(52) CPC 특허분류 C07K 16/2809 ( ) C07K 16/283 ( ) C07K 16/32 ( ) C07K 16/44 ( ) A61K 2039/505 ( ) C07K 2317/34 ( ) C0

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 39/395 ( ) A61K 39/00 ( ) C07K 16/28 ( ) C07K 16/32 ( ) C07K 16/44 ( ) (52) CPC 특허분류 A61K 39/395 ( ) C07K 16/2803 ( ) (21) 출원번호 ( 분할 ) (22) 출원일자 ( 국제 ) 2009 년 12 월 17 일 심사청구일자 없음 (62) 원출원특허 원출원일자 ( 국제 ) 심사청구일자 2014 년 09 월 26 일 (85) 번역문제출일자 2017 년 07 월 27 일 (86) 국제출원번호 PCT/US2009/ (87) 국제공개번호 WO 2010/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 2010 년 07 월 15 일 2009 년 12 월 17 일 61/139, 년 12 월 19 일미국 (US) ( 뒷면에계속 ) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2017년08월07일 (71) 출원인 마크로제닉스, 인크. 미국메릴랜드주 록빌메디칼센터드라이브 9704 (72) 발명자 존슨레슬리에스 미국매릴랜드 단스타운파플라힐로드 후앙링 미국매릴랜드 베데스다모어랜드로드 8210 (74) 대리인 송봉식, 정삼영 전체청구항수 : 총 25 항 (54) 발명의명칭공유결합형디아바디및이의용도 (57) 요약 본발명은디아바디 (Diabody) 분자와, 면역질환, 감염증, 중독, 암을포함하는다양한질환및장애의치료에있어서그사용에관한것이다. 본발명의디아바디분자는동일또는다른항원상의동일또는다른에피토프를인식하는적어도 2 개의에피토프결합부위를형성하도록결합되어있는 2 개의폴리펩티드사슬을포함한다. 또한, 항원은동일또는다른분자에서유래해도좋다. 디아바디분자의각각의폴리펩티드사슬은, 비펩티드결합형공유결합을통하여공유결합되어있고, 예를들면, 각폴리펩티드사슬내에존재하는시스테인잔기의이황화결합에의해공유결합되어있을수있지만, 이것에한정되는것은아니다. 특정의구체예에서, 본발명의디아바디분자는해당분자에항체유사기능성을허용하는 Fc 영역을더포함한다. 대표도 - 1 -

2 (52) CPC 특허분류 C07K 16/2809 ( ) C07K 16/283 ( ) C07K 16/32 ( ) C07K 16/44 ( ) A61K 2039/505 ( ) C07K 2317/34 ( ) C07K 2317/52 ( ) C07K 2317/56 ( ) C07K 2317/626 ( ) (30) 우선권주장 61/156, 년 02 월 27 일미국 (US) 61/256, 년 10 월 30 일미국 (US) - 2 -

3 명세서청구범위청구항 1 제 1 폴리펩티드사슬과제 2 폴리펩티드사슬을포함하는디아바디분자로서, 상기폴리펩티드사슬은서로공유결합으로결합되고, 여기서, I. 상기제 1 폴리펩티드사슬은, N-말단에서 C-말단방향으로 (i) 에피토프 (1) 에특이적인제 1 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL1) 을포함하는제 1 도메인, (ii) 에피토프 (2) 에특이적인제 2 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH2) 을포함하는제 2 도메인, 및 (iii) 자발적으로나선형배좌 (helical conformation) 를취하는양성또는음성전하를띤폴리펩티드도메인을포함하고 ; 제 1 도메인과제 2 도메인은공유결합으로연결되어있지만, 제 1 도메인과제 2 도메인이상기에피토프 (1) 결합부위또는상기에피토프 (2) 결합부위를형성하도록함께회합 (association) 하는것은아니고 ; II. 상기제 2 폴리펩티드사슬은, N-말단에서 C-말단방향으로 (i) 상기에피토프 (2) 에특이적인제 2 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL2) 을포함하는제 4 도메인, (ii) 상기에피토프 (1) 에특이적인제 1 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH1) 을포함하는제 5 도메인, 및 (iii) 자발적으로나선형배좌를취하는음성또는양성전하를띤폴리펩티드도메인을포함하고, 상기제 1 및제 2 폴리펩티드사슬중하나는상기양성전하를띤폴리펩티드도메인을함유하고상기제 1 및제 2 폴리펩티드사슬의다른하나는상기음성전하를띤폴리펩티드도메인을함유하고 ; 제 4 도메인과제 5 도메인은공유결합으로연결되어있지만, 제 4 도메인과제 5 도메인이상기에피토프 (1) 결합부위또는상기에피토프 (2) 결합부위를형성하도록함께회합하는것은아니고 ; 제 1 도메인과제 5 도메인은상기에피토프 (1) 를결합하는결합부위 (VL1)(VH1) 를형성하도록함께회합하고 ; 및제 2 도메인과제 4 도메인은상기에피토프 (2) 를결합하는결합부위 (VL2)(VH2) 를형성하도록함께회합하는디아바디분자. 청구항 2 제 1항에있어서, 상기제 1 폴리펩티드사슬은상기전하를띤폴리펩티드도메인에의해상기제 2 도메인으로부터분리된제 3 도메인을추가로포함하고, 상기제 3 도메인은 Fc 도메인또는그일부인것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 3 제 1 항또는제 2 항에있어서, 상기제 2 폴리펩티드사슬은상기전하를띤폴리펩티드도메인에의해상기제 5 도메인으로부터분리된제 6 도메인을추가로포함하고, 상기제 6 도메인은 Fc 도메인또는그일부인것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 4 제 2 항에있어서, 상기디아바디는제 3 폴리펩티드사슬과제 4 폴리펩티드사슬을추가로포함하는디아바디분자로서, 상기제 3 및제 4 폴리펩티드사슬은서로공유결합으로결합되고, 여기서, III. 상기제 3 폴리펩티드사슬은, N-말단에서 C-말단방향으로 (i) 에피토프 (3) 에특이적인제 3 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL3) 을포함하는제 7 도메인, (ii) 에피토프 (4) 에특이적인제 4 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH2) 을포함하는제 8 도메인, (iii) 자발적으로나선형배좌를취하는양성또는음성전하를띤폴리펩티드도메인, 및 (iv) Fc 도메인또는그부분인제 9 도메인을포함하고 ; - 3 -

4 제 7 도메인과제 8 도메인은공유결합으로연결되어있지만, 제 1 도메인과제 2 도메인이상기에피토프 (3) 결합부위또는상기에피토프 (4) 결합부위를형성하도록함께회합하는것은아니고 ; IV. 상기제 4 폴리펩티드사슬은, N-말단에서 C-말단방향으로 (i) 상기에피토프 (4) 에특이적인제 4 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL2) 을포함하는제 10 도메인, (ii) 상기에피토프 (3) 에특이적인제 3 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH3) 을포함하는제 11 도메인, 및 (iii) 자발적으로나선형배좌를취하는음성또는양성전하를띤폴리펩티드도메인을포함하고, 상기제 3 및제 4 폴리펩티드사슬중하나는상기양성전하를띤폴리펩티드도메인을함유하고상기제 3 및제 4 폴리펩티드사슬의다른하나는상기음성전하를띤폴리펩티드도메인을함유하고 ; 제 10 도메인과제 11 도메인은공유결합으로연결되어있지만, 제 10 도메인과제 11 도메인이상기에피토프 (3) 결합부위또는상기에피토프 (4) 결합부위를형성하도록함께회합하는것은아니고 ; 제 7 도메인과제 11 도메인은상기에피토프 (3) 를결합하는결합부위 (VL3)(VH3) 를형성하도록함께회합하고 ; 및제 8 도메인과제 10 도메인은상기에피토프 (4) 를결합하는결합부위 (VL4)(VH4) 를형성하도록함께회합하는디아바디분자. 청구항 5 제 1 항내지제 4 항중어느한항에있어서, 자발적으로나선형배좌를취하는상기음성전하를띤폴리펩티드도메인은 E-코일 ( 서열번호 299) 인것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 6 제 1 항내지제 5 항중어느한항에있어서, 자발적으로나선형배좌를취하는상기양성전하를띤폴리펩티드도메인은 K-코일 ( 서열번호 300) 인것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 7 제 1 항에있어서, 상기제 1 폴리펩티드사슬은혈청단백질에결합하는단백질의폴리펩티드부분을추가로포함하고, 상기폴리펩티드부분은상기혈청단백질에결합할수있는것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 8 제 7 항에있어서, 상기제 2 폴리펩티드사슬은혈청단백질에결합하는단백질의폴리펩티드부분을추가로포함하고, 상기폴리펩티드부분은상기혈청단백질에결합할수있는것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 9 제 7 항또는제 8 항에있어서, 혈청단백질에결합하는상기단백질은알부민결합단백질인것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 10 제 9 항에있어서, 상기알부민결합단백질은연쇄상구균단백질 G이고, 상기폴리펩티드부분은상기연쇄상구균단백질 G의알부민-결합도메인 (ABD) 인것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 11 제 10 항에있어서, 상기연쇄상구균단백질 G의알부민결합단백질 (ABD) 는스트렙토코쿠스균주 G148(Streptococcus strain G148) 의단백질 G의알부민-결합도메인 (ABD) 인것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 12 제 7 항내지제 11 항중어느한항에있어서, 상기디아바디분자는 2시간초과의생체내혈청반감기를나타내는것을특징으로하는디아바디분자

5 청구항 13 제 1 항내지제 12 항중어느한항에있어서, CD32B의에피토프에결합하는도메인및 CD16의에피토프에결합하는도메인을갖는것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 14 제 1 항내지제 12 항중어느한항에있어서, 자연살해그룹 2D(NKG2D) 수용체에대한결합리간드인도메인을갖는것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 15 제 1 항내지제 12 항중어느한항에있어서, T-세포수용체 (TCR) 결합도메인에대한결합리간드인도메인을갖는디아바디분자. 청구항 16 제 1 항내지제 15 항중어느한항에있어서, 상기분자는종양-연관항원에결합하는것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 17 제 16 항에있어서, 상기종양-연관항원은유방암항원, 난소암항원, 전립선암항원, 자궁경부암항원, 췌장암항원, 폐암항원, 방광암항원, 결장암항원, 고환암항원, 교모세포종암항원, B 세포악성종양과관련된항원, 다발성골수종과관련된항원, 비-호지킨림프종과관련된항원, 또는만성림프구성백혈병과관련된항원인것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 18 제 16 항에있어서, 상기종양-연관항원은 A33; ADAM-9; ALCAM; B1; BAGE; 베타-카테닌 ; CA125; 카르복시펩티다아제 M; CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD28; CD32B; CD36; CD40; CD45; CD46; CD56; CD79a; CD79b; CD103; CD154; CDK4; CEA; CTLA4; 사이토케라틴 8; EGF-R; 에프린수용체 ; ErbB1; ErbB3; ErbB4; GAGE- 1; GAGE-2; GD2; GD3; GM2; gploo; HER-2/neu; 인간파필로마바이러스-E6; 인간파필로마바이러스-E7; 인테그린알파-V-베타-6; JAM-3; KID3; KID31; KSA(17-1A); LUCA-2; MAGE-1; MAGE-3; MART; MUC-1; MUM-1; N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 ; 온코스타틴 M( 온코스타틴수용체베타 ); p15; PIPA; PSA; PSMA; RAAG1O; ROR1; SART; stn; TES7; TNF-α 수용체 ; TNF-β 수용체 ; TNF-γ 수용체 ; 트랜스페린수용체또는 VEGF 수용체인것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 19 제 18 항에있어서, 상기종양-연관항원은 HER-2/neu인것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 20 제 1 폴리펩티드와제 2 폴리펩티드를포함하는디아바디분자로서, 상기제 1 폴리펩티드사슬및상기제 2 폴리펩티드사슬은서로공유결합으로연결되지만, 공유결합은펩티드결합이아니고, 여기서, 상기제 1 폴리펩티드사슬은, (i) CD32B에특이적인제 1 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL1) 을포함하는제 1 도메인, (ii) CD79B에특이적인제 2 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH2) 을포함하는제 2 도메인, 및 (iii) 적어도하나의시스테인잔기, 및 E-코일분리자 ( 서열번호 299) 또는 K-코일분리자 ( 서열번호 300) 를포함하는제 3 도메인을포함하고, 제 1 도메인과제 2 도메인은공유결합으로연결되어있지만, 제 1 도메인과제 2 도메인이상기제 1 에피토프결합부위또는상기에피토프 (2) 결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 상기제 2 폴리펩티드사슬은, (i) CD79b에특이적인제 2 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL2) 을포함하는제 4 도메인, (ii) CD32B에특이적인제 1 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH1) 을포함하는제 5 도메인, 및 (iii) 적어도하나의시스테인잔기, 및 E-코일분리자 ( 서열번호 299) 또는 K-코일 - 5 -

6 분리자 ( 서열번호 300) 를포함하는제 6 도메인을포함하고, 제 4 도메인과제 5 도메인은공유결합으로연결되어있지만, 제 4 도메인과제 5 도메인이에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 상기제 3 및제 6 도메인의상기시스테인잔기는상기제 1 및제 2 폴리펩티드사슬사이에서이황화결합을형성하고 ; 상기제 1 폴리펩티드사슬이상기 E-코일분리자를포함할때, 상기제 2 폴리펩티드사슬은상기 K-코일분리자를포함하고 ; 상기제 1 폴리펩티드사슬이 K-코일분리자를포함할때, 상기제 2 폴리펩티드사슬은 E-코일분리자를포함하고 ; 제 1 도메인과제 5 도메인은 CD32B에결합하는제 1 결합부위 (VL1)(VH1) 를형성하기위하여회합하고 ; 제 2 도메인과제 4 도메인은 CD79b에결합하는제 2 결합부위 (VL2)(VH2) 를형성하기위하여회합하는디아바디분자. 청구항 21 제 20 항에있어서, 상기제 1 폴리펩티드사슬또는상기제 2 폴리펩티드사슬은 Fc 도메인또는그부분을더포함하는것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 22 제 21 항에있어서, 상기 Fc 도메인또는그부분은상기 E-코일분리자또는상기 K-코일분리자에연결되는것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 23 제 21 항에있어서, 상기 Fc 도메인또는그부분은상기제 1 도메인또는상기제 4 도메인의 N-말단에연결되는것을특징으로하는디아바디분자. 청구항 24 제 1 항내지제 23 항중어느한항의디아바디분자및생리학적으로허용되는담체를포함하는약학적조성물. 청구항 25 암또는자가면역장애또는증상의치료를위한약제의제조에서제 1 항내지제 23 항중어느한항에따른디아바디분자, 또는제 24 항의약학적조성물의사용. 발명의설명 [0001] [0002] [0003] 기술분야본출원은미국특허출원제 60/671,657호 (2005년 4월 15일출원 ; 소멸 ); 11/409,339(2006년 4월 17일출원 ; 계류중 ); PCT/US06/014481(2006년 4월 17일출원 ; 소멸 ); 60/945,523(2007년 6월 21일출원 ; 소멸 ), 61/019,051(2008년 1월 4일출원 ; 소멸 ); 12/138,867(2008년 6월 13일출원, 계류중 ), PCT/US08/066957(2008 년 6월 13일출원, 계류중 ), 61/139,352(2008년 9월 19일출원, 계류중 ), 61/156,035(2009년 2월 27일출원, 계류중 ) 및 61/256,779(2009년 10월 30일출원 ; 계류중 ) 의이익을주장하는것으로, 이들출원의전체내용은참고문헌으로서본명세서에포함된다. 1. 발명의분야본발명은달리 " 이중친화성재표적화시약 "("DART") 으로도불리는디아바디 (diabody) 분자와면역질환이나암을포함하는다양한질환및장애의치료에있어서그사용에관한것이다. 본발명의디아바디분자는동일또는다른에피토프를인식하는적어도 2개의에피토프결합부위를형성하도록결합되어있는적어도 2개의폴리펩티드사슬을포함하는것이다. 또한, 에피토프는동일또는다른분자에유래해도, 동일또는다른세포상에위치해도좋다. 디아바디분자의각각의폴리펩티드사슬은, 비펩티드결합형공유결합을통하여공유결합되어있고, 예를들면, 각폴리펩티드사슬내에존재하는시스테인잔기의이황화결합에의해공유결합되어있지만, 이것에한정되는것은아니다. 특정의구체예에서, 본발명의디아바디분자는해당분자에항체유사기능성을 - 6 -

7 허용하는 Fc 영역을더포함한다. [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] 배경기술 2. 발명의배경공유결합형디아바디 (covalent diabody) 의설계는, 단일쇄 Fv 컨스트럭트 (scfv) 에기초하고있다 (Holliger et al.(1993) ''Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,' Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: ; 그전체가참고문헌으로서본발명에포함됨 ). 완전한비변형된 IgG에서는, VL 및 VH 도메인이각각의폴리펩티드사슬, 즉, 각각경쇄와중쇄에위치하고있다. 항체경쇄와항체중쇄의상호작용, 특히 VL 도메인및 VH 도메인의상호작용에의해, 이항체의에피토프결합부위의 1개가형성된다. 이에대하여, scfv 컨스트럭트에는항체의 VL 및 VH 도메인이단일의폴리펩티드사슬로포함되어있지만, 이들의도메인은기능성의에피토프결합부위로이들 2개의도메인이자기집합 (self-assembly) 하는것을가능하게하는, 충분한길이의유연성링커에의해분리되어있다. 링커의길이가불충분하기때문에 ( 약 12 아미노산잔기보다짧기때문에 ), 이들의도메인이자기집합할수없는경우에는, 2개의 scfv 컨스트럭트가상호작용하여 2가의분자를형성한다 (Marvin et al.(2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies", Acta Pharmacol. Sin. 26: ). 또한, 이컨스트럭트의 C 말단에시스테인잔기는그 2가분자의결합특성의방해없이안정화하는것을알수있다 ( 예를들면, Olafsen et al.(2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CE디아바디 Allows Site- Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27 참조 ). 더욱이, 특이성이다르게되어있는 VL 및 VH 도메인을선택하는경우에는, 2가뿐만아니라이중특이성을나타내는분자를구성하는것이가능하다. 2가의디아바디는치료나면역진단을포함하여광범위한용도를갖는다. 2가로하면다양한용도에서의디아바디의설계및공학적조작이상당히유연하게되고, 다량체항원에대한결합활성의향상, 다르게되어있는항원의가교, 양표적항원의존재에의존하는특정의세포형으로의직접적인디아바디가가능하게된다. 이들의증대한결합가, 낮은해리속도및 ( 약 50kDa 이하의작은사이즈의디아바디의경우는 ) 순환계로부터의빠른클리어런스 (clearance) 때문에, 당해기술분야에서공지된디아바디분자는종양이미징의분야에서도특별히사용하고있다 (Fitzgerald et al.(1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris," Protein Eng. 10: 1221). 다른세포의가교, 예를들면세포독성 T 세포의종양세포에의가교는특히중요하다 (Staerz et al.(1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells," Nature 314: ; 및 Holliger et al.(1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9: ). 디아바디의에피토프결합도메인은또한, T 림프구, 내추럴킬러 (NK) 세포또는다른단핵세포상에발현되는 CD3, CD16, CD32 또는 CD64와같은면역이펙터 (effector) 세포의표면결정기에도관련할수있다. 많은연구에있어서, 이펙터세포의결정기, 예를들면 Fcγ 수용체 (FcγR) 에의디아바디결합은또한이펙터세포를활성화하는것을발견하였다 (Holliger et al.(1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9: ; Holliger et al.(1999) " Car cino embryonic Antigen(CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD 3x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins," Cancer Res. 59: ). 통상, 이펙터세포의활성화는, 항원과결합한항체가 Fc-FcγR 상호작용을통하여이펙터세포에결합하는것에의해개시된다. 그러나, 이것과관련하여, 본발명의디아바디분자는이들이 Fc 도메인을포함할지여부에관한것이아니라, ( 예를들면, 당해기술분야에서알려진또는본명세서에예시된이펙터기능분석 ( 예, ADCC 분석 ) 으로분석할경우 ) Ig 유사기능을나타내는것이가능하다. 종양세포와이펙터세포를가교시키는것에의해, 디아바디는종양세포의가까이에이펙터세포를끌어당길뿐아니라, 종양의효과적인사멸을이끈다 (Cao et al.(2003) "Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics," Adv. Drug. Deliv. Rev. 55: , hereby incorporated by reference herein in its entirety). 2.1 이펙터세포수용체및면역계에있어서의그역할전통적인면역기능에서는항체-항원복합체와면역계의세포와의상호작용은광범위한반응을일으키고, 그범위는이펙터기능 ( 예, 항체의존성세포독성작용, 마스트세포 (mast cell) 탈과립및식작용 ) 부터면역조절시그널 ( 예, 림프구증식및항체분비의조절 ) 에이른다. 이들의상호작용은전부항체또는면역복합체의 Fc 도메인이조혈세포상의특수한세포표면수용체와결합하는것에의해개시된다. 항체와면역복합체에의해개시되는세포반응의다양성은, Fc 수용체의구조상의불균일성을통해개시된다. Fc 수용체는세포내시그널 - 7 -

8 전달을매개한다고생각되는구조적으로관련있는항원결합도메인을공유한다. [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] 단백질의면역글로불린유전자슈퍼패밀리의멤버인 Fcγ 수용체는, 면역글로불린분자의 Fcγ 부분과결합하는것이가능한표면당단백질이다. 이패밀리의각멤버는 Fcγ 수용체의알파 (α) 쇄상의인식도메인을통하여 1 이상의이소타입 (isotype) 의면역글로불린을인식한다. Fcγ 수용체는면역글로불린서브타입에대한그특이성에의해정의된다. IgG에대한 Fcγ 수용체는 FcγR로, IgE에대한것은 FcεR로, 그리고 IgA에대한것은 Fcα R로불린다. 여러가지악세서리세포가다른이소타입의항체에대한 Fcγ 수용체를갖고, 항체의이소타입이소정의반응에어느악세서리세포가관련되는지를결정한다 (reviewed by Ravetch J.V. et al.(1991) "Fc Receptors," Annu. Rev. Immunol. 9: ; Gerber J.S. et al.(2001) "Stimulatory And Inhibitory Signals Originating From The Macrophage Fcgamma Receptors," Microbes and Infection, 3: ; Billadeau D.D. et al.(2002),"itams Versus ITIMs: Striking A Balance During Cell Regulation," The Journal of Clinical Investigation, 2(109): ; Ravetch J.V. et al.(2000) "Immune Inhibitory Receptors," Science, 290: 84-89; Ravetch J.V. et al., (2001) "IgG Fc Receptors," Anmi. Rev. Immunol. 19:275-90; Ravetch J.V.(1994) "Fc Receptors: Rubor Redux," Cell, 78(4): ). The different Fcγ receptors, the cells that express them, and their isotype specificity is summarized in Table 1(adapted from Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New York). Fcγ 수용체이패밀리의각멤버는, 면역글로불린관련도메인의 C2 세트에관한세포외도메인, 1회막관통도메인및가변길이의세포질내도메인을갖는내재성막당단백질이다. 3종의공지의 FcγR이있고, 각각 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), and FcγRIII(CD16) 이라한다. 이 3종의수용체는다른유전자에의해코드되고 ; 그러나이 3종의패밀리멤버간의광범위한상동성은, 이들이공통의선조로부터, 유전자복제에의해발생한것임을시사한다 FcγRII(CD32) FcγRII 단백질은 40kDa의내재성막당단백질이고, 모노머 Ig에대하여저친화성 (10 6 M -1 ) 이기때문에복합체화한 IgG와만결합한다. 이수용체는단구, 마크로파지, B세포, NK 세포, 호중구, 마스트세포및혈소판을포함하여, 모든조혈세포상에존재하는가장광범위하게발현되는 FcγR이다. FcγRII는, 이면역글로불린결합쇄중에면역글로불린유사영역을 2개만갖고있고, 따라서 IgG에대하여 FcγRI 보다훨씬더낮은친화성을갖는다. 3종의인간 FcγRII 유전자 (FcγRII-A, FcγRII-B, FcγRII-C) 가존재하고, 이들은전부응집체또는면역복합체의 IgG과결합한다. FcγRII-A와 FcγRII-B의세포질내도메인내에는명확한차이가있기때문에, 수용체라이게이션 (ligation) 에대하여 2개의기능적으로이종의반응을창출한다. 기본적인차이는, A 이소형 (isoform) 이세포활성화 ( 예, 식작용및호흡버스트 (burst) 에이르는세포내시그널전달을개시하는반면, B 이소형은억제적시그널을개시하고, 예를들면 B 세포활성화를억제하는것에있다. FcγRIII(CD16) 이클래스의불균일성때문에, FcγRIII의사이즈는마우스및인간에서 40 내지 80kDa의범위에있다. 2개의인간유전자가 2종의전사산물을코드하고, 즉, 내재성막당단백질의 FcγRIIIA와, 글리코실포스파티딜- 이노시톨 (GPI) 결합형의 FcγRIIIB을코드한다. 1개의마우스유전자는막관통인간 FcγRIIIA에상동성의 FcγRIII를코드하고있다. FcγRIII는다른 2개의 FcγR의각각과구조상의특징을공유한다. FcγRII와같이, FcγRIII는낮은친화성으로 IgG와결합하고, 대응하는 2개의세포외 Ig 유사도메인을포함한다. FcγRIIIA는마크로파지, 마스트세포로발현되고, NK 세포에서는유일한 FcγR이다. GPI 결합형의 FcγRIIIB는현재인간호중구에서만발현되는것이알려져있다. FcγR을통한시그널전달활성화와억제양쪽의시그널은, 라이게이션후에 FcγR을통하여전달된다. 이들의정반대의기능은, 다른수용체이소형간의구조상의상위에기인한다. 수용체의세포질내시그널전달도메인내의 2개의다른도메인, 즉면역수용체티로신계활성화모티프 (ITAM) 또는면역수용체티로신계억제모티프 (ITIMS) 가, 이다른반응의원인으로된다. 이들의구조체에의다른세포질효소의회수 (recruitment) 가 FcγR 매개세포반응의결과를 - 8 -

9 규정한다. ITAM 함유 FcγR 복합체에는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA 가포함되어있지만, ITIM 함유복합체에는 FcγRIIB 만함유되어있다. [0019] 인간호중구는 FcγRIIA 유전자를발현한다. 면역복합체또는특이적항체가교를매개하는 FcγRIIA 클래스 형성은, ITAM 을 ITAM 인산화를용이하게하는수용체관련키나제와함께응집시키도록작용한다. ITAM 인산화 는 Syk 키나제에대한도킹영역로서작용하고, Syk 키나제의활성화는하류의기질 ( 예, PI 3 K) 의활성화를유도 한다. 세포활성화에의해전염증성매개체가방출된다. [0020] FcγRIIB 유전자는 B 림프구상에발현되고, 이세포외도메인은 FcγRIIA와 96% 동일하고, 식별가능하지않은형식으로 IgG 복합체와결합한다. FcγRIIB의세포외도메인중의 ITIM의존재가, FcγR의억제서브클래스를규정한다. 최근, 이억제의분자적기초가확립되었다. 활성화 FcγR와함께결합하면, FcγRIIB 중의 ITIM은인산화되고, 이노시톨폴리인산 5'-포스파타제 (SHIP) 의 SH2 도메인을끌어들이고, 이것이포스포이노시톨메신저 (ITAM 함유 FcγR 개재의티로신키나제활성화의결과로서방출된다 ) 를가수분해하고, 그결과세포내 Ca ++ 의 유입을억제한다. 따라서, FcγRIIB 의가교는, FcγR 라이게이션에대한활성화반응을소실시켜, 세포반응성 을억제한다. 따라서, B 세포활성화, B 세포증식및항체분비가정지된다. [0021] 표 1 면역글로불린이소형의 Fc 영역에대한수용체 수용체 결합 세포형 라이게이션의효과 FcγRI IgG1 마크로파지, 호중구, 흡수, 자극, 호흡기버스트의활 (CD64) 10 8 M -1 호산구, 수상세포 성화, 사멸유도 FcγRII-A (CD32) FcγRII-B2 (CD32) FcγRII-B1 (CD32) FcγRIII (CD16) FcεRI FcαRI (CD89) IgG1 2x10 6 M -1 IgG1 2x10 6 M -1 IgG1 2x10 6 M -1 IgG1 5x10 5 M -1 IgE M -1 IgA1, IgA M -1 마크로파지, 호중구, 호산구, 수상세포, 혈소판, 랑게르한스세포 마크로파지, 호중구, 호산구 흡수, 과립방출 흡수, 자극억제 B 세포, 마스트세포흡수없음, NK 세포, 호산구, 마크로파지, 호중구, 마스트세포 마스트세포, 호산구, 호염기구 마크로파지, 호중구, 호산구 자극억제 사멸유도 과립분비 흡수, 사멸유도 발명의내용 [0022] [0023] 해결하려는과제 3. 발명의개요본발명은, 공유결합형디아바디및 / 또는공유결합형디아바디분자, 및암, 자가면역질환, 알러지질환, 및세균, 진균또는바이러스가원인인감염증을포함하는각종의질환및장애의치료에있어서그사용에관한것이다. 바람직하게는, 본발명의디아바디는 2개의다른세포상의 2개의다른에피토프에결합하는것이가능하고, 여기서, 제 1 에피토프는제 2 에피토프와는다른세포형에발현되는것으로, 그결과디아바디는이들 2개의세포를모이게할수있다. [0024] 과제의해결수단 하나의구체예에있어서, 본발명은공유결합형이중특이성디아바디에관한것으로, 이디아바디는제 1 및 제 2 의폴리펩티드사슬을함유하고있고, 여기서, 제 1 폴리펩티드사슬은, (i) 제 1 에피토프에특이적인제 - 9 -

10 1 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL1) 을포함하는제 1 도메인, (ii) 제 2 에피토프에특이적인제 2 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH2) 을포함하는제 2 도메인, 및선택적으로 (iii) 적어도 1개의시스테인잔기를포함하는제 3 도메인을포함하고, 제 1 및제 2의도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 1 및제 2의도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 여기서, 제 2 폴리펩티드사슬은 (i) 제 2 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL2) 을포함하는제 4 도메인, (ii) 제 1 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH1) 을포함하는제 5 도메인, 및선택적으로 (iii) 적어도 1개의시스테인잔기를포함하는제 6 도메인을포함하고, 제 4 및제 5의도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 4 및제 5의도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 제 1 폴리펩티드사슬과제 2 폴리펩티드사슬은공유결합으로연결되어있지만, 이공유결합은펩티드결합이아니고 ; 이경우, 제 1 도메인과제 5 도메인이회합하여, 제 1 에피토프와결합하는제 1 결합부위 (VL1)(VH1) 을형성하고 ; 제 2 도메인과제 4 도메인이회합하여, 제 2 에피토프와결합하는제 2 결합부위 (VL2)(VH2) 를형성한다. [0025] [0026] [0027] 다른구체예에서, 본발명은공유결합형이중특이성디아바디에관한것으로, 이디아바디는제 1 및제 2의폴리펩티드사슬을포함하고, 여기서, 제 1 폴리펩티드사슬은, (i) 제 1 에피토프에특이적인제 1 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL1) 을포함하는제 1 도메인, (ii) 제 2 에피토프에특이적인제 2 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH2) 을포함하는제 2 도메인, 및 (iii) Fc 도메인또는그일부를포함하는제 3 도메인을포함하고, 제 1 및제 2의도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 1 및제 2의도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 여기서, 제 2 폴리펩티드사슬은 (i) 제 2 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL2) 을포함하는제 4 도메인, (ii) 제 1 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH1) 을포함하는제 5 도메인을포함하고, 제 4 및제 5의도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 3 및제 4의도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 제 1 폴리펩티드사슬과제 2 폴리펩티드사슬은공유결합으로연결되어있지만, 이공유결합은펩티드결합은아니고 ; 이경우, 제 1 도메인과제 5 도메인이회합하여, 제 1 에피토프와결합하는제 1 결합부위 (VL1)(VH1) 을형성하고 ; 제 2 도메인과제 4 도메인이회합하여, 제 2 에피토프와결합하는제 2 결합부위 (VL2)(VH2) 를형성한다. 특정의구체예에있어서, 본발명은디아바디분자에관한것으로, 이분자는제 1 및제 2의폴리펩티드사슬을함유하고있고, 여기서, 제 1 폴리펩티드사슬은, (i) 제 1 에피토프에특이적인제 1 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL1) 을포함하는제 1 도메인, (ii) 제 2 에피토프에특이적인제 2 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH2) 을포함하는제 2 도메인, 및 (iii) Fc 도메인또는그일부를포함하는제 3 도메인을포함하고, 제 1 및제 2의도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 1 및제 2의도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 여기서, 제 2 폴리펩티드사슬은 (i) 제 2 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL2) 을포함하는제 4 도메인, (ii) 제 1 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH1) 을포함하는제 5 도메인, 및 (iii) 적어도 1개의시스테인잔기를포함하는제 6 도메인을포함하고, 제 4 및제 5의도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 4 및제 5의도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 제 1 폴리펩티드사슬과제 2 폴리펩티드사슬은공유결합으로연결되어있지만, 이공유결합은펩티드결합은아니고 ; 이경우, 제 1 도메인과제 5 도메인이회합하여, 제 1 에피토프와결합하는제 1 결합부위 (VL1)(VH1) 을형성하고 ; 제 2 도메인과제 4 도메인이회합하여, 제 2 에피토프와결합하는제 2 결합부위 (VL2)(VH2) 를형성한다. 특정의구체예에있어서, 본발명은공유결합형이중특이성디아바디에관한것으로, 이디아바디는디아바디분자의 2량체이고, 각각의디아바디분자는제 1 및제 2의폴리펩티드사슬을함유하고있고, 여기서, 제 1 폴리펩티드사슬은, (i) 제 1 에피토프에특이적인제 1 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL1) 을포함하는제 1 도메인, (ii) 제 2 에피토프에특이적인제 2 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH2) 을포함하는제 2 도메인, 및 (iii) Fc 도메인또는그일부를포함하는제 3 도메인을포함하고, 제 1 및제 2 의도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 1 및제 2의도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 여기서, 제 2 폴리펩티드사슬은 (i) 제 2 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL2) 을포함하는제 4 도메인, (ii) 제 1 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH1) 을포함하는제 5 도메인, 및 (iii) 적어도 1개의시스테인잔기를포함하는제 6 도메인을포함하고, 제 4 및제 5의도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 4 및제 5의도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 각디아바디분자의제 1 폴리펩티드사슬과제 2 폴리펩티드사슬은공유결합으로연결되어있지만, 이공유결합은펩티드결합은아니고 ; 이경우, 각디아바디분자의제 1 도메인과제 5 도메인이회합하여, 제 1 에피토프와결합하는제 1 결합부위 (VL1)(VH1) 을형성하고 ; 각디아바디분자의제 2 도메인과제 4 도메인이회합하

11 여, 제 2 에피토프와결합하는제 2 결합부위 (VL2)(VH2) 를형성한다. [0028] [0029] [0030] [0031] 또한, 다른구체예에있어서, 본발명은공유결합형 4중특이성디아바디에관한것으로, 이디아바디는디아바디분자의 2량체이고, 제 1 디아바디분자는제 1 및제 2의폴리펩티드사슬을함유하고있고, 여기서, 제 1 폴리펩티드사슬은, (i) 제 1 에피토프에특이적인제 1 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL1) 을포함하는제 1 도메인, (ii) 제 2 에피토프에특이적인제 2 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH2) 을포함하는제 2 도메인, 및 (iii) Fc 도메인또는그일부를포함하는제 3 도메인을포함하고, 제 1 및제 2의도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 1 및제 2의도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 여기서, 제 2 폴리펩티드사슬은 (i) 제 2 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL2) 을포함하는제 4 도메인, (ii) 제 1 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH1) 을포함하는제 5 도메인, 및 (iii) 적어도 1개의시스테인잔기를포함하는제 6 도메인을포함하고, 제 4 및제 5의도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 4 및제 5의도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 제 1 폴리펩티드사슬과제 2 폴리펩티드사슬은공유결합으로연결되어있지만, 이공유결합은펩티드결합은아니고 ; 이경우, 제 1 도메인과제 5 도메인이회합하여, 제 1 에피토프와결합하는제 1 결합부위 (VL1)(VH1) 을형성하고 ; 제 2 도메인과제 4 도메인이회합하여, 제 2 에피토프와결합하는제 2 결합부위 (VL2)(VH2) 를형성하고 ; 그리고제 2 디아바디분자는제 1 및제 2의폴리펩티드사슬을함유하고있고, 여기서, 제 1 폴리펩티드사슬은, (i) 제 3 에피토프에특이적인제 3 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL3) 을포함하는제 1 도메인, (ii) 제 4 에피토프에특이적인제 4 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH4) 을포함하는제 2 도메인, 및 (iii) Fc 도메인또는그일부를포함하는제 3 도메인을포함하고, 제 1 및제 2의도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 1 및제 2의도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 여기서, 제 2 폴리펩티드사슬은 (i) 제 4 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL4) 을포함하는제 4 도메인, (ii) 제 3 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH3) 을포함하는제 5 도메인, 및 (iii) 적어도 1개의시스테인잔기를포함하는제 6 도메인을포함하고, 제 4 및제 5의도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 4 및제 5의도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 제 1 폴리펩티드사슬과제 2 폴리펩티드사슬은공유결합으로연결되어있지만, 이공유결합은펩티드결합은아니고 ; 이경우, 제 1 도메인과제 5 도메인이회합하여, 제 3 에피토프와결합하는제 1 결합부위 (VL3)(VH3) 을형성하고 ; 제 2 도메인과제 4 도메인이회합하여, 제 4 에피토프와결합하는제 2 결합부위 (VL4)(VH4) 를형성한다. 본발명의특정의구체예에있어서, 제 1 에피토프, 제 2 에피토프, 적절히제 3 에피토프, 및제 4 에피토프는동일할수있다. 다른구체예에서는, 제 1 에피토프, 제 2 에피토프, 적절히제 3 에피토프, 및제 4 에피토프가다른것과각각다를수있다. 제 3 에피토프의결합도메인을포함하는본발명의특정구체예에서는, 제 1 에피토프와제 3 에피토프가동일할수있다. 제 4 에피토프의결합도메인을포함하는본발명의특정구체예에서는, 제 1 에피토프와제 4 에피토프가동일할수있다. 제 3 에피토프의결합도메인을포함하는본발명의특정구체예에서는, 제 2 에피토프와제 3 에피토프가동일할수있다. 제 4 에피토프의결합도메인을포함하는본발명의특정구체예에서는, 제 2 에피토프와제 4 에피토프가동일할수있다. 제 3 에피토프의결합도메인과제 4 에피토프의결합도메인을포함하는본발명의또다른구체예에서는, 제 3 에피토프와제 4 에피토프는다를수있다. 상기의임의의조합은본발명에포함되는것으로이해되어야한다. 본발명의특정의구체예에있어서, 디아바디또는디아바디분자의제 1 도메인과제 5 도메인을동일의면역글로불린으로부터유도하는것이가능하다. 다른구체예에서는, 디아바디또는디아바디분자의제 2 도메인과제 4 도메인을동일의면역글로불린으로부터유도하는것이가능하다. 또다른구체예에서는, 디아바디또는디아바디분자의제 1 도메인과제 5 도메인을다른면역글로불린으로부터유도하는것이가능하다. 또다른구체예에서는, 디아바디또는디아바디분자의제 2 도메인과제 4 도메인을다른면역글로불린으로부터유도하는것이가능하다. 상기의임의의조합은본발명에포함되는것으로이해되어야한다. 본발명의특정의구체예에있어서, 디아바디또는디아바디분자의제 1 폴리펩티드사슬과제 2 폴리펩티드사슬사이의공유결합은, 제 1 폴리펩티드사슬상의적어도 1개의시스테인잔기와제 2 폴리펩티드사슬상의적어도 1개의시스테인잔기사이의이황화결합을통한것일수있다. 이황화결합에관여하는제 1 또는제 2 폴리펩티드사슬상의시스테인잔기는, 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5 또는제 6의도메인내를포함하고, 폴리펩티드사슬상의어느곳에존재해도좋다. 특정의구체예에서는, 제 1 폴리펩티드사슬상의시스테인잔기는제 1 도메인에, 그리고제 2 폴리펩티드사슬상의시스테인잔기는제 5 도메인에존재한다. 제 1, 제 2, 제 4 및제 5의도메인은결합에관여하는가변영역에상당한다. 바람직한구체예에서는, 제 1 및제 2 폴리펩티드사슬

12 사이의술피드결합에관여하는시스테인잔기는, 각각제 3 및제 6의도메인내에위치된다. 이구체예의특정의측면에서는, 제 1 폴리펩티드사슬의제 3 도메인은서열번호 17의아미노산서열에의해코드되는 κ 경쇄의 C 말단의 6 아미노산, FNRGEC( 서열번호 23) 을포함한다. 이구체예의다른측면에서는, 제 2 폴리펩티드사슬의제 6 도메인은서열번호 17의아미노산서열에의해코드되는 κ 경쇄의 C 말단의 6 아미노산, FNRGEC( 서열번호 23) 을포함한다. 이구체예의또다른측면에서는, 제 1 폴리펩티드사슬의제 3 도메인은서열번호 78 의뉴클레오티드서열에의해코드되는인간 IgG의힌지도메인으로부터유도되는아미노산서열 VEPKSC( 서열번호 77) 을포함한다. 이구체예의또다른측면에서는, 제 2 폴리펩티드사슬의제 6 도메인은서열번호 78의뉴클레오티드서열에의해코드되는인간 IgG의힌지도메인으로부터유도되는아미노산서열 VEPKSC( 서열번호 77) 을포함한다. 이구체예의또다른측면에서는, 제 1 폴리펩티드사슬의제 3 도메인은인간 κ 경쇄의 C 말단의 6 아미노산 FNRGEC( 서열번호 23) 을포함하고, 그리고제 2 폴리펩티드사슬의제 6 도메인은아미노산서열 VEPKSC( 서열번호 77) 을포함한다. 이구체예의또다른측면에서는, 제 2 폴리펩티드사슬의제 6 도메인은인간 κ 경쇄의 C 말단의 6 아미노산 FNRGEC( 서열번호 23) 을포함하고, 그리고제 1 폴리펩티드사슬의제 3 도메인은아미노산서열 VEPKSC( 서열번호 77) 을포함한다. 이구체예의또다른측면에서는, 제 1 폴리펩티드사슬의제 3 도메인은인간 κ 경쇄의 C 말단의 6 아미노산 FNRGEC( 서열번호 23) 을포함하고, 그리고제 2 폴리펩티드사슬의제 6 도메인은힌지도메인을포함한다. 이구체예의또다른측면에서는, 제 2 폴리펩티드사슬의제 6 도메인은인간 κ 경쇄의 C 말단의 6 아미노산 FNRGEC( 서열번호 23) 을포함하고, 그리고제 1 폴리펩티드사슬의제 3 도메인은힌지도메인을포함한다. 이구체예의또다른측면에서는, 제 1 폴리펩티드사슬의제 3 도메인은인간 κ 경쇄의 C 말단의 6 아미노산 FNRGEC( 서열번호 23) 을포함하고, 그리고제 2 폴리펩티드사슬의제 6 도메인은 Fc 도메인또는그일부를포함한다. 이구체예의또다른측면에서는, 제 2 폴리펩티드사슬의제 6 도메인은인간 κ 경쇄의 C 말단의 6 아미노산 FNRGEC( 서열번호 23) 을포함하고, 그리고제 1 폴리펩티드사슬의제 3 도메인은 Fc 도메인또는그일부를포함한다. [0032] [0033] [0034] 다른구체예에있어서, 이황화결합에관여하는제 1 또는제 2 폴리펩티드사슬상의시스테인잔기는, 제 1 폴리펩티드사슬의제 1, 제 2 또는제 3 도메인의외측에, 그리고제 2 폴리펩티드사슬의제 4, 제 5 또는제 6 도메인의외측에위치하여도좋다. 특히, 제 1 폴리펩티드사슬상의시스테인잔기는제 1 도메인의 N-말단, 또는제 1 도메인의 C-말단에존재할수있다. 제 1 폴리펩티드사슬상의시스테인잔기는제 2 도메인의 N-말단, 또는제 2 도메인의 C-말단에존재할수있다. 제 1 폴리펩티드사슬상의시스테인잔기는제 3 도메인의 N-말단, 또는제 3 도메인의 C-말단에존재해도좋다. 또한, 제 2 폴리펩티드사슬상의시스테인잔기는제 4 도메인의 N-말단, 또는제 4 도메인의 C-말단에존재할수있다. 제 2 폴리펩티드사슬상의시스테인잔기는제 5 도메인의 N-말단, 또는제 5 도메인의 C-말단에존재할수있다. 이에따라, 제 2 폴리펩티드사슬상의시스테인잔기는제 6 도메인의 C-말단, 또는제 6 도메인의 N-말단에존재할수있다. 특정의구체예에서는, 이황화결합은, 제 1 폴리펩티드사슬상의적어도 2개의시스테인잔기와제 2 폴리펩티드사슬상의적어도 2개의시스테인잔기사이에있다. 제 3 도메인과제 6 도메인이 Fc 도메인또는그일부를포함하지않는특정의구체예에서는, 시스테인잔기가제 1 폴리펩티드사슬의 C-말단에있고, 또한제 2 폴리펩티드사슬의 C-말단에있다. 상술한임의의조합은본발명에포함되는것으로이해되어야한다. 상기한본발명의특정의구체예에있어서, 본발명의공유결합형디아바디는디아바디분자의 2량체 ( 각디아바디분자가제 1 및제 2의폴리펩티드사슬을포함한다 ) 를포함한다. 이구체예의어느측면에서는, 디아바디분자끼리가공유결합으로연결되어 2량체를형성하고있지만, 이공유결합은펩티드결합은아니다. 이구체예의바람직한측면에서는, 공유결합이 2량체의각디아바디분자의제 1 폴리펩티드사슬상의적어도 1개의시스테인잔기사이의이황화결합이다. 본발명의더욱바람직한구체예에서는, 공유결합이 2량체를형성하고있는각디아바디분자의제 1 폴리펩티드사슬상의적어도 1개의시스테인잔기사이의이황화결합이지만, 상기적어도 1개의시스테인잔기가각제 1 폴리펩티드사슬의제 3 도메인에존재한다. 본발명의어떠한구체예에있어서, 제 1 폴리펩티드사슬상의제 1 도메인이제 2 도메인의 N-말단에있어도, 제 2 도메인의 C-말단에있어도좋다. 제 1 폴리펩티드사슬상의제 1 도메인은제 3 도메인의 N-말단에있어도, 제 3 도메인의 C-말단에있어도좋다. 제 1 폴리펩티드사슬상의제 2 도메인은제 1 도메인의 N-말단에있어도, 제 1 도메인의 C-말단에있어도좋다. 또한, 제 1 폴리펩티드사슬상의제 2 도메인은제 3 도메인의 N-말단에있어도, 제 3 도메인의 C-말단에있어도좋다. 이에따라, 제 1 폴리펩티드사슬상의제 3 도메인은제 1 도메인의 N-말단에있어도, 제 1 도메인의 C-말단에있어도좋다. 제 1 폴리펩티드사슬상의제 3 도메인은제 2 도메인의 N-말단에있어도, 제 2 도메인의 C-말단에있어도좋다. 제 2 폴리펩티드사슬과관련하여, 제 4 도메인이제 5 도메인의 N-말단에있어도, 제 5 도메인의 C-말단에있어도좋다. 제 4 도메인은제 6 도메인의 N-말단에있어도, 제 6 도메인의 C-말단에있어도좋다. 제 2 폴리펩티드사슬상의제 5 도메인은제 4 도

13 메인의 N-말단에있어도, 제 4 도메인의 C-말단에있어도좋다. 제 2 폴리펩티드사슬상의제 5 도메인은제 6 도메인의 N-말단에있어도, 제 6 도메인의 C-말단에있어도좋다. 이에따라, 제 2 폴리펩티드사슬상의제 6 도메인은제 4 도메인의 N-말단에있어도, 제 4 도메인의 C-말단에있어도좋다. 제 2 폴리펩티드사슬상의제 6 도메인은제 5 도메인의 N-말단에있어도, 제 5 도메인의 C-말단에있어도좋다. 상술한임의의조합은본발명에포함되는것으로이해되어야한다. [0035] [0036] [0037] 특정의구체예에서, 제 1 도메인과제 2 도메인은제 1 폴리펩티드사슬상의제 3 도메인의 C-말단에존재해도좋고, 또는제 1 도메인과제 2 도메인은제 1 폴리펩티드사슬상의제 3 도메인의 N-말단에존재해도좋다. 제 2 폴리펩티드사슬과관련하여, 제 4 도메인과제 5 도메인은제 6 도메인의 C-말단에존재해도좋고, 또는제 4 도메인과제 5 도메인은제 6 도메인의 N-말단에존재해도좋다. 이구체예의특정의측면에서는, 본발명은공유결합형이중특이성디아바디와관련있고, 이디아바디는디아바디분자의 2량체이고, 각디아바디분자는제 1 및제 2 폴리펩티드사슬을포함하고, 여기서제 1 폴리펩티드사슬은, (i) 제 1 에피토프에특이적인제 1 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL1) 을포함하는제 1 도메인, (ii) 제 2 에피토프에특이적인제 2 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH2) 을포함하는제 2 도메인, 및 (iii) Fc 도메인또는그일부를포함하는제 3 도메인을포함하고, 제 1 및제 2 도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 1 및제 2 도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고, 제 3 도메인은제 1 도메인과제 2 도메인양쪽의 N-말단측에있고 ; 여기서, 제 2 폴리펩티드사슬은, (i) 제 2 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL2) 을포함하는제 4 도메인, (ii) 제 1 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH1) 을포함하는제 5 도메인, 및 (iii) 적어도 1개의시스테인잔기를포함하는제 6 도메인을포함하고, 제 4 및제 5 도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 4 및제 5 도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 각디아바디분자의제 1 폴리펩티드사슬과제 2 폴리펩티드사슬은공유결합으로연결되어있지만, 각공유결합은펩티드결합은아니고 ; 이경우, 각디아바디분자의제 1 도메인과제 5 도메인이회합하여, 제 1 에피토프와결합하는제 1 결합부위 (VL1)(VH1) 를형성하고 ; 각디아바디분자의제 2 도메인과제 4 도메인이회합하여, 제 2 에피토프와결합하는제 2 결합부위 (VL2)(VH2) 를형성하고있다. 또한, 다른구체예에서, 본발명은공유결합형 4중특이성디아바디와관련있고, 이디아바디는디아바디분자의 2량체이고, 제 1 디아바디분자는제 1 및제 2 폴리펩티드사슬을포함하고, 여기서제 1 폴리펩티드사슬은, (i) 제 1 에피토프에특이적인제 1 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL1) 을포함하는제 1 도메인, (ii) 제 2 에피토프에특이적인제 2 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH2) 을포함하는제 2 도메인, 및 (iii) Fc 도메인또는그일부를포함하는제 3 도메인을포함하고, 제 1 및제 2 도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 1 및제 2 도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고, 제 3 도메인은제 1 도메인과제 2 도메인양쪽의 N-말단측에있고 ; 여기서, 제 2 폴리펩티드사슬은, (i) 제 2 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL2) 을포함하는제 4 도메인, (ii) 제 1 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH1) 을포함하는제 5 도메인, 및 (iii) 적어도 1개의시스테인잔기를포함하는제 6 도메인을포함하고, 제 4 및제 5 도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 4 및제 5 도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 제 1 폴리펩티드사슬과제 2 폴리펩티드사슬은공유결합으로연결되어있지만, 각공유결합은펩티드결합은아니고 ; 이경우, 제 1 도메인과제 5 도메인이회합하여, 제 1 에피토프와결합하는제 1 결합부위 (VL1)(VH1) 를형성하고 ; 제 2 도메인과제 4 도메인이회합하여, 제 2 에피토프와결합하는제 2 결합부위 (VL2)(VH2) 를형성하고 ; 그리고제 2 디아바디분자는제 1 및제 2 폴리펩티드사슬을포함하고, 여기서제 1 폴리펩티드사슬은, (i) 제 3 에피토프에특이적인제 3 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL3) 을포함하는제 1 도메인, (ii) 제 4 에피토프에특이적인제 4 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH4) 을포함하는제 2 도메인, 및 (iii) Fc 도메인또는그일부를포함하는제 3 도메인을포함하고, 제 1 및제 2 도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 1 및제 2 도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고, 제 3 도메인은제 1 도메인과제 2 도메인양쪽의 N-말단측에있고 ; 여기서, 제 2 폴리펩티드사슬은, (i) 제 4 면역글로불린의경쇄가변도메인의결합영역 (VL4) 을포함하는제 4 도메인, (ii) 제 3 면역글로불린의중쇄가변도메인의결합영역 (VH3) 을포함하는제 5 도메인, 및 (iii) 적어도 1개의시스테인잔기를포함하는제 6 도메인을포함하고, 제 4 및제 5 도메인이공유결합으로연결되어있지만, 제 4 및제 5 도메인은에피토프결합부위를형성하도록회합하는것은아니고 ; 제 1 폴리펩티드사슬과제 2 폴리펩티드사슬은공유결합으로연결되어있지만, 각공유결합은펩티드결합은아니고 ; 이경우, 제 1 도메인과제 5 도메인이회합하여, 제 3 에피토프와결합하는제 1 결합부위 (VL3)(VH3) 를형성하고 ; 제 2 도메인과제 4 도메인이회합하여, 제 4 에피토프와결합하는제 2 결합부위 (VL4)(VH4) 를형성하고있다. 상기한바와같이, 각각의폴리펩티드사슬상의도메인은공유결합으로연결되어있다. 특정의구체예에서는,

14 제 1 및제 2 도메인사이, 제 1 및제 3 도메인사이, 제 2 및제 3 도메인사이, 제 4 및제 5 도메인사이, 제 4 및제 6 도메인사이, 및 / 또는제 5 및제 6 도메인사이의공유결합은펩티드결합일수있다. 특히, 제 1 및제 2 도메인, 및제 4 및제 5 도메인이결합부위를형성하도록결합하지않는한, 제 1 및제 2 도메인, 및제 4 및제 5 도메인은각각제 3 도메인및제 6 도메인에의해, 또는추가의아미노산잔기에의해분리되어있어도좋다. 아미노산잔기의수는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개의아미노산잔기여도좋다. 하나의바람직한면에서는, 도메인사이의아미노산잔기의수는 8개이다. [0038] 본발명의특정의구체예에서, Fc 도메인을포함한느제 1 및제 2 폴리펩티드사슬의도메인 ( 즉, 경우에따라, 각각제 3 및제 6 도메인 ) 은, 이도메인이힌지-Fc 영역을포함하도록힌지도메인을더포함할수있다. 이와는다른구체예에서는, 제 1 폴리펩티드사슬또는제 2 폴리펩티드사슬이, Fc 도메인의포함없이힌지도메인을포함할수있다. 본발명에서이용하는중쇄, 경쇄, 힌지영역, Fc 도메인및 / 또는힌지-Fc 도메인은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM을포함하여어떠한면역글로불린형으로부터유래하는것이어도좋다. 바람직한구체예에서는, 면역글로불린은 IgG 또는이것의어떠한서브타입, 즉 IgG 1, IgG 2, IgG 3 또는 IgG 4 이다. 다른구체예에 서는, 경쇄및중쇄가유래되는면역글로불린은인간화또는키메라화된것이다. [0039] [0040] [0041] [0042] 또한, 디아바디또는디아바디분자가결합하는제 1 에피토프와제 2 에피토프, 적절히, 제 3 에피토프와제 4 에피토프는, 동일의항원에유래하는다른에피토프여도, 다른항원에유래하는다른에피토프여도좋다. 항원은항체를생성하는것이가능한어떠한분자여도좋고, 예를들면, 단백질, 핵산, 세균독소, 세포표면마커, 자가면역마커, 바이러스단백질, 약물등이다. 특정의구체예에서는, 디아바디의적어도 1개의에피토프결합부위는, B 세포, T 세포, 식세포, 네츄럴킬러 (NK) 세포, 수상세포와같은특정의세포상의항원에대하여특이적이다. 본구체예의특정의측면에서, 디아바디또는디아바디분자의적어도 1개의에피토프결합부위는 Fc 수용체에특이적이고, 이 Fc 수용체는활성화성 Fc 수용체또는억제성 Fc 수용체일수있다. 특정의구체예에서는, Fc 수용체가 Fcγ 수용체이고, Fcγ 수용체는 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII 수용체이다. 보다바람직한구체예에서는, FcγRIII 수용체가 FcγRIIIA(CD16A) 수용체또는 FcγRIIIB(CD16B) 수용체이고, 더바람직한구체예에서는, FcγRIII 수용체가 FcγRIIIA(CD16A) 수용체이다. 다른바람직한구체예에서는, FcγRII 수용체가 Fcγ RIIA(CD32A) 수용체또는 FcγRIIB(CD32B) 수용체이고, 더바람직하게는, FcγRIIB(CD32B) 수용체이다. 특히바람직한구체예에서는, 디아바디의 1개의결합부위가 CD32B에특이적이고, 다른결합부위가 CD16A에특이적이다. 본발명의특정의구체예에서는, 디아바디또는디아바디분자의적어도 1개의에피토프결합부위가활성화성 Fc 수용체에특이적이고, 적어도 1개의다른부위가억제성 Fc 수용체에특이적이다. 이구체예의어느측면에서는, 활성화성 Fc 수용체가 CD32A이고, 억제성 Fc 수용체가 CD32B이다. 이구체예의다른측면에서는, 활성화성 Fc 수용체가 BCR이고, 억제성 Fc 수용체가 CD32B이다. 이구체예의또다른측면에서는, 활성화성 Fc 수용체가 IgERI이고, 억제성 Fc 수용체가 CD32B이다. 1개의에피토프결합부위가 CD16A에특이적인경우에는, VL 및 VH 도메인이마우스항체 3G8( 이서열은클론되어있고, 본명세서에나타낸다 ) 의 VL 및 VH 도메인과동일해도좋고, 유사해도좋다. 1개의에피토프결합부위가 CD32A에특이적인다른경우에는, VL 및 VH 도메인이마우스항체 IV.3의 VL 및 VH 도메인과동일해도좋고, 유사해도좋다. 1개의에피토프결합부위가 CD32B에특이적인또다른경우에는, VL 및 VH 도메인이마우스항체 2B6( 이서열은클론되어있고, 본명세서에나타낸다 ) 의 VL 및 VH 도메인과동일해도좋고, 유사해도좋다. 3G8, 2B6 및 IV.3 항체의 VL 또는 VH 도메인의어느것이나임의의조합으로사용할수있는것으로이해되어야한다. 본발명은또한제 1 에피토프가 CD32B에특이적이고, 제 2 에피토프가 CD16A에특이적인이중특이성디아바디또는디아바디분자에관한것이다. 다른구체예에서는, 에피토프결합부위가병원성항원에특이적일수있다. 본명세서에서사용하는병원성항원이란, 암, 감염증, 자가면역질환을포함하는특정의병원성질환과관련된항원일수있다. 따라서, 병원성항원은종양항원, 세균항원, 바이러스항원또는자가면역항원일수있다. 병원성항원의예로서는, 한정하는것은아니지만, 리포다당, 인간면역결핍바이러스, 아데노바이러스, 호흡기다핵체바이러스, 웨스트나일바이러스 ( 예, E16 및 / 또는 E53 항원 ) 및간염바이러스에서유래하는바이러스항원으로이루어지는군에서선택되는바이러스항원, 핵산 (DNA 및 RNA), 및콜라겐을들수있다. 바람직하게는, 병원성항원은중화항원이다. 바람직한구체예에있어서, 한쪽의에피토프결합부위가 CD16A 또는 CD32A에특이적인경우, 다른쪽의에피토프결합부위는자가면역항원을제외한병원성항원에특이적이다. 또다른바람직한구체예에있어서, 한쪽의에피토프결합부위가 CD32B에특이적인경우, 다른쪽의에피토프결합부위는어떠한병원성항원에도특

15 이적이다. 특정의구체예에서는, 본발명의디아바디분자는동일세포상의 2개의다른항원에결합하고, 예를들면, 한쪽의항원결합부위는활성화성 Fc 수용체에특이적이지만, 다른쪽은억제성 Fc 수용체에특이적이다. 다른구체예에서는, 디아바디분자는 2개의다른바이러스중화성에피토프 ( 예, 웨스트나일바이러스의 E16 및 E53이지만, 이에한정되는것은아니다 ) 에결합한다. [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] 본발명의또다른구체예에있어서, 본발명의디아바디를이용하여다양한질환이나장애를치료할수있다. 따라서, 본발명은유효량의본발명의공유결합형디아바디또는디아바디분자를, 이것을필요로하는환자에투여하는것을포함하여이루어지는질환또는장애의치료방법에관한것으로, 이디아바디또는디아바디분자는, 적어도 1개의결합부위가암세포의표면또는세균이나바이러스입자의표면에발현되는항원과같은병원성항원에특이적이고, 적어도 1개의다른결합부위가 Fc 수용체 ( 예로서, CD16A) 에특이적이다. 또다른구체예에있어서, 본발명은유효량의본발명의공유결합형디아바디또는디아바디분자를, 이것을필요로하는환자에투여하는것을포함하여이루어지는질환또는장애의치료방법에관한것으로, 이디아바디또는디아바디분자는, 적어도 1개의결합부위가 CD32B에특이적이고, 적어도 1개의다른결합부위가 CD16A에특이적이다. 또다른구체예에있어서, 본발명은유효량의본발명의공유결합형디아바디또는디아바디분자를, 이것을필요로하는환자에투여하는것을포함하여이루어지는, 병원성항원에대한면역내성의유발방법에관한것으로, 이디아바디또는디아바디분자는, 적어도 1개의결합부위가 CD32B에특이적이고, 적어도 1개의다른결합부위가이병원성항원에특이적이다. 이구체예의어느측면에서는, 병원성항원은알러겐 (allergen) 또는면역내성이요망되는다른분자, 예로서이식한조직에발현되는단백질과같은것일수있다. 또다른구체예에있어서, 본발명은유효량의본발명의공유결합형디아바디또는디아바디분자를, 이것을필요로하는환자에투여하는것을포함하여이루어지는해독방법에관한것으로, 이디아바디또는디아바디분자는, 적어도 1개의결합부위가세포표면마커에특이적이고, 적어도 1개의다른결합부위가해독에특이적이다. 특정의구체예에서는, 투여되는본발명의디아바디는, 1개의결합부위가 Fc와같은세포표면마커에특이적이고, 다른결합부위가세포독소또는약물에특이적이다. 어는구체예에서는, 세포표면마커는적혈구상에존재하지않는것이다. 3.1 정의특별히정의하지않는한, 본명세서에서사용하는모든기술용어, 표기법, 그외과학용어또는전문용어는, 본발명이속하는기술분야의당업자가통상이해하는의미를갖는것으로한다. 어떤경우에는, 통상이해되는용어라도, 명확성및 / 또는참고로본명세서중에정의되지만, 이러한정의를본명세서에포함하여도, 당기술분야에서일반적으로이해되고있는의미에대해반드시큰상이점을나타낸다고해석되어서는안된다. 본발명의실시에는, 특히따로나타내지않는한, 당업자가용이하게예상할수있는분자생물학 ( 재조합기술포함 ), 미생물학, 세포생물학, 생화학, 핵산화학, 및면역학의분야의관용기술을이용하는것으로한다. 이와같은기술은문헌에상세히설명되어있고, 예를들면 Current Protocols in Immunology(J. E. Coligan et al, eds., 1999, including supplements through 2001); Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2001); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition(sambrook and Russel, 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); The Immunoassay Handbook(D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques(Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); Methods of Immunological Analysis(R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbh, 1993), Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999; and Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000) 을참조할수있다. 본명세서중에사용하는용어 " 항체 " 는, 단일클론, 다중특이성항체, 인간항체, 인간화항체, 합성항체, 키메라항체, 낙타화항체, 단일쇄 Fvs(scFv), 단일쇄항체, Fab 항체, F(ab') 단편, 이황화결합이중특이성 Fvs(sdFv), 세포내발현항체 (intrabody), 및항이디오타입 (anti-id) 항체 ( 예를들면, 본발명의항체에대한항Id 및항-항Id 항체를포함 ), 및상기의어떠한것의에피토프결합단편을의미한다. 특히, 항체는, 면역글로불린분자및면역글로불린분자의면역활성단편, 즉항원결합부위를함유하는분자를포함한다. 면역글로불린분자는어떠한타입 ( 예를들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 및클래스 (IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4,

16 IgA 1 및 IgA 2 ) 또는서브클래스여도좋다. [0050] [0051] [0052] 본명세서중에사용하는 " 면역특이적결합 "," 면역특이적인식 "," 특이적결합 "," 특이적인식 " 및이들과유사한용어는, 항원 ( 예를들면, 에피토프또는면역복합체 ) 와특이적으로결합하지만, 다른분자와는특이적으로결합하지않는분자를의미한다. 항원과특이적으로결합하는분자는, 예를들면면역분석 (immunoassay), BIAcore 또는당기술분야에서알려진다른분석으로측정하여, 보다낮은친화성으로다른펩티드또는폴리펩티드와결합하여도좋다. 바람직하게는, 항원과특이적으로결합하는분자는, 다른단백질과교차반응하지않는다. 항원과특이적으로결합하는분자는, 예를들면, 면역분석, BIAcore 또는당업자에게알려진다른기법에의해동정할수있다. 본명세서중에사용하는용어 " 면역복합체 " 란, 적어도 1개의표적분자와적어도 1개의이종 Fcγ 영역함유폴리펩티드가서로결합하여, 보다큰분자량의복합체를형성할때생기는구조체를의미한다. 면역복합체의예는, 항원-항체복합체이고, 이는가용성이어도입자상 ( 예, 세포표면상의항원 / 항체복합체 ) 이어도좋다. 본명세서중에사용하는용어 " 중쇄 "," 경쇄 "," 가변영역 "," 프레임워크 (framework) 영역 "," 불변도메인 (constant domain)" 등이란, 면역학분야에서각기통상의의미를가지고, 천연의면역글로불린중의도메인및합성 ( 예, 재조합 ) 결합단백질 ( 예, 인간화항체, 단일쇄항체, 키메라항체등 ) 의대응하는도메인을의미한다. 천연의면역글로불린 ( 예, IgG) 의기본적인구조단위는, 2개의경쇄와 2개의중쇄를갖는 4량체이고, 통상은약 150,000Da의당단백질로서발현된다. 각쇄의아미노말단 ("N") 부분은, 주로항원인식에관여하는약 100 내지 110 또는그이상의아미노산으로이루어지는가변영역을포함한다. 각쇄의카복시말단 ("C") 부분은정상영역을규정하고있고, 경쇄가 1개의불변도메인을함유하고, 중쇄가통상 3개의불변도메인과힌지영역을갖는다. 따라서, IgG 분자의경쇄의구조는 n-v L -C L -c이고, IgG 분자의중쇄의구조는 n-v H -C H1 -H-C H2 -C H3 -c( 여기서, H는 힌지영역 ) 이다. IgG 분자의가변영역은, 항원과접촉하는잔기를함유하는상보성결정영역 (CDR) 과, 프레임워크세그먼트라불리는비-CDR 세그먼크로이루어지고, 이세그먼트는일반적으로구조를유지하고, CDR 루프의위치를결정한다 ( 그러나, 특정의프레임워크잔기가항원과접촉하여도좋다 ). 따라서, V L 및 V H 도메인은구조 n-fr1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4-c를갖는다. [0053] [0054] [0055] 결합단백질또는항체 ( 본명세서에서는광범위하게정의된다 ) 에대하여말할때, 각도메인의아미노산의귀속은 Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991) 의정의에따른다. 면역글로불린의성숙중쇄및경쇄의가변영역유래의아미노산은, 그쇄중의아미노산의위치에의해정의된다. Kabat은다수의항체의아미노산서열을기재하고, 각서브그룹에대해공통의아미노산서열을동정하고, 각아미노산에잔기번호를할당하였다. Kabat의넘버링방식은, 문제의항체를, 보존아미노산을기준으로한 Kabat의공통서열의 1개와대조하는것에의해, 그의일람표 (compendium) 에는포함되지않는항체까지확장할수있다. 잔기번호를할당하는이방법은, 당업계에서표준적으로되어있고, 다양한항체 ( 키메라또는인간화된변이체를포함 ) 에있어서, 동등의위치의아미노산을용이하게동정한다. 예를들면, 인간항체경쇄의 50위치의아미노산은, 마우스항체경쇄의 50위치의아미노산과동등한위치에있다. 본명세서중에서사용되는 " 중쇄 " 라는용어는 IgG 항체의중쇄를특정하기위해사용된다. 완전한천연의 IgG에서는, 중쇄는면역글로불린도메인 VH, CH1, 힌지, CH2 및 CH3을포함한다. 본명세서전체를통하여, IgG 중쇄중의잔기의번호부여는 Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 th Ed. Public Health Service, NH1, MD(1991)( 참조로서본명세서에포함 ) 에서와같은 EU 인덱스의것이다. "Kabat에서와같은 EU 인덱스 " 란, 인간 IgG1 EU 항체의번호부여를말한다. 인간 IgG1의힌지, CH2 및 CH3 도메인을포함하는아미노산서열의예를, 이하에기재하는도 1a 및 1b에나타낸다. 도 1a 및 1b에는, IgG2, IgG3 및 IgG4의중쇄의힌지, IgG2 및 IgG3 도메인의아미노산서열도나타낸다. IgG2, IgG3 및 IgG4 이소타입의아미노산서열은각각의힌지영역의최초와최후의시스테인잔기 ( 중쇄간 S-S 결합을형성한다 ) 을동일한위치에배치하는것에의해, IgG1 서열과대조한다. IgG2 및 IgG3의힌지영역에대하여는, 모든잔기가 EU 인덱스에의해번호부여되는것에한정되지않는다. " 힌지영역 " 또는 " 힌지도메인 " 은, 일반적으로, 인간 IgG1의 Glu216 내지 Pro230까지의영역을의미한다. 인간 IgG1의힌지영역의아미노산서열의예를도 1a에나타낸다 ( 도 1a에서의아미노산잔기는 Kabat 시스템에따라번호부여된다 ). 다른 IgG 이소타입의힌지영역은, 도 1a에나타내도록중쇄간 S-S 결합을형성하는최초와최후의시스테인잔기를동일한위치에배치하는것에의해, IgG1 서열과서열될수있다

