 [Chen et al., J. Immunol. 178: 6634-41 (2007)]; [Geng et al., J. Viral Hepat. 13: 725-33 (2006)], 및 HIV 환자의 CD14+ 세포및 T 세포 ( 문헌 [Trabattoni et al., Blood 101: 2514-20 (2003)]) 에서상향조절된다. 시험관내에서 PD-1:PD-L1 상호작용의차단은 HIV-특이적, HBV-특이적, HCV-특이적및 SIV-특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포의탈진을역전시키고, 증식및시토카인생산을회복시킨다. 문헌 [Petrovas et al., J. Exp. Med. 203: 2281-92 (2006)]; [Day et al., 상기문헌 ]; [Trautmann et al., 상기문헌 ]; [Boni et al., 상기문헌 ]; [Urbani et al., 상기문헌 ]; [Velu et al., J. Virol. 81: 5819-28 (2007)]. [0496] PD-1 발현의정도는또한 T 세포탈진의정도및질환중증도를나타내는바이러스 - 특이적 CD8 + T 세포에대한 유용한진단상마커일수있다. HIV-특이적 CD8 + T 세포에서의 PD-1 발현수준은바이러스수, CD4 + 계수감소, 및 CD8 + T 세포가시험관내에서 HIV 항원에반응하여증식하는능력의감소와관련이있다. 생체내관찰도마찬가지로, HIV-특이적 CD4 + T 세포에서의 PD-1 발현및바이러스수사이에직접적인상관관계가존재한다. 문헌 [D'Souza et al., J. Immunol. 179: 1979-87 (2007)]. 장기간비진행자는현저하게상향조절된 PD-1을발현하는전형적인진행자와대조적으로, 기능적 HIV-특이적기억 CD8 + T 세포를가지며 PD-1 발현이현저하게낮고, 이는감소된 CD4+ T 세포개수, 감소된 CD4 + T 세포개수, 감소된 HIV-특이적이펙터기억 CD8 + T 세포기능, 및상승된혈장바이러스수와관련이있다. 문헌 [Zhang et al., Blood 109: 4671-78 (2007)]. [0497] PD-1:PD-L 경로는또한박테리아감염의만성화와관련이있다. 헬리코박터피롤리는만성위염및위십이지장궤양을유발하고, 위암발생의위험인자이다. H. 피롤리감염동안, T 세포반응은감염을제거하는데불충분하여, 감염을지속시킨다. 시험관내또는생체내에서 H. 피롤리에노출된이후, PD-L1은위상피세포에서상향조절된다. 위상피세포는 MHC 클래스 II 분자를발현하고, H. 피롤리감염동안 APC 기능에서중요한역할을하는것으로보인다. PD-1이 PD-L1과상호작용하는것을차단하는항-PD-L1 항체는 H. 피롤리및 CD4 T 세포에노출된위상피세포배양물에서 T 세포증식및 IL-2 생산을향상시킨다. 항체또는 sirna에의한 PD-L1의차단은조절 T 세포의생산을방지하였는데, 이는 H. 피롤리감염동안조절및이펙터 T 세포사이의역학을조 - 63 -
절하는것에의해 PD-L1 이 T 세포억제및감염의지속을촉진할수있음을시사한다. 문헌 [Beswick et al., Infect. Immun. 75: 4334-41 (2007)]. [0498] [0499] [0500] [0501] [0502] 또한, 기생충도면역반응을억제하는대식세포를유도하기위해 PD-1:PD-L1 경로를이용한다. 마우스에서의타에니아크래시셉스 (Taenia crassiceps) ( 즉, 촌충 ) 감염동안, PD-1 및 PD-L2는활성화된대식세포에서상향조절되며, CD4+ T 세포는 PD-1을발현한다. PD-1, PD-L1 또는 PD-L2의차단은촌충감염마우스로부터대식세포에의한시험관내 T 세포증식의억제를상당히감소시킨다. 문헌 [Terrazas et al., Int. J. Parasitol. 35: 1349-58 (2005)]. 마우스에서의쉬스토소마만소니 (Shistosoma mansoni) 감염동안, 대식세포는높은수준의 PD-L1 및보다미진한수준의 PD-L2를발현한다. 항-PD-L1은이들대식세포가시험관내에서 T 세포증식을억제하는능력을제거하는반면, 항-PD-L2는어떤효과도없었다. 감염된마우스로부터의대식세포에서의 PD-L1 발현은감염 12 주후에감소되었는데, 이는 T 세포무반응의중단과관련이있다. 문헌 [Smith et al., J. Immunol. 173: 1240-48 (2004)]. 2. 종양면역종양면역에대한경험적증거에는 (i) 자연완화의관찰, (ii) 검출가능하지만비효과적인종양에대한숙주면역반응의존재, (iii) 면역결핍환자에서의 1차및 2차악성종양의보급증가, (iv) 종양환자에서증가된항체및 T-림프구수준의검출, 및 (v) 시험동물이다양한유형의종양에대해면역화될수있다는관찰이포함된다. 연구들은대부분의인간종양이 T 세포에의해인식될수있는종양관련항원 (TAA) 을발현하고, 이에따라잠재적으로면역반응을유도할수있음을보여준다. 문헌 [Boon et al., Immunol. Today 16:334-336 (1995)]. 암환자를 TAA 또는 TAA로펄스된전문항원제시세포로백신화하여초기상임상시험을개시하였다. 문헌 [Dudley et al., Science 298: 850-854 (2002)]; [Gajewski et al., Clin. Cancer Res. 7: 895s-901s (2001)]; [Marincola et al., Adv. Immunol. 74: 181-273 (2000)]; [Peterson et al., J. Clin. Oncol. 21: 2342-2348 (2003)]. 종양항원특이적 CD8+ T 세포의유도는많은시험에서달성되었다. 문헌 [Mackensen et al., Eur. Cytokine Netw 10: 329-336 (1999)]; [Peterson et al., 상기문헌 ]. 또한, 종양항원특이적 T 세포를환자로입양전달하였고, 확장된세포독성 T 림프구 (CTL) 가종양부위로귀소하는것으로밝혀졌다. 문헌 [Meidenbauer et al., J. Immunol. 170: 2161-2169 (2003)]. 그러나, 면역이펙터세포의종양침투에도불구하고, 종양성장은좀처럼제어되지않았다. 종양미세환경이종양세포를면역파괴로부터보호할수있음이널리확립되어있다. 문헌 [Ganss et al., Cancer Res. 58: 4673-4681 (1998)]; [Singh et al., J. Exp. Med. 175: 139-146 (1992)]. 가용성인자, 뿐만아니라형질전환성장인자 β (TGF-β), 인터류킨 (IL)-10, 프로스타글란딘 E 2, FASL, CTLA-4 리간드, 종양 괴사인자-관련아폽토시스-유도리간드 (TRAIL), 및프로그램화된사멸수용체리간드 1 (PD-L1, 일명 B7- H1) 을비롯한막-결합분자가종양에의해발현되는것으로밝혀졌고, 면역회피를매개하는것으로여겨진다. 이에따라, 종양세포에서이러한음성면역조절신호를차단하는것은생체내에서종양-특이적 CD8+ T 세포면역을향상시키는유망한접근법이다. [0503] [0504] [0505] 많은종양에서의 PD-L1 발현은이러한억제에대한성분이며, 다른면역억제신호와협력하여작용할수있다. PD-L1은 T 세포수용체신호전달을음성적으로조절한다. PD-L1 발현은광범위한충실성종양, 예컨대유방암, 폐암, 결장암, 난소암, 흑색종, 방광암, 간암, 침샘암, 위장암, 신경교종, 갑상선암, 흉선암, 상피암, 두경부암에서계내에서보여진다. 문헌 [Brown et al., J. Immunol. 170: 1257-66 (2003)]; [Dong et al., Nat. Med. 8: 793-800 (2002)]; [Hamanishi et al., PNAS 104: 3360-65 (2007)]; [Strome et al., Cancer Res. 63: 6501-5 (2003)]; [Inman et al., Cancer 109: 1499-505 (2007)]; [Konishi et al., Clin. Cancer Res. 10: 5094-100 (2004)]; [Nakanishi et al., Cancer Immunol. Immunother. 56: 1173-82 (2007)]; [Nomi et al., Clin. Cancer Res. 13: 2151-57 (2004)]; [Thompson et al., PNAS 101: 17174-79 (2004)]; [Wu et al., Acta Histochem. 108: 19-24 (2006)]. 또한, 면역학적염색도다양한암에서의 PD-1:PD-L 발현을보여준다. 흥미롭게도, 암은또한만성염증성질환으로특징지어진다. 문헌 [Coussens et al., Nature 420: 860-867 (2002)]. 전세계적으로최대 15% 의암이직접적임감염성기원을갖는한편 ( 문헌 [Kuper et al., J. Intern. Med. 248: 171-183 (2000)]), 많은인간종양은만성자극및염증과관련이있다. 문헌 [Zou et al., Ntu. Rev. Cancer 5: 263-274 (2005)]. - 64 -
[0506] [0507] [0508] [0509] [0510] [0511] [0512] [0513] [0514] 종양에서의 PD-L1 발현과질환결과의관련성연구는 PD-L1 발현이신장암, 난소암, 방광암, 유방암, 위암및췌장암에서의바람직하지않은예후와강력한연관성이있음 ( 그러나아마도소세포폐암에서는그렇지않음 ) 을보여준다. 문헌 [Hamanishi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 3360-65 (2007)], [Inman et al., Cancer 109: 1499-505 (2007)], [Konishi et al., Clin. Cancer Res. 10:5094-100 (2004)]; [Nakanishi et al., Cancer Immunol. Immunother. 56: 1173-82 (2007)]; [Nomi et al., Clin. Cancer Res. 13: 2151-57 (2007)]; [Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 17174-79 (2004)]; [Wu et al., Acta Histochem. 108: 19-24 (2006)]. 또한, 이러한연구는종양에서의보다높은수준의 PD-L1 발현이종양병기의진행및보다깊은조직구조로의침투를용이하게할수있음을시사한다. PD-1:PD-L 경로는또한혈액악성종양에서소정의역할을할수있다. PD-1 또는 PD-L1은 B 세포악성종양에서는거의발현되지않지만, PD-L2는외투세포악성종양에서과다발현된다. 문헌 [Brown et al., 상기문헌 ]; [Rosenwald et al., J. Exp. Med. 198: 851-62 (2003)]. PD-L1은다발성골수종세포에서발현되지만, 정상형질세포에서는발현되지않는다. 골수종세포에반응한 T 세포확장은 PD-L1 차단에의해시험관내에서향상된다. 문헌 [Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007)]. PD-L1은몇몇주요 T 세포림프종, 특히역형성대세포 T 림프종에서발현되고, PD-L1은회합된여포성수지상세포네트워크에서발현된다. 문헌 [Dorfman et al., Am. J. Surg. Pathol. 30: 802-10 (2006)]. 마이크로어레이분석은호지킨림프종에서종양관련 T 세포가계내에서 PD-1 신호에반응함을추가로시사한다. 문헌 [Chemnitz et al., Blood 110: 3226-33 (2007)]. PD-1 및 PD-L1은 HTLV-1 매개성인 T 세포백혈병및림프종에서 CD4 + T 세포에서발현된다. 문헌 [Shimauchi et al., Int. J. Cancer 121: 2585-90 (2007)]. 이들종양세포는 TCR 신호에대해저반응성이고, PD-1 차단은 TNF-α의발현은증가시키지만, IFN-γ은그렇지않다. 동물모델에서의연구는종양에서의 PD-L1 발현이 T 세포활성화및종양세포의용해를억제하고, 일부경우에서는종양특이적 T 세포사멸을증가시킴을밝혀내었다. 문헌 [Dong et al., Nat. Med. 8: 793-800 (2006)]; [Hirano et al., Cancer Res. 65: 1089-96 (2005)]. 이에따라, 본발명의항-PD-L1 항체로 PD-L1을통한신호전달을억제하여 T 세포기능을향상시키는것은종양면역약화에대한가능성을보여주며, 그결과, 암을효과적으로치료할수있다. F. 조합요법본발명의방법은조합되거나부가된치료단계로서또는치료제제의추가의성분으로서공지의만성감염또는암치료방법과조합될수있다. 1. 암 : 종양을퇴치하기위해숙주의면역기능을향상시키는것은최대관심대상이다. 종래의방법으로는 (i) APC 향상, 예컨대 (a) 종양에외래 MHC 동종항원을코딩하는 DNA를주사하는것, 또는 (b) 생검종양세포를종양의면역항원인식확률을증가시키는유전자 ( 예를들어, 면역자극시토카인, GM-CSF, 공동자극분자 B7.1, B7.2) 로형질감염시키는것, (iii) 입양세포면역요법, 또는활성화된종양특이적 T 세포에의한치료가포함된다. 입양세포면역요법은종양침윤성숙주 T-림프구를단리하는것, 예컨대 IL-2 또는종양또는둘모두에의해자극하는것을통해시험관내에서집단을확장시키는것을포함한다. 추가로, 단리된기능이상 T 세포는또한본발명의항-PD-L1 항체를시험관내적용하는것에의해활성화될수있다. 그렇게활성화된 T 세포를이어서숙주에재투여할수있다. 전통적인암요법에는다음과같은것이포함된다 : (i) 방사선요법 ( 예를들어, 방사선요법, X선요법, 조사 ) 또는암세포를사멸시키고종양을수축시키기위한이온화방사선의사용. 방사선요법은외래빔방사선요법 (EBRT) 을통해외부적으로또는근접요법을통해내부적으로투여될수있다 ; (ii) 화학요법, 또는일반적으로신속하게분열하는세포에영향을미치는세포독성약물의적용 ; (iii) 표적화요법, 또는제어되지않은암세포의단백질에특이적으로영향을미치는작용제 ( 예를들어, 티로신키나제억제제이마티닙, 게피니팁 ; 모노클로날항체, 광역학요법 ); (iv) 면역요법, 또는숙주면역반응의향상 ( 예를들어, 백신 ); (v) 호르몬요법, 또는호르몬의차단 ( 예를들어, 종양이호르몬민감성인경우 ), (vi) 혈관신생억제제, 또는혈관형성및성장의차단, 및 (vii) 완화치료, 또는통증, 메스꺼움, 구토, 설사및출혈을감소시키도록치료의질을개선시키는치료. 통증약제, 예컨대모르핀및옥시코돈, 항-구토제, 예컨대온단세트론및아프레피탄트는보다적극적인치료섭생을가능하게할수있다. 암을치료하는데있에서, 암면역의치료를위한종전에기재된임의의종래의치료법을본발명의항-PD-L1 항 - 65 -
체의투여이전에, 또는그에후속하여, 또는동시에수행할수있다. 또한, 본발명의항 -PD-L1 항체를종래 의암치료법, 예컨대종양결합항체 ( 예를들어, 모노클로날항체, 독소접합된모노클로날항체 ) 의투여및 / 또는화학요법제의투여이전에, 또는그에후속하여, 또는동시에투여할수있다. [0515] [0516] [0517] [0518] [0519] [0520] [0521] [0522] [0523] 2. 감염 : 감염 ( 예를들어, 급성및 / 또는만성 ) 을치료하는데있어서, 본발명의항-PD-L1 항체를투여하는것은감염에대한천연숙주면역방어를자극하는것에더하여또는그를대신하여종래의치료법과조합될수있다. 감염에대한천연숙주면역방어로는염증, 열, 항체-매개숙주방어, T-림프구-매개숙주방어, 예컨대림포킨분비및세포독성 T 세포 ( 특히바이러스감염동안 ), 보체매개용해및옵소닌화 ( 식세포작용을용이하게함 ), 및식세포작용이포함되지만, 이들로한정되는것은아니다. 본발명의항-PD-L1 항체가기능이상 T 세포를재활성화하는능력은만성감염, 특히완전한회복을위해세포매개면역이중요한감염을치료하는데특히유용할것이다. a. 박테리아박테리아감염으로인한감염의경우, 본발명의항-PD-L1 항체는박테리아감염을치료하는표준요법과동시에, 또는그이전, 또는그에후속하여투여하는것과조합될수있다. 오늘날박테리아감염은항박테리아항생제에의해가장흔하게치료되지만, 또한면역화된숙주로부터의병원체-특이적항체를함유하는혈청이효과적일수있다. 독소를분비하는결과병원성인박테리아 ( 독소생성박테리아 ) 의경우, 불활성독소에의한백신화및 / 또는독소의독성을차단하는치료제를투여하는것이통상적으로효과적이다 ( 예를들어, 폴리클로날혈청, 항체, 항생제등 ). 그러한유기체로는, 클로스트리디움종 (Clostridium spp.), 바실러스종, 코리네박테륨종 (Corynebacterium spp.), 비브리오콜레라 (Vibrio chloerae), 보르데텔라페르투시스 (Bordetella pertussis), 스타필로코쿠스종, 스트렙토코쿠스종이포함된다. 또한그러한종래의요법에전형적으로반응하는그람음성박테리아로는엔테로박테리아 ( 예를들어, 에스케리키아, 클레브시엘라, 프로테우스, 예르시니아 (Yersinia), 에르위나 (Erwina)), 살모넬라, 및슈도모나스아에루기노사가포함된다. 식세포작용및옵소닌화에내성이있어서종종면역제거에더상당한시험감염을방지하는캡슐화된박테리아로는스트렙토코쿠스종, 헤모필루스종, 네이세리아종, 클레브시엘라종및박테로이데스프라길리스가포함된다. 박테리아는특정시험감염이후에혈청항체및보체를회피하도록세포에침투하는것에의해숙주방어를회피한다. 이러한감염의제거는거의전적으로 T-림프구매개면역에의존적이고, 특히만성감염화되기쉽다. 구체적인예로는살모넬라 (S. 티피, S. 콜레라수이스 (S. choleraesuis), S. 엔테리티디스 (S. enteritidis)), 레지오넬라종 (Legionella spp.), 리스테리아종 (Listeria spp.), 브루셀라종 (Brucella spp.) 및 M. 튜베르큘로시스 (M. tuberculosis), M. 아비움 (M. avium) 및 M. 레프래 (M. leprae) 를비롯한미코박테리움이포함된다. 트레포네마종 (Treponema spp.), 보렐리아종 (Borrelia spp.) 및렙토스피라종 (Leptospira spp.) 을비롯한스피로헤타는지속적이고잠재적인감염을유발하는박테리아이다. 질환매독의원인이되는병원체인트레포네마팔라듐 (Treponema palladium) 은치료하지않고방치할경우심각한병리학적결과를가져올수있는성병이다. 이질환은특징적단계를통해진행된다. 초기임상단계는매독접종부위에서의궤양또는경성하감이다. 그이후는 2차매독으로알려진상태에서의, 감염및해소주기가반복되는것을포함하여스피로헤타혈증및지속적인미생물전이분포기간이다. 2차매독의해소이후에, 질환은무증상잠재기에진입하며, 이는심각하고종종치명적인상태인 3차매독에이를수있다. 3차매독은 (i) 동맥류가형성된대동맥염및 2차대동맥판폐쇄부전으로서의심장, (ii) 중추신경계 ( 척수매독, 진행마비 ), (iii) 눈 ( 간질성각막염 ) 또는 (iv) 귀 ( 신경난청 ) 를나타낼수있다. 비-성병형은성병형의임상소견과유사하지만, 주로직접접촉및불량한위생에의해전파된다. 그러한것으로매종 (T. 팔리듐 subp. 페르테누에 (T. pallidum subp. pertenue)), 핀타 (T. 카라튬 (T. carateum)) 및베젤 (T. 팔리듐 subsp. 엔데미쿰 ) 이포함된다. 매독의치료법에는페니실린 ( 예를들어, 페니실린 G.), 테트라시클린, 독시시클린, 세프트리악손및아지트로마이신이포함된다. 본발명의항-PD-L1 항체는잠재적감염기를치료하기위해가장유익하게투여될것이다. 보렐리아부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi) 에의해유발되는라임병은진드기에물리는것을통해인간에게전파된다. 이질환은처음에국소적발진으로나타났다가, 불쾌감, 열, 두통, 경부경직및관절통을비롯해서플루-유사증상을나타낸다. 그이후의소견으로는이주성및다관절관절염, 뇌신경마비및신경근병증을수반한신경및심장침범, 심근염및부정맥이포함될수있다. 라임병의일부케이스는지속화되어, 3차 - 66 -
매독과유사한회복불가능한손상을야기한다. [0524] [0525] [0526] [0527] [0528] [0529] [0530] [0531] [0532] [0533] [0534] [0535] 라임병에대한현재요법은항생제를투여하는것을주로포함한다. 항생제-내성균주는히드록시클로로퀸또는메토트렉세이트로치료할수있다. 신경병증성통증이있는항생제난치성환자는가바펜틴으로치료할수있다. 미노시클린은신경학적또는다른염증소견을갖는후기 / 만성라임병에도움이될수있다. 항-PD-L1 항체는잠재적감염기를치료하기위해가장유익하게투여될것이다. 그밖의형태의보렐리아증, 예컨대 B. 레쿠렌티스 (B. recurentis), B. 헤름시 (B. hermsii), B. 튜리카타에 (B. turicatae), B. 파리케리 (B. parikeri), B. 히스파니카 (B. hispanica), B. 듀토니 (B. duttonii) 및 B. 페르시카 (B. persica) 로인한보렐리아증, 뿐만아니라렙토스피라병 ( 예를들어, L. 인테로간스 (L. interrogans)) 은전형적으로혈액역가가간내성폐쇄를유발하는농도에이르지않았다면자연해소된다. b. 바이러스바이러스원인으로인한감염의경우, 본발명의항-PD-L1 항체는바이러스감염을치료하는표준요법과동시에, 또는그이전, 또는그에후속하여적용하는것과조합될수있다. 그러한표준요법은바이러스유형에따라달라지지만, 거의모든경우에서바이러스에특이적인항체 ( 예를들어, IgA, IgG) 를함유하는인간혈청을투여하는것이효과적일수있다. 1) 인플루엔자인플루엔자감염은열, 기침, 근육통, 두통및불쾌감을야기하며, 종종계절유행성으로발생한다. 또한인플루엔자는수많은감염후장애, 예컨대뇌염, 심근심낭염, 굿패스츄어증후군및라이에증후군과관련이있다. 인플루엔자감염은또한정상적인폐의항박테리아방어를억제하여, 인플루엔자로부터회복된환자의박테리아성폐렴발생위험을증가시킨다. 인플루엔자바이러스표면단백질은뚜렷한항원변이를나타내는데, 이는돌연변이및재조합으로인한것이다. 따라서, 세포용해성 T 림프구는감염이후에바이러스제거를위한숙주의중요한비히클이다. 인플루엔자는 3가지주요유형 : A, B 및 C로분류된다. 인플루엔자 A는인간및많은다른동물 ( 예를들어, 돼지, 말, 새및물개 ) 을모두감염시키고, 유행성인플루엔자의주요원인이라는점에서특유하다. 또한, 세포가 2 종의다른인플루엔자 A 균주에의해감염되었을때, 2종의모바이러스유형의분절된 RNA 게놈이복제동안혼합되어하이브리드복제품을만들고, 이는새로운유행성균주의원인이된다. 인플루엔자 B는동물에서복제되지않아유전적으로덜변이되고, 인플루엔자 C는오직단일혈청형만을갖는다. 대부분의종래요법은감염으로인해야기되는증상에대한일시적인처방이었고, 실제로숙주의면역반응이질환을제거하였다. 그러나, 특정균주 ( 예를들어, 인플루엔자 A) 는보다심각한질병및사망을야기할수있다. 인플루엔자 A는바이러스복제를억제하는시클릭아민억제제아다만틴및리만타딘을투여하는것에의해임상적으로및예방적으로모두치료될수있다. 그러나, 이들약물의임상적유용성은상대적으로높은부작용의발생빈도, 이들의좁은항바이러스범위 ( 인플루엔자 A 단독 ), 및내성을만드는바이러스의경향으로인해제한된다. 주요인플루엔자표면단백질, 헤마글루티닌및뉴라미니다아제에혈청 IgG 항체를투여하는것은폐감염을방지할수있고, 점막 IgA는상기도및기관의감염을방지하는데요구된다. 가장효과적인최근의인플루엔자치료법은포르말린또는 β-프로피올락톤에의해불활성화된바이러스를투여하여백신화하는것이다. 2) 홍역바이러스 9-11 일의인큐베이션이후에, 홍역바이러스에의해감염된숙주에서는열, 기침, 코감기및결막염이발생한다. 1-2 일내에, 홍반, 반점구진성발진이발생하며, 이는전신으로신속하게퍼져나간다. 감염은또한세포면역을억제하기때문에, 숙주는중이염, 폐렴및감염후뇌척수염을비롯하여박테리아성중복감염이발생할위험이더커진다. 급성감염은특히영양이부족한청소년에서현저한이환률및사망률과관련이있다. 홍역의치료법에는풀링된인간 IgG를수동적으로투여하는것이포함되며, 이는노출후최대한주가되었어도비-면역대상체에서감염을예방할수있다. 그러나, 살아있는약독화바이러스로사전면역화하는것이가장효과적인치료법이고, 95% 를초과한면역화사례에서질환이예방된다. 이러한바이러스는한가지혈청형이존재하므로, 단일면역화또는감염은전형적으로평생동안후속감염으로부터보호한다. 감염된숙주의적은비율에서, 홍역이중추신경계의지속적인감염으로인한만성진행성신경학적장애인 SSPE로발전될수있다. SSPE는비리온어셈블리및출아가방해된결함을갖는홍역바이러스의클론변이체 - 67 -
에의해유발된다. 이러한환자의경우, 바이러스제거를용이하게하기위해본발명의항 -PD-L1 항체로 T 세 포를재활성화하는것이바람직할것이다. [0536] [0537] [0538] [0539] [0540] 3)B형간염바이러스 B형간염바이러스 (HB-V) 는가장감염성인공지된혈행성병원체이다. 이는급성및만성간염및간암종, 뿐만아니라일생동안의만성감염의주요원인이다. 감염된이후에바이러스는간세포에서복제하고, 이것은또한이어서표면항원 HBsAg을발산한다. 혈청에서과도한수준의 HBsAg를검출하는것은 B형간염감염을진단하는표준방법으로사용된다. 급성감염은해소될수있거나, 또는만성지속적감염으로발전될수있다. 최근의만성 HBV 치료법으로는간세포의표면에서클래스 I 인간백혈구항원 (HLA) 의발현을증가시켜세포독성 T 림프구에의한그의인식을용이하게하는 α-인터페론이포함된다. 추가로, 뉴클레오시드유사체간시클로비르, 팜시클로비르및라미부딘도또한임상시험에서 HBV 감염을치료하는데있어서일부효능을나타내었다. HBV의추가의치료법으로는 PEG화된 α-인터페론, 아데포비르, 엔테카비르및텔바이부딘이포함된다. 항 -HBsAg 혈청항체의모투여를통해수동면역이부여될수있고, 불활성화되거나재조합 HBsAg에의한백신화도또한감염에대한내성을부여한다. 본발명의항-PD-L1 항체는치료상이점을위해 B형간염감염의종래치료법과조합될수있다. 4)C형간염바이러스 C형간염바이러스 (HC-V) 감염은만성형태의간염으로이어져간경변증을야기할수있다. 증상은 B형간염으로인한감염과유사하지만, HB-V와뚜렷하게대조적으로, 감염된숙주는 10-20 년간증상이없을수있다. HC-V 감염의치료법으로는 α-인터페론및리바비린의조합투여가포함된다. HC-V 감염의가능한잠재적인요법은프로테아제억제제텔라프레비르 (VX-960) 이다. 추가의치료법으로는항-PD-1 항체 (MDX-1106, 메다렉스 (Medarex)), 바비툭시맙 (B2-당단백질 I 의존적방식으로음이온인지질포스파티딜세린에결합하는항체, 페레그린파마슈티칼스 (Peregrine Pharmaceuticals)), 항-HPV 바이러스코트단백질 E2 항체 ( 들 ) ( 예를들어, ATL 6865 - Ab68 + Ab65, XTL 파마슈티칼스 ) 및시바시르 ( 폴리클로날항 -HCV 인간면역글로불린 ) 이포함된다. 본발명의항 -PD-L1 항체는치료상이점을위해이러한하나이상의 C 형간염감염치료법과조합될수있다. [0541] C 형간염감염을특이적으로치료하기위해본발명의항 -PD-L1 항체와함께사용될수있는프로테아제, 폴리 머라제및 NS5A 억제제에는이하의표 B 에서확인되는것들이포함된다. - 68 -
[0542] < 표 B> [0543] [0544] [0545] [0546] [0547] [0548] [0549] 5) 인간면역결핍바이러스 (HIV) HIV는 T-림프구, 단핵구-대식세포, 여포성수지상세포및랑게르한스세포를비롯하여 CD4+ 세포를공격하고, CD4+ 헬퍼 / 유도세포를고갈시킨다. 그결과, 숙주는세포매개면역에있어서심각한결함을갖게된다. HIV 에의한감염은적어도 50% 의개체에서 AIDS를야기하며, 성적접촉, 감염된혈액또는혈액제제의투여, 감염된정액에의한인공수정, 혈액함유바늘또는시린지에의노출및분만동안감염된모체로부터신생아로의전파를통해전파된다. HIV에감염된숙주는증상이없을수있거나, 또는단핵구증과유사한급성질병 - 열, 두통, 인후통, 불쾌감및발진으로발전할수있다. 증상은지속적인열, 야간발한, 체중감소, 설명이어려운설사, 습진, 건선, 지루성피부염, 대상포진, 경구칸디다증및구강모백반증을비롯한진행성면역기능장애로진행될수있다. 감염이 AIDS로발전된환자에서다수의기생충에의한기회감염이흔하다. HIV의치료법으로는항바이러스요법, 예컨대뉴클레오시드유사체, 지도부딘 (AST) ( 단독또는디다노신또는잘시타빈과조합된것 ), 디데옥시이노신, 디데옥시시티딘, 라미부딘, 스타부딘 ; 역전사억제제, 예컨대델라비르딘, 네비라핀, 로비리드및프로테이나제억제제, 예컨대사퀴나비르, 리토나비르, 인디나비르및넬피나비르가포함된다. 본발명의항-PD-L1 항체는치료상이점을위해종래의 HIV 감염치료법과조합될수있다. 6) 시토메갈로바이러스시토메갈로바이러스 (CMV) 감염은종종지속적이고, 잠재적이고, 재발하는감염과관련이있다. CMV는단핵구 - 69 -
및과립구-단핵구전구세포를감염시켜그안에잠재해있는다. CMV의임상증상으로는단핵구증-유사증상 ( 즉열, 선의비대, 불쾌감 ) 및항생제에대해알레르기성피부발진으로발전되는경향이포함된다. 바이러스는직접접촉에의해전파된다. 바이러스는소변, 타액, 정액및보다낮은정도로다른체액에존재한다. 전파는또한감염된모체로부터그녀의태아또는신생아에게일어날수있고, 수혈및장기이식에의해일어날수있다. CMV 감염은비특이적미토겐및특이적 CMV 항원에대해손상된배자발생반응, 감소된세포독성능력및 CD4+ 림프구의 CD8 림프구개수의증가를특징으로하는, 일반적인세포면역손상을야기한다. [0550] [0551] [0552] [0553] [0554] [0555] [0556] CMV 감염의치료법으로는항바이러스간시클로비르, 포스카르넷및시도비르가포함되지만, 이들약물은전형적으로면역손상환자에게만처방된다. 본발명의항-PD-L1 항체는치료상이점을위해종래의시토메갈로바이러스감염치료법과조합될수있다. 7) 엡스테인-바르바이러스엡스타인-바르바이러스 (EBV) 는지속적이고잠재적인감염을확립할수있고, 주로 B 세포를공격한다. EBV에의한감염은감염성단핵구증의임상상태를야기하며, 그러한것으로열, 인후증 ( 종종삼출물이포함됨 ), 전신림프절염및비장비대증이포함된다. 또한간염이있을수있으며, 이는황달로발전할수있다. EBV 감염의전형적인치료법은증상의완화이지만, EBV는특정암, 예컨대버킷의림프종및비인두암의발생과관련이있다. 따라서, 이러한합병증결과이전에바이러스감염을제거하는것이더유익할것이다. 본발명의항-PD-L1 항체는치료상이점을위해종래의엡스타인-바르바이러스감염치료법과조합될수있다. 8) 헤르페스바이러스단순포진바이러스 (HSV) 는감염된숙주와의직접접촉에의해전파된다. 직접감염은증상이없을수있지만, 전형적으로감염된입자를함유하는수포를야기한다. 질환은질환의활성기의주기로서나타나고, 바이러스가잠재적으로신경절을감염시키고후속발병함에따라병변이생겼다가사라진다. 병변은얼굴, 생식기, 눈및 / 또는손에생길수있다. 일부경우에서, 감염은또한뇌염의원인이될수있다. 헤르페스감염의치료법은주로증상발생을해소하는것에관한것이고, 전신항바이러스성의약, 예컨대 : 아 시클로비르 ( 예를들어, 조비락스 ), 발라시클로비르, 팜시클로비르, 펜시클로비르및국소약제, 예컨대도코사놀 ( 아브레바 ), 트로만타딘및질락틴이포함된다. 헤르페스의잠재적인감염의제거는임상적이점이클것이다. 본발명의항-PD-L1 항체는치료상이점을위해종래의헤르페스바이러스감염치료법과조합될수있다. [0557] [0558] 9)HTLV 인간 T- 림프구친화성바이러스 (HTLV-1, HTLV-2) 는성적접촉, 모유수유또는오염된혈액에의노출을통해 전파된다. 바이러스는 Th1 세포라불리는 T H 세포의하위세트를활성화하여, 과다증식하고 Th1 관련시토카인 ( 예를들어, IFN-γ 및 TNF-α) 을과다생산한다. 이는결과적으로 Th2 림프구의억제및 Th2 시토카인생산 ( 예를들어, IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13) 의감소를야기하여, 제거를위해 Th2-의존성반응을필요로하는유기체의침입에대해감염된숙주가적절한면역반응을개시하는능력을감소시킨다 ( 예를들어, 기생충감염, 점막성및체액성항체의생산 ). [0559] [0560] [0561] [0562] HTLV 감염은기회감염을유발하여스타필로코쿠스종및스트론길로이데스종 (Strongyloides spp.) 에의한기관지확장증, 피부염및중복감염을야기하고, 다균성패혈증으로인해사망에이르게한다. HTLV 감염은또한성인 T 세포백혈병 / 림프종및 HAM/TSP로알려진점진적탈수성상위운동신경질환을직접적으로유발할수있다. HTLV 잠재적감염을제거하는것은임상적이점이클것이다. 본발명의항-PD-L1 항체는치료상이점을위해종래의 HTLV 감염치료법과조합될수있다. 10)HPV 인간파필로마바이러스 (HPV) 는주로각질세포에영향을미치고, 두가지형태로피부및생식기에서발생한다. 이는직접접촉및 / 또는성활동을통해전파되는것으로여겨진다. 피부및생식기 HPV 감염은둘모두, 사마귀및잠재적인감염및때때로재발하는감염을야기할수있으며, 이는증상을조절하고사마귀의외관을차단하는숙주면역에의해조절되지만, 숙주가타인에게감염을전파할수있는능력은남는다. HPV에의한감염은또한특정암, 예컨대자궁경부암, 항문암, 외음부암, 음경암및구인두암을유발할수 - 70 -