17 [0056] [0057] [0058] 본명세서중에서사용되는 "Fc 영역 ","Fc 도메인 " 또는이와유사한용어는, IgG 중쇄의 C-말단영역을규정하기위해사용된다. 인간 IgG1을포함하는아미노산서열의예를도 1b에나타낸다. Kabat 시스템에따라번호부여한경우, 경계는매우다양할수있지만 Fc 도메인은아미노산 231에서 447까지연장되어있다 ( 도 1b에서의아미노산잔기는 Kabat 시스템에따라번호부여된다 ). 도 1b에는, IgG 이소타입 IgG2, IgG3 및 IgG4의 Fc 영역의아미노산서열의예를나타낸다. IgG의 Fc 영역은, 2개의불변도메인, CH2 및 CH3를포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은, 통상, Kabat 의넘버링시스템에따라아미노산 231에서 341까지이른다 ( 도 1b). 인간 IgG Fc 영역의 CH3 도메인은, 통상, Kabat의넘버링시스템에따라아미노산 342에서 447까지이른다 ( 도 1b). 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인 ("Cγ 2" 도메인이라고도불린다 ) 은, 이것이또다른도메인과밀접하게쌍을이루고있지않는다는점에서독특하다. 오히려, 완전한천연의 IgG의 2개의 CH2 도메인사이에는, 2개의 N-결합분지당쇄가개재하고있다. 본명세서중에서사용되는 "FcγR 결합단백질 ","FcγR 항체 " 및 " 항FcγR 항체 " 라는용어는상호호환적으로이용되고, 다양한면역글로불린-유사단백질또는면역글로불린-유래단백질을말한다. "FcγR 결합단백질 " 은 V L 및 / 또는 V H 도메인과상호작용을통하여 FcγR과결합한다 (FcγR 개재결합과는구별된다 ). FcγR 결합단백 질의예로서는, 완전히인간의항체, 다중클론항체, 키메라항체, 또는인간화항체 ( 예를들면, 2개의중쇄와 2개의경쇄를포함 ), 그단편 ( 예를들면, Fab, Fab', F(ab') 2, 및 Fv 단편 ), 2관능성또는다관능성항체 ( 예를들면, Lanzavecchia et al.(1987) "The Use Of Hybrid Hybridomas To Target Human Cytotoxic T Lymphocytes," Eur. J. Immunol. 17: 참조 ), 단일쇄항체 ( 예를들면, Bird et al.(1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242: 참조 ), 융합단백질 ( 예를들면, 파아지디스플레이융합단백질 )," 미니바디 (minibody)"( 예를들면, U.S. 특허번호 5,837,821 참조 ) 및 V L 및 / 또는 V H 도메인또는그단편을포함하는다른항원결합단백질을들수있다. 어떤구체예에있어서, FcγRIIIA 결합단백질은,"4량체항체 " 이고, 즉일반적으로천연의 IgG의구조를갖고, 또한가변도메인과불변도메인을포함한다 ( 즉, V L 도메인과경쇄불변도메인을갖는경쇄 2개및 V H 도메인과중쇄힌지및불변도메인을갖는중쇄 2개를포함한다 ). [0059] [0060] [0061] [0062] 본명세서중에서사용하는 "FcγR 길항제 (antagonist)" 및이의유사용어는, FcγR의적어도 1개의생물학적활성을길항하는 ( 예, 시그널전달을차단 ) 단백질및비단백질성물질 ( 소분자포함 ) 을말한다. 예를들면, 본발명의분자는 IgG의 FcγR에의결합을블락킹하는것에의해시그널전달을차단한다. 본명세서중에서사용하는폴리펩티드또는단백질에관한 " 유도체 " 라는용어는, 아미노산잔기의치환, 결실또는부가하는것에의해개변되어있는아미노산서열을포함하는폴리펩티드또는단백질을의미한다. 본명세서중에서사용하는 " 유도체 " 는개변되어있는, 즉폴리펩티드또는단백질에의임의의타입의분자의공유결합에의해개변되어있는폴리펩티드또는단백질을의미한다. 예를들면, 한정하는것은아니지만, 항체는예로서글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 공지의보호 / 블락킹에의한유도체화, 단백질분해절단, 세포리간드또는다른단백질과의결합등에의해개변하는것이가능하다. 유도체폴리펩티드도는단백질은, 한정하는것은아니지만, 특정의화학적절단, 아세틸화, 포밀화, 튜니카마이신 (tunicamycin) 의대사적합성등을포함하여, 당업자에공지의기술을이용하는화학적변형에의해제조할수있다. 또한, 유도체폴리펩티드또는단백질유도체는, 이것이유도되는원래의폴리펩티드또는단백질과유사또는동일한기능을보유한다. 본명세서중에서사용하는비단백질유도체와관련하여 " 유도체 " 란, 제 1 유기또는무기분자의구조에기초하여형성된제 2 유기또는무기분자를의미한다. 유기분자의유도체는, 한정하는것은아니지만, 예를들면, 히드록실, 메틸, 에틸, 카르복실또는아미노기의부가또는결실에의해, 개변된분자를포함한다. 유기분자는또한에스테르화, 알킬화및 / 또는인산화되어도좋다. 본명세서중에서사용하는 " 디아바디분자 " 란, 2개또는그이상의폴리펩티드사슬또는단백질의복합체로서, 각각적어도 1개의 VL 및 VH 도메인또는그단편을포함하고, 양도메인이단일의폴리펩티드사슬내에포함되어있는복합체를말한다. 어떠한구체예에서," 디아바디분자 " 에는 Fc 또는힌지-Fc 도메인을포함하는분자가포함된다. 이러한복합체의폴리펩티드사슬은동일하여도달라도좋고, 즉디아바디분자는모노다량체도는헤테로다량체일수있다. 특정의구체예에서는," 디아바디분자 " 에는 2량체또는 4량체가포함되고, 즉, 상기폴리펩티드사슬이양쪽과도 VL 및 VH 도메인을포함한다. 다량체단백질을구성하는각각의폴리펩티드사슬은, 쇄간이황화결합에의해다량체의적어도 1개의다른펩티드와공유결합으로연결되어있어도좋다

18 [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] 본명세서중에서사용하는 " 장애 (disorder)" 및 " 질환 " 이란, 호환적으로사용되고, 피험자의증상을의미한다. 특히, 용어 " 자가면역질환 " 은 " 자가면역장애 " 와호환적으로사용되고, 피험자자신의세포, 조직및 / 또는기관에대한피험자의면역반응에기인하는세포, 조직및 / 또는기관의손상에의해특징지워지는피험자의증상을의미한다. 용어 " 염증성질환 " 은용어 " 염증성장애 " 와호환적으로사용되고, 염증바람직하게는만성염증에의해특징지워지는피험자의증상을의미한다. 자가면역장애는염증을수반하여도수반하지않아도좋다. 또한, 염증은자가면역장애에기인하여도기인하지않아도좋다. 따라서, 어떠한특정의장애는자가면역장애와염증성장애의양쪽에의해특징지워질수있다. 본명세서중에서사용하는 " 동일의폴리펩티드사슬 " 란, 거의동일의아미노산서열을갖는폴리펩티드사슬을의미하고, 예를들면, 1개이상의아미노산의상위를갖는폴리펩티드사슬, 바람직하게는, 2개의폴리펩티드사슬의활성이유의있게다르지않는바와같은보존적아미노산치환을갖는폴리펩티드사슬이포함된다. 본명세서중에서사용하는 " 암 " 이란, 이상한무억제의세포증식에서생기는신생물또는종양을의미한다. 본명세서중에서사용하는 " 암 " 은, 명확히백혈병및림프종을포함한다. 어떠한구체예에서, 암은국소화한채로존재하는양성종양을의미한다. 다른구체예에서, 암은근처의신체구조에침입하여파괴하고, 먼부위에까지이르는악성종양을의미한다. 어떠한구체예에서, 암은특정의암항원을수반한다. 본명세서중에서사용하는 " 면역조절제 " 및그변형은, 숙주의면역계를조절하는약제를의미한다. 어떠한특정의구체예에서는, 면역조절제는면역억제제이다. 어떠한특정의구체예에서는, 면역조절제는면역자극제이다. 면역조절제로서는한정되는것은아니지만소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 융합단백질, 항체, 무기분자, 미메틱제 (mimetic agent) 및유기분자를포함한다. 본명세서중에서사용하는 " 에피토프 " 란, 동물바람직하게는포유류, 가장바람직하게는인간에있어서항원성또는면역원성을갖는폴리펩티드또는단백질또는비단백질분자의단편을의미한다. 면역원성을갖는에피토프는, 동물에서항체반응을유발하는폴리펩티드또는단백질의단편이다. 항원성을갖는에피토프는당업자에주지의방법, 예를들면, 면역분석에의해확인될수있는바와같은, 항체가면역특이적으로결합하는폴리펩티드또는단백질의단편이다. 항원성에피토프는반드시면역원성일필요는없다. 본명세서중에서사용하는 " 단편 " 이란, 다른폴리펩티드의아미노산서열의적어도 5개연속한아미노산잔기, 적어도 10개연속한아미노산잔기, 적어도 15개연속한아미노산잔기, 적어도 20개연속한아미노산잔기, 적어도 25개연속한아미노산잔기, 적어도 40개연속한아미노산잔기, 적어도 50개연속한아미노산잔기, 적어도 60개연속한아미노산잔기, 적어도 70개연속한아미노산잔기, 적어도 80개연속한아미노산잔기, 적어도 90개연속한아미노산잔기, 적어도 100개연속한아미노산잔기, 적어도 125개연속한아미노산잔기, 적어도 150개연속한아미노산잔기, 적어도 175개연속한아미노산잔기, 적어도 200개연속한아미노산잔기, 적어도 250개연속한아미노산잔기의아미노산서열을포함하는펩티드또는폴리펩티드를의미한다. 특정의구체예에서는, 폴리펩티드의단편은그폴리펩티드의적어도 1개의기능을보유한다. 본명세서중에서사용하는 " 핵산 " 및 " 뉴클레오티드서열 " 이란, DNA 분자 ( 예, cdna 또는게놈 DNA), RNA 분자 ( 예, mrna), DNA 및 RNA 분자의조합또는하이브리드 DNA/RNA 분자, 및 DNA 또는 RNA 분자의유사체를포함한다. 이와같은유사체는, 예를들면, 한정하는것은아니지만, 이노신또는트리틸화염기를포함하는뉴클레오티드유사체를이용하여제작하는것이가능하다. 이와같은유사체는또한분자에유익한속성을부여하는 ( 예, 뉴클레아제내성을부여하거나, 세포막을통과하는능력을높이는 ) 개변된골격을갖는 DNA 또는 RNA 분자를포함하여도좋다. 핵산또는뉴클레오티드서열은단일쇄또는 2중쇄여도좋고, 단일쇄부분과이중쇄부분의양쪽을포함하여도좋고, 또한 3중쇄부분을포함하여도좋다. 그러나, 바람직하게는, 2중쇄 DNA이다. 본명세서중에서사용하는 " 치료적유효량 " 이란, 질환또는장애를치료또는관리하는데충분한치료제의양을의미한다. 치료적유효량은, 질환의발병을지연시키거나또는최소화하는 ( 예, 암의전이를지연시키거나최소화 ) 충분한치료제의양을나타낸다. 치료적유효량은, 질환의치료또는관리에있어서치료상의이익을부여하는치료제의양을의미하여도좋다. 또한, 본발명의치료제에대한치료적유효량은, 질환의치료또는관리에있어서치료학적으로이익을부여하는, 단독또는다른치료제와조합한치료제의양을의미한다. 본명세서중에서사용하는 " 예방제 " 란, 장애의예방또는장애의재발또는확대의예방에사용되는약제를의미한다. 예방상유효한양은, 과증식성질환특히암의재발또는확대, 또는환자 ( 한정하는것은아니지만, 과증식성질환의소인이있는환자, 예를들면유전적으로암의소인이있거나또는이전에발암물질에노출된환자를포함 ) 에있어서이들의발생을예방하는것에충분한예방제의양을의미하여도좋다. 또한, 예방상유효

19 한양은, 질환의예방에있어서예방상의이익을부여하는예방제의양을의미하여도좋다. 또한, 본발명의예 방제에대한예방상유효한양은질환의예방에있어서예방상의이익을부여하는, 단독또는다른약제와혼합 한예방제의양을의미한다. [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] 본명세서중에서사용하는 " 예방 " 이란, 예방제또는치료제의투여로부터얻어지는, 피험자에있어서의장애의 1 이상의증상의재발또는발병의예방을의미한다. 본명세서중에서사용하는 " 조합하여 " 란, 2 이상의예방제및 / 또는치료제의사용을의미한다. 용어 " 조합하여 " 란, 예방제및 / 또는치료제를, 장애가있는피험자에투여하는순서를제한하는것은아니다. 제 1 예방제또는치료제는, 장애가있는피험자에제 2 예방제또는치료제를투여하기전 ( 예를들면, 5분, 15분, 30분, 45 분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8 주또는 12주전 ) 에, 또는제 2 예방제또는치료제를투여함과동시에, 또는제 2 예방제또는치료제를투여한후 ( 예를들면, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96 시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주또는 12주후 ) 에투여하는것이가능하다. 본명세서중에서사용하는 " 이펙터기능 (effector function)" 이란, 항체의 Fc 영역과, Fc 수용체또는항원과의상호작용에기인하는생화학적사건을의미한다. 이펙터기능의예로서는, 항체의존성세포매개세포독성 (ADCC), 항체의존성세포매개식작용 (ADCP), 및보체의존성세포독성 (CDC) 이있지만, 이에한정되는것은아니다. 이펙터기능에는, 항원결합후에작용하는이펙터기능과, 항원결합과는무관하게작용하는이펙터기능의양쪽을포함한다. 본명세서중에서사용하는 " 이펙터세포 " 란, 1개이상의 Fc 수용체를발현하고, 1개이상의이펙터기능을매개하는, 면역계의세포를의미한다. 이펙터세포의예로서는, 단구, 마크로파지, 호중구, 수상세포, 호산구, 마스트세포, 혈소판, B 세포, 대형과립림프구, 랑게르한스세포, 네츄럴킬러 (NK) 세포가있지만, 이들에한정되는것은아니고, 또한, 이펙터세포는임의의생물, 예를들면, 인간, 마우스, 래트, 토끼및원숭이에서유래할수있지만, 이에한정되는것은아니다. 본명세서중에서사용하는 " 면역복합체와특이적으로결합하는 " 및이와유사한용어는, 어떠한면역복합체와특이적으로결합하지만, 다른분자와는특이적으로결합하지않는분자를의미한다. 면역복합체와특이적으로결합하는분자는, 예를들면, 면역분석, BIAcore, 또는당기술분야에서공지의다른분석으로측정하여, 보다낮은친화성으로다른펩티드또는폴리펩티드와결합하여도좋다. 바람직하게는, 면역복합체와특이적으로결합하는분자는, 다른단백질과교차반응하지않는것이다. 면역복합체와특이적으로결합하는분자는, 예를들면, 면역분석, BIAcore, 또는당기술분야에서공지의다른기술에의해확인하는것이가능하다. 본명세서중에서사용하는 " 안정한융합단백질 " 이란, 당업자에게알려진통상의생화학적및기능성분석을이용하여평가한경우, 제조및 / 또는보존중에최소내지검출불능레벨로분해되는융합단백질을의미하고, 생화학적활성 ( 예를들면, FcγR과의결합 ) 의저하없이장기간보존하는것이가능하다. [0078] 도면의간단한설명 도 1a-b 인간 IgG, CH1, 힌지및 Fc 영역의아미노산서열 도 1a는인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의힌지 (a) 및 Fc(b) 도메인의아미노산서열을나타낸다 (IgG1 힌지도메인 ( 서열번호 1); IgG2 힌지도메인 ( 서열번호 2); IgG3 힌지도메인 ( 서열번호 3); IgG4 힌지도메인 ( 서열번호 4); IgG1 Fc 도메인 ( 서열번호 5); IgG2 Fc 도메인 ( 서열번호 6); IgG3 Fc 도메인 ( 서열번호 7); IgG1 Fc 도메인 ( 서열번호 8)). 도 1a 및 1b에서나타낸아미노산잔기는 Kabat EU의넘버링시스템에따라번호를붙이고있다. 아이소타입서열에대해서는중쇄간의 S-S 결합을형성하는각힌지영역의최초와최후의시스테인잔기를동일위치에배치함으로써 IgG1 서열과의정렬을행하고있다. 도 1b에서는 CH2 도메인중의잔기를 + 로나타내고, CH3 도메인중의잔기를 ~로나타내고있다. 도 2 공유결합형이중기능성디아바디의폴리펩티드사슬의모식도공유결합형이중기능성디아바디의폴리펩티드는짧은펩티드링커에서분리된항체 VL도메인및항체 VH도메인으로이루어진다. 8아미노산잔기의링커는 1본쇄폴리펩티드의 scfv컨스트럭트에대한자기집합을방해하고있고, 그대신에상이한폴리펩티드사슬의 VL도메인및 VH도메인간의상호작용이우선한다. 4개의컨스트럭트를제작했다 ( 각컨스트럭트는컨스트럭트의좌측의아미노말단 "n" 으로부터도면의우측의카르복시말단 "c" 까지기재되어있다 ): 컨스트럭트 (1)( 서열번호 9) 은 n-hu2b6의 VL도메인-링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))-Hu3G8의 VH

20 도메인-및 C말단서열 (LGGC)-c를포함하고, 컨스트럭트 (2)( 서열번호 11) 는 n-hu3g8의 VL도메인-링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))-Hu2B6의 VH도메인-및 C말단서열 (LGGC)-c를포함하고, 컨스트럭트 (3)( 서열번호 1 2) 은 n-hu3g8의 VL도메인-링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))-Hu3G8의 VH도메인-및 C말단서열 (LGGC)-c를포함하고, 컨스트럭트 (4)( 서열번호 13) 는 n-hu2b6의 VL도메인-링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))-Hu2B6의 VH도메인-및 C말단서열 (LGGC)-c를포함한다. 도 3 친화성정제된디아바디의 SDS-PAGE 분석도 3은친화성정제된디아바디의 SDS-PAGE 분석을나타내는도면이다. 친화성정제된디아바디를환원 ( 레인 1 ~3) 또는비환원 ( 레인 4~6) 조건하에서SDS-PAGE 분석에제공했다. 표준의대략의분자량을 ( 레인 3 및 4 사이에 ) 나타내고있다. 레인 1 및 4는 h3g8 CMD를, 레인 2 및 5는 h2b6 CMD를, 레인 3 및 6은 h2b6-h3g8 CBD를나타낸다. 도 4a-b 친화성정제된디아바디의 SEC 분석친화성정제된디아바디를 SEC 분석에제공했다. (a) 이미알려진표준 : 전장 IgG(~150kDa), IgG의 Fab 단편 (~50kDa), 및 scfv(~30kda) 의용출프로파일 ; (b) 이미알려진표준 : h2b6 CMD, h3g8 CMD 및 h2b6-h3g8 CBD 의용출프로파일. 도 5 h2b6-h3g8 CBD의 scd32b 및 scd16a에대한결합 scd32b 및 scd16a에대한 h2b6-h3g8 CBD의결합은샌드위치 ELISA에서분석하였다. scd32b는표준단백질로서사용하였다. 이차프로브는 HRP 접합 scd16a였다. CD16A에결합하는 h3g8 CMD를대조군으로서사용하였다. 도 6a-c BIACORE 분석 OF 디아바디결합 TO scd16a, SCD32B 및 scd32b 2B6-h3G8 CBD, h2b6 CMD 및 h3g8 CMD와 scd16a, scd32b 및 scd32a( 음성대조군 ) 와의결합을 SPR 해석에의해분석했다. h3g8 scfv도대조군으로서시험했다.(a) scd16과의결합, (b) scd32b와의결합, 및 (c) scd32a와의결합. 디아바디를 100nM의농도로, scfv를 200nM의농도로, 유속 50ml/ 분에서 60초간, 수용체표면에투입했다. 도 7a-e scd16a 및 SCD32B에대한디아바디결합의 BIACORE 분석 h2b6-h3g8 CBD, h2b6 CMD 및 h3g8 CMD와 scd16a, 및 scd32b와의결합을 SPR 해석에의해분석했다. h3g8 scfv 도대조군으로서시험했다.(a) h3g8 CMD scd16a와의결합 ; (b) h2b6-h3g8 CBD와 scd16a와의결합 ; (c) h3g8 scfv와 scd16a와의결합 ; (d) h2b6 CMD와 scd32b와의결합 ; 및 (e) h2b6-h3g8 CBD와 scd32b와의결합. 디아바디를 6.25~200nM의농도로, 유속 70ml/ 분에서 180초간, 수용체표면에투입했다. 도 8 공유결합형이중특이성디아바디분자를형성하기위한 VL 및 VH 도메인을포함하는폴리펩티드사슬의상호작용을나타내는모식도 NH 2 및 COOH는각각각폴리펩티드사슬의아미노말단및카르복시말단을나타낸다. S는각폴리펩티드사슬의 C말단시스테인잔기를나타낸다. VL 및 VH는각각 L쇄가변도메인및 H쇄가변도메인을나타낸다. 점선및파선은 2개의폴리펩티드사슬끼리를구별하기위한것이고, 특히상기쇄의링커부분을나타내고있다. h2b6 Fv 및 h3g8 Fv는각각 CD32B 및 CD16에특이적인에피토프결합부위를나타낸다. 도 9 공유결합형이중특이성디아바디의 Fc 도메인을함유하는폴리펩티드사슬의모식도본발명의디아바디분자의폴리펩티드컨스트럭트의모식도 ( 각컨스트럭트는컨스트럭트의좌측의아미노말단 "n" 으로부터도면의우측의카르복시말단 "c" 까지기재되어있다 ). 컨스트럭트 (5)( 서열번호 14) 는 n-hu2b6의 VL도메인-제1 링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))-Hu3G8의 VH도메인-제2 링커 (LGGC)-및인간 IgG1의 C말단 Fc도메인 -c를포함하고, 컨스트럭트 (6)( 서열번호 15) 은 n-hu3g8의 VL도메인-링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))-Hu2B6의 VH 도메인-및제2 링커 (LGGC)-및인간 IgG1의 C말단 Fc도메인-c를포함하고, 컨스트럭트 (7)( 서열번호 16) 은 n- Hu2B6의 VL도메인-제1 링커 (GGGSGGGG( 서열번호10))-Hu3G8의 VH도메인-및 C말단서열 (LGGCFNRGEC)( 서열번호 17)-c를포함하고, 컨스트럭트 (8)( 서열번호 18) 은 n-hu3g8의 VL도메인-링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))-Hu2B6의 VH도메인-및제2 링커 (LGGC)-및인간 IgG1의 C말단힌지 /Fc도메인(A215V의아미노산치환을갖는다 )-c를포함한다. 도 10 CD32B 및 scd16a에대한 Fc 도메인을포함하는디아바디분자의결합 Fc도메인을포함하는디아바디분자와 scd32b 및 scd16a와의결합을샌드위치 ELISA에서분석했다. 분석한디아

21 바디는다음 3개의재조합발현시스템에의해생산되었다 : 컨스트럭트 1 및 6을각각발현하는 pmgx669 및 pmgx674의동시형질도입, 컨스트럭트 2 및 5를각각발현하는 pmgx667 및 pmgx676의동시형질도입, 컨스트럭트 5 및 6을각각발현하는 pmgx676 및 pmgx674의동시형질도입. scd32b를표적단백질로서사용했다. 제2 프로브는 HRP 접합 scd16a로했다. 도 11 2가의공유결합형디아바디를형성하기위해서, 각각 1개의 Fc 도메인을포함하는 2개의폴리펩티드사슬의상호작용을나타내는모식도 NH 2 및 COOH는각폴리펩티드사슬의아미노말단및카르복시말단을각각나타낸다. S는각폴리펩티드사슬의제2 링커서열중의시스테인잔기간의적어도 1개의이황화결합을나타낸다. VL 및 VH는각각 L쇄가변영역및 H쇄가변영역을나타낸다. 점선및파선은 2개의폴리펩티드사슬끼리를구별하기위한것이고, 특히상기쇄의제1 링커부분을나타낸다. CH2 및 CH3은 Fc도메인의 CH2 및 CH3 불변도메인을나타낸다. h2b6 Fv 및 h3g8 Fv는각각 CD32B 및 CD16에특이적인에피토프결합부위를나타낸다. 도 12 힌지 /Fc 도메인을포함하는디아바디분자의 scd32b 및 scd16a에대한결합 Fc도메인을포함하는디아바디분자와 scd32b 및 scd16a와의결합에대해서는샌드위치 ELISA에서분석했다. 분석한디아바디는다음의 4개의재조합발현시스템에의해생산되었다 : 컨스트럭트 1 및 6을각각발현하는 pmgx669+pmgx674의동시형질도입, 컨스트럭트 2 및 8을각각발현하는 pmgx669+pmgx678의동시형질도입, 컨스트럭트 7 및 6을각각발현하는 pmgx677+pmgx674의동시형질도입, 컨스트럭트 7 및 8을각각발현하는 pmgx677+pmgx678의동시형질도입. scd32b를표적단백질로서사용했다. 제2 프로브는 HRP 접합 scd16a로했다. 도 13 4량체디아바디분자를형성하기위한폴리펩티드사슬의상호작용을나타내는모식도 NH 2 및 COOH는각폴리펩티드사슬의각각아미노말단및카르복시말단을나타낸다. S는 Fc를가지는 ' 무거운 ' 폴리펩티드사슬의제2 링커서열중의시스테인잔기와, Fc를가지지않는 ' 가벼운 ' 폴리펩티드사슬의 C말단서열중의시스테인잔기간의적어도 1개의이황화결합을나타낸다. VL 및 VH는각각 L쇄가변도메인및 H쇄가변도메인을나타낸다. 점선및파선은 2개의폴리펩티드사슬끼리를구별하기위한것이고, 특히상기중쇄의제1 링커부분또는상기경쇄의링커를나타낸다. CH2 및 CH3은 Fc도메인의 CH2 및 CH3 불변도메인을나타낸다. h2b6 Fv 및 h3g8 Fv는각각 CD32B 및 CD16에특이적인에피토프결합부위를나타낸다. 도 14 공유결합형이중특이성디아바디를형성하는 Fc 도메인을함유하는폴리펩티드사슬의모식도본발명의디아바디분자를형성하는폴리펩티드컨스트럭트의모식도 ( 각컨스트럭트는컨스트럭트의좌측의아미노말단 "n" 으로부터도면의우측의카르복시말단 "c" 까지기재되어있다 ). 컨스트럭트 (9)( 서열번호 19) 는 n-인간 IgG1의힌지 /Fc도메인-Hu3G8의 VL도메인-링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))-Hu2B6의 VH도메인-링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))-및 C말단 LGGC 서열-c를포함하고, 컨스트럭트 (10)( 서열번호 20) 은 n-인간 IgG1의 Fc도메인-Hu3G8의 VL도메인-링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))-Hu2B6의 VH도메인-링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))-및 C말단 LGGC 서열-c를포함하고, 컨스트럭트 (11)( 서열번호 21) 은 n-hu2b6의 VL도메인 (G105C)-링커(GGGSGGGG( 서열번호 10))-Hu3G8의 VH도메인-및 A215V의아미노산치환을갖는인간 IgG1의 C말단힌지 /Fc도메인-c를포함하고, 컨스트럭트 (12)( 서열번호 22) 는 n-hu3g8의 VL도메인-링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))-Hu2B6의 VH도메인 (G44C)-및 C말단 FNRGEC( 서열번호 23) 서열-c를포함한다. 도 15 a-b 친화성 4량체디아바디의 SDS-PAGE 및웨스턴블롯분석컨스트럭트 10 및 1, 컨스트럭트 9 및 1, 컨스트럭트 11 및 12를발현하는벡터에서동시형질도입된재조합발현시스템에의해생산된디아바디를, 비환원적조건의 SDS-PAGE 분석 (a), 및염소항인간 IgG1 H+L을프로브로서사용한웨스턴블랏분석 (b) 에제공했다. SDS-PAGE 겔중의단백질을심플리블루세이프스테인 (Simply Blue Safestain; Invitrogen사 ) 으로시각화했다. a 및 b의양패널에있어서, 컨스트럭트 10 및 1, 컨스트럭트 9 및 1, 컨스트럭트 11 및 12A를포함하는디아바디분자는각각레인 1, 2, 3에상당한다. 도 16 Fc 도메인및유전자조작에의해만들어진사슬내이황화결합을포함하는디아바디분자의 SCD32B 및 scd16a에대한결합 Fc도메인, 및 ' 가벼운 ' 폴리펩티드사슬과 ' 무거운 ' 폴리펩티드사슬간의유전자조작에의해만들어진이황화결합을포함하는디아바디분자와, scd32b 및 scd16a와의결합을샌드위치 ELISA에서분석했다. 분석한디아바디는다음 3개의재조합발현시스템에의해생산되었다 : 각각컨스트럭트 1 및 10을발현하는계, 컨스트럭트

22 1 및 9를발현하는계, 및컨스트럭트 11 및 12를발현하는계. scd32b를표적단백질로서사용했다. 제2 프로브는 HRP 접합 scd16a로했다. h3g8의결합을대조군으로서사용했다. 도 17 디아바디분자의폴리단백질전구체의모식도및람다경쇄및 / 또는힌지도메인을함유하는폴리펩티드의모식도본발명의디아바디분자를형성하는폴리펩티드컨스트럭트의모식도 ( 각컨스트럭트는컨스트럭트의좌측의아미노말단 "n" 으로부터도면의우측의카르복시말단 "c" 까지기재되어있다 ). 컨스트럭트 (13)( 서열번호 95) 은 n-3g8의 VL도메인-제1 링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))-2.4G2VH의 VH도메인-제2 링커 (LGGC)-푸린인식부위 (RAKR( 서열번호 93))-2.4G2의 VL도메인-제3 링커 (GGGSGGG( 서열번호 10)-3G8의 VH도메인-및 C말단 LGGC도메인을포함하고 ( 서열번호 95을코드하는뉴클레오티드서열은서열번호 96에나타냄 ), 컨스트럭트 (14)( 서열번호 97) 는 n-3g8의 VL도메인-제1 링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))-2.4G2VH의 VH도메인-제2 링커 (LGGC)-푸린인식부위 (RAKR( 서열번호 93))-FMD( 구제역바이러스프로테아제 C3) 부위-2.4G2의 VL도메인-제3 링커 (GGGSGGG( 서열번호 10)-3G8의 VH도메인-및 C말단 LGGC도메인을포함한다 ( 서열번호 97를코드하는뉴클레오티드서열은서열번호 98에나타낸다 ). 컨스트럭트 (15)( 서열번호 99) 는 n-hu2b6의 VL도메인-링커 (GGGSGGGG( 서열번호 10))- Hu3G8의 VH도메인-및 C말단 FNRGEC( 서열번호 23) 도메인을포함한다 ( 서열번호 99을코드하는뉴클레오티드서열은서열번호 100에나타낸다 ). 컨스트럭트 (16)( 서열번호 101) 은 n-hu3g8의 VL도메인-링커 (GGGSGGGG( 서열번호10))-Hu2B6의 VH도메인-C말단 VEPKSC( 서열번호 77) 도메인을포함한다 ( 서열번호 101을코드하는뉴클레오티드서열은서열번호 102에나타낸다 ). 도 18 폴리단백질전구체분자로부터유래하는디아바디분자의 mcd32b 및 SCD16A에대한결합폴리단백질전구체분자컨스트럭트 13( 서열번호 95) 에유래하는디아바디분자와마우스 CD32B(mCD32B) 및가용성 CD16A(sCD16A) 와의결합을샌드위치 ELISA에서해석했다. mcd32b를표적단백질로서사용했다. 제2 프로브는비오틴접합 scd16a로했다. 도 19 람다사슬및 / 또는힌지도메인을포함하는디아바디분자의 scd32b 및 scd16a에대한결합인간람다경쇄의 C말단에유래하는도메인및 / 또는 IgG의힌지도메인을포함하는디아바디와, scd32b 및 scd16a와의결합을샌드위치 ELISA에서분석하고, 컨스트럭트 1 및 2( 도 5) 로이루어지는디아바디와비교했다. 분석한디아바디는컨스트럭트 15 및 16( 각각서열번호 99 및서열번호 101) 을발현하는재조합발현시스템에의해생산되었다. scd32b를표적단백질로서사용했다. 제2 프로브는 HRP 접합 scd16a로했다. 작은점형상모양의바는컨스트럭트 15/16의조합물을나타내고, 또체크모양의바는컨스트럭트 1/2의조합물을나타낸다. 도 20 세포표면에위치한 CD32B와플루오레세인-접합분자에결합된 2B6/4420 DART의모식도 2B6 arm에대한다른특이성을대체할수있을뿐아니라," 보편적인어댑터 (universal adaptor)" 인 DART의항- 플루오레세인 arm의유연성을나타낸다. V-영역은박스로나타냈고, GGGSGGGG( 서열번호 10) 링커는선으로나타냈고, 이황화결합은 2개의쇄를연결하는것으로나타냈다. 하나의쇄의구성성분은블루로, 다른쇄의구성성분은핑크로나타냈다. N은아미노말단, C는카복시말단, FL은플루오레세인, VL은경쇄가변영역, VH은중쇄가변영역이다. 도 21( 패널 A 및 B) 2B6/4420 DART는플루오레세인-접합분자에대하여특이적으로결합하고, CD32에동시에결합할수있다. (A) 2B6/4420 또는 2B6/3G8은, FITC-S 단백질로코팅된 ELISA 플레이트에결합되었다. 2B6 arm의바인딩및기능은가용성 CD32B로검출하였고, 이어서 CD32B에특이적인항체와 HRP가결합된 2차검출항체로검출하였다. (B) 2B6/4420 또는 2B6/3G8는, HuIgG 또는 FITC-HuIgG( 플루오레세인-결합형 ) 으로코팅된 ELISA 플레이트에결합되었다. 결합은 2B6 Fv에특이적인다중클론혈청으로검출하고, 이어서 HRP가결합된 2차항체로검출하였다. 도 22 ( 패널 A 및 B) 항-인간 CD79B 항체를사용하여정제된 B 세포의활성화. FITC-연결된항-인간 CD79B 항체 (CB3.1-FITC(A) 또는 CB3.2-FITC(B)) 와 GAM IgG Fc 특이적인 F(ab')2 단편 50 μg/ml(x축 ) 의농도를증가시켜, 정제된 B 세포를활성화시켰다. B 세포는 PBS( 백색막대 ) 또는 5μg/ml의 α FITCαCD32BDART( 흑색막대 ) 또는 αcd16αcd32bdart( 회색막대 ) 의존재하에서활성화되었다. 반응은 3회실시

23 하고, 표준편차를계산하였다. 도 23 ( 패널 A 및 B) 정제된 B 세포의활성화건강한 2차공여자로부터정제된 B 세포를도 22에나타낸바와같이활성화시켰다. 항-CD79b 항체 FITC-결합 CB3.2-FITC(A) 의존재하에서활성화된세포에서증식인덱스를측정하였고, 비표지의 CB3.2 항체 (B) 의존재하에서활성화된세포의증식인덱스와비교하였다. 도 24 ( 상위및하위패널 ) MGD261을사용한 HCD16A/B 트랜스제닉마우스에서의생체내마우스 B 세포감소 MacroGenics 사육콜로니유래의 mcd32-/-hcd16a+c57b1/6, mcd32-/-hcd32b+c57b1/6 및 mcd32-/- hcd16a+hcd32b+c57b1/6 마우스를, MGD261(10, 3, 1 또는 0.3mg/kg) 또는관계없는항체 (he16 10mg/kg) 로, 0, 3, 7, 10, 14 및 17일째에 IV 주사하였다. FACS 분석을위해, -19( 사육전 ), 4, 11, 18, 25 및 32일째에혈액을수집하였다. 1주일에 3번동물의건강과활동을기록하였다. 상위패널 : h2b6-3g8 및 WNV mab; 하위패널 : h2b6-3g8 -hcd16a 또는 -hcd32b 마우스및 WNV mab -hcd16a 또는 -hcd32b 마우스. 도 G2-3G8 DB을이용한 HCD16A/B 트랜스제닉마우스에서의생체내마우스 B 세포감소 MacroGenics 사육콜로니유래의 mcd16-/-, mcd16-/-hcd16a+ C57B1/6, mcd16-/-hcd16b+ 및 mcd16-/-hcd16a+ hcd16b+ 마우스를, 2.4G2-3G8 DB(75ug/ 마우스 ) 또는 PBS로, 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 및 18일째에 IP 주사하였다. FACS 분석을위해, -10( 사육전 ), 4, 11 및 18일째에혈액을수집하였다. 1주일에 3번동물의건강과활동을기록하였다. 도 26 인간종양세포주 RAJI의정맥 (IV) 모델을이용한 MGD261의항-종양활성의증명. MacroGenics 사육콜로니유래의 12-22주령 mcd16-/-, hcd16a+, RAG1-/-C57B1/6 마우스를, 5xlO6 Raji 세포로, 0일째에 IV 주사하였다. 또한, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27 및 30일째에, 마우스를 250, 25 또는 2.5ug의 MGD261 또는 PBS( 음성대조군 ) 으로, 복강내 (IP) 주사하였다. 이후, 마우스를매일관찰하여, 체중을 1주일에두번기록하였다. 다리마비를보이는마우스를희생시켰다. 도 27 비-포유류숙주에서의 DART 발현 BL21DE3 세포 (Novagen) 를 pet25b(+) T7-lac + 3G8/3G8 플라스미드로형질전환후, amp-내성콜로니를배지배양용시드로이용하였다. 배양물이 0.5 OD600 unit에이를때, 0.5mM IPTG를첨가하여발현을유도하였다. 배양물을 30 에서 2시간키운후, 무세포배지를수집하였다. 도 28 DART ELISA 96-well Maxisorp 플레이트를이용하여, h3g8-h3g8 DART 결합 ELISA를수행하였다. 반응후, 플레이트를 PBS- T로 3회세정한후, 80 μl/well의 TMB 기질로현상하였다. 5분간인큐베이션한후, 40μl/well의 1% H 2 SO 4 로반응을중단시켰다. 96-well 플레이트리더및 SOFTmax 소프트웨어를이용하여 OD450nm를얻었다. GraphPadPrism 3.03 소프트웨어를이용하여 OD450nm를플롯팅하였다. 도 29 DART-유도인간 B-세포사멸인간 PBMC를표시된분자와함께밤새배양하였다. FACS를이용하여, 총 FSC/SSC ungated 풀상의 B 세포 (CD20+ 세포 ) 의 PI+Annexin-V+ 풀의퍼센트로서, 어팝토시스 (apoptosis) 를분석하였다. 도 30 8B5-CB3.1 DART 컨스트럭트본발명을설명하기위하여, 다중 8B5-CB3.1 DART 컨스트럭트를제조하였다. 컨스트럭트 5 및 6, 또는 6 및 7, 또는 8 및 9, 또는 9 및 10, 암호화된발현플라스미드를, 항플라그테그가있거나없이, 리포펙타민 2000(Invitrogen) 을이용하여, HEK-293 세포에동시형질도입시키므로써 8B5-CB3.1 DART를발현시켰다. 3일마다 3번조건배지를수집하였다. CD32B 친화성컬럼을이용하여조건배지를정제하였다. 도 31 8B5-CB3.1 DART ELISA 96-웰 Maxisorp 플레이트를이용하여, 8B5-CB3.1 DART/ch8B5 경쟁 ELISA를수행하였다. 반응후, 플레이트를 PBS-T로 3회세정한후, 80 μl/ 웰의 TMB 기질로현상하였다. 5분간인큐베이션한후, 40μl/ 웰의 1% H 2 SO 4 로반응을중단시켰다. 96-웰플레이트리더및 SOFTmax 소프트웨어를이용하여 OD450nm를얻었다. GraphPadPrism

24 3.03 소프트웨어를이용하여 OD450nm를플롯팅하였다. 도 32 4가의 DART 구조의모식도 4개의폴리펩티드사슬의어셈블리을통하여얻어지는 DART 종의일반적인구조를나타낸다. Ig-유사 DART의 4 개의항원-결합도메인을사선과암회색의타원으로표시하였다. 도 33 Ig-유사 4가의 DART Ig-유사 4가 DART의에피토프결합부위의구조를나타낸다. 도 34 mcd32-hcd16a 결합 ELISA 실시예 6.10의 Ig-유사 4가 DART가, 대조군 (ch-mcd32 mab) 항체또는다른 DART 종보다더큰친화성으로항원에결합함을나타내는 ELISA의결과이다. 도 35 Ig DART 분자의모식도 Ig DART 분자를도시한다. 특이성은음영, 패턴또는백색영역으로, 불변영역은흑색으로, 이황화결합은도트흑색선으로표시하였다. 모든단백질쇄의 N-말단은그림의위쪽으로향하여배향되어있고, 모든단백질쇄의 C- 말단은그림의아래쪽으로향하여배향되어있다. 도 35a-e는이중특이적이고, 도 35f-j는삼중특이적이다. 도 35a 및 35e는 4가이다. 도 35b, c, f, i 및 j는 6가이다. 도 35 d, g 및 h는 8가이다. 각각의도메인의상세한설명에대하여는, 도 1, 2, 9, 14 및 17 및명세서의 Section 3.1 참조. 도 36 HU2B6 4.5-HU3G8 5.1 생물특이적디아바디의결합능력도 36은 Hu2B6 4.5 또는 Hu3G8 5.1 디아바디 ( 삼각형 ) 와비교하여 Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1 생물특이적디아바디 ( 사각형 ) 의 CD32b 및 CD16a에대한결합능력을보여준다. 도 37 E-코일및 K-코일 DART 유도체의도식도 37은 E-코일및 K-코일 DART 유도체의일반적배열을묘사한다. 도 38 바람직한 E-코일및 K-코일분리자의헬릭스배열도 38은바람직한 "E-코일" 서열 (EVAALEK) 4 ( 서열번호 299) 및바람직한 "K-코일" 서열 (KVAALKE) 4 ( 서열번호 30 0) 의헬릭스배열을보여준다. 도 39 E-코일및 K-코일 Fc-함유 DART 유도체도 39는사슬교환에의해형성될수있는 E-코일및 K-코일 Fc-함유 DART 유도체의다른종을묘사한다. 도 40 h2b6yahcb3 DART의 E-코일및 / 또는 K-코일유도체및 E-코일및 / 또는 K-코일 FC-함유유도체에서의크기배재크로마토그래피도 40은 h2b6yahcb3 DART의 E-코일및 / 또는 K-코일유도체및 E-코일및 / 또는 K-코일 Fc-함유유도체에서의크기배재크로마토그래피의결과를보여준다. 이런분자의네종을분석하였다 ; 모두 E-코일및 K-코일을가졌다 : EK(Fc 영역없음 ), 2.1 mg; EFc/K(E-코일에연결된 Fc), 2.7 mg; E/KFc(K-코일에연결된 Fc), 1.8 mg; EFc/KFc( 동일한 DART의 K-코일및 E-코일에연결된 Fc), 2.0 mg. 도 41 생산된이량체분자의구조도 41은도 40의크기배재크로마토그래피에서확인된, 생성된이량체분자의가능한구조를보여준다. 도 42 h2b6yahcb3 DART의 E-코일및 / 또는 K-코일유도체및 E-코일및 / 또는 K-코일 FC-함유유도체의 SDS-폴리아크릴아마이드겔전기영동분석도 42는 h2b6yahcb3 DART의 E-코일및 / 또는 K-코일유도체및 E-코일및 / 또는 K-코일 FC-함유유도체의크기배재크로마토그래피 ( 도 40) 로부터얻은분획의 SDS 폴리아크릴아마이드겔전기영동분석의결과를보여준다. 측면레인 : 분자마커대조군 ; 레인 1 : EK(Fc 영역없음 ); 레인 2: EFc/K, 집합분획 ; 레인 3: EFc/K, 단량체분획 ; 레인 4: E/KFc, 집합분획 ; 레인 5: E/KFc, 단량체분획 ; 레인 6: EFc/KFc, 집합분획 ; 레인 7: EFc/KFc, 이량체분획 ; 레인 8: EFc/KFc, 단량체분획. 도 43 이중특이성결합 ELISA 분석

25 도 43은 E-코일 /K-코일 Fc-함유 h2b6yahcb3 DART 유도체 (EFc/K 또는 E/KFc), h2b6yahcb3 DART, 대조군및 EFc/KFc h2b6yahcb3 DART 유도체를비교한이중특이성결합 ELISA의결과를보여준다. 도 44 T-세포증식을억제하는 h2b6yahcb3 DART의 E-코일및 / 또는 K-코일유도체및 E-코일및 / 또는 K-코일 FC-함유유도체의능력도 44는 T-세포증식을억제하기위한 h2b6yahcb3 DART의 E-코일및 / 또는 K-코일유도체및 E-코일및 / 또는 K- 코일 Fc-함유유도체의능력을보여준다. 도 45 hcd16-hcd32b ABD-DART 도 45는 hcd16 및 hcd32b 항원과면역반응하는재조합이중특이성 DART와융합된연쇄상구균단백질 G의 ABD3 도메인으로구성된재조합항체분자, hcd16-hcd32b ABD-DART의모식도를보여준다. 도 46a/46b 이중특이성 ELISA를사용한 hcd16-hcd32b ABD-DART의결합친화성 ELISA 플레이트에 2μg/mL의농도의 CD16 항원 ( 도 46a) 또는인간혈청알부민 ( 도 46a) 중어느하나로코팅하였다. 2μg/mL에서시작하는 hcd16-hcd32b ABD-DART( ) 및대조군 hcd16-hcd32b DART( ) 의다양한농도를결합시켰다. 검출을위하여바이오틴화 scd32b 항원에이어 HRP 접합스트렙타비딘을플레이트에첨가하였다. 도 47 DART 단백질의 PBMC 매개세포독성 PBMC는 DART 단백질의세포독성을매개하였다. ADCC 분석은표적세포로서인간 B-세포주, Daudi를이펙터세포로서 PBMC와배양하여수행하였다. 개별분석은 20:1의이펙터-대-표적비율및항체의적정에서 3회반복하여수행하였다 : hcd16a-hcd32b DART( ) 및 hcd16a-hcd32b ABD DART( ). 세포매개세포독성은 LDH 분비분석에의해측정하였다. 10 에서의더낮은곡선은 hcd16a-hcd32b ABD DART( ) 이다. 도 48 C57B1/6 마우스에서 hcd 16-hCD32B ABD-DART의개선된약동학적성질마우스 (n=3) 에 (A) hcd16-hcd32b ABD-DART( ) 및 (B) hcd16-hcd32b DART( ) 를 5 mg/kg으로단일정맥주사로주입하였다. 마우스혈청을다양한시점에서수집하였고, 혈청에서의단백질의농도를 ELISA에의해정량하였다. 약동학적계산은 WinNonlin Professional 5.1을사용하여수행하였다. 도 49 a-e HER2 저발현세포주의패널에서의 HER2 x TCRb DART 활성 Her2 및 T-세포수용체 (TCR) 결합도메인을갖는 DART 분자를낮은수준의 HER2 발현을나타내는것으로이전에특징화된다양한유방암세포주, 결장암및방광암세포주에서세포독성을매개하는그들의능력을시험하였다 ( 그리고따라서항-Her2/neu 항체, Herceptin과함께처리하기위해내화됨 ). 시험한유방암세포주는 ZR75-1(HER2 2+)( 도 49a), MCF-7(HER2 1+)( 도 49b) 및 MDA-MB468(HER2-ve)( 도 49c) 이다. 시험한비-유방암세포주는 HT-29( 결장암세포주 )( 도 49d) 및 SW780( 방광암세포주 )( 도 49e) 이다. [0079] [0080] 발명을실시하기위한구체적인내용 5. 바람직한구체예디아바디분자의각폴리펩티드사슬은, VL 도메인및 VH 도메인을포함한다. 이들은, 도메인의자기집합이일어나지않도록공유결합에의해연결되어있다. 2개의폴리펩티드사슬의상호작용에의해 2개의 VL-VH 쌍이생기고, 2개의에피토프결합부위, 즉 2가의분자를형성한다. VH 또는 VL 도메인은, 폴리펩티드사슬내의어는위치에도구속되지않고, 즉아미노 (N) 말단또는카르복시 (C) 말단에제한되는것은아니다. 또한, 상기도메인은, 서로상대적인위치에제한되는것은아니고, 즉 VL 도메인이 VH 도메인에대하여 N 말단측에있어도좋고, 그역으로있어도좋다. 유일한제한은, 기능적인디아바디를형성하기위해, 상보적인폴리펩티드사슬이이용가능하다고하는점이다. VL 및 VH 도메인이동일항체에유래하는경우, 2개의상보적폴리펩티드사슬은동일해도좋다. 예를들면, 결합도메인이에피토프 A에특이적인항체에유래하는경우 ( 즉, 결합도메인이 VL A -VH A 상호작용으로부터형성되는경우 ), 각폴리펩티드는 VH A 및 VL A 을포함하는것이가능하다. 항체의 2개 의폴리펩티드사슬의호모 2량체화는, 2개의 VL A -VH A 결합부위의형성을유도하고, 결과적으로 2가의단일특이성항체가생긴다. VL 및 VH 도메인이다른항원에대하여특이적인항체에유래하는경우, 기능적인이중특이성디아바디의형성에는, 다른 2개의폴리펩티드사슬의상호작용, 즉헤테로 2량체의형성이필요하게된다. 예를들면, 이중특이성디아바디의경우, 1개의폴리펩티드사슬은 VL A 및 VH B 로구성된다. 상기쇄의호모 2량

26 체화는결과적으로결합하지않거나또는예측할수없는결합의, 2개의 VL A -VH B 결합부위의형성을일으킬수있다. 이에대하여, 2개의다른폴리펩티드사슬이예를들면재조합발현시스템에있어서자유로이상호작용할수있는경우, 한쪽은 VL A 및 VH B 로, 다른쪽은 VL B 및 VH A 로이루어지고, 2개의다른결합부위, 즉 VL A -VH A 및 VL B -VH B 를형성하는것이가능하다. 모든디아바디폴리펩티드사슬의쌍에대하여, 2개의쇄의대조미스또는결합미스, 즉 VL-VL 또는 VH-VH 도메인의상호작용의가능성이있다. 그러나, 기능적인디아바디의정제는, 적절히 2량체화한결합부위의면역특이성에기초하여, 당해분야에서공지또는본명세서에서예시한, 예를들면, 친화성크로마토그래피와같은친화성을기초로한방법을이용하는것으로, 용이하게행할수있다. [0081] [0082] [0083] [0084] 다른구체예에서는, 디아바디의 1 이상의폴리펩티드사슬이 Fc 도메인을포함하고있다. 디아바디분자의폴리펩티드사슬에서의 Fc 도메인은, 우선적으로 2량체를형성하고, 결과적으로면역글로불린유사의성질 ( 예를들면, Fc-FcγR 상호작용 ) 을나타내는디아바디분자가형성된다. Fc 함유디아바디는, 예를들면 2개의폴리펩티드사슬로이루어지고, 각각이 VH 도메인, VL 도메인및 Fc 도메인을포함하는 2량체여도좋다. 상기폴리펩티드사슬의 2량체화에의해, 비개변형 2가항체의구조와는명확히구별되는구조임에도불구하고, Fc 도메인을포함하는 2가의디아바디가생긴다 ( 도 11). 이와같은디아바디분자는야생형면역글로불린과비교하면, 예를들면혈중반감기나결합특성등과같은표현형의변화를나타낼수있다. 다른구체예에서, Fc 도메인을포함하는디아바디분자는 4량체이어도좋다. 상기 4량체는, 2개의 ' 무거운 ' 폴리펩티드사슬, 즉 VL, VH 및 Fc 도메인으로이루어지는폴리펩티드사슬와, 2개의 ' 가벼운 ' 폴리펩티드사슬, 즉 VL 및 VH으로이루어지는폴리펩티드사슬을포함한다. 상기경쇄및중쇄는상호작용에의해단량체를형성하고, 이들단량체는비쌍화상태의 Fc 도메인을통하여서로작용하여 Ig 유사분자를형성한다. 이와같은 Ig 유사디아바디는 4가이고, 단일특이성, 2중특이성, 또는 4중특이성일수있다. 디아바디분자의적어도 2개의결합부위는동일또는다른에피토프를인식할수있다. 다른에피토프는, 동일항원유래, 또는다른항원유래로할수있다. 하나의구체예에서, 에피토프는다른세포유래이다. 다른구체예에서, 에피토프는동일세포또는바이러스상의세포표면항원이다. 에피토프결합부위는, 항체의생성이가능한어떠한항원도인식할수있다. 예를들면, 단백질, 핵산, 박테리아독소, 세포표면마커, 자가면역마커, 바이러스단백질, 약물등이다. 구체적인구체예에서는, 디아바디의적어도 1개의에피토프결합부위는, 특정의세포, 예를들면 B 세포, T 세포, 식세포, NK 세포또는수상세포상의항원에대하여특이적이다. 디아바디의폴리펩티드사슬의각도메인즉 VL, VH 및 Fc 도메인은펩티드링커에의해분리할수있다. 이펩티드링커는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의아미노산으로할수있다. 어떠한구체예에서는, 아미노산링커서열은핵산서열서열번호 74에의해암호화되는 GGGSGGGG( 서열번호 10) 이다. 어떠한구체예에서는, 디아바디분자의각폴리펩티드사슬은, 디아바디분자의각폴리펩티드사슬이, 적어도 1개의시스테인잔기를포함하도록제작된다. 이시스테인잔기는, 본발명의두번째폴리펩티드사슬상의적어도 1개의시스테인잔기와상호작용하여, 쇄간이황화결합을형성할수있다. 쇄간이황화결합은, 디아바디분자의안정화에기여하고, 재조합계에서발현및회수를개선하는것으로, 결과적으로안정하고일관성이있는조제물을얻을수있을뿐아니라, 분리정제된산물의 in vivo에서의안정성을개선한다. 상기적어도 1개의시스테인잔기는, 단일의아미노산으로서또는비교적긴아미노산서열 ( 예를들면힌지도메인 ) 의일부로서, 폴리펩티드사슬의임의의위치에도입하는것이가능하다. 구체적인구체예에서, 상기적어도 1개의시스테인잔기를유전자제조합하는것에의해폴리펩티드사슬의 C-말단에존재하도록설계한다. 어떠한구체예에서, 상기적어도 1개의시스테인잔기는, 아미노산서열 LGGC의내부로폴리펩티드사슬에도입된다. 구체적인구체예에서, 본발명의디아바디분자를구성하는폴리펩티드사슬의 C-말단은, 아미노산서열 LGGC를포함한다. 다른구체예에서, 상기적어도 1개의시스테인잔기는, 예를들면서열번호 1 또는서열번호 4의, 힌지도메인을구성하는아미노산서열내부로폴리펩티드사슬내에도입된다. 구체적인구체예에서, 본발명의디아바디분자를구성하는폴리펩티드사슬의 C-말단은, 예를들면서열번호 1과같은 IgG 힌지도메인의아미노산을포함한다. 다른구체예에서, 본발명의디아바디분자를구성하는폴리펩티드사슬의 C-말단은, 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 78) 로암호화되는아미노산서열 VEPKSC( 서열번호 77) 를포함한다. 다른구체예에서, 상기적어도 1개의시스테인잔기는, 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 76) 로암호화되는아미노산서열 LGGCFNRGEC( 서열번호 17) 내부로폴리펩티드사슬내에도입된다. 구체적인구체예에서, 본발명의디아바디를포함하는폴리펩티드사슬의 C-말단은뉴클레오티드서열 ( 서열번호 76) 에의해암호화되는아미노산서열 LGGCFNRGEC( 서열번호 17) 을포함한다. 어떠한구체예에서, 상기적어도 1개의시스테인잔기는, 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 75) 로암호화되는아미노산서열 FNRGEC( 서열번호 23) 의내부로폴리펩티드사슬내에도입된다. 구체적인구체예에서, 본발명의디아바

27 디분자를구성하는폴리펩티드사슬의 C- 말단은, 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 75) 에의해암호화되는아미노산 서열 FNRGEC( 서열번호 23) 을포함한다. [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] 어떠한구체예에서, 디아바디분자는적어도 2개의폴리펩티드사슬을포함하고, 이들각쇄는아미노산서열 LGGC을포함하고, 상기서열내의시스테인잔기사이의이황화결합에의해공유결합된다. 다른구체적인구체예에서, 디아바디분자는적어도 2개의폴리펩티드사슬을포함하고, 이들중하나의쇄는아미노산서열 FNRGEC( 서열번호 23) 를포함하는반면, 다른쇄는적어도 1개의시스테인잔기를포함하는힌지도메인을포함하고, 상기적어도 2개의폴리펩티드사슬은 FNRGEC( 서열번호 23) 내의시스테인잔기와힌지도메인내의시스테인잔기사이의이황화결합에의해공유결한된다. 구체적인구체예에서, 힌지도메인에위치한이황화결합에대한시스테인잔기는 Cys-128(Kabat EU에의한번호부여 ; 개변되지않는완전한 IgG 중쇄의힌지도메인에위치 ) 이다. 또한, 그상대방은, 서열번호 23 중의시스테인잔기 Cys-214(Kabat EU에의한번호부여 ; 개변되지않는완전한 IgG 경쇄의 C-말단에위치 ) 이다 (Elkabetz et al.(2005) "Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains," J. Biol. Chem. 280: ; 참조로서그전체를본명세서에포함 ). 또다른구체예에서, 적어도 1개의시스테인잔기를유전자조작에의해아미노산쇄의 N-말단에존재시킨다. 또다른구체예에서, 적어도 1개의시스테인잔기를유전자조작에의해디아바디분자의폴리펩티드사슬의링커부분에존재시킨다. 또다른구체예에서, VH 또는 VL 도메인은조작전의 VH 또는 VL 도메인과비교하여적어도 1개의아미노산의개변을포함하도록유전자조작한다. 이와같은아미노산개변은, 조작전의아미노산을시스테인으로치환하는것을포함한다. 본발명은 Fc 도메인또는그일부 ( 예, CH2 도메인또는 CH3 도메인 ) 을포함하는디아바디분자를포함한다. Fc 도메인또는그일부는, IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM을포함하지만이에한정되는것은아니고, 어떠한면역글로불린의이소타입또는얼로타입 (allotype) 에유래해도좋다. Fc 도메인또는그일부는, IgG에서유래하는것이바람직한구체예이다. IgG 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는이들의얼로타입 (allotype) 인것이특히바람직한구체예이다. 어떠한구체예에서, 디아바디분자는 Fc 도메인을포함한다. 이 Fc 도메인은어떠한면역글로불린이소타입으로부터독립하여선택된 CH2 도메인또는 CH3 도메인을포함한다 ( 즉, Fc 도메인은 IgG 에서유래하는 CH2 도메인과 IgE에서유래하는 CH3 도메인, 또는 IgG1에서유래하는 CH2 도메인과 IgG2에서유래하는 CH3 도메인등을포함하여이루어진다 ). 상기 Fc 도메인을, 본발명의디아바디분자를구성하는폴리펩티드사슬중에, 상기폴리펩티드사슬의다른도메인또는부분에대하여어떠한위치여도, 유전자조작으로도입할수있다. 예를들면, Fc 도메인또는그일부가, 폴리펩티드사슬의 VL 및 VH 양쪽도메인의 N-말단에있어도좋고, 또는한쪽의도메인의 N-말단과다른쪽의도메인의 C-말단에 ( 즉, 폴리펩티드사슬의 2개의도메인사이 ) 있어도좋다. 본발명은또한, 힌지도메인을포함한는분자를포함한다. 힌지도메인은, IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM을포함하는어떠한면역글로불린의이소타입또는얼로타입에서유래될수있다. 바람직한구체예에서, 이힌지도메인은 IgG에서유래되고, 이 IgG 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는이것의얼로타입이다. 이힌지도메인은디아바디분자가힌지 Fc 도메인을포함하도록, 디아바디분자를구성하는폴리펩티드사슬중에 Fc 도메인과함께, 유전자조작으로도입할수있다. 어떠한구체예에서, 힌지및 Fc 도메인은, 당해분야에서공지또는본명세서에서예시한어떤면역글로불린이소타입과도무관하게선택된다. 다른구체예에서, 힌지및 Fc 도메인은, 폴리펩티드사슬의적어도 1개의다른도메인, 예를들면, VL 도메인에의해떨어져있다. 힌지도메인을또는임의로힌지-Fc 도메인을, 본발명의폴리펩티드중에, 상기폴리펩티드사슬의다른도메인또는일부에대하여어떠한위치여도, 유전자조작으로도입할수있다. 어떠한구체예에서, 본발명의폴리펩티드사슬은힌지도메인을포함하지만, 이힌지도메인은 Fc 도메인을포함하지않는폴리펩티드사슬의 C-말단에존재한다. 또다른구체예에서, 본발명의폴리펩티드사슬은, 폴리펩티드사슬의 C-말단에존재하는힌지-Fc 도메인을포함한다. 어떠한구체예에서, 본발명의폴리펩티드사슬은, 폴리펩티드사슬의 N-말단에존재하는힌지-Fc 도메인을포함한다. 상술한바와같이, 본발명은각각의폴리펩티드사슬이 VH 및 VL 도메인을포함하는폴리펩티드사슬의다량체를포함한다. 어떠한구체예에서, 상기다량체의폴리펩티드사슬은또한 Fc 도메인을포함한다. Fc 도메인의 2 량체형성은, 면역글로불린유사의기능성, 즉 Fc를통한기능 ( 예, Fc-FcγR 상호작용, 보체결합등 ) 을나타내는디아바디분자의형성을야기한다. 어떠한구체예에서, 각폴리펩티드사슬을구성하는 VH 및 VL 도메인은동일한특이성을나타내고, 상기디아바디분자는 2가이고, 또한단일특이적이다. 다른구체예에서, 각폴리펩티드사슬을구성하는 VH 및 VL 도메인은다른특이성을갖고, 디아바디는 2가이고또한이중특이적이다. 다른구체예에서, 본발명의디아바디분자는, 각폴리펩티드사슬이 VH 및 VL 도메인을포함하는폴리펩티드

28 사슬의 4량체를포함한다. 어떠한구체예에서, 4량체의 2개의폴리펩티드사슬은또한 Fc 도메인을포함한다. 따라서, 4량체는각각이 VH, VL 및 Fc 도메인으로이루어지는 2개의 ' 무거운 ' 폴리펩티드사슬와, VH 및 VL 도메인으로이루어지는 2개의 ' 가벼운 ' 폴리펩티드사슬을포함한다. 2가단량체로의중쇄와경쇄의상호작용과결합한, 중쇄의 Fc 도메인을통한 2가단량체의 2량체형성은 4가의면역글로불린유사분자의형성을야기할수있다 ( 실시예 6.2 및 6.3에예시 ). 어떠한구체예에서, 단량체는동일하고, 4가의디아바디분자는단일특이성또는이중특이성이다. 다른구체예에서단량체는다르고, 4가의분자는이중특이성또는 4중특이성이다. [0090] [0091] [0092] 상기 4중특이성디아바디분자의형성은, 4개의다른폴리펩티드사슬의상호작용을필요로한다. 이와같은상호작용을단세포재조합체생산시스템에서효율적으로행하는것은, 쇄의잠재적인미스페어링에의한다수의변이체의존재때문에곤란한다. 미스페어링의가능성이증가하는것에대한하나의해결책은, 소망하는폴리펩티드사슬쌍의중에 "knobs-into-holes" 형변이를도입하는것이다. 이러한변이는, 호모이량체형성보다도헤테로이량체형성이바람직하다. 예를들면, Fc-Fc 상호작용에관하여, 아미노산치환 ('knob' 을형성하는벌키한측쇄를포함하는아미노산, 예를들면트립토판과치환하는것이바람직 ) 을 CH2 또는 CH3 도메인에도입하여, 입체방해가유사하게돌연변이된도메인과의상호작용을막도록하고, 또한입체방해가그변이형도메인을, 상보적인또는적합한변이 ( 즉,"the hole", 예를들면글리신으로치환하는 ) 를유전자조작으로도입한도메인과, 강제적으로쌍을이루도록한다. 이러한변이세트는, 디아바디분자를구성하는어떠한폴리펩티드사슬쌍에도유전자조작으로도입하는것이가능하고, 또한이러한쌍의폴리펩티드사슬의어느부분에도유전자조작으로도입하는것이가능하다. 호모이량체형성보다도헤테로이량체형성에유리한단백질조작의방법, 특히면역글로불린유사분자의조작에대하여는, 당해분야에서잘알려져있고, 이들은본명세서중에포함된다 (Ridgway et al.(1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CHS Domains For Heavy Chain Heterodimerization,"Protein Engr. 9: , Atwell et al.(1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,"J. Mol. Biol. 270: 26-35, 및 Xie et al.(2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis," J. Immunol. Methods 296:95-101; 이들문헌은참조로서그전체를본명세서중에포함한다 ). 또한, 본발명은변이형 Fc 또는변이형힌지-Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 를포함하는디아바디분자를포함한다. 이변이형 Fc 도메인은, 비교가능한야생형힌지-Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 과비교하여, 적어도하나의아미노산개변 ( 예, 치혼, 삽입또는결실 ) 을포함하고있다. 변이형 Fc 도메인또는변이형힌지-Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는분자 ( 예, 항체 ) 는, 야생형 Fc 도메인또는야생형힌지-Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는분자와비교하여, 통상은표현형이변화되어있다. 변이형의표현형은, NK 의존성또는마크로파지의존성분석으로분석한경우, 혈중반감기의변화, 안정성의변화, 세포성효소에대한감수성의변화, 또는이펙터기능의변화로서표현되는경우가있다. 이펙터기능이변화된것이확인된변이형 Fc 도메인은, 국제공개 WO 04/063351호, 미국특허출원공개 2005/ 및 2005/ 호, 미국가출원제60/626,510호 (2004년 11월 10 일출원 ), 제60/636,663호 (2004년 12월 15일출원 ) 및제60/781,564호 (2006년 3월 10일출원 ), 본발명자의동시출원인미국특허출원제11/271,140(2005년 11월 10일출원 ) 및제11/305,787호 (2005년 12월 15일 ) 에개시되어있다. 각특허문헌은참조로서그전체가본명세서에포함된다. 본발명의이중특이성디아바디는, 2개의분리한다른에피토프에동시에결합할수있다. 어떠한구체예에서, 에피토프는동일항원유래이다. 다른구체예에서, 에피토프는다른항원유래이다. 적어도하나의에피토프결합부위는, T 림프구, NK 세포, 또는다른단핵세포로발현되고, 면역이펙터세포상에제시되는결정원인 ( 예, CD3, CD16, CD32, CD64 등 ) 에특이적인것이구체예로서바람직하다. 하나의구체예에서, 디아바디분자는이펙터세포의결정원인에결합하고, 또한상기이펙터세포도활성화한다. 이와관련하여, 본발명의디아바디분자는이들이더욱 Fc 도메인을포함하는지여부는관계없이, Ig 유사의기능성을나타낼수있다 ( 예, 당해분야에서공지의또는본명세서에서예시한, 어떠한이펙터기능분석 ( 예, ADCC assay) 로분석 ). 어떠한구체예에서, 본발명의이중특이성디아바디는, 종양세포상의암항원과이펙터세포의결정원인의양쪽에결합하는것과동시에이펙터세포를활성화한다. 다른구체예에서, 본발명의이중특이성디아바디또는디아바디분자는, 상기 ( 배경기술참조 ) 와같이, 동일세포상의활성화수용체와억제수용체에동시에결합하고 ( 예, CD32A와 CD32B, BCR과 CD32B, 또는 IgERI과 CD32B에결합 ), 이들을연결하는것에의해표적 ( 예, 이펙터 ) 세포의활성화를정해하는것이가능하다. 본구체예의다른측면에서, 이중특이성디아바디는, 바이러스상의 2개의중화에피토프 ( 예, RSV 에피토프 ; E16 및 E53과같은 WNV 에피토프 ) 에동시에결합하는것에의해, 항바이러스성을나타낼수있다

29 [0093] [0094] [0095] [0096] 어떠한구체예에서, 본발명의이중특이성디아바디분자는, 특정의세포형을표적으로하기위한특유의기회를제공한다. 예를들면, 이중특이성디아바디또는디아바디분자를, 유전자조작하여표적세포형또는표적조직형에특이한항원의세트를인식하는에피토프결합부위의조합을포함하도록하는것이가능하다. 또한, 각각의항원의한쪽또는양쪽이, 다른조직및 / 또는세포형에서별개로일반적인것이라면, 저친화성결합도메인을이용하여, 디아바디또는디아바디분자를구축하는것이가능하다. 이러한저친화성결합도메인은, 치료목적을위해충분한결합력으로개개의에피토프또는항원에결합할수없을것이다. 그러나, 에피토프또는항원의양쪽이, 단일표적세포또는조직상에존재하는경우, 그세포또는조직에대한디아바디또는디아바디분자의결합력은, 항원하나만을발현하고있는세포또는조직의것과비교하면증가할수있을것이다. 이와같이, 상기세포또는조직은, 본발명에의해효율적으로표적화될수있다. 상기이중특이성분자는, 단지하나의항원에대한특이성을갖는단일특이성디아바디또는항원과비교하면, 상기양쪽의항원을발현하는세포상의한쪽또는양쪽의표적항원에대하여강화된결합성을나타낼수있다. 본발명의디아바디결합특성은, 결합활성및 / 또는 1 이상의 FcγR을통한이펙터세포기능 (Fc-FcγR 상호작용을통하여, 또는 F cγr에대한디아바디분자의면역특이적결합에의해중개된다 ) 을측정하기위해 in vitro 기능분석에의해특성분석되는것이바람직하다 (5.4.2 및 참조 ). FcγR에대한본발명의분자 ( 예, 디아바디 ) 의친화성및결합특성을결합도메인항원또는 Fc-FcγR 상호작용 ( 즉, 각각, 결합도메인에의항원특이적결합, 또는 FcγR에의 Fc 영역의특이적결합 ) 을측정하기위해당해분야에서공지된 in vitro 분석법 ( 생화학적또는면역학을베이스로한분석법 ) 을이용하여측정할수있다. 상기 in vitro 분석법에는, ELISA 분석, 표면플라즈몬공명분석, 면역침전분석 (5.4.2 참조 ) 가포함되나, 이에한정되는것은아니다. 본발명의분자가 ( 본명세서에기재, 개시된바와같이 ) in vivo 모델에서, in vitro 베이스의분석에있어서의이것과유사한결합특성을갖는구체예가가장바람직하다. 그러나, 본발명은 in vitro 베이스의분석에서는원하는표현형을나타내지않지만, in vivo 에서는원하는표현형을나타내는본발명의분자를배제하는것은아니다. 어떠한구체예에서는, 본발명의분자를조작하여, 금형분자 (template molecule) 의상응하는부분과비교하여, 변화한글리코실화패턴또는변화한글리코폼을포함하도록할수있다. 조작된글리코폼은, 이펙터기능을증강하는것을포함하지만이에한정되지않고, 다양한목적에유용하다. 예를들면, 유전자조작된또는변이형의발현주를이용하는방법, 1 이상의효소, 예를들면, DI N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnT III) 와의공발현에의한방법, 각종생물또는각종생물유래의세포주에서본발명의디아바디를발현시키는방법, 또는디아바디를발현시켜정제한후에탄수화물을변형시키는방법을들수있다. 유전자조작된글리코폼을제작하는방법은, 당해분야에서공지되어있다. 이러한방법은, Umana et al.(1999) "Engineered Glycoforms Of An Antineuroblastoma IgG1 With Optimized Antibody-Dependent Cellular Cytotoxic Activity," Nat. Biotechnol 17: ; Davies et al.(2001) "Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In Adcc Through Higher Affinity For Fc Gamma RIII," Biotechnol Bioeng 74: ; Shields et al.(2002) "Lack Of Fucose On Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fc gamma RIII And Antibody- Dependent Cellular Toxicity," J Biol Chem 277: ; Shinkawa et al.(2003) "The Absence Of Fucose But Not The Presence Of Galactose 또는 Bisecting N-Acetylglucosamine Of Human IgG1 Complex-Type Oligosaccharides Shows The Critical Role Of Enhancing Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity," J Biol Chem 278: , US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739Al; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140Al; PCT WO 02/30954A1; Potillegent technology(biowa, Inc. Princeton, NJ); GlycoMAb glycosylation engineering technology(glycart biotechnology AG, Zurich, Switzerland) 을포함하지만, 이에한정되지않는다. 또한, 상기방법들은참조로서그전체가본명세서에포함된다. 예를들면, WO ; EA ; US ; Okazaki et al.(2004) "Fucose Depletion From Human IgG1 Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy And Association Rate Between IgG1 And Fc GammaRIIIA," JMB, 336: 를참조하고, 이들은참조로서그전체가본명세서에포함된다. 또한, 본발명은, 본발명의디아바디를제작하기위해비천연아미노산을조립하는것을포함한다. 이와같은방법은당업자에게공지이다. 예를들면, 천연의생합성기구를이용하여단백질내로의비천연아미노산조립을가능하게하는방법등이있다. 예를들면, Wang et al.(2002) "Expanding The Genetic Code," Chem. Comm. 1 : 1-11; Wang et al.(2001) "Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli," Science, 292: ; van Hest et al.(2001) "Protein-Based Materials, Toward A New Level Of Structural Control," Chem. Comm. 19: 를참조할수있고, 이들은참조로서그전체가본명세서에포함된다. 또다른방법으로, 아미노아실