있다. HPV 감염에대한치유법은공지되어있지않지만, 최근의치료법은이미퀴모드를국소적으로적용하는 것으로, 이는침범된영역을공격하도록면역계를자극한다. HPV 잠재적감염을제거하는것은임상적이점이 클것이다. 본발명의항 -PD-L1 항체는치료상이점을위해종래의 HPV 감염치료법과조합될수있다. [0563] [0564] [0565] [0566] [0567] [0568] [0569] [0570] c. 진균진균감염, 또는진균증은 1차적감염으로서또는내인성균무리에의해손상된면역계를가진숙주의기회적콜로니화로서발생할수있다. 진균증에대한면역은주로호중구, 대식세포, 림프구및아마도자연살해 (NK) 세포를포함해서세포성이다. 진균증은전형적으로항체및보체에의한직접사멸에대해영향을받지않는다. 1차감염으로인해야기되는전신침습적진균증에는블라스토미세스증, 콕시디오이데스진균증, 히스토플라스마증, 및파라콕시디오이데스진균증이포함된다. 진균감염으로인한만성감염의경우, 본발명의항 -PD-L1 항체는이러한진균증에대한종래의공지된임의의치료법이전에, 또는그와동시에, 또는그이후에투여될수있다. 블라스토미세스데르마티티스 (Blastomyces dermatitis) 에의해유발되는블라스토미세스증은흡입에의해발생하고, 1차폐감염또는대개피부, 골및남성비뇨생식관을포함한혈행성파종질환을야기한다. 1차노출은증상이없을수있거나, 또는인플루엔자와유사한증후군을야기할수있다. 이러한질환은만성무통성형태로나타날수있다. 이질환은또한 AIDS 환자에서와같이손상된면역과관련이있다. 종래의 B. 데르마티티스감염요법으로는이트라코나졸, 케토코나졸또는암포테리신 B의정맥내주사가포함된다. 콕시디오이데스이미티스 (Coccidioides immitis) 에의해유발되는콕시디오이데스진균증은흡입에의해발생하고, 1차폐감염, 진행성폐질환, 또는대개피부, 피하조직, 골, 관절, 및뇌막을포함한혈행성파종질환을야기할수있다. 1차노출은증상이없을수있거나 (60%) 또는인플루엔자와유사한증후군과관련이있을수있다. 폐렴, 흉막염및폐공동화가발생할수있다. 전이성소견에는피부병변, 예컨대결절, 궤양, 보다깊은부위에서의배농루및사마귀형육아종, 골, 관절, 건초및수막, 예컨대수막염이포함된다. 상기질환은또한 AIDS 환자에서와같이손상된면역과관련이있다. 콕시디오이데스진균증의치료법은케토코나졸, 인트라코나졸및플루코나졸, 특히비수막질환의장기간유지요법을포함한다. 수막형태는통상적으로암포테리신 B의경막내투여에의해치료된다. 히스토플라스마카프술라툼 (Histoplasma capsulatum) 에의해유발되는히스토플라스마증은작은효모가대식세포에존재하는, 흡입에의해발생하는세망내피계질환이다. 이는 1차폐감염, 진행성폐질환또는대개세망내피계, 점막표면및부신을포함한혈행성파종질환을유발할수있다. 잠재적인감염의재활성화는종종손상된면역을갖는환자, 예컨대 AIDS 환자에서발생한다. 1차노출은증상이없을수있거나, 또는폐렴, 흉막염, 폐공동화및종격동림파절증을비롯한플루-유사증후군과관련이있을수있다. 전위부위로는세망내피계 ( 간비종대, 림프절증, 빈혈, 백혈구감소증및혈소판감소증 ), 점막 ( 구비강인두궤양 ), 위장관 ( 흡수불량 ) 및부신부전이포함된다. 대부분의 1차감염이자연적으로해소되지만, AIDS 환자에서와같이손상된면역계와관련된경우계속재발되며, 종종혈행성폐렴, ARDS, 파종성혈관내응고 (DIC), 혈행성분포구진농포및수막염과관련된다. 히스토플라스마증은암포테리신 B ( 특히급성혈행성파종으로인해병든면역손상환자의경우 ), 이트라콘졸및케토코나졸에의해치료된다. 파라콕시디오데스브라실리엔시스 (Paracoccidioides brasiliensis) 에의해유발되는파라콕시디오이데스진균증은 1차폐감염또는대개피부, 점막, 세망내피계및부신을포함한혈행성파종질환을생성할수있는, 흡입에의해발생하는진균증이다. 감염은초기에증상이없을수있지만, 휴면기에이어부활할수있다. 이러한감염의치료법은케토코나졸, 이트라콘졸및술폰아미드를이용한다. 면역손상된숙주에서발생하는기회병원체로인한전신침습적진균증으로는칸디다증, 크립토콕쿠스증, 아스페르길루스증, 모균증및폐포자충증이포함된다. 손상된면역계에서면역반응을강화시키는것에의해, 본발명의항-PD-L1 항체는또한특히종래의요법과조합된경우에이들상태를치료하는데치료상가치를가질수있다. 칸디다증 ( 칸디다알비칸스, C. 트로피칼리스 (C. tropicalis), C. 글라브라타 (C. glabrata) 에의한것 ), 크립토콕쿠스증 ( 크립토코쿠스네오포만스 (Cryptococcus neoformans) 에의한것 ), 아스페르길루스증 ( 아스페르길루스플라부스 (Aspergillus flavus), A. 퍼미가터스 (A. fumigatus), A. 테레우스 (A. tereus) 및 A. 니게르 (A. niger) 에의한것 ) 및모균증 ( 리조푸스아르히주스 (Rhizopus arrhizus), 리조뮤코 (Rhizomuco), 아브시디아 (Absidia), 쿠닝하멜라 (Cunninghamella), 모르티에렐라 (Mortierella), 사케세나에아종 (Saksenaea spp.) 에의 - 71 -
한것 ) 의치료는하나이상의다음과같은이미다졸, 케토코나졸, 인트라코나졸, 플루코나졸, 암포테리신 B ( 플루시토신을함유하거나함유하지않음 ) 로치료할수있다. 최근원생동물에서진균으로재분류된폐포자충증 ( 뉴모시스티스카르니 (penumocystis carnii) 에의한것 ) 은트리메토프림-술파메톡사졸 (TMP-SMZ) 및정맥내펜다미딘이세티오네이트, 뿐만아니라답손, TMP-답손, 트리메트렉세이트, 클린다마이신-프리마퀸및아토바그논으로치료한다. [0571] [0572] [0573] [0574] [0575] [0576] [0577] [0578] [0579] 미포자충류기생충에의해유발되는미포자충증이최근에원생동물로부터진균으로재분류되었다. 이는미토콘드리아대신미토솜을갖는단세포유기체이다. 인간에서질환을유발할수있는유기체로는엔테로시토준비에뉴시 (Enterocytozoon bieneusi), 엔세팔리토준헬렘 (Encephalitozoon hellem), 엔세팔리토준인테스티날리스 (Encephalitozoon intestinalis), 엔세팔리토준쿠니큘리 (Encephalitozoon cuniculi), 플리스토포라속종 (Pleistophora spp.), 트라키플레이스토포라호미니스 (Trachipleistophora hominis), 트라키플레이스토포라안트로포프테라 (Trachipleistophora anthropophthera), 노세마콘노리 (Nosema connori), 노세마오큘라룸 (Nosema ocularum), 브라키올라베시큘라룸 (Brachiola vesicularum), 비타포르마코르니아에 (Vittaforma corneae), 마이크로스포리듐세일로넨시스 (Microsporidium ceylonensis), 마이크로스포리듐아프리카늄 (Microsporidium africanum), 브라키올라알게라에 (Brachiola algerae) 가포함된다. 감염은동물, 오염된물, 또는다른감염된숙주와직접접촉하는것으로부터인간에게전파되는것으로생각된다. 숙주세포를감염시킨후, 포자원형질이성장하여다핵플라스포듐으로분열되거나그것을형성하여, 무성생식및유성생식을둘모두포함한복합적인수명주기를가질수있다. 연속생성에의한자체감염및만성, 소모성질환은종종미포자충감염의특징이된다. 상기질환의임상소견은종및숙주의면역상태에따라다양할수있으며, 결막염 ( 예를들어, V. 코르니아에 ), 만성설사, 흡수불량및소모 ( 예를들어, E. 비에뉴시, E. 인테스티날리스 ) 가포함된다. 안구, 장및파종성소포자균증의치료법으로는알벤다졸의투여가포함된다. 푸마질린의국소적용은미포자충각결막염을치료하는데효과적으로사용될수있다. 그밖의약물로는구충제 ( 예를들어, 알벤다졸 ), 항생제 ( 예를들어, 푸마질린 ), 면역조절제 ( 예를들어, 탈리도미드 ), 항원생동물제 ( 예를들어, 메트로니다졸 ) 가포함된다. d. 원생동물기생충장애로인한질환, 예컨대말라리아, 주혈흡충증및리슈마니아증은개발도상국에서가장보편적이고중요한보건문제중하나이다. 이러한질환은이들이 1) 숙주세포안에서생존하고 ( 예를들어, 리슈마니아증 ), 2) 표면항원을신속하게변화시키고 ( 예를들어, 파동편모충증 ) 및 3) 숙주항원을내보이는것에의해그자신을숙주세포로 " 위장하는 " 것 ( 예를들어, 주혈흡충증 ) 을비롯한다양한방법으로숙주면역을피할수있기때문에특정한도전을제시한다. 장기이식과함께, 암뿐만아니라세계적으로유행하는 AIDS의치료를위해면역억제약물을사용하는것은플라스모듐종 (Plasmodium spp.), 톡소플라즈마종 (Toxoplasma spp.), 리슈마니아종 (Leishmania spp.), 크립토스포리디움종 (Cryptosporidium spp.), 트리파노소마종 (Trypanosoma spp.) 및연충류로인한잠재적이거나무증상인감염을재활성화시킬수있다. 원생동물성기생충에의한감염으로인해야기된만성감염의경우, 본발명의항-PD-L1 항체를표준항-원생동물요법과함께, 또는그이전에또는그에후속하여투여하는것에의해조합할수있다. 속플라스모듐 ( 예를들어, P. 오발레 (P. ovale), P. 말라리아에 (P. malariae), P. 팔시파룸 (P. falciparum), P. 비박스 (P. vivax)) 의기생충에의해유발되는말라리아는암컷얼룩날개모기속모기의소화관에서발생된포자소체로서감염주기를시작한다. 인간에게전파되면, 이들포자소체는염증반응을유도하지않고간세포내에침투하여증식한다. 분열소체라불리는이러한유기체의자손은이어서적혈구세포에침투하고, 전형적으로열및한기를특징으로하는질환의임상학적단계를개시한다. 감염이풍토성인세계의지역에서, 거의모든거주자들은낮은범위에서중간범위의병원성을갖는계속적으로낮은수준의만성감염을보유하며, 증가되는 IgG 항체의수준은분열소체가적혈구로진입하는것으로부터보호한다. 임상질환의치료및예방둘모두를위한최근의이용가능한항-말라리아약물로는아르테메테르-루메판트린 ( 요법, 예를들어, 코아르템 및리아메트 ), 아르테수네이트 - 아모디아킨 ( 요법 ), 아르테수네이트 - 메플로퀸 ( 요 법 ), 아르테수네이트 - 술파독신 / 피리메타민 ( 요법 ), 아토바쿠온 - 프로구아닐 ( 요법및예방, 예를들어, 말라론 ), 퀴닌 ( 요법 ), 클로로퀸 ( 요법및예방 ), 코트리파지드 ( 요법및예방 ), 독시시클린 ( 요법및예방 ), 메플로 - 72 -
퀸, ( 요법및예방, 예를들어, 라리암 ), 프리마퀸 (P. 비박스및 P. 오발레에대한요법만 ; 예방은안됨 ), 프 로구아닐 ( 예방 ), 술파독신 - 피리메타민 ( 요법및예방 ), 히드록시클로로퀸 ( 요법및예방, 예를들어, 플라퀘닐 ) 이포함된다. [0580] [0581] [0582] [0583] [0584] [0585] 무반응성 T 세포를재활성화하는것을통해, 본발명의항-PD-L1 항체는말라리아기생충을제거하는데도움이되는특정치료제일수있다. 속톡소플라즈마기생충에의해유발되는톡소플라스마증은종종증상이없지만, 작은분획이임상질환으로발전할수있고, 그범위는양성급성림프절증에서중추신경계의치명적감염에이를수있다. 감염의공급원으로는날것인또는부분적으로요리된돼지또는양고기내의포낭및감염된고양이의배설물을통과한충란이포함된다. 감염은인간에서통상적으로위장관을통해일어나고, 원생동물은실질적으로모든체내세포에침입하여 ( 타키조이트로서 ) 증식할수있다. 이러한타키조이트는매우천천히성장하는감염체 ( 브라디조이트 ) 로채워진낭포를생성할수있고, 이것은장기간생존한채로남아잠재적인만성감염을야기할수있다. 면역계가손상된숙주, 예컨대면역억제약물을처방받았거나 HIV에걸린숙주는특히톡소플라스마증에걸리기쉽다. 1차톡소플라스마증을치료하는데사용되는약제로는다음과같은것들이포함된다 : 항생제 ( 예를들어, 술파디아진, 클린다마이신, 스피라마이신및미노시클린 ) 를수반할수도, 수반하지않을수도있는피리메타민. 잠재적인톡소플라스마증은클린다마이신을함유할수도, 그렇지않을수도있는항생제아토바쿠온에의해치료될수있다. 속리슈마니아의기생충에의해유발되는리슈마니아증은피부와내장의대식세포를감염시키고, 모래파리를통해인간에게전파된다. 특이적인혈청항체가거의또는전혀존재하지않기때문에, 활성화된 T 세포를통한세포매개면역이감염을제거하는중요한경로인것으로보인다. 열대성궤양으로도알려져있는구세계리슈마니아증은몇몇리슈마니아종에의해유발된다 : L. 트로피카 (L. tropica), L. 메이져 (L. major) 및 L. 아에티오피카 (L. aethiopica). 신세계리슈마니아증은 L. 멕시카나 (L. Mexicana) 및 L. 브라질리엔시스 (L. braziliensis) 의다양한아종에의해유발된다. 이러한기생충들은강력한세포매개면역반응을유도하지만, 임상질환의결과도또한숙주반응을일부야기한다. 숙주가억제되거나부적당한세포매개반응을시작하면, 자연치유를거의바랄수없는미만성만성피부리슈마니아증으로된다 ( 예를들어, L. 아에티오피카, L. 멕시카나 ). 숙주가과잉의세포매개반응을시작하면, 그반응은 1차병변의가장자리에서나타나는비궤양성림프소절이지속되는낭창양또는재발성리슈마니아증이다 ( 예를들어, L. 트로피카 ). 재발성리슈마니아증은초기병변이후 1 내지 10년간나타날수있다. 피부형및내장형의 2 형태의질환이존재하며, 세포매개면역에의해피부병변을나타내는피부형이제거에있어서중요하다. 내장형에서세포매개면역은불충분하거나존재하지않고, 상기질환은임상적으로폴리클로날 B 세포고감마글로불린혈증, 백혈구감소증, 비장비대증및 TNF-α의상승된생산을보인다. 밀테포신 ( 예를들어, 임파비도 ) 및파라미오신은피부및내장리슈마니아증둘모두에대해최근이용가능한치료법이다. 속크립토스포리디아의원생동물로부터의감염에의해유발되는크립토스포리디움증은감염된숙주의대변배설물과인간의직접접촉으로인해야기된다. 장점막조직의감염은설사를유발할수있다. 상기질환은전형적으로급성감염으로나타나지만, 특히면역손상된개체에서는만성화될수있다. 치료는전형적으로임시방 편인것으로특히수화작용이지만, 파로모마이신, 아지트로마이신및혈청 Ig ( 예를들어, 락토빈 -R ) 가성공적 으로감염을제거하였다. [0586] [0587] [0588] 기생충트리파노소마 ( 예를들어, T. 부루세이, subsp. 감비엔스, 로데지엔스 ) 에의해유발되는트리파노소마증은체체파리가무는것을통해인간및소를감염시킨다. 이러한병원체가제시하는도전은다양한표면항원을나타내는집단의연속생성으로인한것이다. 감염은비특이적이고비보호적인혈청이뮤노글로불린의상승된수준을특징으로한다. 트리파노소마증의치료법으로는다음과같은펜다미딘 (T.b. 감비엔스용 ), 정맥내수라민 (T.b. 로데시엔스용 ), 에플로르니틴, 멜라르소프롤 ( 니푸르티목스와함께할수도, 함께하지않을수도있음 ) 의정맥내투여를포함한다. 흡충류 ( 예를들어, 스키토소마종 (Schistomsoma spp.), 촌충류및선충류로인한연충감염은 T 세포의존적 - 73 -