30 -trna의생합성에관여하는효소에중점을두는방법으로서, 예를들면, Tang et al.(2001) "Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled-Coil Protein Containing Hexafluoroleucine In An Engineered Bacterial Host," J. Am. Chem. Soc. 123(44): ; Kiick et al.(2001) "Identification Of An Expanded Set Of Trans lationally Active Methionine Analogues In Escherichia coli," FEBS Lett. 502(1-2):25-30를참조할수있고, 이들은참조로서그전체가본명세서에포함된다. [0097] [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] 어떠한구체예에서, 본발명은글리코실화부위를부가또는결실하는것에의해, 본발명의분자의 VL, VH 또는 Fc 도메인을개변하는방법을포함한다. 단백질의탄수화물을개변하는방법은, 당해분야에서공지이고, 본발명중에포함된다. 예를들면, 미국특허제6,218,149호 ; EP B1; 미국공개제2002/ 호 ; WO 03/035835; 미국공개제2003/ 호 ; 미국특허제6,218,149호 ; 미국특허제6,472,511호를참조할수있고, 이들은참조로서그전체가본명세서에포함된다. 본발명의디아바디분자는자연살해그룹 2D(NKG2D) 수용체에대한결합리간드인도메인을포함하도록구축될수있다. 이런결합리간드, 및특히정상세포에서발현되지않는이들은조직적합성 60(H60) 분자, 레티노산초기유도유전자-1(RAE-1) 의산물, 및설치류 UL16-결합단백질유사전사체 1(MULT1) 을포함한다 (Raulet D.H.(2003) "Roles Of The NKG2D Immunorecepter And Its Ligand" Nature Rev. Immunol. 3: ; Coudert, J.D. et al.(2005) "Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells," Blood 106: ). 인간 NKG2D와반응하는추가적인리간드는다형성 MHC 클래스 I 사슬-연관분자 MICA 및 MICB를포함한다 (Diefenbach, A. et al.(1999) "Natural Killer Cells: Stress Out, Turn On, Tune In," Curr. Biol. 9(22):R851-R8533; Bauer, S. et al.(1999) "Activation Of NK Cells 및 T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA," Science 285(5428): ; Stephens, H.A.(2001) "MICA and MICB genes: can Enigma of their polymorphism be resolved?," Trends Immunol. 22: ). MICA의서열은서열번호 311이다 : MGLGPVFLLL AGIFPFAPPG AAAEPHSLRY NLTVLSWDGS VQSGFLTEVH LDGQPFLRCD RQKCRAKPQG QWAEDVLGNK TWDRETRDLT GNGKDLRMTL AHIKDQKEGL HSLQEIRVCE IHEDNSTRSS QHFYYDGELF LSQNLETKEW TMPQSSRAQT LAMNVRNFLK EDAMKTKTHY HAMHADCLQE LRRYLKSGVV LRRTVPPMVN VTRSEASEGN ITVTCRASGF YPWNITLSWR QDGVSLSHDT QQWGDVLPDG NGTYQTWVAT RICQGEEQRF TCYMEHSGNH STHPVPSGKV LVLQSHWQTF HVSAVAAAAI FVIIIFYVRC CKKKTSAAEG PELVSLQVLD QHPVGTSDHR DATQLGFQPL MSDLGSTGST EGA MICB의서열은서열번호 312이다 : PHSLRYNLMV LSQDGSVQSG FLAEGHLDGQ PFLRYDRQKR RAKPQGQWAE DVLGAKTWDT ETEDLTENGQ DLRRTLTHIK DQKGGLHSLQ EIRVCEIHED SSTRGSRHFY YDGELFLSQN LETQESTVPQ SSRAQTLAMN VTNFWKEDAM KTKTHYRAMQ ADCLQKLQLP PMVNVICSEV SEGNITVTCR ASSFYPRNIT LTWRQDGVSL SHNTQQWGDV LPDGNGTYQT WVATRIRQGE EQRFTCYMEH SGNHGTHPVP SGKALVLQSQ RT DFPYVSAA MPCFVIIIIL CVPCCKKKT S AAEGP T-세포수용체에특이적으로결합하는항체는항TCR 항체 BMA 031을포함한다 (Kurrle, R. et al.(1989) "BMA 031-A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application," Transplant Proc. 21(1 Pt 1): ; Nashan, B. et al.(1987) "Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex," Transplant Proc. 19(5): ; Shearman, CW. et al.(1991) "Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α/β T Cell," J. Immunol. 146(3): ; Shearman, CW. et al.(1991) "Construction, Expression, And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human a/β T Cell Receptor," J. Immunol. 147(12): ). NKG2D 수용체에특이적으로결합하는항체는 KYK-2.0을포함한다 (Kwong, KY et al.(2008) "Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual

31 Antagonistic And Agonistic Activity," J. MoI. Biol. 384: ; 및 PCT/US09/54911). [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] 이런디아바디의용도를통하여, 이제표적세포는 (NKG2D) 수용체를배열한세포에의해결합할수있는세포가되도록초점을바꾼다. NKG2D 수용체는모든인간 ( 및다른포유동물 ) 자연살해세포 (Bauer, S. et al.(1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA" Science 285(5428): ; Jamieson, A.M. et al.(2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing," Immunity 17(1): 19-29) 뿐만아니라모든 CD8+ T 세포 (Groh, V. et al.(2001) "Costimulation Of CD8aβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells," Nat. Immunol. 2(3): ; Jamieson, A.M. et al.(2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing " Immunity 17(l):19-29) 에서발현된다. 대안적으로, 본발명의디아바디분자는 T-세포수용체 ("TCR") 에대한결합리간드인도메인을포함하도록구축될수있다. TCR은 CD4+ 또는 CD8+ T-세포에의해천연적으로발현되고, 이런세포가항원-제시세포의클래스 I 또는클래스 II MHC 단백질에의해결합되고제시되는항원성펩티드를인지하는것을허용한다. TCR에의한 pmhc( 펩티드-MHC) 복합체의인식은사이토카인의생산및항원-제시세포의용해를유도하는세포면역반응의전파를시작한다 ( 예컨대, Armstrong, K.M. et al.(2008) "Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptid-MHC Complexes," Biochem. J. 415(Pt 2): ; Willemsen, R.(2008) "Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy," Cytometry A. 73(11): ; Beier, K.C. et al.(2007) "Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation," Eur. Respir. J. 29: ; Mallone, R. et al.(2005) "Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes," Am. J. Ther. 12(6): 을참조하라 ). 예를들어, 표적세포의표면에존재하는수용체에결합할수있는적어도하나의에피토프-결합도메인을추가로포함하도록이런디아바디분자를구축함으로써, 이런디아바디분자는 DART 분자일것이고, 따라서표적세포에대한결합이가능하며, 그것으로인해표적세포가자연살해그룹 2D(NKG2D) 수용체또는 TCR에대한결합리간드를제시하는것을유발한다 ( 표적세포-결합디아바디에존재하는것은무엇이든 )( 예컨대, Germain, C. et al.(2008) "Redirecting NK Cells Mediated Tumor Cell Lysis By A New Recombinant Bifunctional Protein," Prot. Engineer. Design Selection 21(11): 를참조하라 ). 이런디아바디는 NK 세포-매개세포용해또는 T-세포매개세포독성의표적인세포에임의의원하는표적세포로초점을바꾸기위하여사용될수있다. 한구체예에서, 표적세포의표면에존재하는수용체에결합할수있는디아바디의에피토프-결합도메인은이런암세포가 NK 세포-매개세포용해또는 T-세포매개세포독성에대한기질로초점을바꾸도록종양-연관항원에결합하는에피토프이다. 특별한관심은유방암항원, 난소암항원, 전립선암항원, 자궁경부암항원, 췌장암항원, 폐암항원, 방광암항원, 결장암항원, 고환암항원, 교모세포종암항원, B 세포악성종양과관련된항원, 다발성골수종과관련된항원, 비-호지킨림프종과관련된항원, 또는만성림프구성백혈병과관련된항원인종양-연관항원이다. 이런용도를위한적절한종양-연관항원은 A33( 결장암종항원 ; Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov;33(8): ); Bl(Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(l):6-9); BAGE(Bodey, B Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); 베타-카테닌 (Prange W. et al J Pathol. 201(2):250-9); CA125(Bast, R.C. Jr. et al Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81); CD5(Calin, G.A. et al Semin Oncol. 33(2): ; CD19(Troussard, X. et al Hematol Cell Ther. 40(4): ); CD20(Thomas, D.A. et al Hematol Oncol Clin North Am. 20(5): ); CD22(Kreitman, R.J AAPS J. 18;8(3):E532-51); CD23(Rosati, S. et al Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107); CD25(Troussard, X. et al Hematol Cell Ther. 40(4): ); CD27(Bataille, R Haematologica 91(9): ); CD28(Bataille, R Haematologica 91(9): ); CD36(Ge, Y Lab Hematol. 11(l):31-7); CD40/CD154(Messmer, D. et al Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60); CD45(Jurcic, J.G Curr Oncol Rep. 7(5):339-46); CD56(Bataille, R Haematologica 91(9): ); CD79a/CD79b(Troussard, X. et al Hematol Cell Ther. 40(4): ; Chu, P.G. et al Appl Immunohistochem MoI Morphol. 9(2):97-106); CD103(Troussard, X. et al Hematol Cell Ther. 40(4): ); CDK4(Lee, Y.M. et al Cell Cycle 5(18):2110-4); CEA( 암배항원 ; Mathelin, C Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al Rev Invest Clin. 57(6):814-9); CTLA4(Peggs, K.S. et al Curr Opin Immunol. 18(2):206-13); EGF-R( 상피성장인자수용체 ; Adenis, A. et al Bull Cancer. 90 Spec

32 No:S228-32); Erb(ErbBl; ErbB3; ErbB4; Zhou, H. et al Oncogene 21(57): ; Rimon, E. et al Int J Oncol. 24(5): ); GAGE(GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al Int J Cancer. 118(1): 123-8); GD2/GD3/GM2(Livingston, P.O. et al Cancer Immunol Immunother. 54(10): ); gp1oo(lotem, M. et al J Immunother. 29(6):616-27); HER-2/neu(Kumar, Pal S et al Semin Oncol. 33(4):386-91); 인간파필로마바이러스-E6/ 인간파필로마바이러스-E7(DiMaio, D. et al Adv Virus Res. 66:125-59); KSA(17-1A)(Ragupathi, G Cancer Treat Res. 123:157-80); MAGE(MAGE-1; MAGE- 3; (Bodey, B Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); MART(Kounalakis, N. et al Curr Oncol Rep. 7(5):377-82); MUC-1(Mathelin, C Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46); MUM-1(Castelli, C. et al J Cell Physiol. 182(3):323-31); N-아세틸글루코사민전이효소 (Dennis, J.W Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21-34); p15(gil, J. et al Nat Rev MoI Cell Biol. 7(9):667-77); PSA(prostate specific 항원 ; Cracco, CM. et al Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11); PSMA(Ragupathi, G Cancer Treat Res. 123:157-80); stn(holmberg, L.A Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91); TNF-수용체 (TNF-α 수용체, TNF-β 수용체 ; 또는 TNF-γ 수용체 ; van Horssen, R. et al Oncologist. 11(4): ; Gardnerova, M. et al Curr Drug Target. 1(4):327-64); 또는 VEGF 수용체 (O'Dwyer. PJ Oncologist. 11(9):992-8) 을포함한다. [0119] [0120] [0121] [0122] [0123] [0124] 이런용도를위한추가적인종양-연관항원 ( 그리고이런항원에특이적으로반응하는항체를개시하는간행물 ) 은 ADAM-9( 미국특허공개번호 2006/ ; PCT 공개번호WO 06/084075); ALCAM(PCT 공개번호WO 03/093443); 카르복시펩티다아제 M( 미국특허공개번호 2006/ ); CD46( 미국특허번호 7,148,038; PCT 공개번호WO 03/032814); 사이토케라틴 8(PCT 공개번호WO 03/024191); 에프린수용체 ( 그리고특히 EphA2( 미국특허번호 7,569,672; PCT 공개번호WO 06/084226); 인테그린알파-V-베타-6(PCT 공개번호WO 03/087340); JAM-3(PCT 공개번호WO 06/084078); KID3(PCT 공개번호WO 05/028498); KID31(PCT 공개번호WO 06/076584); LUCA-2( 미국특허공개번호 2006/ ; PCT 공개번호WO 06/083852); 온코스타틴 M( 온코스타틴수용체베타 )( 미국특허번호 7,572,896; PCT 공개번호WO 06/084092); PIPA( 미국특허번호 7,40s,061; PCT 공개번호 WO 04/043239); RAAG1O( 미국특허번호 7,527,969; PCT 공개번호WO 04/001381); RORl( 미국특허번호 5,843,749); TES7(PCT 공개번호 WO 08/066691); 및트랜스페린수용체 ( 미국특허번호 7,572,895; PCT 공개번호WO 05/121179) 를포함한다. 또한관심있는것은특정전염성제제, 예컨대, 인간면역결핍바이러스 (HIV), B형간염바이러스 (HBV), 인플루엔자, 인간유두종바이러스 (HPV), 구제역 ( 콕사키바이러스 ), 광견병바이러스, 단순포진바이러스 (HSV) 를포함하지만이에제한되지않는바이러스제제, 및로타바이러스, 아데노바이러스, 칼리시바이러스, 아스트로바이러스및노르워크바이러스를포함하는위장염의원인인자 ; E. 콜리, 살모넬라타이피뮤리움, 슈도모나스에루지노사, 비브리오콜레라, 네이세리아고노로에, 헬리코박터파일로리, 헤모필러스인플루엔자, 시겔라디센테리에, 스타필로코쿠스아우레우스, 마이코박테리움투베르쿨로시스및스트렙토코쿠스뉴모니에를포함하지만, 이에제한되지않는박테리아제제, 곰팡이제제및가르디 (Giardi) 와같은기생충에특이적인항원이다. 대안적으로, 이런에피토프는예를들어급성단핵구성백혈병세포가 NK 세포-매개세포용해에대한기질로방향을바꾸도록 Fc 수용체 ( 예컨대, FcγRI 또는 FcγRII) 에결합할수있다. 5.1 디아바디결합도메인본발명의디아바디는, 일반적으로면역글로불린또는항체에유래하는항원결합도메인을포함한다. 본발명의방법에사용하는결합도메인이유래하는항체는, 조류및포유동물 ( 예, 인간, 비인간영장류, 뮤린, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니아피그, 낙타, 말또는닭 ) 을포함하는어떠한동물기원의것이어도좋다. 항체는, 인간또는인간화단일클론항체인것이바람직하다. 본명세서에서이용하는경우, ' 인간 ' 항체는, 인간면역글로불린의아미노산서열을갖는항체를포함하여, 인간면역글로불린라이브러리또는합성인간면역글로불린암호화서열의라이브러리, 또는암호화유전자유래의항체를발현하는마우스로부터단리한항체를포함한다. 본발명은, 암, 자가면역질환, 염증성질환또는감염증의치료및 / 또는예방용에당해분야에서알려진어떠한항체를, 본발명의디아바디의결합도메인의소스로서사용하는것을의도하고있다. 알려진암항체의비한정적인예를섹션 5.7.1에나타낼뿐아니라, 열거한표적항원에특이적인다른항체, 및섹션 5.7.1에열거한암항원에대한항체를나타낸다. 자가면역질환및염증성질환의치료및 / 또는예방용의알려진항체의비한정적인예를섹션 5.7.2에나타낼뿐아니라, 열거한표적항원에대한항체및섹션 5.6.1에열거한항원에대한

33 항체도나타낸다. 다른구체예에서, 섹션 5.6.3에열거한감염증에관련한에피토프에대한항체를사용하는것이가능하다. 어떠한구체예에서, 상기항체는 1 이상이아미노산서열개변을갖는변이형 Fc 영역을포함한다. 당해항체는, 본발명의방법에의해동정되고, 부여된이펙터기능, 및 / 또는야생형 Fc 영역을포함하는대응하는분자와비교하여 FcγRIIB에대한친화성의증강및 FcγRIIIA에대한친화성의저감을갖는것이알려져있다. 본발명에따라제작될수있는염증성질환의치료또는예방에이용되는항체의비한정적예를표 23에나타낸다. 또한, 자가면역질환의치료또는예방에이용되는항체의비한정적예를표 24에나타낸다. [0125] [0126] [0127] 인간에있어서의항체의 in vivo에서의사용및 in vitro 검출분석을포함하는어떠한사용에관하여, 인간, 키메라또는인간화항체유래의가변도메인을갖는디아바디를사용하는것이바람직하다. 완전한인간항체유래의가변영역은, 피험자의치료를위해특히바람직하다. 인간항체는, 인간면역글로불린서열에유래하는항체라이브러리를이용한상기파아지디스플레이법 (phage display method) 을포함하는, 당해분야에서알려진다양한방법에의해작성하는것이가능하다. 또한, 미국특허제4,444,887호및제4,716,111; 및국제공개 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741도참조되며, 이들각각은참조로서그전체가본명세서에포함된다. 인간항체는소정의항원에결합할수있고, 인간면역글로불린의아미노산서열을실질적으로갖는프레임워크영역 (framework region) 과인간이외의면역글로불린의아미노산서열을실질적으로갖는 CDR을포함하는, 항체, 그변이체또는단편을말한다. 인간화항체는, 적어도하나의, 일반적으로는 2개의가변도메인을실질적으로전부포함하는것이가능하다. 이가변도메인은 CDR 영역의전부또는실질적으로전부가인간이외의면역글로불린 ( 즉, 공여자항체 ) 의 CDR 영역과일치하고, 전부또는실질적으로전부인프레임워크영역이인간면역글로불린의컨센서스서열 (consensus sequence) 의프레임워크영역으로되어있다. 인간화항체의프레임워크영역및 CDR 영역은, 모서열과정확히일치할필요는없다. 예를들면, 공여자 CDR 또는컨센서스프레임워크는, 적어도 1개의잔기의치환, 삽입또는결실에의해변이유발되고, 변이유발된부위의 CDR 또는프레임워크잔기가컨센서스또는공여자항체에일치하지않도록하는것이가능하다. 그러나, 이와같은변이를광범위하게행하는것은바람직하지않다. 일반적으로는, 인간화항체잔기의적어도 75%, 바람직하게는 90% 이상, 가장바람직하게는 95% 를초과하는잔기가, parent의프레임워크영역 (FR) 및 CDR의것과일치한다. 인간화항체는당해분야에서알려진다양한기술을이용하여제작될수있다. 한정하는것은아니지만, 그와같은기술에는, CDR-그라프트법 ( 유럽특허번호 EP 239,400; 국제공개번호 WO 91/09967; 및 U.S. 특허번호 5,225,539, 5,530,101, and 5,585,089), 베니어링 (veneering) 또는리서피싱 (resurfacing)( 유럽특허번호 EP 592,106 및 EP 519,596; Padlan(1991) "A Possible Procedure For Reducing The Immunogenicity Of Antibody Variable Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties," Molecular Immunology 28(4/5): ; Studnicka et al.(1994) "Human-Engineered Monoclonal Antibodies Retain Full Specific Binding Activity By Preserving Non-CDR Complementarity-Modulating Residues," Protein Engineering 7(6): ; and Roguska et al.(1994) "Humanization Of Murine Monoclonal Antibodies Through Variable Domain Resurfacing," Proc Natl Acad Sci USA 91 : ), chain shuffling(u.s. 특허번호 5,565,332), 및예를들면, U.S. 특허번호 6,407,213, 5,766,886, 5,585,089, 국제공개 WO , Tan et al.(2002) "'Superhumanized' Antibodies: Reduction Of Immunogenic Potential By Complementarity-Determining Region Grafting With Human Germline Sequences: Application To An Anti-CD28," J. Immunol. 169: , Caldas et al.(2000) "Design And Synthesis Of Germline-Based Hemi-Humanized Single-Chain Fv Against The CD 18 Surface Antigen," Protein Eng. 13 :353-60, Morea et al.(2000) "Antibody Modeling: Implications For Engineering And Design," Methods 20:267-79, Baca et al.(1997) "Antibody Humanization Using Monovalent Phage Display," J. Biol. Chem. 272: , Roguska et al.(1996) "A Comparison Of Two Murine Monoclonal Antibodies Humanized By CDR-Grafting And Variable Domain Resurfacing," Protein Eng. 9: , Couto et al.(1995) "Designing Human Consensus Antibodies With Minimal Positional Templates," Cancer Res. 55(23 Supp):5973s-5977s, Couto et al.(1995) "Anti-BA46 Monoclonal Antibody Mc3: Humanization Using A Novel Positional Consensus And In Vivo And In Vitro Characterization," Cancer Res. 55: , Sandhu(1994) "A Rapid Procedure For The Humanization Of Monoclonal Antibodies," Gene 150:409-10, Pedersen et al.(1994) "Comparison Of Surface Accessible Residues In Human And Murine Immunoglobulin Fv Domains. Implication For Humanization Of Murine Antibodies," J. MoL Biol. 235: , Jones et al.(1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse," Nature 321 : , Riechmann et al.(1988) "Reshaping Human Antibodies For

34 Therapy," Nature 332: 및 Presta(1992) "Antibody Engineering," Cure. Op. Biotech. 3(4): 에개시된기술등이포함된다. 흔히, 프레임워크영역중의프레임워크잔기를, CDR 공여자항체유래에대응하는잔기로치환하여항원결합성을변화시키고, 바람직하게는개선할수있다. 이러한프레임워크치환은, 당기술분야에서주지의방법으로동정될수있다. 예를들면, CDR과프레임워크잔기의상호작용을모델링하여항원결합성에중요한프레임워크잔기를동정하는방법, 및서열비교에의해특정의위치의특유의프레임워크잔기를동정하는방법을들수있다 ( 예를들면, Queen et al, U.S. 특허번호 5,585,089; U.S. 공개번호 2004/ and 2003/ ; U.S. 특허번호 6,350,861; 6,180,370; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; 및 5,530,101 및 Riechmann et al.(1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy,"Nature 332: 이있고, 이들모두는참조로서그전체가본명세서에포함된다 ). [0128] [0129] [0130] [0131] [0132] [0133] 가장바람직한구체예에서, 인간화결합도메인은, 공여자인마우스항체와동일한에피토프에특이적으로결합한다. 당업자에게는, 본발명이일반적으로항체의 CDR 그라프트법을포함하는것으로이해될것이다. 따라서, 설령동일항체클래스또는동일항체서브클래스여도, 공여자항체와수용자항체를동일종의동물유래로하는것이가능하다. 그러나, 보다일반적으로는, 공여자측및수용자측의항체는, 다른종류의동물에서유래한다. 전형적으로는, 공여자항체는설치류 mab이고, 수용자항체는인간의항체이다. 어떠한구체예에서, 공여자항체로부터유래하는적어도하나의 CDR이인간항체에그라프트화된다. 다른구체예에서, 중쇄및 / 또는경쇄가변영역의각각의적어도 2개, 바람직하게는 3개전부의 CDR이인간항체에그라프트화된다. CDR은, Kabat CDR, 루프 CDR, 또는이들의조합을포함할수있다. 어떠한구체예에서, 본발명은, 적어도하나의 CDR 그라프트화중쇄와적어도하나의 CDR 그라프트화경쇄를함유하는인간화 FcγRIIB 항체를포함한다. 본발명의방법에서이용되는디아바디에는, 변형된유도체, 즉디아바디에어떠한디아바디분자가공유결합하여변형된유도체가포함된다. 예를들면, 한정되는것은아니지만, 상기디아바디유도체는예를들면, 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 공지의보호기 / 봉쇄기 (protecting/blocking group) 에의한유도체화, 단백질분해절단, 세포성리간드또는다른단백질과의결합등에의해개변된디아바디를포함한다. 어떠한다수의화학적변형도공지의기술에의해실행될수있고, 예를들면, 이에한정되는것은아니지만특이적화학절단, 아세틸화, 포밀화, 튜니카마이신 (tunicamycin) 의대사합성등을포함한다. 또한, 상기유도체는하나이상의비전형적인아미노산을포함할수있다. 키메라항체는, 예를들면, 비인간항체에서유래하는가변영역과인간면역글로불린의불변영역을갖는항체와같이, 키메라항체의다른부분이다른면역글로불린분자에서유래하는분자의것이다. 키메라항체를만드는방법은공지이다. 예를들면, Morrison(1985) "Transfectomas Provide Novel Chimeric Antibodies," Science 229: ; Oi et al.(1986) "Chimeric Antibodies," BioTechniques 4: ; Gillies et al.(1989) "High-Level Expression Of Chimeric Antibodies Using Adapted cdna Variable Region Cassettes," 1. Immunol. Methods 125: ; and U.S. 특허번호 6,311,415, 5,807,715, 4,816,567 및 4,816,397를참조할수있고, 이들모두는참조로서그전체가본명세서에포함된다. 흔히, 프레임워크영역내의프레임워크잔기를, CDR 공여자항체유래에대응하는잔기로치환하여, 항원결합성을바꾸고바람직하게는개선하는것이가능하다. 이러한프레임워크치환은당해기술분야에서주지의방법에의해동정하는것이가능하다. 예를들면, CDR과프레임워크잔기의상호작용을모델링하여항원결합성에중요한프레임워크잔기를동정하는방법이나, 서열을비교하여특정위치에있는프레임워크의특이한잔기를동정하는방법을들수있다 ( 예를들면, U.S. 특허번호 5,585,089; 및 Riechmann et al.(1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy," Nature 332: 참조, 이들모두는참조로서그전체가본명세서에포함된다.) 본발명의디아바디의결합도메인유래의단일클론항체는, 당해기술분야에서알려진다양한기술을사용하여제조할수있다. 상기기술에는, 하이브리도마, 재조합체및파아지디스플레이기술또는이들의조합이포함된다. 예를들면, 단일클론항체는, 하이브리도마기술을이용하여제조할수있다. 상기하이브리도마기술에는, 당해분야에서는공지인기술이외에예를들면 Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp (Elsevier, N.Y., 1981)(both of which are incorporated by reference in their entireties) 가포함된다. 여기서사용되는용어 " 단일클론항체 " 는하이브리도마기술을이용하여제조된항체에한정되는것은아니다. " 단일클론항체 " 라는용어는, 어떠한진핵생물클론, 원핵생물클론또는파아지클론을포함하는단일클론에서유래하는항체를의미하는것으로서, 이것을생산하는방법을의미하는것은아니

35 다. [0134] [0135] [0136] [0137] 하이브리도마기술을이용하여특정의항체를제조및스크리닝하는방법은루틴하고공지인기술이다. 비한정적인예로는, 마우스를대상항원또는그와같은항원을발현하는세포에서면역화하는것이가능하다. 예를들면, 항원특이적항체가마우스혈청으로부터검출되도록, 일단면역반응이검출되도록마우스비장이적출되고, 이자세포가단리된다. 그후, 이이자세포를주지기술에의해임의의적당한미에로마 (myeloma) 세포와융합시킨다. 하이브리도마를한계희석법에의해선택하고클론화한다. 이하이브리도마클론을그후당해분야에서알려진방법으로상기항원에결합할수있는항체를분비하는세포에대해분석한다. 통상, 고레벨의항체를포함하는복수 (ascites fluid) 를, 마우스의복강내에양성하이브리도마클론을접종하는것에의해얻을수있다. 대상항원을, 섹션 5.8.1에기재한암에관련한항원, 섹션 5.8.2에기재한자가면역질환및염증성질환에관련한항원, 섹션 5.8.3에기재한감염증에관련한항원, 및섹션 5.8.4에기재한효소를포함한다. 다만, 이것들에한정되는것은아니다. 또한, 항체는당해분야에서알려진다양한파아지디스플레이법을이용하여제조할수있다. 파아지디스플레이법에서는, 기능성항체도메인이이것을코딩하는폴리뉴클레오티드서열을담지하는파아지입자표면상에제시된다. 구체적인구체예에서, 상기파아지를이용하여레퍼토리 (repertoire) 또는조합의항체라이브러리 ( 예, 인간또는마우스 ) 로부터발현된항원결합도메인 ( 예, Fab 및 Fv 또는이황화결합안정화 Fv) 을제시할수있다. 대상의항원에결합하는항원결합도메인을발현하는파아지는, 항원을이용하여 ( 예를들면, 표지한항원, 또는고체표면또는비즈에결합또는캡쳐된항원을이용 ) 선택또는동정할수있다. 이들방법에서이용되는파아지는, 일반적으로는 fd 및 M13을포함하는수지상파아지이다. 항원결합도메인은, 파아지유전자 III 또는 VIII 단백질의어느하나에재조합융합시킨단백질로서발현된다. 본발명의면역글로불린또는그단편의제조에이용될수있는파아지디스플레이법의예는, 이하의문헌중에개시되어있는방법을포함한다. 즉, Brinkmann et al.(1995) "Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments," J. Immunol. Methods, 182:41-50; Ames et al.(1995) "Conversion Of Murine Fabs Isolated From A Combinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins," J. Immunol. Methods, 184: ; Kettleborough et al.(1994) "Isolation Of Tumor Cell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using Phage-Antibody Libraries And The Re-Construction Of Whole Antibodies From These Antibody Fragments," Eur. J. Immunol, 24: ; Persic et al.(1997) "An Integrated Vector System For The Eukaryotic Expression Of Antibodies or Their Fragments After Selection From Phage Display Libraries," Gene, 187:9-18; Burton et al.(1994) "Human Antibodies From Combinatorial Libraries," Advances in Immunology, 57: ; PCT 출원번호 PCT/GB91/01134; PCT 공개 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 U.S. 특허번호 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108을참조할수있고, 이들모두는참조로서그전체가본명세서에포함된다. 파아지디스플레이기술을이용하여, 항원에대한항체의친화성을증대시킬수있다. 이기술은고친화성항체를얻는데에유용하다. 친화성성숙이라불리는이기술은, 천연변이유발또는동종항원을이용한 CDR 워킹및재선택을사용하여, 초기항체또는 parental 항체와비교한경우에항원에대하여보다높은친화력으로결합하는항체를동정한다 (Glaser et al.(1992) "Dissection Of The Combining Site In A Humanized Anti-Tac Antibody," J. Immunology 149: 참조 ). 단일뉴클레오티드보다전체에대한천연변이유발은, 결과적으로아미노산변이의반랜덤화 (semi-randomized) 레퍼토리를일으킨다. 변이형클론의풀로이루어지는라이브러리를구축할수있고, 상이변이형클론은각각이하나의 CDR 중의단일아미노산의개변에따라다르고, 각 CDR 잔기에관하여가능한아미노산치환을각각제시하는변이체를포함하고있다. 항원에대한결합친화성이증가한변이체는, 고정한변이체와표지한항원과의접촉에의해스크리닝하는것이가능하다. 당해분야에서알려진어떠한스크리닝방법이라도, 항원에대한결합활성이증가한변이형항체를동정하는데에사용할수있다 ( 예, ELISA)(Wu et al.(1998) "Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3- Specific Humanized mab," Proc Natl. Acad Sci. USA 95: ; Yelton et al.(1995) "Affinity Maturation Of The Br96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis," J. Immunology 155: 참조 ). 경쇄를랜덤변이시킨 CDR 워킹도사용할수있다 (Schier et al.(1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site," J. MoI. Bio. 263: 참조 ). 또한, 본발명은프레임워크또는 CDR 영역에변이 ( 예를들면, 1 이상의아미노산치환 ) 를갖는, 본명세서에

36 기재또는당업계에알려진어떠한결합도메인의아미노산서열로이루어지는결합도메인의사용을포함한다. 이들결합도메인에있어서의변이는, 결합도메인의 FcγRIIB( 이것에결합도메인이면역특이적으로결합한다 ) 에대한결합력및 / 또는친화력을유지또는증강하는것이바람직하다. 당업자에알려진표준적기술 ( 예, 면역분석 ) 을사용하여특정의항원에대한항체의친화성을분석할수있다. [0138] [0139] [0140] 당업자에게알려진표준기술을사용하여, 항체또는그단편을코딩하는뉴클레오티드서열중에변이를도입하는것이가능하다. 이와같은기술에는, 예를들면, 결과적으로아미노산치환을일으키는부위특이적돌연변이유발및 PCR을통한돌연변이유발등을들수있다. 유도체는, 원래의항체또는그단편과비교하여, 15 아미노산미만의치환, 10 아미노산미만의치환, 5 아미노산미만의치환, 4 아미노산미만의치환, 3 아미노산미만의치환또는 2 아미노산미만의치환을포함하는것이바람직하다. 바람직한구체예에서, 유도체는 1 이상의예측되는비필수아미노산잔기에서의보존적아미노산치환을갖는다 FcγRIIB과면역특이적으로결합하는에피토프결합부위를포함하는디아바디구체적인구체예에있어서, 본발명의디아바디의적어도하나의결합도메인은, FcγRIIB의적어도하나의활성을어고나이즈한다 (agonize). 본발명의일구체예에서, 상기활성은 B 세포수용체를통한시그널전달을저해하는것이다. 다른구체예에있어서, 결합도메인은 B 세포의활성화, B 세포의증식, 항체생산, B 세포의세포내칼슘유입, 세포주기의진행, 또는 FcγRIIB 시그널전달경로에있어서의 1 이상의하류의시그널전달분자의활성을저해한다. 또다른구체예에서, 결합도메인은 FcγRIIB의인산화또는 SHIP의동원 (recruitment) 을증강한다. 본발명의또다른구체예에서, 결합도메인은 B 세포수용체를통한시그널전달경로에서의 MAP 키나제활성또는 Akt 동원을저해한다. 다른구체예에서결합도메인은 FcεRI 시그널전달의 FcγRIIB를통한저해에어고나이즈한다 (agonize). 구체적인구체예에서, 상기결합도메인은 FcεRI 유도된마스트세포 (mast cell) 활성화, 칼슘동원, 탈과립, 사이토카인생산, 또는세로토닌방출을저해한다. 다른구체예에서, 본발명의결합도메인은 FcγRIIB의인산화를자극하고, SHIP의동원을자극하고, SHIP의인산화및 SHIP과 Shc의결합을자극하고, 또는 MAP 키나제패밀리멤버 ( 예, Erk1, Erk2, JNK, p38 등 ) 의활성화를저해 한다. 또다른구체예에서, 본발명의결합도메인은 p62 dok 의티로신인산화, 및이것과 SHIP 및 rasgap 과의결 합을증강한다. 다른구체예에서, 본발명의결합도메인은단구또는마크로파아지에서의 FcγR 을통한식작용 을저해한다. [0141] 다른구체예에서, 결합도메인은 FcγRIIB의적어도하나의활성을길항한다 (antagonize). 일구체예에서, 상기활성화는 B 세포수용체를통한시그널전달의활성화이다. 구체적인구체예에있어서, 결합도메인은 B 세포의활성화, B 세포의증식, 항체생산, B 세포의세포내칼슘유입, 또는 FcγRIIB 시그널전달경로에있어서의 1 이상의하류의시그널전달분자의활성을증강한다. 또다른구체예에서, 결합도메인은 FcγRIIB의인산화또는 SHIP의동원 (recruitment) 을감소시킨다. 본발명의또다른구체예에서, 결합도메인은 B 세포수용체를통한시그널전달경로에서의 MAP 키나제활성또는 Akt 동원을증강한다. 다른구체예에서, 결합도메인은 Fcε RI 시그널전달의 FcγRIIB를통한저해에길항한다 (antagonize). 구체적인구체예에서, 상기결합도메인은 Fc εri 유도된마스트세포 (mast cell) 활성화, 칼슘동원, 탈과립, 사이토카인생산, 또는세로토닌방출을증강한다. 다른구체예에서, 결합도메인은 FcγRIIB의인산화를저해하고, SHIP의동원을저해하고, SHIP의인산화및 SHIP과 Shc의결합을저해하고, 또는 MAP 키나제패밀리멤버 ( 예, Erk1, Erk2, JNK, p38 등 ) 의활성화를증 강한다. 또다른구체예에서본발명의결합도메인은 p62 dok 의티로신인산화, 및이것과 SHIP 및 rasgap과의결합을저해한다. 다른구체예에서, 본발명의결합도메인은단구또는마크로파아지에서의 FcγR을통한식작용을증강한다. 다른구체예에서, 결합도메인은비장마크로파아지에의한옵소닌화입자 (opsonized particl e) 의식작용, 클리어린스 (clearance) 를저해한다. [0142] [0143] 다른구체예에서, 적어도하나의결합도메인을이용하여, FcγRIIB를발현하는세포를본발명의디아바디의표적으로하는것이가능하다. 하나의구체적인구체예에서, 결합도메인중하나는, 클론 2B6 또는 3H7로부터생산되는마우스단일클론항체에서유래한다. 상기클론은각각 ATCC 수탁번호 PTA-4591 및 PTA-4592를갖는다. 2B6 및 3H7 항체를생산하는마이크로도마는, American Type Culture Collection(10801 University Blvd., Manassas, VA ) 에 2002년 8월 13일에특허수속상의미생물의기탁의국제적승인에관한부다페스트조약의규정에기초하여기탁되어, 각각수탁번호 PTA-4591(2B6를생산하는하이브리도마용 ) 및 PTA-4592(3H7를생산하는하이브리도마용 ) 가부여되었다. 이들은, 참조로서본명세서에포함된다. 결합도메인은인간유래이거나또는인간화된것이구체예로서바람직하다. 3H7 또는 2B6 클론으로부터생산되는항체의인간화버전에서유래하는결합도메인이바람

37 직하다. [0144] [0145] [0146] [0147] [0148] 본발명은또한다른항체유래의결합도메인을갖는디아바디를포함한다. 다른항체로는특히 FcγRIIB 바람직하게는인간 FcγRIIB, 보다바람직하게는천연의인간 FcγRIIB에결합하고, 또한 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 및 1F2( 각각 ATCC 수탁번호 PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 및 PTA-5959를갖는다 ) 를포함하지만이에한정되지않는클론에유래한다. 상기의클론을생산하는하이브리도마는, 부다페스트조약의규정하에, American Type Culture Collection(10801 University Blvd., Manassas, VA ) 에 2004년 5월 7일에기탁되어있다. 이들하이브리도마는, 참조로서본명세서에포함된다. 상기항체유래의결합도메인은인간화된것이구체예로서바람직하다. 구체적인구체예에서, 본발명의디아바디에사용되는결합도메인은, 항체또는그항원결합단편 ( 예를들면, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 또는 1F2 클론에서생산되는항체의 1 이상의상보성결정영역 (CDR), 바람직하게는 6개의 CDR 전체를포함 ) 유래이다. 다른구체예에서, 결합도메인은, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 또는 1F2 클론의각각에서생산되는마우스단일클론항체와동일한에피토프에결합하고, 및 / 또는, 예로서 ELISA 분석또는다른적당한경쟁면역분석 (competitive immunoassay) 로측정한때에, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 또는 1F2 클론에서생산된마우스단일클론항체와경쟁하고, 또한그결합도메인이 FcγRIIA와결합하는것보다더강한친화성으로 FcγRIIB와결합한다. 본발명은또한 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 또는 1F2 클론에서생산되는마우스단일클론항체의중쇄가변부및 / 또는경쇄가변부의아미노산서열과적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는적어도 99% 동일한중쇄가변부및 / 또는경쇄가변부의아미노산서열을포함하는결합도메인을갖는디아바디를포함한다. 본발명은또한 Fc γriia에결합하는것보다더높은친화성으로 FcγRIIB에특이적으로결합하고, 또한 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 또는 1F2 클론에서생산되는마우스단일클론항체의 1 이상의 CDR의아미노산서열과적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는적어도 99% 동일한 1 이상의 CDR의아미노산서열을포함하는, 결합도메인을갖는디아바디를포함한다. 2개의아미노산서열의동일성퍼센트의결정은, BLAST 단백질검색을포함하는당업자에게공지인어떠한방법에의하여도결정할수있다. 본발명은또한결합도메인이 FcγRIIA와결합하는것보다강한친화성으로 FcγRIIB와특이적으로결합하는결합도메인을포함하는디아바디의사용을포함한다. 이결합도메인은, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 또는 1F2 클론에서생산되는마우스단일클론항체의뉴크레오티드서열에스트린전트조건 (stringent condition) 하에서혼성화하는뉴크레오티드서열에의해코딩되어있다. 바람직한구체예에서, 결합도메인은, FcγRIIA보다강한친화성으로 FcγRIIB와특이적으로결합하고, 또한 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 또는 1F2 클론에서생산되는마우스단일클론항체의경쇄가변부및 / 또는중쇄가변부의뉴크레오티드서열에스트린전트조건 (stringent condition) 하에서혼성화하는뉴크레오티드서열에의해코딩되어있는경쇄가변부및 / 또는중쇄가변부를포함한다. 다른바람직한구체예에서, 결합도메인은, FcγRIIA보다강한친화성으로 FcγRIIB와특이적으로결합하고, 또한 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 또는 1F2 클론에서생산되는마우스단일클론항체의 1 이상의 CDR의뉴크레오티드서열에스트린전트조건 (stringent condition) 하에서혼성화하는뉴크레오티드서열에의해코딩되어있는 1 이상의 CDR을포함한다. 스트린전트혼성화조건은한정되는것은아니지만, 필터에결합한 DNA를약 45 의온도하에서 6 염화나트륨 / 시트르산나트륨 (SSC) 용액중에서처리한후, 약 50~65 하에서 0.2 SSC/0.1% SDS 용액으로 1회이상세정하는혼성화를포함한다. 보다고도의스트린전트조건은, 예를들면필터에결합한 DNA를약 45 의온도하에서 6 SSC 용액중에서처리한후, 약 60 하에서 0.1 SSC/0.2% SDS 용액으로 1회이상세정하는혼성화를포함한다. 또는, 당업자에게공지된다른스트린전트혼성화조건 ( 예를들면, Ausubel, F. M. et al, eds Current Protocols in Molecular Biology, vol.1, Green Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley 및 Sons, Inc., NY 페이지 내지 및 참조 ) 을포함한다. 본발명은또한프레임워크또는 CDR 영역에변이 ( 예를들면, 1 이상의아미노산치환 ) 을갖는상기어떠한결합도메인의아미노산서열을포함하는결합도메인의사용을포함한다. 이들결합도메인에있어서의변이는, 결합도메인이면역특이성에결합하는 FcγRIIB에대한결합도메인의결합력및 / 또는친화성을유지또는강화하는것이바람직하다. 당업자에게공지인표준적인기술 ( 예를들면, 면역분석 ) 을이용하여, 특정의항원에대한항체의친화성을분석하는것이가능하다

38 [0149] [0150] [0151] [0152] [0153] [0154] [0155] 당업자에게공지인표준적인기술을이용하여, 항체또는그단편을코딩하는뉴클레오티드서열중에변이를도입하는것이가능하다. 이와같은기술에는, 예를들면, 아미노산치환을유발하는부위특이적돌연변이유발및 PCR을통한돌연변이유발이포함된다. 유도체는, 원래의항체또는그단편에대하여 15 아미노산미만의치환, 10 아미노산미만의치환, 5 아미노산미만의치환, 4 아미노산미만의치환, 3 아미노산미만의치환, 또는 2 아미노산미만의치환을포함하는것이바람직하다. 유도체가 1 이상의예측되는비필수아미노산잔기에보존적아미노산치환을갖는것이구체예로서바람직하다. 바람직한구체예에서, 결합도메인은인간화항체에서유래한다. 인간화 FcγRIIB 특이적항체는, 적어도 1개, 통상은 2개의가변도메인의실질적으로전체를포함하고있어도좋다. 이가변도메인은, CDR 영역의전체또는실질적으로전체가비인간면역글로불린 ( 예, 공여자항체 ) 의 CDR 영역과일치하고, 프레임워크영역의전체또는실질적으로전체가인간면역글로불린의프레임워크영역의컨센서스서열 (consensus sequence) 로되어있다. 본발명의디아바디는, FcγRIIB에특이적인인간화가변도메인을포함한다. 이가변도메인에서는, 인간항체 ( 수용자항체 ) 의중쇄및 / 또는경쇄가변영역의 1 이상의 CDR의 1 이상의영역이, FcγRIIA 보다강한친화성으로 FcγRIIB와특이적으로결합하는공여자의단일클론항체의 1 이상의 CDR의유사부분에서치환되어있다. 이와같은단일클론항체로서, 예를들면 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 또는 1F2 클론에서생산되는단일클론항체를들수있다. 다른구체예에서, 인간화항체는각각 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 또는 1F2과동일한에피토프에결합한다. 바람직한구체예에서, 인간화 FcγRIIB 결합도메인의 CDR 영역은, FcγRIIB에특이적인마우스항체에서유래한다. 어떠한구체예에서, 본명세서에기재된인간화항체는, 한정되는것은아니지만, 수용자항체의아미노산결실, 삽입, 변형을포함하는개변을포함한다. 여기서말하는수용자항체란, 즉인간항체이고, 더욱이공여자단일클론항체의결합특이성을보유하는데에필요한중쇄및 / 또는경쇄의가변도메인의프레임워크영역을의미한다. 어떠한구체예에서, 본명세서에기재된인간화항체의프레임워크영역은반드시천연의인간항체가변영역의프레임워크영역의아미노산서열과정확히동일할필요는없고, 인간화항체의성질을바꾸는아미노산결실, 삽입, 변형을포함하는 ( 다만, 이것들에한정되는것은아니다 ) 다양한개변을포함한다. 여기서, 인간화항체의성질을바꾸는것이란, 예를들면, 마우스의 FcγRIIB 특이적항체와동일한표적에대하여특이적인인간화항체영역의결합특성을개선하는것등이해당한다. 가장바람직한구체예에서는, 비인간프레임워크잔기를광범위하게도입하는것을피하고, 인간에있어서인간화항체의최소한의면역원성을보유하기위하여, 프레임워크영역에대하여최소한의개변을행한다. 공여자의단일클론항체는, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 또는 1F2에서생산되는단일클론항체인것이바람직하다. 구체적인구체예에서, 결합도메인은 FcγRIIA와결합하는것보다도강한친화력으로 FcγRIIB와특이적으로결합하는 CDR 그래프트화항체의가변도메인을포함한다. 여기에서, CDR 그래프트화항체는레시피언트항체의프레임워크잔기와, 도너단일클론항체유래의잔기로이루어지는중쇄가변영역도메인을포함한다. 도너단일클론항체는, 예를들면, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 또는 1F2 클론으로부터생산되는단일클론항체와같이, FcγRIIA와결합하는것보다도강한친화력으로 FcγRIIB와특이적으로결합하는항체이다. 다른구체적인구체예에서, 본발명의디아바디는 CDR 그래프트화항체가 FcγRIIA와결합하는것보다도강한친화력으로 FcγRIIB와특이적으로결합하는이 CDR 그래프트화항체유래의가변도메인을포함한다. 여기에서, CDR 그래프트화항체는, 레시피언트항체의프레임워크잔기와, 도너단일클론항체유래의잔기로이루어지는경쇄가변영역도메인을포함한다. 도너단일클론항체는, 예를들면, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 또는 1F2클론으로부터생산되는단일클론항체와같이, FcγRIIA와결합하는것보다도강한친화력으로 FcγRIIB와특이적으로결합하는항체이다. 본발명에서사용되는인간화항 FcγRIIB의가변도메인은, CDR1( 서열번호 24 또는서열번호 25) 및 / 또는 CDR2( 서열번호 26 또는서열번호 27) 및 / 또는 CDR3( 서열번호 28 또는서열번호 29) 의아미노산서열을포함하는중쇄가변영역, 및 / 또는 CDR1( 서열번호 30 또는서열번호 31) 및 / 또는 CDR2( 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 또는서열번호 35) 및 / 또는 CDR3( 서열번호 36 또는서열번호 37) 의아미노산서열을포함하는경쇄가변영역을가지고있어도된다. 구체적인구체예에서, 디아바디는인간화 2B6 항체에유래하는가변도메인을포함한다. 이디아바디에서는, VH 영역이인간생식계열의 VH 세그먼트인 VH1-18(Matsuda et al.(1998) "The Complete Nucleotide Sequence Of The Human Immunoglobulin 중쇄가변부위 Locus," J. Exp. Med. 188: ) 및 JH6(Ravetch et

39 al.(1981) "Structure Of The Human Immunoglobulin Mu Locus: Characterization Of Embryonic And Rearranged J And D Genes," Cell 27(3 Pt. 2): ) 에유래하는 FR 세그먼트와, 서열번호 24, 서열번호 26 또는서열번호 28의아미노산서열을갖는 2B6 VH의 1 이상의 CDR 영역으로이루어진다. 1의구체예에서, 2B6 VH는서열번호 38의아미노산서열을갖는다. 다른구체예에서, 2B6 VH 도메인은서열번호 85의 Hu2B6VH의아미노산서열을갖고, 서열번호 86의뉴클레오티드서열에의해코딩될수있다. 다른구체적인구체예에서, 디아바디는 VL 영역을더포함하고, 이 VL 영역은인간생식계열 VL 세그먼트인 VK-A26(Lautner-Rieske et al.(1992) "The Human Immunoglobulin Kappa Locus. Characterization Of The Duplicated A Regions," Eur. J. Immunol. 22: ) 및 JK4(Hieter et al.(1982) "Evolution Of Human Immunoglobulin Kappa J Region Genes," J. Biol. Chem. 257: ) 의 FR 세그먼트와, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 및서열번호 36의아미노산서열을갖는 2B6 VL의 1 이상의 CDR 영역으로이루어진다. 1의구체예에서, 2B6 VL 은서열번호 39, 서열번호 40, 또는서열번호 41의아미노산서열을갖는다. 구체적인구체예에서, 2B6 VL은서열번호 87의 Hu2B6VL의아미노산서열을갖고, 서열번호 88의뉴클레오티드서열에의해코딩될수있다. [0156] [0157] [0158] 다른구체적인구체예에서, 디아바디는인간화 3H7 항체에유래하는가변도메인을갖는다. 이디아바디에서는, VH 영역이인간생식계열 VH 세그먼트에유래하는 FR 세그먼트와, 서열번호 35의아미노산서열을갖는 3H7 VH 의 CDR 영역으로이루어진다. 다른구체적인구체예에서, 인간화 3H7 항체는또한 VL 영역을포함하고, 이 VL 영역은인간생식계열 VL 세그먼트의 FR 세그먼트와, 서열번호 42의아미노산서열을갖는 3H7VL의 CDR 영역으로이루어진다. 구체적으로는, 결합도메인은천연의인간 FcγRIIB의세포외도메인과면역특이적으로결합하고, 또이하의조합중어느하나에서 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 또는 1F2의 CDR 서열을포함한다 ( 또는, 이루어진다 ). 상기조합이란 VH CDR1 및 VL CDR1; VH CDR1 및 VL CDR2; VH CDR1 및 VL CDR3; VH CDR2 및 VL CDR1; VH CDR2 및 VL CDR2; VH CDR2 및 VL CDR3; VH CDR3 및 VH CDR1; VH CDR3 및 VL CDR2; VH CDR3 및 VL CDR3; VH1 CDR1, VH CDR2 및 VL CDR1; VH CDR1 및 VH CDR2 및 VL CDR2; VH CDR1, VH CDR2 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR1, VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR2; VH CDR2, VH CDR2 및 VL CDR3; VH CDR1, VL CDR1 및 VL CDR2; VH CDR1, VL CDR1 및 VL CDR3; VH CDR2, VL CDR1 및 VL CDR2; VH CDR2, VL CDR1 및 VL CDR3; VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR2; VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR3; VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR1; VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR2; VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR3; VH CDR1, VH CDR2, VL CDR1 및 VL CDR2; VH CDR1, VH CDR2, VL CDR1 및 VL CDR3; VH CDR1, VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR2; VH CDR1, VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR2; VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3, VL CDR2 및 VL CDR3; VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR2; VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1 및 VL CDR3; VH CDR1, VH CDR2, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3; VH CDR1, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3; VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3; 또는본명세서에서개시한 VH CDR 및 VL CDR 중어느하나의조합을말한다. 본발명의디아바디에포함되는결합도메인의유래가되는항체는, FcγRIIA와비교하여 FcγRIIB에가장강한특이성을가진항체를선택할수있도록, 에피토프매핑에의해더욱특징지을수있다. 항체의에피토프매핑법은당해분야에서는주지이며, 본발명의방법에포함된다. 몇개의구체예에서는, FcγRIIB의 1 이상의영역을포함하는융합단백질을, 본발명의항체의에피토프를매핑하는데사용할수있다. 구체적인구체예에서, 융합단백질은인간 IgG2의 Fc 부분과융합한 FcγRIIB의영역의아미노산서열을포함하고있다. 각융합단백질은, 하기의표 2에나타내는바와같은아미노산치환및 / 또는상동수용체 ( 예를들면, FcγRIIA) 의대응영역에의한이수용체의특정영역의교환을더욱포함할수있다. pmgx125 및 pmgx132는 FcγRIIB 수용체의 IgG 결합부위를포함하고 ( 전자는 FcγRIIB의 C 말단을갖고, 그리고후자는 FcγRIIA의 C 말단을가짐 ), C 말단결합성을구별하기위하여사용할수있다. 그밖은 IgG 결합부위에서의 FcγRIIA 치환, 및 FcγRIIA 또는 Fcγ RIIB 중어느하나의 N 말단을갖는다. 이들분자는항체가결합하는수용체분자의부분을결정하는데도움이된다. [0159] 표 2 단일클론항 FcγRIIB 항체의에피토프를조사하는데에사용할수있는융합단백질의리스트에관한것이다. 잔기 172~180은, FcγRIIA 및 FcγRIIB의 IgG 결합부위에속한다. FcγRIIA 서열유래의특정아미노산을볼드체 (bold) 로나타내었다

40 플라스미드 수용체 N-말단 서열번호 C-말단 pmgx125 RIIb IIb KKFSRSDPN 43 APS------SS (IIb) pmgx126 RIIa/b IIa QKFSRLDPN 44 APS------SS (IIb) pmgx127 IIa QKFSRLDPT 45 APS------SS (IIb) pmgx128 IIb KKFSRLDPT 46 APS------SS (IIb) pmgx129 IIa QKFSHLDPT 47 APS------SS (IIb) pmgx130 IIb KKFSHLDPT 48 APS------SS (IIb) pmgx131 IIa QKFSRLDPN 49 VPSMGSSS(IIa) pmgx132 IIb KKFSRSDPN 50 VPSMGSSS(IIa) pmgx133 RIIa-131R IIa QKFSRLDPT 51 VPSMGSSS(IIa) pmgx134 RIIa-131H IIa QKFSHLDPT 52 VPSMGSSS(IIa) pmgx135 IIb KKFSRLDPT 53 VPSMGSSS(IIa) pmgx136 IIb KKFSHLDPT 54 VPSMGSSS(IIa) 주 : APSSS는서열번호 309이고 ; VPSMGSSS는서열번호 310이다 [0160] [0161] [0162] 융합단백질은, 본발명의항 FcγRIIB 항체에의결합을측정하기위한어느하나의생화학적분석법, 예를들면, ELISA법에서사용할수있다. 다른구체예에서는, 특정잔기를 FcγRIIA 서열유래의잔기와치환한펩티드를사용하여, 에피토프특이성의새로운확인을행할수있다. 항체는본발명의항체의기능, 특히 FcγRIIB 시그널전달을조절하는활성을동정하기위한분석법을사용하여특성분석할수있다. 예를들면, 본발명의특성분석은 FcγRIIB의 ITIM 모티프 (motif) 중의티로신잔기의인산화를측정하거나, 또는, B 세포수용체에의해발생하는칼슘동원의저해를측정할수도있다. 본발명의특성분석은세포베이스의분석법또는무세포계분석법으로할수있다. 마스트세포 (mast cell) 에서는, 고친화성 IgE 수용체인 FcεRI와 FcγRIIB의공응집이, 항원유도성탈과립, 칼슘동원, 및사이토카인생산의저해를초래하는것은당해분야에서는충분히입증되어있다 (Metcalfe D. D. et al.(1997) "Mast Cells," Physiol. Rev. 77: ; Long E.O.(1999) "Regulation Of Immune Responses Through Inhibitory Receptors," Annu. Rev. Immunol. 17: ). 이시그널전달경로의분자적상세에대해서는, 최근밝혀졌다 (Ott V. L.(2002) "Downstream Of Kinase, p62(dok), Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition Of Fc Epsilon RI Signaling," J. Immunol. 162(9): ). 일단 FcεRI와공응집하면, Fcγ RIIB는그 ITIM 모티프중의티로신상에서즉시인산화되고, 그후 Src 호몰로지2 함유이노시톨-5-포스파타제 (Src Homology-2 containing inositol-5-phosphatase: SHIP) 를동원한다. 이효소는 SH2 도메인함유이노시톨 폴리포스페이트5-포스파타제이며, 순차인산화되어, Shc 및 p62 dok 와회합한다. p62 dok 는어댑터분자패밀리의프로토타입이며, 여기에서말하는어댑터분자패밀리는, 예를들면, 아미노말단의플렉스트린상동도메인 (PH 도메인 ) 과같은시그널전달도메인, PTB 도메인, 및 PXXPmotif와다수의인산화부위를포함하는카르복시말단영역을포함한다 (Carpino et al.(1997) "p62(dok): A Constitutively Tyrosine-Phosphorylated, GAP- Associated Protein In Chronic Myelogenous Leukemia Progenitor Cells," Cell, 88: ; Yamanshi et al.(1997) "Identification Of The Abl-And ras GAP-Associated 62 kda Protein As A Docking Protein, Dok," Cell, 88: ). [0163] 본발명에서사용하는항 FcγRIIB 항체는, 마찬가지로, 1 이상의 IgE 개재응답을조절하는능력에대하여특성분석할수있다. IgE에대하여고친화성의수용체및 FcγRIIB에대하여저친화성의수용체를공발현하는세포주를, IgE 개재응답의조절에서의항 FcγRIIB 항체의특성분석에사용하는것이바람직하다. 구체적인구체예에서, 전체길이의인간 FcγRIIB로트랜스펙트한래트호염기구성백혈병세포주 (RBL-H23; Barsumian E.L. et al.(1981) "IgE-Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines: Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones," Eur. J. Immunol.11 : ; 참조로서본명세서에그모두를포함함 ) 유래의세포를사용할수있다. RBL-2H3은충분히특징지어진래트세포주이며, IgE를통한세포활성화후의시그널전달기구를연구하는데도널리사용되고있다. RBL-2H3 세포에서발현되고, 그리고 FcεRI와공응집하면, FcγRIIB는 FcεRI 유도칼슘동원, 탈과립및사이토카인생산을저해한다 (Malbec et al.(1998) "Fc Epsilon Receptor I-Associated Lyn-Dependent Phosphorylation OfFc Gamma Receptor HB During Negative Regulation Of Mast Cell Activation," J. Immunol. 160: ; Daeron et al.(1995) "Regulation Of High-Affinity IgE Receptor-Mediated Mast Cell Activation By Murine Low-Affinity IgG Receptors," J. Clin. Invest. 95:577; Ott V. L.(2002) "Downstream Of Kinase, p62(dok), Is A Mediator Of FcgammaIIB

41 Inhibition OfFc Epsilon RI Signaling," J. Immunol. 162(9): ). [0164] [0165] [0166] [0167] [0168] 본발명에서사용하는항체는 FcεRI 유도형마스트세포활성화의저해에대하여특성분석할수도있다. 예를들면, FcγRIIB로트랜스펙트된래트호염기구성백혈병세포주 (RBL-H23; Barsumian E.L. et al.(1981) "IgE- Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines: Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones," Eur. J. Immunol.11 : ) 유래의세포를, IgE에서감작하고, 그리고 FcεRI만을응집하는토끼항마우스 IgG의 F(ab')2 단편로자극하거나, 또는 FcγRIIB와 FcεRI를공응집하는완전한토끼항마우스 IgG로자극한다. 이계에서는, 하류시그널전달분자의간접적인조절을, 감작및자극한세포에본발명의항체를첨가했을때에분석할수있다. 예를들면, FcγRIIB의티로신인산화및 SHIP의동원과인산화, Erk1, Erk2, JNK 또는 p38을포함하지만그것들에한정되지않는 MAP 키나제패밀리멤버의활성화, 및 p62dok 의티로신인산화및그것과 SHIP 및 RasGAP의회합을분석한다. 본발명의항체에의해 FcεRI 유도형마스트세포활성화의저해를측정하는 1개의전형적인분석은이하를포함할수있다. 즉, 인간 FcγRIIB로 RBL-H23 세포를트랜스펙트하는것, IgE로 RBL-H23 세포를감작하는것, 그리고토끼항마우스IgG의 F(ab')2(FcεRI만을응집하고, FcεRI 개재시그널전달을일으킨다 ; 대조군으로서사용함 ) 로 RBL-H23 세포를자극하거나, 또는완전한토끼항마우스 IgG(FcγRIIB와 FcεRI를공응집하고, 결과적으로 FcεRI 개재시그널전달을저해함 ) 로 RBL-H23 세포를자극하는것을포함할수있다. 완전한토끼항마우스 IgG 항체로자극한세포를, 또한, 본발명의항체와프리인큐베이트할수있다. 본발명의항체와프리인큐베이트한세포, 및본발명의항체와프리인큐베이트하지않은세포의 FcεRI 의존성활성을측정하고, 이들세포에서의 FcεRI 의존성활성의레벨을비교함으로써본발명의항체에의한 FcεRI 의존성활성의조절을나타낼수있다. 상기의전형적인분석을사용하여, 예를들면, FcγRIIB 수용체에의리간드 (IgG) 결합을블록하고, 또한및 Fc εri와 FcγRIIB의공응집을방해함으로써 FcεRI 시그널전달의 FcγRIIB 개재저해에어고나이즈하는항체를동정할수있다. 마찬가지로이분석은, FcγRIIB와 FcεRI의공응집을증강하고, FcγRIIB와 FcεRI의공응집을촉진함으로써 FcεRI 시그널전달의 FcγRIIB 개재저해에어고나이즈하는항체를동정한다. 몇개의구체예에서, 본명세서에서동정되어기재된또는당해분야에서알려진, 본발명의항 FcγRIIB 항체의에피토프결합도메인을포함하는항 FcγRIIB 디아바디는, 바람직하게는세포베이스의분석법에있어서, 마스트세포또는호염기구 (basophils) 의탈과립을모니터링하고및 / 또는측정함으로써, IgE 개재응답을조절하는그능력에대하여특성분석된다. 이러한분석에서사용하는마스트세포또는호염기구는, 당업자에게공지의표준적인재조합법을사용하여, 인간 FcγRIIB를포함하도록유전자조작되어있는것이바람직하다. 구체적인구체예에서, 본발명의항 FcγRIIB 항체는, 세포베이스의 β-헥소사미니다제 ( 과립중에포함되는효소 ) 방출분석으로 IgE 개재응답을조절하는그능력에대하여특성분석된다. 마스트세포및호염기구으로부터의 β- 헥소사미니다제방출은급성알레르기상태및급성염증상태의최초의특징이다 (Aketani 등, 2001 Immunol. Lett.75: 185-9; Aketani 등, 2000 Anal. Chem. 72: ). 세로토닌이나히스타민을포함하지만이것들에한정되지않는다른염증성매개자의방출을본발명방법에따라분석하고, IgE 개재응답을측정해도된다. 특정작용기작에얽매이는것은아니지만, 마스트세포및호염기구으로부터의 β-헥소사미니다제함유과립과같은과립의방출은, FcγRI와다가항원과의가교에의해개시되는세포내칼슘농도의존성의프로세스이다. 인간마스트세포의연구의가능성은적당한장기의인간마스트세포배양물이없어제한되어있다. 최근들어, LAD1 및 LAD2라고불리는 2종의신규줄기세포인자의존성의인간마스트세포주가마스트세포육종 / 백혈병환자유래의골수액으로부터수립되었다 (Kirshenbaum et al.(2003) "Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD 1 And 2 Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma/Leukemia; Activation Following Aggregation Of FcRI or FcγRI," Leukemia research, 27:677-82; 참조로서그모두를본명세서에포함함 ). 양세포주는 FcεRI 및몇개의인간마스트세포마커를발현하는것이기재되어있다. LAD1 세포및 LAD2 세포는 IgE 개재응답에본발명의항체가미치는효과를평가하는데사용할수있다. 구체적인구체예에서, 상기와같은세포베이스의 β-헥소사미니다제방출분석을 LAD 세포에서사용하여, 본발명의항 FcγRIIB 항체에의한 IgE 개재응답의모든조절을측정할수있다. 전형적인분석에서는, 예를들면, LAD1 등의인간마스트세포를, 인간키메라 IgE 항니트로페놀 (NP) 로자극하고, 다가항원인 BSA-NP로챌린지한다. 그리고세포의탈과립을, 상청액중에방출되는 β-헥소사미니다제를측정함으로써모니터링한다 (Kirshenbaum et al.(2003) "Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD I And 2 Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma/Leukemia; Activation Following Aggregation Of FcRI or FcγRI," Leukemia research, 27:677-82; 참조로서그모두를본명세서에

42 포함함 ). [0169] [0170] [0171] [0172] 몇개의구체예에서, 당해분야에서공지의표준적인방법, 예를들면, FACS 염색등을사용하여측정했을때, 인간마스트세포의내재성 FcγRIIB의발현이낮은경우, 본발명의항 FcγRIIB 디아바디에의해매개되는저해경로의활성화의차이를모니터링및 / 또는검출하는것은곤란할지도모른다. 그때문에, 본발명은, 사이토카인및특정증식조건을사용하여 FcγRIIB 발현을상방제어 (up-regulation) 할수있는다른방법을포함한다. FcγRIIB는 THP1이나 U937 등의인간단구계세포주 (Tridandapani et al.(2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells," J. Biol. Chem., 277(7): ), 및인간초대단구 (Pricop et al.(2001) "Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptors On Human Monocytes By Th1 And Th2 Cytokines," J. of Immunol, 166: ) 에서는, IL-4에의해고도로상방제어되는것이기재되어있다. 디부티릴환상 AMP에의한 U937 세포의분화는 FcγRII의발현을증가시키는것이기재되어있다 (Cameron et al.(2002) "Differentiation Of The Human Monocyte Cell Line, U937, With Dibutyryl Cyclic AMP Induces The Expression Of The Inhibitory Fc Receptor, FcgammaRIIB," Immunology Letters 83, ). 따라서, 검출감도를증강하기위하여, 본발명의방법에서사용하는인간마스트세포에서의내재성 FcγRIIB의발현은, 예를들면, IL-4, IL-13과같은사이토카인을사용하여상방제어할수있다. 항 FcγRIIB 디아바디는 B세포수용체 (BCR) 를통한시그널전달의저해에대하여분석할수도있다. BCR을통한시그널전달은, 적어도 1개이상의하류의생물학적응답, 예를들면, B세포의활성화및증식, 항체생산등을포함할수있다. FcγRIIB와 BCR의공응집은세포주기의진행및세포의생존의저해를초래한다. 또한, Fcγ RIIB와 BCR의공응집은 BCR 개재시그널전달의저해를초래한다. 특히, BCR을통한시그널전달은이하의적어도 1개이상을포함한다. 즉, 하류시그널전달분자의조절, 예를들면, FcγRIIB의인산화상태, SHIP의동원, Btk 및 / 또는 PLCγ의국부존재, MAP 키나제활성, Akt( 항어팝토시스시그널 ) 의동원, 칼슘동원, 세포주기의진행, 및세포증식을들수있다. BCR 시그널전달의 FcγRIIB 개재저해에있어서의이펙터기능의대부분은 SHIP을통하고있지만, 최근, SHIP 결손마우스유래의리포다당 (LPS) 활성화 B 세포가, 칼슘동원, Ins(1,4,5)P 3 생산, 및 Erk 및 Akt의인산화의 현저한 FcγRIIB 개재저해를나타내는것이입증되었다 (Brauweiler et al.(2001) "Partially Distinct Molecular Mechanisms Mediate Inhibitory FcgammaRIIB Signaling In Resting And Activated B Cells," Journal of Immunology, 167(1): ). 따라서, SHIP 결손마우스유래의 ex vivo B 세포를사용하여, 본발명의항체를특징지을수있다. 본발명의항체에의한 BCR 시그널전달의 FcγRIIB 개재저해를측정하기위한전형적인분석은이하의스텝을포함할수있다. 즉, SHIP 결손마우스로부터비장 B 세포를분리하는스텝, 상기세포를리포다당으로활성화하는스텝, 및상기세포를 F(ab')2 항 IgM으로자극하여 BCR을응집시키거나, 또는항 IgM으로자극하여 BCR을 FcγRIIB와공응집시키는스텝이다. 완전한항 IgM으로자극하여, BCR을 FcγRIIB와공응집시킨세포를, 또한본발명의항체와프리인큐베이트할수있다. 세포의 FcγRIIB 의존성활성은당해분야에서알려지는표준적인기술에의해측정할수있다. 항체와프리인큐베이트한세포및프리인큐베이트하지않은세포의 FcγRIIB 의존성활성의레벨을비교함으로써, 그항체에의한 FcγRIIB 의존성활성의조절을나타낼수있다. [0173] FcγRIIB 의존성활성의측정은, 예를들면, 플로우사이토메트리로서세포내칼슘동원을측정하는것, Akt 및 / 또는 Erk 의인산화를측정하는것, PI(3,4,5)P 3 의 BCR 개재축적을측정하는것, 또는 B 세포의 FcγRIIB 개 재증식을측정하는것을포함할수있다. [0174] [0175] 상기분석을사용하여, 예를들면, 본발명에서사용하는이하와같은디아바디또는항 FcγRIIB 항체를동정할수있다. 즉, FcγRIIB 수용체의리간드 (IgG) 결합부위를블록하고, 또한 FcγRIIB와 BCR의공응집을방해함으로써 BCR 시그널전달의 FcγRIIB 개재저해에길항함으로써, BCR 시그널전달의 FcγRIIB 개재저해를조절하는디아바디또는항 FcγRIIB 항체이다. 또, 상기분석을사용하여, FcγRIIB와 BCR의공응집을증강하고또한 BCR 시그널전달의 FcγRIIB 개재저해에어고나이즈하는항체를동정할수도있다. 항 FcγRIIB 항체는인간단구 / 마크로파지에서 FcγRII를통한시그널전달에대하여분석할수도있다. Fcγ RIIB와면역수용체티로신활성화모티프 (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) 를갖는수용체와의공응집은 SHIP를이펙터로서사용하는 FcγR 개재식작용을하방제어 (down-regulation) 하도록작용한다 (Tridandapani et al.(2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human

43 Monocytic Cells," J. Biol. Chem., 277(7): ). FcγRIIA와 FcγRIIB의공응집은 FcγRIIB의 ITIM 모티프상의티로신잔기의신속한인산화를초래하고, 이것은 SHIP의인산화의증강, SHIP와 Shc의결합, 및 120kDa 및 60~65kDa의분자량을갖는단백질의인산화를일으킨다. 또한, FcγRIIA와 FcγRIIB의공응집은 Akt 의인산화의하방제어를초래한다. Akt는세린트레오닌키나제이며, 세포제어에관여하고, 또어팝토시스를억제하는활동을갖는다. [0176] [0177] [0178] [0179] [0180] [0181] [0182] [0183] 항-FcγRIIB 디아바디는인간단구 / 마크로파지에서 FcγR을통한식작용의저해에대하여분석할수있다. 예를들면, 인간단구계세포주 THP-1 유래의세포를, FcγRII에대한마우스단일클론항체 IV.3의 Fab 단편및염소항마우스항체 (FcγRIIA만을공응집시킴 ) 로자극하거나, 완전한 IV.3 마우스단일클론항체및염소항마우스항체 (FcγRIIA와 FcγRIIB를공응집시킴 ) 로자극할수있다. 이계에서는, 하류의시그널전달분자의조절, 예를들면, FcγRIIB의티로신인산화, SHIP의인산화, SHIP와 Shc의결합, Akt의인산화, 및 120kDa 및 60~65kDa의분자량을갖는단백질의인산화등을, 자극한세포에본발명의분자를가함으로써분석할수있다. 또한, 단구계세포주의 FcγRIIB 의존성식작용효율을본발명의항체의존재하및비존재하에서직접, 측정할수있다. 본발명의항체에의한인간단구 / 마크로파지에서의 FcγR 개재식작용의저해를측정하기위한다른전형적인분석은이하를포함할수있다. 즉, THP-1 세포를 IV.3 마우스항 FcγRII 항체의 Fab 및염소항마우스항체로자극 (FcγRIIA만을응집시켜, FcγRIIA 개재시그널전달을유도 ) 하거나, 마우스항 FcγRII 항체및염소항마우스항체로자극하는 (FcγRIIA와 FcγRIIB를공응집시켜, FcγRIIA 개재시그널전달을저해하는 ) 것을포함한다. 마우스항 FcγRII 항체및염소항마우스항체로자극한세포를, 또한본발명의분자와프리인큐베이트할수있다. 본발명의분자와프리인큐베이트한자극완료된세포및본발명의분자와프리인큐베이트하지않은세포의 FcγRIIA 의존성활성을측정하는것, 및이들세포에있어서의 FcγRIIA 의존성활성의레벨을비교함으로써본발명의항체에의한 FcγRIIA 의존성활성의조절을나타낼수있다. 기재된전형적인분석을사용하여, 예를들면, 이하와같은결합도메인을동정할수있다. 즉, FcγRIIB 수용체의리간드결합을블록하고, 또한 FcγRIIB와 FcγRIIA의공응집을방해함으로써 FcγRIIA 시그널전달의 Fc γriib 개재저해에길항하는결합도메인이다. 마찬가지로, 이분석으로, FcγRIIB와 FcγRIIA의공응집을증강하고, 또한 FcγRIIA 시그널전달의 FcγRIIB 개재저해에어고나이즈하는결합도메인을동정할수있다. 대상이되는 FcγRIIB 결합도메인은, 이전에보고된방법 (Tridandapani et al.(2000) "The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells," J. Biol. Chem. 275: ) 에의해, 플루오레세인화 IgG 옵소닌화양적혈구 (SRBC) 를탐식하는 THP-1 세포의능력을측정함으로써분석할수있다. 예를들면, 식작용을측정하기위한전형적인분석은, THP-1 세포를본발명의항체로또는 Fc γrii에결합하지않는대조항체로처리하는스텝, 상기세포의활성레벨을비교하는스텝으로구성된다. 그때, 세포의활성 ( 예를들면, 로제트형성활성 (IgG 피복 SRBC와결합하는 THP-1 세포의수 ), 부착활성 (THP-1 세포에결합한 SRBC의총수 ), 및식작용율 ) 의차이가본발명의항체에의한 FcγRIIA 의존성활성의조절을나타낼수있다. 이분석을사용하여, 예를들면, FcγRIIB 수용체의리간드결합을블록하고, 또는식작용의 Fc γriib 개재저해에길항하는항체를동정할수있다. 이분석은 FcγRIIA 시그널전달의 FcγRIIB 개재저해를증강하는항체를동정할수도있다. 바람직한구체예에서, 결합도메인은, 인간단구 / 마크로파지에서의 FcγRIIB 의존성활성을이하의적어도 1 이상의방법으로조절한다. 즉, 하류시그널전달분자의조절 ( 예를들면, FcγRIIB의인산화상태의조절, SHIP 인산화의조절, SHIP와 Shc의결합의조절, Akt의인산화의조절, 약 120kDa 및 60~65kDa의더한층의단백질의인산화의조절 ) 및식작용의조절이다 CD16A 결합도메인이하의섹션에서는, CD16A 결합단백질에대하여논한다. 이단백질은, 공유결합형디아바디의제작을위한경쇄및중쇄의가변영역의소스로서사용할수있다. 본발명에서는, CD16A 결합단백질은항 CD16A 항체의 VL 및 VH 도메인으로이루어지는분자를포함한다. 이 VL 및 VH 도메인을본발명의디아바디의제작에사용한다. 여러 CD16A 결합단백질을본발명에관련하여사용할수있다. 적당한 CD16A 결합단백질은, 인간또는인간화단일클론항체, 및 CD16A 결합항체단편 ( 예를들면, scfv 또는 1쇄항체, Fab 단편, 미니바디 ), 및경쇄가변영역도메인, 중쇄가변영역도메인, 또는그양쪽과의상호작용을통하여 CD16A에결합하는다른항체유사단백질을포함한다