반응인호산구증가증및감작항체의공통면역반응을공유한다. [0589] [0590] [0591] [0592] [0593] [0594] [0595] [0596] 스키스토소마만소니 (Shistosoma mansoni), S. 자포니쿰 (S. japonicum), S. 해마토비움 (S. haematobium) 및 S. 메콩기 (S. mekongi) 에의해유발되는주혈흡충증 ( 일명주혈흡충병 ) 은그수명주기를물속알로서시작했다가미라시디아로부화되고, 이것이달팽이를통과하여포자낭을다중생성한다. 이어서, 이는두갈래꼬리의세르카리아를생성하며, 스키스토소뮬라로서인간숙주의혈류를감염시킬수있고, 이는처음에폐로이동했다가간으로이동한다. 이들흡충은종내에는쌍을형성하고, 짝짓기를하고, 장간막세정맥에알을낳는다. 이러한많은알들이장을경유하여배설되는동안, 일부는점막하층, 간의문세정맥, 및그밖의신체장기에포획된다. 포획된알과관련된육아종성염증은만성주혈흡충증의결정적인증상이다. 주혈흡충증의치료법으로는프라지콴텔, 안티몬, 옥삼니퀸 (S. 만소니 ) 및미라지드 의투여가포함된다. 촌충류감염은 2개의군으로분류될수있고, 그하나는장거주성충, 예컨대광절열두조충및무구조충으로, 제한된비-체액성면역효과를갖는다. 두번째그룹은이동성조직포낭형애벌레촌충, 예컨대왜소조충, 단방조충및유구조충으로, 이들은강력한비경구숙주반응및보호적혈청항체를유도한다. 인간에서가장심각한촌충류감염은포충증으로, 이것이간, 폐, 뇌, 신장또는다른신체일부에이식될경우, 포충낭을형성할수있다. 포충증의치료법으로는메트로니다졸, 알벤다졸의투여및수술적개입, 예컨대제거, 흡인, 조대술또는그물막고정술이포함된다. 선충류는인간을감염시키는가장흔하고널리분포된연충으로, 선모충증, 회충증, 사상충증및분선충증과같은장애를유발한다. 선모충에의해유발되는선모충증은날고기또는부분적으로요리된고기, 예컨대돼지에서 T. 스피랄리스 (T. spiralis) 의애벌레를섭취하는것으로인해야기될수있다. 인간에서, 감염은상승된 IgM 생산에이어 IgG를생산하게한후, 이어서 T 림프구에의해항체-손상된유충이신속하게배출되게하는강력한체액반응을유도한다. 장내에서성충을사멸시키는것으로공지된유일한치료법은티아벤다졸이고, 애벌레를사멸시키는치료법은공지되어있지않다. 회충으로도알려져있는아스카리스 ( 아스카리스룸브리코이데스 (Ascaris lumbricoides)) 는배설물에의해오염된물질의섭취로인해생기는인간에서흔한기생충이다. 환자가매우오랜기간동안증상이없는채로있을수있지만, 유생단계가신체를통과함에따라이는내장손상, 복막염및염증, 간또는비장의비대, 독성및폐렴을유발할수있다. 회충증의치료법으로는메벤다졸 ( 예를들어, 벌목스 ), 피페라진, 피란텔파모에이트 ( 예를들어, 안티민스, 핀 - 리드, 핀 -X ), 알벤다졸, 티아벤다졸 ( 피페라진과함께또는따로 ), 헥실레소르시놀, 산토닌및케노포디움 오일을투여하는것이포함된다. 본발명의항 -PD-L1 항체는회충증을치료하기위한상기요법을투여하는것 과함께, 또는그이전에또는그에후속하여투여될수있다. [0597] [0598] [0599] 사상충속선충에의해유발되는사상충증은곤충벡터에의해인간에도입된다. 온코세리아시스또는하천실명증을유발하는회선사상충은먹파리에물려전파된다. 감염성애벌레는피하에그자신을숨기고성체로발생하여섬유조직발생숙주반응을유도하며, 다량의미세사상충을발산시켜이것이피하및눈을통해확산되면추가로각막염또는망막염이유도되고이어서각막이뿌옇게된다. 림프사상충증은브루기아종 (Brugia spp.) 및우케레리아종 (Wuchereria spp.) 에의한감염으로인해야기된다. 시간이지나면서, 림프조직특히서혜부에서의상흔은유출을막아기형상태의코끼리피부병을야기할수있다. 사상충증의주요치료법은항생제이버멕틴, 알벤다졸및디에틸카르바마진시트레이트 (DEC, 헤트라잔 ) ( 이버멕틴또는알벤다졸과함께또는따로 ) 를투여하는것이다. 그밖의치료전망에는공생박테리아, 월바키아를사멸시키는독시시클린이포함된다. 속스트론길로이데스 ( 예를들어, S. 스테르코랄리스 (S. stercoralis), S. 풀레보르니 (S. fuelleborni)) 의기생충에의해유발되는분선충증은배설물에의해오염된토양을통해인간에게전파되는질환이다. 이는자유생활주기 ( 간상유충이성충으로성숙됨 ) 뿐만아니라기생주기 ( 사상유충이성충으로성장함 ) 둘모두로존재할수있고, 이는피부에침투하여폐에이어인두를거친후궁극적으로장내에서거주한다. 스트론길로이데스에의해또한자기감염이발생되는것으로알려져있고, 이는본질적으로사상유충의연속생성으로인한반 - 74 -
복감염이다. [0600] [0601] [0602] [0603] [0604] [0605] [0606] [0607] [0608] [0609] [0610] [0611] 감염은증상이없을수있거나, 또는위장관에서의통증및설사, 폐에서의뢰플러증후군 ( 즉호산구증가증 ) 및두드러기를특징으로할수있다. 혈액호산구증가증이또한있을수있다. 스트론길로이데스의지속적인감염이소화성궤양, 담낭질환및크론병을모방할수있어오진이흔하다. 이는특히면역손상숙주에서문제가된다. 분선충증에대한공지의치료법은이버멕틴, 알벤다졸또는티아벤다졸이지만, 이러한약제는단지성충만사멸시키기때문에, 반복적인투여가필요하다. e. 백신화질환에대한면역을유도하기위한백신화또는항원성물질의투여는병원체에의한감염효과를예방하거나개선시키기위해일상적으로사용된다. 숙주면역을향상시키는것은감염성병원체에서뿐만아니라질환화되기시작한 ( 예를들어암성 ) 숙주조직에서발견된바람직하지않은항원에대해사용될수있다. 전통적으로백신은약화되거나사멸된전체병원체로부터유래되지만, 또한인간클래스 I 또는클래스 II 주요조직적합성복합체 (MHC) 분자에의해특이적으로인식되는무손상병원체상의에피토프를대표하는펩티드일수있다. 특정관심펩티드항원은 T 세포에의해특이적으로인식되는것이다. 최근, 요법상백신화를탈진된 CD8+ T 세포에 PD-L1 차단제를투여하는것과함께조합하는것이만성감염마우스모델에서기능및바이러스제어를향상시키는것으로밝혀졌다. 문헌 [Ha et al., J.Exp.Med. 205(3): 543-555 (2008)]. 그결과, 본원에서기재하는항-PD-L1 항체는또한항원백신과조합되어 ( 예를들어, 이전, 동시또는이후투여 ), 바이러스, 박테리아, 진균또는원생동물침입뿐만아니라종양면역으로인한감염 ( 예를들어, 급성및만성 ) 을치료할수있다. G. 제약학적투여량 : 본발명의제약조성물의투여량및목적하는약물농도는고려되는특정용도에따라다를수있다. 적합한투여량및투여경로의결정은당업자의기술범위내에있다. 동물실험은인간치료법에대한효과적인용량의결정을위한신뢰할수있는지침을제공한다. 유효량에대한종간스케일링은문헌 [Mordenti, J. and Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics." In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp.42-46] 에제시된원칙에따라수행될수있다. 본원에기술된폴리펩티드또는항체의생체내투여가이용되는경우, 정상투여량은투여경로에따라서하루에포유동물체중을기준으로약 10 ng/kg 내지약 100 mg/kg 또는그이상, 바람직하게는약 1 mg/kg/ 일내지 10 mg/kg/ 일로다양할수있다. 특정투여량및전달방법에관한지침은문헌에제공되어있고 ; 예를들어, 미국특허제4,657,760호 ; 동제5,206,344호 ; 또는동제5,225,212호를참조한다. 상이한제제가상이한치료법및상이한장애에효과적일수있으며, 특정장기또는조직을치료하기위한투여가다른장기또는조직에대한것과상이한양식으로의전달을필요로할수있다는것은본발명의범위내에있다. 나아가, 투여량은 1회이상의별개투여에의해서, 또는연속주입에의해투여될수있다. 수일또는그보다오랜기간에걸친반복투여의경우, 상태에따라서치료는질환증상이목적하는수준으로저해될때까지지속된다. 그러나, 다른투약법이유용할수있다. 이러한요법의진행은통상의기술및검정에의해쉽게모니터링된다. H. 제제의투여재구성된제제및액체제제를포함하나이로제한되지않는본발명의항-PD-L1 항체에의한치료를필요로하는포유동물, 바람직하게는인간에게, 공지된방법에따라서, 예를들어볼러스와같은정맥내투여, 또는일정기간에걸친연속주입에의해서, 근육내, 복강내, 뇌척수액내, 피하, 관절내, 활액막내, 경막내, 경구, 국소또는흡입경로에의해서투여된다. 바람직한실시양태에서, 상기제제는포유동물에게피하 ( 즉, 피부아래 ) 투여에의해투여된다. 상기목적을위하여, 제제는시린지를이용하여주사될수있다. 그러나, 주사장치 ( 예를들어, INJECT-EASE 및 GENJECT 장치 ); 주사기펜 ( 예를들어, GENPEN ); 자동-주사기장치, 무바늘장치 ( 예를들어, MEDIJECTOR 및 BIOJECTOR ) 및피하패치전달시스템과같은상기제제의투여를위한다른장치를이용할수있다. 특정실시양태에서, 본발명은단일용량투여단위용키트에관한것이다. 이러한키트는단일또는복수챔버의예비충전된시린지를비롯한, 치료단백질또는항체의수성제제의용기를포함한다. 예시적인예비충 - 75 -
전된시린지는베터게엠베하 (Vetter GmbH, 독일라벤스버그소재 ) 로부터입수가능하다. [0612] [0613] [0614] [0615] [0616] [0617] [0618] [0619] [0620] [0621] [0622] 단백질의적절한투여량 (" 치료유효량 ") 은예를들어치료할상태, 상태의중증도및경과, 단백질이치료또는예방목적으로투여되는지의여부, 선행요법, 환자의임상병력및항-PD-L1 항체에대한반응, 사용되는제제의포맷, 및주치의의판단에의존할것이다. 항-PD-L1 항체는적합하게는환자에게 1회또는일련의치료에걸쳐서투여되고, 환자에게진단이후임의의시점에투여될수있다. 항-PD-L1 항체는단독치료로서, 또는문제되는상태의치료에유용한다른약물또는요법과함께투여될수있다. 항-PD-L1 항체의경우, 초기후보투여량은환자에게투여될경우약 0.1-20 mg/kg 범위일수있고, 이는 1 이상의개별투여형을취할수있다. 그러나, 다른투약법도유용할수있다. 그러한요법의진행상황은종래의기술을이용하여쉽게모니터링된다. I. 제조품본발명의다른실시양태에서, 상기제제를함유하는제조품이제공되는데, 이는그의사용설명서를바람직하게제공한다. 제조품은용기를포함한다. 적합한용기는예를들어병, 바이알 ( 예를들어, 이중챔버바이알 ), 시린지 ( 예를들어, 단일또는이중챔버시린지 ) 및시험관을포함한다. 상기용기는유리또는플라스틱과같은다양한물질로형성될수있다. 용기는제제를보유한다. 용기상의또는용기에부속된라벨은재구성및 / 또는사용을위한지침을나타낼수있다. 라벨은추가로제제가피하투여및 / 또는 T 세포기능이상장애의치료에유용하거나피하투여및 / 또는 T 세포기능이상장애의치료를의도함을나타낼수있다. 제제를보유하는용기는재구성제제의반복투여 ( 예를들어, 2-6회투여 ) 를가능하게하는다회사용바이알일수있다. 제조품은추가로적합한희석물 ( 예를들어, BWFI) 을포함하는제2 용기를포함할수있다. 희석물및동결건조제제를혼합할때, 재구성된제제중최종단백질농도는일반적으로적어도 50 mg/ml일것이다. 제조품은상업적및사용자입장에서바람직한다른물질, 예를들어다른완충액, 희석제, 필터, 바늘, 시린지및사용을위한지침이적힌포장삽입물을추가로포함할수있다. 하기실시예를참조하여보다충분하게본발명을이해할수있을것이다. 그러나, 하기실시예는본발명의범위를제한하는것으로해석되어서는안된다. 본명세서전체에서모든인용문은본원에명백하게참고로포함된다. 다른실시양태에서, 본발명은자동-주사기장치로투여하기위한본원에기재된제제를포함하는제조품을제공한다. 자동-주사기는활성화시에환자또는투여자로부터추가로필요한작용없이그의내용물을전달할수있는주사장치로설명될수있다. 이들은특히, 전달속도가일정하여야하고전달시간이수분보다긴경우치료제제의자동-투약에적합하다. 실시예 1 파지라이브러리에서의항-PD-L1 항체의확인항-PD-L1 항체를확인하기위한라이브러리분류및스크리닝인간 (R&D 시스템즈 (R&D Systems), cat# 156-B7) 및뮤린 (R&D 시스템즈, cat# 1019-B7) PD-L1-Fc 융합체를교대라이브러리분류를위한항원으로서사용하였다. 구체적으로, 파지라이브러리를먼저인간항원에대해, 이어서뮤린, 인간, 및뮤린항원에대해후속 3 라운드로분류하였다. 눈크 96 웰맥시소르프 (Maxisorp) 면역플레이트를표적항원 (10 μg /ml) 으로밤새 4 에서코팅하고, 파지차단완충액 PBST ( 포스페이트완충염수 (PBS) 및 1% (w/v) 소혈청알부민 (BSA) 및 0.05% (v/v) 트윈-20) 으로 1 시간동안실온에서차단하였다. 항체파지라이브러리 VH ( 예를들어, 문헌 [Lee et al., J. Immunol. Meth. 284:119-132, 2004] 참조 ) 및 VH/VL ( 문헌 [Liang et al., J. Mol. Biol. 366: 815-829, 2007] 참조 ) 을항원플레이트에개별적으로첨가하고, 밤새실온에서인큐베이션하였다. 다음날, 항원코팅된플레이트를 PBT (0.05% 트윈-20을함유하는 PBS) 로 10회세척하고, 결합된파지를 50 mm HCl 및 500 mm NaCl로 30 분동안용출시키고, 동부피의 1 M 트리스염기 (ph 7.5) 로중화시켰다. 회수된파지를이. 콜라이 XL-1 블루세포중에서증폭시켰다. 후속선별라운드동안, 항원코팅된플레이트와항체파지의인큐베이션은 2 내지 3시간으로줄이고, 플레이트세척의엄격도는점차증가시켰다. 4 라운드의패닝이후에, 현저하게풍부해진것이관찰되었다. VH 및 VH/VL 라이브러리분류로부터각각 96 클론을골라내어이들이인간및뮤린 PD-L1-Fc 둘모두에특이적으로결합하는지여부를측정하였다. 이들클론의가변영역을 PCR 서열분석하여특유한서열클론을확인하였다. - 76 -
[0623] 개별클론의 V L 및 V H 영역을 LPG3 및 LPG4 벡터 ( 문헌 [Lee et al., 상기문헌 ]) 에각각클로닝하고, 포유동물 CHO 세포에서일시적으로발현시키고, 단백질 A 칼럼에의해정제하여, 관심모클론을 IgG로재포맷시켰다. 13 파지항체가가용성 PD-1-Fc 융합단백질및 293 세포에서발현된인간또는마우스 PD-L1 사이의상호작용을차단하는능력을평가하였다 (IC 50 값을표 1 - 상반부에표기함 ). PD-1에대한인간 PD-L1 결합을차단하는데 IC 50 이가장낮은항체인 YW243.55를후속친화성성숙을위해선별하여인간및마우스 PD-L1 둘모두에대한그의친화성을개선시켰다. ( 표 1). 영장류및뮤린종둘모두에대해비슷한교차반응성을갖는 ( 뿐만아니라인간에대한친화성을보유하는 ) 항체는향상된치료상가치를제공할것이고, 실험모델에서그특징이잘규명된동일한항체가인간임상시험에사용될수있다. 이로서모델특이적대용물을사용하는것으로인한불확실성을회피한다. [0624] [0625] V H 라이브러리유래의클론의친화성개선을위한라이브러리의구축파지미드 pw0703 ( 파지미드 pv0350-2b ( 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol 340: 1073-1093 (2004)]) 에서유래되었고, 모든 CDR-L3 위치에정지코돈 (TAA) 을함유하고, M13 박테리오파지의표면상에 1가 Fab를나타냄 ) 은, 친화성성숙을위해 V H 라이브러리로부터의관심클론의중쇄가변도메인 (V H ) 을이식하기위한라이브러리주형 으로작용하였다. 친화성성숙을위해완전 (hard) 및부분 (soft) 무작위화전략을둘모두이용하였다. 완전무작위화의경우, 천연인간항체를모방하도록설계된아미노산을이용하여 3개의경쇄 CDR의선택된위치를갖는 1개의경쇄라이브러리를무작위화하였으며, 설계된 DNA 퇴보는문헌 [Lee et al., (J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004)] 에기재된바와같다. 부분무작위화의경우, CDR-L3의위치 91-94 및 96, CDR-H1의위치 28-31 및 34-35, CDR-H2의위치 50, 52 및 53-58, CDR-H3의위치 95-99 및 100A의잔기를표적화하고 ; CDR 루프, L3/H1/H2 및 L3/H3의 2개의상이한조합을무작위화를위해선택하였다. 부분무작위화조건을달성하기위해 ( 선택된위치에서약 50% 의돌연변이율도입 ), 돌연변이유발 DNA를야생형뉴클레오티드에유리한염기의 70-10-10-10 혼합물로합성하였다 ( 문헌 [Gallop et al., Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994)]). [0626] [0627] 친화성을개선하기위한파지분류종전에확인된파지클론을첫번째라운드에서플레이트분류하고, 이어서 5회또는 6회라운드로용액분류하였다. 라이브러리를개별적으로인간및뮤린 PD-L1-Fc에대해분류하였다 (R&D 시스템즈, 각각 cat. # 156- B7, cat # 1019-B7). 인간 PD-L1-Fc 표적의경우, 제1 라운드플레이트분류에서, 3개의라이브러리를 1% BSA 및 0.05% 트윈 20 중의약 3 O.D./ml의파지주입을이용하여실온에서 2 시간동안표적코팅된플레이트 ( 눈크맥시소르프 플레이트 ) 에대해개별분류하였다. 제1 라운드의플레이트분류후에, 용액분류를수행하여선별의엄격도를증가시켰다. 용액분류의경우, 제1 라운드의플레이트분류로부터증식된 1 O.D./mL 파지를 1% 수퍼블럭 (Superblock) ( 피어스바이오테크놀로지 (Pierce Biotechnology)) 및 0.05% 트윈-20을함유하는완충액 100 μl중 20 nm 비오티닐화된표적단백질 ( 농도는모클론파지 IC 50 값을기초로함 ) 과함께 30분동안실온에서인큐베이션하였다. 상기혼합물을 1% 수퍼블럭으로 10배추가희석하고, 웰당 100 μl를뉴트라비딘-코팅된웰 (5 μg /ml) 에 15분동안실온에서적용하며부드럽게진탕시켜서, 비오티닐화된표적과파지가결합하도록하였다. 웰을 PBS-0.05% 트윈-20으로 10회세척하였다. 배경결합을측정하기위해, 비오티닐화되지않은표적과함께파지를함유하는대조군웰을뉴트라비딘-코팅된플레이트상에포획시켰다. 결합된파지를 0.1 N HCl에의해 20 분동안용출시키고, 1/10 부피의 1 M 트리스 (ph 11) 로중화시키고, 적정하고, 다음라운드를위해전달하였다. 다음으로, 선별엄격도를증가시키는두가지방법과함께, 용액분류를 5 라운드더수행하였다. 첫번째방법은비오티닐화된표적단백질농도를 4 nm에서 0.5 nm으로감소시키는것에의한온-레이트선별에대한것이고, 두번째방법은과량의비-비오티닐화된표적단백질 (100 내지 2000 배더 ) 을첨가하여실온또는 37 에서더약한결합자를경쟁에서탈락시키는것에의한오프-레이트선별에대한것이다. 또한, 파지주입을감소시켜 (0.1 내지 0.5 O.D/ml) 배경파지결합을낮췄다. 뮤린 PD-L1-Fc 표적의경우, 파지분류방법은인간 PD-L1 Fc 항원에대해상기에서기재한것과유사하며약간변형된다. 구체적으로, 제1 라운드의플레이트패닝직후에용액패닝을위해 100 nm 비오티닐화된뮤린 PD-L1-Fc를사용하였다. 제4 후속라운드의용액패닝에서, 비오티닐화된표적을 10 nm에서 1 nm로감소시키고, 200-500배과량의비-비오티닐화된표적을실온에서첨가하였다. [0628] 이어서, 이하의실시예에서기재하는고처리량친화성스크리닝 ELISA 절차에의해친화성성숙된클론을추가 - 77 -
로스크리닝하였다. [0629] [0630] [0631] 고처리량친화성스크리닝 ELISA ( 단일스팟경쟁 ) 인간및뮤린 PD-L1 표적각각에대한 7번째및 6번째라운드스크린으로부터콜로니를가려내었다. 콜로니를 96-웰플레이트 ( 팔콘 (Falcon)) 에서 50 μg /ml 카르베니실린및 1E10/ml KO7을함유하는 2YT 배지의웰당 150 μl로 37 에서밤새성장시켰다. 동일한플레이트로부터, XL-1 감염된모파지의콜로니를대조군으로서골라내었다. 96-웰눈크맥시소르프 플레이트를 PBS 중의웰당 100 μl의인간및뮤린 PD-L1-Fc 단백질 (2 μg /ml) 로 4 에서밤새또는실온에서 2 시간동안개별코팅하였다. 플레이트를 65 μl의 1% BSA로 30 분동안, 그리고 40 μl의 1% 트윈 20으로추가 30 분동안차단시켰다. 파지상청액을 10 nm 표적단백질을함유하거나함유하지않는 ELISA ( 효소연결면역흡착검정 ) 완충액 (0.5% BSA, 0.05% 트윈-20 함유 PBS) 중에서 100 μl의총부피로 1:10으로희석하고, F 플레이트 ( 눈크 ) 에서실온에서적어도 1 시간동안인큐베이션하였다. 표적단백질을함유하거나함유하지않는 75 μl의혼합물을나란히표적단백질코팅된플레이트로옮겼다. 플레이트를 15 분동안부드럽게진탕시켜미결합파지가표적단백질코팅된플레이트에포획되게하였다. 플레이트를 PBS-0.05% 트윈 20으로적어도 5회세척하였다. ELISA 완충액 (1:5000) 중의양고추냉이퍼옥시다제 (HRP)-접합된항-M13 항체를첨가함으로써결합을정량화하고, 30 분동안실온에서인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-0.05% 트윈 20으로적어도 5회세척하였다. 다음에, 웰당 1:1 비율의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 퍼옥시다제기질및퍼옥시다제용액 B (H 2 O 2 ) ( 키르케가르트-페 리래버러토리즈 (Kirkegaard Perry Laboratories), 메릴랜드주게이터스버그소재 ) 를 100 μl웰에첨가하고, 실온에서 5 분동안인큐베이션하였다. 각웰에 1 M 인산 (H 3 PO 4 ) 100 μl를첨가하여반응을정지시키고, 실온에서 5 분동안인큐베이션하였다. 표준 ELISA 플레이트판독기를이용하여 450 nm에서각웰의황색의 OD ( 광학밀도 ) 를측정하였다. OD 감소율 (%) 을다음의공식에의해계산하였다. [0632] [0633] OD 450nm 감소율 (%) = [( 경쟁자존재웰의 OD 450nm ) / ( 경쟁자부재웰의 OD 450nm )] x 100 모파지웰 (100%) 에대한 OD 450nm 감소율 (%) 비교시, 인간및뮤린표적둘모두에대한 OD 450nm 감소율 (%) 이 50% 보다낮은클론을서열분석을위해가려내었다. 파지제조를위해특유의클론을선별하여모클론과 비교하는것에의해인간및뮤린 PD-L-Fc 둘모두에대한결합친화성 ( 파지 IC 50 ) 을측정하였다. [0634] [0635] 재료 hpd-1-fc, hpd-l1-fc, hb7.1-fc, mpd-1-fc, mpd-l1-fc, 및 mb7.1 은 R&D 시스템즈에서구입하였다. 종래의기 술을이용하여 hpd-l1 발현 293 세포는제넨테크에서생성시켰다. F(ab') 2 염소항 - 인간 IgG Fc 는잭슨이뮤노 리서치래버러터리스 (Jackson ImmunoResearch Laboratories) 에서구입하였다. [0636] [0637] [0638] 단백질의접합 PD-1-Fc, 및 B7.1-Fc 단백질을 EZ-연결술포-NHS-LC-LC-비오틴 ( 피어스 ) 으로 30 분동안실온에서제조자의설명에따라비오티닐화하였다. 과량의비-반응비오틴은퀵스핀고용량칼럼, G50-세파덱스 ( 로슈 ) 로제조자의설명에따라제거하였다. F(ab') 2 염소항-인간 IgG Fc는 MSD 술포-태그 NHS-에스테르 ( 메조스케일디스커버리 (Meso Scale Discovery)) 로제조자의설명에따라루테늄표지하였고, 과량의비 - 반응술포 - 태그는퀵스핀고용량칼럼, G50- 세파덱스 로제거하였다. [0639] [0640] 파지항체의시험을위한 ECL 세포결합검정 hpd-l1 발현 293 세포에의 hpd-1-fc 결합을 50% 억제시키는항체농도 (IC 50 ) 를전기화학발광 (ECL) 세포결합 검정에의해측정하였다. hpd-l1 발현 293 세포를인산염완충염수 (PBS) 로세척하고, 96 웰고결합플레이트 ( 메조스케일디스커버리 ) 상에서 25 μl PBS 중에웰당 25,000 세포로시딩하였다. 플레이트를실온에서인큐베이션하여세포가플레이트의탄소표면에부착되도록하였다. 25 μl의 30% FBS를각웰에첨가하고, 플레이트를가볍게진탕하면서 30 분동안인큐베이션하여비특이적인결합부위를차단시켰다. 플레이트를부드러운분배및흡인조건하에서 ELISA 마이크로플레이트세척기 (ELx405 셀렉트, 바이오-테크인스트루먼츠 (Bio-Tek Instruments)) 상에서 PBS로 3회세척하였다. 플레이트를페이퍼타올상에블롯팅하여웰에서과량의 PBS를 - 78 -
제거하였다. 12.5 μl의 2배농도의항체를 PBS 중의 3% FBS ( 검정완충액 ) 중의각웰에첨가한후 12.5 μl의 4 μg /ml (2배농도 ) 의검정완충액중의 hpd-1-비오틴을첨가하고, 플레이트를가볍게교반하면서 1 시간동안인큐베이션하였다. 플레이트를마이크로플레이트세척기상에서 PBS로 3회세척하고, 플레이트를페이퍼타올상에블롯팅하였다. 25 μl의 2 μg /ml의스트렙타비딘-루테늄 ( 메조스케일디스커버리 ) 을첨가하고, 검정완충액중실온에서 30 분동안부드럽게교반하면서인큐베이션하였다. 마이크로플레이트세척기상에서 PBS로 3 회세척하고, 플레이트를페이퍼타올상에블롯팅하였다. 계면활성제를함유하지않는 150 μl의 1X MSD 판독완충액 ( 메조스케일디스커버리 ) 을첨가하였다. 방출된발광을섹터화상기 6000 판독기 ( 메조스케일디스커버리 ) 상에서 620 nm에서판독하였다. ECL 값을 4개파라미터비선형최소제곱적합을이용하여검정에사용된시험항체의농도에의해분석하여, 검정에서각경쟁자에대한 IC 50 값을수득하였다. [0641] [0642] [0643] [0644] 결과및논의 : 인간및뮤린 PD-L1 둘모두에결합하는 YW243.55 유래의 15개의독특한파지항체를선별하고, 추가의평가를위해전장 IgG1 항체로재포맷하였다. 이들항체의경쇄및중쇄가변영역서열을도 11A 및 B에나타낸다. 전기화학발광 (ECL) 세포결합검정을통해 15개의재포맷된 Ab가인간또는마우스 PD-L1을발현하는 293 세포에대한 PD-1의결합을차단하는능력을시험하였다. ( 표 1 - 하반부 : 표 1에서 " 포맷 1" 은가용성인간 PD-1- Fc의인간 PD-L1-형질감염된 293 세포에의결합을나타내고 ; " 포맷 2" 는뮤린 PD-1-Fc의뮤린 PD-L1 형질감염된 293 세포에의결합을나타내고, " 포맷 3" 은인간 PD-1의뮤린 PD-L1-형질감염된 293 세포에의결합을나타낸다.) 15종의모든친화성개선된 Ab가마우스 PD-L1에대해상당한교차반응성을획득하였지만, PD-1에의인간및마우스 PD-L1 둘모두의결합을차단하는능력에기초하여 YW243.55S70이후속 1차후보로선별되었다 ( 표 1: 49 pm 및 22 pm 각각의 IC 50 값 ). < 표 1> [0645] [0646] [0647] 실시예 2 항 -PD-L1 항체 ( 비아코어 ) 의특징규명 [0649] 비아코어 -3000 기기를이용한표면플라즈몬공명 (SRP) 에의해재조합인간및마우스 PD-L1 에대한항 -PD- L1 파지항체 YW243.55 및 YW243.55S70 의결합친화성을측정하였다. 재조합인간 PD-L1-Fc (R&D 시스템즈, - 79 -
cat # 156-B7) 및재조합마우스 PD-L1-Fc (R&D 시스템즈, cat# 1019-B7) 를 CM5 바이오센서칩상에직접코팅하여대략 500 반응단위 (RU) 를달성하였다. 역학측정을위해, 2배연속희석물 (3.9 nm 내지 500 nm) 을 25 에서 30 μl / 분의유속으로 PBT 완충액 (0.05% 트윈-20을함유하는 PBS) 중에주입하였다. 단순한일대일랭뮤어결합모델 ( 비아코어평가소프트웨어버전 3.2) 을사용하여회합율 (k on ) 및해리율 (k off ) 을계산하였다. 평형해리상수 (kd) 는 k off /k on 의비로계산하였다. [0650] [0651] 측정된항 -PD-L1 파지항체클론 YW243.55 및 YW243.55.S70 의결합친화성을하기표 2 에나타내었다. < 표 2> [0652] [0653] [0654] [0655] 실시예 3A 인간, 레서스및마우스 PD-L1에대한항-PD-L1 Ab의특이성 - FACS 및방사성리간드세포결합검정본실시예는본발명의항-PD-L1 항체의인간, 레서스및마우스 PD-L1에대한특이성을보여준다. 또한, 293- 형질감염된세포상의세포막에서발현된마우스및인간 PD-L1에대한 Ab의친화성을보여준다. [0657] [0658] 인간및마우스 PD-L1로 293 세포를안정적으로형질감염시켰다. 세포를수거하고, 결합연구를위해 96 웰플레이트에웰당 150,000 세포로플레이팅하였다. 레서스혈액을바이오메디칼리서치 (Biomedical Research; 텍사스주샌안토니오소재 ) 의사우스웨스트재단으로부터수득하였다. 혈액을동부피의 PBS로희석하고, 단핵세포가분리되도록 96% 피콜-파크 (Ficoll-Paque) (GE 헬스케어 ) 상에덮어씌웠다. 적혈구용해완충액 ( 퀴아겐 ) 을이용하여적혈구의단핵세포를용해시키고, 6-웰플레이트에서 5 ng/ml PMA 플러스 1 μm 이오노마이신과함께 1.5 x 10 6 세포 /ml로밤새배양하였다. 배양배지는 10% 태아소혈청, 20 μm HEPES, 및깁코 (Gibco) 사의다음과같은보충물의 1:100 희석물 : 글루타 -맥스, 나트륨피루베이트, 페니실린 / 스트렙토마이신, 및비필수아미노산을함유하는 RPMI 1640이었다. 다음날세포를수거하고, 결합연구를위해 96 웰플레이트에분취하였다 ( 대략웰당 120,000 세포 ). [0659] [0660] PD-L1 항체 YW243.55.S70 또는헤르셉틴 항체대조군은 10 μg /ml에서시작하여 3배연속희석물중에서적정하고, 빙상에서 25 분동안 50 μl부피의세포에결합시켰다. 세포를세척한다음 20 μg /ml의항-인간 IgG PE ( 칼태그 (Caltag)) 와빙상에서 25 분동안결합시켰다. 레서스세포를또한 CD3 FITC 및 CD4 APC (BD 바이오사이언시즈 (BD Biosciences)) 로공동염색하여 CD4+ T 세포를구분하였다. 모든샘플을베크만딕킨슨 FACS칼리버 (Beckman Dickinson FACSCalibur) 상에서구동시키고, 항-PD-L1 항체농도의함수로서 PD-L1 결합데이터의평균형광강도를트리스타, 인크. 플로우조 소프트웨어 (Tree Star, Inc. FlowJo software) 를사용하여분석하였고 ; 칼레이다그래프를이용하여 EC 50 값 ( 최대결합의절반과관련된 Ab 농도 ) 을계산하였다. 또한, 평형결합연구를수행하여 293 세포상에서발현된인간및마우스 PD-L1 에대한 YW24355S70 결합의정확한친화성 (Kd) 을규정하였다 ( 실시예 3B). 이들값을하기표 3 에요약한다 : - 80 -