44 [0184] [0185] [0186] [0187] 몇개의구체예에서, 본발명에따라사용하기위한 CD16A 결합단백질은비인간항 CD16A 항체 ( 예를들면, 마우스항 CD16A 항체 ) 에유래하는서열을갖는 1 이상의 CDR과, 1 이상의인간면역글로불린의프레임워크서열에유래하는 1 이상의프레임워크영역을갖는 VL 및 / 또는 VH 도메인을포함한다. CDR 및다른서열을얻을수있는다수의비인간항 CD16A 단일클론항체가알려져있다 ( 예를들면, Tamm et al.(1996) "The Binding Epitopes Of Human CDl 6(Fc gamma RIII) Monoclonal Antibodies. Implications For Ligand Binding," J. Imm. 157: ; Fleit et al.(1989) p.159; LEUKOCYTE TYPING II: HUMAN MYELOID AND HEMATOPOIETIC CELLS, Reinherz et al, eds. New York: Springer-Verlag; (1986); LEUCOCYTE TYPING III: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS McMichael A J, ed., Oxford: Oxford University Press, 1986); LEUKOCYTE TYPING IV: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kapp et al., eds. Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING V: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Schlossman et al., eds. Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING VI: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kishimoto, ed. Taylor & Francis를참조하기바람 ). 또한, 실시예에서설명하는바와같이, 세포상에제시되는인간 CD16A를인식하는새로운 CD16A 결합단백질은단일클론항체또는관련되는결합단백질의제작및선택을위한주지의방법 ( 예를들면, 하이브리도마기술, 파지디스플레이법등 ) 을사용하여얻을수있다. 예를들면, O'Connell et al.(2002) "Phage Versus Phagemid Libraries For Generation Of Human Monoclonal Antibodies," J. MoI. Biol. 321 :49-56; Hoogenboom et al.(2000) "Natural And Designer Binding Sites Made By Phage Display Technology," Imm. Today 21 :371078; Rrebs et al.(2001) "High-Throughput Generation And Engineering Of Recombinant Human Antibodies," J. Imm. Methods 254:67-84; 및본명세서에서인용한다른문헌을참조. 인간이외의종유래의단일클론항체를, 당해분야에서알려져있는항체의인간화기술을사용하여키메라화또는인간화할수있다. 또는, CD16A에대한완전한인간항체는, 인간면역계의성분을갖는트랜스제닉동물을사용하여 ( 예를들면, 미국특허제5,569,825호및제5,545,806호 ), 인간말초혈세포를사용하여 (Casali et al.(1986) "Human Monoclonals From Antigen-Specific Selection Of B Lymphocytes And Transformation By EBV," Science 234: ), 인간 B세포유래의 DNA 라이브러리를 Huse et al.(1989) "Generation Of A Large Combinatorial Library Of The Immunoglobulin Repertoire In Phage Lambda," Science 246: 에서개략적으로설명된통상의프로토콜을따라스크리닝함으로써, 및다른방법에의해제작할수있다. 바람직한구체예에서, 결합도너 (donor) 는, 예를들면, 미국특허출원제2004/ 호 ( 참조로서그모두를본명세서에포함함 ) 에개시되어있는바와같은, 3G8 항체또는그인간화형유래인것이구체예로서바람직하다. 몇개의목적으로는, 3G8이결합하는에피토프와동일한에피토프에서, 또는 3G8에의한결합을블록하기위하여당해에피토프에적어도충분히근접하는에피토프에서, CD16A 수용체에결합하는 CD16A 결합단백질을사용하는것이유리하다고생각된다. 원하는결합특성을갖는결합단백질을동정하기위한에피토프매핑법및경쟁적결합실험은실험면역학의당업자에게는주지이다. 예를들면, 상기에서인용한 Harlow와 Lane의논문 ; Stahli et al.(1983) "Distinction Of Epitopes By Monoclonal Antibodies," Methods in Enzymology 92: ; Kirkland et al.(1986) "Analysis Of The Fine Specificity And Cross-Reactivity Of Monoclonal Anti- Lipid A Antibodies," J. Immunol. 137: ; Morel et al.(1988) "Monoclonal Antibodies To Bovine Serum Albumin: Affinity And Specificity Determinations," Molec. Immunol. 25:7-15; Cheung et al.(1990) "Epitope-Specific Antibody Response To The Surface Antigen Of Duck Hepatitis B Virus In Infected Ducks," Virology 176: ; and Moldenhauer et al.(1990) "Identity Of HML-I Antigen On Intestinal Intraepithelial T Cells And Of B-ly7 Antigen On Hairy Cell Leukaemia," Scand. J. Immunol. 32:77-82를참조. 예를들면, 2개의항체가동일부위에결합하는지아닌지는일방의항체를사용하여 ELISA 플레이트상에서항원을포착하고, 그후포착된항원에결합하는제 2 항체의능력을측정함으로써, 확인하는것이가능하다. 또, 에피토프의비교는제 1 항체를직접적으로또는간접적으로효소, 방사성핵종또는형광단으로표지하고, 세포상의, 용액중의또는고상상의항원으로의제 1 항체의결합을저해하는미표지의제 2 항체의능력을측정함으로써달성할수도있다. CD16A 수용체와 ELISA 플레이트상에형성된면역복합체와의결합을블록하는항체의능력을측정하는것도가능하다. 상기면역복합체는, 우선플루오레세인등의항원으로플레이트를피복하고, 다음에특이적인항플루오레세인항체를플레이트에도포함으로써형성된다. 이면역복합체는, 그후, sfcriiia와같은가용성 Fc 수용체의리간드로서기능한다. 또는, 가용성의면역복합체를형성시켜, 효소, 방사성핵종또는형광단으로직접적으로또는간접적으로표지해도된다. 그후, 이들표지된면역복합체와, 세포상의, 용액중의또는고상상

45 의 Fc 수용체와의결합을저해하는항체의능력을측정할수있다. [0188] [0189] [0190] [0191] [0192] [0193] [0194] 본발명의 CD16A 결합단백질은인간면역글로불린 Fc 영역을포함하고있어도되고, 포함하지않아도된다. Fc 영역은, 예를들면, scfv 결합단백질중에는존재하지않는다. Fc 영역은, 예를들면, 인간또는인간화 4 량체단일클론 IgG 항체에는존재한다. 상기한바와같이, 본발명의몇개의구체예에서는, CD16A 결합단백질은이펙터기능이개변되어있는 Fc 영역을포함한다. 개변된이펙터기능으로서, 예를들면, 미개변 Fc 영역 ( 예를들면, 천연의 IgG1 단백질의 Fc 등 ) 과비교한경우의 Fc 수용체또는보체의 C1 성분과같은이펙터리간드에대한친화성의저하를들수있다. 제 1의구체예에서, Fc 영역은 297 자리에상당하는 Fc 영역의아미노산이글리코실화되어있지않다. 이러한항체는 Fc 이펙터기능이결여되어있다. 따라서, CD16A 결합단백질은, 결합단백질중에 Fc 도메인이결여되므로, Fc 수용체또는보체의 C1 성분과같은이펙터리간드로의 Fc 개재결합을나타내지않는경우가있지만, 다른케이스에서는, 결합이나이펙터기능의결여는항체의정상영역의변화에기인하고있다 mab 3G8 CDR 서열에유사한 CDR 서열을포함하는 CD16A 결합단백질본발명의실시시에사용할수있는 CD16A 결합단백질은마우스단일클론항체 3G8의 CDR에유래하는 ( 즉동일또는유사의서열을가지고있음 ) CDR 서열을포함하는단백질을포함한다. 마우스 3G8 단일클론항체의중쇄및경쇄의가변영역을코딩하는상보적 cdna(cdr을코딩하는서열을포함함 ) 를, 기재한바와같이클론화하여서열결정했다. 3G8의핵산서열및단백질서열을이하에나타낸다. 마우스가변영역및 CDR 서열을사용하여, 3G8의 CDR에유래하는상보성결정영역을포함하는수많은키메라및인간화단일클론항체를제작하고, 그것들의특성을해석했다. CD16A에고친화성으로결합하고, 또다른원하는성질을갖는인간화항체를동정하기위하여, 3G8 유래의 CDR을갖는 VH 영역을포함하는항체중쇄를제작하고, 3G8 유래의 CDR을갖는 VL 영역을포함하는항체경쇄와 ( 공발현에의해 ) 결합시켜, 해석용의 4량체항체를제작했다. 얻어진 4량체항체의성질을이하에기재한바와같이측정했다. 이하에서설명한바와같이, 3G8의 CDR을포함하는 CD16A 결합단백질, 예를들면, 본명세서에기재한인간화항체단백질을본발명에따라서사용할수있다 VH 영역 1구체예에있어서, 본발명의 CD16A 결합단백질은, 적어도 1개의 CDR( 통상은 3개의 CDR) 이마우스단일클론항체 3G8 중쇄의 1개의 CDR( 일반적으로는 3개모든 CDR) 의서열을갖고, 이결합단백질의나머지의부분이실질적으로인간의서열을갖는 ( 인간항체의중쇄가변영역에유래하고, 실질적으로그것에유사한 ), 중쇄가변도메인을포함할수있다. 1구체예에있어서, 본발명은, 실질적으로인간의프레임워크중에 3G8 항체유래의 CDR을포함하는인간화 3G8 항체또는항체단편이며, 중쇄가변도메인의적어도 1개의 CDR이대응하는마우스항체 3G8 중쇄 CDR과서열의점에서상이한, 상기항체를제공한다. 예를들면, 1의구체예에서, CDR은당해분야에서공지의또는표 3 및표 4~11에서개시한것과같은, CD16A로의 3G8의결합에영향을주는것이당해분야에서알려져있는 1 이상의 CDR 치환을적어도가짐으로써, 3G8의 CDR서열과는상이하다. 적당한 CD16 결합단백질은이들치환을 0, 1개, 2개, 3개또는 4개, 또는그것이상포함하며 ( 대부분의경우, 1~4개의치환을가짐 ), 임의로, 추가의치환도가질수있다. 표 3 [0195] V H 도메인의치환 번호 카밧위치 부위 치환 1 2 FR1 He 2 5 FR1 Lys 3 10 FR1 Thr 4 30 FR1 Arg 5 34 CDR1 Val 6 50 CDR2 Leu 7 52 CDR2 Phe 또는 Asp 8 54 CDR2 Asn Tyr 또는

46 9 60 CDR2 Ser CDR2 Ser FR3 Thr FR3 Gln 또는 His CDR3 Tyr CDR3 Asp Lys 또는 Ala 또는 표 4 [0196] 3G8 V H 유래의 V H 서열 * FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 3G8VH A A A A A A A Ch3G8VH A A A A A A B HxC B A B A A A B CxH A A A A B A B Hu3G8VH-l B A B A B A B Hu3G8VH-2 C A B A B A B Hu3G8VH-3 D A B A B A B Hu3G8VH-4 B A B A C B B Hu3G8VH-5 B A B A C A B Hu3G8VH-6 B B B A B B B Hu3G8VH-7 B B B A B A B Hu3G8VH-S B A B A B C B Hu3G8VH-9 B A B B B B B Hu3G8VH-I0 B A B A B B B Hu3G8VH-ll B A B B B A B Hu3G8VH-12 B A B C B A B Hu3G8VH-13 B A B D B A B Hu3G8VH-14 B A B E B A B Hu3G8VH-15 B A B A D A B Hu3G8VH-16 B A B A E A B Hu3G8VH-17 B A B A F A B Hu3G8VH-1S B A B A G A B Hu3G8VH-19 B A B A C C B Hu3G8VH-20 B B B C B A B Hu3G8VH-21 B A B A D B B Hu3G8VH-22 B B B C B C B Hu3G8VH-23 B B B C E C B Hu3G8VH-24 B B B C F C B Hu3G8VH-25 B B B C G C B Hu3G8VH-26 B B B C C C B Hu3G8VH-27 B B B C E D B Hu3G8VH-28 B B B C F D B Hu3G8VH-29 B B B C G D B Hu3G8VH-30 B B B C C D B Hu3G8VH-31 E B B C B A B Hu3G8VH-32 E B B H B A B

47 Hu3G8VH-33 E B B H B A B Hu3G8VH-34 E B B C B C B Hu3G8VH-35 E B B C C C B Hu3G8VH-36 E B B H C D B Hu3G8VH-37 E B B H E C B Hu3G8VH-38 E B B F B A B Hu3G8VH-39 E B B I B A B Hu3G8VH-40 E B B G B A B Hu3G8VH-41 E B B J B A B Hu3G8VH-42 E B B C H A B Hu3G8VH-43 E B B C H C B Hu3G8VH-44 E B B C I D B Hu3G8VH-45 E B B C J D B [0197] * 표시는표 5-11 에있는서열을나타낸다. 표 5 [0198] FR1 A B C D E 잔기 Q Q Q Q Q 1 V V V V I 2 T T T T T 3 L L L L L 4 K R K R K 5 E E E E E 6 S S S S S 7 G G G G G 8 P P P P P 9 G A A A T 10 I L L L L 11 L V V V V 12 Q K K K K 13 P P P P P 14 S T T T T 15 Q Q Q Q Q 16 T T T T T 17 L L L L L 18 S T T T T 19 L L L L L 20 T T T T T 21 C C C C C 22 S T T T T 23 F F F F F 24 S S S S S 25 G G G G G 26 F F F F F 27 S S S S S 28 L L L L L 29 R S S R S 서열번호

48 [0199] 표 6 [0200] CDR1 A B 잔기 T T 31 S S 32 G G 33 M V 34 G G 35 V V 35A G G 35B 서열번호 [0201] 표 7 [0202] FR2 A B 잔기 W W 36 I I 37 R R 38 Q Q 39 P P 40 S P 41 G G 42 K K 43 G A 44 L L 45 E E 46 W W 47 L L 48 A A 서열번호 [0203] 표

49 [0204] CDR2 A B C D E F G H I J 잔기 H H H H H L H L H L 50 I I I I I I I I I I 51 W Y W Y W D F W D W 52 W W W W W W W W W W 53 D N D D N D D D D N 54 D D D D D D D D D D 55 D D D D D D D D D D 56 K K K K K K K K K K 57 R R R R R R R R R R 58 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 59 N N S N N S S S S S 60 P P P P P P P P P P 61 A A S A A S S S S S 62 L L L L L L L L L L 63 K K K K K K K K K K 64 S S S S S S S S S S 서열번호 [0205] 표 9 [0206] FR3 A B C D E F G H I J 잔기 R R R R R R R R R R 66 L L L L L L L L L L 67 T T T T T T T T T T 68 I I I I I I I I I I 69 S S S S S S S T T T 70 K K K K K K K K K K 71 D D D D D D D D D D 72 T T T T T T T T T T 73 S S S S S S S S S S 74 S K K K K K K K K K 75 N N N N N N N N N N 76 Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 77 V V V V V V V V V V 78 F V V V V V V V V V 79 L L L L L L L L L L 80 K T T T T T T T T T 81 I M M M M M M M M M 82 A T T T T T T T T T 82A

50 S N N N N N N N N N 82B V M M M M M M M M M 82C D D D D D D D D D D 83 T P P P P P P P P P 84 A V V V V V V V V V 85 D D D D D D D D D D 86 T T T T T T T T T T 87 A A A A A A A A A A 88 T T T T T T T T T T 89 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 90 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 91 C C C C C C C C C C 92 A A A A A A A A A A 93 Q R Q T K A H R H Q 서열번호 A 서열번호 B 서열번호 C 서열번호

51 [0207] 표 10 [0208] CDR3 A B C D 잔기 I I I I 95 N N N N 96 P P P P 97 A A A A 98 W W Y Y 99 F F F F 100 A D A D 101 Y Y Y Y 서열번호

52 [0209] 표 11 [0210] FR4 A B 잔기 W W 103 G G 104 Q Q 105 G G 106 T T 107 L L 108 V V 109 T T 110 V V 111 S S 112 A S 서열번호 [0211] [0212] [0213] [0214] [0215] [0216] 1구체예에서, CD16A 결합단백질은 Hu3G8VH-1 컨스트럭트 ( 서열번호 68에나타냄 ) 의 VH 도메인과동일한또는유사한중쇄가변도메인의서열을포함할수있다. 예를들면, 본발명은, (1) 표 1에기재한 0, 1 또는그이상의 CDR 치환에의해 Hu3G8VH-1( 서열번호 68) 의 VH 도메인과는다르고, (2) 표 1에기재한 0, 1 또는그이상의프레임워크치환에의해 Hu3G8VH-1의 VH 도메인과는다르고, (3) 나머지의위치에서 Hu3G8VH-1의 VH 서열과적어도약 80% 동일이다, 많은경우적어도약 90%, 때로는적어도약 95% 동일이다, 또는적어도약 98% 동일한, 서열을갖는 VH 도메인을포함하는 CD16A 결합단백질을제공한다. 본발명의 CD16A 결합단백질의전형적인 VH 도메인은 3G8VH, Hu3G8VH-5 및 Hu3G8VH-22의서열 ( 각각, 서열번호 79, 서열번호 69 및서열번호 70) 을갖는다. 3G8VH 및 Hu3G8VH-5의서열 ( 각각, 서열번호 79 및서열번호 69) 을코딩하는전형적인뉴클레오티드서열을각각서열번호 80 및서열번호 81에나타낸다. VH 도메인은, 표 3에서나타낸치환의적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개또는적어도 6개에의해 Hu3G8VH-1( 서열번호 68) 의서열과상이한서열을가질수있다. 이들치환은 CD16A에대한친화성의증가를초래하고, 및 / 또는인간에게투여한경우에 CD16A 결합단백질의면역원성을줄인다고생각되고있다. 몇개의구체예에서, 나머지위치의 Hu3G8VH-1의 VH 도메인과의서열동일성의정도는적어도약 80%, 적어도약 90%, 적어도약 95%, 또는적어도약 98% 이다. 한정이아니고예시로서, 다수의 CD16A 결합단백질의 VH 도메인의서열을표 4-11에나타낸다. 인간 Cγ1 정상영역과융합시킨, 이들서열을포함하는중쇄를, hu3g8vl-1 경쇄 ( 이하에기재 ) 와함께공발현시켜, 4량체의항체를형성시켰다. 또, CD16A에대한이항체의결합성을측정하여, 아미노산치환의효과를 hu3g8vh-1의 VH 도메인과비교하여평가했다. VH 도메인이 hu3g8vh-1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 42, 43, 44 및 45의서열을갖는컨스트럭트는고친화결합성을나타내고, hu3g8vh-6 및 -40의 VH 도메인은중간의결합성을나타냈다. hu3g8vh-5 및 hu3g8vh-22( 각각, 서열번호 69 및서열번호 70) 의 VH 도메인을포함하는 CD16A 결합단백질은특히바람직한결합성질을갖는다고생각된다 VL 영역

53 [0217] [0218] [0219] 바람직한결합특성을갖는경쇄가변도메인서열을동정하기위하여동일한연구를행했다. 1의구체예에서, 본발명은이하와같은경쇄가변도메인을포함하는 CD16A 결합단백질을제공한다. 이도메인에서는, 적어도 1개의 CDR( 통상은 3개의 CDR) 이마우스단일클론항체 3G8 경쇄의 1개의 CDR( 통상은 3개모든 CDR) 의서열을갖고, 이결합단백질의나머지부분은실질적으로인간의서열을갖는다 ( 인간항체의경쇄가변영역에유래하고, 실질적으로그것과유사함 ). 1구체예에서, 본발명은, 실질적으로인간의프레임워크중에 3G8 항체유래의 CDR을포함하는인간화 3G8 항체의단편으로서, 경쇄가변도메인의적어도 1개의 CDR이마우스단일클론항체 3G8의경쇄 CDR과서열에있어서상이한, 상기항체단편를제공한다. 1구체예에서, CDR은 1 이상의아미노산치환, 예를들면, 표 2에서나타낸 1 이상의치환 ( 예를들면, CDR1의 24위치의아르기닌 ; CDR1의 25위치의세린 ; CDR1의 32위치의티로신 ; CDR1의 33위치의류신 ; CDR2의 50위치의아스파르트산, 트립토판또는세린 ; CDR2의 53위치의세린 ; CDR2의 55 위치의알라닌또는글루타민 ; CDR2의 56위치의트레오닌 ; CDR3의 93위치에있어서의세린 ; 및 / 또는 CDR3의 94 위치의트레오닌 ) 을 CDR 속에적어도가짐으로써 3G8 서열과는상이했다. 여러구체예에서, 가변도메인은, 이러한치환을 0, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개또는그것이상갖고 ( 대부분의경우, 1~4개의상기치환 ), 임의로추가의치환도가질수있다. 구체예의하나에있어서, 적당한 CD16A 결합단백질은 Hu3G8VL-1( 서열번호 71) 컨스트럭트의 VL 도메인과동일한또는유사한경쇄가변도메인서열을포함할수있다. 이서열을표 13-20에나타낸다. 예를들면, 본발명은, (1) 표 5에기재한 0, 1 또는그이상의 CDR 치환에의해 Hu3G8VL-1( 서열번호 71) 의 VL 도메인과는다르고, (2) 표 12에기재한 0, 1 또는그이상의프레임워크치환에의해 Hu3G8VL-1의 VL 도메인과는다르고, (3) 나머지위치에서 Hu3G8VL-1의 VL 서열 ( 서열번호 71) 과적어도약 80% 동일이다, 대부분의경우적어도약 90%, 때로는적어도약 95% 동일하거나, 또는적어도약 98% 동일한, 서열을갖는 VL 도메인을포함하는 CD16A 결합단백질을제공한다. [0220] 표 12 3G8 V L 도메인의치환 번호 카밧위치 부위 치환 1 24 CDR1 Arg 2 25 CDR1 Ser 3 32 CDR1 Tyr 4 33 CDR1 Leu 5 50 CDR2 Asp 또는 Trp 또는 Ser 6 51 CDR2 Ala 7 53 CDR2 Ser 8 55 CDR2 Ala 또는 Gln 9 56 CDR2 Thr CDR3 Ser CDR3 Thr [0221] 표 13 3G8 V L 유래의 V L 서열 FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 3G8VL A A A A A A A Ch3G8VL A A A A A A A Hu3G8VL-l B A A A B A B Hu3G8VL-2 B B A A B A B Hu3G8VL-3 B C A A B A B Hu3G8VL-4 B D A A B A B Hu3G8VL-5 B E A A B A B Hu3G8VL-6 B F A A B A B Hu3G8VL-7 B G A A B A B Hu3G8VL-8 B A A B B A B

54 Hu3G8VL-9 B A A C B A B Hu3G8VL-I0 B A A D B A B Hu3G8VL-11 B A A E B A B Hu3G8VL-12 B A A F B A B Hu3G8VL-13 B A A G B A B Hu3G8VL-14 B A A A B B B Hu3G8VL-15 B A A A B C B Hu3G8VL-16 B A A A B D B Hu3G8VL-17 B A A A B E B Hu3G8VL-18 B B A D B A B Hu3G8VL-19 B B A D B D B Hu3G8VL-20 B B A D B E B Hu3G8VL-21 B C A D B A B Hu3G8VL-22 B C A D B D B Hu3G8VL-23 B C A D B E B Hu3G8VL-24 B D A D B A B Hu3G8VL-25 B D A D B D B Hu3G8VL-26 B D A D B E B Hu3G8VL-27 B E A D B A B Hu3G8VL-28 B E A D B D B Hu3G8VL-29 B E A D B E B Hu3G8VL-30 B A A D B D B Hu3G8VL-31 B A A D B E B Hu3G8VL-32 B A A H B A B Hu3G8VL-33 B A A I B A B Hu3G8VL-34 B A A J B A B Hu3G8VL-35 B B A H B D B Hu3G8VL-36 B C A H B D B Hu3G8VL-37 B E A H B D B Hu3G8VL-38 B B A I B D B Hu3G8VL-39 B C A I B D B Hu3G8VL-40 B E A I B D B Hu3G8VL-41 B B A J B D B Hu3G8VL-42 B C A J B D B Hu3G8VL-43 B E A J B D B Hu3G8VL-44 B A A K B A B [0222] * 표시는, 표 의서열을나타낸다. [0223] 표 14 FR1 A B 잔기 D D 1 T I 2 V V 3 L M 4 T T 5 Q Q 6 S S 7 P P 8 A D 9 S S 10 L L 11 A A 12 V V 13 S S

55 L L 15 G G 16 Q E 17 R R 18 A A 19 T T 20 I I 21 S N 22 C C 서열번호 [0224] 표 15 [0225] CDR1 A B C D E F G 잔기 K R K K K K K 24 A A S A A A A 25 S S S S S S S 26 Q Q Q Q Q Q Q 27 S S S S S S S 27A V V V V V V V 27B D D D D D D D 27C F F F F F F F 27D D D D D D D D 28 G G G G G G G 29 D D D D D D D 30 S S S S S S S 31 F F F Y F F Y 32 M M M M L M L 33 N N N N N A A 서열번호 A 서열번호 B 서열번호 C 서열번호 D 서열번호

56 [0226] [0227] 표 16 FR2 A 잔기 W 35 Y 36 Q 37 Q 38 K 39 P 40 G 41 Q 42 P 43 P 44 K 45 L

57 L 47 I 48 Y 서열번호 [0228] 표 17 [0229] CDR2 A B C D E F G H I J K 잔기 T D W T D D S S S T T 50 T A A T A A A T T T T 51 S S S S S S S S S S S 52 N N N N N N N N N N S 53 L L L L L L L L L L L 54 E E E E E A Q E Q Q Q 55 S S S T T T S S S S S 서열번호 [0230] 표 18 [0231] FR3 A B 잔기 G G 57 I V 58 P P 59 A D 60 R R 61 F F 62 S S 63 A G 64 S S 65 G G 66 S S 67 G G 68 T T 69 D D 70 F F 71 T T 72 L L

58 N T 74 I I 75 H S 76 P S 77 V L 78 E Q 79 E A 80 E E 81 D D 82 T V 83 A A 84 T V 85 Y Y 86 Y Y 87 C C 서열번호 [0232] 표 19 [0233] CDR3 A B C D E 잔기 Q Q Q Q Q 89 Q Q Q Q Q 90 S S S S S 91 N Y Y N N 92 E S E S E 93 D T D D T 94 P P P P P 95 Y Y Y Y Y 96 T T T T T 서열번호 [0234] 표 20 [0235] FR4 A B 잔기 F F 98 G G 99 G Q 100 G G 101 T T 102 K K 103 L L

59 E E 105 I I 106 K K 서열번호 [0236] [0237] [0238] [0239] [0240] [0241] [0242] [0243] 본발명의 CD16 결합단백질의전형적인 VL 도메인은표 12-20에나타내는바와같이, 3G8VL, Hu3G8VL-1 또는 Hu3G8VL-43의서열 ( 각각, 서열번호 82, 서열번호 71 및서열번호 72) 을갖는다. 3G8VL( 서열번호 82) 및 Hu3G8VL-1( 서열번호 71) 을코딩하는전형적인뉴클레오티드서열을각각서열번호 83 및서열번호 84에나타낸다. VL 도메인은, 표 2에서나타낸치환의 0, 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개또는적어도 9개에의해 Hu3G8VL-1의서열 ( 서열번호 71) 과는상이한서열을가질수있다. 이들치환은 CD16A에대한친화성의증가를초래하거나, 및 / 또는인간에투여한경우에 CD16A 결합단백질의면역원성을줄인다고생각된다. 몇개의구체예에서, 나머지위치의서열동일성의정도는적어도약 80%, 적어도약 90%, 적어도약 95%, 또는적어도약 98% 이다. 한정이아니라예시로서, 다수의 CD16A 결합단백질의 VL 도메인서열을표 13-20에나타낸다. 인간 Cκ 불변도메인과융합시킨이들서열을포함하는경쇄를, Hu3G8VH 중쇄 ( 상기 ) 와공발현시켜, 4량체의항체를형성시켰다. 또, CD16A에대한이항체의결합성을측정하여, 아미노산치환의효과를 Hu3G8VL-1의 VL 도메인 ( 서열번호 71) 과비교하여평가했다. VL 도메인이 hu3g8vl-1, 2, 3, 4, 5, 10, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 27, 28, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 및 42의서열을갖는컨스트럭트는고친화결합성을나타냈다. 또, hu3g8vl-15, 17, 20, 23, 25, 26, 29, 30, 31, 38, 39, 40 및 41은중간의결합성을나타냈다. hu3g8vl-1, hu3g8vl-22 및 hu3g8vl-43( 각각, 서열번호 71, 서열번호 73 및서열번호 72) 의 VL 도메인을포함하는 CD16A 결합단백질은특히바람직한결합성질을갖는다고생각되고있다 VL 및 / 또는 VH 도메인의조합당해분야에서는공지이며, 또본명세서의다른부분에서도기재한바와같이, 면역글로불린의경쇄및중쇄는, 그들쇄가결합하여디아바디를생산하는조건하에서, 재조합기술에의해발현시킬수있고, 또 in vitro 에서그렇게조합시킬수있다. 따라서, 본명세서에서기재한 3G8 유래의 VL 도메인을본명세서에기재한 3G8 유래의 VH 도메인과조합하여, CD16A 결합성디아바디를제작할수있고, 그러한조합의모두가의도되어있는것을알수있을것이다. 한정이아니라예시로서, 유용한 CD16A 디아바디의예는적어도 1개의 VH 도메인과적어도 1개의 VL 도메인을포함하는디아바디이며, 그 VH 도메인이 hu3g8vh-1, hu3g8vh-22 또는 hu3g8vh-5( 각각, 서열번호 68, 서열번호 70 및서열번호 69) 에유래하고, 또 VL 도메인이 hu3g8vl-1, hu3g8vl-22 또는 hu3g8vl-43( 각각, 서열번호 71, 서열번호 73 및서열번호 41) 에유래한다. 특히, hu3g8vh-22( 서열번호 22) 와 hu3g8vl-1, hu3g8vl-22 또는 hu3g8vl-43( 각각, 서열번호 71, 서열번호 70 및서열번호 72), 또는 hu3g8vh-5( 서열번호 69) 와 hu3g8vl-1( 서열번호 71) 을포함하는인간화항체는, 바람직한성질을갖는다. 본명세서에기재한 VL 및 VH 도메인의서열을, 당해분야에서공지인방법, 예를들면, 친화성성숙등 (Schier et al.(1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site," J. MoI. Biol. 263: ; Daugherty et al.(1998) "Antibody Affinity Maturation Using Bacterial Surface Display," Protein Eng. 11 : ; Boder et al.(1997) "Yeast Surface Display For Screening Combinatorial Polypeptide Libraries," Nat. Biotechnol. 15: ; Boder et al.(2000) "Directed Evolution Of Antibody Fragments With Monovalent Femtomolar Antigen-Binding Affinity," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 97: ; Hudson et al.(2003) "Engineered Antibodies," Nature Medicine 9:129-39를참조 ) 에의해, 더욱개변할수있는것은당업자라면충분히이해할수있을것이다. 예를들면, CD16A 결합단백질을, 친화성성숙기술을사용하여개변하고, CD16A에대한친화성이증가한및 / 또는 CD16B에대한친화성이저하된단백질

60 을동정할수있다. [0244] [0245] [0246] [0247] 전형적인 CD16 결합단백질의하나는마우스 3G8 항체이다. 인간화 3G8의 VH 및 VL 도메인을포함하는아미노산서열을도 2, 9, 14에기재하고, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71 및서열번호 72로나타낸다 Fc 영역또는그일부를포함하는디아바디본발명은 Fc 도메인또는그일부 ( 예를들면, CH2 또는 CH3도메인 ) 를포함하는디아바디분자를포함한다. 몇개의구체예에서, Fc 도메인또는그일부는 IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 영역 ( 예를들면, CH2 또는 CH3) 의 1 이상의불변도메인을포함한다. 다른구체예에서, 본발명은 Fc 도메인또는그일부를포함하는분자를포함하고, 여기에서, 상기 Fc 도메인또는그일부는, 필적하는야생형 Fc 도메인또는그일부에대하여적어도 1 개의아미노산개변 ( 예를들면, 치환 ) 을포함하고있다. 상기변형 Fc 도메인은당해분야에서는잘알려져있고, 상기변형 Fc 도메인을포함하는항체의표현형 ( 당해분야에서주지의결합활성해석법또는이펙터기능해석법중어느하나, 예를들면, ELISA, SPR 해석또는 ADCC 등으로분석됨 ) 을바꾸는데주로사용된다. 이러한변형 Fc 도메인또는그일부는, Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는본발명의디아바디분자에의해나타내어지는이펙터기능 ( 예를들면, NK 의존적또는마크로파지의존적분석등에서기능적으로분석됨 ) 을부여하거나또는개변함으로써, 본발명에서사용된다. 이펙터기능을개변하면동정된 Fc 도메인변이체는국제공개 WO 04/063351호, 미국특허출원공개제2005/ 호및동제2005/ 호, 2004년 11월 10일에출원된미국가출원제60/626,510호, 2004년 12월 15일에출원된동제60/636,663호및 2006년 3월 10일에출원된동제 60/781,564호, 및본발명자의동시출원인 2005년 11월 10일에출원된미국특허출원제11/271,140호및 2005년 12월 15일에출원된동제11/305,787호중에개시되어있다. 이것들은모두참조로서그모두를본명세서중에포함한다. 다른구체예에서, 본발명은, 당해분야에서알려지는모든 Fc 변이체의사용도포함한다. 예를들면, Duncan et al.(1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG," Nature 332: ; Lund et al.(1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG," J. Immunol. 147: ; Lund et al.(1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma RII," MoI. Immunol. 29:53-59; Alegre et al.(1994) "A Non- Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo," Transplantation 57: ; Hutchins et al.(1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H " Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92: ; Jefferis et al.(1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44: ; Lund et al.(1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors," FASEB J. 9: ; Jefferis et al.(1996) "Modulation Of Fc(Gamma) R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions," Immunol. Lett. 54: ; Lund et al.(1996) "Multiple Interactions Of Igg With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains," J. Immunol. 157: ; Armour et al.(1999) "Recombinant Human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities," Eur. J. Immunol. 29: ; Idusogie et al.(2000) "Mapping Of The ClQ Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgGl Fc," J. Immunol. 164: ; Reddy et al.(2000) "Elimination OfFc Receptor-Dependent Effector Functions OfA Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4," J. Immunol. 164: ; Xu et al.(2000) "In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies," Cell. Immunol. 200:16-26; Idusogie et al.(2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement," J. Immunol. 166: ; Shields et al.(2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R," J. Biol. Chem. 276: ; Jefferis et al.(2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta et al.(2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function," Biochem. Soc. Trans. 30: ; 미국특허제5,624,821호 ; 미국특허제5,885,573호 ; 미국특허제6,194,551호 ; 국제공개 WO 00/42072호 ; 국제공개 WO 99/58572호 ( 모두참조로서그모두를본명세서중에포

61 함함 ) 에서개시된 Fc 변이체등을들수있다. [0248] [0249] [0250] 몇개의구체예에서, Fc 영역의아미노산에대한상기 1 이상의개변은, Fc 영역의, 따라서본발명의디아바디분자의, 1 이상의 FcγR 수용체에대한친화성및결합력을감소한다. 특정구체예에서, 본발명은, 변형 Fc 영역또는그일부를포함하는디아바디를포함하고, 여기에서, 상기변형 Fc 영역은, 야생형 Fc 영역과비교하여적어도 1개의아미노산개변을포함하고, 변형 Fc 도메인만이 1개의 FcγR과결합하고, 이 FcγR이 FcγRIIIA이다. 다른특정구체예에서, 본발명은, 변형 Fc 영역또는그일부를포함하는디아바디를포함하고, 여기에서, 상기변형 Fc 영역은, 야생형 Fc 영역과비교하여적어도 1개의아미노산개변을포함하고, 변형 Fc 영역만이 1 개의 FcγR과결합하고, 이 FcγR이 FcγRIIA이다. 다른특정구체예에서, 본발명은, 변형 Fc 영역또는그일부를포함하는디아바디를포함하고, 여기에서, 상기변형 Fc 영역은, 야생형 Fc 영역과비교하여적어도 1개의아미노산개변을포함하고, 변형 Fc 영역만이 1개의 FcγR과결합하고, 이 FcγR이 FcγRIIB이다. 몇개의구체예에서, 본발명은, 변형 Fc 도메인을포함하는분자를포함하고, 여기에서, 상기변이체는, 당업자에게공지이며, 또본명세서에기재된방법을사용하여측정했을때, Fc 도메인을포함하지않는분자또는야생형Fc 도메인을포함하는분자와비교하여, ADCC 활성의증가및 / 또는 FcγRIIA(CD32A) 에대한결합증가를부여하거나또는중개한다. 다른구체예에서, 본발명은변형 Fc 도메인을포함하는분자를포함하고, 여기에서, 상기변이체는당업자에게공지이고, 또한본명세서에기재된방법을사용하여측정했을때, Fc 도메인을포함하지않는또는야생형 Fc 도메인을포함하는분자와비교하여, ADCC 활성 ( 또는다른이펙터기능 ) 의저하및 / 또는 Fcγ RIIB(CD32B) 로의결합증대를부여하거나, 또는중개한다. 본발명은또한 2 이상의 IgG 이소타입에유래하는도메인또는영역을포함하는 Fc 도메인의사용을포함한다. 당해분야에서알려져있는바와같이, Fc 영역의아미노산개변은 Fc를통한이펙터기능및 / 또는결합활성에큰영향을끼칠수있다. 그러나, 기능특성의이러한개변은, 선택한 IgG 이소타입이라고하는배경에서행하는경우더욱세련되고, 및 / 또는조작될수있다. 마찬가지로, Fc 이소타입의천연의특성은 1 이상의아미노산개변에의해조작할수있다. 복수의 IgG 이소타입 ( 즉, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 은, 힌지및 / 또는 Fc 도메인의아미노산서열의차이때문에, 상이한물리학적및기능적성질, 예를들면, 혈중반감기, 보체결합, FcγR 결합친화성, 및이펙터기능활성 ( 예를들면, ADCC, CDC) 을나타낸다. 몇개의구체예에서, 원하는특징을갖는디아바디를설계하기위하여, 아미노산개변및 IgG Fc 영역은, 그것들의각각의개별의결합성및 / 또는이펙터기능활성에기초하여독립적으로선택된다. 대개의구체예에서는, 상기아미노산개변및 IgG 힌지 /Fc 영역은, IgG1이라고하는상황에서본명세서에기재되고또는당해분야에서공지인것과같은결합성및 / 또는이펙터기능활성에관하여각각분석되어있다. 몇개의구체예에서, 상기아미노산개변및 IgG 힌지 /Fc 영역은, 디아바디분자또는다른 Fc 함유분자 ( 예를들면, 면역글로불린 ) 라고하는상황에서 FcγR 결합성또는이펙터기능에대하여각각분석했을때, 유사의기능성, 예를들면, FcγRIIA에대한친화성의증가등을나타낸다. 상기아미노산개변과선택한 IgG Fc 영역의조합은, 그후, 추가적으로또는보다바람직하게는상승적으로작용하여, 야생형 Fc 영역을포함하는본발명의디아바디분자와비교하여, 본발명의디아바디분자의상기기능성을개변한다. 다른구체예에서, 상기아미노산개변및 IgG의 Fc 영역은, 본명세서에기재한또는당해분야에서공지의야생형 Fc 영역을포함하는디아바디분자또는다른 Fc 함유분자 ( 예를들면, 면역글로불린 ) 라고하는상황에서 FcγR 결합성및 / 또는이펙터기능에대하여별개로분석했을때, 상반되는기능성, 예를들면, FcγRIIA에대한친화성의각각증가및저하를내보인다. 상기 상반되는 아미노산개변및선택한 IgG 영역의조합은, Fc 영역을포함하지않는또는동일이소타입의야생형 Fc 영역을포함하는본발명의디아바디와비교하면, 본발명의디아바디의특이적기능성을선택적으로약화시키거나또는감소시키도록작용한다. 또는또한, 본발명은신규한성질을나타내는, 당해분야에서공지의아미노산개변과선택한 IgG 영역의조합을포함하는변형 Fc 영역을포함한다. 이러한성질은상기개변및 / 또는영역을본명세서에서기재한것과같이독립적으로분석한경우에는검출불능이다. 복수의 IgG 이소타입, 및그도메인의기능특성은당해분야에서는주지이다. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의아미노산서열을도 1a~1b에나타낸다. 본발명의방법에사용하는특정 IgG 이소타입에유래하는 2 이상의도메인의선택및 / 또는조합은 FcγR에대한친화성을포함하여, 친이소타입중어느하나의기지파라미터를기초로할수있다 ( 표 21; Flesch et al.(2000) "Functions Of The Fc Receptors For Immunoglobulin G," J. Clin. Lab. Anal. 14: ; Chappel et al.(1993) "Identification OfA Secondary Fc Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody," J. Biol. Chem. 33: ; Chappel et al.(1991) "Identification Of The Fc Gamma Receptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgG1 /IgG2 Hybrid And Point-Mutated Antibodies," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: ; 모두참조로서그모두를본명세서중에원용함 ). 예를들면, FcγRIIB로의한정된결합을나타내거나,

62 또는 FcγRIIB로의결합을나타내지않는 IgG 이소타입 ( 예를들면, IgG2 또는 IgG4) 에유래하는영역또는도메인의사용은활성화수용체로의결합을최대로하고, 억제성수용체로의결합을최소한으로하도록디아바디를조작하는것이요망되는경우에, 특히유용하다. 마찬가지로, C1q 또는 FcγRIIIA와우선적으로결합하는것이알려진, 예를들면, IgG3(Bruggemann et al.(1987) "Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies," J. Exp. Med. 166: ) 등의 IgG 이소타입에유래하는 Fc 영역또는도메인의사용은, ADCC를증강하는것이당해분야에서알려진 Fc아미노산개변과조합하여, 이펙터기능활성 ( 예를들면, 보체활성화또는 ADCC) 이최대가되도록디아바디분자를조작할수있다. [0251] 표 21 FcγR 에결합하는 IgG 의일반적인특징에관한것이다 (Flesch abd Neppert, 1999, J. Clin. Lab. Anal. 14: ) 수용체 IgG 에대한친화성추정치 (M -1 ) 상대적친화성 FcγRI IgG3 >IgG1 >>IgG4 결합하지않음 : IgG2 FcγRIIA R 131 A <10 7 IgG3 >IgG1 결합하지않음 : IgG2, IgG4 FcγRIIA H 131 A <10 7 IgG3 >IgG1 >IgG2 결합하지않음 : IgG4 FcγRIIB A <10 7 IgG3 >IgG1 >IgG4 결합하지않음 : IgG2 FcγRIII <10 7 IgG3 = IgG1 결합하지않음 : IgG2, IgG4 [0252] [0253] [0254] [0255] [0256] A IgG 복합체에만결합 5.3. 분자결합체본발명의디아바디분자를, 이종폴리펩티드 ( 즉, 관련성이없는폴리펩티드, 또는그일부, 바람직하게는그폴리펩티드의적어도 10아미노산, 적어도 20아미노산, 적어도 30아미노산, 적어도 40아미노산, 적어도 50아미노산, 적어도 60아미노산, 적어도 70아미노산, 적어도 80아미노산, 적어도 90아미노산또는적어도 100아미노산 ) 와, 재조합에의해융합시켜, 또는화학적으로결합 ( 공유결합, 비공유결합모두를포함 ) 시켜, 융합단백질을제작할수있다. 융합은반드시직접적일필요는없지만, 링커서열을통하여일어날수있다. 또한, 본발명의디아바디분자 ( 즉, 폴리펩티드 ) 는치료약또는주어진생물학적응답을개변하는약제성분과결합할수있다. 직접적인결합을대신하는것으로서, 본발명의다가 ( 예를들면, 4가 ) 의디아바디분자상의복수의에피토프결합부위에의해, 디아바디의적어도 1개의결합영역은디아바디의결합에영향을주지않고, 치료약또는원하는약제성분과결합하도록디자인할수있다. 치료약또는약제성분은고전적인화학치료약인것에한정되지않는다. 예를들면, 약제성분은원하는생물학적활성을갖는단백질또는폴리펩티드이어도된다. 이러한단백질로서는이하가포함된다 : 아브린 (abrin), 리신 A, 녹농균외독소 ( 즉, PE-40) 또는디프테리아독소등의독소, 리신, 겔로닌및포크위드 (pokeweed) 항바이러스단백질, 예를들면종양괴사인자, α-인터페론 (IFN-α) 및 β-인터페론 (IFN-β) 을포함하지만이것들에한정은되지않는인터페론, 신경성장인자 (NGF), 혈소판유래증식인자 (PDGF), 조직플라스미노겐활성화인자 (TPA), 어팝토시스제 ( 예를들면, TNF-α, TNF-β, 국제공개 WO 97/33899호에기재된 AIM I), AIM II( 국제공개 WO 97/34911호참조 ), Fas리간드, 및 VEGI( 국제공개 WO 99/23105호 ) 등의단백질, 혈전제또는혈관신생저해제 ( 예를들면, 안지오스타틴또는엔도스타틴 ), 또는예를들면, 림포카인 ( 예를들면, 인터류킨1(IL-1), 인터류킨 2(IL-2), 인터류킨6(IL-6), 과립구대식세포군체자극인자 (GM-CSF), 및과립구군체자극인자 (G-CSF), 대식세포군체자극인자 (M-CSF)), 또는성장인자 ( 예를들면, 성장호르몬 (GH)) 와같은생물학적응답개변물질, 프로테아제, 또는리보뉴클레아제

63 [0257] [0258] [0259] 본발명의디아바디분자 ( 즉, 폴리펩티드 ) 를, 예를들면, 정제를용이하게하는펩티드등의마커서열과융합시킬수있다. 바람직한구체예에서, 마커아미노산서열은헥사히스티딘펩티드이며, 예를들면, 시판품중에서도특히 pqe 벡터 (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) 중에서제공되는태그를들수있다. Gentz 등이 1989, "Bioassay For Trans-Activation Using Purified Human Immunodeficiency Virus TAT- Encoded Protein: Trans-Activation Requires mrna Synthesis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 에서기재하고있는바와같이, 예를들면, 헥사히스티딘은융합단백질의간편한정제를제공한다. 정제에유용한다른펩티드태그에는, 인플루엔자헤마글루티닌단백질의에피토프에상당하는헤마글루티닌 HA 태그 (Wilson et al.(1984) "The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein," Cell, 37: ), 및 Flag 태그((Knappik et al.(1994) "An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments," Biotechniques, 17(4): ) 가포함되는데, 이것들에한정되지않는다. 또한융합단백질은유전자셔플링, 모티프셔플링, 엑손셔플링및 / 또는코돈셔플링 ( 정확하게는 DNA 셔플링 이라고불림 ) 의기술을통하여제작할수있다. DNA 셔플링을사용하여, 본발명의분자의활성 ( 예를들면, 보다높은친화성과보다낮은해리속도를가진에피토프결합부위 ) 을변경할수있다. 일반적으로는, 미국특허제5,605,793호 ; 제5,811,238호 ; 제5,830,721호 ; 제5,834,252호 ; 및제5,837,458호, 및 Patten et al.(1997) "Applications Of DNA Shuffling To Pharmaceuticals And Vaccines," Curr. Opinion Biotechnol. 8: ; Harayama(1998) "Artificial Evolution By DNA Shuffling," Trends Biotechnol. 16:76-82; Hansson et al.(1999) "Evolution Of Differential Substrate Specificities In Mu Class Glutathione Transferases Probed By DNA Shuffling," J. MoL Biol. 287: ; 및 Lorenzo et al.(1998) "PCR-Based Method For The Introduction Of Mutations In Genes Cloned And Expressed In Vaccinia Virus," BioTechniques 24: ( 모두참조로서이모두를본명세서중에포함함 ) 을참조한다. 본발명의디아바디분자, 또는본발명의분자를코딩하는핵산은, 또한에러프론 (error-prone) PCR법, 랜덤뉴클레오티드삽입법또는다른방법을사용한랜덤변이유발에의해, 재조합전에개변할수있다. 본발명의분자를코딩하는폴리뉴클레오티드의 1 이상의부분을, 1 이상의이종분자의 1 이상의성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편등과재조합할수있다. 또한, 본발명은, 진단약또는치료약, 또는다른어느분자 ( 혈중반감기의증가 / 감소가요망되는분자및 / 또는세포의특정소집단을표적으로하는분자 ) 와결합한, 또는그것들을면역특이적으로인식하는본발명의디아바디분자도포함한다. 본발명의분자를진단에사용해서, 예를들면, 질환, 장애, 또는감염의발생또는진행을임상시험의일환으로서모니터링하여, 예를들면, 주어진치료계획의효과를측정할수있다. 본발명의분자를검출가능한물질과결합시킴으로써, 또는검출가능한물질을면역특이적으로인식하는분자에의해, 검출을용이하게할수있다. 검출가능한물질의예에는, 각종효소, 보결분자족, 형광물질, 발광물질, 생물발광물질, 방사성물질, 양전자방출금속, 및비방사성상자성금속이온이포함된다. 검출가능한물질은, 본발명의분자와직접적으로, 또는매개물질 ( 예를들면, 당해분야에서공지의링커 ) 을통하여간접적으로, 당해분야에서공지의방법을사용하여연결또는결합할수있다. 또는, 당해분자가검출가능한물질을면역특이적으로인식할 ( 즉, 상기물질과면역특이적으로결합할 ) 수있다. 예를들면, 본발명의진단약으로서사용하기위한항체와결합시킬수있는금속이온에대해서는, 미국특허제4,741,900호를참조한다. 상기진단및검출은, 검출가능한물질을면역특이적으로인식하도록이분자를디자인하거나, 또는본발명의분자를검출가능한물질과연결함으로써, 달성할수있다. 여기에서검출가능한물질은한정은되지않지만, 각종효소, 예를들면, 양고추냉이페록시다제, 알칼리포스파타제, β-갈락토시다제, 또는아세틸콜린에스테라제 ( 단, 이것들에한정은되지않음 ); 스트렙타비딘 / 비오틴및아비딘 / 비오틴등의보결분자족복합체 ( 단, 이것들에한정은되지않음 ); 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민플루오레세인, 염화단실, 또는피코에리트린등의형광물질 ( 단, 이것들에한정되지않음 ), 루미놀등의발광물질 ( 단, 이것에한정되지않음 ), 루시페라제, 루시페린및에쿼린등의생물발광물질 ( 단, 이것들에한정되지않음 ), 비 스무스 ( 213 Bi), 탄소 ( 14 C), 크롬 ( 51 Cr), 코발트 ( 57 Co), 불소 ( 18 F), 가돌리늄 ( 153 Gd, 159 Gd), 갈륨 ( 68 Ga, 67 Ga), 게르마늄 ( 68 Ge), 홀뮴 ( 166 Ho), 인듐 ( 115 In, 113 In, 112 In, 111 In), 요오드 ( 131 I, 125 I, 123 I, 121 I), 란탄 ( 140 La), 루테튬 ( 177 Lu), 망간 ( 54 Mn), 몰리브덴 ( 99 Mo), 팔라듐 ( 103 Pd), 아인산 ( 32 P), 프라세오디뮴 ( 142 Pr), 프로메튬 ( 149 Pm), 레늄 ( 186 Re, Re), 로듐 ( Rh), 루테늄 ( Ru), 사마륨 ( Sm), 스칸듐 ( Sc), 셀렌 ( Se), 스트론튬 ( Sr), 황 ( S), 테크네튬 ( 99 Tc), 탈륨 ( 201 Ti), 주석 ( 113 Sn, 117 Sn), 트리튬 ( 3 H), 크세논 ( 133 Xe), 이터븀 ( 169 Yb, 175 Yb), 이트륨 ( 90 Y), 아연

64 ( 65 Zn) 등의방사성물질 ( 단, 이것들에한정되지않음 ), 여러가지양전자방사단층촬영에서사용되는양전자 방출금속, 및비방사성상자성금속이온을포함한다. [0260] [0261] [0262] [0263] [0264] [0265] 본발명의디아바디분자는세포독소 ( 예를들면, 세포증식억제제또는살세포제 ), 치료제, 또는방사성원소 ( 예를들면, α방사체, γ방사체등 ) 과같은치료성분을면역특이적으로인식하거나, 또는그것과결합할수있다. 세포독소또는세포독성제는세포에유해한어떤약제도포함한다. 예로서, 파클리탁셀, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 아우노루비신, 디히드록시안트라신디온 (dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-디히디로테스토스테론, 당코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤및푸로마이신또는그것들의유사체또는동족체를포함한다. 치료제는한정하지않지만, 대사길항물질 ( 예를들면, 메토트렉세이트, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 다카르바진 ), 알킬화제 ( 예를들면, 메클로레타민, 티오테파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및시스디클로로디아민백금 (II)(DDP) 시스플라틴 ), 안트라시클린류 ( 예를들면, 다우노루비신 ( 이전의다우노마이신 ) 및독소루비신 ), 항체 ( 예를들면, 닥티노마이신 ( 이전의악티노마이신 ), 블레오마이신, 미트라마이신, 및안트라마이신 (AMC), 및유사분열저해제 ( 예를들면, 빈크리스틴및빈블라스틴 ) 를포함한다. 또한, 본발명의디아바디분자는치료성분, 예를들면, 방사성물질또는방사성금속이온과결합시키는데유용한대환상킬레이트제와결합시키거나, 또는그것을면역특이적으로인식하도록디자인할수있다 ( 방사성물질의상기예를참조하기바람 ). 몇개의구체예에서, 대환상킬레이트제는링커분자를통하여폴리펩티드에결합할수있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 -N,N',N'',N'''-4아세트산(DOTA) 이다. 상기링커분자는당해분야에서일반적으로알려져있고, Denardo et al.(1998) "Comparison Of 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane- N,N',N",N"'-Tetraacetic Acid(DOTA)-Peptide-ChL6, A Novel Immunoconjugate With Catabolizable Linker, To 2-Iminothiolane-2-[p-(bromoacetamido)benzyl] -DOTA-ChL6 In Breast Cancer Xenografts," Clin. Cancer Res. 4: ; Peterson et al.(1999) "Enzymatic Cleavage Of Peptide-Linked Radiolabels From Immunoconjugates," Bioconjug. Chem. 10:553-; 및 Zimmerman et al, (1999) "A Triglycine Linker Improves Tumor Uptake And Biodistributions Of 67-Cu-Labeled Anti-Neuroblastoma mab chce7 F(ab')2 Fragments," Nucl. Med. Biol. 26: 에도기재되어있다. 이것들은모두참조로서그모두를본명세서중에원용한다. 상기치료성분을, 예를들면, Fc 도메인을포함하여, 폴리뉴클레오티드와결합시키는방법은주지다. 예를들면, Arnon et al.,"monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.(eds.), 1985, pp , Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al,"antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.), Robinson et al.(eds.), 1987, pp , Marcel Dekker, Inc.); Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al.(eds.), 1985, pp ); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.(eds.), 1985, pp , Academic Press; 및 Thorpe et al.(1982) "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates," Immunol. Rev., 62: 를참조한다. 본발명의디아바디분자는, 당해분자와결합한치료성분과함께또는치료성분없이투여해도되고, 단독으로투여해도되며, 또는치료처치용의세포독성인자및 / 또는사이토카인과조합하여투여해도된다. 단독으로투여하는경우, 다가의, 예를들면 4가의디아바디분자의적어도 1개의에피토프는치료약 ( 예를들면, 세포독성인자및 / 또는사이토카인 ) 을면역특이적으로인식하도록설계할수있다. 이치료약은본발명의분자와동시에, 또는그것에이어서투여할수있다. 이와같이, 디아바디분자는직접적인결합과유사한방법으로치료약을특이적으로표적으로할수있다. 또는, 또한본발명의분자를항체에결합시켜, Segal이미국특허제 4,676,980호에기재하고있는것과같이항체헤테로결합체를형성시킬수있다. 이문헌은, 참조로서그모두를본명세서중에포함한다. 본발명의디아바디분자는고상지지체에결합할수도있다. 이것은특히표적항원의이뮤노분석또는정제에유용하다. 이러한고상지지체는유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리염화비닐또는폴리프로필렌을포함하지만, 이것들에한정은되지않는다 디아바디분자의결합의특성분석본발명의디아바디분자는각종방법으로특성분석할수있다. 특히, 본발명의분자는, 예를들면, FcRIIIA

65 또는 FcRIIB 등의항원과면역특이적으로결합하는능력에대하여, 또는당해분자가 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는경우에는, Fc-FcγR 상호작용 ( 즉, Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 의 FcγR로의특이적결합 ) 을나타내는능력에대하여, 분석할수있다. 상기분석은, 용액중에서 ( 예를들면, Houghten(1992) "The Use Of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries For The Identification Of Bioactive Peptides," BioTechniques, 13: ), 비드상에서 (Lam(1991) "A New Type Of Synthetic Peptide Library For Identifying Ligand-Binding Activity," Nature, 354:82-84), 칩상에서 (Fodor(1993) "Multiplexed Biochemical Assays With Biological Chips," Nature, 364: ), 세균상에서 ( 미국특허제5,223,409호 ), 포자상에서 ( 미국특허제5,571,698호, 제5,403,484호및제5,223,409호 ), 플라스미드상에서 (Cull et al.(1992) "Screening For Receptor Ligands Using Large Libraries Of Peptides Linked To The C Terminus Of The Lac Repressor," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: ), 또는페이지상에서 (Scott et al.(1990) "Searching For Peptide Ligands With An Epitope Library," Science, 249: ; Devlin(1990) "Random Peptide Libraries: A Source Of Specific Protein Binding Molecules," Science, 249: ; Cwirla et al.(1990) "Peptides On Phage: A Vast Library Of Peptides For Identifying Ligands," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: ; and Felici(1991) "Selection Of Antibody Ligands From A Large Library Of Oligopeptides Expressed On A Multivalent Exposition Vector," J. MoI. Biol, 222: )( 이들문헌은참조로서그모두를본명세서중에포함함 ) 실시할수있다. 항원에면역특이적으로결합하는것이동정되어있는분자, 예를들면, FcγRIIIA는, 그후, 항원에대한특이성및친화성에대하여분석할수있다. [0266] [0267] 복수의에피토프결합도메인을포함하도록제작한본발명의분자는 1 이상의항원 ( 예를들면, 암항원 ) 에대한면역특이적인결합성및다른항원 (FcγR) 과의교차반응성에대하여, 또는그분자가 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는경우에는 Fc-FcγR 상호작용에대하여, 당해분야에서공지의어느하나의방법에의해분석할수있다. 면역특이적결합, 교차반응성, 및 Fc-FcγR 상호작용을해석하기위해서사용할수있는면역분석법에는웨스턴블롯법, 방사면역분석법, ELISA법 ( 효소결합면역흡착해석법 ), 샌드위치 면역분석법, 면역침강분석법, 침강반응, 겔확산침강반응, 면역확산분석법, 응집분석법, 보체결합분석법, 면역방사성계수분석법, 형광면역분석법, 단백질A 면역분석법등과, 그저여러종류이지만, 이것들의기술을사용한경쟁및비경쟁분석계가포함된다. 다만, 이것들의기술에한정은되지않는다. 상기분석법은, 당해분야에서는일상적으로행해지고있으며, 널리알려져있다 ( 예를들면, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York를참조. 이것들은참조에의해그모두를본명세서중에원용함 ). 항원-결합도메인의상호작용, 또는 Fc-FcγR 상호작용의결합친화성및해리속도를경쟁결합분석법에의해측정할수있다. 경쟁결합분석법의일례로방사면역분석법이있다. 이방법은, 표지된항원, 예를들면, 4량체 FcγR( 예를들면, 3 H 또는 125 I, 섹션 5.4.1을참조 ) 과대상의분자 ( 예를들면, 복수의에피토프결합도메인을포함하는본발명의분자 ) 를, 4량체 FcγR( 섹션 5.4.1을참조 ) 과같은미표지에피토프의양을증가해가면서, 인큐베이션하고, 표지항원에결합한이분자를검출하는것을포함한다. 항원에대한본발명의분자의친화성및결합해리속도는 Scatchard 해석법에의한포화율로부터측정할수있다. [0268] [0269] 항원또는 FcγR에대한본발명의분자의친화성및결합특성은처음에항원-결합도메인또는 Fc-FcγR 상호작용에대하여당해분야에서는공지의 in vitro 분석법 ( 생화학또는면역학에기초하는분석법 ) 을사용하여측정할수있다. 여기에서, in vitro 분석법은, ELISA법, 표면플라즈몬공명해석법, 면역침강분석법을포함하지만, 이것들에한정은되지않는다. 또한, 본발명의분자의결합특성을, 섹션 5.4.2에기재한것과같은 1 이상의 FcγR 개재이펙터세포기능을측정하기위한 in vitro 기능분석법에의해특징짓는것이바람직하다. 가장바람직한구체예에있어서, 본발명의분자는, in vitro 베이스의분석에있어서의결합특성과동일한결합특성을 in vivo 모델 ( 예를들면, 본명세서에서기재하고, 또한개시한것 ) 에서도갖는다. 그러나, 본발명은, in vitro 베이스의분석에서는원하는표현형이나타나지않지만, in vivo에서는원하는표현형을나타내는본발명의분자를배제하는것이아니다. 몇개의구체예에서, 복수의에피토프결합도메인, 및임의로 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는분자의스크리닝및동정은기능에기초하는분석법, 바람직하게는고속처리능력을갖는방법으로행해진다. 기능에기초하는분석법은, 예를들면, 본명세서중의섹션 및 5.4.3에기재되어있는바와같은, 1 이상의 FcγR 개재이펙터세포기능을특성분석위한당해분야에서공지인어느하나의분석법으로할수있다. 본발명의방법에서사용할수있는이펙터세포기능의비한정적인예로서항체의존성세포장애 (ADCC), 항체의존성식작용, 식작용, 옵소닌화, 옵소닌식작용, 세포결합성, 로제트형성, C1q 결합, 및보체의존성세포를통한세

66 포독성을포함한다. 단, 이것들에한정되지않는다. [0270] [0271] BIAcore 동태해석을사용하여, 항원또는 FcγR에대한본발명의분자의결합속도및해리속도를측정하는구체예가바람직하다. BIAcore 동태해석은항원또는 FcγR의결합과해리를, 고정한분자 ( 예를들면, 각각에피토프결합도메인또는 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는분자 ) 를그표면에담지한칩상에서해석하는것을포함한다. BIAcore 해석은, 섹션 5.4.3에서설명한다. 당업자에게공지인어느하나의방법을사용한형광활성화셀소팅장치 (FACS) 를, 면역학또는기능에기초하는분석법에사용하여, 본발명의분자를특성분석하는것이바람직하다. 플로소터는본발명의분자에의해결합된 ( 예를들면, 그것에의해옵소닌화된 ) 다수의세포를개별적으로, 또한신속하게조사할수있다 ( 예를들면, 1시간당 1000만~1억개의세포 )(Shapiro 등, Practical Flow Cytometry, 1995). 또한, 디아바디의거동을최적화하는데사용되는특정파라미터에는, 한정은되지않지만, 항원농도 ( 즉, FcγR 4량체복합체, 섹션 5.4.1을참조 ), 동태경쟁시간, 또는 FACS 스트린전시가포함된다. 이것들을각각변화시켜, 특이적인결합특성 ( 예를들면, 복수의에피토프로의동시결합 ) 을나타내는본발명의분자를포함하는디아바디분자를선택할수있다. 생체세포를분취하여조사하는유세포분석기는당해분야에서는주지이다. 공지의유세포분석기는, 예를들면, 미국특허제4,347,935호 ; 제5,464,581호 ; 제5,483,469호 ; 제5,602,039호 ; 제5,643,796호 ; 및제 6,211,477호에기재되어있다. 이들문헌의내용모두는, 참조로서본명세서중에포함된다. 다른공지의유세포분석기로는 Becton Dickinson and Company로부터시판되고있는 FACS Vantage TM 시스템, 및 Union Biometrica 로부터시판되고있는 COPAS TM 시스템이있다. [0272] [0273] [0274] [0275] 표적항원결합친화성또는 Fc-FcγR 결합친화성의특성분석, 및세포표면상의표적항원밀도또는 FcγR 밀도의평가는, 당해분야에서주지의방법, 예를들면, Scatchard 해석법등에의해, 또는메이커사용설명서에따른키트, 예를들면, Quantum TM Simply Cellular(Simply CellulaR은등록상표 )(Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN) 의사용에의해, 행할수있다. 1 이상의기능분석은, 당업자에게공지의또는본명세서중에기재한것같은 1 이상의 FcγR 개재이펙터세포기능을특성분석위한당해분야에서공지인어느하나의분석이어도된다. 특정구체예에서, 복수의에피토프결합도메인, 및임의로 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는본발명의분자는 1 이상의표적항원또는 1 이상의 FcγR( 예를들면, FcγRIIIA, FcγRIIA, FcγRII A) 로의결합에대하여 ELISA 분석법으로분석되고, 계속해서 1 이상의 ADCC 분석으로분석된다. 몇개의구체예에서, 본발명의분자는또한표면플라즈몬공명에기초한분석, 예를들면, BIAcore를사용하여측정된다. 표면플라즈몬공명에기초한측정은, 당해분야에서는주지이지만, 섹션 5.4.3에서더욱설명하고, 본명세서중에서도예를들면실시예 6.1에서예증된다. 가장바람직한구체예에서, 복수의에피토프결합도메인, 및임의로 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 를포함하는본발명의분자는또한표적항원 ( 예를들면, FcγR) 과의상호작용또는 Fc-FcγR 상호작용에대하여동물모델에서특징지어진다. Fc-FcγR 상호작용을분석하는경우, 본발명의방법에서사용하는데바람직한동물모델은, 예를들면, 인간 FcγR을발현하는트랜스제닉마우스, 예를들면, 미국특허제5,877,397호및제6,676,927호에기재되어있는어느하나의마우스모델이다. 이들문헌은참조로서그모두가본명세서중에포함한다. 또한, 상기방법에서사용하는트랜스제닉마우스는, 한정은되지않지만, 인간 FcγRIIIA를담지하고있는 FcγRIIIA 넉아웃누드마우스 ; 인간 FcγRIIA를담지하고있는 FcγRIIIA 넉아웃누드마우스 ; 인간 FcγRIIB 및인간 Fc γriiia를담지하고있는 FcγRIIIA 넉아웃누드마우스 ; 인간 FcγRIIB 및인간 FcγRIIA를담지하고있는 Fc γriiia 넉아웃누드마우스 ; 인간 FcγRIIIA 및 FcγRIIA를담지하고있는 FcγRIIIA 및 FcγRIIA 넉아웃누드마우스, 및인간 FcγRIIIA, FcγRIIA 및 FcγRIIB을담지하고있는 FcγRIIIA, FcγRIIA 및 FcγRIIB 넉아웃누드마우스를포함한다 FcγR을포함하는결합분석 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는, 및 / 또는 FcγR에특이적인에피토프결합도메인을포함하는분자에의한 FcγR로의결합을특성분석하는것은, 한정은되지않지만 FcγR의다형돌연변이체를포함하여, 어느 FcγR을사용해도행할수있다. 몇개의구체예에서는, 158위치에페닐알라닌을포함하는 FcγRIIIA의다형돌연변이체가사용된다. 다른구체예에서는, 158위치에발린을포함하는 FcγRIIIA의다형돌연변이체를사용하여특성분석이행해진다. FcγRIIIA 158V는 IgG1에대하여 158F보다도높은친화성, 및 ADCC 활성의증가를보인다 ( 예를들면, Koene et al.(1997) "Fc gammariiia-158v/f Polymorphism Influences The Binding OfIgG By Natural Killer Cell Fc gammariiia, Independently Of The Fc gammariiia-48l/r/h Phenotype," Blood, 90: ;

67 Wu et al.(1997) "A Novel Polymorphism Of FcgammaRIIIa(CD 16) Alters Receptor Function And Predisposes To Autoimmune Disease," J. Clin. Invest. 100: ; 모두참조로서그모두를본명세서중에포함함 ). 이잔기는실제로 IgG1의하부힌지영역과직접상호작용하는데, 이것은 IgG1-FcγRIIIA의공결정화연구에의해최근밝혀졌다 ( 예를들면, Sondermann et al.(2000) "The 3.2-A Crystal Structure Of The Human IgG1 Fc Fragment-Fc gammariii complex," Nature, 406(6793) : 을참조. 이문헌은참조로서그모두가본명세서중에원용됨 ). 연구에의해, 몇개의케이스에있어서, 치료용항체는 FcγRIIIA-158V 호모접합환자에서향상된효과를갖는것이밝혀졌다. 예를들면, 인간화항 CD20 단일클론항체리툭시마브 (Rituximab) 는 Fcγ RIIIA-158F 호모접합환자와비교하여 FcγRIIIA-158V 호모접합환자에서, 보다치료효과가있었다 ( 예를들면, Cartron et al.(2002) "Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcgammaRIIIA Gene," Blood, 99(3): 을참조 ). 다른구체예에서, 이영역을포함하는치료용분자는또한 FcγRIIIA-158V 및 FcγRIIIA-158F에관하여이질접합의환자에있어서, 및 FcγRIIIA-131H를갖는환자이어도효과적일수있다. 특정작용기작에얽매일생각은없지만, 다른알로타이프를사용한본발명의분자의선택은, 일단치료용디아바디로제작되면, 그러한알로타입에대하여호모접합성의환자에대하여임상적으로보다효과가있다고생각되는돌연변이체를제공할수있다. [0276] [0277] [0278] [0279] [0280] [0281] FcγR 결합분석이, 본발명의분자와 FcγR와의결합을측정하기위하여, 특히, Fc 도메인과 FcγR과의결합을측정하기위하여개발되었다. 이분석에의해, 리간드에대한수용체의친화성이본질적으로약해도, 예를들면, FcγRIIB와 FcγRIIIA에대하여마이크로몰의범위이어도, Fc-FcγR 상호작용의검출및정량이가능하게되었다. 상기방법은국제공개 WO 04/063351호및미국특허출원공개제2005/ 호및제2005/ 호에그상세가기재되어있다. 모두참조로서그모두를본명세서에원용한다. 간단하게말하면, 이방법은, 당해분야에서알려진어느하나의표준적인면역분석법, 예를들면, FACS, ELISA, 표면플라즈몬공명등으로추적할수있는 FcγR 복합체의형성을포함한다. 또한, FcγR 복합체는복합체를형성하지않은 FcγR과비교하면, Fc 영역에대하여개선된결합활성을가지고있다. 본발명에의하면, 바람직한분자복합체는 4량체의면역복합체이며, 이면역복합체는, (a) FcγR의가용성영역 ( 예를들면, FcγRIIIA, FcγRIIA 또는 FcγRIIB 의가용성영역 ); (b) FcγR의가용성영역 ( 예를들면, FcγRIIIA, FcγRIIA 또는 FcγRIIB의가용성영역 ) 의 C말단으로기능할수있도록연결된비오틴화 15아미노산 AVITAG 서열 (AVITAG); 및 (c) 스트렙타비딘-피코에리트린 (SA-PE) 을, 4량체 FcγR 복합체를형성하는몰비로 ( 바람직하게는 5:1의몰비로 ) 포함해도된다. 이융합단백질은, 예를들면, 15아미노산 AVITAG 서열중의리신잔기를특이적으로비오틴화하는대장균비오틴리가제 BirA 효소를사용하여, 효소적으로비오틴화되어있다. 비오틴화된가용성 FcγR 단백질을, 그후, 4량체 Fcγ R 복합체를형성시키기위하여 SA-PE와, 1 SA-PE: 5 비오틴화가용성 FcγR의몰비로혼합한다. Fc 영역을포함하는폴리펩티드는단량체의비복합 FcγR보다도적어도 8배높은친화성으로 4량체 FcγR 복합체와결합하는것을알았다. Fc 영역을포함하는폴리펩티드의 4량체 FcγR 복합체로의결합성은, 당업자에게는공지의표준적인기술, 예를들면, 형광활성화셀소팅법 (FACS), 방사면역분석법, ELISA법등을사용하여측정할수있다. 본발명은, 세포베이스의또는무세포계의분석에서 Fc 영역을포함하는분자의기능성을측정하기위한, 상기방법에의해형성되는본발명의분자를포함하는면역복합체의사용을포함한다. 편의상, 시약은, 측정키트에서, 즉 FcγR 4량체복합체와결합하는 Fc 영역을포함한분자의능력을측정하기위하여패키지된시약의조합으로제공될수있다. Fc-FcγR 상호작용을측정하는데사용하는분자복합체의다른형태는본발명의방법에서의사용도고려되어있다. 예를들면, 2003년 1월 13일출원의미국가출원제 60/439,709호 ( 참조로서그모두를본명세서에포함함 ) 에기재되어있도록형성된융합단백질을들수있다 변이형중쇄를갖는분자의기능성분석본발명은, 복수의에피토프결합도메인과, 경우에따라 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는본발명의분자를, 이분자의이펙터세포기능을동정하기위한당업자에게알려진분석을사용하여특성분석하는것을포함한다. 특히, 본발명은, 본발명의분자를, FcγR 개재이펙터세포기능에대하여특성분석하는것을포함한다. 또한, 본발명의디아바디분자의표적항원의적어도 1개가 FcγR일경우, 디아바디분자에의한 FcγR의결합은 FcγR-Fc 결합에의해활성화되는경로와유사한 FcγR 개재경로를활성화하는데도도움이될수있다. 이렇게하여, 디아바디분자의적어도 1개의에피토프결합도메인이 FcγR을인식하는경우에는, 디아바디분자는 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하지않고, 또는부수되는 Fc-FcγR 결합없이, FcγR 개재이펙터세포기능을유발할수있다. 본발명에따라분석할수있는이펙터세포기능의예로서, 한정되는것은아니지만,