[0661] < 표 3> [0662] [0663] [0664] [0665] 실시예 3B 인간및마우스 PD-L1에대한항-PD-L1 Ab의친화성측정 - 평형결합방사성리간드세포결합검정인간또는마우스 PD-L1에의해형질감염된 293 세포를 10% 태아소혈청 (FBS), 2 mm L-글루타민, 1X 페니실린-스트렙토마이신이보충된 RPMI 1640 배지로이루어진성장배지에서 5% CO 2 중 37 에서배양하였다. 세포 를결합완충액 (2% FBS 및 50 mm Hepes를함유하는 50:50 DMEM/F12, ph 7.2) 으로세척하고, 0.2 ml의결합완충액중의대략 230,000 세포로 96 웰플레이트에배치하였다. 요오도겐방법을이용하여항-PD-L1 항체, YW243.55.S70.hIgG를요오드화하였다. 방사성표지된항-PD-L1 항체를 NAP-5 칼럼을이용한겔여과에의해유리 125 I-NA로부터정제하였고 ; 정제된 Ab는 17.41 μci/ μg의특이적활성을가졌다. 고정된농도의요오드화항체및감소하는농도의연속희석된비표지항체를함유하는 50 μl부피의경쟁반응혼합물을 96 웰플레이트에배치하였다. 인간 PD-L1 및뮤린 PD-L1을발현하는 293 안정한형질감염세포주를 10% 태아소혈청 (FBS), 2 mm L-글루타민, 1X 페니실린-스트렙토마이신이보충된 50:50 DMEM/F12 배지로이루어진성장배지에서 5% CO 2 중 37 에서배양하였다. 세포를결합완충액 (2% FBS, 50 mm HEPES, ph 7.2, 및 2 mm 나트륨아지드를함유하는 50:50 DMEM/F12) 으로세척하였고, 0.2 ml의결합완충액중의대략 200,000 세포밀도로 50 μl의경쟁반응혼합물에첨가하였다. 세포와의각경쟁반응에서요오드화된항체의최종농도는약 150 pm (0.25 ml 당약 120,000 cpms) 이었고, 세포와의경쟁반응에서비표지된항체의최종농도는 500 nm에서출발하여이어서 10 농도에대해 2배씩감소하는것으로달리하였다. 세포와의경쟁반응물을실온에서 2 시간동안인큐베이션하였다. 비표지된항체의각농도에대한세포와의경쟁반응을 3중으로검정하였다. 인큐베이션 2 시간후에, 경쟁반응물을밀리포어멀티스크린필터플레이트로옮기고, 결합완충액으로 4회세척하여, 유리물을결합된요오드화항체로부터분리시켰다. 필터를왈락위자드 (Wallac Wizard) 1470 감마계수기 ( 퍼킨엘머라이프앤드어낼리티칼사이언시즈인크.(PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc.) 메사추세츠주웰즐리소재 ) 상에서계수하였다. 결합데이터를먼슨 (Munson) 및로바드 (Robard) 의적합알고리즘을이용하는뉴리간드소프트웨어 ( 제넨테크 ) 를이용하여평가하여, 항체의결합친화성을판단하였다. 문헌 [Musson et al., Anal. Biochem. 107: 220-39 (1980)]. [0666] [0667] [0668] [0669] [0670] [0671] [0672] 스캐차드분석에의해판단된 Kd 값은표 3에나타낸바와같은인간및마우스 PD-L1에대한항-PD-L1 항체결합의 EC 50 값을제공하였다. 실시예 4 항-PD-L1 Ab의선택성및친화성 (IC 50 ) 본실시예는본발명의전장항-PD-L1 항체의 PD-1 및 B7.1 둘모두에대한 PD-L1의결합을차단하는능력을평가하는데사용된결합선택성및친화성 (IC 50 으로서 ) 검정을보여준다. 방법 : hpd-l1-fc ELISA에대한 hb7.1-fc-비오틴및 hpd-1-fc-비오틴결합 ( 포맷 4): 눈크맥시소르프 384 웰플레이트를 PBS 중의 25 μl의 250 ng/ml hpd-l1-fc로밤새코팅하였다. 웰을마이크로플레이트세척기상에서 PBS 중의 0.05% 트윈 ( 세척완충액 ) 으로 3회세척하고, PBS 중의 0.5% BSA로웰을차단하였다. 2배농도의 12.5 μl의항체를 PBS 중의 0.05% 트윈, 0.5% BSA ( 검정희석물 ) 중의각웰에첨가한다음, 검정희석물중의 12.5 μl의 250 ng/ml (2배농도 ) 의 hb7.1-fc-비오틴을첨가하고, 플레이트를 1 시간 30 분동안교반하면서인큐베이션하였다. 웰을세척완충액으로 6회세척하고, 25 μl의스트렙타비딘-hrp ( 검정 - 81 -
희석물중 1:40,000, GE 헬스케어 ) 를첨가하였다. 플레이트를교반하면서 30 분동안인큐베이션하고, 웰을세척완충액으로 6회세척하였다. 25 μl의 TMB 기질 ( 키르케가아드앤드페리래버러터리즈 ) 을 1 시간동안첨가하고, 25 μl의 1 M 인산으로반응을중지시켰다. 450 nm에서흡광도를판독하고, 실시예 1의 ECL 세포결합검정이하에서기재한바와같이 IC 50 값을분석하였다. [0673] [0674] [0675] [0676] [0677] [0678] 포맷 5, 6, 7: hpd-l1-fc에대한 hpd-1-fc-비오틴결합 ( 포맷 5) 의경우, 결합에 hb7.1-fc-비오틴대신 hpd-1-fc-비오틴을사용한것을제외하고포맷은상기검정과유사하였다. TMB 기질반응시간은 17 분이었다. mpd-l1-fc에대한 mb7.1-fc-비오틴결합 ( 포맷 6) 의경우, hpd-l1-fc 대신 mpd-l1-fc를사용하여플레이트를코팅하고, 결합에 hb7.1-fc-비오틴대신 mb7.1-fc-비오틴을사용한것을제외하고포맷은포맷 5와유사하였다. TMB 기질반응시간은 7 분이었다. mpd-l1-fc에대한 mpd-1-fc-비오틴결합 ( 포맷 7) 의경우, 결합에 mb7.1-fc-비오틴대신 mpd-1-fc-비오틴을사용한것을제외하고포맷은상기언급한마우스 ELISA와유사하였다. TMB 기질반응시간은 5 분이었다. 결과 : 지정된결합쌍사이의상호작용을차단하는것에대한친화성성숙된파지항-PD-L1 항체 YW243.55.S70의 IC 50 평가치를표 4에나타낸다. YW243.55S70은 PD-L1/PD-1 상호작용을차단하는그의 IC 50 값 (42 pm) 과비교적비슷한농도인 38 pm의최대억제농도의절반으로인간 PD-L1이 hb7.1 Fc에결합하는것을차단할수있었다. PD-L1의 PD-1 및 B7.1와의상호작용을둘모두차단하는 YW243.55S70의능력을측정한비아코어연구는이러한 ELISA 결과와일치하였다 ( 데이터는나타내지않음 ). [0679] < 표 4> [0680] [0681] [0682] [0683] [0684] [0685] [0686] [0687] [0688] 실시예 5 항-PD-L1 항체 YW243.55.S70에의한시험관내 CD4+ 및 CD8+ T 세포활성의향상 PMEL/B16 시험관내검정본실시예는멜라닌세포펩티드, gp100에반응한 γ-ifn 생산의향상에의해측정되는, PMEL T 세포수용체트랜스제닉 CD8 + T 세포의활성화에대한본발명의항-PD-L1 항체의효과를보여준다. 이절차에서, CD8+ T 세포는 CD8+ T 세포가 gp100 펩티드에대해특이적인 TCR을발현하는 PMEL TCR 트랜스제닉마우스에서수득하였다. CD8+ T 세포를정제한후에, 여러라운드의자극을주어활성화된 CD8+ T 세포를생성및확장시켰고, 이는이어서 PD-1 발현을상향조절할것이다. 동시에, B16 흑색종세포를 IFN-γ로처리하여그의 PD-L1 발현을상향조절하였다. 이어서, 세포를항-PD-L1 항체의존재하에서공동배양하고, IFN-γ 생산에대한효과를평가하였다. B16 세포가낮은수준의 gp100 펩티드를내생적으로발현하므로 ( 펩티드의외인성적용과대조됨 ) 3차자극을위해 B16 세포를선택하였다. 또한, 이들세포는 PD-L2, B7.1 또는 B7.2를발현하지않으므로, PD-L1과관련이없는부가적인신호전달 ( 예를들어 CD28 또는 CTLA-4를통한신호전달또는 PD-1을통해 PD-L2 유도된신호전달 ) 의효과가최소화되었다. PMEL 검정 : 도 3에나타낸바와같이, 항-PD-L1 항체는 IFN-γ-생산 PMEL CD8 + T 세포의백분율및지정된양의 gp100 펩티드에반응하여생산되는 IFN-γ의평균수준을둘모두향상시켰다. D.011.10 시험관내검정 : Ova-특이적 TCR Tg CD4+ T 세포를이용한유사한검정은 PD-1의발현을유도하기위한 Ova 펩티드에의한이전 - 82 -
자극에따라항-PD-L1 Ab의존재하에서향상된 T 세포증식을보여주었다 ( 도 4). 마지막자극에서, PD-L1을발현하는조사된 A20 B 세포를사용하여 DO.11.10 T 세포에지정된농도의 Ova 펩티드를제공하였다. 특히, PD-1/PD-L1 축의기여는생리학적으로적절한크기의자극을보다근접하게반영한수준인보다낮은정도의항원수용체자극에서더욱두드러졌다. [0689] [0690] [0691] [0692] 재료및방법 : PMEL 검정최초자극 ( 제 0 일 - 제 4 일 ) PMEL 트랜스제닉 T 세포수용체마우스로부터비장및장간막림프절을수거하였다. 장기를단세포현탁액으로분쇄하고, 적혈구를용해시켰다. CD8 + T 세포단리키트및 AutoMACS 세포분리기 ( 밀테니바이오텍 (Miltenyi Biotec)) 를이용하여제조사의지침에따라 CD8 + T 세포를단리하였다. [0693] [0694] [0695] [0696] 비-트랜스제닉성-매칭된마우스로부터비장을단리하고, 이를단세포현탁액으로분쇄하고적혈구를용해시켰다. 세포를 0.1 μg /ml의 gp100-펩티드로 37 에서 2 시간동안펄싱하고세척하였다. 세포를 96 웰편평바닥플레이트에서 200,000 PMEL CD8 + T 세포및 75,000 gp100-펄싱된비장세포와함께 4 일동안공동배양하였다. 배양배지는이소코브의변형된둘베코배지 + 10% 태아소혈청 + 20 μm HEPES, 및깁코의다음과같은보충물의 1:100 희석물이었다 : 글루타-맥스, 나트륨피루베이트, 페니실린 / 스트렙토마이신, 및비필수아미노산. 2차자극 ( 제 4 일 - 제 7 일 ) PMEL 배양을스핀다운시키고, 다중채널피펫을이용하여배지를흡출하였다. 새로운배지를첨가및혼합하 여세포를세척한후, 또다시스핀시켰다. 대부분의배지를제거하고, 항체 ( 헤르셉틴, YW243.55.S70, 또는 아무것도없음 ) 를 10 μg /ml 의최종농도로첨가하였다. 종점에평균 IFN-γ 생산을평가할수있도록조건을 2 중웰에서설정하였다. [0697] [0698] [0699] [0700] [0701] [0702] [0703] [0704] [0705] [0706] DC-1 세포를 0.1 μg /ml gp100 펩티드로 2 시간동안 37 에서펄싱하고세척하였다. Gp100-펄싱된 DC-1 세포를세척된 PMEL 배양물에 40,000 세포 / 웰로첨가하였다. PMEL 및 DC-1 + 항체를 3 일동안공동배양하였다. 3차자극 ( 제 7 일 - 제 8 일 ) 3차자극하루전인제 6 일에, B16 흑색종세포를 20 ng/ml 마우스 IFN-γ (R&D 시스템즈 ) 와밤새인큐베이션하여그의 PD-L1 발현을상향조절시켰다. 제 7 일에, PMEL 배양을스핀다운시키고, 다중채널피펫을이용하여배지를흡출하였다. 새로운배지를첨가하고혼합한후, 다시스핀시켰다. 대부분의배지를제거하고, 항체를 10 μg /ml의최종농도로첨가하였다. IFN-γ로밤새자극한후, B16 세포를세척하고, 3 그룹으로나누어, gp100 없이, 1 ng/ml의 gp100와함께 ( 저 gp100), 및 10 ng/ml의 gp100와함께 ( 고 gp100) 2 시간인큐베이션하였다. 세포를세척한다음세척된 PMEL + Ab 배양물에웰당 40,000 세포로첨가하고, 밤새함께인큐베이션하였다. 제 8 일 IFN-γ 세포내염색제조사의지침에따라배양의마지막 5 시간동안골지-플러그 (Golgi-Plug) (BD 바이오사이언시즈 ) 를첨가하였다. IFN-γ 세포내염색은 BD 바이오사이언시즈시토픽스 / 시토펌 (Cytofix/Cytoperm) 고정 / 투과용액키트를제조사의지침에따라사용하여행하였고, 모든염색항체는또한 BD 바이오사이언시즈로부터의것이다. 세포를 CD8a PE 및 Thy1.1 FITC로표면염색하고, 포화농도의 IFN-γ APC로세포내염색하였다. 모든샘플을베크만딕킨슨 FACS칼리버상에서구동시켰고, 데이터는트리스타, 인크. 플로우조 소프트웨어를사용하여분석하였다. D011.10 시험관내검정 DO11.10 트랜스제닉마우스로부터비장및장간막림프절을수거하고, 단세포현탁액으로분쇄하고, 적혈구를 용해하였다. 세포를 Ova 펩티드를 0.3 μm 함유하는 6 웰플레이트에서 ml 당 1 x 10 6 의세포밀도로 72 시간 - 83 -
동안배양하였다. 배양배지는 RPMI 1640 + 10% 태아소혈청 + 20 μm HEPES, 및깁코의다음과같은보충물 의 1:100 희석물이었다 : 글루타 - 맥스, 나트륨피루베이트, 페니실린 / 스트렙토마이신, 및비필수아미노산. [0707] 최초자극후에, 세포를수거하고마우스 CD4 T 세포정제키트를사용하여제조사의지침 ( 밀테니바이오텍 ) 에 따라 CD4 + T 세포를정제하였다. 이어서, 정제된 CD4 + T 세포는밤새휴지상태로있었다. [0708] [0709] [0710] [0711] [0712] [0713] [0714] [0715] [0716] [0717] [0718] [0719] 다음날, 세포를수거하고, 세척하고, 조사된 (10,000 라드 ) A20 세포와공동배양하였다. 공동배양은 20 μg /ml의최종농도로 Ova 펩티드및항체로적정한 50,000 CD4 + T 세포대 40,000 A20 세포를함유하는 96 웰 U자바닥플레이트에서 3중웰로설정하였다. 48 시간후에, 배양물을 3H-티미딘 1 μci/ 웰로밤새펄싱하고, 다음날동결시켰다. 이후에플레이트를해동시키고, 세포수거기상에서수거하고, 베타-계수기상에서판독하였다. 실시예 6 항-PD-L1에의한혼합림프구반응에서의인간 CD8+ T 세포의향상된증식도 5는항-PD-L1 ( 예를들어, YW243.55.S1) 이 MHC-미스매칭된공여자로부터의세포에반응하여인간 CD8 T 세포의증식을향상시키는능력을보여준다. CD8+ T 세포반응은 CD8+ T 세포로세테셉 (RosetteSep) ( 스템셀테크놀로지스 (StemCell Technologies)) 을제조사의지침에따라처음사용하는것에의해공여자 A의전혈로부터강화되었다. 이어서, 세포를동부피의인산염완충염수 (PBS) 로희석시키고, 구배원심분리에의해피콜-파큐플러스 (GE 헬스케어 ) 상에덮어씌워분리하였다. 분리이후에, 세포를 CD8 APC (BD 바이오사이언시즈 ) 로염색하고, 78% CD8+ T 세포임을확인하였다. 세포를 2.5 μm CFSE 트레이서염료 ( 몰레큘라프로브스 ) 로형광표지하였다. 동종이형항원제시세포 (APC) 로서제공하기위해, 먼저공여자 B의전혈로부터단핵세포를단리해낸후, CD3+T 세포를고갈시켰다. 혈액을동부피의 PBS로희석시키고, 피콜상에서의구배원심분리이후에단핵세포를단리하였다. 세포를 CD3 FITC (BD 바이오사이언시즈 ) 로염색하고, 세척하고, 이어서항-FITC 마이크로비드 ( 밀테니바이오텍 ) 와함께인큐베이션하였다. 이어서 CD3 FITC 양성세포를 AutoMACS 세포분리기 ( 밀테니바이오텍 ) 상에서고갈시켰다. 이어서세슘조사기내에서세포를 2500 라드로조사하였다. 세포를 96 웰편평바닥플레이트내에서 150,000 CD8+ T 세포및 150,000 APC와 5 일동안 10 μg /ml의항체와함께공동배양하였다. 배양배지는 RPMI 1640 + 10% 태아소혈청 + 20 μm HEPES, 및깁코의다음과같은보충물의 1:100 희석물이었다 : 글루타-맥스, 나트륨피루베이트, 페니실린 / 스트렙토마이신, 및비필수아미노산. 제 5 일에, 세포를수거하고, 세척하고, CD8-비오틴에이어스트렙타비딘-PerCp (BD 바이오사이언시즈 ) 로염색하였다. 샘플을베크만딕킨슨 FACS칼리버상에구동시키고, 데이터를트리스타, 인크. 플로우조소프트웨어를사용하여분석하였다. 항-PD-L1의존재하에서, MHC-미스매칭된공여자로부터의세포에반응하여 CD8 T 세포의증식이대략 45% 향상된것으로관찰되었다. 실시예 7 생체내모델에서 LCMV에대한 PD-L1 차단효과만성자극조건하에서의 T 세포는억제수용체 PD-1의발현을상향조절하고지속시키는것으로나타났다. 2종의리간드 PD-L1 및 PD-L2 중어느하나에의한 PD-1의라이게이션은만성적으로활성화된 T 세포를불응상태로만들어, 그의동족항원에대한반응을약화시킨다. 림프구성맥락수막염바이러스 (LCMV) 에의해지속적으로감염된마우스에서, PD-1 또는그의리간드 PD-L1의차단은만성적불응성 T 세포를소생시켜항바이러스 T 세포반응의크기및기능품질을향상시키는데충분하다. 유사하게, HIV 또는 HCV에의해만성적으로감염된인간은 PD-1 또는 PD-L1의차단에의해시험관내에서활성이향상될수있는자극에대해 T 세포불응성을나타낸다. 따라서, LCMV 모델에서의 PD-L1 차단의활성은항바이러스및항종양면역을향상시키는데대한치료적잠재력을시사한다. 마우스에서의 LCMV 생체내실험을위해, 본발명자들은마우스 IgG2a 중쇄및마우스카파경쇄불변도메인상류의파지유래중쇄및경쇄가변영역서열을클로닝하여인간화항-PD-L1 항체 (YW243.55S70) 를재포맷하였 - 84 -