68 이하가포함된다 : 항체의존성세포상해, 식작용, 옵소닌작용, 옵소닌식작용, Clq 결합, 및보체의존성세포상해. 이펙터세포기능활성을판정하기위하여, 당업자에게알려진세포베이스의분석또는무세포측정은모두사용할수있다 ( 이펙터세포측정에대해서는, 이하를참조 : Perussia et al.(2000) "Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity(ADCC) And Reverse ADCC(Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells," Methods MoL Biol. 121 : ; Baggiolini et al.(1988) "Cellular Models For The Detection And Evaluation Of Drugs That Modulate Human Phagocyte Activity," Experientia, 44(10): ; Lehmann et al.(2000) "Phagocytosis: Measurement By Flow Cytometry," J. Immunol. Methods, 243(1-2): ; Brown(1994) "In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signal Transduction," Methods Cell Biol, 45: ; Munn et al.(1990) "Phagocytosis Of Tumor Cells By Human Monocytes Cultured In Recombinant Macrophage Colony- Stimulating Factor," J. Exp. Med., 172: , Abdul-Majid et al.(2002) "Fc Receptors Are Critical For Autoimmune Inflammatory Damage To The Central Nervous System In Experimental Autoimmune Encephalomyelitis," Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al.(1998) "Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids," Immunity 8: ( 각각의전체내용을참조로서본명세서중에포함함 )). [0282] [0283] [0284] 어떤구체예에서는, 본발명의분자를인간단구에서 FcγR 개재식작용에대하여분석할수있다. 또한, 본발명의분자의 FcγR 개재식작용을그밖의식세포, 예를들면, 호중구 ( 다형핵백혈구 ; PMN); 인간말초혈단구, 단구유래마크로파지에서분석할수도있다. 이것들은당업자에게알려진표준적수순을사용하여취득할수있다 ( 예를들면, Brown(1994) "In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signal Transduction," Methods Cell Biol., 45: 참조 ). 1구체예에서는, 본발명의분자의기능을, 기술된방법 (Tridandapani et al.(2000) "The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells," J. Biol. Chem. 275: ) 에의해, 플루오레세인화 IgG-옵소닌화양적혈구세포 (SRBC) 를탐식하는 THP-1 세포의능력을측정함으로써특성분석한다. 본발명의분자의식작용을판정하기위한다른예시적인분석은, 항체의존성옵소닌식작용분석 (ADCP) 이며, 이것은이하의스텝을포함할수있다 : 대장균 (Escherichia coli)-표지 FITC(Molecular Probes) 또는황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)-fitc 등의표적생체입자를, (i) 플루오레세인에대한항체인야생형 항체 (FcγR 의존성 ADCP에관한대조항체로서 )( 전체내용을참조로서본명세서에포함하는 Bedzyk et al.(1989) "Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-플루오레세인 Idiotype Family," J. Biol. Chem, 264(3): 참조 ), 또는 (ii) FcγRIII에의결합을넉아웃하는 D265A 돌연변이를보유하는 항체 (FcγR 의존성 ADCP에대한백그라운드대조로서 ), (iii) 의에피토프결합도메인및 Fc 도메인및 / 또는 FcγRIII에특이적인에피토프결합도메인을포함하는디아바디로코팅하는것 ; 그리고옵소닌화한입자를형성시키는것 ; 기재한옵소닌화입자 (i~iii) 중어느하나를 THP-1 이펙터세포 ( 단구세포계, ATCC로부터입수가능 ) 에 1:1, 10:1, 30:1, 60:1, 75:1, 또는 100:1의비로첨가하여, FcγR 개재식작용을발생시키는것 ; 바람직하게는이세포와대장균-FITC/ 항체를 37 에서 1.5시간인큐베이트하는것 ; 인큐베이션후, 세포에트리판블루를첨가하여 ( 바람직하게는실온에서 2~3분 ), 내부로받아들여지지않고세포표면의외측에부착된세균의형광을소실시키는것 ; 세포를 FACS 버퍼 ( 예를들면, PBS 중의 0.1%BSA, 0.1% 아지화나트륨 ) 속으로옮기고, FACS( 예를들면, BD FACS Calibur) 를사용하여 THP1 세포의형광을분석하는것. 바람직하게는, 이분석에사용되는 THP-1 세포를 FACS에의해세포표면상의 FcγR의발현에대하여분석한다. THP-1 세포는 CD32A와 CD64 양쪽을발현한다. CD64는본발명의방법에따라 ADCP 분석을실행할때블록되는, 고친화성 FcγR이다. THP-1 세포를, 바람직하게는 100μg/mL의가용성 IgG1 또는 10% 인간혈청으로블록한다. ADCP 의정도를측정하기위해, 게이트를바람직하게는 THP-1 세포에설정하고, 형광강도의중앙값을측정한다. 개개의돌연변이체에대한 ADCP 활성을산출하고, 얻어진야생형 chmab 에대하여표준화한수치로서기록한다. 옵소닌화한입자를 THP-1 세포에첨가하여, T 옵소닌화입자와 THP-1 세포의비가 30:1 또는 60:1이되도록한다. 가장바람직한구체예에서는, ADCP 분석을이하와같은대조를사용하여실시한다 : 배지중의대장균- FITC, 대장균-FITC 및 THP-1 세포 (FcγR 비의존성 ADCP 활성으로서도움이됨 ), 대장균-FITC, THP-1 세포및야생형 항체 (FcγR 의존성 ADCP 활성으로서도움이됨 ), 대장균-FITC, THP-1 세포, D265A(FcγR 의존성 ADCP 활성에관한백그라운드대조로서도움이됨 ). 다른구체예에서는, 본발명의분자를, 당업자에게알려진표준적인방법중어느하나를사용하여, 이펙터세포, 예를들면, 내추럴킬러세포로, FcγR 개재 ADCC 활성에대하여분석할수있다 ( 예를들면, Perussia et

69 al.(2000) "Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity(ADCC) And Reverse ADCC(Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells," Methods MoI. Biol. 121 : ; Weng et al.(2003) "Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma," J. Clin. Oncol. 21 : ; Ding et al.(1998) "Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids," Immunity 8: 참조 ). 본발명의분자의 ADCC 활성을판정하기위한예시적인분석은이하의스텝을포함하는 5l Cr 방출분석에기초하는것이다 : 표적세포를 [ 51 Cr]Na 2 CrO 4 로표지하는것 ( 이세포막투과성분자가표지용으로일반적으로사용된다. 왜냐하면, 이것은세포질단백질과결합하고, 세포로부터속도론적으로완만하게자발방출되지만, 표적세포의괴사후, 대량으로방출되기때문임 ); 변이형중쇄를포함하는본발명의분자로표적세포를옵소닌화하는것 ; 옵소닌화한방사성표지표적세포와이펙터세포를, 표적세포와이펙터세포의적절한비로, 마이크로타이터플레이트에서혼합하는것 ; 세포의혼합물을 16~18시간, 37 에서인큐베이트하는것 ; 상청액을회수하는것 ; 및방사활성을측정하는것. 그후, 본발명의분자의세포상해성을, 예를들면, 이하의식을사용하여산출할수있다 : 용해 %=( 실험 cpm -표적누출 cpm)/( 계면활성제용해 cpm -표적누출 cpm)x100%, 또는, 용해 %=(ADCC-AICC)/( 최대방출 -자발방출 ). 비용해는이하의식을사용하여산출할수있다 : 비용해 = 본발명의분자의존재하에서의용해 %-본발명의분자의부재하에서의용해 %. 표적 : 이펙터세포의비또는항체농도중어느하나를변경함으로써, 그래프를작성할수있다. [0285] [0286] [0287] [0288] 바람직하게는, 본발명의 ADCC 분석에서사용하는이펙터세포는말초혈단핵세포 (PBMC) 이다. 이것은바람직하게는, 당업자에게알려진표준적방법, 예를들면, Ficoll-Paque 밀도구배원심분리를사용하여, 정상인간혈액으로부터정제된다. 본발명의방법에서사용하는데바람직한이펙터세포는다른 FcγR 활성화수용체를발현한다. 본발명은, 중쇄항체돌연변이체가야생형 IgG1 항체에비해증가한 ADCC 활성및식작용을나타내는지아닌지를판정하기위해, 이펙터세포, FcγRI, FcγRIIA 및 FcγRIIB를발현하는 THP-1, 및 FcγRIIIA와 FcγRIIB 양쪽을발현하는, 인간전혈에유래하는단구유래의 1차마크로파지를포함한다. 인간단구세포계인 THP-1은고친화성수용체 FcγRI 및저친화성수용체 FcγRIIA의발현을통하여식작용을활성화한다 (Fleit et al.(1991) "The Human Monocyte-Like Cell Line THP-I Expresses Fc Gamma RI And Fc Gamma RII," J. Leuk. Biol. 49: ). THP-1 세포는 FcγRIIA 또는 FcγRIIB를구성적으로발현하지않는다. 사이토카인을사용하여이들세포를자극하면, FcR 발현패턴이영향을받는다 (Pricop et al.(2001) "Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptors On Human Monocytes By ThI And Th2 Cytokines," J. of Immunol., 166: ). 사이토카인 IL4의존재하에서의 THP-1 세포의생육은 Fc γriib 발현을유발하여, FcγRIIA 및 FcγRI 발현의감퇴를초래한다. 또한, FcγRIIB 발현도세포밀도의증가에의해증대된다 (Tridandapani et al.(2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells," J. Biol. Chem., 277(7): ). 대조적으로, IFNγ는 FcγRIIIA의발현을유도할수있다고보고되어있다 (Pearse et al.(1993) "Interferon Gamma-Induced Transcription Of The High-Affinity Fc Receptor For IgG Requires Assembly Of A Complex That Includes The 91-kDa Subunit Of Transcription Factor ISGF 3," Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: ). 세포표면상의수용체의존재또는부재는, 당업자에게알려진일반적방법을사용하여, FACS에의해확인할수있다. 사이토카인에의해유발되는세포표면상에서의 FcγR의발현은 FcγRIIB의존재하에서활성화및억제양쪽을시험하는계를제공한다. THP-1 세포가 FcγRIIB를발현할수없는경우에는, 본발명은다른인간단구세포계인 U937을더포함한다. 이들세포는 IFNγ 및 TNF의존재하에서, 최종적으로마크로파지로분화하는것을알았다 (Koren et al.(1979) "In Vitro Activation OfA Human Macrophage-Like Cell Line," Nature 279: ). FcγR 의존성종양세포사멸은마우스종양모델에서는마크로파지와 NK 세포에의해중개된다 (Clynes et al.(1998) "Fc Receptors Are Required In Passive And Active Immunity To Melanoma," Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: ). 본발명은식작용및 ADCC 분석양쪽에서, 표적세포의세포상해를유발하는 Fc 돌연변이체의효력을측정하기위하여, 이펙터세포로서의도너유래의세정한 (elutriated) 단구의사용을포함한다. FcγRI, FcγRIIIA, 및 FcγRIIB의발현패턴은다른증식조건에의해영향을받는다. 세정하여동결시킨단구, 신선한세정한단구, 10% FBS 속에유지한단구, FBS+GM-CSF 속및 / 또는인간혈청속에서배양한단구로부터의 FcγR 발현은당업자에게알려진일반적방법을사용하여측정할수있다. 예를들면, 세포를 Fc γr 특이적항체로염색하고, FACS에의해측정하여 FcγR 프로필을결정할수있다. 그후에마크로파지의 in vivo FcγR 발현을가장잘모방하는조건을본발명의방법으로사용한다. 몇개의구체예에서는, 본발명은, 특히적합한 FcγR 프로필을갖는인간세포를취득할수없는경우에는, 마

70 우스세포의사용을포함한다. 몇개의구체예에서는, 본발명은, 인간 FcγRIIIA로트랜스펙트할수있는마우스마크로파지세포계 RAW264.7(ATCC), 및당기술분야에서알려진방법을사용하여단리된안정한트랜스펙턴트를포함한다 ( 예를들면, Ralph et al.(1977) "Antibody-Dependent Killing Of Erythrocyte And Tumor Targets By Macrophage-Related Cell Lines: Enhancement By PPD And LPS," J. Immunol. 119: 참조 ). 트랜스펙턴트는, 일반적인실험조작을사용한 FACS 측정에의해, FcγRIIIA 발현에대하여정량하고, 고발현체를본발명의 ADCC 분석에사용할수있다. 다른구체예에서는, 본발명은본명세서에서개시한것등의넉아웃트랜스제닉마우스로부터의, 인간 FcγR을발현하는비장복강마크로파지의단리를포함한다. [0289] [0290] [0291] 림프구는 Ficoll-Paque 구배 (Pharmacia) 를사용하여, 도너의말초혈 (PBM) 로부터회수할수있다. 단리된세포의단핵집단내에서는, 대부분 ADCC 활성이, 그표면에 FcγRIIIA를포함하지만, FcγRIIB는포함하지않는내추럴킬러세포 (NK) 를통하여생긴다. 이들세포를사용한결과는, NK 세포 ADCC의유발에대한돌연변이체의효력을나타내어, 세정한단구를사용하여시험하기위한시약을확립한다. 본발명의 ADCC 분석에서사용하는표적세포로서, 한정하는것은아니지만, 이하가포함된다 : 유방암세포계, 예를들면, SK-BR-3(ATCC 수탁번호 HTB-30)( 예를들면, Tremp et al.(1976) "Human Breast Cancer In Culture," Recent Results Cancer Res 참조 ); B 림프구 ; 버키트림프종유래의세포, 예를들면, Raji 세포 (ATCC 수탁번호 CCL-86)( 예를들면, Epstein et al.(1965) "Characteristics And Mode Of Growth Of Tissue Culture Strain(EBl) Of Human Lymphoblasts From Burkitt's Lymphoma," J. Natl. Cancer Inst. 34: 참조 ), 및 Daudi 세포 (ATCC 수탁번호 CCL-213)( 예를들면, Klein et al.(1968) "Surface IgM-Kappa Specificity On A Burkitt Lymphoma Cell In Vivo And In Derived Culture Lines," Cancer Res. 28: 참조 ). 표적세포는분석할디아바디분자의항원결합영역에의해인식되는것이아니면안된다. ADCC 분석은어팝토시스경로에의해세포사를중개하는 NK 세포의능력에기초하고있다. NK 세포는일부에는세포표면의항원에결합한 IgG Fc 도메인의 FcγRIIIA 인식에의해, 세포사를중개한다. 본발명의방법에따라사용하는 ADCC 분석은방사성베이스의분석또는형광베이스의분석이어도된다. 변이형 Fc 영역을포함하는본발명의분자를특성분석위해사용하는 ADCC 분석은이하의스텝을포함한다 : 표적세포, 예를들면, SK- BR-3, MCF-7, OVCAR3, Raji, Daudi 세포를표지하는것 ; 표적세포를항원결합영역을통하여표적세포상의세포표면수용체를인식하는항체로옵소닌화하는것 ; 표지한옵소닌화표적세포와이펙터세포를적절한비 ( 이것은통상의실험조작에의해결정할수있음 ) 로혼합하는것 ; 세포를회수하는것 ; 사용한표지에기초하는적절한검출스킴을사용하여, 용해한표적세포의상청부분중의표지를검출하는것. 표적세포는당기술분야에서알려진표준적방법을사용하여, 방사성표지또는형광표지로표지할수있다. 예를들면, 표지로서, 한정되는것은아니지만, 이하가포함된다 : [ 51 Cr]Na 2 CrO 4 ; 및형광증강리간드인 2,2':6',2''- 터피리딘 -6-6''- 디카르복실산 (TDA) 의아세톡시메틸에스테르. [0292] 특정의바람직한구체예에서는, 형광증강리간드인 2,2':6',2''-터피리딘-6-6''-디카르복실산 (TDA) 의아세톡시메틸에스테르로표지한표적세포에대한 ADCC 활성을측정하기위하여, 시간분해형광측정분석을사용한다. 이러한형광측정분석은당기술분야에서알려져있다. 예를들면, Blomberg et al.(1996) "Time-Resolved Fluorometric Assay For Natural Killer Activity Using Target Cells Labelled With A Fluorescence Enhancing Ligand," Journal of Immunological Methods, 193: ( 그전체내용을참조로서본명세서에포함함 ) 을참조. 간단하게말하면, 표적세포를막투과성 TDA의아세톡시메틸디에스테르인 ( 비스 ( 아세톡시메틸 )2,2':6',2''-터피리딘-6-6''-디카르복실산(BATDA)) 로표지한다. 이것은생세포의세포막을통과하여신속히확산한다. 세포내에스테라제가에스테르기를개열시켜, 재생된막비투과성 TDA 분자는세포내에포착된다. 이펙터세포및표적세포를예를들면적어도 2시간, 길어도 3.5시간, 37, 5% CO 2 하에서인큐베이트한후, 용 해표적세포로부터방출된 TDA 를 Eu3+ 로킬레이트화하고, 생성한유로퓸 -TDA 킬레이트의형광을시간분해형광 광도계 ( 예를들면, Victor 1420, PerkinElmer/Wallace) 로정량한다. [0293] 다른특정의구체예에서는, 복수의에피토프결합부위, 및경우에따라 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는본발명의분자를특성분석하기위해서사용하는 ADCC 분석은이하의스텝을포함한다 : 바람직하게는 4~5x10 6 개의표적세포 ( 예를들면, SK-BR-3, MCF-7, OVCAR3, Raji 세포 ) 를비스 ( 아세톡시메틸 )2,2':6',2''-터피리딘- t-6''-디카르복실산 (DELFIA BATDA 시약, Perkin Elmer/Wallac) 으로표지한다. 최적표지효율을위해, ADCC 분 석에서사용하는표적세포의수는, 바람직하게는 5x10 6 개를초과하지않도록해야한다. 이세포에 BATDA 시약 을첨가하고, 혼합물을 37, 바람직하게는 5% CO 2 하에서, 적어도 30 분간인큐베이트한다. 다음에세포를생리

71 학적버퍼 ( 예를들면, 0.125mM 술핀피라졸을포함하는 PBS), 및 0.125mM 술핀피라졸을함유하는배지에서세정한다. 다음에표지한표적세포를, EcγRIIA에특이적인에피토프결합도메인, 및경우에따라 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는본발명의분자로옵소닌화 ( 코팅 ) 한다. 바람직한구체예에서는, ADCC 분석에서사용하는분자는또한세포표면수용체, 종양항원, 또는암항원에특이적이다. 본발명의디아바디분자는섹션 에열거하는것등의암또는종양항원과특이적으로결합할수있다. ADCC 분석에서사용하는표적세포는, 본발명의디아바디가표적세포의세포표면수용체와특이적으로결합하도록, 이디아바디에도입된에피토프결합부위를따라선택된다. [0294] 표적세포를이펙터세포, 예를들면, PBMC 에, 이펙터 : 표적의비가약 1:1, 10:1, 30:1, 50:1, 75:1, 또는 100:1 이되도록첨가한다. 이펙터및표적세포를적어도 2 시간, 길어도 3.5 시간, 37, 5% CO 2 하에서인큐베이 트한다. 세포상청액을회수하고, 산성유로퓸용액 ( 예를들면, DELFIA 유로퓸용액, Perkin Elmer/Wallac) 에첨가한다. 생성한유로퓸-TDA 킬레이트의형광을시간분해형광광도계 ( 예를들면, Victor 1420, Perkin Elmer/Wallac) 로정량한다. 최대방출 (MR) 및자발방출 (SR) 은표적세포를각각 1% TX-100 및배지와만인큐베이트함으로써측정한다. 항체비의존성세포상해 (AICC) 를, 시험분자 ( 예를들면, 본발명의디아바디 ) 의부재하에서표적및이펙터세포를인큐베이션함으로써측정한다. 각측정은바람직하게는 3회반복하여실시한다. 비용해의평균퍼센트를이하에의해산출한다 : 실험방출값 (ADCC)-AICC)/(MR-SR)x100. [0295] 본발명은, Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는본발명의분자에의한 C1q의결합및보체의존성세포상해 (CDC) 의중개를특성분석위한, 당기술분야에서공지이며또한본명세서에예시되는측정을포함한다. C1q 결합성을측정하기위하여, C1q 결합 ELISA를실시할수있다. 예시적인측정은이하의스텝을포함할수있다 : 측정플레이트를코팅버퍼중에서본발명의분자또는출발폴리펩티드 ( 대조군 ) 에의해, 4 에서밤새코팅한다. 이어서이플레이트를세정하고, 블록한다. 세정후, 인간 C1q의알리쿼트를각웰에첨가하고, 실온에서 2시간인큐베이트한다. 또한세정한후, 100μL의양항보체 C1q 페록시다제콘주게이트항체를각웰에첨가하고, 실온에서 1시간인큐베이트한다. 플레이트를다시세정버퍼로세정하고, OPD(O-페닐렌디아민2염산염 (Sigma)) 를포함하는 100μl의기질버퍼를각웰에첨가한다. 황색의출현에의해관찰되는산화반응을 30분간진행시키고, 100μl의 4.5 NH 2 SO 4 의첨가에의해이반응을정지시킨다. 이어서흡광도를 (492~405)nm에서읽어 낸다. [0296] 보체활성화를평가하기위하여, 보체의존성세포상해 (CDC) 측정을, 예를들면, 참조로서그전체를본명세서에포함하는 Gazzano-Santoro et al.(1997) "A Non-Radioactive Complement-Dependent Cytotoxicity Assay For Anti-CD20 Monoclonal Antibody," J. Immunol. Methods 202: 에기재되는바와같이, 실시할수있다. 간결하게말하면, ( 변이형 ) Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는분자및인간보체를여러농도로버퍼로희석한다. 디아바디분자가결합하는항원을발현하는세포는 1ml당약 1x10 6 세포의밀도로희석한다.( 변이형 ) Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는디아바디분자, 희석한인간보체및항원을발현하는세포의혼합물을, 평평한밑바닥조직배양 96웰플레이트에첨가하고, 37, 5%CO 2 하에서 2시간인큐베이트시켜, 보체개재 세포용해를촉진시킨다. 이어서, 50μL의알라마블루 (Accumed International) 를각웰에첨가하고, 37 에서밤새인큐베이트한다. 흡광도는 530nm의여기및 590nm의발광을갖는 96웰형광광도계를사용하여측정한다. 결과는상대형광단위 (RFU) 로나타낼수있다. 샘플농도를표준곡선으로부터구하고, 비변이형분자 ( 즉, Fc 도메인을포함하지않거나또는비변이형 Fc 도메인을포함하는분자 ) 와비교한활성 % 를대상의돌연변이체에대해서기록한다. [0297] [0298] 그밖의분석복수의에피토프결합도메인, 및경우에따라 Fc 도메인을포함하는본발명의분자는, 항원결합도메인또는 Fc-FcγR 결합의속도론적파라미터를특징짓기위한, 당기술분야에서알려진표면플라즈몬공명 (SPR) 에기초하는측정중어느하나를사용하여분석할수있다. 한정하는것은아니지만이하를포함하는시판의 SPR 장치중어느하나를본발명에서사용할수있다 : Biacore AB제의 BIAcore 장치 (Uppsala, Sweden); Affinity Sensors제의 IAsysdivise(Franklin, MA.); Windsor Scientific Limited제의 IBIS 시스템 (Berks, UK); 일본레이저전자제의 SPR-CELLIA시스템 ( 홋카이도, 일본 ); 및 Texas Instruments사제의 SPR Detector Spreeta(Dallas, TX). SPR에기초하는기법의개략적인설명에대해서는, 이하를참조하기바란다 : Mullet et al.(2000) "Surface Plasmon Resonance-Based Immunoassays," Methods 22: 77-91; Dong et al.(2002) "Some new aspects in biosensors," Reviews in MoI. Biotech. 82: ; Fivash et al.(1998) "BIAcore For Macromolecular Interaction," Current Opinion in Biotechnology 9: ; Rich et al.(2000) "Advances In Surface

72 Plasmon Resonance Biosensor Analysis," Current Opinion in Biotechnology 11 : 54-61( 그전체를참조로서본명세서중에포함함 ). 또한, 미국특허제6,373,577호 ; 제6,289,286호 ; 제5,322,798호 ; 제5,341,215호 ; 제 6,268,125호 ( 그전체를참조로서본명세서중에포함함 ) 에기재된단백질-단백질상호작용을측정하기위한 SPR 장치및 SPR에기초하는방법의어느것도본발명의방법에포함하는것으로한다. [0299] [0300] [0301] 간단하게말하면, SPR 베이스의분석은, 결합페어중일방을표면에고정화하는것, 및용액중의결합페어의타방과의상호작용을실시간으로모니터링하는것을포함한다. SPR은복합체의형성또는해리시에발생하는표면부근에서의용매의굴절율의변화를측정하는것에기초하는것이다. 고정화를행하는표면은센서칩이며, 이것이 SPR 기법의심장부가되는것이다. 이것은금의박층으로코팅된유리표면으로이루어지고, 분자의표면으로의결합성을최적화하도록설계된특수한표면영역의기초를형성한다. 여러센서칩이특히상기의회사로부터시판되고있고, 이들모두를본발명의방법에서사용할수있다. 센서칩의예로서는 BIAcore AB, In c. 로부터시판되고있는것, 예를들면 Sensor Chip CM5, SA, NTA, 및 HPA를들수있다. 본발명의분자는, 한정되는것은아니지만, 이하를포함하는, 당기술분야에서알려진고정화방법및화학작용을사용하여, 센서칩의표면에고정화할수있다 : 아민기를통한직접공유결합, 술프히드릴기를통한직접공유결합, 아비딘코팅표면으로의비오틴결합, 탄수화물기로의알데히드결합, 및히스티딘태그를통한 NTA칩과의결합. 몇개의구체예에서는, 복수의에피토프결합부위및경우에따라 Fc 도메인을포함하는본발명의분자와, 항원또는 FcγR과의결합의속도론적파라미터는 BIAcore 장치 ( 예를들면, BIAcore 장치 1000, BIAcore Inc., Piscataway, NJ) 를사용하여측정할수있다. 위에서기술한바와같이 ( 섹션 참조 ), 디아바디분자의적어도 1개의에피토프결합부위가 FcγR을면역특이적으로인식하는경우, 및 / 또는디아바디분자가 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는경우, 임의의 FcγR을사용하여본발명의분자의결합을평가할수있다. 특정구체예에서는, FcγR은 FcγRIIIA, 바람직하게는가용성의단량체 FcγRIIIA이다. 예를들면, 1구체예에서는, 가용성단량체 FcγRIIIA는링커-AVITAG 서열에결합된 FcγRIIIA의세포외영역이다 ( 미국가출원번호 60/439,498호, 2003년 1월 9일출원 ( 대리인정리번호 ) 및미국가출원번호 60/456,041호, 2003 년 3월 19일출원을참조하기바란다 ( 이들전체를참조로서본명세서중에포함함 )). 다른특정구체예에서는, FcγR은 FcγRIIB, 바람직하게는가용성의 2량체 FcγRIIB이다. 예를들면 1구체예에서는, 가용성 2량체 Fcγ RIIB 단백질을이하에기재된방법에따라조제한다 : 미국가출원번호 60/439,709호, 2003년 1월 13일출원 ( 그전체를참조로서본명세서에포함함 ). 모든면역학적측정에있어서, 본발명의분자에의한 FcγR의인식 / 결합은복수의도메인에의해영향받는다. 어떤특정구체예에서는, 본발명의분자는복수의에피토프결합도메인중 1개를통하여 FcγR을면역특이적으로인식한다. 본발명의분자가 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는, 또다른구체예에서는, 디아바디분자는 Fc-FcγR 상호작용을통하여 FcγR을면역특이적으로인식할수있다. 본발명의분자가 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 과, FcγR을면역특이적으로인식하는에피토프결합부위양쪽을포함하는, 또다른구체예에서는, 디아바디분자는에피토프결합도메인과 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 중한쪽또는양쪽을통하여 FcγR을인식할수있다. 복수의에피토프결합부위및경우에따라 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는본발명의분자의, 항원및 / 또는 FcγR에대한속도론적파라미터를, BIAcore 장치를사용하여측정하기위한예시적인분석은, 이하를포함한다 : 제 1 항원을센서칩표면의 4개의플로우셀중하나에, 바람직하게는아민커플링화학을통하여고정화하고, 그것에의해약 5000 반응단위 (RU) 의제 1 항원이표면에고정화되도록한다. 적합한표면이조제된시점에서, 제 1 항원을면역특이적으로인식하는본발명의분자를, 바람직하게는 20μg/mL 용액의유속 5 μl/ml에서의 1분간의주입에의해, 이표면을통과시킨다. 이단계에서이표면에결합한본발명의분자의레벨은일반적으로 400~700RU의범위이다. 다음에, HBS-P 버퍼 (20mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, ph 7.5) 중의제 2 항원 ( 예를들면, FcγR) 또는 FcγR 수용체의일련의희석계열을표면상에 100μL/ 분으로주입한다. 상이한제 2 항원또는수용체희석물사이에서의분자의재생은바람직하게는 100mM NaHCO 3 ph9.4; 3M NaCl의 1 회의 5 초간주입에의해행해진다. 당기술분야에서알려진어느재생기술도본발명의방법에서상정되어있 다. [0302] 모든데이터세트가수집된시점에서, 얻어지는결합곡선을, SPR 장치제조원, 예를들면, BIAcore 사 (Piscataway, NJ) 로부터공급되고있는컴퓨터알고리즘을사용하여, 포괄적으로적합시킨다. 이들알고리즘에 서는, K on 및 K off 양쪽을산출하고, 이것들로부터겉보기평형결합정수 Kd 를 2 개의속도정수의비 ( 즉, K off /K o n) 로서연역한다. 개개의속도정수를어떻게해서유도하는지에대한더욱상세한처리법은 BIAevaluaion Software Handbook(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 로부터얻어진다. 작성한데이터의해석은당기술분야에서

73 알려진어느방법을사용해도실시할수있다. 작성한속도론적데이터를해석하는각종방법의개략적설명에대해서는, 이하를참조하기바란다 : Myszka(1997) "Kinetic Analysis Of Macromolecular Interactions Using Surface Plasmon Resonance Biosensors," Current Opinion in Biotechnology 8: 50-7; Fisher et al.(1994) "Surface Plasmon Resonance Based Methods For Measuring The Kinetics And Binding Affinities Of Biomolecular Interactions," Current Opinion in Biotechnology 5: ; O'Shannessy(1994) "Determination Of Kinetic Rate And Equilibrium Binding Constants For Macromolecular Interactions: A Critique Of The Surface Plasmon Resonance Literature," Current Opinion in Biotechnology, 5:65-71; Chaiken et α/.(1992) "Analysis Of Macromolecular Interactions Using Immobilized Ligands," Analytical Biochemistry, 201 : ; Morton et al.(1995) "Interpreting Complex Binding Kinetics From Optical Biosensors: A Comparison Of Analysis By Linearization, The Integrated Rate Equation, And Numerical Integration," Analytical Biochemistry 227: ; O'Shannessy et al., 1996, Analytical Biochemistry 236: ( 이들전체를참조로서본명세서중에포함함 ). [0303] 바람직한구체예에서는, SPR 분석, 예를들면, BIAcore를사용하여측정한속도론적파라미터는, 본발명의분자가기능적분석, 예를들면, ADCC 속에서, 어떻게기능할지를예측하기위한지표로서사용할수있다. SPR 분석으로부터취득한속도론적파라미터에기초하여본발명의분자의효력을예측하기위한예시적인방법은이하를포함한다 : 본발명의분자의 ( 에피토프결합도메인및 / 또는 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을통한 ) FcγRIIIA 및 FcγRIIB의결합에관한 Koff값을측정하는것 ; ADCC 데이터에대하여, (1) FcγRIIIA에대한 K off (wt)/k off (mut); (2) FcγRIIB에대한 K off (mut)/k off (wt) 를플롯하는것. 1 보다도높은수치가야생형과비교 하여, FcγRIIIA 에대한감소한해리속도, 및 FcγRIIB 에대한증가한해리속도를나타내고, 증대한 ADCC 기능 을갖는것을나타낸다. [0304] [0305] [0306] [0307] [0308] [0309] [0310] [0311] 5.5. 본발명의디아바디분자의제조방법본발명의디아바디분자는, 당기술분야에서주지의각종방법에의해제조할수있고, de novo 단백질합성, 결합단백질을코딩하는핵산의재조합발현과같은방법이있다. 원하는핵산서열은재조합법 ( 예를들면, 원하는폴리뉴클레오티드의이전에제작된돌연변이체의 PCR 돌연변이유발 ) 에의해, 또는고상 DNA 합성에의해얻을수있다. 통상은재조합발현이사용된다. 어떤구체예에서, 본발명은 CD16A VH 및 / 또는 VL을코딩하는서열을포함하는폴리뉴클레오티드를제공한다. 다른구체예에서는, 본발명은 CD32B VH 및 / 또는 VL을코딩하는서열을포함하는폴리뉴클레오티드를제공한다. 유전자코드의축중 (degeneracy) 때문에, 각각의면역글로불린아미노산서열을여러핵산서열이코딩되어있고, 본발명은여기에기재하는결합단백질을코딩하는모든핵산을포함한다 본발명의분자를코딩하는폴리뉴클레오티드본발명은본발명의분자 ( 폴리펩티드및항체를포함함 ) 를코딩하는폴리뉴클레오티드도포함한다. 당기술분야에서알려진어느하나의방법에의해, 본발명의분자를코딩하는폴리뉴클레오티드를취득하고, 그폴리뉴클레오티드의뉴클레오티드서열을결정할수있다. 본발명의방법에의해분류되는분자의뉴클레오티드서열이결정되면, 그뉴클레오티드서열을당기술분야에서주지의방법, 예를들면, 재조합 DNA 기술, 부위특이적돌연변이유발, PCR 등을사용하여조작하고 ( 예를들면, 이하에기재된기술을참조하기바란다 : Sambrook 등, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제3판, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; 및 Ausubel 등편집, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY( 이들모두의전체를참조로서본명세서에포함함 )), 예를들면, 아미노산의치환, 결실, 및 / 또는삽입을생기게함으로써, 예를들면, 다른아미노산서열을갖는항체를제작할수있다. 1구체예에서는, 인간라이브러리또는당기술분야에서이용할수있는그밖의라이브러리를당기술분야에서알려진표준적기술에의해스크리닝하여, 본발명의분자를코딩하는핵산을클로닝할수있다 본발명의분자의재조합발현본발명의분자 ( 즉, 항체 ) 를코딩하는핵산서열이얻어진시점에서, 이분자를생산하기위한벡터를, 재조합 DNA 기술에의해당기술분야에서주지의기술을사용하여제작할수있다. 당업자에게주지의방법을이용하여, 본발명의분자의코드서열및적당한전사번역제어시그널을함유하는발현벡터를구축할수있다. 이들의방법으로서는, 예를들면, in vitro 재조합 DNA 기술, 합성기술, 및 in vivo 유전적재조합을들

74 수있다 ( 예를들면, Sambrook 등, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제 2 판, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 및 Ausubel 등편, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY 에기재되는기술을참조하기바람 ). [0312] [0313] [0314] [0315] [0316] 본발명의방법에의해동정된분자의뉴클레오티드서열을포함하는발현벡터는종래기술 ( 예를들면, 일렉트로포레이션, 리포솜트랜스펙션, 및인산칼슘침강 ) 에의해숙주세포에도입하고, 이어서트랜스펙트한세포를종래기술에의해배양하여, 본발명의분자를생산시킬수있다. 특정구체예에서는, 본발명의분자의발현을구성적, 유도성, 또는조직특이적인프로모터에의해제어한다. 본발명의방법에의해동정된분자를발현시키기위해서이용하는숙주세포는세균세포, 예를들면, 대장균 (Escherichia coli) 이거나, 또는바람직하게는, 특히완전한재조합면역글로불린분자를발현시키기위해서는, 진핵세포일수있다. 특히, 포유동물세포, 예를들면, 차이니즈햄스터난소세포 (CHO) 는, 인간사이토메갈로바이러스유래의주요중간초기유전자프로모터엘리먼트등의벡터와의병용에있어서, 면역글로불린을위한유효한발현시스템이다 (Foecking et al.(1986) "Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors," Gene 45: ; Cockett et al.(1990) "High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification," Biotechnology 8: ). 여러숙주-발현벡터계를이용하여, 본발명의방법에의해동정된분자를발현시킬수있다. 이러한숙주-발현시스템는본발명의분자의코드서열을생산하고, 계속해서정제할수있는비히클에상당하지만, 적당한뉴클레오티드코드서열에의해형질전환또는트랜스펙트되면본발명의분자를 in situ로발현할수있는세포에도상당한다. 이것들로서는한정되는것은아니지만, 이하의것을들수있다 : 예를들면, 본발명의방법에의해동정된분자의코드서열을함유하는재조합박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는코스미드 DNA 발현벡터에의해형질전환된세균 ( 예를들면, 대장균 (E.coli) 이나고초균 (B. subtilis) 등 ) 의미생물 ; 본발명의방법에의해동정된분자를코딩하는서열을함유하는재조합효모발현벡터로형질전환된효모 ( 예를들면, 사카로미세스, 피키아속 ); 본발명의방법에의해동정된분자를코딩하는서열을함유하는재조합바이러스발현벡터 ( 예를들면, 바큘로바이러스 ) 를감염시킨곤충세포계 ; 본발명의방법에의해동정된분자를코딩하는서열을함유하는재조합바이러스발현벡터 ( 예를들면, 콜리플라워모자이크바이러스 (CaMV) 및담배모자이크바이러스 (TMV)) 를감염시킨또는재조합플라스미드발현벡터 ( 예를들면, Ti 플라스미드 ) 로형질전환된식물세포계 ; 또는포유동물세포의게놈유래의프로모터 ( 예를들면, 메탈로티오네인프로모터 ) 또는포유동물바이러스유래의프로모터 ( 예를들면, 아데노바이러스후기프로모터 ; 백시니아바이러스 7.5K 프로모터 ) 를함유하는재조합발현컨스트럭트를보유하는포유동물세포계 ( 예를들면, COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3 세포, 림프구 ( 미국특허제5,807,715호를참조 ), Per C.6 세포 (Crucell에의해개발된인간망막세포 )). 세균계에서는, 발현되는분자에대하여의도되는용도에따라, 많은발현벡터를유리하게선택할수있다. 예를들면, 항체의의약조성물을조제하기위하여대량의단백질을생산시킬필요가있는경우에는, 용이하게정제되는융합단백질산물의고레벨의발현을지령하는벡터가바람직하다. 이러한벡터로서는, 한정되는것은아니지만, 항체코드서열을벡터중에 lacz 코드영역과함께인프레임으로개별적으로연결하여융합단백질이생산되도록하는대장균발현벡터 pur278(ruther et al.(1983) "Easy Identification Of cdna Clones," EMBO J. 2: ); pin 벡터 (Inouye et al.(1985) "Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli," Nucleic Acids Res. 13: ; Van Heeke et al.(1989) "Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli," J. Biol. Chem. 24: ) 등을들수있다. 또한 pgex 벡터를사용하여, 외래폴리펩티드를글루타티온S-트랜스페라제 (GST) 와의융합단백질로서발현시킬수도있다. 일반적으로, 이러한융합단백질은가용성이며, 용해한세포로부터, 매트릭스글루타티온-아가로스비드에의흡착및결합, 계속해서유리글루타티온의존재하에서의용출에의해용이하게정제할수있다. pgex 벡터는트롬빈또는 Xa 인자프로테아제절단부위를포함하도록설계되어있고, 그결과, 클로닝된표적유전자산물을 GST 성분으로부터절리하는것이가능하다. 곤충계에있어서는, 오토그라파칼리포니카핵다각체병바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)(acnpv) 가외래유전자를발현시키기위한벡터로서이용된다. 이바이러스는스포도프테라프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포속에서증식한다. 항체코드서열을바이러스의비필수영역 ( 예를들면, 폴리헤드린유전자 ) 중에개별적으로클로닝하여, AcNPV 프로모터 ( 예를들면, 폴리헤드린프로모터 ) 의제어하에배치시킬수있다

75 [0317] [0318] [0319] [0320] 포유동물숙주세포에서는, 많은바이러스베이스의발현시스템를이용할수있다. 아데노바이러스를발현벡터로서사용하는경우에는, 원하는항체코드서열을, 아데노바이러스전사 / 번역제어복합체, 예를들면, 후기프로모터및 3분절 (tripartite) 리더서열과연결할수있다. 이키메라유전자를뒤따라아데노바이러스게놈에 in vitro 또는 in vivo 재조합에의해삽입할수있다. 바이러스게놈의비필수영역 ( 예를들면, E1 또는 E3 영역 ) 으로의삽입에의해, 감염한숙주내에서생존가능하고또한면역글로불린분자를발현할수있는재조합바이러스가얻어진다 ( 예를들면, Logan et al.(1984) "Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation OfmRNAs Late After Infection," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 를참조하기바람 ). 특정개시시그널도, 삽입한항체코드서열의효율적인번역을위해필요할수있다. 이들시그널은 ATG 개시코돈및인접서열을포함한다. 또한, 개시코돈은전체인서트의번역을확실하게하기위하여, 원하는코드서열의리딩프레임과동일한페이즈로되어야한다. 이들외인성번역제어시그널및개시코돈은여러기원이어도되고, 천연이어도합성이어도된다. 발현의효율은적절한전사인헨서엘리먼트, 전사터미네이터등을포함시킴으로써증강할수있다 (Bitter et al.(1987) "Expression And Secretion Vectors For Yeast," Methods in Enzymol. 153: 를참조 ). 또한, 삽입한서열의발현을모듈레이트하거나, 유전자산물을원하는특정양식으로개변또는프로세싱하거나하는숙주세포주를선택할수있다. 이러한단백질산물의수식 ( 예를들면, 글리코실화 ) 및프로세싱 ( 예를들면, 절단 ) 은단백질의기능에있어서중요할수있다. 예를들면, 특정구체예에서는, 본발명의디아바디분자를포함하는폴리펩티드는단일유전자산물로서 ( 예를들면, 단일폴리펩티드사슬로서, 즉폴리단백질전구체로서 ) 발현시킬수있지만, 이러한단일유전자산물은본발명의디아바디분자의별개인폴리펩티드를형성하기위하여천연의또는재조합의세포기구에의한단백질분해절단을필요로한다. 따라서, 본발명은본발명의폴리펩티드를포함하는폴리단백질전구체분자를코딩하는핵산서열 ( 이폴리단백질전구체의번역후절단을지령할수있는코드서열을포함함 ) 을유전자공학적으로제작하는것을포함한다. 폴리단백질전구체의번역후절단은본발명의폴리펩티드를야기시킨다. 본발명의폴리펩티드를포함하는전구체분자의번역후절단은 in vivo( 즉, 천연의또는재조합의세포계 / 기구, 예를들면, 적절한부위에서의푸린절단에의하여숙주세포내 ) 에서일어나도되고, in vitro( 예를들면, 기지의활성프로테아제또는펩티다제를포함하는조성물및 / 또는원하는단백질분해작용을촉진하는것이알려져있는조건또는시약을포함하는조성물중에서의이폴리펩티드사슬의인큐베이션 ) 에서일어나도된다. 재조합단백질의정제및수식은당기술분야에서잘알려져있어, 폴리단백질전구체의설계에는당업자가용이하게이해할수있는몇개의구체예가포함된다. 상기의전구체분자의수식을위해서는당기술분야에서알려진프로테아제또는펩티다제를사용할수있고, 예를들면, 트롬빈 ( 아미노산서열 LVPR^GS( 서열번호 89) 를인식함 ), 또는 Xa 인자 ( 아미노산서열 I(E/D)GR^( 서열번호 90) 을인식하는 (Nagai et al.(1985) "Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia CoIi," Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: , and reviewed in Jenny et al.(2003) "A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa," Protein Expr. Purif. 31 :1-11; 그전체내용을참조로서본명세서에포함함 )), 엔테로키나제 ( 아미노산서열 DDDDK^( 서열번호 91) 를인식하는 (Collins-Racie et al.(1995) "Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia CoIi Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA," Biotechnology 13: ; 그전체내용을참조로서본명세서에포함함 )), 푸린 ( 아미노산서열 RXXR^을인식하고, RX(K/R)R^을우선적으로인식하는 ( 각각서열번호 92 및서열번호 93)(P6 위치의추가의 R은절단을촉진하는것같음 )), 및 AcTEV( 아미노산서열 ENLYFQ^G( 서열번호 94) 를인식하는 (Parks 등, 1994, "Release of Proteins and Peptides from Fusion Proteins Using a Recombinant Plant Virus Proteinase" Anal. Biochem. 216: ; 그전체내용을참조로서본명세서에포함함 )), 및구제역바이러스프로테아제 C3이사용된다. 예를들면, 섹션 6.4를참조. 각각의숙주세포는단백질및유전자산물의번역후프로세싱및수식에대한특징적또한특이적인기구를갖는다. 적당한세포주또는숙주계를선택함으로써, 발현되는외래단백질의올바른수식과프로세싱을확실하게할수있다. 이때문에, 1차전사물의적절한프로세싱, 유전자산물의글리코실화및인산화를위한세포기구를갖는진핵숙주세포를사용할수있다. 이러한포유동물숙주세포로서는, 한정되는것은아니지만, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, CRL7030 및 Hs578Bst를들수있다. 재조합단백질을장기간, 고수율로생산시키기위해서는, 안정한발현이바람직하다. 예를들면, 본발명의항체를안정하게발현하는세포주를유전자공학적으로제작할수있다. 바이러스의복제기점을함유하는발현

76 벡터를사용하는것보다도오히려, 선택마커및적당한발현제어엘리먼트 ( 예를들면, 프로모터, 인헨서서열, 전사터미네이터, 폴리아데닐화부위등 ) 에의해제어되는 DNA로숙주세포를형질전환한다. 외래 DNA를도입한후에, 유전자조작한세포를부화배지중에서 1~2일간증식시키고, 이어서선택배지로전환한다. 재조합플라스미드중의선택마커는선택에대한내성을부여하므로, 세포가안정하게플라스미드를그염색체중에편입시키고, 증식하여중심을형성하고, 계속해서클로닝하여세포주로증가시키는것이가능하다. 이방법은, 본발명의항체를발현하는세포주를유전자공학적으로제작하기위하여유리하게사용할수있다. 이러한유전자공학적으로제작된세포주는본발명의분자와직접적또는간접적으로상호작용하는화합물을스크리닝하여평가하는점에서특히유용하다. [0321] [0322] [0323] [0324] 많은선택계를이용할수있고, 그것들에는, 한정되는것은아니지만, 이하의것이포함된다 : 단순헤르페스바이러스디미딘키나제 (Wigler et al.(1977) "Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells," Cell 11 : ), 히포크산틴구아닌포스포리보실트랜스페라제 (Szybalska et al.(1992) "Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells: First Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy," Bioessays 14: ), 및아데닌포스포리보실트랜스페라제 (Lowy et al.(1980) "Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster aprt Gene," Cell 22: ) 유전자는각각 tk-, hgprt-또는 aprt-세포에서사용할수있다. 또, 대사길항물질내성은이하의유전자를선택하기위한기초로서사용할수있다 : 메토트랙사이트내성을주는 dhfr(wigler et al.(1980) "Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: ; O'Hare et al.(1981) "Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: ); 미코페놀산내성을주는 gpt(mulligan et al.(1981) "Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine- Guanine Phosphoribosyltransferase," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: ); 아미노글리코시드 G-418 내성을주는 neo(tolstoshev(1993) "Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions," Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: ; Mulligan(1993) "The Basic Science Of Gene Therapy," Science 260: ; and Morgan et al.(1993) "Human Gene Therapy," Ann. Rev. Biochem. 62: ); 및히그로마이신내성을주는 hygro(santerre et al.(1984) "Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells," Gene 30: ). 재조합 DNA 기술의분야에서일반적으로알려지는이용가능한방법은 Ausubel et al.(eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al.(eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al.(1981) "A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells," J. MoI. Biol. 150:1-14에기재되어있다. 본발명의분자의발현레벨은벡터증폭에의해증가시킬수있다 ( 개요에대해서는, Bebbington 및 Hentschel, DNA 클로닝에있어서의포유동물세포에서의클론화유전자의발현을위한유전자증폭에기초하는벡터의이용 (The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning), Vol.3, Academic Press, New York, 1987을참조하기바람 ). 항체를발현하는벡터계중의마커가증폭가능할때, 숙주세포의배양물중에존재하는저해제의레벨을증가시키면, 마커유전자의복사수가증가할것이다. 증폭된영역은디아바디분자의폴리펩티드의뉴클레오티드서열과결부되어있으므로, 이폴리펩티드의생산도증가할것이다 (Crouse et al.(1983) "Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes," MoI. Cell. Biol. 3: ). 숙주세포는, 본발명의 2개의발현벡터, 즉, 디아바디분자의제 1 폴리펩티드를코딩하는제 1 벡터및디아바디분자의제 2 폴리펩티드를코딩하는제 2 벡터로동시트랜스펙트할수있다. 이들 2개의벡터는, 양쪽폴리펩티드의동등한발현을가능하게하는동일한선택마커를함유해도된다. 또는, 양쪽폴리펩티드를코딩하는단일벡터를사용해도된다. 본발명의분자의폴리펩티드를코딩하는서열은 cdna 또는게놈 DNA일수있다. 본발명의분자 ( 즉, 디아바디 ) 가재조합에의해발현된시점에서, 이것을, 당기술분야에서공지의, 폴리펩티드, 폴리단백질또는디아바디를정제하기위한당기술분야에서공지의방법 ( 항원선택성에기초하는항체정제스킴과유사 ) 의어느하나로정제할수있다. 이러한정제법으로서, 예를들면, 크로마토그래피 ( 예를들면, 이온교환, 친화성, 특히 ( 임의이며, 디아바디분자가 Fc 도메인또는그일부를포함하는경우에는단백질

77 A 에의한선택의후에 ) 특이적항원에대한친화성에의한것, 및사이징컬럼크로마토그래피 ), 원심분리, 시 차용해도, 또는폴리펩티드, 폴리단백질또는디아바디를정제하기위한다른표준적인기법이있다. [0325] [0326] [0327] [0328] [0329] [0330] [0331] 5.6. 예방및치료방법본발명의분자는 FcγR에의해중개되는이펙터세포기능 ( 예를들면, ADCC) 이요망되는질환, 장애또는감염 ( 예를들면, 암, 감염성질환 ) 을치료및 / 또는예방하는데특히유용하다. 이하에서기술하는바와같이, 본발명의디아바디는 Fc 도메인을포함하지않음에도불구하고, 이펙터기능을끌어내는데항체와유사한기능성을나타낼수있다. FcγR을면역특이적으로인식하는적어도 1개의에피토프결합도메인을포함함으로써, 디아바디분자는 Fc-FcγR 상호작용에유사한 FcγR 결합및활성을나타낼수있다. 예를들면, 본발명의분자는면역이펙터세포 ( 예를들면, NK 세포 ) 상의세포표면항원과 FcγR( 예를들면, FcγRIIIA) 과결합하고, 이세포에대하여이펙터기능 ( 예를들면, ADCC, CDC, 식작용, 옵소닌화등 ) 을자극한다. 다른구체예에서, 본발명의디아바디분자는 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는것이다. 이러한구체예에서는, Fc 도메인은야생형 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 에대하여적어도 1개의아미노산수식을더포함하고, 또한 / 또는 1 이상의 IgG 아이소타입 ( 예를들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 유래의도메인을포함할수있다. 변이형 Fc 도메인을포함하는본발명의분자는, 야생형 Fc 도메인을포함하는분자와비교하여, 부여된또는개변된표현형, 예를들면, 개변된또는부여된이펙터기능활성 ( 예를들면, NK 의존성또는마크로파지의존성측정으로측정됨 ) 을나타낼수있다. 이구체예에서, 이펙터기능활성이부여또는개변되어있는본발명의분자는이펙터기능활성의증대된효력이기대되는질환, 장애또는감염의치료및 / 또는예방에유용하다. 어떤특정구체예에서는, Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는본발명의디아바디분자가보체의존성캐스케이드를중개한다. 이펙터기능을개변하는것으로서확인된 Fc 도메인돌연변이체는국제출원 WO 04/063351, 미국특허출원공개 2005/ 및 2005/ , 미국가출원 60/626,510(2004년 11월 10일출원 ), 60/636,663(2004 년 12월 15일출원 ), 및 60/781,564(2006년 3월 10일출원 ), 및미국특허출원 11/271,140(2005년 11월 10일출원 ), 및 11/305,787(2005년 12월 15일출원 )( 본발명자들의동시출원 ) 에개시되어있으며, 각각의전체내용을참조로서본명세서에포함한다. 본발명은, 피험자에게, 치료가유효한양의 1종이상의분자를투여하는것을포함하여이루어지는, 피험자의암을치료, 예방또는관리하기위한방법및조성물을포함하고, 상기분자는 1개이상의에피토프결합부위및경우에따라본발명을따라유전자조작된 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하고, 또한이분자는암항원과더욱결합한다. 본발명의분자는원발성종양, 암세포의전이, 및감염성질환의예방, 저지, 증식억제또는퇴행에특히유용하다. 특정작용기구에의해속박되는것은아니지만, 본발명의분자는이펙터기능을중개하여종양의소실, 종양의억제, 또는그양쪽을초래한다. 다른구체예에서는, 본발명의디아바디는세포표면항원및 / 또는수용체의가교및어팝토시스또는부의증식조절의시그널전달의증가에의해치료활성을중개한다. 특정작용기구에의해속박되는것은아니지만, 본발명의디아바디분자는당기술분야에서알려진치료용항체와비하여증대된치료효력을나타내지만, 이것은일부에는, 예를들면, 디아바디-에피토프상호작용의향상한결합력때문에표적세포상에보다오래머물러있는디아바디의능력에의해, 디아바디가특정항원 ( 예를들면, FcγR) 을저레벨로발현하는표적세포와면역특이적으로결합할수있기때문이다. 항원 ( 예를들면, FcγR) 에대한친화성및결합력이증대해있는본발명의디아바디는, 표적세포집단에서는 FcγR이저레벨로발현되는피험자에있어서, 암또는다른질환또는장애를치료, 예방또는관리하는데특히유용하다. 본명세서중에서사용하는경우, 세포에서의 FcγR 발현은세포당의이분자의밀도에의해정의되며, 이것은당업자에게공지의통상의방법을사용하여측정된다. 복수의에피토프결합부위, 및경우에따라 FcγR( 또는그일부 ) 을포함하는본발명의분자는또한, 바람직하게는, 표적항원 ( 예를들면, 암항원 ) 을 30,000~20,000분자 / 세포의밀도로, 20,000~10,000 분자 / 세포의밀도로, 10,000분자 / 세포또는그이하의밀도로, 5000분자 / 세포또는그이하의밀도로, 또는 1000분자 / 세포또는그이하의밀도로발현하는세포에있어서, 결합력및친화성및 / 또는이펙터기능이부여되어있거나, 또는증대되어있다. 본발명의분자는, 표적세포집단에서는표적항원이저레벨로발현되는아집단에있어서, 암과같은질환또는장애를치료, 예방또는관리하는데특별히이용된다. 본발명의분자는또한암, 자가면역질환, 염증성질환, 또는감염성질환과같은질환을치료또는예방하기위한당기술분야에서공지의다른치료약으로조합하여, 유리하게사용할수도있다. 특정, 구체예에서는, 본발명의분자를, 예를들면, 이분자와상호작용하여면역응답을높이는이펙터세포의수또는활성을증가시키

78 는데도움이되는, 조혈성증식인자 ( 예를들면, IL-2, IL-3 및 IL-7 등 ), 림포카인, 또는모노클로날또는키메라항체와병용해도된다. 본발명의분자는또한질환, 장애, 또는감염을치료하기위하여사용하는 1종이상의약물, 예를들면, 항암제, 항염증제또는항바이러스제와조합하여유리하게이용할수도있고, 이것들은, 예를들면, 이하의섹션 5.7에상세하게기술된다. [0332] [0333] [0334] [0335] [0336] [0337] 암본발명은, 피험자에게치료상유효한양의, 복수의에피토프결합도메인을포함하는 1종이상의분자를투여하는것을포함하는, 피험자의암을치료또는예방하기위한방법및조성물을포함한다. 몇개의구체예에서, 본발명은 FcγR 다형을갖는피험자 ( 예를들면, FcγRIIIA-158V 또는 FcγRIIIA-158F 대립유전자에대하여호모접합성의피험자 ) 의암을치료또는예방하기위한방법및조성물을포함한다. 몇개의구체예에서, 본발명은 FcγRIIIA(158F) 와면역특이적으로결합하는, 디아바디분자의적어도 1개의에피토프결합도메인을공학적으로조작하는것을포함한다. 다른구체예에서는, 본발명은 FcγRIIIA(158V) 과면역특이적으로결합하는, 디아바디분자의적어도 1개의에피토프결합도메인을공학적으로조작하는것을포함한다. 표준적인단일클론항체요법의효력은피험자의 FcγR 다형에의존한다 (Cartron et al.(2002) "Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcRIIIa Gene," Blood 99: ; Weng et al.(2003) "Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma," J Clin Oncol. 21(21): ; 이양자의전체를참조로서본명세서에포함함 ). 이들수용체는이펙터세포의표면상에발현되어, ADCC를중개한다. 저친화성의활성화수용체의고친화성대립유전자는 ADCC를중개하는이펙터세포의능력을개선한다. Fc-FcγR 상호작용에의지하여이펙터기능을달성하는것과는대조적으로, 본발명의방법은, 저친화성의활성화수용체를면역특이적으로인식하도록분자를조작하여, 이분자를특정다형용으로설계하는것을포함한다. 이것과는별도로, 또는이것에더하여, 본발명의분자는이펙터세포상의 FcγR에대하여 ( 야생형 Fc 도메인과비교하여 ) 증대한친화성을나타내는변이형 Fc 도메인을포함하도록조작해도된다. 본발명의조작된분자는환자에대하여그 FcγR 다형에관계없이, 보다좋은면역요법시약을제공한다. 본발명에따라제작된디아바디분자는배양세포계또는환자유래의 PMBC 세포를사용한 ADCC에의해시험하여, ADCC를증대시키는 Fc 돌연변이체의능력을판정한다. 본명세서에개시한방법을사용하여, 표준적 ADCC를실시한다. Ficoll-Paque 구배 (Pharmacia) 를사용하여, 림프구를말초혈로부터회수한다. 표적세포 ( 즉, 배양세포계또는환자유래의세포 ) 에유로퓸 (PerkinElmer) 을부하하고, 이펙터와함께 37 에서 4시간인큐베이트한다. 형광플레이트리더 (Wallac) 를사용하여, 방출된유로퓸을검출한다. 얻어진 ADCC 데이터는 NK 세포개재세포상해를유발하는본발명의분자의효력을나타내고, 어느분자가환자샘플및세정한 (elutriated) 단구양쪽을사용하여시험할수있는지를입증한다. 그후, ADCC 활성을유발시키는데최대의능력을나타내는디아바디분자를환자유래의 PBMC를사용한 ADCC 분석으로시험한다. 건강한도너유래의 PBMC가이펙터세포로서사용된다. 따라서본발명은, 암항원을면역특이적으로인식하는디아바디분자를제작함으로써, 암항원에의해특징지어지는암을예방또는치료하는방법을제공하지만, 이디아바디분자는그것자체가세포상해성 ( 어팝토시스또는증식성시그널의다운레귤레이션을증대시키는세포표면수용체의가교에따름 ) 이며, 또한 / 또는본발명에따라 Fc 도메인을포함하고, 또한 / 또는 1 이상의이펙터기능 ( 예를들면, ADCC, 식작용 ) 을중개하도록제작된다. 본발명에따라제작된디아바디는세포상해활성 ( 예를들면, 증대한종양세포살상및 / 또는증대한 ADCC 활성또는 CDC 활성 ) 을가지므로, 암의예방또는치료에유용하다. 암항원을수반하는암은암항원에결합하고또한세포상해성이며, 또한 / 또는본발명의방법에따라조작함으로써증대한이펙터기능을나타내는디아바디의투여에의해치료또는예방할수있다. 예를들면, 한정하는것은아니지만, 이하의암항원을수반하는암을본발명의방법및조성물에의해치료또는예방할수있다 : KS 1/4 범암종항원 (Perez et al.(1989) "Isolation And Characterization Of A Cdna Encoding The Ksl/4 Epithelial Carcinoma Marker," J. Immunol. 142: ; Miller et al.(1991) "Bispecific-Monoclonal- Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes," Cancer Immunol. Immunother. 33(4): ), 난소암항원 (CA125)(Yu et al.(1991) "Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants," Cancer Res. 51(2): ), 전립선산성포스페이트 (Tailor et al.(1990) "Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full- Length cdna Clone," Nucl. Acids Res. 18(16):4928), 전립선특이적항원 (Henttu et al.(1989) "cdna Coding

79 For The Entire Human Prostate Specific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes," Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2): ; Israeli et al.(1993) "Molecular Cloning OfA Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen," Cancer Res. 53: ), 흑색종관련항원 p97(estin et al.(1989) " Tr ansfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels Of Human Melanoma-Associated Antigen p97," J. Natl. Cancer Instit. 81(6): ), 흑색종항원 gp75(vijayasardahl et al.(1990) "The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B(Brown) Locus Gene Product," J. Exp. Med. 171(4): ), 고분자량흑색종항원 (HMW-MAA)(Natali et al.(1987) "Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody And Its Possible Prognostic Significance," Cancer 59:55-63; Mittelman et al.(1990) "Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma- Associated Antigen Monoclonal Antibodies," J. Clin. Invest. 86: ), 전립선특이적막항원, 암태아성항원 (CEA)(Foon et al.(1995) "Immune Response To The Carcinoembryonic Antigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine," J. Clin. Invest. 96(l):334-42), 다형성상피뮤신항원, 인간유지방소공항원, 결직장종양관련항원 ( 예를들면, CEA, TAG-72(Yokota et al.(1992) "Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms," Cancer Res. 52: ), C017-lA(Ragnhammar et al.(1993) "Effect Of Monoclonal Antibody 17-1 A And GM-CSF In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma -Long-Lasting, Complete Remissions Can Be Induced," Int. J. Cancer 53: ); GICA 19-9(Herlyn et al.(1982) "Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor- Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal, Gastric, And Pancreatic Carcinoma," J. Clin. Immunol. 2: ), CTA-1 및 LEA, 버키트림프종항원 , CD19(Ghetie et al.(1994) "Anti-CD 19 Inhibits The Growth Of Human B-CeIl Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest," Blood 83: ), 인간B-림프종항원- CD20(Reff et al.(1994) "Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20," Blood 83: ), CD33(Sgouros et al.(1993) "Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody MI 95(Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia," J. Nucl. Med. 34: ), 흑색종특이적항원 ( 예를들면, 강글리오시드 GD2(Saleh et al.(1993) "Generation Of A Human Anti-Idiotypic Antibody That Mimics The GD2 Antigen," J.Immunol., 151, ), 강글리오시드 GD3(Shitara et al.(1993) "A Mouse/Human Chimeric Anti-(Ganglioside GDS) Antibody With Enhanced Antitumor Activities," Cancer Immunol. Immunother. 36: ), 강글리오시드 GM2(Livingston et al.(1994) "Improved Survival In Stage III Melanoma Patients With GM2 Antibodies: A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination With GM2 Ganglioside," J. Clin. Oncol. 12: ), 강글리오시드 GM3(Hoon et al.(1993) "Molecular Cloning OfA Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen On Human Cancers," Cancer Res. 53: ), 종양특이적이식형세포표면항원 (TSTA)( 예를들면, DNA 종양바이러스의 T 항원및 RNA 종양바이러스의포락선항원을비롯한바이러스유발종양항원등 ), 종양태아항원-알파페토프로틴 ( 예를들면, 결장의 CEA), 방광종양태아항원 (Hellstrom et al.(1985) "Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas," Cancer. Res. 45: ), 분화항원 ( 예를들면, 인간폐암항원 L6, L20(Hellstrom et al.(1986) "Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma," Cancer Res. 46: ), 섬유육종의항원, 인간백혈병 T세포항원-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee et al.(1988) "Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Characterization OfA Monoclonal Idiotype Cascade(AbI, Ab2, andab3)," J. Immunol. 141 : ), 신생당단백질, 스핀골리피드, 유방암항원 ( 예를들면, EGFR( 표피성장인자수용체 )), HER2 항원 (pl85 HER2 ), 다형상피뮤신 (PEM)(Hilkens et al.(1992) "Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property," Trends in Biochem. Sci. 17: ), 악성인간림프구항원-APO-1(Trauth et al.(1989) "Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis," Science 245: ), differentiation antigen(feizi(1985) "Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens," Nature 314:53-57)( 예를들면, 태아적혈구및초기내배엽중의 I 항원 ), 위선암중의 I(Ma), 유방상피중의 M18 및 M39, 골수세포중의 SSEA-1, 결직장암중의 VEP8, VEP9, Myl, VIM- D5 및 D156-22, TRA-1-85( 혈액형 H), 결장선암중의 C14, 폐선암중의 F3, 위암중의 AH6, 배아성암세포중의 Y 하프텐인 Le Y, TL5( 혈액형 A), A431 세포중의 EGF 수용체, 췌장암중의 E l 시리즈 ( 혈액형 B), 배아성암세포

80 중의 FC10.2, 위선암항원, 선암중의 CO-514( 혈액형 Le a ), 선암중의 NS-10, CO-43( 혈액형 Le b ), G49, EGF 수용체, 결장선암중의 MH2( 혈액형 ALe b /Le y ), 결장암, 위암뮤신중의 19.9, 골수세포중의 T 5 A 7, 흑색종중의 R 24, 배아성암세포중의 4.2, G D3, Dl.1, OFA-1, G M2, OFA-2, G D2, 및 Ml:22:25:8, 및 4~8 세포배아중의 SSEA-3 및 SSEA-4. 다른구체예에서는, 항원은피부 T 세포림프종으로부터의 T 세포수용체유래펩티드이다 (Edelson(1998) "Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy," Cancer J Sci Am. 4:62-71 참조 ). [0338] [0339] 본발명의방법및조성물에의해치료또는예방할수있는암및이것에관련되는질환에는, 한정되는것은아니지만, 이하가포함된다 : 백혈병 ( 한정되는것은아니지만, 급성백혈병, 급성림프성백혈병, 급성골수성백혈병 ( 골수아구성, 전골수공성, 골수단구성, 단구성, 적백혈구성백혈병, 및척수형성이상증후군등 ), 만성백혈병 ( 한정되는것은아니지만, 만성골수성 ( 과립구 ) 백혈병, 만성림프성백혈병, 털세포백혈병등 )); 진성적혈구증가증 ; 림프종 ( 한정되는것은아니지만, 호지킨병, 비호지킨병등 ); 다발골수종 ( 한정되는것은아니지만, 비정형적다발골수종, 비분비성골수종, 골경화성골수종, 형질세포백혈병, 고립성형질세포종및수외성형질세포종등 ); 발덴스트롬마쿠로글로불린혈증 ; 특징미확정의단클론글로불린혈증 ; 양성단클론글로불린혈증 ; 중쇄병 ; 골및결합조직육종 ( 한정되는것은아니지만, 골부육종, 골육종, 연골육종, 이윙육종, 악성거세포종, 골의선유육종, 척삭종, 골막육종, 연조직육종, 혈관종 ( 혈관육종 ), 선유육종, 카포시육종, 평활근육종, 지방육종, 림프관육종, 신경초종, 횡문근육종, 활막육종등 ; 뇌종양 ( 한정되는것은아니지만, 글리오마, 성상세포종, 뇌간글리오마, 상의세포종, 희돌기글리오마, 비글리알종, 청신경초종, 두개인두종, 수아종, 수막종, 송과체종, 송과체아종, 초발뇌림프종등 ); 유방암 ( 한정되는것은아니지만, 선암, 소엽 ( 소세포 ) 암, 관내암, 수양유방암, 점액유방암, 관상유방암, 유두암, 페이젯병, 및염증성유방암등 ); 부신암, ( 한정되는것은아니지만, 크롬친화성세포종및부신피질암등 ); 갑상선암 ( 한정되는것은아니지만, 유두성또는소포성갑상선암, 수양갑상선암및미분화갑상선암등 ); 췌장암, ( 한정되는것은아니지만, 췌도세포종, 가스트리노마, 글루카고노마, 비포마, 소마토스타틴분비종양, 및카시노이드또는췌도세포종양등 ): 하수체암 ( 한정되는것은아니지만, 쿠싱병, 프로락틴분비종양, 말단비대증, 및요붕증등 ); 눈의암 ( 한정되는것은아니지만, 홍채흑색종, 맥락막흑색종, 및모양체흑색종등의안부흑색종, 및망막아종등 ; 질암 ( 한정되는것은아니지만, 편평상피암, 선암, 및흑색종등 ); 외음부암 ( 한정되는것은아니지만, 편평상피암, 흑색종, 선암, 기저악성종양, 육종, 및패젯병등 ); 자궁경부암 ( 한정되는것은아니지만, 편평상피암, 및선암등 ); 자궁암 ( 한정되는것은아니지만, 자궁내막암및자궁육종등 ); 난소암 ( 한정되는것은아니지만, 난소상피암, 경계성종양, 배세포종양, 및간질종양등 ); 식도암 ( 한정되는것은아니지만, 편평상피암, 선암, 선양낭포암, 점막표피암, 선편평상피암, 육종, 흑색종, 형질세포종, 우상암, 및연맥세포 ( 소세포 ) 암등 ); 위암 ( 한정되는것은아니지만, 선암, 균상 ( 폴립상 ), 궤양성, 표재성, 확산성, 악성림프종, 지방육종, 선유육종, 및암육종등 ); 결장암 ; 직장암 ; 간암 ( 한정되는것은아니지만, 간악성종양및간아종등 ); 담낭암 ( 한정되는것은아니지만, 선암등 ); 담관암 ( 한정되는것은아니지만, 유두형, 결절성, 및확산성등 ); 폐암 ( 한정되는것은아니지만, 비소세포폐암, 편평상피암 ( 표피암 ), 선암, 대악성종양및소세포폐암등 ); 정소암 ( 한정되는것은아니지만, 배종양, 정령표피종, 미분화성, 고전적 ( 전형적 ), 정자세포, 비정상피종, 태아성암, 기형종, 융모암 ( 난황낭종양 ) 등 ); 전립선암 ( 한정되는것은아니지만, 선암, 평활근육종, 및횡문근육종등 ); 음경암 ; 구강암 ( 한정되는것은아니지만, 편평상피암등 ); 기저암 ; 타액선암 ( 한정되는것은아니지만, 선암, 점막표피암, 및선양낭포암등 ); 인두암 ( 한정되는것은아니지만, 편평상피암, 및우상암등 ); 피부암 ( 한정되는것은아니지만, 기저악성종양, 편평상피암및흑색종, 표재성흑색종, 결절성흑색종, 악성흑자흑색종, 말단성흑자성흑색종등 ); 신장암 ( 한정되는것은아니지만, 신장악성종양, 선암, 부신종, 선유육종, 이행성악성종양 ( 신골반및 / 또는자궁 )); 바리어스종양 ; 방광암 ( 한정되는것은아니지만, 이행성악성종양, 편평상피암, 선암, 암육종등 ). 또한, 암은이하를포함한다 : 점액육종, 골원성육종, 내피육종, 림프관내피육종, 중피종, 활막종, 혈관아종, 상피암, 낭포선암, 기관지원성암, 한선암, 지선암, 유두암및유두선암 ( 이러한질환의총설에대해서는, 이하를참조하기바란다 : Fishman et al.(1985) Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia; and Murphy et al.(1997) Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America). 따라서, 본발명의방법및조성물은, 한정되는것은아니지만, 이하를포함하는다양한암또는그밖의이상증식성질환의치료또는예방에서도유용하다 : 암 ( 방광, 유방, 결장, 신장, 간장, 폐, 난소, 취장, 위, 전립선, 자궁경부, 갑상선및피부의암을포함함 ); 편평상피암등 ; 림프조혈계종양, 예를들면, 백혈병, 급성림프성백혈병, 급성림프성백혈병, B세포림프종, T세포림프종, 버키트림프종등 ; 골수조혈계종양, 예를

81 들면, 급성및만성골수성백혈병및전골수공성백혈병등 ; 간엽기원의종양, 예를들면, 선유육종및횡문근육종등 ; 그밖의종양, 예를들면, 흑색종, 정령표피종, 기형암, 신경아종및글리오마등 ; 중추및말초신경계의종양, 예를들면, 성장세포종, 신경아종, 글리오마, 및신경초종등 ; 간엽기원의종양, 예를들면, 선유육종, 횡문근육종, 및골육종등 ; 및그밖의종양, 예를들면, 흑색종, 색소성건혈증 (, 각화가시세포종, 정령표피종, 갑상선소포암및기형암등. 어팝토시스의이상에기인하는암도본발명의방법및조성물에의해치료할수있는것으로상정된다. 이러한암으로서, 한정되는것은아니지만이하가포함된다 : 소포종, p53 돌연변이를수반하는암, 유방, 전립선및난소의호르몬의존성종양, 및가족성선종님폴립증및척수형성이상증후군등의전암성병변. 특정구체예에서는, 난소, 방광, 유방, 결장, 폐, 피부, 췌장또는자궁에있어서, 악성질환또는증식이상변화 ( 이형성및형성부전등 ), 또는과잉증식성질환을본발명의방법및조성물에의해치료또는예방한다. 다른특정구체예에서는, 육종, 흑색종, 또는백혈병을본발명의방법및조성물에의해치료또는예방한다. [0340] [0341] [0342] [0343] [0344] [0345] 특정구체예에서는, 본발명의분자 ( 예를들면, 복수의에피토프결합도메인, 및임의로 Fc 도메인또는그일부를포함하는디아바디 ) 는, 암세포의증식을, 본발명의이분자의부재하에서의암세포의증식과비교하여, 적어도 99%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 45%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 25%, 적어도 20%, 또는적어도 10% 억제하거나또는감소시킨다. 특정구체예에서는, 본발명의분자 ( 예를들면, 복수의에피토프결합도메인, 및임의로 Fc 도메인또는그일부를포함하는디아바디 ) 는, 친분자보다도, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는적어도 100% 많게, 세포를살상하거나, 암세포의증식을억제또는경감한다 자가면역질환및염증성질환몇개의구체예에서, 본발명의분자는, 본발명방법에따라조작된, FcγRIIB에특이적인에피토프결합도메인및 / 또는변이형 Fc 도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하고, 이 Fc 도메인이야생형 Fc 도메인과비교하여보다큰 FcγRIIB에대한친화성, 및저하된 FcγRIIIA 및 / 또는 FcγRIIA에대한친화성을나타낸다. 그러한결합특성을갖는본발명의분자는면역응답의조절, 예를들면, 자가면역질환또는염증성질환에관련되는면역응답의억제에있어서유용하다. 어느작용기구에도구속되는것을의도하지않지만, FcγRIIB에대한친화성을갖는및 / 또는증대한 FcγRIIB에대한친화성과저하된 FcγRIIIA 및 / 또는 FcγRIIA에대한친화성을갖는 Fc 도메인을포함하는, 본발명의분자는 FcγR에대한활성화응답을약화시키고, 또한세포응답성의억제를초래하여, 따라서자가면역질환의치료및 / 또는예방에있어서치료효력을갖는다고생각된다. 본발명은또한피험자에있어서의, 염증성장애에관련되는 1 이상의증상을예방하고, 치료하고, 또는관리하는방법을제공하고, 이방법은 1 이상의항염증약의, 치료상또는예방상유효한양을피험자에게투여하는것을더포함한다. 본발명은또한자가면역질환에관련되는 1 이상의증상을예방하고, 치료하고, 또는관리하는방법을제공하고, 이방법은, 1 이상의면역조절약의치료상또는예방상유효한양을피험자에게투여하는것을더포함한다. 섹션 5.7은항염증약및면역조절약의비한정적인예를게재한다. 본발명의분자를투여함으로써치료할수있는자가면역장애의예는, 한정되는것은아니지만, 원형탈모증, 경직성척추염, 항인지질증후군, 자가면역애디슨병, 부신의자가면역질환, 자가면역용혈성빈혈, 자가면역간염, 자가면역난소염및고환염, 자가면역혈소판감소증, 베체트병, 수포성류천포창, 심근증, 셀리악스프루피부염 (celiac sprue-dermatitis), 만성피로면역기능장애증후군 (CFIDS), 만성염증성탈수성다발성신경장애, 척-스트라우스증후군, 반흔성류천포창, CREST 증후군, 한랭응집소병, 클론병, 원판상낭창, 본태성혼합클리오글로불린혈증, 선유근통-선유근염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랑-바레, 교본갑상선염, 특발성폐선유증, 특발성혈소판감소성자반병 (ITP), IgA 신경장애, 청년성관절염, 편평태선, 홍반성낭창, 메니에르병, 혼합결합조직병, 다발성경화증, I형또는면역을통한당뇨병, 중증근무력증, 심상성천포창, 악성빈혈, 결절성다발성동맥염, 다발성연골염, 다선증후군, 류머티즘성다발성근통, 다발성근염및피부근염, 원발성무감마글로불린혈증, 원발성담즙성간경변, 건선, 건선성관절염, 레이노현상, 라이터증후군, 관절류머티즘, 사르코이도시스, 강혈증, 쇼그렌증후군, 스티프만증후군, 전신성에리테마토수스, 에리테마토수스, 타카야수동맥염, 측두동맥염 / 거세포성동맥염, 궤양성대장염, 포도막염, 포진상피부염맥관염과같은혈관염, 백반, 및베게너육아종증을포함한다. 염증성장애의예는, 한정되는것은아니지만, 천식, 뇌염, 염증성장질환, 만성폐색성폐질환 (COPD), 알레르기장애, 패혈증쇼크, 폐선유증, 미분화척추관절증, 미분화

82 관절증, 관절염, 염증성골용해, 및만성적인바이러스또는세균감염으로부터생기는만성염증을포함한다. 본명세서의섹션 2.2.2에기재된바와같이, 몇개의자가면역장애는염증성장애와관련되어있다. 이와같이, 자가면역장애로생각되는장애와염증성장애로생각되는장애사이에는중복이있다. 따라서, 몇개의자가면역장애는염증성장애로서도특징지을수있다. 본발명의방법에따라서예방, 치료또는관리할수있는염증성장애의예로서는, 한정되는것은아니지만, 천식, 뇌염, 염증성장질환, 만성폐색성폐질환 (COPD), 알레르기장애, 패혈증쇼크, 폐선유증, 미분화척추관절증, 미분화관절증, 관절염, 염증성골용해, 및만성적인바이러스또는세균감염으로부터생기는만성염증을들수있다. [0346] [0347] [0348] [0349] [0350] [0351] [0352] [0353] [0354] FcγRIIB에특이적인적어도 1개의에피토프결합도메인및 / 또는증대한 FcγRIIB 친화성및저하된 FcγRIIIA 친화성을갖는변이형 Fc 도메인을포함하는본발명의분자는또한, 염증성장애가있는동물 ( 특히포유동물 ) 이받는염증을경감하기위하여사용할수도있다. 특정구체예에서는, 본발명의분자는동물의염증을상기분자를투여받지않은동물의염증과비교하여, 적어도 99%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 45%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 25%, 적어도 20%, 또는적어도 10% 경감한다. FcγRIIB에특이적인적어도 1개의에피토프결합도메인및 / 또는증대된 FcγRIIB 친화성및저하된 FcγRIIIA 친화성을갖는변이형 Fc 도메인을포함하는본발명의분자는또한, 이식의거절반응을방지하기위하여사용할수도있다 감염성질환본발명은또한, 피험자에게있어서의감염증의치료또는예방의방법을포함하고, 이방법은, 감염증과관련된감염성병원체에특이적인적어도 1개의에피토프결합도메인을포함하는, 1종이상의본발명의분자의치료상또는예방상유효한양을투여하는것을포함한다. 특정구체예에있어서, 본발명의분자는감염성병원체에대하여독성이며, 이분자의부재하에서의면역응답과비교하여, 이병원체에대한면역응답을증강하거나, 또는이병원체에대한이펙터기능을증강한다. 본발명의분자에의해치료또는예방할수있는감염증은, 한정되는것은아니지만, 바이러스, 세균, 진균, 원충, 및바이러스를포함하는감염성병원체에의해야기된다. 본발명의방법과의관련에서, 본발명의분자를사용하여치료또는예방할수있는바이러스성질환은, 한정되는것은아니지만, A형간염바이러스, B형간염바이러스, C형간염바이러스, 인플루엔자바이러스, 수두바이러스, 아데노바이러스, I형단순헤르페스바이러스 (HSV-I), II형단순헤르페스바이러스 (HSV-II), 우역바이러스, 라이노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기합포체바이러스, 파필로마바이러스, 파포바바이로스, 사이토메갈로바이러스, 에키노바이러스, 아르보바이러스, 훈타바이러스, 콕사키바이러스, 유행성이하선염바이러스, 홍역바이러스, 풍진바이러스, 폴리오바이러스, 천연두바이러스, 엡스타인-바바이러스, I형인간면역결핍바이러스 (HIV-I), II형인간면역결핍바이러스 (HIV-II), 및바이러스성수막염, 뇌염, 뎅기열또는천연두와같은바이러스성질환의병원체에의해야기되는것을포함한다. 본발명의방법과의관련에서, 본발명의분자를사용하여치료또는예방할수있는세균성질환은, 한정되는것은아니지만, 마이코박테리아, 리케차, 마이코플라즈마, 나이세리아, 폐렴구균 (S. pneumonia), 라임병보렐리아 (Borrelia burgdorferi)( 라임병 ), 탄저균 ( 탄저병 ), 파상풍균, 스트렙토코쿠스, 스타필로코쿠스, 마이코박테리움, 파상풍균, 백일해균, 콜레라균, 페스트균, 디프테리아균, 클라미디아, 황색포도상구균 (S. aureus) 및레지오넬라균을포함하는세균에의해야기되는것을포함한다. 본발명의방법과의관련에서, 본발명의분자를사용하여치료또는예방할수있는원충성질환은, 한정되는것은아니지만, 리슈마니아, 콕시지움 (kokzidioa), 트리파노소마또는말라리아원생충을포함하는원충에의해야기된다. 본발명의방법과의관련에서, 본발명의분자를사용하여치료또는예방할수있는기생충성질환은, 한정되는것은아니지만, 클라미디아리케차를포함하는기생충에의해야기된다. 본발명의 1개의구체예에의하면, 감염성병원체에특이적인적어도 1개의에피토프결합도메인을포함하는본발명의분자는, 이병원체 ( 예를들면, 병원성단백질 ) 에대한항체이펙터기능을나타낸다. 감염성병원체의예로서, 한정되는것은아니지만, 세균 ( 예를들면, 대장균 (Escherichia coli), 폐렴간균 (Klebsiella pneumoniae), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 장구균 (Enterococcus faecials), 칸디다알비칸스 (Candida albicans), 프로테우스불가리스 (Proteus vulgaris), 스타필로코쿠스비리단스 (Staphylococcus

83 viridans) 및슈도모나스아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)), 병원체 ( 예를들면, B림프구향성파포바바이러스 (LPV); 보르다텔라페르투시아 (Bordatella pertussis); 보르나병바이러스 (BDV); 소코로나바이러스 ; 맥락수막염바이러스 ; 뎅기열바이러스 ; 바이러스, 대장균 ; 에볼라 ; 에코바이러스1; 에코바이러스11(EV); 엔도톡신 (LPS); 장내세균 ; 장내고아바이러스 ; 장내바이러스 ; 고양이백혈병바이러스 ; 수족구병바이러스 ; 긴팔원숭이백혈병바이러스 (GALV); 그램음성세균 ; 헬리코박터파일로리 (Heliocacter pylori); B형간염바이러스 (HBV); 단순헤르페스바이러스 ; HIV-1; 인간사이토메갈로바이러스 ; 인간코로나바이러스, 인플루엔자 A, B 및 C; 레지오넬라균 ; 리슈마니아멕시카나 (Leishmania mexicana); 리스테리아모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes); 홍역바이러스 ; 수막염균 ; 마진바이러스 ; 마우스간염바이러스 ; 마우스백혈병바이러스 ; 마우스감마헤르페스바이러스 ; 마우스레트로바이러스 ; 마우스코로나바이러스 ; 마우스간염바이러스 ; 미코박테리움알비움M(Mycobacterium avium-m); 임균 (Neisseria gonorrhoeae); 뉴캐슬병바이러스 ; 바르보바이러스 B19; 열대열말라리아원충 ; 폭스바이러스 ; 슈도모나스 ; 로타바이러스 ; 살로넬라티피뮤리움 (Samonella typhiurium); 적리균 ; 연쇄구균 ; T-세포림프구바이러스1; 백시니아바이러스 ) 을들수있다. [0355] [0356] [0357] [0358] [0359] [0360] [0361] 해독본발명은또한독소 ( 예를들면, 독성의약물분자 ) 에노출된피험자의해독방법을포함하며, 이방법은, 독성의약물분자에특이적인적어도 1개의에피토프결합도메인을포함하는 1종이상의본발명의분자의치료상또는예방상유효한양을투여하는것을포함한다. 특정한구체예에서, 본발명의분자의독소로의결합은이독소의유해한생리학적작용을경감또는배제한다. 또다른구체예에서는, 본발명의디아바디의독소에의결합은, 이디아바디의부재하에서의독소의제거, 분해또는중화와비교하여, 독소의제거, 분해또는중화를증대또는증강한다. 본발명의방법에따른면역독소요법은, 디곡신, PCP, 코카인, 콜히친, 3환식항울약을포함하는데, 이것들에한정되는약물의과잉투여또는이약물에대한폭로를치료하기위하여사용할수있다 병용요법본발명은또한, 한정되는것은아니지만, 현행의표준적및실험적화학요법, 호르몬요법, 생물학적요법, 면역요법, 방사선요법또는외과수술을포함하는, 암, 자가면역질환, 감염증, 또는중독의치료또는예방에대하여당업자에게알려진그밖의요법과병용하여, 본발명의분자를투여하는것을포함한다. 몇개의구체예에서는, 본발명의분자를, 치료상또는예방상유효한양의 1종이상의약제, 치료용항체, 또는암, 자가면역질환, 감염증, 또는중독의치료및 / 또는예방에대하여당업자에게알려진다른약제와병용하여, 투여할수있다. 특정구체예에서는, 1종이상의본발명의분자를, 암의치료에유용한그밖의 1종이상의치료약과동시에, 포유동물, 바람직하게는인간에게투여한다. 동시에 라는용어는, 예방약또는치료약의정확한동시투여에한정되는것이아니고, 오히려본발명의분자와그밖의약제를포유동물에게연속적또한일정한시간간격이내에투여해서, 본발명의분자가그밖의약제와함께작용하여, 이것들을각각투여한경우보다도증대된이익을제공하도록한것을의미한다. 예를들면, 예방또는치료용 ( 예를들면, 화학요법, 방사선요법, 호르몬요법또는생물학적요법 ) 약의각각을, 동시에, 또는임의의순서로연속적으로, 상이한시점에서투여할수있다. 그러나, 동시에투여하지않는경우에는, 원하는치료또는예방효과가제공되도록, 시간적으로충분히근접시켜서투여해야한다. 각치료약은, 임의의적절한형태로, 또한임의의적합한경로로, 각각투여할수있다. 여러구체예에서는, 예방약또는치료약을아하와같이투여한다 : 1시간미만의간격, 약 1시간간격, 약 1시간~약 2시간간격, 약 2시간~ 약 3시간간격, 약 3시간~약 4시간간격, 약 4시간~약 5시간간격, 약 5시간~약 6시간간격, 약 6시간~약 7시간간격, 약 7시간~약 8시간간격, 약 8시간~약 9시간간격, 약 9시간~ 약 10시간간격, 약 10시간~약 11시간간격, 약 11시간~약 12시간간격, 24시간간격이하또는 48시간간격이하. 바람직한구체예에서는, 2종이상의성분을환자의동일내진시에투여한다. 다른구체예에서는, 예방약또는치료약을약 2~4일간격, 약 4~6일간격, 약 1주간간격, 약 1~2주간간격, 2주간이상의간격으로투여한다. 바람직한구체예에서는, 예방약또는치료약을양쪽약제가여전히활성인시간범위내에, 투여한다. 당업자라면, 투여하는약제의반감기를측정함으로써, 이러한시간을결정할수있을것이다. 특정구체예에서는, 본발명의예방약또는치료약을, 피험자에게주기적으로투여한다. 주기적치료에는, 제 1 약제를어떤기간투여한후, 제 2 약제및 / 또는제 3 약제를어떤기간투여하고, 이연속투여를반복하는것을포함한다. 주기적치료는, 1종이상의요법에대한내성의진행을감소시켜, 요법의 1개의부작용을회피하거나또는감소시키거나, 또한 / 또는치료의효력을향상시킬수있다

84 [0362] [0363] [0364] [0365] [0366] [0367] [0368] 어떤구체예에서는, 예방약또는치료약을, 약 3주간미만의주기로, 약 2주간마다 1회, 약 10일마다 1회, 또는약 1주간마다 1회투여한다. 1주기에는, 주기마다약 90분간, 주기마다약 1시간, 주기마다약 45분간걸쳐서주입하는것에의한, 치료약또는예방약의투여가포함된다. 각주기는적어도 1주간의중지, 적어도 2주간의중지, 적어도 3주간의중지기를포함한다. 투여하는주기의회수는약 1~약 12주기, 보다전형적으로는약 2~ 약 10주기, 보다전형적으로는약 2~약 8주기이다. 또다른구체예에서는, 본발명의치료및예방약을, 메트로놈적투약방식으로, 장기의중지기간을두지않는연속주입또는빈번투여중어느하나에의해투여한다. 이러한메트로놈적투여에는, 중지기간이없는, 일정한간격으로의투약이포함될수있다. 전형적으로는, 치료약, 특히세포상해약을저용량으로사용한다. 이러한투약방식에는, 장기간의비교적저용량의연일투여가포함된다. 바람직한구체예에서는, 저용량의사용은독성부작용을최소로하여, 중지기간을배제할수있다. 특정구체예에서는, 치료및예방약은, 이하의범위에서, 연일저용량투여또는연속주입에의해송달된다 : 약 24시간부터약 2일까지, 약 1주간까지, 약 2주간까지, 약 3주간까지, 약 1개월까지, 약 2개월까지, 약 3개월까지, 약 4개월까지, 약 5개월까지, 약 6개월까지. 이러한투약방식의스케줄은종양전문가가최적화할수있다. 다른구체예에서는, 복수의치료코스를포유동물에동시에투여한다. 즉, 개별의용량의치료약을각각투여하지만, 본발명의분자가다른약제와협동하여작용할수있는것과같은시간간격내에투여한다. 예를들면, 어떤성분을 1주간에 1회투여하고, 그것과조합하여, 다른성분을 2주간마다 1회, 또는 3주간마다 1회투여해도된다. 바꿔말하면, 치료약의투약레지멘은, 치료약이동시에또는환자의동일내진시에투여되지않을때조차, 동시에실시된다. 다른예방및 / 또는치료약과병용하는경우, 본발명의분자와다른예방및 / 또는치료약은상가적으로, 보다바람직하게는상승적으로, 작용할수있다. 1개의구체예에서는, 본발명의분자를 1 이상의치료약과함께동일한의약조성물중에서동시에투여한다. 다른구체예에서는, 본발명의분자를 1 이상의치료약과함께각각의의약조성물로서동시에투여한다. 또다른구체예에서는, 본발명의분자를, 다른예방또는치료약의투여전, 또는그후에투여한다. 본발명은, 동일또는다른투여경로, 예를들면, 경구및비경구로, 본발명의분자를다른예방또는치료약과병용하여투여하는것을상정하고있다. 특정구체예에서는, 본발명의분자를, 한정하는것은아니지만, 독성등의유해부작용을초래할가능성이있는다른예방또는치료약과동시에투여하는경우, 그예방또는치료약은유해부작용이유발되는임계값보다낮은용량으로투여하는것이유리하다. 본명세서에서제공하는투약량및투여빈도는치료상유효한및예방상유효하다는용어에의해포함되어있다. 투약량및빈도는또한, 전형적으로는각환자에게특유한요인에따라, 투여하는특정치료또는예방약, 암의중독도및타입, 투여경로, 및환자의연령, 체중, 응답성, 및과거의병력에따라, 변경된다. 바람직한치료계획은, 이러한요인을고려하고, 예를들면, 문헌에보고되어, 또이하에서추장되고있는투약량을따름으로써, 당업자가선택할수있는것이다 : Physician's Desk Reference( 제56판, 2002) 항암제특정구체예에서는, 본발명의방법은, 1 이상의본발명의분자를, 암의치료및 / 또는예방을위해사용되는 1 이상의치료약과함께투여하는것을포함한다. 1개의구체예에서는, 혈관신생저해약을본발명의분자와병용하여투여할수있다. 본발명의방법및조성물중에서사용할수있는혈관신생저해약으로서는한정되는것은아니지만이하가포함된다 : 안지오스타틴 (Angiostatin)( 플라스미노겐단편 ); 항혈관신생항트롬빈III; 안지오자임 (Angiozyme); ABT-627; Bay ; 베네핀 (Benefin); 베바시주마브 (Bevacizumab); BMS ; 연골유래저해약 (CDI); CAI; CD59 보체단편 ; CEP-7055; Col 3; 콤브레타스타틴 (Combretastatin)A-4; 엔도스타틴 ( 콜라겐XVIII 단편 ); 피브로넥틴단편 ; Gro-β; 할로푸기논 (Halofuginone); 헤파리나제류 ; 헤파린헥사사카라이드단편 ; HMV833; 인간융모성고나도트로핀 (hcg); IM-862; 인터페론α/β/γ; 인터페론유도성단백질 (IP-10); 인터류킨-12; 크링글 (Kringle)5( 플라스미노겐단편 ); 마리마스타트 (Marimastat); 메탈로프로테이나제저해약 (TIMPs); 2-메톡시에스트라디올 ; MMI 270(CGS 27023A); MoAb IMC-1C11; 네오바스타트 (Neovastat); NM-3; 판젬 (Panzem); PI-88; 태반리보뉴클레아제저해제 ; 플라스미노겐활성화인자저해제 ; 혈소판인자-4(PF4); 프리노마스타트 (Prinomastat); 프로락틴16kDa 단편 ; 프로리페린 (Proliferin) 관련단백질 (PRP); PTK787/ZK ; 레티노이드 ; 솔리마스타트 (Solimastat); 스쿠알라민 (Squalamine); SS3304; SU5416; SU6668; SU11248; 테트라히트로코르티졸-S; 테트라티오몰리브데이트 ; 탈리도마이드 ; 트롬보스폰딘-1(TSP-1); TNP-470; 트랜스포밍증식인자β(TGF-b); 바스큘로스타틴 (Vasculostatin); 바소스타틴 (Vasostatin)( 칼레티큘린단편 ); ZD6126; ZD6474; 파르네실트랜스페라제저해약 (FTI); 및비스포스포네이트류

85 [0369] 본발명의의약조성물및제형및키트를포함하는, 본발명의각종구체예에서본발명의분자와병용하여사용할수있는항암약으로서는, 한정되는것은아니지만, 이하가포함된다 : 아시비신 (acivicin); 아클라루비신 (aclarubicin); 염산아코다졸 (acodazole); 아크로닌 (acronine); 아도젤레신 (adozelesin); 알데스류킨 (aldesleukin); 알트레타민 (altretamine); 암보마이신 (ambomycin); 아세트산아메탄트론 (ametantrone); 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide); 암사크린 (amsacrine); 아나스트로졸 (anastrozole); 안트라마이신 (anthramycin); 아스파라기나제 ; 아스페린 (asperlin); 아자시티딘 (azacitidine); 아제테파 (azetepa); 아조토마이신 (azotomycin); 바티마스타트 (batimastat); 벤조데파 (benzodepa); 비칼루타미드 (bicalutamide); 염산비산트렌 (bisantrene); 디메실산비스타피드 (bisnafide); 비젤레신 (bizelesin); 황산블레오마이신 (bleomycin); 나트륨브레퀴나르 (brequinar); 브로피리민 (bropirimine); 부술판 (busulfan); 칵티노마이신 (cactinomycin); 칼루스테론 (calusterone); 카라세미드 (caracemide); 카르베티머 (carbetimer); 카르보플라틴 (carboplatin); 카르무스틴 (carmustine); 염산카루비신 (carubicin); 카르젤레신 (carzelesin); 세데핀골 (cedefingol); 클로람부실 (chlorambucil); 시롤레마이신 (cirolemycin); 시스플라스틴 (cisplatin); 클라드리빈 (cladribine); 메실산크리스나톨 (crisnatol); 시클로포스파미드 ; 시타라빈 (cytarabine); 다카르바진 (dacarbazine); 닥티노마이신 (dactinomycin); 염산다우노루비신 (daunorubicin); 데시타빈 (decitabine); 덱소르마플라틴 (dexormaplatin); 데자구아닌 (dezaguanine); 메실산데자구아닌 (dezaguanine); 디아지큐온 (diaziquone); 도세탁셀 (docetaxel); 독소루비신 (doxorubicin); 염산독소루비신 (doxorubicin); 드롤록시펜 (droloxifene); 시트르산드롤록시펜 (droloxifene); 프로피온산도로모스타놀론 (dromostanolone); 두아조마이신 (duazomycin); 에다트렉세이트 (edatrexate); 염산에플로르니틴 (eflornithine); 엘사미트루신 (elsamitrucin); 엔로플라틴 ; 엔프로메이트 (enpromate); 에피프로피딘 (epipropidine); 염산에피루비신 (epirubicin); 에르불로졸 (erbulozole); 염산에소루비신 (esorubicin); 에스트라무스틴 (estramustine); 인산에스트라무스틴 (estramustine) 나트륨 ; 에타니다졸 (etanidazole); 에토포시드 (etoposide); 인산에토포시드 (etoposide); 에토프린 (etoprine); 염산파드로졸 (fadrozole); 파자라빈 (fazarabine) 펜레티니드 (fenretinide); 플록수리딘 (floxuridine); 인산플루다라빈 (fludarabine); 플루오로우라실 ; 플루로시타빈 (flurocitabine); 포스퀴돈 (fosquidone); 나트륨포스트리에신 (fostriecin); 겜시타빈 (gemcitabine); 염산겜시타빈 (gemcitabine); 히드록시우레아 ; 염산이다루비신 (idarubicin); 이포스파미드 (ifosfamide); 일모포신 (ilmofosine); 인터류킨II( 재조합인터류킨II, 또는 ril2를포함함 ), 인터페론α-2a; 인터페론α-2b; 인터페론α-nl; 인터페론α-n3; 인터페론β-Ia; 인터페론γ-Ib; 이프로플라틴 (iproplatin); 염산이리노테칸 (irinotecan); 아세트산란레오티드 (lanreotide); 레트로졸 (letrozole); 아세트산류프롤리드 (leuprolide); 염산리아로졸 (liarozole); 로메트렉솔 (lometrexol) 나트륨 ; 로무스틴 (lomustine); 염산로소크산트론 (losoxantrone); 마소프로콜 (masoprocol); 메이스타신 (maytansine); 염산메클로레타민 (mechlorethamine); 아세트산메게스트롤 (megestrol); 아세트산멜렌게스트롤 (melengestrol); 멜팔란 (melphalan); 메노가릴 (menogaril); 메르캅토푸린 ; 메토트렉세이트 ; 나트륨메토트렉세이트 ; 메토프린 (metoprine); 메투레데파 (meturedepa); 미틴도미드 (mitindomide); 미토카르신 (mitocarcin); 미토크로민 (mitocromin); 미토길린 (mitogillin); 미토말신 (mitomalcin); 마토마이신 ; 미토스페르 (mitosper); 미토탄 (mitotane); 염산미코크산트론 (mitoxantrone); 미코페놀산 (mycophenolic acid); 노코다졸 (nocodazole); 노갈라마이신 (nogalamycin); 오르마플라틴 (ormaplatin); 옥시수란 (oxisuran); 파클리탁셀 (paclitaxel); 페가스파르가세 (pegaspargase); 펠리오마이신 (peliomycin); 펜타무스틴 (pentamustine); 황산페플로마이신 (peplomycin); 페르포스파미드 (perfosfamide); 피포브로만 (pipobroman); 피포술판 (piposulfan); 염산피로크산트론 (piroxantrone); 플리카마이신 (plicamycin); 플로메스탄 (plomestane); 포피머 (porfimer) 나트륨 ; 포피로마이신 (porfiromycin); 프레드니무스틴 (prednimustine); 염산프로카르바진 (procarbazine); 퓨로마이신 (puromycin); 염산퓨로마이신 (puromycin); 피라조푸린 (pyrazofurin); 리보프린 (riboprine); 로글레티미드 (rogletimide); 사핀골 (safingol); 염산사핀골 (safingol); 세무스틴 (semustine); 심트라젠 (simtrazene); 나트륨스파르포세이트 (sparfosate); 스파르소마이신 (sparsomycin); 염산스피로게르마늄 (spirogermanium); 스피로무스틴 (spiromustine); 스피플래틴 (spiroplatin); 스트렙토니그린 (streptonigrin); 스트렙토조신 (streptozocin); 술로페누르 (sulofenur); 탈리소마이신 (talisomycin); 테코갈란 (tecogalan) 나트륨 ; 테가푸르 (tegafur); 염산텔록산트론 (teloxantrone); 테모포르핀 (temoporfin); 테니포시드 (teniposide); 테록시론 (teroxirone); 테스토락톤 (testolactone); 티아미프린 (thiamiprine); 티오구아닌 (thioguanine); 치오테파 (thiotepa); 치아조푸린 (tiazofurin); 티라파자민 (tirapazamine); 시트르산토레미펜 (toremifene); 아세트산토레스톨론 (trestolone); 인산트리시리빈 (triciribine); 트리메트렉세이트 (trimetrexate); 글루쿠론산트리메트렉세이트 ; 트리프토렐린 (triptorelin); 염산투불로졸 (tubulozole); 우라실마스타드 (uracil mustard); 우레데파 (uredepa); 바프레오티드 (vapreotide); 베르테포르핀 (verteporfin); 황산빈블라스틴 (vinblastine); 황산빈크리스틴 (vincristine); 빈데신 (vindesine); 황산빈데신 (vindesine); 황산비네피딘 (vinepidine); 황산빈

86 글리시네이트 (vinglycinate); 황산빈류로신 (vinleurosine); 타르타르산비노렐빈 (vinorelbine); 황산빈로시딘 (vinrosidine); 황산빈졸리딘 (vinzolidine); 보로졸 (vorozole); 제니플라틴 (zeniplatin); 지노스타틴 (zinostatin); 염산조루비신 (zorubicin). 그밖의항암약으로서, 한정되는것은아니지만, 이하가포함된다 : 20-에피-1,25디히드록시비타민D3; 5-에티닐우라실 ; 아비라테론 (abiraterone); 아클라루비신 (aclarubicin); 아실풀벤 (acylfulvene); 아데시페놀 (adecypenol); 아도젤레신 (adozelesin); 알데스류킨 (aldesleukin); ALL-TK 길항약 ; 알토레타민 ; 암바무스틴 (ambamustine); 아미독스 (amidox); 아미포스틴 (amifostine); 아미노레불린산 ; 암루비신 (amrubicin); 암사크린 (amsacrine); 아나그렐리드 (anagrelide); 아나스트로졸 (anastrozole); 안드로그라폴리드 (andrographolide); 혈관형성저해약 ; 길항약D; 길항약G; 안타렐릭스 (antarelix); 항배방화 ( 抗背方化 ) 형태발생단백질-1; 항안트로겐전립선암 ; 항에스트로겐 ; 항네오플라스톤 ; 안티센스올리고뉴클레오티드 ; 글리신산아피디콜린 (aphidicolin); 어팝토시스유전자모듈레이터 ; 어팝토시스레귤레이터 ; 아푸린산 ; 아라-CDP-DL- PTBA; 아르기닌데아미나제 ; 아술라크린 (asulacrine); 아타메스탄 (atamestane); 아트리무스틴 (atrimustine); 악시나스타틴 (axinastatin)1; 악시나스타틴2; 악시나스타틴3; 아자세트론 (azasetron); 아자톡신 (azatoxin); 아자티로신 (azatyrosine); 바카틴III 유도체 ; 발라놀 (balanol); 바티마스타트 (batimastat); BCR/ABL 길항약 ; 벤조클로린류 ; 벤조일스타우로스포린 (benzoylstaurosporine); β락탐유도체 ; β알레틴 (beta-alethine); β클라마이신 (betaclamycin)b; 베툴린산 ; bfgf 저해약 ; 비칼루타미드 (bicalutamide); 비산트렌 (bisantrene); 비사지리디닐스퍼민 (bisaziridinylspermine); 비스나피드 (bisnafide); 비스트라텐 (bistratene)a; 비젤레신 (bizelesin); 브레플레이트 (breflate); 브로피리민 (bropirimine); 부도티탄 (budotitane); 부티오닌술폭시민 (buthionine sulfoximine); 칼시포트리올 (calcipotriol); 칼포스틴 (calphostin)c; 캄프토테신 (camptothecin) 유도체 ; 카나리폭스 (canarypox)il-2; 카페시타빈 (capecitabine); 카르복사미드-아미노- 트리아졸 ; 카르복시아미드트리아졸 ; CaRest M3; CARN 700; 연골유래저해약 ; 카르젤레신 (carzelesin); 카세인키나제저해약 (ICOS); 카스타노스퍼민 (castanospermine); 세크로핀 (cecropin)b; 세트로렐릭스 (cetrorelix); 클로른 (chlorlns); 클로로퀴녹살린술폰아미드 ; 시카프로스트 (cicaprost); cis 포스피린 ; 클라드리빈 (cladribine); 클로미펜 (clomifene) 유사체 ; 클로트리마졸 (clotrimazole); 콜리스마이신 (collismycin)a; 콜리스마이신B; 콤브레타스타틴 (combretastatin)a4; 콤브레타스타틴유사체 ; 코나게닌 (conagenin); 크람베시딘 (crambescidin)816; 크리스타놀 (crisnatol); 크립토피신 (cryptophycin)8; 크립토피신A 유도체 ; 큐라신 (curacin)a; 시클로펜타안트라퀴논류 ; 시클로플라탐 (cycloplatam); 시페마이신 (cypemycin); 시타라빈오크포스페이트 (cytarabineocfosfate); 세포용해인자 ; 시토스타틴 (cytostatin); 타클릭시마브 (dacliximab); 데시타빈 (decitabine); 디히드로디뎀닌 (dehydrodidemnin)b; 데스로레린 (deslorelin); 덱사메타손 (dexamethasone); 덱시포스파미드 (dexifosfamide); 덱스라족산 (dexrazoxane); 덱스베라파밀 (dexverapamil); 디아지쿠온 (diaziquone); 디뎀닌 (didemnin)b; 디독스 (didox); 디에틸노르스페닌 (diethylnorspennine); 디히드로-5-아자시티딘 ; 디히드로탁솔, 9-; 디옥사마이신 (dioxamycin); 디페닐스피포무스틴 (diphenyl spiromustine); 도세탁셀 (docetaxel); 도코사놀 (docosanol); 돌라세트론 (dolasetron); 독시플루리딘 (doxifluridine); 드롤록시펜 (droloxifene); 드로나비놀 (dronabinol); 듀로카마이신 (duocarmycin)sa; 에브셀렌 (ebselen); 에코무스틴 (ecomustine); 에델포신 (edelfosine); 에드레콜로마브 (edrecolomab); 에플로니틴 (eflornithine); 엘레멘 (elemene); 에미테푸르 (emitefur); 에피루비신 (epirubicin); 에프리스테리드 (epristeride); 에스트라무스틴 (estramustine) 유사체 ; 에스트로겐작동약 ; 에스트로겐길항약 ; 에타니다졸 (etanidazole); 인산에토포시드 (etoposide); 엑세메스탄 (exemestane); 파드로졸 (fadrozole); 파자라빈 (fazarabine); 펜레티니드 (fenretinide); 필그라스팀 (filgrastim); 피나스테리드 (finasteride); 플라보피리돌 (flavopiridol); 플레젤라스틴 (flezelastine); 플루아스테론 (fluasterone); 플루다라빈 (fludarabine); 염산플루오로다우노루니신 (fluorodaunorunicin); 포르페니멕스 (forfenimex); 포르메스탄 (formestane); 포스트리에신 (fostriecin); 포테무스틴 (fotemustine); 텍사피린가돌리늄 (gadolinium texaphyrin); 질산갈륨 ; 갈로시타빈 (galocitabine); 가니렐릭스 (ganirelix); 겔라티나제저해약 ; 겜시타빈 (gemcitabine); 글루타티온저해약 ; 펩술팜 (hepsulfam); 헤레굴린 (heregulin); 헥사메틸렌비스아세토아미드 ; 하이페리신 (hypericin); 이반드론산 ; 이다루비신 (idarubicin); 이독시펜 (idoxifene); 이드라만톤 (idramantone); 일모포신 (ilmofosine); 일모스타트 (ilomastat); 이미다조아크리돈류 ; 이미퀴모드 (imiquimod); 면역자극펩티드류 ; 인슐린유사성장인자-1수용체저해약 ; 인터페론작동약 ; 인터페론류 ; 인터류킨류 ; 이오벤구안 (iobenguane); 요오도독소루비신 (iododoxorubicin); 이포메아놀 (ipomeanol), 4-; 이로플락트 (iroplact); 이르소글라딘 (irsogladine); 이소벤가졸 (isobengazole); 이소호모할리콘드린 (isohomohalicondrin)b; 이타세토론 (itasetron); 자스플라시놀리드 (jasplakinolide); 카할랄리드 (kahalalide)f; 3아세트산라멜라린 (lamellarin)-n; 란레오디드 (lanreotide); 레이나마이신 (leinamycin); 레노그라스팀 (lenograstim); 황산렌티난 (lentinan); 렙톨스타틴 (leptolstatin); 레트로졸 (letrozole); 백혈병억제인자 ; 백혈구 α인터페론 ; 류프롤리드 + 에스트로겐 + 프로게스테론 ; 류프로렐린 (leuprorelin); 레바미솔 (levamisole); 리아로졸 (liarozole); 선

87 상폴리아민유사체 ; 친유성디사카라이드펩티드 ; 친유성백금화합물 ; 리소클리나미드 (lissoclinamide)7; 로바플라틴 (lobaplatin); 롬브리신 (lombricine); 로메트렉솔 (lometrexol); 로니다민 (lonidamine); 로속산트론 (losoxantrone); 로바스타틴 (lovastatin); 록소리빈 (loxoribine); 루르토테칸 (lurtotecan); 텍사피린루테늄 (lutetium texaphyrin); 리소필린 (lysofylline); 용해성펩티드류 ; 마이탄신 (maitansine); 만노스타틴 (mannostatin)a; 마리마스타트 (marimastat); 마소프로콜 (masoprocol); 마스핀 (maspin); 마트릴리신 (matrilysin) 저해약 ; 매트릭스금속프로테이나제저해약 ; 메노가릴 (menogaril); 메르바론 (merbarone); 메테렐린 (meterelin); 메티오니나제 ; 메토클로프라미드 (metoclopramide); MIF 저해약 ; 미페프리스톤 (mifepristone); 밀테포신 (miltefosine); 미리모스팀 (mirimostim); 미스매치이중쇄 RNA; 미토구아존 (mitoguazone); 미토락톨 (mitolactol); 미토마이신유사체 ; 미토나피드 (mitonafide); 마이토톡신선유아성장인자-사포린 (saporin); 미톡산트론 (mitoxantrone); 모파로텐 (mofarotene); 몰그라모스팀 (molgramostim); 모노클론항체, 인간융모고나도트로핀 ; 모노포스포릴리피드A+ 미오막테리움세포벽sk; 모피다몰 (mopidamol); 다중약제내성유전자저해약 ; 다발성종양억제인자 1 베이스의치료 ; 머스타드항암약 ; 마이카퍼옥시드B; 마이코박테리아세포벽추출물 ; 미리아포론 ; N-아세틸디날린 (acetyldinaline); N-치환벤즈아미드류 ; 나파렐린 (nafarelin); 나그레스팁 (nagrestip); 날록손 (naloxone)+ 펜타조신 (pentazocine); 나파빈 (napavin); 나프테르핀 (naphterpin); 나르토그라스팀 (nartograstim); 네다플라틴 (nedaplatin); 네모루비신 (nemorubicin); 네리드론산 ; 중성엔도펩티다제 ; 닐루타미드 (nilutamide); 니사마이신 (nisamycin); 일산화질소모듈레이터 ; 니트록시드항산화제 ; 니트룰린 (nitrullyn); 06-벤질구아닌 ; 옥트레오티드 (octreotide); 오키세논 (okicenone); 올리고뉴클레오티드류 ; 오나프리스톤 (onapristone); 온단세트론 (ondansetron); 온단세트론 (ondansetron); 오라신 (oracin); 경구사이토카인유도약 ; 오르마플라틴 (ormaplatin); 오사테론 (osaterone); 옥살리플라틴 (oxaliplatin); 옥사우노마이신 (oxaunomycin); 파클리탁셀 (paclitaxel); 파클리탁셀유사체 ; 파클리탁셀유도체류 ; 팔라우아민 (palauamine); 팔미토일리족신 (palmitoylrhizoxin); 팔미드론산 ; 파낙시트리올 ; 파노미펜 (panomifene); 파라박틴 (parabactin); 파젤립틴 (pazelliptine); 페가스파르가스 (pegaspargase); 펠데신 (peldesine); 폴리황산펜도산나트륨 ; 펜토스타틴 (pentostatin); 펜트로졸 (pentrozole); 퍼플루브론 (perflubron); 퍼포스파미드 ; 페릴릴알코올 ; 페나지노마이신 (phenazinomycin); 아세트산페닐 ; 인산염저해약 ; 피시바닐 (picibanil); 염산필로카르핀 (pilocarpine); 피라루비신 (pirarubicin); 피리트렉심 (piritrexim); 플라세틴 (placetin)a; 플라세틴B; 플라스미노겐활성화인자저해약 ; 백금복합체 ; 백금화합물 ; 백금-트리아민복합체 ; 포미머 (porfimer) 나트륨 ; 포피로마이신 (porfiromycin); 프레드니손 (prednisone); 프로필bis-아크리돈 ; 프로스타글란딘J2; 프로테아솜저해약 ; 단백질A 베이스의면역모듈레이터 ; 단백질키나제C 저해약 ; 단백질키나제C 저해약류, 미크로알갈 (microalgal); 단백질티로신포스파타제저해약 ; 푸린뉴클레오시드포스포릴라제저해약 ; 푸르푸린류 ; 피라졸로아크리딘 ; 피리독실화헤모글로빈폴리옥시에틸렌콘주게이트 ; raf 길항약 ; 랄티트렉세드 (raltitrexed); 라모세트론 (ramosetron); ras 파르네실단백질트랜스페라제저해약 ; ras 저해약 ; ras- GAP 저해약 ; 탈메틸화레텔립틴 (retelliptine); 네늄 Re186 에티드로네이트 ; 리족신 (rhizoxin); 리보자임류 ; RII 레티나미드 ; 로글레티미드 (rogletimide); 로히투킨 (rohitukine); 로무르티드 (romurtide); 로퀴니멕스 (roquinimex); 루비기논 (rubiginone)bl; 루복실 (ruboxyl); 사핀골 (safingol); 사인토핀 (saintopin); SarCNU; 사르코피톨 (sarcophytol)a; 사르그라모스팀 (sargramostim); Sdi 1 모방체 ; 세무스틴 (semustine); 세네센스유도저해약1; 센스올리고뉴클레오티드류 ; 시그널도입저해약 ; 시그널도입모듈레이터 ; 단일쇄항원결합성단백질 ; 시조피란 (sizofiran); 소부족산 (sobuzoxane); 보로캅트산나트륨 ; 페닐아세트산나트륨 ; 솔베롤 (solverol); 소마트메딘결합성단백질 ; 소네르민 (sonermin); 스파르포스산 (sparfosic acid); 스피카마이신D; 스피로무스틴 (spiromustine); 스플레노펜틴 (splenopentin); 스폰기스타틴 (spongistatin)1; 스쿠알라민 ; 줄기세포저해약 ; 줄기세포분열저해약 ; 스티피아미드 (stipiamide); 스트로멜리신 (stromelysin) 저해약 ; 술피노신 (sulfinosine); 고작용성혈관작용성장내펩티드길항약 ; 수라디스타 (suradista); 수라민 (suramin); 스와인소닌 (swainsonine); 합성글리코사민오글리칸 ; 탈리무스틴 (tallimustine); 타목시펜메티오디드 (tamoxifen methiodide); 타우로무스틴 (tauromustine); 타자로텐 (tazarotene); 테코갈란 (tecogalan) 나트륨 ; 테가푸르 (tegafur); 텔루라피릴륨 (tellurapyrylium); 텔로메라제저해약 ; 테모포르핀 (temoporfin); 테모졸로미드 (temozolomide); 테니포시드 (teniposide); 테트라클로로데카옥시드 ; 테트라조민 (tetrazomine); 탈리블라스틴 (thaliblastine); 티오코랄린 (thiocoraline); 트롬보포에틴 ; 트롬보포에틴모방체 ; 티말파신 (thymalfasin); 티모포에틴 (thymopoietin) 수용체작동약 ; 치모트리난 (thymotrinan); 갑상선자극호르몬 ; 티에닐에티오푸르푸린 ; 티라파자민 (tirapazamine); 2염화티타노센 ; 토프센틴 (topsentin); 토레미펜 (toremifene); 전능성줄기세포인자 ; 번역저해약 ; 트레티노인 (tretinoin); 트리아세틸우리딘 ; 트리시리빈 (triciribine); 트리메트렉세이트 ; 트립토렐린 (triptorelin); 트로피세트론 (tropisetron); 투로스테리드 (turosteride); 티로신키나제저해약 ; 티르포스틴류 ; UBC 저해약 ; 우베니멕스 (ubenimex); 요생식동유래성장억제인자 ; 우로키나제수용체길항약 ; 바프

88 레오티드 (vapreotide); 바리올린 (variolin)b; 벡터시스템, 적혈구유전자치료 ; 벨라레솔 (velaresol); 베라민 (veramine); 베르딘류 ; 베르테포르핀 (verteporfin); 비노렐빈 (vinorelbine); 빈크살틴 (vinxaltine); 비탁신 (vitaxin); 보로졸 (vorozole); 자노테론 (zanoterone); 제니플라틴 (zeniplatin); 질라스코르브 (zilascorb); 및지노스타틴스티말라머 (zinostatin stimalamer). 바람직한그밖의항암약은 5-플루오로우라실및류코보린 (leucovorin) 이다. [0370] 본발명의방법에서사용할수있는치료용항체의예로서는, 한정되는것은아니지만, 이하가포함된다 : ZENAPAXS( 등록상표 )(daclizumab)(roche Pharmaceuticals, Switzerland)( 급성신장동종이식편거절반응의예방 용의, 면역억제성인간화항 CD25 모노클론항체 ); PANOREX TM ( 마우스항 17-IA 세포표면항원 IgG2a 항체 )(Glaxo Wellcome/Centocor); BEC2( 마우스항이디오타입 (GD3 에피토프 ) IgG 항체 )(ImClone System); IMC- C225( 키메라항 EGFR IgG 항체 )(Clone System); VITAXIN TM ( 인간화항 αvβ3 인테그린항체 )(Applied Molecular Evolution/MedImmune); Smart M195( 인간화항 CD33 IgG 항체 )(Protein Design Lab/Kanebo); LYMPHOCIDETM( 인간화항 CD22IgG 항체 )(Immunomedics); ICM3( 인간화항 ICAM3 항체 (ICOS Phann); IDEC-114( 영장류화항 CD80 항체 )(IDECPharm/Mitsubishi); IDEC-131( 인간화항 CD40L 항체 )(IDEC/Eisai); IDEC-151( 영장류화항 CD4 항체 )(IDEC); IDEC-152( 영장류화항 CD23 항체 )(IDEC/Seikagaku); SMART 항 CD3( 인간화항 CD3 IgG)(Protein Design Lab); 5G1.1( 인간화항보체인자 5(C5) 항체 )(Alexion Pharm); D2E7( 인간화항 TNF-α항체 )(CAT/BASF); CDP870( 인간화항 TNF-αFab 단편 )(Celltech); IDEC-151( 영장류화항 CD4 IgG1 항체 )(IDECPharm/SmithKline Beecham); MDX-CD4( 인간항 CD4 IgG 항체 )(Medarex/Eisai/Genmab); CDP571( 인간화항 TNF-αIgG4 항체 )(Celltech); LDP-02( 인간화항 α4β7 항체 )(LeukoSite/Genentech); OrthoClone OKT4A( 인간화항 CD4 IgG 항체 )(Ortho Biotech); ANTOVATM( 인간화항 CD40L IgG 항체 )(Biogen); ANTEGRENTM( 인간화항 VLA-4 IgG 항체 )(Elan); 및 CAT-152( 인간항 TGF-β2 항체 )(Cambridge Ab Tech). 본발명에따라사용할수있는치료용항체의그밖의예를표 22에나타낸다. [0371] 표 22 항암치료용항체 회사제품질환표적 Abgenix ABX-EGF 암 EGF 리셉터 AltaRex Antisoma Boehringer Ingelheim Centocor/J&J OvaRex BravaRex Theragyn(pemtumomabyirrium-90) 난소암 전이성암난소암 종양항원 CA125 종양항원 MUC1 PEM 항원 Therex 유방암 PEM 항원 Blvatuzumab 두경부암 CD44 Panorex ReoPro ReoPro ReoPro 대장암 PTCA 급성 MI 빈혈발작 Corixa Bexocar NHL CRC Technology MAb, 이디오타입 105AD7 대장암 17-1A gp Ⅲb/Ⅲa gp Ⅲb/Ⅲa gp Ⅲb/Ⅲa CD20 gp72 백신 Crucell 항-EpCAM 암 Ep-CAM Cytoclonal MAb, 폐암 비소세포폐암 NA Genentech Herceptin 전이성유방암 HER-2 Herceptin Rituxan Rituxan MAb-VEGF MAb-VEGF AMD Fab E-26( 제 2 세대 IgE) 초기유방암 재발 / 저항성저악성도또는여포성 NHL 중악성도및고악성도 NHL NSCLC, 전이성 대장암, 전이성 노화성황반변성 알러지성천식과비염 HER-2 CD20 CD20 VEGF VEGF CD18 IgE

89 IDEC ImClone Zevalin(Rituxan + 이트륨 -90) Cetuximab+ 이노테칸 Cetuximab+ 시스플라틴및방사선 Cetuximab+ 겜시타빈 Cetuximab+ 시스플라틴 +5FU 또는탁솔 Cetuximab+ 카보플라틴 + 파크리탁셀 Cetuximab+ 시스플라틴 Cetuximab+ 방사선 BEC2 + 바실러스카르메트게랑균 BEC2 + 바실러스카르메트게랑균 IMC-1C11 저악성도의여포성, 재발또는저항성, CD20- 양성, B 세포 NHL 및 Rituximab 저항성 NHL 저항성대장암 새롭게진단된또는재발성경두부암 새롭게진단된전이성췌장암 재발성또는전이성경두부암 새롭게진단된비소세포폐암 경두부암 ( 광범위한불치의국소영역질환및원거리전이 ) 국소진행성경두부암 소세포폐암 흑색종 간전이수반대장암 ImmonoGen nuc242-dm1 대장암, 위암및 ImmunoMedics LymphoCide LymphoCide Y-90 CEA-Cide CEA-Cide Y-90 CEA-Scan(Tc-99m- 표지 arcitumomab) CEA-Scan(Tc-99m- 표지 arcitumomab) CEA-Scan(Tc-99m- 표지 arcitumomab) CEA-Scan(Tc-99m- 표지 arcitumomab) LeukoScan(Tc-99m- 표지 sulesomab) LymphoScan(Tc-99m- 표지 ) AFP-Scan(Tc-99m- 표지 ) 췌장암비-Hodgkins 림프종 비 -Hodgkins 림프종 전이성고형종양 전이성고형종양 대장암 ( 방사이미징 ) 유방암 ( 방사이미징 ) 폐암 ( 방사이미징 ) 수술중종양 ( 방사이미징 ) 연조직감염 ( 방사이미징 ) 림프종 ( 방사이미징 ) liver 7 gem- 악성종양 ( 방사이미징 ) CD20 EGF 리셉터 EGF 리셉터 EGF 리셉터 EGF 리셉터 EGF 리셉터 EGF 리셉터 EGF 리셉터 미믹형갱글리오시드 GD3 미믹형갱글리오시드 GD3 VEGF-리셉터 nuc242 CD22 CD22 CEA CEA CEA CEA CEA CEA CEA CD22 AFP Intracel HumaRAD-HN(+ 이트륨 -90) Medarex MedImmune Merck KGaA Millennium NeoRx HumaSPECT MDX-101(CTLA-4) MDX-210(her-2 과발현 ) MDX-210/MAK Vitaxin MAb 425 IS-IL-2 Campath(alemtuzumab) CD20- 스트렙타비딘 (+ 비오틴 - 이트륨 90) Avidicin( 알부민 +NRLU13) 경두부암 대장이미징전립선암및다른암 전립선암 암 암 다양한암 다양한암 만성림프성백혈병 비 -Hodgkins 림프종 전이성암 NA NA CTLA-4 HER-2 HER-2 αvβ 3 EGF 리셉터 Ep-CAM CD52 CD20 NA

90 Peregrine Oncolym(+ 요소 -131) Pharmacia Corporation Protein Design Labs Titan Trilex Viventia Biotech Xoma Cotara(+ 요소-131) C215(+ 포도상구균엔테로톡신 ) MAb, 폐 / 신장암 nacolomab tafenatox (C242 + 포도상구균엔테로톡신 ) Nuvion SMART M195 SMART 1D10 CEAVac TriGem TriAb CEAVac TriGem TriAb NovoMAb-G2 방사표지 Monopharm C GlioMAb-H( + 겔로닌독소 ) Rituxan Rituxan ING-1 비 -Hodgkins 림프종 절제불능악성 신경교종췌장암 폐 & 신장암 대장암및췌장암 T세포악성종양 AML NHL 진행성대장암 전이성흑색종및소세포폐암 전이성유방암 진행성대장암 전이성흑색종및소세포폐암 전이성유방암 비 -Hodgkins 림프종 대장암및췌장암 신경교종, 흑색종및신경아세포종 재발성 / 저항성저악성도또는여포성 NHL 중악성도및고악성도의 NHL 선암 HLA-DR 10 베타 DNA 관련단백질 NA NA NA CD3 CD33 HLA-DR 항원 CEA GD2- 갱글리오시드 MUC-1 CEA GD2- 갱글리오시드 MUC-1 NA SK-1 항원 NA CD20 CD20 Ep-CAM [0372] [0373] 면역조절제및항염증제 본발명은, 본발명의분자를다른치료약과함께투여하는것을포함하는, 자가면역질환및염증성질환의치 료방법을제공한다. 면역조절약의예로서는, 한정되는것은아니지만, 메토트랙세이트, 엔브렐 (ENBREL), 레미 케이드 (REMICADE TM ), 레플루노미드, 시클로포스파미드, 시클로스포린A, 및마크롤리드항생물질 ( 예를들면, FK506( 카크롤리무스 )), 메틸프레드니솔론 (MP), 코르티코스테로이드, 스테로이드, 미코페놀산모페틸, 라파마이신 ( 시롤리무스 ), 미조리빈, 데옥시스페르구알린 (deoxyspergualin), 브레퀴나르 (brequinar), 말로노니트릴아미드 ( 예를들면, 레플루나미드 ), T세포수용체모듈레이터, 및사이토카인수용체모듈레이터를포함한다. [0374] 항염증약은, 염증성질환및자가면역질환의치료에있어서성공을거두었고, 현재, 이러한질환을위한공통또한표준의치료약으로되어있다. 당업자에게알려진어느항염증약도본발명의방법에사용할수있다. 항염증약의비한정적인예는비스테로이드계항염증약 (N상기), 스테로이드계항염증약, β작동약, 항콜린작동약, 및메틸크산틴을포함한다. N상기의예는, 한정되는것은아니지만, 아스피인, 이부프로펜, 셀레콕시브 (CELEBREX TM ), 디클로페낙 (VOLTAREN TM ), 에토돌락 (LODINE TM ), 페노프로펜 (NALFON TM ), 인도메타신 (INDOCIN TM ), 케토랄락 (TORADOL TM ), 옥사프로진 (DAYPRO TM ), 나부메톤 (RELAFEN TM ), 술린닥 (CLINORIL TM ), 톨메틴 (TOLECTIN TM ), 로페콕시브 (VIOXX TM ), 나프록센 (ALEVE TM, NAPROSYN TM ), 케토프로펜 (ACTRON TM ) 및나부메톤 (RELAFEN TM ) 을포함한다. 이러한 N상기는시클로옥시게나제효소 ( 예를들면, COX-1 및 / 또는 COX-2) 를저해함으로써기능한다. 스테로이드계항염증약의예는, 한정되는것은아니지만, 글루코코르티코이드, 덱사메타손 (DECADRONTM), 코르티손, 히드로코르티손, 프레드니손 (DELTASONETM), 프레드니솔론, 트리암시놀론, 아줄피딘, 및에이코사노이드, 예를들면, 프로스타글란딘, 트롬복산, 및류코트리엔을포함한다. [0375] 염증성질환의치료또는예방을위해본발명의분자와병용하여사용할수있는항체의비한정적인예를표 23 에나타내고, 또한자가면역질환의치료또는예방을위해사용할수있는항체의비한정적인예를표 24 에 나타낸다

91 [0376] 표 23 염증성질환의치료용항체 항체명 표적항원 산물형 아이소타입 스폰서 적응증 SG1.l 보체 인간화 IgG Alexion Pharm Inc 류마티스성관절염 (C5) SG1.l 보체 인간화 IgG Alexion Pharm Inc SLE (C5) SG1.l 보체 인간화 IgG Alexion Pharm Inc 신염 (C5) SG1.l-SC 보체 인간화 ScFv Alexion Pharm Inc 심폐바이패스 (C5) SG1.l-SC 보체 인간화 ScFv Alexion Pharm Inc 심근경색 (C5) SG1.l-SC 보체 인간화 ScFv Alexion Pharm Inc 혈관성형술 (C5) ABX-CBL CBL 인간 Abgenix Inc GvHD ABX-CBL CD147 설치류 IgG Abgenix Inc 동종이식거부반응 ABX-IL8 IL-8 인간 IgG2 Abgenix Inc 건선 Antegren VLA-4 인간화 IgG Athena/Elan 심근경색 Anti-CDlla CDlla 인간화 IgG1 Genentech Inc/Xoma 건선 Anti-CD18 CD18 인간화 Fab'2 Genentech Inc 심근경색 Anti-LFAI CD18 설치류 Fab'2 Pasteur- Merieux/ 동종이식거부반응 Immunotech Antova CD40L 인간화 IgG Biogen 동종이식거부반응 Antova CD40L 인간화 IgG Biogen SLE BTI-322 CD2 Rat IgG Medimmune Inc GvHD, 건선 CDP571 TNF-alpha 인간화 IgG4 Celltech 크론병 CDP571 TNF-alpha 인간화 IgG4 Celltech 류마티스성관절염 CDP850 E-selectin 인간화 Celltech 건선 CorsevinM Fact VII 키메라 Centocor 항응고약 D2E7 TNF-alpha 인간 CAT/BASF 류마티스성관절염 Hu23F2G CD11/18 인간화 ICaS Pharm Inc 심근경색 Hu23F2G CD11/18 인간화 IgG ICaS Pharm Inc 발작 IC14 CD14 ICaS Pharm Inc 중독성쇼크 ICM3 ICAM-3 인간화 ICaS Pharm 건선 Inc IDEC-114 CD80 영장류화 IDEC PharmiMitsub 건선 ishi IDEC-131 CD40L 인간화 IDEC PharmiEisai SLE IDEC-131 CD40L 인간화 IDEC PharmiEisai 심근경색 IDEC-151 CD4 영장류화 IgG1 IDEC PharmiGlaxo 류마티스성관절염 SmithKline IDEC-152 CD23 영장류화 IDEC Pharm 천식 / 알러지 Infliximab TNF-alpha 키메라 IgG1 Centocor 류마티스성관절염 Infliximab TNF-alpha 키메라 IgG1 Centocor 크론병 LDP-Ol beta2- integrin 인간화 IgG Millennium Inc (LeukoSite Inc.) 발작 LDP-Ol beta2- 인간화 IgG Millennium Inc 동종이식거부반응 integrin (LeukoSite Inc.) LDP-02 alpha4beta7 인간화 Millennium Inc 궤양성대장염 (LeukoSite Inc.) MAK- TNF alpha 설치류 Fab'2 Knoll Pharm, 중독성쇼크 195F BASF

92 MDX-33 CD64 (FeR) 인간 Medarex/Centeon 자가면역혈액질환 MDX-CD4 CD4 인간 IgG Medarex/Eisai/ 류마티스성관절염 Genmab MEDI-507 CD2 인간화 Medimmune Inc 건선 MEDI-507 CD2 인간화 Medimmune Inc GvHD OKT4A CD4 인간화 IgG Ortho Biotech 동종이식거부반응 OrthoClone CD4 인간화 IgG Ortho Biotech 자가면역질환 OKT4A Orthoclone/anti- CD3 OKT3 CD3 설치류 migg2a Ortho Biotech 동종이식거부반응 RepPro/Abciximab gpiibiiia 키메라 Fab Centocor/Lilly 관상동맥혈관형성술의합병증 rhumab-e25 IgE 인간화 IgG1 Genentech/No 천식 / 알러지 vartis/tanox Biosystems SB IL5 인간화 GlaxoSmithKlme 천식 / 알러지 SB IL-4 인간화 GlaxoSmithKlme 천식 / 알러지 SCH55700 IL-5 인간화 Celltech/Sche 천식 / 알러지 nng Simulect CD25 키메라 IgG1 Novartis Pharm 동종이식거부반응 SMART a-cd3 CD3 인간화 Protein Design Lab 자가면역질환 SMART a-cd3 CD3 인간화 Protein Design Lab 동종이식거부반응 SMART a-cd3 CD3 인간화 IgG Protein Design Lab 건선 Zenapax CD25 인간화 IgG1 Protein Design Lab/Hoffman - LaRoche 동종이식거부반응 [0377] 표 24 자가면역질환의치료용항체 항체적응증표적항원 ABX-RB2 5c8( 항 CD-40 항원항체 ) phase II 시험을 99 년 10 월중에중지한 ' 유해반응 ' 을조사 T 세포, B 세포및 NK 세포상의 CBL 항원에대한항체 Xenomous에서유래하는완전한인간항체 CD40 IDEC 131 전신성홍반성낭창 (SLE) 항CD40 인간화 IDEC 151 류마티스관절염 영장류화 ; 항CD4 IDEC 152 천식 영장류화 ; 항CD23 IDEC 114 건선 영장류화 ; 항CD80 MEDI-507 류마티스관절염 ; LDP-02( 항 b7 mab) 다발성경화증 크론병 건선염증성장질환 크론병 항 CD2 궤양성대장염 SMART 항γ인터페론항체 자가면역질환 항-γ인터페론 Verteportin 류마티스관절염 백혈구세포상의 a4b7 인테그린수용체

93 MDX-33 MDX-CD4 VX-497 자가면역반응에의해생기는혈액질환 특발성혈소판감소성자반증 (ITP) FcRI 수용체에대한단일클론항체 자가면역용혈성빈혈류마티스관절염및다른자가면역증 CD4 수용체분자에대한단일클론을치료항체 자가면역질환 다발성경화증 류마티스관절염 염증성장질환 낭창 이노신인산디히드로게나제 ( 새로운 RNA 및 DNA 를만드는데필요한효소, 림프구증식에필요한뉴클레오티드의생산에이용 ) 의저해제 건선 VX-740 류마티스관절염 ICE 인터루킨-1β( 변환효소, 공격 적인면역반응에이르는경로를 제어 ) 의저해제 VX-745 Enbrel(etanercept) IL-8 Apogen MP4 염증에특이적 면역반응개시및염증의진행의화학적시그널전달에관여 P38MAP 키나제의저해제 마이토젠활성화단백질키나제 TNF( 종양괴사인자 ) 를표적화 IL-8( 인터루킨 8) 에대한완전한인간단일클론항체재조합항원 질환관련 T 세포를선택적으로파괴하는 어팝토시스를유도하는 T 세포는프로그램된세포사멸에의해제거되어, 자신의세포를더이상공격하지않는 특정의 apogens 은특정의 T 세포를표적화한다. [0378] [0379] 감염증치료용의약제몇가지의구체예에서는, 본발명의분자는감염증의치료및 / 또는예방을위해, 당업자에공지된 1종이상의추가적인치료약의치료상또는예방상유효한양과조합시켜서투여할수있다. 본발명은감염증의치료및 / 또는예방을위한당업자에공지된항생물질과조합시킨본발명의분자의사용을상정하고있다. 본발명의분자와조합시켜서사용할수있는항생물질로서는한정되는것은아니지만, 마크로라이드 ( 예를들면토브라마이신 (Tobi( 등록상표 )), 세팔로스포린 ( 예를들면세팔렉신 (Keflex( 등록상표 )), 세프라딘 (Velocef( 등록상표 )), 세프록심 (Ceftin( 등록상표 )), 세프프로질 (Cefzil( 등록상표 )), 세파클로르 (Ceclor( 등록상표 )), 세픽심 (Suprax( 등록상표 )) 또는세파드록실 (Duricef( 등록상표 ))), 클라리트로마이신 ( 예를들면클라리트로마이신 (Biaxin( 등록상표 )), 에리트로마이신 ( 예를들면에리트로마이신 (EMycin( 등록상표 )), 페니실린 ( 예를들면페니실린 V(V-Cillin K( 등록상표 ) 또는 Pen Vee K( 등록상표 ))) 또는퀴놀론 ( 예를들면오플록사신 (Floxin( 등록상표 )), 시프로플록사신 (Cipro( 등록상표 )) 또는노르플록사신 (Noroxin( 등록상표 ))), 아미노배당체계항생물질 ( 예를들면아프라마이신, 아르베카신, 밤베르마이신 (bambermycin), 부티로신, 디베카신, 네오마이신, 네오마이신, 운데실레네이트, 네틸마이신, 파로모마이신, 리보스타마이신, 시소마이신, 및스펙티노마이신 ), 암페니콜 (amphenicol) 계항생물질 ( 예를들면아지드암페니콜 (azidamphenicol), 클로르암페니콜, 플로르페니콜, 및티암페니콜 ), 안사마이신계항생물질 ( 예를들면리파마이드 (riphamide) 및리팜핀 ), 카르바세펨계 ( 예를들면로라카르베프 ), 카르바페넴계 ( 예를들면비아페넴및이미페넴 ), 세팔로스포린계 ( 예를들면세파클로르, 세파드록실, 세파만돌, 세파트리진, 세파제돈 (cefazedone), 세포조프란, 세프피미졸, 세프피라미드및세프피롬 ), 세파마이신계 ( 예를들면세프부페라존, 세프메타졸및세프미녹스 ), 모노박탐계 ( 예를들면아즈트레오남, 카루모남및티게모남 (tigemonam)), 옥사세펨계 ( 예를들면플로목세프및목살락탐 ), 페니실린계 ( 예를들면암디노실린 (amdinocillin), 암디노실린피복실 (amdinocillin pivoxil), 암옥시실린, 바캄피실린, 벤질페니실린산, 벤질페니실린나트륨, 에피실린, 펜베니실린, 플록사실린, 페남실린, 페네타메이트히드리오다이드 (penethamate hydriodide), 페니실린o-베네타민, 페니실린O, 페니실린V, 페니실린V벤자틴, 페니실린V히드라바민 (penicillin V hydrabamine), 페니메피시클린 (penimepicycline) 및펜시히실린 (phencihicillin) 칼륨 ), 린코사미드계 ( 예를들면클린다마이신및린코마이

94 신 ), 암포마이신, 바시트라신, 카프레오마이신, 콜리스틴, 엔듀라시딘, 엔비오마이신, 테트라사이클린계 ( 예를들면아피사이클린 (apicycline), 클로르테트라사이클린, 클로모사이클린및데메클로사이클린 ), 2,4-디아미노피리미딘계 ( 예를들면브로디모프림 (brodimoprim)) 니트로푸란계 ( 예를들면푸랄타돈및염화푸라졸륨 (furazolium chloride)), 퀴놀론및그유사체 ( 예를들면시녹사신, 클리나플록사신, 플루메퀸및그레파글록사신 (grepagloxacin)), 술폰아미드계 ( 예를들면아세틸술파메톡시피라진, 벤질술파미드, 노프릴술파미드, 프타릴술프아세토아미드, 술프아크리소이딘 (sulfachrysoidine) 및술파시틴 (sulfacytine)), 술폰계 ( 예를들면디아티모술폰 (diathymosulfone), 글루코술폰나트륨및솔라술폰 (solasulfone)), 시클로세린, 무피로신및투베린 (tuberin) 을포함한다. [0380] [0381] [0382] [0383] [0384] [0385] [0386] 특정의구체예에서는, 본발명의분자는치료상또는예방상유효한양의 1종이상의항진균제와조합시켜서투여할수있다. 본발명의분자와조합시켜서사용할수있는항진균제에는한정되는것은아니지만, 암포테리신 B, 이트라코나졸, 케토코나졸, 플루코나졸, 인트라티컬 (intrathecal), 플루시토신, 미코나졸, 부토코나졸, 클로트리마졸, 니스타틴, 테르코나졸, 티오코나졸, 시클로피록스, 에코나졸, 할로프로그린 (haloprogrin), 나프티핀, 테르비나핀, 운데실레네이트및그리세오풀빈이포함된다. 몇가지의구체예에서는, 본발명의분자는치료상또는예방상유효한양의 1종이상의항바이러스약과조합시켜서투여할수있다. 본발명의분자와조합시켜서사용할수있는유효한항바이러스약에는한정되는것은아니지만, 프로테아제저해제, 뉴클레오티드역전사효소저해제, 비뉴클레오티드역전사효소저해제및뉴클레오티드유사체가포함된다. 항바이러스약의예로서는한정되는것은는아니지만, 지도부딘, 아시클로비르, 간시클로비르, 비다라빈, 이독스우리딘, 트리플루리딘및리바비린, 및포스카르네트, 아만타딘, 리만타딘, 사퀴나비르, 인디나비르, 암프레나비르, 로피나비르, 리토나비르, α인터페론 ; 아데포비르, 클레바딘 (clevadine), 엔테카비르, 프레코나릴을들수있다 백신요법본발명은본발명의조성물을사용하여, 항원성또는면역원성물질에대한면역응답을유발하는것을추가로포함하고, 이물질로서는한정되는것은아니지만, 암항원및감염증항원 ( 이들예는후술함 ) 이포함된다. 본발명의백신조성물은 1 이상의항원성또는면역원성물질 ( 그것에대한면역응답이요구됨 ) 을포함하고, 이 1 이상의항원성또는면역원성물질은 FcγRIIIA에대한증대한친화성을갖는본발명의변이형항체에의해코트된다. 본발명의백신조성물은항원성또는면역원성물질에대한면역응답, 바람직하게는방어성면역응답을야기함에있어서특히유효하다. 몇가지의구체예에서는, 본발명의백신조성물중의항원성또는면역원성물질은바이러스 ( 그것에대한면역응답이요구됨 ) 를포함한다. 바이러스는재조합체또는키메라여도되고, 바람직하게는약독화되어있다. 재조합체, 키메라, 및약독화바이러스의생산은당업자에공지된표준적인수법을사용하여행할수있다. 본발명은본발명에따라제제화되는생재조합바이러스백신또는불활화재조합바이러스백신을포함한다. 생백신이바람직하고, 왜냐하면숙주내에서의복제가자연스러운감염으로일어나는것과동종또한동일한정도의지속적인자극을초래하고, 따라서충분하고장기적인면역을부여하기때문이다. 그러한생재조합바이러스백신제제의생산은세포배양물또는닭배뇨막중에서의바이러스증식과, 그것에계속되는정제를포함하는종래의방법을사용하여달성할수있다. 구체적인구체예에서는, 재조합바이러스는그것이투여되는피험자에대하여비병원성의것이다. 이것에관하여, 백신용으로유전자조작바이러스를사용하기위해서는, 이들바이러스주가약독화특성을가질필요가있다. 트랜스펙션에사용하는주형에적당한돌연변이 ( 예를들면결실 ( 缺失 )) 를도입하면, 약독화특성을갖는신규바이러스가얻어진다. 예를들면온도감수성또는한랭적응에관련되는특정의미스센스돌연변이를결실돌연변이중에도입할수있다. 이들돌연변이는한랭또는온도감수성변이체에관련되는점돌연변이보다안정적일것이며, 복귀돌연변이의빈도가매우낮을것이다. 재조합바이러스를제작하기위한재조합 DNA 기술은당기술분야에서공지이며, 본발명에포함된다. 예를들면부쇄 RNA 바이러스의개변을위한기술이당기술분야에있어서공지이며, 예를들면미국특허제5,166,057호를참조한다 ( 그전문을참조로서본명세서에편입시킨다 ). 또 자살 특성을갖는키메라바이러스가본발명의피내백신제제에서의사용을위해구축될수있다. 그러한바이러스는숙주내에서불과 1회내지수회의복제밖에행하지않는다. 백신으로서사용했을때에는, 재조합바이러스는한정된복제사이클을행하고, 충분한레벨의면역응답을유발하지만, 인간숙주중에서추가로복제사이클을행하여병을야기하는일은없다. 또불활화 ( 사멸 ) 바이러스를본발명에따라서제제화할수있