다. Fcγ 수용체결합을억제하는것에의해 PD-L1 발현세포의항체-매개세포독성을방지하기위해, 위치 265 ( 아스파르트산 ) 및 297 ( 아스파라긴 ) 을알라닌 (DANA) 으로변화시켰다. 문헌 [Shields, RL et al., J. Biol Chem 2001 276 (9): 6591-6604]. 항-PD-L1 항체가만성감염에서항바이러스성면역을향상시키는능력을시험하기위해, 마우스를제 0 일에참조대조군으로서클론 13 LCMV 또는 LCMV의암스트롱균주의 2 x 10 6 플라크형성단위 (pfu) 로감염시켰다. 실험설계의개략도는도 6에나타내었다. 클론 13에의한감염은확장되지만바이러스를효과적으로제거할수없는 T 세포를특징으로하는만성감염을야기한반면, 암스트롱 LCMV는감염 8-10 일이내에제거되었다. 제 14 일에, 마우스에항-PD-L1 또는대조군 migg를 10 mg/kg 용량으로주 3회전달하여치료를개시하였다. 제 21 일및제 28 일에, CD8 T 세포기능및혈액및조직중의바이러스역가를분석하였다. [0720] [0721] 문헌 [Barber et al., Nature 439:682-7 (2006)] 에서공개된데이터와일치하게, 본실시예는만성 LCMV 감염에서의 2 주치료섭생에따라 LCMV에대한세포독성림프구반응을향상시키는항-PD-L1 Ab 능력을보여준다. 도 7A는 gp33 LCMV-특이적펩티드에반응하여세포표면에 CD107a를발현하는 CD8 T 세포의 % 를보여준다. 정상적으로는세포내에서발현되는 CD107a의원형질막발현은탈과립화과정에따른것으로, 따라서탈과립화에대한대용물마커의역할을한다. 급성암스트롱 LCMV 감염으로부터의세포의반응과관련하여, 만성균주, 클론 13에의해감염된동물로부터의세포는탈과립화가손상된반면 ( 대조군 Ig 그룹 ), PD-L1 차단은 CD8+ 탈과립화를암스트롱감염에서관찰되는것과비교가능한수준으로회복시킬수있었다. 유사하게, 7B는대조군 Ig 와비교하여, 항-PD-L1-처리된그룹에서 LCMV gp33에반응하여 IFN-γ-생산 CD8 T 세포가증가된 % 를보여준다. 다음으로, 혈액및조직에서 LCMV 바이러스를감소시키거나근절하는것에대한항-PD-L1 Ab의영향을시험하였다. 도 8A에서, 그래프는클론 13 LCMV에의해감염된후제 21 일및제 28 일에대조군 Ig 및 PD-L1 처리된마우스의표시된조직에서의로그바이러스역가를보여준다. 항체처리는감염후제 14 일에시작하였다. PD-L1의차단은혈액, 간, 뇌, 폐및신장에서바이러스역가를매우현저하게감소시켰다. 인상적으로, 5 마 리의마우스중 3 마리에서 α-pd-l1 Ab는혈액 LCMV 역가를검출수준미만 (< 1 x 10-5 ) 으로감소시켰다. 비교설계의후속실험에서는, 항-PD-L1로 10 mg/kg 또는 2 mg/kg의용량으로주 3회 2 주동안처리된 5/5 마우스의혈액및간에서바이러스의근절이관찰되었다 ( 데이터는나타내지않음 ). 하단그래프는혈액에서의바이러스역가의감소역학을나타낸것으로, 대조군에비해항-PD-L1 처리된그룹에서제 28 일에평균감소율이 96.8% 임을보여준다. 이러한데이터는만성감염에서 T 세포반응을억제하는데있어서 PD-1/PD-L1 경로의중요성을지지하며, 만성감염, 예컨대 C형간염및 HIV 인간으로부터수득한 T 세포에대한시험관내 PD-L1 차단의효과와일치한다. [0722] [0723] [0724] 재료및방법 : LCMV gp33 펩티드에반응하여 CD8 T 세포에의한 IFN-감마생산 % 측정감염된마우스로부터비장을단리하고, 완전배지 : 10% 열불활성화된태아소혈청, 2 mm L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 / 스트렙토마이신및 10 mm 2-메르캅토에탄올을함유하는 IMDM ( 인비트로겐인크., 캘리포니아주칼스배드소재 ) 에서장기를분쇄하여단세포현탁액을생성하였다. ACK 용해완충액 (0.15 M NH 4 Cl, 10 mm KHCO 3, 0.1 mm EDTA) 을이용하여적혈구를용해시켰다. 항원특이적 CD8 T 세포반응을측정하기위해, 비장세포를완전배지에서세척하고, 시험관내에서 LCMV 펩티드 GP33 (KAVYNFATC, 프로이뮨인크., 플로리다주브라덴톤소재 ) 으로 4 시간동안재자극하였다. 1 x 10 6 비장세포를 96 웰편평바닥플레이트에서 100 ng/ml의 GP33 펩티드와함께 100 단위 /ml의인간인터류킨-2 ( 시그마-알드리치, 미주리주세인트루이스소재 ), 1 μl /ml 의브레펠딘 A 및 1 μl /ml (1:1000 희석물 ) 의모넨신 (BD 파밍겐 ) 및항-CD107a FITC ( 클론 ID4B, BD 바이오사이언시즈, 캘리포니아주산호세소재 ) 의존재하에배양하였다. 인큐베이션후에, 세포를 2% 태아소혈청을함유하는 PBS에서 1회세척하고, 세포표면마커를형광색소접합된항체 : 항-CD8 APC ( 클론 53.67, BD 바이오사이언시즈, 캘리포니아주산호세소재 ) 항-CD4 PerCp-Cy5.5 ( 클론 RM4-5, BD 바이오사이언시즈, 캘리포니아주산호세소재 ) 및항-PD-1 PE ( 클론 J43, BD 바이오사이언시즈, 캘리포니아주산호세소재 ) 를이용하여염색하였다. 세포내 IFN-γ의염색은항-IFN-γ PE-Cy7 ( 클론 XMG1.2, 이바이오사이언스인크., 캘리포니아주산호세소재 ) 을이용하여제조사의지침에따라시토픽스시토펌플러스키트 (BD 바이오사이언시즈, 캘리포니아주산호세소재 ) 를이용하여행하였다. GP33 특이적인 CD8 T 세포의개수를검출하기위해, 새로운비장세포를제조사의지침에따라 GP33 오량체 (APC에연결된 H2-Db, 프로이뮨인크., 플로리다주브라덴톤소재 ) 를이용하 - 85 -
여염색하였다. BD FACS 아리아 (BD 바이오사이언시즈, 캘리포니아주산호세소재 ) 를이용하여데이터를수집 하고, 플로우조소프트웨어 ( 트리스타, 인크., 오리건주애쉬랜드소재 ) 를이용하여분석하였다. [0725] [0726] [0727] [0728] [0729] [0730] LCMV 바이러스역가의측정 : MC57 섬유육종세포를완전 IMDM 중의 LCMV-함유혈액또는조직균질물의 10배연속희석물로감염시켰다. 이어서, 반응물을조직배양인큐베이터내에서 37 에서 2-6 시간동안인큐베이션한다음, 1% 메틸셀룰로스를함유하는 DMEM로덮어씌웠다. 이어서 3-5 일동안인큐베이션한다음, 메틸셀룰로스층을흡인하여제거하였다. 세포를 PBS/4% 파라포름알데히드로고정시킨다음, 0.5% 트리톤-x로 20 분동안투과성으로만들고, PBS 중에서세척한후, 10% FCS 중에서 1 시간동안가볍게진동시키면서차단하였다. LCMV에대한염색은 VL4 항체 (1 시간 ) 로행하고, 2회세척한다음, 차단완충액중에서항-래트 HRP (1:400) 로발색시켰다. 이어서, 3회세척한다음, o-페닐렌디아민기질 ( 시그마 P8806-50TAB 3 mg/ 정제 ) 을웰에첨가하여발색시켰다. 실시예 8 암에서의 PD-L1 차단현재많은종양들이항종양 T 세포반응을약화시키기위한수단으로서 PD-1 리간드의발현을이용한다는것은분명하다. 몇몇인간암은종양및종양-침윤백혈구둘모두에서상승된수준의 PD-L1을발현하는것을특징으로하며, 이렇게상승된 PD-L1 발현은종종더나쁜예후와관련이있다. 마우스종양모델은종양내에서유사한 PD-L1 발현의증가를보였고, 이는종양면역을억제하는데있어서 PD-1/PD-L1 경로의역할을보여준다. 본발명자들은본원에서, 동계 C57B6 마우스에서 MC38.Ova 뮤린결장직장암종세포의정위적종양성장에대한 PD-L1 차단의영향을보여주는실험을제시한다 ( 도 9A). 이들세포는레트로바이러스형질도입을통해오브알부민을발현하고, PD-L1을발현하지만, 유동세포계수법에의한측정시그의세포표면에서 PD-L2는발현하지않는다 ( 히스토그램 - 도 10A). 마우스에 50 만개의 MC38.Ova 세포를제 0 일에피하접종하였다. 제 1 일또는 제 14 일마우스 ( 종양의평균크기가 250 mm 3 에달한경우 ) 에 10 마우스 / 그룹으로 10 mg/kg 항-PD-L1 (YW243.55S70-마우스 IgG2a-DANA), 대조군 Ig, 또는차단항-CTLA4 Ab, (UC10-4F10-11) 를연구기간동안주 3 회처리하였다. 개입초기또는이후의 PD-L1의차단은종양성장을방지하는단일작용제요법으로서매우효과적이었다. 대조적으로, T 세포상에서발현되는또다른억제분자인 CTLA4의차단은종양성장억제에대한어떤증거도보이지않았다. 이러한결과는항종양면역반응을억제하는데있어서 CTLA4/B7에비해 PD-1/PD- L1 축의특유한역할을보여주며, PD-1 및 B7.1과의 PD-L1 상호작용을차단하는항체에의해인간암을치료하는잠재력을지지한다. [0731] [0732] [0733] [0734] [0735] [0736] [0737] [0738] [0739] [0740] MC38.Ova 동계종양모델 : 방법. 제 0 일에, 70 마리의동물에 100 μl HBSS+ 마트리겔중의 50 만개의 MC38.Ova 세포를피하접종하였다. D1 착수시점에, 20 마리의마우스를 2 처리그룹 ( 하기참조 : 그룹 1 또는그룹 2) 중하나로구성하였다. 남아있는 40 마리의마우스는제 14 일까지종양이성장하도록두었다. 이들 40 마리중, 종양크기가유사한 30 마리의마우스를 3 처리그룹 ( 그룹 3-5) 중하나로구성하였다. 종양을측정하고, 주 2회마우스의체중을재었다. 종양부피가달라하기처리그룹에속하지못한마우스는안락사시켰다 : 그룹 1: 항-gp120 항체, 10 mg/kg IP, 100 μl, D1, 3x/ 주그룹 2: 항-PD-L1 항체, 10 mg/kg IP, 100 μl, D1, 3x/ 주그룹 3: 항-gp120 항체, 10 mg/kg IP, 100 μl, D14, 3x/ 주그룹 4: 항-PD-L1 항체, 10 mg/kg IP, 100 μl, D14, 3x/ 주그룹 5: 항-CTLA-4 항체, 10 mg/kg IP, 100 μl, D14, 3x/ 주 *** 그룹 1 및 2는 D1에투약하기시작했고 ; 그룹 3, 4, 및 5는 D14에투약하기시작했다. 실시예 9 항-PD-L1과항종양효과를제공하는다른작용제또는면역향상요법과의조합 - MC38.Ova 모델제 0 일에, 150 마리의동물에 100 μl HBSS + 마트리겔중의 50 만개의 MC38.Ova 세포를피하접종하였다. 마 우스를종양이성장하도록두었다. 마우스의체중을재고, 제 11 일 ( 종양부피가 100-200 mm 3 인때 ) 까지주 2-86 -
회측정하였다. 제 11 일에, 종양을측정한후, 마우스를하기 12 처리그룹중하나로구성하였다. 종양부피가달라하기처리그룹에속하지못한마우스는안락사시켰다. 겜시타빈 ( 그룹 4) 처리는제 12 일에시작하였고, 그밖의항체그룹으로의처리는제 14 일에시작하였다. 모든부피는불활성비히클중 100 μl였고, 부가적인상세사항은하기에나타낸바와같다 : [0741] [0742] [0743] [0744] [0745] [0746] [0747] [0748] [0749] 그룹 1: 항-gp120 항체, 10 mg/kg IP, 100 μl, 3x/ 주 x 5, n=10 그룹 2: 항-PD-L1 항체, 10 mg/kg IP, 100 μl, 3x/ 주 x 5, n=10 그룹 3: 항-VEGF 항체, 5 mg/kg IP, 100 μl, 2x/ 주 x 5, n=10 그룹 4: 겜시타빈, 40 mg/kg IP, 100 μl, 12, 16, 20 일, n=10 그룹 5: 항-PD-L1 항체 + 항-gp120 항체, n=10 그룹 6: 항-PD-L1 항체 + 항-VEGF 항체, n=10 그룹 7: 항-PD-L1 항체 + 겜시타빈, n=10 그룹 8: 항-gp120 항체 + 겜시타빈, n=10 그룹 9: 항-gp120 항체 + 항-VEGF, n=10 [0751] [0752] [0753] [0754] [0755] 제 12 일 : CBC 분석을위해그룹 1의마우스를마취상태하에서안와후방으로채혈하였다 (100 μl ). 제 14 일및제 22 일 : CBC 분석을위해그룹 4의마우스를마취상태하에서안와후방으로채혈하였다 (100 μl ). 제 19 일 : CBC 분석을위해그룹 4를제외한모든마우스를마취상태하에서안와후방으로채혈하였다 (100 μl ). 제 26 일 : PK 분석을위해그룹 4를제외한모든마우스를마취상태하에서안와후방으로채혈하였다 (100 μl ). 종양을측정하고, 주 2회마우스의체중을재었다. 15% 초과의체중감소를보이는동물은매일체중을재고, 체중이 20% 를초과하여감소되면안락사시킬것이다. 종양부피가 3,000 mm 3 을초과하거나, 또는종양이형성 되지않을경우에는 3 개월후에마우스를안락사시킬것이다. [0756] [0757] [0758] [0759] [0760] [0761] 본연구는 PD-L1 차단이 α-vegf 및겜시타빈단독의유도섭생에비해더효과적임을보여주었다 ( 도 10). 실시예 10 포유동물세포에서항-PD-L1 항체의발현본실시예는포유동물세포에서재조합발현에의해잠재적으로글리코실화된형태의항-PD-L1 항체를제조하는것을설명한다. 벡터 prk5 (1989년 3월 15일자로공개된 EP 307,247 참조 ) 를발현벡터로사용하였다. 임의로, 항체의경쇄및 / 또는중쇄를코딩하는 DNA를, 문헌 [Sambrook et al., 상기문헌 ] 에기재된바와같은라이게이션방법을이용하여상기 DNA의삽입을허용하도록선택된제한효소가존재하는 prk5 내로라이게이션하였다. 한실시양태에서, 선택된숙주세포는 293 세포일수있다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573) 를조직배양플레이트에서태아송아지혈청이보충되고임의로는영양소성분및 / 또는항생제가보충된 DMEM과같은배지중에서전면성장시까지성장시켰다. prk5-항체를코딩하는 DNA 약 10 μg을 VA RNA 유전자를코딩하는 DNA 약 1 μg과혼합하고 ( 문헌 [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)]), 500 μl의 1 mm 트리스-HCl, 0.1 mm EDTA, 0.227 M CaCl 2 에용해시켰다. 상기혼합물에 50 mm HEPES (ph 7.35), 280 mm NaCl, 1.5 mm NaPO 4 500 μl를적 가하고, 25 에서 10 분동안침전물이형성되게하였다. 상기침전물을현탁시키고 293 세포에첨가하여약 4 시간동안 37 에서침강되게하였다. 배양배지를흡출하고, PBS 중 20% 글리세롤 2 ml를 30 초동안첨가하였다. 이어서, 293 세포를혈청-무함유배지로세척하고, 신선한배지를첨가하고, 세포를약 5 일동안인큐베이션하였다. - 87 -