95 다. 불활화백신제제는키메라바이러스를 사멸시키기 위한종래의방법을사용해서조제하는것이가능하다. 불활화백신은그감염성이파괴되어있다는의미로 죽어있다. 이상적으로는바이러스의감염성이그면역원성을손상시키지않고파괴된다. 불활화백신을조제하기위해서는, 키메라바이러스를세포배양물또는닭배뇨막중에서증식시켜, 존초원심에의해정제하고, 포름알데히드또는 β-프로피오락톤에의해불활화해서풀한다. [0387] [0388] [0389] [0390] [0391] [0392] [0393] [0394] 특정의구체예에서는, 완전히외래성의에피토프 ( 다른바이러스성또는비바이러스성병원체에유래하는항원을포함함 ) 가본발명의피내백신제제에사용하기위한바이러스로유전자공학적으로조작된다. 예를들면 HIV(gp160, gp120, gp41) 와같은비관련바이러스의항원, 기생충항원 ( 예를들면말라리아 ), 세균또는진균항원또는종양항원을조작하여약독화주로할수있다. 사실상모든이종유전자서열이피내백신제제로사용하기위한본발명의키메라바이러스로구축될수있다. 바람직하게는, 이종유전자서열은생물학적응답의개변인자로서작용하는부분또는펩티드이다. 바람직하게는, 여러가지병원체중어느하나에대하여방어성면역응답을야기하는에피토프, 또는중화항체에결합하는항원이키메라바이러스에의해또는그일부로서발현된다. 예를들면본발명의키메라바이러스에구축될수있는이종유전자서열은한정되는것은아니지만, 인플루엔자및파라인플루엔자의혈구응집소, 뉴라미니다아제및융합당단백질 ( 예를들면인간 PIV3의 HN 및 F유전자 ) 을포함한다. 또다른구체예에서는, 키메라바이러스로조작할수있는이종유전자서열에는면역조절활성을갖는단백질을코드하는것이포함된다. 면역조절단백질의예로서는, 한정되는것은아니지만, 사이트카인, I형인터페론, γ인터페론, 콜로니자극인자, 인터류킨 -1, -2, -4, -5, -6, -12 및이들물질의안타고니스트가포함된다. 또다른구체예에서는, 본발명은변이형항체를표면에발현하는병원성세포또는바이러스, 바람직하게는약독화바이러스를포함한다. 대체적인구체예에서는, 본발명의백신조성물은항원성또는면역원성물질이 FcγRIIIA에대한증대한친화성을갖는본발명의변이형항체와기능적으로연결되어있는융합폴리펩티드를포함한다. 본발명의백신조성물에사용하기위한융합폴리펩티드의조작은관례적인재조합 DNA 기술의방법을사용해서행해지고, 통상의기능의범위내이다. 본발명은본발명의조성물을투여함으로써, 피험자에있어서면역관용을유발하는방법을추가로포함한다. 바람직하게는, 피험자에있어서면역관용을유발하기에적합한조성물은본발명의변이형항체에의해코트된항원성또는면역원성물질을포함하고, 그때, 이변이형항체는 FcγRIIB에대하여보다높은친화성을갖는것이다. 특정의작용기구에구속되는것을의도하지않지만, 그러한조성물은 FcγRIIB를통한저해경로를활성화함으로써면역관용을유발하는데유효하다 조성물및투여방법본발명은복수의에피토프결합도메인및임의로 Fc도메인 ( 또는그일부 ) 을포함하는본발명의분자 ( 즉디아바디 ) 를포함하여이루어지는방법및의약조성물을제공한다. 본발명은또질환, 장애또는감염에관련된 1 이상의증상을치료, 예방, 및개선하는방법으로서, 피험자에유효한양의본발명의융합단백질또는콘쥬게이트분자, 또는본발명의융합단백질또는콘쥬게이트분자를포함하는의약조성물을투여하는것에의한상기방법을또한제공한다. 바람직한구체예에서는, 항체, 융합단백질, 또는콘쥬게이트분자는실질적으로정제되어있다 ( 즉, 그효과를한정하거나또는바람직하지않은부작용을발생시키는물질을실질적으로포함하지않는다 ). 구체적인구체예에서는, 피험자는동물, 바람직하게는포유동물, 예를들면비영장류 ( 예를들면소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트등 ) 및영장류 ( 예를들면원숭이, 예를들면게잡이원숭이및인간 ) 이다. 바람직한구체예에서는피험자는인간이다. 또다른바람직한구체예에서는, 본발명의항체는피험자와동일한생물종에유래하는것이다. 여러가지송달계가알려져있고, 본발명의분자를포함하는조성물을투여하기위해서이용할수있지만, 예를들면리포솜, 미립자, 마이크로캡슐내로의봉입, 항체또는융합단백질을발현할수있는재조합세포, 수용체개재엔도시토시스 ( 예를들면 Wu et al.(1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem. 262: 를참조 ), 레트로바이러스또는다른벡터의일부로서의핵산의구축등이있다. 본발명의분자를투여하는방법에는한정되는것은아니지만, 비경구투여 ( 예를들면피내, 근육내, 복강내, 정맥내및피하 ), 경막외, 및점막 ( 예를들면비강내및구강경로 ) 이포함된다. 구체적인구체예에서는, 본발명의분자를근육내, 정맥내, 또는피하에투여한다. 조성물을임의의편리한경

96 로에의해, 예를들면주입또는볼루스주사에의해, 상피또는피부점막내층 ( 예를들면구강점막, 직장및장관점막등 ) 을통한흡수에의해투여해도되고, 다른생물학적활성약제와함께투여해도된다. 투여는전신적이어도국소적이어도된다. 또한, 예를들면흡입기또는분무기의사용에의해, 및에어로졸화제를사용하는제제화에의해폐투여를채용할수도있다. 예를들면미국특허제6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; 및 4,880,078호 ; 및 PCT 공개 WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; 및 WO 99/66903을참조하길바란다 ( 이들각각의전체를참조로서본명세서에편입시킨다 ). [0395] [0396] [0397] [0398] [0399] [0400] [0401] 본발명은또본발명의분자를밀폐용기 ( 예를들면앰플또는작은봉투 ) 중에패키징하여, 항체의양을표시하는것을제공한다. 일구체예에서는, 본발명의분자를건조한무균동결건조분말또는무수농축물로서밀폐용기에넣어서공급하고, 그리고예를들면물또는생리식염수를사용해서피험자에투여하기위한적당한농도로재조제한다. 바람직하게는, 본발명의분자를건조한무균동결건조분말또는무수농축물로서밀폐용기에넣고, 적어도 5mg, 더욱바람직하게는적어도 10mg, 적어도 15mg, 적어도 25mg, 적어도 35mg, 적어도 45mg, 적어도 50mg, 또는적어도 75mg의단위용량으로공급한다. 동결건조한본발명의분자는그원래의용기내에서 2~8 사이에서저장해야하며, 또한이분자는재조제한후 12시간이내, 바람직하게는 6시간이내, 5시간이내, 3시간이내, 또는 1시간이내에투여해야한다. 대체적인구체예에서는, 본발명의분자를액제로서밀폐용기에넣고, 이분자, 융합단백질, 또는콘쥬게이트분자의양및농도를표시해서공급한다. 바람직하게는, 본발명의분자의액제를밀폐용기에넣고, 적어도 1mg/ml, 더욱바람직하게는적어도 2.5mg/ml, 적어도 5mg/ml, 적어도 8mg/ml, 적어도 10mg/ml, 적어도 15mg/ml, 적어도 25mg/ml, 적어도 50mg/ml, 적어도 100mg/ml, 적어도 150mg/ml, 적어도 200mg/ml의이분자로공급한다. 질환에관련된 1 이상의증상을치료, 예방또는개선하기위해서유효할수있는본발명의조성물의양은표준적인임상기술에의해결정할수있다. 제제중에서사용하는정확한용량은또투여경로나병상의위독한정도에도좌우되며, 의사의판단및각환자의상황에따라결정해야한다. 유효한용량을 in vitro 또는동물모델시험계로부터유도한용량-응답곡선으로부터추정할수있다. 본발명에의해포함되는디아바디의경우, 환자에게투여되는투여량은전형적으로는 mg/kg~100mg/kg ( 환자의체중 ) 이다. 바람직하게는, 환자에게투여되는용량은 mg/kg~20mg/kg, mg/kg~10mg/kg, mg/kg~5mg/kg, ~2mg/kg, ~1mg/kg, mg/kg~0.75mg/kg, mg/kg~0.5mg/kg, mg/kg~0.25mg/kg, ~0.15mg/kg, ~0.10mg/kg, 0.001~0.5mg/kg, 0.01~0.25mg/kg 또는 0.01~0.10mg/kg이다. 본발명의디아바디의투여량과빈도는예를들면리피드화등의수식에의해디아바디의받아들임및조직침투를증강함으로써, 저감또는변경할수있다. 일구체예에서는, 환자에게투여되는본발명의분자의투여량은단일제 ( 團劑 ) 요법으로서사용할때 0.01mg~ 1000mg/ 일이다. 다른구체예에서는, 본발명의분자를다른치료용조성물과함께사용하여, 환자에게투여되는투여량을상기분자를단제요법으로서사용할때보다낮게한다. 특정의구체예에서는, 본발명의의약조성물을치료가필요한부위에국소투여하는것이바람직하다. 이것은예를들면한정되는것은아니지만, 국소주입에의해, 주사에의해, 또는시알라스틱 (sialastic) 멤브레인등의멤브레인또는섬유를포함하는다공질, 비다공질, 또는젤라틴상태의재료로이루어지는이식편을사용해서달성할수있다. 바람직하게는, 본발명의분자를투여할때, 이분자가흡수되지않는재료를사용하도록주의해야한다. 다른구체예에서는, 조성물을소포, 특히리포솜에넣어서송달할수있다 (Langer(1990) "New Methods Of Drug Delivery," Science 249: ;Treat 외 감염증과암의치료법에있어서의리포솜 (Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer), Lopez-Berestein and Fidler( 편 ), Liss, New York, pp (1989);lopez-berestein, 전술, pp 을참조하길바란다 ; 일반적으로는전술을참조 ). 또다른구체예에서는, 조성물을제어방출또는지속방출시스템으로송달할수있다. 본발명의 1종이상의분자를포함하는지속방출제제를만들기위해서, 당업자에공지된어떠한기술을사용해도된다. 예를들면미국특허제4,526,938호 ; PCT 공개 WO 91/05548; PCT 공개 WO 96/20698; Ning 외, 1996, 지속방출겔을사용한인간대장암이종이식편의종양내방사선면역요법 (Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel) Radiotherapy & Oncology 39: , Song 외, 1995, 장순환에멀전의항체를통한폐타겟팅 (Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions ) PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: ; Cleek 외, 1997, 심혈관적용을위

97 한 bfgf 항체에대한생물분해성폴리머담체 (Biodegradable Polymeric Carriers for a bfgf Antibody for Cardiovascular Application) Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater.24: ; 및 Lam 외, 1997, 국소송달을위한재조합인간화단일클론항체의마이크로캡슐화 (Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery) Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater.24: 을참조 ( 각각의전체를참조로서본명세서에편입시킨다 ). 일구체예에서는, 펌프를제어방출시스템에서사용할수있다 (Langer, 전술 ; Sefton, (1987) "Implantable Pumps," CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14: ; Buchwald et al.(1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis," Surgery 88: ; and Saudek et al.(1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery," N. Engl. J. Med. 321 : 를참조 ). 다른구체예에서는, 폴리머재료를사용해서항체의제어방출을달성할수있다 ( 예를들면 Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise(eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida(1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball(eds.), Wiley, New York(1984); Levy et al.(1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate," Science 228: ; During et al.(1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization," Ann. Neural. 25: ; Howard et al.(1989) "Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits," J. Neurosurg. 7(1): 참조 ); 미국특허제5,679,377호 ; 미국특허제5,916,597호 ; 미국특허제5,912,015호 ; 미국특허제5,989,463호 ; 미국특허제5,128,326호 ; PCT 공개 WO 99/15154; 및 PCT 공개 WO 99/20253을참조 ). 지속방출제제에사용되는폴리머의예로서는, 한정되는것은아니지만, 폴리 (2-히드록시에틸메타크릴레이트 ), 폴리 ( 메틸메타크릴레이트 ), 폴리 ( 아크릴산 ), 폴리 ( 에틸렌 -코-아세트산비닐), 폴리 ( 메타크릴산 ), 폴리글리코리드 (PLG), 폴리산무수물, 폴리 (N-비닐피롤리든), 폴리 ( 비닐알코올 ), 폴리아크릴아미드, 폴리 ( 에틸렌글리콜 ), 폴리락티드 (PLA), 폴리 ( 락티드-코-글리콜리드 )(PLGA), 및폴리오르토에스테르를들수있다. 또다른구체예에서는, 제어방출시스템을치료표적 ( 예를들면폐 ) 의근방위치에배치함으로써전신용량의일부밖에필요없도록할수있다 ( 예를들면 Goodson, 제어방출의의료상의응용 (Medical Applications of Controlled Release), 전술, vol.2, pp (1984) 을참조 ). 다른구체예에서는, 제어방출이식편으로서유용한폴리머조성물이 Dunn 외 ( 미국특허제5,945,155호를참조 ) 에따라사용된다. 이특정의방법은폴리머계로부터의생물활성물질의 in situ 제어방출의치료효과에기초한다. 이식은일반적으로치료처치를필요로하는환자체내의어떠한장소에서행해도된다. 다른구체예에서는비폴리머계의지속송달시스템이사용되지만, 이경우에는피험자체내의비폴리머이식편이약품송달시스템으로서사용된다. 체내에이식하면, 이식편의유기용매가, 이조성물로부터주위조직액중에산일, 분산또는침출하여, 비폴리머재료가서서히응집또는침강하고, 고체의미공질매트릭스를형성한다 ( 미국특허제5,888,533호를참조 ). [0402] [0403] 제어방출시스템은 Langer에의한문헌 (1990, "New Methods Of Drug Delivery," Science 249: ) 에서술되어있다. 본발명의 1종이상의치료약을포함하는지속방출제제를만들기위해서, 당업자에공지된어느기술을사용해도된다. 예를들면미국특허제4,526,938호 ; 국제공개 WO 91/05548 및 WO 96/20698; Ning et al.(1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained- Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39: , Song et al.(1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: ; Cleek et al.(1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bfgf Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. ReI. Bioact. Mater. 24: ; and Lam et al.(1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control ReI. Bioact. Mater. 24: 을참조 ( 각각의전체를참조로서본명세서에편입시킨다 ). 구체적인구체예에서는, 본발명의조성물이본발명의디아바디를코드하는핵산인경우, 이것을적당한핵산발현벡터의일부로서구성하고, 그것이세포내에받아들여지도록이것을투여함으로써, 그코드화된디아바디의발현을촉진시키기위해서이핵산을 in vivo로투여할수있다. 세포내로받아들여지는것은, 예를들면레트로바이러스벡터를사용함으로써 ( 미국특허제4,980,286호를참조 ), 또는직접주사에의해, 또는미립자충돌 ( 예를들면유전자총 ; Biolistic, Dupont) 에의해, 또는지질, 세포표면수용체또는트랜스펙트시약으로코팅함으로써, 또는핵에침입하는것이알려져있는호메오박스유사펩티드와연결해서투여하거나 ( 예를들면 Joliot et al.(1991) "Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 을참조 ) 함으로써행한다. 또핵산을세포내에도입하여, 상동적재조합에의해발현을

98 위해숙주세포 DNA 내에편입시킬수있다. [0404] [0405] [0406] [0407] [0408] [0409] [0410] [0411] [0412] [0413] [0414] 치료상또는예방상유효한양의본발명의분자를사용하는피험자의치료는, 단회치료여도되지만, 바람직하게는일련의치료를포함한다. 바람직한예에있어서는, 약 0.1~30mg/kg( 체중 ) 의본발명의분자를사용하여, 주 1회, 약 1~10주간에걸쳐, 바람직하게는약 2~8주간에걸쳐, 더욱바람직하게는약 3~7주간에걸쳐, 한층더바람직하게는약 4, 5, 또는 6주간에걸쳐피험자를치료한다. 다른구체예에서는, 본발명의의약조성물을 1일 1회, 1일 2회, 또는 1일 3회투여한다. 다른구체예에서는, 의약조성물을주 1회, 주 2회, 2주마다 1회, 월 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 연 2회또는연 1회투여한다. 치료에사용하는분자의유효투여량이특정의치료기간을통해서증가하거나감소하거나하는것도또한이해하길바란다 의약조성물본발명의조성물은의약조성물의제조에유용한벌크약조성물 ( 예를들면불순한또는비멸균의조성물 ) 및단위투여제형의조제에이용할수있는의약조성물 ( 즉, 피험자또는환자에투여하기에적합한조성물 ) 을포함한다. 그러한조성물은예방상또는치료상유효한양의본명세서중에개시한예방약및 / 또는치료약또는그들약제의조합과, 제약상허용할수있는담체를포함한다. 바람직하게는본발명의조성물은예방상또는치료상유효한양의 1종이상의본발명의분자및제약상허용되는담체를포함한다. 본발명은또본발명의디아바디분자와, 특정의암항원에특이적인치료용항체 ( 예를들면종양특이적단일클론항체 ) 와, 제약상허용되는담체를포함하는의약조성물을포함한다. 특정의구체예에있어서, 약학적으로허용할수있다 는용어는, 동물, 특히인간에서의사용에대해서, 연방정부또는주정부의규제당국에의해인가되었거나또는미국약국방또는다른일반적으로인정된약국방에개제된것을의미한다. 담체 라는용어는치료약이그들과함께투여되는희석제, 애쥬번트 ( 예를들면프로인트애쥬번트 ( 완전및불완전 )), 부형제, 또는비히클을의미한다. 이와같은제약상의담체는물이나기름등의무균액체여도되고, 석유, 동물, 식물또는합성기원의것, 예를들면피너츠유, 대두유, 광유, 참기름등을포함한다. 의약조성물을정맥내투여할때물은바람직한담체이다. 생리식염수및수성덱스트로스및글리세롤수용액은특히주사액용의액상담체로서이용할수있다. 적합한제약상의부형제는전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 소맥분, 초크, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 모노스테아르산글리세롤, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 물, 에탄올등을포함한다. 필요하면조성물은또소량의습윤제또는유화제, 또는 ph 완충제를함유해도된다. 이들조성물은용액, 현탁액, 유화액, 정제, 환약, 캡슐제, 분제, 지속방출제제등의제형을취할수있다. 일반적으로, 본발명의조성물의성분은각각또는함께혼합해서단위투여제형으로, 예를들면건조한동결건조분말또는무수농축물로서, 밀폐용기, 예를들면앰플또는작은봉투에넣고, 활성약제의양을표시해서공급된다. 조성물을주입에의해투여하는경우에는, 약품급의멸균수또는생리식염수를함유하는주입보틀을사용해서조제해도된다. 조성물을주사에의해투여하는경우에는, 무균의주사용수또는생리식염수의앰플을제공하여, 제성분이투여전에혼합되도록할수있다. 본발명의조성물을중성또는염형태로서제제화해도된다. 제약상허용할수있는염으로서는, 한정되는것은아니지만, 예를들면염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산등으로부터유도되는음이온에의해형성된염, 및나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인등으로부터유도된양이온에의해형성된염이포함된다 유전자치료특정의구체예에서는, 본발명의분자를코드하는서열을포함하는핵산을투여함으로써, 유전자치료를사용해서질환, 장애, 또는감염에관련된 1 이상의증상을치료, 예방, 또는개선한다. 유전자치료는발현되는또는발현가능한핵산을피험자에투여함으로써행해지는치료를의미한다. 본발명의본구체예에서는핵산이치료또는예방효과를매개하는그코드화항체또는융합단백질을생산한다. 당기술분야에서이용할수있는어느유전자치료법도본발명에따라서사용할수있다. 대표적인방법을이하에기재한다. 유전자치료법의일반적총괄에대해서는, Goldspiel et al.(1993) "Human Gene Therapy," Clinical Pharmacy 12: ; Wu et al.(1991) "Delivery Systems For Gene Therapy," Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev(1993,) "Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions," Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:

99 596; Mulligan(1993) "The Basic Science Of Gene Therapy," Science 260: ; and Morgan et al.(1993) "Human Gene Therapy," Ann. Rev. Biochem. 62 : 를참조. 이용할수있는재조합 DNA 기술의기술분야에서공지된방법은 Ausubel et al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1993); 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual. Stockton Press, NY(1990) 에기재되어있다. [0415] [0416] [0417] [0418] [0419] 바람직한구체예에서는, 본발명의조성물은본발명의디아바디를코드하는핵산을포함하고, 이핵산은적합한숙주내에서항체를발현하는발현벡터의일부이다. 특히, 이와같은핵산은항체코드영역과기능적으로연결된프로모터, 바람직하게는이종프로모터를갖고, 상기프로모터는유도성, 구성적, 경우에따라서는조직특이적인것일수있다. 다른특정의구체예에서는, 항체코드서열및다른원하는서열이게놈내의원하는부위에서의상동적재조합을촉진하는영역에의해끼워져있고, 그결과로서항체를코드하는핵산의염색체내발현을초래하는것같은핵산분자가사용된다 (Koller et al.(1989) "Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: ; 및 Zijlstra et al.(1989) "Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta 2 -Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells," Nature 342: ). 다른바람직한구체예에서는, 본발명의조성물은융합단백질을코드하는핵산을포함하고, 상기핵산은적합한숙주에있어서융합단백질을발현하는발현벡터의일부분이다. 특히, 이와같은핵산은융합단백질의코드영역과기능적으로연결된프로모터, 바람직하게는이종프로모터를갖고, 상기프로모터는유도성, 구성적, 경우에따라서는조직특이적인것일수있다. 다른특정의구체예에서는, 융합단백질의코드서열및다른원하는서열이게놈내의원하는부위에서의상동적재조합을촉진하는영역에의해끼워져있고, 그결과로서, 융합단백질을코드하는핵산의염색체내발현을초래하는것같은핵산분자가사용된다. 핵산의피험자에대한송달은직접적 ( 이경우에는피험자를핵산또는핵산담지벡터에직접노출 ) 또는간접적 ( 이경우에는세포를먼저핵산으로 in vitro로형질전환하고, 다음에피험자에이식 ) 의어느쪽이어도된다. 이들 2개의수법은각각 in vivo 또는 ex vivo 유전자치료로서알려져있다. 특정의구체예에서는, 핵산서열을직접 in vivo로 ( 거기서발현되어, 코드된산물을초래함 ) 투여한다. 이것은당기술분야에서공지된다수의방법중어느하나에의해, 예를들면그것을적당한핵산발현벡터의일부로서구축하고, 그것을세포내에받아들여지도록투여함으로써실시할수있다. 이와같은받아들임은예를들면결손또는약독화레트로바이러스또는다른벡터를사용한감염에의해 ( 미국특허제4,980,286호를참조 ), 또는 DNA 그대로의직접주입에의해, 또는미립자밤바드먼트 ( 예를들면유전자총 ;Biolistic, Dupont) 에의해, 또는지질또는세포표면수용체또는트랜스펙션시약의코팅에의해, 또는리포솜, 미립자, 또는마이크로캡슐내로의봉입에의해, 또는핵에침입하는것이알려진펩티드와그들을연결해서투여함으로써, 수용체개재엔도시토시스를받는항원과연결해서투여함으로써 ( 예를들면 Wu et al.(1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem. 262: 를참조 )( 이방법은수용체를특이적으로발현하는세포형을표적으로하기위해서사용됨 ) 실시할수있다. 다른구체예에서는, 핵산-항원복합체 ( 이항원은엔도솜을파괴하는융합성바이러스펩티드를포함함 ) 를형성시켜, 핵산의리소좀분해를회피시킬수있다. 또다른구체예에서는, 핵산은특이적수용체를표적으로함으로써, in vivo로세포특이적인받아들임및발현으로목표를정할수있다 ( 예를들면 PCT 공개 WO 92/06180; WO 92/22635; W0 92/20316; W0 93/14188; WO 93/20221을참조 ). 또핵산은세포내에도입하여, 상동적재조합에의해, 발현을위해숙주세포 DNA내에편입시킬수있다 (Koller et al.(1989) "Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: ; 및 Zijlstra et al.(1989) "Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta 2 -Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells," Nature 342: ). 특정의구체예에서는, 본발명의분자 ( 예를들면디아바디또는융합단백질 ) 을코드하는핵산서열을함유하는바이러스벡터가사용된다. 예를들면레트로바이러스벡터를이용할수있다 (Miller et al.(1993) "Use Of Retroviral Vectors For Gene Transfer And Expression," Meth. Enzymol. 217: 를참조 ). 이들레트로바이러스벡터는바이러스게놈의올바른패키징및숙주세포 DNA중으로의편입을위해필요한성분을함유한다. 유전자치료에이용하는항체또는융합단백질을코드하는핵산서열은 1 이상의벡터중에클로닝되어, 이것에의해뉴클레오티드서열의피험자에대한송달이용이해진다. 레트로바이러스벡터에대해더욱상세한것은 Boesen 외 ((1993) "Circumvention Of Chemotherapy-Induced Myelosuppression By Transfer Of The Mdrl Gene," Biotherapy 6: ) 에서찾아볼수있고, 이것은화학요법에의해내성이있는조혈간세포를

100 만들목적으로 mdr 1유전자를간세포로송달하기위한레트로바이러스벡터의사용을기재한다. 유전자치료에있어서의레트로바이러스벡터의사용을설명하는다른참고문헌에는이하의것이있다 : Clowes et al.(1994) "Long-Term Biological Response Of Injured Rat Carotid Artery Seeded With Smooth Muscle Cells Expressing Retrovir ally Introduced Human Genes," J. Clin. Invest. 93: ; Keim et al.(1994) "Retrovirus-Mediated Gene Transduction Into Canine Peripheral Blood Repopulating Cells," Blood 83: ; Salmons et al.(1993) "Targeting Of Retroviral Vectors For Gene Therapy," Human Gene Therapy 4: ; 및 Grossman et al.(1993) "Retroviruses: Delivery Vehicle To The Liver," Curr. Opin. Genetics and Devel. 3: [0420] [0421] [0422] [0423] [0424] [0425] 아데노바이러스는유전자치료에이용할수있는다른바이러스벡터이다. 아데노바이러스는유전자를호흡기상피에송달하는운반체로서특히흥미를자아낸다. 아데노바이러스는원래호흡기상피에감염하여경도의질환을야기한다. 아데노바이러스에기초하는송달계의다른표적은간장, 중추신경계, 내피세포, 및근육이다. 아데노바이러스는분열하지않는세포에감염할수있으므로유리하다. Kozarsky et al.(1993,"gene Therapy: Adenovirus Vectors," Current Opinion in Genetics and Development 3: ) 은아데노바이러스에기초하는유전자치료법의총설을알리고있다. Bout 외 (1994, "Lung Gene Therapy: In Vivo Adenovirus-Mediated Gene Transfer To Rhesus Monkey Airway Epithelium," Human Gene Therapy, 5:3-10) 는유전자를붉은털원숭이의호흡기상피에도입하기위한아데노바이러스벡터의이용을실증했다. 유전자치료에있어서의아데노바이러스의이용의다른예는, Rosenfeld et al.(1991) "Adenovirus-Mediated Transfer Of A Recombinant Alpha I- Antitrypsin Gene To The Lung Epithelium In Vivo," Science 252: ; Rosenfeld et al.(1992) "In Vivo Transfer Of The Human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene To The Airway Epithelium," Cell 68: ; Mastrangeli et al.(1993) "Diversity Of Airway Epithelial Cell Targets For In Vivo Recombinant Adenovirus-Mediated Gene Transfer," J. Clin. Invest. 91 : ; PCT 공개 W094/12649; 및 Wang et al.(1995) "A Packaging Cell Line For Propagation Of Recombinant Adenovirus Vectors Containing Two Lethal Gene-Region Deletions," Gene Therapy 2: 에서찾아볼수있다. 바람직한구체예에서는아데노바이러스벡터가사용된다. 아데노수반바이러스 (AAV) 도유전자치료에있어서의이용이제안되어있다 ( 예를들면 Walsh et al.(1993) "Gene Therapy For Human Hemoglobinopathies," Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 및미국특허제 5,436,146호를참조 ). 유전자치료에대한다른어프로치는일렉트로포레이션, 리포펙션, 인산칼슘을통한트랜스펙션, 또는바이러스감염등의방법에의해, 조직배양물중의세포에유전자를도입하는것을포함한다. 통상, 도입의방법은선택마커의세포로의도입을포함한다. 다음에세포를선택에제공하여, 회수하고, 또한도입한유전자를발현하는세포를단리한다. 다음에그들세포를피험자에송달한다. 이구체예에서는, 핵산을세포중에도입한후에, 얻어지는재조합세포를 in vivo 투여한다. 이와같은도입은당기술분야에서공지된어떠한방법, 예를들면한정되는것은아니지만, 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션, 핵산서열을함유하는바이러스또는박테리오파지벡터를사용하는감염, 세포융합, 염색체를통한유전자도입, 미소세포를통한유전자도입 (microcell mediated gene transfer), 스페로플라스트융합등에의해실시할수있다. 외래유전자를세포중에도입하기위한다수의기술은당기술분야에서공지이며 ( 예를들면 Loeffler et al.(1993) "Gene Transfer Into Primary And Established Mammalian Cell Lines With Lipopolyamine-Coated DNA," Meth. Enzymol. 217: , Cotten et al.(1993) "Receptor-Mediated Transport Of DNA Into Eukaryotic Cells," Meth. Enzymol. 217: 참조 ), 수용세포의필요한발생적및생리학적기능이파괴되지않는것을조건으로하여본발명에따라서이용할수있다. 그기술은핵산의세포에대한안정적인도입을제공하여, 그것에의해핵산이세포에의해발현가능하게되고, 그리고바람직하게는그세포자손에게유전되고또한발현될수있는것이어야한다. 얻어지는재조합세포는당기술분야에서공지된여러가지방법에의해피험자에송달할수있다. 재조합혈액세포 ( 예를들면조혈간세포또는전구세포 ) 는바람직하게는정맥내에투여된다. 사용을위해상정되는세포량은원하는효과, 환자의상태등에의존하여, 당업자가결정하는것이가능하다. 유전자치료의목적으로핵산이도입되는세포는모든원하는입수가능한세포형을포함하고, 한정되는것은아니지만, 상피세포, 내피세포, 케라티노사이트, 섬유아세포, 근육세포, 간세포 ; 혈액세포, 예를들면 T림프구, B림프구, 단구, 마크로파지, 호중구, 호산구, 거핵구, 과립구 ; 여러가지간세포또는전구세포, 특히조혈간세

101 포또는전구세포, 예를들면골수, 제대혈, 말초혈, 태아간등으로부터얻어지는것을포함한다. [0426] [0427] [0428] [0429] [0430] [0431] [0432] [0433] [0434] [0435] 바람직한구체예에서는, 유전자치료에사용되는세포는피험자자신에유래하는것이다. 재조합세포를유전자치료에사용하는구체예에서는, 항체또는융합단백질을코드하는핵산서열을세포중에도입하여, 그들이이세포또는그자손에의해발현되도록하고, 다음에그재조합세포를치료효과를위해 in vivo로투여한다. 구체적인구체예에서는, 간세포또는전구세포를사용한다. 분리가능하며 in vitro에서유지할수있는간세포및 / 또는전구세포는어느것이나본발명의이구체예에따라서이용할수있을가능성이있다 ( 예를들면 PCT 공개 WO 94/08598; Stemple et al.(1992) "Isolation Of A Stem Cell For Neurons And GHa From The Mammalian Neural Crest," Cell 7 1 : ; Rheinwald(1980) "Serial Cultivation Of Normal Human Epidermal Keratinocytes," Meth. Cell Bio. 21A: ; 및 Pittelkow et al.(1986) "New Techniques For The In Vitro Culture Of Human Skin Keratinocytes And Perspectives On Their Use For Grafting Of Patients With Extensive Burns," Mayo Clinic Proc. 61 : 을참조 ). 특정의구체예에서는, 유전자치료의목적으로도입되는핵산은코드영역과기능적으로연결된유도성프로모터를포함하고, 그것에의해적당한전사유도물질의존재또는부재를제어함으로써핵산의발현이제어가능하게된다 키트본발명은본발명의분자를충전한 1 이상의용기를포함하는의약팩또는키트를제공한다. 또한, 질환의치료에유용한 1 이상의다른예방또는치료약을의약팩또는키트중에포함시켜도된다. 본발명은또본발명의의약조성물의 1 이상의성분을충전한 1 이상의용기를포함하는의약팩또는키트도포함한다. 경우에따라서는, 이와같은용기에의약또는생물학적제품의제조, 사용또는판매를규제하는정부당국이지시한형식으로, 인간투여를위한제조, 사용또는판매의행정당국에의한인가를반영하는주의서를첨부해도된다. 본발명은상기한방법에서사용할수있는키트를제공한다. 일구체예에서는, 키트는 1 이상의본발명의분자를포함한다. 다른구체예에서는, 키트는또한 1 이상의용기중에암의치료에유용한 1 이상의다른예방또는치료약을포함한다. 다른구체예에서는, 키트는또한암에관련된 1 이상의암항원과결합하는 1 이상의세포상해성항체를포함한다. 어떠한구체예에서는, 다른예방또는치료약은화학요법제이다. 다른구체예에서는, 예방또는치료약은생물학적또는호르몬치료약이다 치료상의유용성의특징및검증인간에게사용하기전에, 본발명의의약조성물, 예방또는치료약의몇가지구체예는, 바람직하게는, in vitro 에서, 세포배양계에서, 및동물모델생물에서, 예를들면치류동물모델계에서, 원하는치료활성에대해서시험된다. 예를들면특정의의약조성물의투여가적절한것인지를확인하는데사용할수있는분석은세포배양분석을포함하고, 이분석에있어서는, 환자조직샘플을배양으로증식시켜, 본발명의의약조성물에노출시키거나또는다른방법으로접촉시키고, 그리고조직샘플에대한이조성물의효과를관찰한다. 조직샘플은환자로부터의생검에의해얻을수있다. 이시험에의해, 개개의환자에대하여치료상가장유효한예방또는치료분자를동정할수있다. 여러가지구체적구체예에서는 in vitro 분석을자기면역질환또는염증성질환에관계된세포형의대표적세포 ( 예를들면 T세포 ) 를사용해서실시하고, 본발명의의약조성물이그러한세포형에대하여원하는효과를나타내는지를확인할수있다. 예방약및 / 또는치료약의조합은인간에게사용하기전에, 적당한동물모델계에서시험할수있다. 이와같은동물모델계로서는한정되는것은아니지만, 래트, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 돼지, 개, 토끼등을들수있다. 당기술분야에서주지된어느동물계를사용해도된다. 본발명의구체적인구체예에서는, 예방및 / 또는치료약의조합은마우스모델계에서시험한다. 이와같은모델계는널리사용되고있으며, 당업자에게주지이다. 예방및 / 또는치료약은반복해서투여할수있다. 수순의몇가지양상은다양할수있다. 이러한양상에는예방및 / 또는치료약의투여의시간적관리, 및이와같은약제를따로따로투여하는것인지혼합물로서투여하는것인지가포함된다. 본발명의방법에사용하는바람직한동물모델은예를들면마우스이펙터세포상에 FcγR을발현하는트랜스제닉마우스이며, 예를들면미국특허제5,877,396호 ( 그전체를참조로서본명세서에편입시킨다 ) 에기재된어느하나의마우스모델을본발명에사용할수있다. 본발명의방법에사용하는트랜스제닉마우스로서는한정되는것은아니지만, 인간 FcγRIIIA를보유하는마우스 ; 인간 FcγRIIA를보유하는마우스 ; 인간 FcγRIIB 및인간 FcγRIIIA를보유하는마우스 ; 인간 FcγRIIB 및인간 FcγRIIA를보유하는마우스를들수있다. 바람

102 직하게는상기한기능적분석에있어서최고레벨의활성을나타낸변이를인간에서의사용에앞서동물모델연구에서의사용에대해서시험한다. 충분량의항체는상기한방법을사용하여, 동물모델에서의사용을위해조제하는것이가능하며, 예를들면본명세서에개시되어예시되는포유류발현시스템및정제법을사용해서조제할수있다. [0436] 마우스이종이식모델을사용하여, 종양특이적표적에대해서제작된마우스항체의효력을본발명의디아바디분자의에피토프결합도메인의친화성과특이성, 및면역응답을끌어내는디아바디의능력에기초하여시험할수있다 (Wu et al.(2001) "Mouse Models For Multistep Tumorigenesis," Trends Cell Biol. 11 : S2-9). 마우스이펙터세포상에인간 FcγR을발현하는트랜스제닉마우스는유니크하며, 인간 Fc-FcγR 상호작용의효력을시험하기위한테일러메이드동물모델이다. Jeffrey Ravetch 박사의연구실에서제작된 FcγRIIIA, Fc γriib 및 FcγRIIA 트랜스제닉마우스계통의페어가이용가능하며 (Rockefeller 대학과 Sloan Kettering 암센터의라이센스계약을통하여 ), 이하의표 25에들고있는바와같은것이다. [0437] 표 25 마우스계통 계통백그라운드누드 / CD16A KG 누드 / CD16A KG 누드 / CD16A KG 누드 / CD16A KG 누드 / CD32B KG 누드 / CD32B KG 인간FcR 없음 FcγRIIIA FcγRIIA FcγRIIA 및 IIIA 없음 FcγRIIB [0438] [0439] [0440] [0441] [0442] 본발명의병용요법의항염증활성은당기술분야에서공지된또한 Crofford L. J. 및 Wilder R. L. 동물의관절염과자가면역 (Arthritis and Autoimmunity in Animals), Arthritis and Allied Conditions:A Textbook of Rheumatology, McCarty 외 ( 편 ), 제30장 (Lee and Febiger, 1993) 에기재된여러가지염증성관절염의실험동물모델을이용해서확인할수있다. 염증성관절염및자가면역류머티즘질환의실험적및자연발생적동물모델은또본발명의병용요법의항염증활성을평가하기위해서이용할수도있다. 이하는예로서든몇가지의분석이며한정되는것은아니다. 당기술분야에서공지된또한널리이용되는관절염또는염증성질환의주요한동물모델은이하의것을포함한다 : 애쥬번트유도관절염래트모델, 콜라겐유도관절염래트및마우스모델, 및, 항원유도관절염래트, 토끼및햄스터모델. 이들은모두 Crofford L. J. 및 Wilder R. L. 동물의관절염과자가면역 (Arthritis and Autoimmunity in Animals), Arthritis and Allied Conditions:A Textbook of Rheumatology, McCarty 외 ( 편 ), 제30장 (Lee and Febiger), 1993에기재되어있다 ( 그전체를참조로서본명세서에편입시킨다 ). 본발명의병용요법의항염증활성은카라게난유도관절염래트모델을사용해서평가할수있다. 카라게난이유도하는관절염은또만성관절염또는염증의연구에있어서, 토끼, 개및돼지에서도이용되고있다. 정량적인조직형태계측적평가가치료효력의결정에사용된다. 이와같은카라게난유도관절염모델을이용하는방법은 Hansra P. 외, 래트에있어서의카라게난유도관절염 (Carrageenan-induced Arthritis in the Rat), Inflammation, 24(2): , (2000) 에기재되어있다. 또자이모산유도염증동물모델도일반적으로이용되고있으며, 당기술분야에서공지이다. 본발명의병용요법의항염증활성은또카라게난이유도하는래트의발부종 (paw edema) 의억제를 Winter C. A. 외, 항염증약분석으로서의카라게난이유도하는래트뒷다리부종 (Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs) Proc. Soc. Exp. Biol Med.111, , (1962) 에기재되는방법의개변법을사용해서측정함으로써평가할수도있다. 이분석은대부분의 N상기의항염증활성에대한 1차 in vivo 스크리닝으로서사용되고있으며, 인간에서의효력을예측한다고생각되고있다. 시험예방약또는치료약의항염증활성은비히클을투여한대조군에대한시험군의뒷다리중량증가의억제퍼센트로서나타난다. 또한, 염증성장질환의동물모델을본발명의병용요법의효력을평가하는데사용할수도있다 (Kim et al.(1992) "Experimental Colitis In Animal Models," Scand. J. Gastroentrol. 27: ; Strober(1985)

103 "Animal Models Of Inflammatory Bowel Disease--An Overview," Dig. Dis. Sci. 30(12 Suppl):3S-10S). 궤양성대장염및클론병은동물에서유도할수있는인간염증성장질환이다. 황산화된다당류 ( 한정되는것은아니지만, 아밀로펙틴, 카라게난, 황산아밀로펙틴및황산덱스트란을포함함 ) 또는화학자극제 ( 한정되는것은아니지만, 트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 및아세트산을포함함 ) 를동물에게경구투여해서염증성장질환을유도할수있다. [0443] [0444] [0445] 자가면역질환의동물모델도또본발명의병용요법의효력을평가하는데사용할수있다. 자가면역질환, 예를들면 I형당뇨병, 갑상선자가면역, 전신성에리테마토데스, 및사구체신염의동물모델이개발되어있다 (Flanders et al.(1999) "Prevention Of Type I Diabetes From Laboratory To Public Health," Autoimmunity 29: ; Rasmussen et al.(1999) "Models To Study The Pathogenesis Of Thyroid Autoimmunity," Biochimie 81 : ; Foster(1999) "Relevance Of Systemic Lupus Erythematosus Nephritis Animal Models To Human Disease," Semin. Nephrol. 19:12-24). 또한, 당업자에공지된분석은어느것이나자가면역및 / 또는염증성질환에대한본명세서에개시한병용요법의예방상및 / 또는치료상의유용성을평가하는데사용할수있다. 본발명의예방및 / 또는치료프로토콜의독성및효력은세포배양또는실험동물에있어서의표준적인약학적수법에의해확인할수있고, 예를들면 LD 50 ( 집단의 50% 에대한치사량 ) 및 ED 50 ( 집단의 50% 에있어서의치료 유효량 ) 을결정하는수법에의해확인할수있다. 독성과치료효과간의용량비가치료지수이며, LD 50 /ED 50 비로서표현된다. 큰치료지수를나타내는예방및 / 또는치료약이바람직하다. 독성부작용을나타내는예방및 / 또는치료약을사용할수는있지만, 이와같은약물을이환조직의부위에타겟팅하는송달시스템을설계하여, 비감염세포에일어날수있는손상을최소한으로억제하고, 그것에의해부작용을경감시키도록주의해야한다. [0446] 세포배양분석및동물연구로부터얻어진데이터는인간에사용하는예방및 / 또는치료약의투여량의범위를결 정하는데이용할수있다. 이와같은약물의투여량은바람직하게는독성이낮거나전혀없고, ED 50 을포함하는 순환농도의범위내에있다. 투여량은채용하는투여제형및이용하는투여경로에의존하여바뀔수있다. 본발명의방법에서사용하는어느약품에대해서도, 치료상유효한용량은우선세포배양분석으로부터추정할수있다. 용량은세포배양에서결정한 IC 50 ( 즉, 증상의최대의 2분의 1의억제 (half-maximal inhibition) 를달성하는시험화합물의농도 ) 을포함하는순환혈장농도범위를달성하도록, 동물모델에있어서결정해도된다. 이와같은정보는인간에유용한투여량을더욱정확하게결정하는데사용할수있다. 혈장중의레벨은예를들면고속액체크로마토그래피에의해측정할수있다. [0447] [0448] [0449] 본발명에따라서사용되는치료법의항암활성은또암연구용의여러가지실험동물모델, 예를들면 SCID 마우스모델또는트랜스제닉마우스또는인간이종이식편을가지는누드마우스, 동물모델, 예를들면햄스터, 토끼등을사용함으로써결정할수도있고, 이들은당기술분야에서공지이며, 또한 Relevance of Tumor Models for Anticancer Development(1999, Fiebig 및 Burger 편 ); Contributions to Oncology(1999, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research(1991, Boven and Winograd 편 ); 및 Anticancer Drug Development Guide(1997 편 Teicher)( 이들전체를참조로서본명세서에편입시킨다 ) 에기재되어있다. 본발명의분자의치료효력을결정하기에바람직한동물모델은마우스이종이식모델이다. 이종이식종양의공급원으로서사용할수있는종양세포주는한정되는것은아니지만, SKBR3 및 MCF7 세포를포함하고, 그들은유선암의환자에유래한다. 이들세포는 erbb2와프로락틴수용체의양자를갖는다. SKBR3 세포는 ADCC 및이종이식종양모델로서당기술분야에있어서통상사용되고있다. 이것과는별도로인간난소선암에유래하는 OVCAR3 세포를이종이식종양의공급원으로서사용할수있다. 본발명의프로토콜과조성물은인간에게사용하기전에, 바람직하게는 in vitro에서, 다음에 in vivo에서, 원하는치료또는예방활성에대해서시험된다. 치료약및치료법은종양또는악성배양세포주의세포를사용해서스크리닝할수있다. 당기술분야에있어서표준적인많은분석을이와같은생존및 / 또는증식을평가하는 데사용할수있다 ; 예를들면세포증식은 3 H-티미딘받아들임을측정함으로써, 직접세포계수로부터, 프로토온코진 ( 예를들면 fos, myc) 또는세포주기마커등의공지된유전자의전사활성의변화를검출함으로써평가할수있다 ; 세포생존율은트리판블루염색에의해평가할수있고, 분화는형태의변화, 연한천중에서의증식및 / 또는콜로니형성의감소또는삼차원기저막또는세포외매트릭스조제물중의관형상네트워크형성등에

104 기초하여시각적으로평가할수있다. [0450] [0451] [0452] [0453] [0454] [0455] [0456] [0457] [0458] [0459] [0460] [0461] [0462] [0463] 치료에사용하는화합물은인간에서시험하기전에적합한동물모델계에서시험할수있고, 동물로서는한정되는것은아니지만, 래트, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 토끼, 햄스터등이있으며, 예를들면상기한동물모델에서시험할수있다. 화합물은그후에적당한임상시험에서사용된다. 또한, 당업자에공지된분석은어느것이라도암, 염증성질환, 또는자가면역질환의치료또는예방에대해서본명세서에개시한병용요법의예방상및 / 또는치료상의유효성을평가하는데사용할수있다. 6. EXAMPLES 6.1. 공유결합형이중특이성디아바디의설계와특징단일특이성공유결합형디아바디및이중특이성공유결합형디아바디를구축하고, 각각의재조합체의제작, 정제및결합특성을평가했다. 본명세서에기재한재조합발현시스템에의해제작되고, 친화성정제된디아바디분자는 SDS-PAGE 및 SEC 해석에의해단일의 2량체종으로이루어지는것이판명되었다. ELISA 및 SPR 해석에의해, 공유결합형이중특이성디아바디는양쪽의표적항원에친화성을나타내는점, 및양쪽의항원과동시에결합할수있는점이또한분명해졌다. 재료와방법폴리펩티드분자의구축및설계 : 핵산발현벡터를설계하고, 도 2에서모식도에의해나타낸 4개의폴리펩티드컨스트럭트를제작했다. 컨스트럭트 1( 서열번호 9) 은 FcγRIIB를인식하는인간화 2B6항체의 VL도메인, 및 FcγRIIIA를인식하는인간화 3G8항체의 VH도메인을포함한다. 컨스트럭트 2( 서열번호 11) 는 Hu3G8의 VL도메인, 및 Hu2B6의 VH도메인을포함한다. 컨스트럭트 3( 서열번호 12) 은 Hu3G8의 VL도메인, 및 Hu3G8의 VH도메인을포함한다. 컨스트럭트 4( 서열번호 13) 는 Hu2B6의 VL도메인, 및 Hu2B6의 VH도메인을포함한다. PCR 및발현벡터의구축 : VL 및 VH도메인의코드서열을제1 PCR산물이중복서열을포함하도록설계한포워드및리버스프라이머를사용해서주형 DNA로부터증폭했다. 이것에의해중복 PCR로원하는폴리펩티드컨스트럭트의코드서열을제작하는것이가능하게된다. 주형 DNA의제1 PCR 증폭 : 약 35ng의주형 DNA( 예를들면목적으로하는항체의경쇄및중쇄 ), 1μl의 10μM 포워드프라이머및리버스프라이머, 2.5μl의 10 pfuultra 버퍼 (Stratagene, Inc.), 1μl의 10mM dntp, 1μ l의 2.5유닛 /μl의 pfuultra DNA 폴리머라아제 (Stratagene, Inc.), 및총량 25μl가되도록가한증류수를미량원심튜브내에서조용히혼합하고, 미량원심기로단시간스핀해서반응혼합물을튜브의바닥에모았다. PCR 반응을 GeneAmp PCR System 9700(PE Applied Biosystem) 을사용해서행했다. 반응은 94 에서 2분간 ; 계속해서 94 에서 15초간, 58 에서 30초간및 72 에서 1분간을 25사이클로설정했다. Hu2B6의 VL은 Hu2B6의경쇄로부터포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 55 및 56) 를사용해서증폭했다. Hu2B6의 VH는 Hu2B6의중쇄로부터포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 57 및 58) 를사용해서증폭했다. Hu3G8의 VL은 Hu3G8의경쇄로부터포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 55 및 59) 를사용해서증폭했다. Hu3G8 의 VH는 Hu3G8의중쇄로부터포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 60 및 61) 를사용해서증폭했다. 1% 아가로오스겔에서 PCR산물을 120볼트에서 30분간, 전기영동했다. PCR 산물을겔로부터잘라낸후, MinElute 겔추출키트 (Qiagen, Inc.) 를사용해서정제했다. 중복 PCR: 제1 PCR산물을하기와같이결합시켜서, 주형 DNA의최초의증폭에서설명한 PCR조건과동일한조건을사용해서증폭했다. 중복 PCR의산물도상기한바와같이정제했다. 컨스트럭트 1을코드하는핵산서열 ( 서열번호 9)( 도 2에모식도로나타냄 ) 을 Hu2B6의 VL 및 Hu3G8의 VH의 PCR증폭산물, 및포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 55 및 61) 를혼합해서증폭했다. 컨스트럭트 2를코드하는핵산서열 ( 서열번호 11)( 도 2에모식도로나타냄 ) 을 Hu3G8의 VL 및 Hu2B6의 VH의 PCR 증폭산물, 및포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 55 및 58) 를혼합해서증폭했다. 컨스트럭트 3을코드하는핵산서열 ( 서열번호 12)( 도 2에모식도로나타냄 ) 을 Hu3G8의 VL 및 Hu3G8의 VH의 PCR증폭산물, 및포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 55 및 61) 를혼합해서증폭했다. 컨스트럭트 4를코드하는핵산서열 ( 서열번호 13)( 도 2에모식도로나타냄 ) 을 Hu2B6의 VL 및 Hu2B6의 VH의 PCR증폭산물, 및포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 55 및 58) 를혼합해서증폭했다. VL도메인의포워드프라이머 ( 즉, 서열번호 55) 및 VH도메인의리버스프라이머 ( 즉, 서열번호 58 및서열번호

105 61) 는발현벡터내로의최종산물의클로닝을가능하게하는유니크한제한부위를포함하고있다. 정제된중복 PCR 산물을제한엔도뉴클레아제 NheI 및 EcoRI 로절단하고, 포유동물발현벡터 pcineo(promega, Inc.) 내에 도입해서클론화했다. 컨스트럭트를코드하는플라스미드를표 26 에나타나있는바와같이명명했다. [0464] 표 26 플라스미드컨스트럭트 암호화컨스트럭트 플라스미드명 삽입물 1 pmgx0669 hu2b6vl-hu3 G8VH 2 pmgx0667 hu3g8vl-hu2b6vh 3 pmgx0666 hu3g8vl-hu3g8vh 4 pmgx0668 hu2b6vl-hu2b6vh [0465] [0466] [0467] [0468] 폴리펩티드 / 디아바디의발현 : 컨스트럭트 1을코드하는 pmgx0669를컨스트럭트 2를코드하는 pmgx0667과함께, 리포펙타민2000(Invitrogen) 을사용하여, 사용설명서에따라서 HEK-293 세포에동시형질도입했다. 이들 2개의플라스미드의동시형질도입은 FcγRIIB 및 FcγRIIIA의양쪽에대하여면역특이적인공유결합형이중특이성디아바디 (CBD)(h2B6-h3G8디아바디) 가발현하도록설계되어있다. 컨스트럭트 3 및 4를각각코드하는 pmgx0666 및 pmgx0668을각각 FcγRIIIA에대하여면역특이적인공유결합형단일특이성디아바디 (CMD)(h3G8 디아바디 ) 및 FcγRIIB에대하여면역특이적인공유결합형단일특이성디아바디 (CMD)(h2B6 디아바디 ) 의발현을위해 HEK-293 세포에각각트랜스펙트했다. 배양 3일후, 분비된산물을조건배지로부터정제했다. 정제 : 디아바디를조건배지로부터 CNBr 활성형세파로오스 4B와결합시킨관련된항원을사용해서회수했다. 로딩전에어퍼니티세파로오스수지를 20mM Tris/HCl(pH 8.0) 로평형화했다. 로딩후, 용출전에수지를평형버퍼에서세정했다. 디아바디를 50mM 글리신 (ph 3.0) 을사용해서세정이끝난수지로부터용출했다. 용출한디아바디를 1M Tris/HCl(pH 8.0) 로즉시중화하고, 원심분리형농축기를사용해서농축했다. 농축한디아바디를추가로 PBS로평형화한 Superdex 200 칼럼을사용해서사이즈배제크로마토그래피 (SEC) 에의해정제했다. SEC: 사이즈배제크로마토그래피를사용하여, 칼럼으로부터용출된디아바디의대략적인사이즈와이질성을분석했다. SEC 해석은 PBS로평형화한 GE헬스케어사의 Superdex 200HR 10/30 칼럼으로행해졌다. 전체길이 IgG( 약 150kDa), Fab 단편 ( 약 50kDa) 및 1본쇄 Fv( 약 30kDa) 의용출프로필과의비교를대조로서사용했다. ELISA: 용출및정제된디아바디의결합성을 ELISA 분석에의해섹션 5.4.2에서설명한바와같이특성분석했다. 1웰당 50μl의 2μg/ml의 scd32b-ig 용액을탄산버퍼가들어간 96웰 Maxisorp 플레이트상에 4 에서하룻밤코팅했다. 플레이트를 PBS-T(PBS+0.1% Tween20) 에서 3회세정하고, PBS-T 중의 0.5% BSA에서 30분간, 실온에서블로킹했다. 계속해서, h2b6-h3g8 CBD, h2b6 CMD 또는 h3g8 CMD를블로킹버퍼를사용해서 2배희석으로연속희석하고, 0.5μg/ml로부터 0.001μg/ml까지의범위의디아바디농도를제작했다. 그후에플레이트를실온에서 1시간인큐베이션했다. PBS-T에서 3회세정한후, 0.2μg/ml의 scd16a-비오틴을 1웰당 50μl로각웰에가했다. 플레이트를다시실온에서 1시간인큐베이션했다. PBS-T에서 3회세정한후, 1:5000 희석한 HRP 결합스트렙타비딘 (Amersham Pharmacia Biotech) 을검출을위해 1웰당 50μl 사용했다. HRP-스트렙타비딘을 45분간, 실온에서인큐베이션했다. 플레이트를 PBS-T에서 3회세정하고, TMB 기질을 1웰당 80μl 사용해서발색시켰다. 10분간의인큐베이션후, 1% H 2 SO 4 를 1웰당 40μl 가함으로써 HRP-TMB 반응을정지시켰다. OD450을 96웰플레이 트리더와 SOFTmax 소프트웨어를사용해서읽어들이고, 결과를 GraphPadPrism 3.03 소프트웨어를사용해서플롯 했다. [0469] [0470] BIAcore 분석 : 용출및정제된디아바디의동태파라미터를섹션 5.4.3에서설명한바와같이 BIAcore 분석 (BIAcore instrument 1000, BIAcore Inc., Piscataway, N.J.) 및부속의소프트웨어를사용해서해석했다. scd16a, scd32b, 또는 scd32a( 음성대조 ) 를센서칩표면의 4개의플로우셀중 1개 ( 플로우셀 2) 에어느수용체도약 1000의응답유닛 (response units:ru) 이표면상에고정되도록, (NHS/EDC의혼합물에의한카르복시메틸기의수식에의해 ) 아민결합화학을통하여고정했다. 이것에계속하여, 미반응의활성에스테르를 1M Et- NH 2 를가해서 캡오프 (capped off) 했다. 적당한표면이조제되면, 공유결합형이중특이성디아바디 (h2b6- h3g8 CBD) 또는공유결합형단일특이성디아바디 (h2b6 CMD 또는 h3g8 CMB) 를표면에, 6.25~200nM 의용액을 70mL/min 의유속으로 180 초간도입함으로써흘렸다. h3g8 scfv 도비교용으로테스트했다

106 [0471] 전체데이터세트를회수한시점에서, 얻어진결합곡선을제조업자인 BIAcore, Inc. 사 (Piscataway, NJ) 로부터 제공되는컴퓨터알고리즘을사용하여, 전체적으로피트 ( 근사 ) 시켰다. 이들알고리즘에의해 K on 및 K off 의양쪽 이산출되었다. 이것으로부터외견의평형결합상수 (K D ) 가 2 개의속도상수의비 ( 즉 K off /K on ) 로서추정된다. 개개 의속도상수를어떻게도출했는가에대한보다상세한처리에대해서는 BIAevaluaion 소프트웨어핸드북 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 에서볼수있다. [0472] [0473] [0474] [0475] [0476] [0477] [0478] 결합기및해리기는각각피트시켰다. 해리속도상수를 180초의해리기에있어서 32~34초간격으로얻었다. 결합기피트를 1:1 Langmuir 모델에서얻었다. 기저피트를이중특이성디아바디와 scfv에관한 Rmax 및카이자승법에기초하여선택했다. 2가측정물피트는 CMD 결합에사용되었다. 결과비환원조건하에서의 SDS-PAGE 해석에의해, h3g8 CMD, h2b6 CMD 및 h2b6-h3g8 CBD 발현시스템의정제산물은각각단일종이며, 약 50kDa( 도 3의각각레인 4, 5 및 6) 의추정분자량을가진다는것이분명해졌다. 환원조건하에서는 CMD의각발현시스템로부터정제된산물은단일밴드 ( 레인 1 및 2) 로서이동했지만, h2b6-h3g8 CBD 계로부터정제된산물은 2개로분리되는단백질 ( 도 3, 레인 3) 인것이분명해졌다. 발현시스템로부터정제되어, 환원조건하에서 SDS-PAGE에의해시각화된전체폴리펩티드는약 28kDa의위치로이동했다. 각발현시스템산물의 SEC 해석에서도, 그들이단일분자종이며 ( 도 4b), 각각 IgG의 Fab 단편 ( 약 50kDa) 와거의같은시간에서용출되는것 ( 도 4a) 이분명해졌다. 이들결과는친화성정제한산물이 CMD 발현시스템의경우는동종의공유결합형호모 2량체이며, 또 h2b6-h3g8 CBD의경우에는동종의공유결합형헤테로 2량체인것을나타내고있다. ELISA 샌드위치분석을사용하여, CD32B 및 / 또는 CD16A의어느한쪽또는양쪽에대한 h2b6-h3g8 CBD의결합특이성을시험했다 ( 도 5). CD32B를표적항원으로서사용하고, 또 CD16A를제2 프로브로서사용했다. ELISA의양성시그널에의해, 헤테로 2량체인 h2b6-h3g8 CBD는양항원에대하여특이성을갖는것이분명해졌다. h3g8 CMD(CD32B에결합하지않음 ) 에서의마찬가지의시험에서는시그널이보여지지않았다. SPR 해석은 h3g8 CMD가 scd16을면역특이적으로인식하지만 scd32b는인식할수없는것, h2b6 CMD가 scd32b 를면역특이적으로인식하지만 scd16은인식할수없는것, 그리고 h2b6-h3g8 CBD가 scd16과 scd32b의양쪽을면역특이적으로인식할수있는것을나타냈다 ( 도 6a~b). 시험한디아바디는모두대조군수용체sCD32A에는결합하지않았다 ( 도 6c). 또 SPR 해석을사용하여, scd16 및 / 또는 scd32b에대한 2개의 CMD 및 h2b6-h3g8 CBD의속도상수및평형상수를추정했다. 결과를 h3g8 scfv에대해서산출한상기상수와비교했다. 도 7a~e는 SPR 해석의결과를그래프로나타낸것이다. 도 7에서그려진결과로계산된 on 및 off 속도, 및평형상수를표 27에나타낸다. [0479] 표 27 BIAcore 데이터로부터산출된속도상수및평형상수 수용체 / 분석물 k-on k-off Kd scd 16 / h3g8 디아바디 2.3 x scd16 / h2b6-h3g8 CBD 4.6 x scd 16 / h3g8 scfv 3.2 x scd32b / h2b6-h3g8 CBD 3.6 x scd32b / h2b6 디아바디 6.2 x [0480] [0481] [0482] ELISA 해석의결과와합하면, h2b6-h3g8 공유결합형헤테로 2량체는 CD32B 및 CD16의양쪽에대하여특이성을유지하고있는것, 및양항원에동시에결합할수있는것이실험으로부터뒷받침되었다. 본분자를도 8에모식도로나타냈다 Fc도메인을포함하는공유결합형이중특이성디아바디의설계와특성분석 IgG 유사분자, 즉 Fc도메인을포함하는분자를만들기위해서, 실시예 6.1에서나타낸헤테로 2량체 CBD 분자를포함하는폴리펩티드의 1개를, Fc도메인을추가로포함하 ( 항체의중쇄및경쇄에유사한 무거운 쇄및

107 가벼운 쇄를만들어내 ) 도록개변했다. 따라서, 헤테로 2량체의이중특이성분자가동종분자와 2량체화하는 Fc 도메인을포함함으로써 4가의 4량체 IgG 유사분자 ( 즉, 헤테로 2량체의이중특이성분자의 Fc도메인을통하여 2 량체화함으로써형성되는분자 ) 가형성될것이다. 흥미롭게도이와같은 4량체분자는예를들면표적항원에대한면역특이적결합성에대해서조건배지를시험한다는기능분석을사용하여, 재조합발현시스템의조건배지중에는검출되지않았다. 그대신에, VL, VH 및 Fc도메인으로이루어지는단량체를포함하는 2량체분자만이상기기능분석에서검출되었다. 이론상의 4량체구조가안정성의면에서문제가될지여부를시험하기위해서, Fc도메인을포함하는폴리펩티드가힌지영역을추가로포함하도록유전자조작하고, 한편 가벼운 쇄를포함하는폴리펩티드는인간κ형경쇄의불변도메인의 6개의 C말단아미노산을포함하도록유전자조작했다. 이와같이유전자조작한 무거운 및 가벼운 쇄를재조합발현시스템에서공발현시켰을때, 기능분석에의해, 표적항원과항Fc 항체양쪽에면역특이적으로결합할수있는디아바디분자가검출되었다. [0483] [0484] [0485] [0486] [0487] [0488] [0489] 재료와방법폴리펩티드분자의구축및설계 : 실시예 6.1에서나타낸컨스트럭트 1 및 2의개변형을제작하기위해서, 핵산발현벡터를설계했다. 컨스트럭트 5( 서열번호 14) 및 6( 서열번호 15) 은또한 Fc도메인을포함하도록, 각각컨스트럭트 1 및 2를유전자조작함으로써제작되었다. 컨스트럭트 7( 서열번호 16) 은컨스트럭트 1을유전자조작하고, 또한그 C말단에서열 FNRGEC( 서열번호 23) 를포함하도록제작되었다. 컨스트럭트 8( 서열번호 18) 은컨스트럭트 2를유전자조작하고, 또한힌지영역과 Fc도메인 (V215A 변이를포함함 ) 을포함하도록제작되었다. 컨스트럭트 5~8의모식도를도 9에나타낸다. PCR 및발현벡터의구축 : PCR 및 PCR산물의정제프로토콜은모두실시예 6.1에서설명한바와같다. 플라스미드 pmgx0669 및 pmgx0667을각각컨스트럭트 1 및 2의코드서열용의주형으로서사용했다. HuIgG의 Fc도메인용의및 / 또는힌지도메인용의코드서열은각각서열번호 5 또는서열번호 1 및서열번호 5로했다. 주형 DNA의코드서열은포워드및리버스프라이머를사용해서증폭했는데, PCR산물이중복서열을포함하고, 중복 PCR이원하는산물의코드서열을생성시키는것같은프라이머를사용했다. 컨스트럭트 1의코드서열은 pmgx0669로부터포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 55 및서열번호 62) 를사용해서증폭되었다. 컨스트럭트 2의코드서열은 pmgx0667로부터포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 55 및서열번호 63) 를사용해서증폭되었다. HuIgG 힌지-Fc는포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 65 및서열번호 66) 를사용해서증폭했다. 컨스트럭트 7( 서열번호 16) 의코드서열은 pmgx0669로부터포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 55 및서열번호 67) 를사용해서증폭되었다. 중복 (overlapping) PCR: 제1 PCR산물을이하에기재한바와같이조합하고, 실시예 6.1에서설명한바와같이증폭및정제했다. 컨스트럭트 5( 서열번호 14)( 도 9에모식도로나타냄 ) 를코드하는핵산서열은컨스트럭트 1 및 HuIgG Fc의 PCR 증폭산물, 및포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 55 및서열번호 64) 를조합시켜서증폭했다. 컨스트럭트 6( 서열번호 15)( 도 9에모식도로나타냄 ) 을코드하는핵산서열은컨스트럭트 2 및 HuIgG Fc의 PCR증폭산물, 및포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 55 및서열번호 66) 를조합시켜서증폭했다. 컨스트럭트 8( 서열번호 18)( 도 9에모식도로나타냄 ) 을코드하는핵산서열은컨스트럭트 2 및 HuIgG 힌지-Fc의 PCR증폭산물, 및포워드및리버스프라이머 ( 각각서열번호 55 및서열번호 66) 를조합시켜서증폭했다. 최종산물을상기한바와같이포유동물발현벡터 pcineo(promega, Inc.) 내에클론화했다. 컨스트럭트를코드하는플라스미드는표 28에나타나있는바와같이명명했다. [0490] 표 28 플라스미드컨스트럭트 암호화컨스트럭트 플라스미드명 삽입물 5 pmgx0676 hu2b6vl-hu3g8vh-hufc 6 pmgx0674 hu3g8vl-hu2b6vh-hufc 7 pmgx0677 Hu2B6VL-hu3G8VH-FNRGEC 8 pmgx0678 Hu3G8VL-hu2B6VH-hu 힌지-Fc (A215V) [0491] 폴리펩티드 / 디아바디의발현 : 섹션 6.1 에서기재한바와같이, 리포펙타민 2000(Invitrogen) 을사용해서 HEK

108 293 세포내에별개로 4 개의동시형질도입을행했다. 상기동시형질도입은즉, 컨스트럭트 1 및 6 을각각코드하 는 pmgx0669 및 pmgx0674, 컨스트럭트 2 및 5 를각각코드하는 pmgx0667 및 pmgx0676, 및컨스트럭트 7 및 8 을 각각코드하는 pmgx0677 및 pmgx0678 이다. [0492] [0493] [0494] [0495] [0496] [0497] [0498] [0499] [0500] 이들플라스미드의동시형질도입은 FcγRIIB 및 FcγRIIIA의양쪽에면역특이적인 IgG 유사구조를갖는 4가의이중특이성디아바디 (CBD) 를발현하도록설계되었다. 컨스트럭트 6 및 5를각각코드하는 pmgx0674 및 pmgx0676 의추가적인동시형질도입도행했다. 배양 3일후, 조건배지를회수했다. 조건배지중의분비산물의양을정제된 Fc를기준으로사용하여, 항IgG Fc ELISA에의해정량화했다. 그후에샘플중의산물의농도를정량값에기초하여정규화하고, 이정규화한샘플을이후의분석에사용했다. ELISA: 배지중에분비된디아바디분자의결합성을, 상기샌드위치 ELISA에서분석했다. 특별히나타낸경우를제외하고, CD32B를플레이트코팅용으로, 즉표적단백질로서사용했다. 또 HRP 결합 CD16을프로브로서사용했다. 결과 ELISA 분석을사용하여, 컨스트럭트 1 및 6(pMGX669-pMGX674), 컨스트럭트 2 및 5(pMGX667-pNGX676), 그리고컨스트럭트 5 및 6(pMGX674-pMGX676) 을포함하는재조합발현시스템유래의정규화한샘플을, CD32B 및 CD16A 와동시에결합가능한디아바디분자의발현에대해서시험했다 ( 도 10). ELISA 데이터는컨스트럭트 1 및 6을사용한동시형질도입, 또는컨스트럭트 2 및 5를사용한동시형질도입에서는한쪽또는양쪽의항원에결합할수있는산물은생기지않았다 ( 도 10, 각각 및 ). 그러나컨스트럭트 5 및 6의동시형질도입은 CD32B 및 CD16A의양항원에결합할수있는산물의분비를초래했다. 후자의산물은컨스트럭트 5 및 6의 2량체이며, 도 11에모식도로나타낸구조를갖고, 각각의항원에대한 1개의결합영역을포함하고있다. IgG 유사헤테로 4량체구조의형성을이끌기위해서, 부가적인 6아미노산의코드서열을컨스트럭트 1의 C말단에부가하여, 컨스트럭트 7( 서열번호 16; 도 9에모식도로나타냄 ) 을제작했다. 부가적인 6아미노산 FNRGEC( 서열번호 23) 는 κ형경쇄의 C말단에유래하고, 통상 IgG분자내에서중쇄의상부힌지도메인과상호작용한다. 또힌지도메인을컨스트럭트 6의내부에유전자조작으로도입하고, 컨스트럭트 8( 서열번호 18, 및도 9) 을제작했다. 컨스트럭트 8은또한상부힌지영역중에아미노산변이 A215V를포함하고있었다. 컨스트럭트 7 및컨스트럭트 8을코드하는발현플라스미드인, 각각 pmgx677 및 pmgx678을그후 HEK-293 세포에동시형질도입하고, 상기한바와같이발현시켰다. 컨스트럭트 7 및 8(pMGX0677+pMGX0678) 을포함하는재조합발현시스템로부터생산된디아바디분자는 ELISA 분석에서 CD32B 및 CD16A의결합에관하여, 컨스트럭트 1 및 6(pMGX669+pMGX674), 컨스트럭트 2 및 8(pMGX669+pMGX678), 그리고컨스트럭트 6 및 7(pMGX67+pMGX674)( 도 12) 을포함하는발현시스템로부터생산된디아바디분자와비교했다. 이미서술한바와같이, 컨스트럭트 1 및 6(pMGX669+pMGX674) 을포함하는발현시스템에의해생산된분자는 CD32A 및 CD16A의어느쪽에도결합할수없는것을알수있었다 ( 도 10 및도 12). 이것에대해서컨스트럭트 7 및 6(pMGX0677+pMGX0674) 의공발현, 또는컨스트럭트 7 및 8(pMGX0677-pMGX0678) 의공발현으로부터얻어지는산물은 CD32A 및 CD16A의양쪽과결합할수있었다 ( 도 12). 컨스트럭트 7이 C말단서열 FNRGEC( 서열번호 23) 를포함하는것을제외하면컨스트럭트 1에유사한점, 그리고컨스트럭트 8이힌지도메인및 A215V 변이를포함하는것을제외하면컨스트럭트 6에유사한점이주목된다. 이데이터는 C-κ형경쇄의 C말단에유래하는여분의 6아미노산 (FNRGEC; 서열번호 23) 을 Fc를가지지않는 가벼운 쇄에부가하는것이, 대응하는중쇄가힌지도메인을포함하는지여부에관계없이 ( 즉 pmgx0677+pmgx0674 및 pmgx0677-pmgx0678, 도 12), 4량체 IgG 유사디아바디분자의형성을안정화하는데도도움이되는것을나타내고있다. Fc를갖는 무거운 폴리펩티드에힌지도메인을부가하는것은, 대응하는 가벼운 쇄에대한 C말단서열 FNRGEC( 서열번호 23) 의부가가없는경우에는분명히마찬가지의안정화를달성할수없었다 ( 즉, 컨스트럭트 2 및 8(pMGX669+pMGX67) 의동시형질도입의산물에의한결합이결여되어있다 ). 4량체디아바디분자의구조를도 13에모식도로나타낸다 량체 IgG 유사디아바디의형성에있어서의도메인의순서및추가적인이황화결합의효과 4량체 IgG 유사디아바디분자의 가벼운 및 무거운 폴리펩티드사슬간의추가적인안정화의효과를폴리펩티드사슬상의선택된잔기의시스테인에의한치환에의해조사했다. 부가적인시스테인잔기는 무거운 및 가벼운 쇄간에부가적인이황화결합을부여한다. 또한, Fc도메인또는힌지-Fc도메인을폴리펩티드사슬의 C말단로부터 N말단으로옮김으로써결합활성에있어서의도메인의순서를조사했다. 부가적인이황화