[0762] 형질감염후대략 24 시간이지난후에상기배양배지를제거하고, 배양배지 ( 단독 ) 또는 200 μci/ml 35 S- 시스 테인및 200 μci/ml 35 S-메티오닌을함유하는배양배지로교체하였다. 12시간동안인큐베이션한후, 조건화배지를수집하여회전필터에서농축시키고 15% SDS 겔에로딩하였다. 처리된겔을건조시키고, 항체의존재를밝히기위해선택된시간동안필름에노출시킬수있다. 형질감염된세포를함유하는배양물을추가로인큐베이션할수있었고 ( 혈청-무함유배지중에서 ), 상기배지를선택된생물검정으로시험하였다. [0763] [0764] 별법적인기술로, 문헌 [Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)] 에기재되어있는덱스트란술페이트방법을이용하여항체를 293 세포내에일시적으로도입할수있다. 293 세포를스피너플라스크내에서최대밀도로성장시키고, prk5-항체를코딩하는 700 μg DNA를첨가하였다. 세포를원심분리에의해스피너플라스크로부터우선농축하고 PBS로세척하였다. DNA-덱스트란침전물을 4시간동안세포펠렛상에서인큐베이션하였다. 세포를 20% 글리세롤로 90초동안처리하고, 조직배양배지로세척하고, 조직배양배지, 5 μg /ml 소인슐린및 0.1 μg /ml 소트랜스페린을함유하는스피너플라스크에다시도입하였다. 약 4일후, 조건화배지를원심분리하고여과하여세포및잔해를제거하였다. 이어서, 발현된항체를함유하는샘플을농축하고투석및 / 또는칼럼크로마토그래피와같은임의의선택된방법으로정제할수있다. 또다른실시양태에서, 항체는 CHO 세포에서발현될수있다. prk5 내로라이게이션된항체를코딩하는 DNA는 CaPO 4 또는 DEAE-덱스트란과같은공지의시약을사용하여 CHO 세포를형질감염시킬수있다. 상기기재된바 와같이, 세포배양물을인큐베이션하고, 배지를배양배지 ( 단독 ) 또는 35 S-메티오닌과같은방사능표지를함유하는배지로교체할수있었다. 항체의존재를결정한후에, 배양배지를무혈청배지로교체할수있다. 바람직하게는, 상기배양물을약 6일동안인큐베이션한후에조건화배지를수거하였다. 이어서, 발현된항체를함유하는배지를임의의선택된방법으로농축하고정제할수있었다. [0765] 항체의에피토프-태그가부착된변이체도숙주 CHO 세포에서발현될수있다. prk5 내로라이게이션된항체를코딩하는 DNA는 prk5 벡터로부터서브클로닝될수있다. 상기서브클론삽입물로 PCR을수행하여바큘로바이러스발현벡터에선택된에피토프태그, 예컨대폴리-his 태그와인-프레임으로융합시킬수있었다. 이어서, 항체삽입물을코딩하는폴리-his 태그가부착된 DNA는안정한클론의선택을위해선별마커, 예를들어 DHFR 을함유하는 SV40 유도벡터내로서브클로닝될수있다. 마지막으로, CHO 세포를 ( 상기기재된바와같이 ) SV40 구동벡터로형질감염시킬수있었다. 상기기재된바와같이표지하여발현을입증할수있었다. 이어 서, 발현된폴리 -His 태그가부착된항체를함유하는배양배지를임의의선택된방법, 예를들어 Ni 2+ - 킬레이트 친화성크로마토그래피에의해농축하고정제할수있었다. [0766] [0767] [0768] [0769] [0770] 항체는또한일시적발현절차에의해 CHO 및 / 또는 COS 세포내에서또는다른안정한발현절차에의해 CHO 세포내에서발현될수있다. 하기절차를이용하여 CHO 세포에서의안정적인발현을수행하였다. 단백질은 IgG 구축물 ( 이뮤노어드헤신 ) 로발현되었고, 이때각단백질의가용형태 ( 예를드어, 세포외도메인 ) 에대한코딩서열은힌지, CH2 및 CH2 도메인을함유하는 IgG1 불변영역에융합되었고 / 거나폴리-His 태그가부착된형태였다. PCR 증폭후, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)] 에기재된바와같은표준기술을이용하여각각의 DNA를 CHO 발현벡터에서브클로닝하였다. 관심 DNA의 5' 및 3' 에상용성제한부위가있도록 CHO 발현벡터를구축하여, cdna가간편하게셔틀링되도록하였다. CHO 세포에서의발현에사용된벡터는문헌 [Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 (1774-1779) (1996)] 에기술된바와같고, SV40 초기프로모터 / 인핸서를사용하여관심 cdna 및디히드로폴레이트환원효소 (DHFR) 의발현을구동시켰다. DHFR 발현은형질감염후안정적으로유지되는플라스미드의선별을허용한다. 목적하는플라스미드 DNA 12 μg을시판되는형질감염시약수퍼펙트 (SUPERFECT) ( 퀴아겐 ), 도스퍼 (DOSPER) 또는퓨진 (FUGENE) ( 베링거만하임 (Boehringer Mannheim)) 을사용하여대략 1000 만개의 CHO 세포에도입하였다. 문헌 [Lucas et al., 상기문헌 ] 에기재된바와같이세포를성장시켰다. 약 3 x 10-7 세포를아래에서설명되는바와같은추가의성장및생산을위해앰플내에동결시켰다. 플라스미드 DNA를함유하는앰플을수조에넣어해동시키고, 볼텍싱시켜혼합하였다. 내용물을배지 10 ml를함유하는원심분리튜브에피펫팅하고, 1000 rpm에서 5분동안원심분리하였다. 상청액을흡출하고, 세포를 10-88 -
ml의선별배지 (0.2 μm정용여과된 5% 소태아혈청을함유하는 0.2 μm여과된 PS20) 에재현탁시켰다. 이어서, 상기세포를선별배지 90 ml를함유하는 100 ml 스피너에분취하였다. 1일내지 2일이지난후, 상기세포를선별성장배지 150 ml를충전한 250 ml 스피너로옮기고 37 에서인큐베이션하였다. 2-3 일이더지난후, 250 ml, 500 ml 및 2000 ml 스피너에 3x10 5 개세포 /ml를시딩하였다. 원심분리및생성배지중의재현탁에의해세포배지를신선한배지로교환하였다. 임의의적합한 CHO 배지를사용할수있지만, 실제로는 1992 년 6월 16일자로허여된미국특허제5,122,469호에기재된생성배지를사용할수있다. 3L 생성스피너에 1.2x10 6 개세포 /ml를시딩하였다. 제 0 일에, 세포수및 ph를측정하였다. 제 1 일에, 스피너를샘플링하고, 여과된공기를살포하기시작하였다. 제 2 일에스피너로부터샘플링하고, 온도를 33 로변화시키고, 500 g/l 글루코스 30 ml 및 10% 소포제 ( 예를들어, 35% 폴리디메틸실록산에멀젼, 다우코닝 (Dow Corning) 365 의료등급에멀젼 ) 0.6 ml를첨가하였다. 생성전반에걸쳐, 필요에따라 ph를조정하여 ph가약 7.2로유지되도록하였다. 10일후, 또는생존률이 70% 아래로떨어졌을때, 세포배양물을원심분리및 0.22 μm필터를통한여과에의해수거하였다. 여과물을 4 에서저장하거나, 정제를위한칼럼상에즉시로딩하였다. [0771] [0772] [0773] [0774] [0775] [0776] [0777] [0778] [0779] 폴리-His 태그가부착된구축물의경우, Ni-NTA 칼럼 ( 퀴아겐 ) 을사용하여단백질을정제하였다. 정제전에, 이미다졸을 5 mm 농도로조건화배지에첨가하였다. 조건화배지를 4 에서 0.3 M NaCl 및 5 mm 이미다졸을함유하는 20 mm Hepes (ph 7.4) 완충액내에평형화시킨 6 ml Ni-NTA 칼럼상으로 4-5 ml/ 분의유속으로펌핑하였다. 로딩후, 상기칼럼을추가의평형화완충액으로세척하고, 0.25 M 이미다졸을함유하는평형화완충액으로단백질을용출시켰다. 이어서, 고도로정제된단백질을 25 ml G25 수퍼파인 ( 파마시아 ) 칼럼을사용하여 10 mm Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을함유하는저장완충액 (ph 6.8) 중에탈염시키고 -80 에서저장하였다. 이뮤노어드헤신 (Fc 함유 ) 구축물을하기와같이조건화배지로부터정제하였다. 조건화배지를 20 mm 인산나트륨완충액 (ph 6.8) 로평형화시킨 5 ml 단백질 A 칼럼 ( 파마시아 ) 에펌핑하였다. 로딩후, 상기칼럼을평형화완충액으로철저하게세척한후에 100 mm 시트르산 (ph 3.5) 으로용출시켰다. 1 ml 분획을 1 M 트리스완충액 (ph 9) 275 μl를함유하는튜브에수집함으로써, 용출된단백질을즉시중화시켰다. 이어서, 고도로정제된단백질을폴리-His 태그가부착된단백질에대해상기기재된바와같은저장완충액중에탈염시켰다. SDS 폴리아크릴아미드겔및에드만 (Edman) 분해법에의한 N-말단아미노산서열분석에의해균질성을평가하였다. 실시예 11 이. 콜라이에서의항-PD-L1 항체의발현본실시예는이. 콜라이내에서의재조합발현에의해글리코실화되지않은형태의항-PD-L1 항체를제조하는것을설명한다. 먼저, 항-PD-L1 항체를코딩하는 DNA 서열을선택된 PCR 프라이머를사용하여증폭시켰다. 상기프라이머는선택된발현벡터상의제한효소부위에상응하는제한효소부위를함유해야한다. 다양한발현벡터를사용할수있다. 적절한벡터의예는앰피실린및테트라시클린저항성에대한유전자를함유하는 pbr322 ( 이. 콜라이에서유래됨 ; 문헌 [Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)] 참조 ) 이다. 벡터를제한효소로소화시키고탈인산화시켰다. 이어서, PCR 증폭된서열을상기벡터에라이게이션시켰다. 바람직하게는, 벡터는항생제내성유전자, trp 프로모터, 폴리his 리더 ( 처음 6개의 STII 코돈, 폴리his 서열및엔테로키나제절단부위를포함함 ), NPOR 코딩영역, 람다전사종결자및 argu 유전자를코딩하는서열을포함할것이다. 이어서, 라이게이션혼합물을사용하여, 선택된이. 콜라이균주를문헌 [Sambrook et al., ( 상기문헌 )] 에기재된방법을이용하여형질전환시켰다. LB 플레이트에서성장하는능력에의해형질전환체를확인한후, 항생제내성콜로니를선별하였다. 제한분석및 DNA 서열분석에의해플라스미드 DNA를단리및확인할수있었다. 선별된클론을항생제가보충된 LB 브로쓰와같은액체배양배지중에서밤새성장시킬수있었다. 이어서, 상기철야배양물을사용하여, 더큰규모의배양물에접종할수있었다. 이어서, 세포를원하는광학밀도까지성장시켰고, 이동안에발현프로모터가작동되었다. 추가로수시간동안세포를배양한후, 원심분리에의해세포를수거할수있었다. 원심분리에의해수득된세포펠렛을당업계에공지된다양한작용제를사용하여가용화할수있었고, 이후에는가용화된항체를항체의강력한결합을허용하는조건하에서금속킬레이팅칼럼을사용하여정제할수있었다. - 89 -
[0780] 하기절차를이용하여항-PD-L1 항체를이. 콜라이내에서폴리-His 태그가부착된형태로발현시킬수있었다. 먼저, 항체를코딩하는 DNA를선택된 PCR 프라이머를사용하여증폭시켰다. 프라이머는선택된발현벡터상의제한효소부위에상응하는제한효소부위, 및효율적이고신뢰할수있는번역개시, 금속킬레이트칼럼상에서의신속한정제, 및엔테로키나제에의한단백질분해제거를제공하는기타유용한서열들을함유한다. 이어서, PCR 증폭된, 폴리-His 태그가부착된서열을발현벡터에라이게이션시키고, 이것을사용하여균주 52를기초로하는이. 콜라이숙주를형질전환시켰다 (W3110 fuha(tona) lon gale rpohts(htprts) clpp(laciq). 먼저, 형질전환체를 50 mg / ml의카르베니실린을함유하는 LB에서 O.D.600이 3-5에도달할때까지 30 에서진탕하며성장시켰다. 이어서, 배양물을 CRAP 배지 ( 물 500 ml 중 (NH 4 ) 2 SO 4 3.57 g, 시트르산나트륨 2H 2 O 0.71 g, KCl 1.07 g, 디프코 (Difco) 효모추출물 5.36 g, 쉐필드 (Sheffield) 하이카제 SF 5.36 g 및또한 110 mm MPOS (ph 7.3), 0.55% (w/v) 글루코스및 7 mm MgSO 4 를혼합하여제조한것 ) 중에 50-100배희석하고, 대략 20-30 시간동안 30 에서진탕하며성장시켰다. 샘플을제거하여 SDS-PAGE 분석을통해발현을입증하고, 벌크배양물을원심분리하여세포를펠렛화하였다. 정제및리폴딩시킬때까지세포펠렛을동결시켰다. [0781] [0782] [0783] 발효물 0.5 내지 1 L로부터의이. 콜라이페이스트 ( 펠렛 6-10 g) 를 7 M 구아니딘, 20 mm 트리스 (ph 8) 완충액중에 10 부피 (w/v) 로재현탁시켰다. 고체아황산나트륨및나트륨테트라티오네이트를각각 0.1 M 및 0.02 M 의최종농도로첨가하고, 용액을 4 에서밤새교반하였다. 이단계에서, 모든시스테인잔기가아황산염화에의해차단된변성단백질이생성되었다. 상기용액을베크만초원심분리기에서 40,000 rpm으로 30분동안원심분리하였다. 상청액을 3-5 부피의금속킬레이트칼럼완충액 (6 M 구아니딘, 20 mm 트리스 (ph 7.4)) 로희석하고, 0.22 μm필터를통해여과하여정화하였다. 조건에따라, 정화된추출물을금속킬레이트칼럼완충액으로평형화시킨 5 ml 퀴아겐 Ni-NTA 금속킬레이트칼럼에로딩하였다. 50 mm 이미다졸 ( 칼바이오켐, 우트롤 (Utrol) 등급 ) 을함유하는추가의완충액 (ph 7.4) 로칼럼을세척하였다. 250 mm 이미다졸을함유하는완충액으로단백질을용출시켰다. 목적하는단백질을함유하는분획을풀링하고, 4 에서저장하였다. 아미노산서열을기초로계산된흡광계수를사용하여 280 nm에서의흡광도에의해단백질농도를추정하였다. 샘플을새로제조된리폴딩완충액 (20 mm 트리스 (ph 8.6), 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mm 시스테인, 20 mm 글리신및 1 mm EDTA로이루어짐 ) 으로천천히희석하여단백질을리폴딩시켰다. 최종단백질농도가 50 내지 100 μg /ml가되도록리폴딩부피를선택하였다. 리폴딩용액을 4 에서 12시간내지 36시간동안부드럽게교반하였다. TFA를 0.4% 의최종농도 ( 대략 ph 3) 로첨가하여리폴딩반응을켄칭시켰다. 추가의단백질정제이전에, 상기용액을 0.22 μm필터를통해여과하고, 아세토니트릴을 2-10% 의최종농도로첨가하였다. 리폴딩된단백질로 0.1% TFA의이동상완충액을사용한포로스 (Poros) R1/H 역상칼럼에서의크로마토그래피를실시하였고, 이때 10% 80% 의아세토니트릴구배로용출시켰다. A280 흡광도를갖는분획의분취액을 SDS 폴리아크릴아미드겔에서분석하고, 균질한리폴딩된단백질을함유하는분획을모았다. 일반적으로, 대부분의단백질의적당하게리폴딩된종은가장낮은농도의아세토니트릴에서용출되는데, 이는이러한종들이소수성내부가상기역상수지와의상호작용으로부터차폐되면서가장조밀하기때문이다. 응집된종은일반적으로더높은아세토니트릴농도에서용출된다. 잘못폴딩된단백질형태를목적하는형태로부터제거하는것에더하여, 역상단계는또한샘플로부터내독소를제거하였다. 목적하는바와같이폴딩된항-PD-L1 항체를함유하는분획을풀링하고, 상기용액에질소를부드럽게흐르게하여아세토니트릴을제거하였다. 투석에의해또는제제완충액으로평형화되고멸균여과된 G25 수퍼파인 ( 파마시아 ) 수지를사용한겔여과에의해, 단백질을 0.14 M 염화나트륨및 4% 만니톨을함유하는 20 mm Hepes (ph 6.8) 로제제화하였다. - 90 -
도면 도면 1-91 -