109 결합을포함하는분자의결합활성은그러한결합을가지는먼저구축된디아바디분자에비해바뀌지않았지만, Fc 또는힌지-Fc도메인을디아바디를구성하는 무거운 폴리펩티드사슬의 N말단으로옮기면, 그표적항원의한쪽또는양쪽에대한이중특이성분자의결합친화성및 / 또는결합력이놀라울정도로개선되었다. [0501] [0502] [0503] [0504] [0505] 재료와방법폴리펩티드분자의구축및설계 : 실시예 6.2에서나타낸컨스트럭트 5, 6 및 8의개변형을제작하기위해서, 핵산발현벡터를설계했다. 컨스트럭트 9( 서열번호 19) 및컨스트럭트 10( 서열번호 20)( 모두도 13에모식도로나타냄 ) 은각각 Fc도메인또는힌지-Fc도메인이폴리펩티드의 C말단로부터 N말단로시프트하고있는것을제외하면, 컨스트럭트 8 및 6과유사하다. 또한, 사용한 Fc도메인은모두야생형 IgG1의 Fc도메인이다. 컨스트럭트 11( 서열번호 21)( 도 14에모식도로나타냄 ) 은 C말단이서열 FNRGEC( 서열번호 23) 를추가로포함하도록설계되어있는것을제외하면, 실시예 6.1로부터의컨스트럭트 2에유사하다. 컨스트럭트 12( 서열번호 22)( 도 14에모식도로나타냄 ) 는 Fc도메인이또한힌지영역을포함하는것을제외하면, 실시예 6.2로부터의컨스트럭트 5에유사하다. 또컨스트럭트 11 및 12에관해서는, 2B6의 VL도메인및 2B6의 VH도메인은각도메인중의글리신을시스테인으로치환하기위한단일아미노산변이 ( 각각 G105C 및 G44C) 를포함하고있다. PCR 및발현벡터의구축 : PCR 및 PCR산물의정제프로토콜은모두실시예 6.1 및 6.2에서설명한바와같다. 중복 PCR: 실시예 6.1 및 6.2에기재된방법을사용하여최종산물을구축하고증폭하고정제했다. 최종산물을상기한바와같이포유동물발현벡터 pcineo(promega, Inc.) 내에클론화했다. 컨스트럭트를코드하는플라스미드는표 29에나타나있는바와같이명명했다. [0506] 표 29 플라스미드컨스트럭트 암호화컨스트럭트 플라스미드명 삽입물 9 pmgx0719 Hu힌지 /Fc-hu3G8VL-hu2B6VH 10 pmgx0718 HuFc-hu2B6VL-hu3G8VH 11 pmgx0716 Hu2B6VL( G/C)-hu3G8VH-hu힌지FC 12 pmgx0717 Hu3G8VL-hu2B6VH(G/C)-FNRGEC [0507] [0508] [0509] [0510] 폴리펩티드 / 디아바디의발현 : 섹션 6.1에서기재한바와같이리포펙타민2000을사용해서 HEK-293 세포내에별개로 3개의동시형질도입을행했다. 상기동시형질도입은즉컨스트럭트 1 및 9를각각코드하는 pmgx0669 및 pmgx0719, 컨스트럭트 1 및 10을각각코드하는 pmgx0669 및 pmgx0718, 그리고컨스트럭트 11 및 12를각각코드하는 pmgx0617 및 pmgx0717이다. 이들플라스미드의동시형질도입은 FcγRIIB 및 FcγRIIIA의양쪽에면역특이적인 IgG 유사구조를가진 4가의이중특이성디아바디 (CBD) 를발현하도록설계되어있다. 배양 3일후, 조건배지를회수했다. 조건배지중의분비산물의양을항IgG Fc ELISA에의해, 정제한 Fc를기준으로서사용해서정량화했다. 그후에샘플중의산물의농도를정량값에기초하여정규화하고, 이정규화한샘플을이후의분석에사용했다. ELISA: 배지중에분비된디아바디분자의결합성을, 상기샌드위치 ELISA에의해분석했다. 특별히나타낸경우를제외하고, CD32B를플레이트코팅용으로, 즉표적단백질로서사용했다. 또 HRP 결합 CD16을프로브로서사용했다. 웨스턴블랏 : 상기 3개의동시형질도입으로부터의조건배지약 15ml를 SDS-PAGE에의해비환원조건하에서해석했다. 1장의겔을 Simply Blue Safestain(Invitrogen) 으로염색하고, 계속해서, 동일겔을일반적인전사방법을사용해서 PVDF멤브레인 (Invitrogen) 에전사했다. 전사후, 멤브레인을 1 PBS중의 5% 탈지분유에서블로킹했다. 그후에멤브레인을 2% 탈지분유 1 PBS/0.1% Tween 20중의 1:8000 희석한 HRP 결합염소항인간 IgG1 H+L 항체 10ml 중에서실온에서 1시간조용히교반하면서인큐베이션했다. 1 PBS/0.3% Tween 20에서, 각각 5분간씩 2회세정한후, ECL 웨스턴블로팅검출시스템 (Amersham Biosciences) 을사용하여, 사용설명서에따라실온에서 20분간멤브레인을노광했다. 필름을 X선처리장치로현상했다. 결과

110 [0511] [0512] [0513] [0514] [0515] [0516] [0517] [0518] [0519] [0520] 컨스트럭트 1 및 9, 컨스트럭트 1 및 10, 및컨스트럭트 11 및 12를포함하는재조합발현시스템유래의조건배지를, SDS-PAGE( 비환원조건하 ) 해석및웨스턴블랏팅 ( 항IgG를프로브로서사용 ) 에의해해석했다. 웨스턴블랏에의해컨스트럭트 11 및 12를포함하는계또는컨스트럭트 9 및 1을포함하는계유래의산물은, 주로약 150kDa의단일분자종 ( 각각도 15의레인 3 및 2) 을형성하는것이분명해졌다. 이들산물은모두내부이황화결합이디아바디를구성하는 가벼운 및 무거운 쇄간에설계되어있다. 한편, 가벼운 및 무거운 쇄간에내부이황화결합이설계되어있지않은컨스트럭트 10 및 1로부터형성된분자는분자량약 75kDa 및약 100kDa( 도 15의레인 1) 의적어도 2개의분자종을형성했다. 웨스턴블랏의결과에도불구하고, 3개의산물의각각이 CD32A 및 CD16의양쪽과결합할수있는것을알수있었다 ( 도 16). 놀랍게도 C말단에힌지-Fc도메인을포함하는산물 ( 컨스트럭트 11 및 12로부터형성됨 ) 에비해, Fc( 또는 Fc-힌지 ) 도메인이 Fc함유폴리펩티드사슬 ( 즉, 무거운 쇄) 의아미노말단에있는양쪽의발현시스템유래의산물 ( 컨스트럭트 9+1 및컨스트럭트 10+1) 에서는그표적펩티드 ( 즉 CD32B 및 / 또는 CD16) 의한쪽또는양쪽에대한친화성및 / 또는결합력이증강되는것이실증되었다 폴리프로테인전구체의프로세싱에있어서의내부 / 외부절단부위의효과, 및공유결합형이중특이성디아바디의발현 ; 인간 IgG 람다쇄및힌지도메인의일부를포함하는이중특이성디아바디의설계및특성분석본명세서에서설명한바와같이, 본발명의디아바디의개개의폴리펩티드사슬또는디아바디분자를단일의폴리프로테인전구체분자로서발현시킬수있다. 실시예 6.1~6.3에서설명한재조합계의상기폴리프로테인전구체로부터기능적인 CBD를적절히프로세싱해서발현하는능력은내부절단부위 ( 특히푸린절단부위 ) 에의해분리되는 CBD의제1 및제2 폴리펩티드사슬의양쪽을코드하는핵산을제작함으로써시험했다. 기능적인 CBD는폴리프로테인전구체분자를포함하는재조합계로부터단리했다. 실시예 6.3에서이미서술한바와같이, 인간κ 경쇄유래의 C말단의 6아미노산 FNRGEC( 서열번호 23) 의부가는디아바디형성을안정화하는것을알수있었다. 아마도이것은서열번호 23을포함하는도메인과, Fc도메인또는힌지-Fc도메인을포함하는도메인간에서쇄간상호작용이증강되기때문이라고생각된다. 이람다쇄 /Fc 유사상호작용의안정효과를어느쪽의폴리펩티드사슬도 Fc도메인을포함하지않는 CBD에서시험했다. 디아바디의한쪽의폴리펩티드사슬을유전자조작하고, 그 C말단에서열번호 23을도입했다. 그상대방이되는폴리펩티드사슬은 IgG의힌지도메인에유래하는아미노산서열 VEPKSC( 서열번호 77) 를포함하도록유전자조작했다. 이 CBD와컨스트럭트 1 및 2를포함하는 CBD( 실시예 6.1 유래 ) 의비교에의해, 힌지도메인및람다쇄에유래하는도메인을포함하는 CBD는그표적에피토프의한쪽또는양쪽에대하여약간큰친화성을나타내는것이분명해졌다. 재료와방법 폴리펩티드분자의구축및설계 : ( 폴리프로테인전구체 ): 2개의폴리프로테인전구체분자를제작하기위해서핵산발현벡터를설계했다. 양분자모두도 17에모식도로나타내고있다. 컨스트럭트 13( 서열번호 95) 은폴리펩티드사슬의 N말단측으로부터순서대로 3G8의 VL도메인, 2.4G2의 VH도메인 (mcd32b에결합함 ), 푸린절단부위, 2.4G2의 VL도메인, 및 3G8의 VH도메인을포함하고있다. 컨스트럭트 13을코드하는뉴클레오티드서열을서열번호 96에나타낸다. 컨스트럭트 14( 서열번호 97)( 도 17) 는폴리펩티드사슬의 N말단측으로부터순서대로 3G8의 VL도메인, 2.4G2의 VH도메인 (mcd32b에결합함 ), 푸린절단부위, FMD( 구제역바이러스프로테아제 C3) 부위, 2.4G2의 VL도메인, 및 3G8의 VH도메인을포함하고있다. 컨스트럭트 14를코드하는뉴클레오티드서열을서열번호 98에나타낸다. 핵산발현벡터를실시예 6.1에서나타낸컨스트럭트 1 및 2의개변형을제작하기위해서설계했다. 컨스트럭트 15( 서열번호 99)( 도 17) 는컨스트럭트 15의 C말단이아미노산서열 FNRGEC( 서열번호 23) 를포함하는것을제외하면, 실시예 6.1에서나타낸컨스트럭트 1( 서열번호 9) 에유사하다. 컨스트럭트 15를코드하는핵산서열을서열번호 100에나타낸다. 컨스트럭트 16( 서열번호 101)( 도 17) 은컨스트럭트 16의 C말단이아미노산서열 VEPSK ( 서열번호 77) 를포함하는것을제외하면, 실시예 6.1에서나타낸컨스트럭트 2에유사하다. 컨스트럭트 16을코드하는핵산서열을서열번호 102에나타낸다. PCR 및발현벡터의구축 : PCR 및 PCR산물의정제프로토콜은모두실시예 6.1 및 6.2에서설명한바와같다. 중복 PCR: 실시예 6.1 및 6.2에기재된방법을사용하고, 적당한프라이머를사용하여, 최종산물을구축하고증폭하고정제했다

111 [0521] 최종산물을상기서술한바와같이포유동물발현벡터 pcineo(promega, Inc.) 내에클론화했다. 컨스트럭트를 코드하는플라스미드는표 30 에나타나있는바와같이명명했다. [0522] 표 30 플라스미드컨스트럭트 암호화컨스트럭트 플라스미드명 삽입물 13 pmgx0750 3G8VL-2.4G2VH-Furin-2.4G2VL-3G8VH 15 pmgx0752 Hu2B6VL-Hu3G8VH-FNRGEC 16 pmgx0753 Hu3G8VL-Hu2B6VH-VEPKSC [0523] [0524] [0525] [0526] [0527] [0528] [0529] [0530] 폴리펩티드 / 디아바디의발현 : 섹션 6.1에서기재한바와같이리포펙타민2000을사용해서 HEK-293 세포내에 1회의트랜스펙션및 1회의동시형질도입을행했다. 단독의트랜스펙션에서는컨스트럭트 13을코드하는 pmgx0750 을, 또동시형질도입에서는컨스트럭트 15 및 16을각각코드하는 pmgx0752 및 pmgx0753을사용했다. 배양 3일후, 조건배지를회수하고, 분비된산물을상기한바와같이친화성정제했다. ELISA: 배지중에분비된디아바디분자의결합성을상기샌드위치 ELISA에의해분석했다. 마우스 CD32B를표적단백질로서사용해서플레이트를코팅했다. 또 HRP 결합 CD16을컨스트럭트 15 및 16의동시형질도입의산물용프로브로서사용했다. mcd32b를표적단백질로서사용하고, 또비오틴결합 CD16A를컨스트럭트 13을포함하는재조합계용의프로브로서사용했다. 결과컨스트럭트 13을포함하는재조합발현시스템로부터얻어진조건배지를샌드위치ELISA에서해석했다. ELISA 분석은 mcd32b 및 / 또는 CD16의한쪽또는양쪽에대한특이성에대해서 CBD의결합성을시험했다 ( 도 18). CD32B 를표적항원으로서이용하고, 또 CD16A를 2차프로브로서사용했다. ELISA에있어서의양성시그널에의해, 폴리프로테인전구체로부터생성되는헤테로 2량체 h2.4g2-h3g8 CBD는양항원에대하여특이성을갖는것이분명해졌다. 마찬가지로, 컨스트럭트 15 및 16을코드하는벡터의동시형질도입에의해생긴정제산물을 ELISA 분석에서시험하고, 컨스트럭트 1 및 2로이루어지는산물 ( 실시예 6.1) 과비교했다. CD32B를표적항원으로서이용하고, 또 CD16A를 2차프로브로서사용했다. 컨스트럭트 1 및 2로이루어지는산물과마찬가지로, 컨스트럭트 15 및 16의산물은동시에 CD32B 및 CD16A와결합할수있는것을알수있었다. 오히려, 컨스트럭트 15 및 16의산물이표적항원, 즉 CD32B 또는 CD16A의한쪽또는양쪽에대하여약간증강된친화성을갖는것을알수있었다. 이것은아마컨스트럭트 1 및 2로이루어지는산물에는없는람다쇄영역 FNRGEC( 서열번호 23) 와힌지영역 VEPKSC ( 서열번호 77) 의상호작용에의해주어지는쇄간결합의안정성및 / 또는충실도의증가 ( 야생형의 VH-VL도메인의상호작용과비교했을때 ) 에의한것이라고생각된다 다중친화도를함께연결하기위한, 이중친화성재표적화시약 (DUAL AFFINITY RETARGETING REAGENTS("DART")) 의이용본발명의하나의구체예는, 다중친화도를함께연결하는새로운방법뿐아니라, 신규의이중친화성재표적화시약 (dual affinity retargeting reagents)("darts") 에관한것이다. 이 "DART" 는단일특이성, 이중특이성, 삼중특이성등일수있고, 따라서하나이상의상이한에피토프 ( 동일또는다른항원의 ) 에동시에결합할수있다. 또한, "DART" 는 1가, 2가, 3가, 4가, 6가, 8가등일수있고, 따라서하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯또는그이상의분자에동시에결합할수있다. 도 35에나타낸바와같이, DART의이러한두가지특성이조합되어, 예를들면 4가등의이중특이성항체들을생성할수있다. 헵텐 (hapten), 플루오레세인 ( 플루오레세인 ) 에대한친화성뿐만아니라, 원형의 (prototypic) 면역수용체인 hucd32b에대한친화성을갖는 DART를개발한점은발전된것이다. "2B6/4420" 라고칭하는이 DART는보편적인어댑터로서작용하고, 플루오레세인이연결된결합파트너와반응하는분자와 hucd32b를같이연결시킬수있다. CD32B는, 활성신호와면역복합체를집합시켜, 활성화신호를켄치 (quench) 하는능력을갖는 Fc 수용체이다. 초기실시에서, 이기술은새로운 DART 컨스트럭트를만들필요없이 hucd32b를모이게하기위한몇몇생물학적표적을신속히스크리닝할수있게해준다. 2B6/4420는단지세포표면수용체에대한플루오레세인화항체와혼합될수있고, 따라서이수용체에대한친화성을갖는 DART의작용을모사할수있다 ( 도 20)

112 더욱이, DART 시약은쉽게발현또는생산되지않는친화성시약의효율적인연결 (linkage) 을허용하기때문에, 기술적인제약을극복할수있다. 2B6/4420-함유 DART는리서치도구와임상적인후보로서매우유용하다. HEK293 세포로부터생성되는 2B6/4420는 ELISA 분석에서 CD32B 및플루오레세인에동시에결합할수있다. 또한, 이것은 CD79와의결합을통하여 BCR 복합체에대해 CD32B을모음으로써세포증식을저해할수있다. DART의 2B6 arm은다른관련된특이성을갖는상이한항체서열또는결합서열로대체될수있다. [0531] [0532] [0533] [0534] [0535] [0536] 재료와방법플라스미드컨스트럭트 : 2B6/4420는인간화 2B6 MAb(hu2B6, MGA321) 및키메라마우스 Fv/ 인간 Fc 버전의항- 플루오레세인 MAb, 4420의서열에서유래한다. 완전히어셈블된 DART는 2개의폴리펩티드로구성되고, 2개의 Fv 영역이공유결합한다. 제 1 폴리펩티드는분비신호서열과그뒤에 hu2b6vl로이루어지며, 이 hu2b6vl는아미노산잔기 GGGSGGGG로구성되는링커에의해분리된 4420VH와의융합단백질로서생산된다. 카파경쇄의 C-말단유래의서열 FNRGEC는이폴리펩티드의 C-말단에첨부되어있다. 나머지폴리펩티드는신호서열-4420VL- GGGSGGGG-hu2B6VH로구성되고, 그 C-말단에는인간 IgG1 Fd 단편의 C-말단에서유래된서열 VEPKSC이첨부되어있다. 이 2개의쇄에있는시스테인은이황화결합을형성하여, 2개의폴리펩티드사슬을공유결합시킨다 ( 도 20). 설명된폴리펩티드를암호화하는 DNA 서열은존재하는플라스미드로부터 PCR 증폭하고, 오버랩 PCR에의해결합하고, pcineo(promega) 의 Nhe I와 EcoR I 사이내로클로닝하였다. 마지막으로, 위에서설명한것과유사한방법을이용하여앞서구성된 hucd32b 및 hucdlβ(2b6/3g8) 에대해친화성을갖는 DART를대조군으로서이용하였다. 항체 : 뮤린 (murine) 단일클론항체항-인간 CD79b, CB3.1 및 CB3.2( 하이브리도마 ) 를 Dr. Cooper MD, University of Alabama at Birmingham, Birmingham AL로부터구입하였다. CB3.1와 CB3.2는제조사의사용법 (Pierce, Rockford IL) 에따라플루오레세인이소티오시아네이트 (FITC) 로표지하였다. Fc-단편-특이적인, 염소항-마우스 (GAM) IgG의 F(ab')2 단편은 Jackson Laboratories(West Grove, PA) 로부터구입하였다. 항-huCD32B 마우스 MAb, 3H7는인하우스로제조및정제하였다. 염소항-2B6Fv는, hu2b6 전체항체로염소를면역화하고, hu2b6의 Fv 영역에대하여친화성정제함으로써제조하였다. HuIgG, FITC-huIgG 및 HRP-항-마우스 IgG는 Jackson Immunoresearch로부터구입하였다. HRP-항-염소는 Southern Biotech로부터구입하였다. DART 발현 : 각쇄를암호화하는플라스미드를제조사의사용법에따라리포펙타민 2000(Invitrogen) 으로 293H 세포 (Invitrogen) 내로공동삽입시켰다. 분비된단백질을 3일간격으로 3-4회수집하여, CD32B의고정화된가용성형태에대해액체크로마토그래피하여정제하였다. ELISA: 2B6/4420 또는 2B6/3G8 DART를, FITC-표지된단백질 S(Novagen), 인간 IgG 또는 FITC-huIgG로코팅딘 MaxiSorp 플레이트 (NalgeNunc) 상에캡처하였다. 가용성 CD32B 엑토도메인 (ectodomain) 과, 이어서 3H7(CD32B에특이적인마우스단일클론항체 ) 와, 마지막으로항-마우스-HRP을결합시킴으로써검출을실시하였다. 또는, 염소항-2B6 Fv 다중클론친화성정제된항혈청과, 이어서항-염소-HRP을결합시킴으로써검출하였다. HRP 활성은 colorimetric TMB substrate(biofx) 을이용하여측정하고, VersaMax ELISA 플레이트리더로읽었다. B 세포정제및증식분석 : 말초혈액단핵세포를, 건강한공여자의혈액을이용하여 Ficoll/Paque Plus(Amersham Pharmacia Biotech, UK) 구배방법으로분리하였다. B 림프구를제조사의사용법에따라 Dynal B Cell Negative Isolation Kit(Dynal Biotechnology Inc., NY) 을이용하여단리하였다. 단리된 B 세포 (CD20) 의순도는 FACS 분석으로계산한결과 90% 보다높았다. 증식분석을위해, 정제된 B 세포를평면바닥의 96-웰마이크로타이터플레이트에서완전 RPMI 1640 배지에 200μl의최종농도로서웰당 1x10 5 세포밀도로씨딩하고, 항체및디아바디의존재또는부존재하에서 5% CO 2, 37 에서 48시간동안배양하였다. 1μCi/well 의 [ 3 H] 티미딘 (Perkin Elmer, Wellesley, MA) 를첨가하고, 수집전에 시간동안계속배양하였다. [ 3 H] 티미 딘삽입은액체섬광계수기 (Liquid Scintillation Counter) 로측정하였다. [0537] [0538] 결과 2B6/4420 DART가활성이고특이적임을증명하기위하여, 2개의 ELISA 실험을수행하였다. 첫째, 2B6/4420 또는 2B6/3G8( 음성대조군 ) 를 ELISA 플레이트상에코팅된플루오레세인-결합형단백질 (S-단백질) 에결합시켰다. 다음으로 DART의 2B6 arm을가용성 CD32B으로처리하였다. 2B6의것과오버랩되지않는에피토프를갖는 CD32B에대한다른항체, 이어서 HRP-연결형 2차항체로결합을측정하였다. 2B6/4420 DART가플루오레세인과 CD32B에동시에결합할수있는반면, 2B6/3G8는그렇지못하였다 ( 도 21a). DART를가용성 CD32B로코팅된플레이트상에

113 캡처하여, hu2b6 Fv에특이적인항체에의해그결합을검출한결과, 양 DART는우수한결합을보인다. 2B6/4420 DART가인간 IgG에연결된플루오레세인에결합할수있음을증명하기위하여 ( 이것이이시약의초기실시라는조건에서 ), 플루오레세인으로표지또는비표지된 HuIgG을 ELISA 플레이트에결합시켜, 2B6/4420의캡처에이용하였다. 다시, 2B6/3G8을음성대조군으로이용하였다. 결합은 Hu2B6 Fv에특이적인항체를사용하여검출하였다. 2B6/4420 DART는 FITC-HuIgG에는결합하였지만, 비표지 HuIgG에는결합하지않았으며, 이는 DART가항체에결합된플루오레세인에결합할수있고, 항체단독에는유의있는결합이없음을나타낸다. 예상한바와같이, 이러한맥락에서, 2B6/3G8 DART에의해어떠한결합도검출되지않았다. [0539] 2B6/4420 DART가, 세포계분석에서신호전달에영향을미칠수있는이중친화성시약으로서작용할수있음을증명하는실험을수행하였다. BCR와 CD32B의공응집은 B 세포활성을저해하는것으로나타났다. 플루오레세인으로표지된 αcd79b 항체로코팅된 BCR와 CD32B의공응집을유도하여, 세포증식의저해를유도하는 2B6/4420 DART의능력을조사하였다. 인간혈액에서 B 세포를음성적으로선택하고, FITC-표지된마우스항-인간-CD79b의농도를증가시켜클론 CB3.1 및 CB3.2에처리하고, BCR을교차연결하기위한 2차시약으로서 Fc-특이적 GAM의 F(ab')2 단편을고정된농도 (5μg/mL) 의 2B6/4420 DART 또는동량의 2B6/3G8 DART( 플루오레세인을표적화하지 않는분자로서, 대조군으로이용 ) 와함께첨가하여활성화시켰다. [ 3 H]-티미딘삽입으로측정되는세포증식은, DART의부재또는대조군 2B6/3G8 DART의존재하에서, 단일클론항-CD79b-FITC 활성제의농도가증가함에따라증가하였다. 2B6/4420 DART가존재하면모든농도의항-인간 CD79b-FITC에서 B-세포증식이상당히감소되었다 ( 도 22, 패널 A 및 B, 도 23, 패널 A) [0540] [0541] [0542] 비표지된 CB3.2로코팅되고, 같은실험조건으로활성화된 B 세포가 2B6/4420 DART로처리되었을때는, 증식의저해가관찰되지않았으며, 이는표적-특이성을증명하는것이다 ( 도 23, 패널 B). 이러한데이터는, 2B6/4420 DART가 CD32B와 BCR을교차결합시켜, 항원-수용체-유도된세포활성을차단할수있는저해신호를전달할수있음을나타낸다 CD32B 발현 B세포악성종양에대한 DART 면역치료제현재, B세포악성종양은리투산 (Rituxan ) 항-CD20 항체를이용하여치료된다. 그러나, 몇몇 B세포악성종양은 CD20 을발현하지않거나또는 Rituxan 에저항성이있다. 본발명의 DART 는 Rituxan 항 -CD20 항체와관련된문 제를극복할수있는대안적인면역치료제를제공한다. [0543] [0544] [0545] MGD261은 hcd32b(h2b6 항체를통하여 ) 및 hcd16a 및 hcd16b(h3g8 항체를통하여 ) 에결합하는이중친화성재표적화 (DART) 분자이다. MGD261의효능 (B 세포제거 ) 및안정성은 mcd32-/-hcd16a+ C57B1/6, mcd32-/-hcd32b+ C57B1/6 및 mcd32-/- hcd16a+ hcd32b+ C57B1/6에서시험되었다. 이러한반복투여량 (dose) 실험에서, 마우스는 3주동안일주일에 2번총 6번의 IV 주사를받았다. B 세포제거는 FACS로모니터하였고, 안정성은케이지사이드 (cage side) 관찰로모니터하였다. 데이터 : MacroGenics 사육콜로니유래의 mcd32-/-hcd16a+ C57B1/6, mcd32-/-hcd32b+ C57B1/6 및 mcd32-/- hcd16a+ hcd32b+ C57B1/6 마우스를, 0, 3, 7, 10, 14 및 17일째에, MGD261(10, 3, 1 또는 0.3mg/kg) 또는무관한항체 (he16 10mg/kg) 로 IV 주사하였다. FACS 분석을위해 -19( 사육전 ), 4, 11, 18, 25 및 32일째에혈액을수집하였다. 일주일에세번동물의건강및활동을기록하였다

114 [0546] 디자인 : [0547] [0548] [0549] [0550] [0551] [0552] [0553] [0554] [0555] FACS 분석방법 : h2b6-h3g8 투여전 18일째와처리후 4, 11, 18, 25 및 32일째에전체혈액샘플을수집하였다. FACS 분석으로 B 세포수에미치는 h2b6-h3g8의효과를결정하기위해혈액샘플을분석하였다. Beckman Coulter사에서구입한 FlowCount 비즈를이용하여 B 세포, T 세포및 PMN를카운트하기위해, 비세정프로토콜을사용하였다. 상기분석에이용된항체의패널은, PMN에대하여는 1A8-FITC, T 세포에대하여는 CD3- PE, B 세포에대하여는 CD19-APC, 및총백혈구 (leukocyte) 에대하여는 CD45-PerCP이다. 결과어떤농도의 he16 또는 MGD261로처리된마우스는실험동안불편함의어떠한징후도보이지않았다. B 세포제거는 hcd16a와 hcd32b의이중트랜스제닉마우스에서관찰되었다. 디아바디 h2b6-3g8가 hcd16a를발현하는이펙터세포및 hcd32b를발현하는 B 세포에관여한다 ; 이러한관여는 B 세포사멸에필요하다. B 세포제거는단일트랜스제닉마우스에서는관찰되지않았다 ( 도 24). 연구동안, T 세포와 PMN 수준의유의있는변화는없었다. 본발명의대안적인치료제를더욱증명하기위하여, "2.4G2-3G8 DB" 라고명명된 MGD261의대용물을제조하였다. 2.4G2-3G8 DB는 mcd32b(2.4g2 항체를통하여 ) 및 hcd16a 및 hcd16b(h3g8 항체를통하여 ) 에결합하는이중특이성재표적화 (DART) 분자이다. 2.4G2-3G8 DB의효능 (B 세포제거 ) 및안정성은 mcd16-/-, mcd16-/-hcd16a+ C57B1/6, mcd16-/-hcd16b+ 및 mcdl β-/-hcd16a+ hcd16b+ 마우스에서시험되었다. 이러한반복투여량 (dose) 실험에서, 마우스는 3주동안일주일에 3번총 9번의 IV 주사를받았다. B 세포제거는 FACS로모니터하였고, 안정성은케이지사이드 (cage side) 관찰로모니터하였다. 데이터에의하면, 2.4G2-3G8 DB는어떠한유의있는부작용없이 hcd16 트랜스제닉마우스에서 B 세포를제거할수있음을보여준다. 데이터 : MacroGenics 사육콜로니유래의 mcd16-/-, mcd16-/-hcd16a+ C57B1/6, mcd16-/-hcd16b+ 및 mcd16-/- hcd16a+ hcd16b+ 마우스를, 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 및 18일째에, 2.4G2-3G8 DB(75ug/ 마우스 ) 또는 PBS로 IP 주사하였다. FACS 분석을위해 -10( 사육전 ), 4, 11 및 18일째에혈액을수집하였다. 일주일에세번동물의건강및활동을기록하였다. [0556] [0557] FACS 분석방법 : 2.4G2-3G8 투여전 10 일째와처리개시후 4, 11 및 18 일째에전체혈액샘플을수집하였다

115 FACS 분석으로 B 세포수에미치는 2.4G2-3G8의효과를결정하기위해혈액샘플을분석하였다. BD Immunocytometry System사에서구입한 TruCOUNT 튜브를이용하여 B 세포, T 세포및 PMN를카운트하기위해, 비세정프로토콜을사용하였다. 상기분석에이용된항체의패널은, PMN에대하여는 1A8-FITC, T 세포에대하여는 CD3-PE, B 세포에대하여는 CD19-APC, 및총백혈구 (leukocyte) 에대하여는 CD45-PerCP이다. [0558] [0559] [0560] [0561] [0562] [0563] [0564] [0565] 결과 he16 또는 2.4G2-3G8 DB로처리된마우스는실험동안불편함의어떠한징후도보이지않았다. B 세포제거는 mcd16-/-hcd16a+ 또는 mcd 16-/-hCD16A+ hcd16b+ 마우스에서관찰되었으나, mcd16-/-마우스에서는관찰되지않았다. 이러한데이터는, hcd16a를운반하는이펙터세포가 B 세포사멸을위해필요하다는것을나타낸다 ( 도 25). 연구동안, T 세포와 PMN 수준의유의있는변화는없었다. 정맥 (IV) 모델 : 인간종양세포주 Raji의정맥 (IV) 모델을이용하여, MGD261의항-종양활성을시험하였다. Raji 는 hcd32b를발현하는인간 Burkitt 림프종세포주이다. mcd16-/-, hcd16a+, RAG1-/-마우스에서정맥주사하면, 종양세포가척추에위치하고다리마비를일으킨다. 데이터에의하면, MGD261가 mcd16-/-, hcd16a+, RAG1-/-in vivo 마우스에서 Raji 종양세포성장을차단할수있고, MGD261가인간에서 CD32B를발현하는 B세포악성종양의치료에이용될수있음을보여준다. 데이터 : MacroGenics 사육콜로니유래의 12-20주령의 mcd16-/-, hcd16a+, RAG1-/-C57B1/6 마우스를 0일째되는날 5xlO 6 Raji 세포로 IV 주사하였다. 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27 및 30일째에, 마우스를 250, 25 또는 2.5ug 의 MGD261 또는 PBS( 대조군 ) 로복강 (IP) 주사하였다. 마우스를매일관찰하여, 일주일에두번씩체중을기록하였다. 다리마비를보이는마우스를희생시켰다. 결과 PBS로처리한마우스는 25일과 50일사이에죽었다. MGD261로처리한마우스는적어도 90일까지는생존하였다 ( 도 26). 생존율이증가한점은통계학적으로중요하다. Logrank Test를이용한생존곡선의비교결과 96.46의 χ 2 (df 9; P 값 < ) 이었다. [0566] [0567] [0568] [0569] [0570] [0571] 6.7. 원핵생물에서의 DART 발현비-포유류숙주에서 DART를생산하는능력을증명하기위한실험을수행하였다. 따라서, E. coli를 DART-발현플라스미드로형질전환하여, DART 발현을모니터하였다. 재료와방법플라스미드제조 : 3G8은 HuCD16에대한인간화단일클론항체이다. 여기서설명된 DART는 2개의공유결합된쇄로구성되고, 이들각각의쇄는 VL-스페이서-VH-Cys를갖고, 반대쇄와이황화결합을형성한다. 3G8VL- GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly-3G8VH-LeuGlyGlyCys를암호화하는 DART 서열은존재하는진핵발현컨스트럭트로부터 PCR 증폭하여, Nco I 및 EcoR I으로절단하였다. 표적벡터는 pet25b(+)(novagen) 이고, 이는 E. coli에서분비를위한 pelb 리더서열을포함한다. 3G8/3G8 DART 서열의삽입전에, 이벡터를다음과같이변형시켰다 : 첫째, 콘드롤하에서, 가용성이지만낮은수준의단백질발현을위해, T7 프로모터를 lαc 프로모터로치환하였다. 또한, pelb 리더의시작점에존재하는 Met에서의개시를위해, 다중클로닝사이트 (MCS) 의시작점에존재하는 2개의인터널 Met 코돈을제거하도록, 2개의점돌연변이를도입하였다. 이컨스트럭트에의해생산되는 DART 는동일한특이성, 즉 HuCD 16를갖는 2개의 V-영역 arm으로구성된다. 발현 : BL21DE3 세포 (Novagen) 를 pet25b(+) T7-lαc+3G8/3G8 플라스미드로형질전환하고, amp-저항콜로니를씨드배양에사용하였다. 배양물이 0.5 OD 600 unit에이르면, 발현을유도하기위하여 0.5mM IPTG를첨가하였다. 배양액은 300 에서 2시간동안성장시키고, 세포가없는배지를수집하였다. 정제 : 3G8/3G8 DART를친화성및사이즈배제크로마토그래피를이용하여 2단계공정으로정제하였다. 이 DART 를친화성크로마토그래피를이용하여조건배지로부터캡처하였다. 특히, CD16A는 CNBr로활성화된 Sepharose 4B(GE Healthcare) 에커플링되었다. 이 CD16A-Sepharose 수지를로딩하기에앞서 20mM Tris/HCl, ph 8.0로평형화하였다. 로딩이완성되면, 결합된 DART를 50mM 글리신 ph 3.0으로용출하기에앞서, 상기수지를평형완충액으로세정하였다. 용출된 DART는즉시 1M Tris/HCl ph 8.0로중화하고, 원심분리타입농축기 (Vivaspin 20, 10k MWCO PES, VivaScience Inc.) 으로농축시켰다. 농축된 DART는, PBS로평형화된 Superdex 200 칼럼 (GE

116 Healthcare) 을이용하여사이즈배제크로마토그래피로더욱정제하였다. [0572] [0573] [0574] 결과 1.7리터의 E coli 배양조건배지를 CD16A Sepharose 칼럼에통과시켰다. DART의수율은 0.12mg이었다. SDS- PAGE 및 SEC에의해정제된 DART를분석한결과, 포유동물세포 (CHO) 발현된대조군 DART와비슷한양상을보였다 ( 도 27). E.coli에서발현된 h3g8-h3g8 DART 결합 ELISA: ELISA를이용하여 E.coli에서의 h3g8-h3g8 DART 발현을측정하였다. 2μg/ml의항-h3G8 Fv 특이항체 2C11를, 50μl/well의양으로, 탄산완충액중의 96-웰 Maxisorp 플레이트상에 4 에서밤새코팅시켰다. 시험 DART를첨가하기전에, 이플레이트를 PBS-T(PBS, 0.1% Tween 20) 으로 3 회세정한후, PBS-T중의 0.5% BSA로실온에서 30분동안블락킹시켰다. 블락킹동안, E.coli 발현 h3g8-h3g8 DART, h2b6-h3g8 DART 및 h2b6-h2b6 DART( 음성대조군 ) 을 PBST/BSA로 1μg/ml 및 0.3μg/ml로희석시켰다. 희석된 DART를 50μl/well의양으로각웰에첨가하였다. 이플레이트를실온에서 1시간동안배양하였다. PBS-T로 3회세정한후, 0.1μg/ml의비오틴화 scd16-fc 융합단백질을플레이트에 50μl/well의양으로첨가하였다. 이플레이트를실온에서 1시간동안배양하였다. PBS-T로 3회세정한후, 검출을위해1:5000 희석된 HRP 결합스트렙타비딘 (Amersham Pharmacia Biotech) 을 50μl/well으로이용한후, 실온에서 1시간동안배양하였다. 이플레이트를 PBS-T로 3회세정한후, 80ul/well의 TMB 기질을이용하여현상하였다. 5분간배양후, 이반응을 1% H 2 SO 4 40μl/well로정지시켰다. 96-웰플레이트리더기와 SOFTmax 소프트웨어를이용하여 OD450nm를판독하였 다. GraphPadPrism 3.03 소프트웨어를이용하여그결과를플롯팅하였다 ( 도 28). [0575] [0576] [0577] [0578] [0579] [0580] [0581] [0582] [0583] [0584] [0585] [0586] [0587] [0588] [0589] [0590] [0591] [0592] [0593] [0594] [0595] 6.8. DART-유도인간 B-세포사멸인간 PBMC를밤새 CD16-CD32B-hu3G8-hu2b6( 상기설명 ); ch2b6-aglyc-aglycosylated 키메라 2B6 항체 ( 본명세서에참조로서포함되며, 미국출원계속중인미국특허출원 Serial 번호 11/108,135, 공개번호 US 2005/ 에서설명 ) 및 CD16-CD79로배양하였다. CD16-CD79의 DNA 및단백질서열은다음과같다 : H3G8VL-CB3.1VH 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 226): gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga 50 gagggccacc atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg 100 atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc 150 ctcatctata ctacatccaa tctagaatct ggggtcccag acaggtttag 200 tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc agcctgcagg 250 ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300 acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggagg 350 cggaggccag gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg 400 gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc 450 tactggatga actgggtgaa gcagaggcct ggacaaggcc ttgaatggat 500 tggtatggtt gatccttcag acagtgaaac tcactacaat caaatgttca 550 aggacaaggc cacattgact gttgacaaat cctccagcac agcctacatg 600 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag 650 agctatgggc tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagttg 700 agcccaaatc ttgt 714 아미노산서열 ( 서열번호 227): DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL

117 [0596] [0597] [0598] [0599] [0600] [0601] [0602] [0603] [0604] [0605] [0606] [0607] [0608] [0609] [0610] [0611] [0612] [0613] [0614] [0615] [0616] [0617] [0618] [0619] [0620] [0621] [0622] [0623] [0624] [0625] [0626] [0627] LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY 100 TFGQGTKLEI KGGGSGGGGQ VQLQQPGAEL VRPGASVKLS CKASGYTFTS 150 YWMNWVKQRP GQGLEWIGMV DPSDSETHYN QMFKDKATLT VDKSSSTAYM 200 QLSSLTSEDS AVYYCARAMG YWGQGTSVTV SSVEPKSC 238 CB3.1VL-h3G8VH 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 228): gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50 accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100 gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150 cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200 cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250 aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc caggttaccc tgagagagtc tggccctgcg ctggtgaagc 400 ccacacagac cctcacactg acttgtacct tctctgggtt ttcactgagc 450 acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt cagcctcccg ggaaggctct 500 agagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc tataatccag 550 ccctgaagag ccgactgaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggta 600 gtcctcacaa tgaccaacat ggaccctgtg gatactgcca catactactg 650 tgctcaaata aaccccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg 700 tcactgtgag ctcattcaac aggggagagt gt 732 아미노산서열 ( 서열번호 229): DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100 LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS 150 TSGMGVGWIR QPPGKALEWL AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV 200 VLTMTNMDPV DTATYYCAQI NPAWFAYWGQ GTLVTVSSFN RGEC 244 어팝토시스는 FACS 분석으로총 FSC/SSC ungated population 상의 B 세포 (CD20+ 세포 ) 의 PI+Annexin-V+ population의퍼센트로서분석하였다 ( 도 29) B5-CB3.1 DART 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC 프라이머로서 H9 및 lgh630r을이용하고, 주형 (template) 으로서 ch8b5lc을이용하여 8B5VL를증폭시켰다. 프라이머로서 lgh628f 및 lgh629r을이용하고, 주형으로서 ch8b5lc을이용하여 CB3.1VH를증폭시켰다. 링커서열을프라이머 lgh628f 및 lgh629r에삽입시켰다. c-말단링커와정지코돈을 lgh629r 프라이머에삽입시켰다. 이 PCR 산물을겔정제하여동등몰비로함께혼합한후, 프라이머로서 H9 및 lgh629r을이용하여증폭하였다. 오버랩된 PCR 산물을 Nhel/EcoRI 제한효소로절단한후, pcineo 벡터내로클로닝하였다. CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC

118 [0628] [0629] [0630] [0631] [0632] [0633] [0634] [0635] [0636] [0637] [0638] [0639] [0640] [0641] [0642] [0643] [0644] [0645] [0646] [0647] [0648] [0649] [0650] [0651] [0652] H9 및 lgh630r을이용하여 CB3.1VL를증폭하고, H9 및 lgh630r는프라이머로서 FR4의 8B5VL, 주형으로서 chcb3.1lc와동일한서열을공유하였다. 8B5VH는프라이머로서 lgh631f 및 lgh640r을이용하고, 주형으로서 ch8b5hc을이용하여증폭하였다. 링커서열을프라이머 lgh631f 및 lgh640r에삽입시켰다. c-말단링커와정지코돈을 lgh640r 프라이머에삽입시켰다. 이 PCR 산물을겔정제하여동등몰비로함께혼합한후, 프라이머로서 H9 및 lgh640r을이용하여증폭하였다. 오버랩된 PCR 산물을 Nhel/EcoRI 제한효소로절단한후, pcineo 벡터내로클로닝하였다. 항-Flag 태그-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC 항-Flag 태그를오버랩 PCR을이용하여신호서열과 8B5VL 사이에삽입시켰다. 이신호서열과 Flag 태그를, 프라이머로서 H9 및 lgh647r을이용하고주형으로서 ch8b5lc을이용하여증폭하였다. 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC를프라이머로서 lgh647f 및 lgh629r을이용하고주형으로서 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC을이용하여재증폭하였다. 이 PCR 산물을겔정제하여동등몰비로함께혼합한후, 프라이머로서 H9 및 lgh629r을이용하여증폭하였다. 오버랩된 PCR 산물을 Nhel/EcoRI 제한효소로절단한후, pcineo 벡터내로클로닝하였다. 8B5VL-CB3.1VH-LGGC 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC 컨스트럭트내에상이한 C-말단링커를만들기위하여, 프라이머로서 H9 및 lgh646r을이용하여이컨스트럭트를재증폭하였다. C-말단 LGGC 링커를 lgh646r 프라이머내에통합시켰다. 이 PCR 산물을 Nhel/EcoRI 제한효소로절단한후, pcineo 벡터내로클로닝하였다. CB3.1VL-8B5VH-LGGC CB3.1VL-8B5VH-LGGC을만들기위하여동일한전략을이용하였다. C-말단 LGGC 링커를 lgh648r 프라이머내에통합시키고, CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC를주형으로서이용하였다. 이 PCR 산물을 Nhel/EcoRI 제한효소로절단한후, pcineo 벡터내로클로닝하였다. 항-Flag 태그-8B5VL-CB3.1VH-LGGC 항-Flag 태그-8B5VL-CB3.1VH-LGGC을만들기위하여동일한전략을이용하였다. C-말단 LGGC 링커를 lgh648r 프라이머내에통합시키고, 항-Flag 태그-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC를주형으로서이용하였다. 이 PCR 산물을 Nhel/EcoRI 제한효소로절단한후, pcineo 벡터내로클로닝하였다. 8B5-CB3.1-VEPKSC 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 230): gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga 50 aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250 cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400 agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550 cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600 ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650 ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcagttgag cccaaatctt 700 gt

119 [0653] [0654] [0655] [0656] [0657] [0658] [0659] [0660] [0661] [0662] [0663] [0664] [0665] [0666] [0667] [0668] [0669] [0670] [0671] [0672] [0673] [0674] [0675] [0676] [0677] [0678] [0679] [0680] [0681] [0682] [0683] [0684] 8B5-CB3.1-VEPKSC 아미노산서열 ( 서열번호 231): DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50 ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100 GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200 LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSVE PKSC 234 CB3.1-8B5-FNRGEC 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 232): gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50 accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100 gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150 cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200 cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250 aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 tctcctcgtt caacagggga gagtgt 726 CB3.1-8B5-FNRGEC 아미노산서열 ( 서열번호 233): DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100 LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150 DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200 VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSFNRG EC 242 8B5VL-CB3.1VH-LGGC 프라이머로서 H9 및 lgh694r을이용하고, 주형으로서 ch8b5lc을이용하여 8B5VL를증폭시켰다. 프라이머로서 lgh695f 및 lgh696r을이용하고, 주형으로서 ch8b5hc을이용하여 8B5VH를증폭시켰다. 링커서열을프라이머 lgh694r 및 lgh695f에삽입시켰다. 프라이머로서 lgh355f 및 lgh366r을이용하고, 주형으로서 ch8b5hc을이용하여 HuIgG1Fc를증폭시켰다. 이 PCR 산물을겔정제하여동등몰비로함께혼합한후, 프라이머로서 H9 및 lgh366r을이용하여증폭하였다. 오버랩된 PCR 산물을 Nhel/EcoRI 제한효소로절단한후, pcineo 벡터내로클로닝하였다. 8B5VL-CB3.1VH-LGGC 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 234): gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga

120 [0685] [0686] [0687] [0688] [0689] [0690] [0691] [0692] [0693] [0694] [0695] [0696] [0697] [0698] [0699] [0700] [0701] [0702] [0703] [0704] [0705] [0706] [0707] [0708] [0709] [0710] [0711] [0712] [0713] [0714] [0715] [0716] [0717] [0718] [0719] [0720] aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250 cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400 agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550 cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600 ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650 ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696 8B5VL-CB3.1VH-LGGC 아미노산서열 ( 서열번호 235): DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50 ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100 GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200 LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSLG GC 232 CB3.1-8B5-LGGC 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 236): gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50 accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100 gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150 cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200 cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250 aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 tctcctcgct gggaggctgc 720 CB3.1-8B5-LGGC 아미노산서열 ( 서열번호 237):

121 [0721] [0722] [0723] [0724] [0725] [0726] [0727] [0728] [0729] [0730] [0731] [0732] [0733] [0734] [0735] [0736] [0737] [0738] [0739] [0740] [0741] [0742] [0743] [0744] [0745] [0746] DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100 LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150 DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200 VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSLGGC 240 Primers: Lgh628F ( 서열번호 238): ggaggcggat ccggaggcgg aggccaggtc caactgcagc agcctgg 47 Lgh629R ( 서열번호 239): tttgaattct aacaagattt gggctcaact gaggagacgg tgactgagg 49 Lgh630R ( 서열번호 240): gcctccgcct ccggatccgc ctcctttcag ctccagcttg gtccc 45 Lgh631F ( 서열번호 241): ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg aagcttgagg agtctgg 47 Lgh640R ( 서열번호 242): tttgaattct aacactctcc cctgttgaac gaggagactg tgagagtgg 49 Lgh644R ( 서열번호 243): tttgtcgtca tcatcgtctt tgtagtcgga gtggacacct gtggagag 48 Lgh646R ( 서열번호 244): tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgactg ag 42 Lgh647F ( 서열번호 245): caaagacgat gatgacgaca aagacattca gatgacacag tctcc 45 Lgh648R ( 서열번호 246): tttgaattct agcagcctcc cagcgaggag actgtgagag tgg 43 발현 : 발현플라즈미를암호화하는컨스트럭트 5와 6, 또는 6과 7, 또는 8과 9, 또는 9와 10( 도 30) 을, 리포펙타민 2000(Invitrogen) 을이용하여항-flag 태그와함께또는없이, HEK-293 세포내로동시형질도입시켜 8B5- CB3.1 DART를발현시켰다. 3일마다 3회조건배지를수집하여, CD32B 친화성칼럼을이용하여조건배지를정제하였다. ELISA: ELISA를다음과같이수행하였다 : 2μg/ml의 CD32B-Fc를, 50μl/well의양으로, 탄산완충액중의 96-웰 Maxisorp 플레이트상에 4 에서밤새코팅시켰다. 시험단일쇄 Fc 융합단백질을첨가하기전에, 이플레이트를 PBS-T(PBS, 0.1% Tween 20) 으로 3회세정한후, PBS-T중의 0.5% BSA로실온에서 30분동안블락킹시켰다. 블락킹동안, 8B5-CB3.1 DART을 2μg/ml에서시작하여일련의 2배희석으로희석시켰다. 25μl/well의희석물 DART 를 25μl/well의 50ng/ml ch8b5와혼합하여, 희석플레이트에서 ELISA 플레이트로옮겼다. 이플레이트를실온에서 1시간동안배양하였다. PBS-T로 3회세정한후, 1:10,000 희석된 HRP 결합 F(ab') 2 염소항인간 IgG F(ab') 2 (Jackson ImmunoResearch) 을 50μl/well의양으로플레이트에첨가하였다. 이플레이트를실온에서 1시간동안배양하였다. 이플레이트를 PBS-T로 3회세정한후, 80ul/well의 TMB 기질을이용하여현상하였다. 5분간배양후, 이반응을 1% H 2 SO 4 40μl/well로정지시켰다. 96-웰플레이트리더기와 SOFTmax 소프트웨어를이용하여 OD450nm를판독하였다. GraphPadPrism 3.03 소프트웨어를이용하여그결과를플롯팅하였다 ( 도 31). [0747] Ig- 유사 4 가 DART 의디자인및특성분석

122 [0748] [0749] [0750] [0751] [0752] [0753] [0754] [0755] [0756] [0757] [0758] [0759] [0760] [0761] [0762] [0763] [0764] [0765] [0766] [0767] [0768] [0769] [0770] [0771] [0772] [0773] [0774] [0775] [0776] 4개의폴리펩티드사슬을이용하여 4가의항원결합영역을갖는 Ig-유사 DART 종들을제조할수있다 ( 도 32, 도 33). Ig-유사 DART는특유의특성을갖는데, 그이유는그도메인이같은에피토프 ( 그결과, 4가이며, 모노- 에피토프특이적이고, 4개의동일한항원분자에결합할수있는 Ig-유사 DART를형성할수있다 ) 또는다른에피토프또는항원에결합하도록디자인될수있기때문이다. 예를들면, 그도메인은같은항원의 2개의에피토프 ( 그결과, 4가이며, 모노-항원특이적이고, 2개의에피토프에특이적인 Ig-유사 DART를형성할수있다 ) 또는다른항원분자의에피토프에결합하도록디자인될수있고, 그결과제 1 항원에특이적인한쌍의결합영역와제 2 항원에특이적인두번째쌍의결합영역을갖는 4가 Ig-유사 DART를형성할수있다. 이러한특징의조합을갖는하이브리드분자를쉽게제조할수있다. 이러한 Ig-유사 DART의특성을설명하기위하여, CD32에특이적인한쌍의결합영역와 CD16A에특이적인두번째쌍의결합영역을갖는, 예시적인 4가 Ig-유사 DART 종을제조하였다. 다음의 4개의폴리펩티드사슬을이용하여상기 Ig-유사 DART종을제조하였다 : 2.4G2-3G8-hKappa 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 247): gatgtccaga tgacccagtc tccatctaat cttgctgcct ctcctggaga 50 aagtgtttcc atcaattgca aggcaagtga gagcattagc aagtatttag 100 cctggtatct acagaaacct gggaaagcaa ataagcttct tatgtacgat 150 gggtcaactt tgcaatctgg aattccatcg aggttcagtg gcagtggatc 200 tggtacagat ttcactctca ccatcagaag cctggagcct gaagattttg 250 gactctatta ctgtcaacag cattatgaat atccagccac gttcggttct 300 gggaccaagc tggagatcaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 taccctgaaa gagtctggcc ctgggatatt gcagccctcc cagaccctca 400 gtctgacttg ttctttctct gggttttcac tgaggacttc tggtatgggt 450 gtaggctgga ttcgtcagcc ttcagggaag ggtctagagt ggctggcaca 500 catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg aagagccgac 550 tgacaatctc caaggatacc tccagcaacc aggtattcct caaaatcgcc 600 agtgtggaca ctgcagatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc 650 cgcctggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctcac 700 tgggaggctg cggcggaggg agccgtacgg tggctgcacc atcggtcttc 750 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt 800 gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg 850 tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 900 gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa 950 agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg 1000 gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt G2-3G8-hKappa Encoded 아미노산서열 ( 서열번호 248): DVQMTQSPSN LAASPGESVS INCKASESIS KYLAWYLQKP GKANKLLMYD 50 GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTIRSLEP EDFGLYYCQQ HYEYPATFGS 100 GTKLEIKGGG SGGGGQVTLK ESGPGILQPS QTLSLTCSFS GFSLRTSGMG 150 VGWIRQPSGK GLEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SSNQVFLKIA

123 [0777] [0778] [0779] [0780] [0781] [0782] [0783] [0784] [0785] [0786] [0787] [0788] [0789] [0790] [0791] [0792] [0793] [0794] [0795] [0796] [0797] [0798] [0799] [0800] [0801] [0802] [0803] [0804] [0805] [0806] [0807] [0808] [0809] [0810] [0811] [0812] SVDTADTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSLGGCGGG SRTVAAPSVF 250 IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ 300 DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC 350 3G8-2.4G2-hG1 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 249): gacactgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca 50 gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg 100 atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc 150 ctcatctata ctacatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag 200 tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg 250 aggaggatac tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaaggaggcg gatccggagg 350 cggaggcgag gtggagctag tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg 400 gaaggtccct gaaactctcg tgtgcagcct caggattcac tttcagtgac 450 tattacatgg cctgggtccg gcaggctcca acgacgggtc tggagtgggt 500 cgcatccatt agttatgatg gtggtgacac tcactatcga gactccgtga 550 agggccgatt tactatttcc agagataatg caaaaagcag cctatacctg 600 caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtgcaac 650 agagactacg ggaataccta caggtgttat ggatgcctgg ggtcaaggag 700 tttcagtcac tgtctcctca ctgggaggct gcggcggagg gagcgcctcc 750 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc 800 tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac 850 cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 900 ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 950 gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga 1000 atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 1050 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg 1100 gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 1150 tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1200 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa 1250 tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg 1300 tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1350 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat 1400 ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 1450 catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1500 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 1550 gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct

124 [0813] [0814] [0815] [0816] [0817] [0818] [0819] [0820] [0821] [0822] [0823] [0824] [0825] [0826] [0827] [0828] [0829] [0830] [0831] [0832] ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1650 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta 1700 cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa G8-2.4G2-hG1 Encoded 아미노산서열 ( 서열번호 250): DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL 50 LIYTTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQQSNEDPY 100 TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VELVESGGGL VQPGRSLKLS CAASGFTFSD 150 YYMAWVRQAP TTGLEWVASI SYDGGDTHYR DSVKGRFTIS RDNAKSSLYL 200 QMDSLRSEDT ATYYCATETT GIPTGVMDAW GQGVSVTVSS LGGCGGGSAS 250 TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT 300 FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS 350 CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE 400 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY 450 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV 500 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 550 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 578 상이한플라스미드분리체로부터상기서열을갖는 Ig-유사 DART 분자를얻어, "Ig DART 1" 및 "Ig DART 2" 로명명하였다. ELISA에서, mcd32-hcd16a에결합하는 Ig-유사 DART 종의능력을, 배지단독, 단일 CD32 및단일 CD16A 결합영역 ("DART"), 및대조군항-ch-mCD32 mab의것과비교하였다 ( 도 34). 본발명의 Ig-유사 DART는, DART 또는대조군항체의어떤것보다항원결합친화성이훨씬더컸다 CD32B-CD79-1 및 CD32B-CD79-2 이중특이성디아바디의디자인및특성분석. CD79VL-CD32BVH( 서열 1), CD32BVL-CD79VH-1( 서열 2), 및 CD32BVL-CD79VH-2( 서열 3) 를암호화하는유전자를발현벡터 pee13내로클로닝하여각각발현컨스트럭트 1, 2 및 3을얻었다. 컨스트럭트 1 발현플라스미드를발현플라스미드 2 또는 3의어느하나와함께 HEK-293 세포내로동시형질도입시켜, 각각 CD32B-CD79-1 및 CD32B- CD79-2 이중특이성디아바디를제조하였다. 조건배지를 3일마다 3회수거하여, CD32B 친화성칼럼으로정제하였다. ELISA를다음과같이수행하였다 : 2μg/ml의 CD32B-Fc를, 50μl/well의양으로, 탄산완충액중의 96-웰 Maxisorp 플레이트상에 4 에서밤새코팅시켰다. 시험단일쇄 Fc 융합단백질을첨가하기전에, 이플레이트를 PBS-T(PBS, 0.1% Tween 20) 으로 3회세정한후, PBS-T중의 0.5% BSA로실온에서 30분동안블락킹시켰다. 블락킹동안, CD32B-CD79-1 또는 CD32B-CD79-2 이중특이성디아바디를 2μg/ml에서시작하여일련의 2배희석으로희석시켰다. 25μl/well의희석물이중특이성디아바디를 25μl/well의 50ng/ml 항-CD32B 항체와혼합하여, ELISA 플레이트에첨가하였다. 이플레이트를실온에서 1시간동안배양하였다. PBS-T로 3회세정한후, 1:10,000 희석된 HRP 결합 F(ab') 2 염소항인간 IgG F(ab') 2 (Jackson ImmunoResearch) 을 50μl/well의양으로 플레이트에첨가하였다. 이플레이트를실온에서 1시간동안배양하였다. 이플레이트를 PBS-T로 3회세정한후, 80ul/well의 TMB 기질을이용하여현상하였다. 5분간배양후, 이반응을 1% H 2 SO 4 40μl/well로정지시켰다. 96-웰플레이트리더기와 SOFTmax 소프트웨어를이용하여 OD450nm를판독하였다. GraphPadPrism 3.03 소프트웨어를이용하여그결과를플롯팅하였다. 이실험은 CD32B-CD79-1 및 CD32B-CD79-2 이중특이성디아바디가, 항- CD32B 대조군항체의것과등가의친화성으로 CD32-Fc에면역특이적으로결합할수있음을보여준다. 상기컨스트럭트의뉴클레오티드및인코딩된아미노산서열은하기와같다 : [0833] [0834] 서열 1 - CD79VL-CD32BVH 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 251): gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca

125 [0835] [0836] [0837] [0838] [0839] [0840] [0841] [0842] [0843] [0844] [0845] [0846] [0847] [0848] [0849] [0850] [0851] [0852] [0853] [0854] [0855] [0856] [0857] [0858] [0859] [0860] [0861] [0862] [0863] [0864] [0865] [0866] [0867] [0868] [0869] [0870] gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100 gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150 cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 tctcctcgct gggaggctgc 720 서열 2 - CD79VL-CD32BVH 아미노산서열 ( 서열번호 252): DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC 240 서열 3 - CD32BVL-CD79VH-1 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 253): gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696 서열 4 - CD32BVL-CD79VH-1 아미노산서열 ( 서열번호 254):

126 [0871] [0872] [0873] [0874] [0875] [0876] [0877] [0878] [0879] [0880] [0881] [0882] [0883] [0884] [0885] [0886] [0887] [0888] [0889] [0890] [0891] [0892] [0893] [0894] [0895] [0896] [0897] [0898] [0899] [0900] [0901] [0902] DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50 ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232 서열 5 - CD32BVL-CD79VH-2 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 255): gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696 서열 6 - CD32BVL-CD79VH-2 아미노산서열 ( 서열번호 256): DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50 ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC H8B5-HBCRC 생물기능성디아바디의구축및최적화디아바디는 CD32 및 B-세포수용체복합체 ("BCRC") 에결합할수있는가변부위를함유하도록구축되었다. 클로닝. 컨스트럭트는표준 PCR/ 중복 PCR을사용하여구축하였다 : h8b5vl-g3sg4-hbcrcvh M48I-LGGC: 완전히인간화된 8B5 VL(CD32를인식함 ) 을프라이머로서 lgh321f 및 lgh788r을사용하여증폭하였다. hbcrcvh M48I를프라이머로서 lgh784f 및 lgh386r을사용하여증폭하였다. PCR 산물을겔정제하였고, 혼합한뒤 lgh321f 및 lgh386r를사용하여증폭하였다. 이후중복 PCR 단편은 XbaI-EcoRI 부위로 pee6에클로닝하였다. "G3SG4" 는서열 : GGGSGGGG( 서열번호 10) 을갖는링커이다. hbcrcvl R45N-G3SG4-h8B5VH-LGGC hbcrcvl R45N은프라이머로서 lgh321f 및 lgh785r을사용하여증폭하였다. h8b5vh은프라이머로서 lgh787f 및 lgh786r를사용하여증폭하였다. PCR 산물을젤정제하였고, 혼합한뒤 lgh321f 및 lgh786r을사용하여증폭하였다. 이후중복 PCR 단편을 XbaI-EcoRI 부위로 pee13에클로닝하였다

127 [0903] [0904] [0905] [0906] [0907] [0908] [0909] [0910] [0911] [0912] [0913] [0914] [0915] [0916] [0917] [0918] [0919] [0920] [0921] [0922] [0923] [0924] [0925] [0926] [0927] [0928] [0929] [0930] [0931] [0932] [0933] [0934] [0935] [0936] 단일벡터구축. peeβhhbcrcvl R45N-h8B5VH를 BglH-SalI 부위로절단하였고, 3.3kb 단편을정제하였고, pee13 hhbcrcvl 45N-h8B5VH에 BamHI-SalI 부위로삽입하였다. BglII 및 BamHI는상보적인점착성말단을공유한다. DART를구축하기위해사용한 DART 및프라이머의서열은하기에서묘사한다 : hhbcrcvl. R45N-h8B5VH-LGGC 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 257): gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50 gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100 gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150 cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 tctcctcgct gggaggctgc 720 hhbcrcvl.r45n-h8b5vh-lggc 아미노산서열 ( 서열번호 258): DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC 240 H8B5VL-hHBCRCVH M48I-LGGC 뉴클레오티드서열 ( 서열번호 259): gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga

128 [0937] [0938] [0939] [0940] [0941] [0942] [0943] [0944] [0945] [0946] [0947] [0948] [0949] [0950] [0951] [0952] [0953] [0954] [0955] [0956] [0957] [0958] [0959] [0960] tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696 H8B5VL-HBCRCVH M48I-LGGC 아미노산서열 ( 서열번호 260): DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50 ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232 Lgh321F 프라이머 ( 서열번호 261): cgagctagct ctagatgaga tcacagttct ctctac 36 Lgh386R 프라이머 ( 서열번호 262): tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgaccg tggtc 45 Lgh784F 프라이머 ( 서열번호 263): ggcggatccg gaggcggagg ccaggttcag ctggtgcag 39 Lgh785R 프라이머 ( 서열번호 264): cctccggatc cgcctccttt gatctcaagc ttggtccc 38 Lgh786R 프라이머 ( 서열번호 265): tttgaattct agcagcctcc caggctggag acggtcacca gg 42 Lgh787F 프라이머 ( 서열번호 266): ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg cagcttgtgg agtc 44 Hu3G8VL 1-G3SG4-Hu2B6VH 4-LGGC 발현플라스미드는 CD32 및 CD79를인식하는 Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1 생물특이적디아바디를만들기위하여 Hu2B6VL 5-G3SG4-Hu3G8VH 5-LGGC와함께 HEK-293 세포로공동-형질도입시켰다. 동시에, Hu2B6VL 5-G3SG4-Hu2B6VH 4-LGGC 및 Hu3G8VL 1-G3SG4-Hu3G8VH 5-LGGC를 Hu2B6 4.5 및 Hu3G8 5.1 디아바디를만들기위하여 HEC-293 세포로개별적으로형질도입시켰다. 배양한지 3일후, 조건배지를회수하였고, 결합 ELISA에의해특징화하였다. 이실험의결과는도 36에묘사하였다. 실험계획 : 100 ng/ 웰의가용성 FcRIIb-G2-Agly를탄산염버퍼에서 96-웰 Maxisorp 플레이트에 40 에서밤새코팅하였다. 플레이트를 PBS/0.1% Tween20으로 3회세척하였고, PBS/0.l% Tween 20에있는 0.5% BSA로 30분간상온에서디아바디를첨가하기전에차단시켰다. Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1 생물특이적디아바디, Hu2B6 4.5 디아바디, 및 hu3g8 5.1 디아바디의조건배지의 25ng/ 웰에서시작하는일련의 2배희석을각웰에첨가하였다. 플레이트를상온에서 1시간동안배양하였다. PBS/0.1% Tween20으로 3회세척한다음, 10ng/ 웰의 FcRIIIa-G2-바이오틴을플레이트에첨가하였다. 플레이트를상온에서 1시간동안배양하였다. PBS/0.1% Tween20로 3회세척한다음, 1:5000로희석한 50 ul의 HRP 접합스트렙타비딘 (Amersham Pharmacia Biotech) 을검출을위해사용하였다. 상온에서 45분간배양한다음, 플레이트를 PBS/0.1% Tween20로 3회세척하고, TMB 기질을사용하여현상하였다. 10분간배양한후, 반응을 1% H 2 SO 4 에의해정지시켰다. OD450 nm을 SOFTmax에의해읽었다. OD450 nm를 GraphPadPrism 3.03 소프트웨어를사용하여그래프화하였다. [0961] [0962] 6.13 IgDART 디아바디의구축 IgDART 디아바디는 CD32 및 B- 세포수용체복합체 ("BCRC") 에결합할수있는가변부위를함유하도록구축되었 다. 제 1 디아바디는분자의 VH 서열및 Fc 서열사이에 LGGCGGGS( 서열번호 267) 링커를사용하였다. 제 2 디아

129 바디는서열 : LEIK( 서열번호 268) 를갖는 LEIK 링커또는서열 TVSS( 서열번호 269) 를갖는 TVSS 링커중어느 하나를사용하였다. 이들디아바디및이를암호화하는뉴클레오티드의사슬의서열은하기에서나타낸다 : [0963] [0964] [0965] [0966] [0967] [0968] [0969] [0970] [0971] [0972] [0973] [0974] [0975] [0976] [0977] [0978] [0979] [0980] [0981] [0982] [0983] [0984] [0985] [0986] [0987] [0988] [0989] [0990] [0991] [0992] [0993] [0994] H8B5VL-hBCRCVH M48I, M62K_LGGCG3S_hKappa( 서열번호 270): DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50 ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GCGGGSRTVA APSVFIFPPS 250 DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS 300 TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC 343 H8B5VL 서열은위치 에위치한링커 GGGSGGGG( 서열번호 10) 에의해 hbcrcvh 서열에융합된다. hbcrcvh 서열은위치 에위치한링커 LGGCGGGS( 서열번호 267) 에의해 Fc 서열에융합된다 ( 둘다위에서밑줄쳐보여줌 ). H8B5VL-hBCRCVH M48I, M62K_LGGCG3S_hKappa 서열을암호화하는폴리뉴클레오티드서열은 : ( 서열번호 271): gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgcggcg 700 gagggagccg aactgtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct 750 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa 800 cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc 850 aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 900 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa 1000 acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 1050 tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 1082이고, 여기서링커 : GGGSGGGG( 서열번호 10) 및 LGGCGGGS( 서열번호 267) 를암호화하는서열은각각위치 및 에위치한다 ( 둘다위에서밑줄쳐보여줌 )

130 [0995] [0996] [0997] [0998] [0999] [1000] [1001] [1002] [1003] [1004] [1005] [1006] [1007] [1008] [1009] [1010] [1011] [1012] [1013] [1014] [1015] [1016] [1017] [1018] [1019] [1020] [1021] [1022] [1023] [1024] [1025] [1026] [1027] [1028] HBCRCVL R45N-h8B5VH_LGGCGGGS-hG1 ( 서열번호 272): DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC GGGSASTKGP 250 SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 300 LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT 350 HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV 400 KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV 450 SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY 500 PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF 550 SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK 574 hbcrcvl 서열은위치 에위치한링커 GGGSGGGG( 서열번호 10) 에의해 H8B5VH 서열에융합된다. H8B5VH 서열은위치 에위치한링커 LGGCGGGS( 서열번호 267) 에의해 Fc 서열에융합된다 ( 둘다위에서밑줄쳐보여줌 ). HBCRCVL R45N-h8B5VH_LGGCGGGS-hG1 서열을암호화하는폴리뉴클레오티스서열은 : ( 서열번호 273): gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50 gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100 gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150 cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt 600 ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg 700 tctccagcct gggaggctgc ggcggaggga gcgcctccac caagggccca 750 tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc 800 ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt

131 [1029] [1030] [1031] [1032] [1033] [1034] [1035] [1036] [1037] [1038] [1039] [1040] [1041] [1042] [1043] [1044] [1045] [1046] [1047] [1048] [1049] [1050] [1051] [1052] [1053] [1054] [1055] [1056] [1057] [1058] [1059] [1060] [1061] cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 900 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc 950 cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca 1000 gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 1050 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt 1100 cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc 1150 ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 1200 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa 1250 gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1300 ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1350 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa 1400 agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg 1450 agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1500 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa 1550 ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 1600 acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1650 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag 1700 cctctccctg tctccgggta aa 1722이고, 여기서링커 : GGGSGGGG( 서열번호 10) 및 LGGCGGGS( 서열번호 267) 를암호화하는서열은각각위치 및 에위치한다 ( 둘다위에서밑줄쳐보여줌 ). H8B5VL-HBCRCVH M48I, M62K_(-4)LEIK_hKappa ( 서열번호 274): DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50 ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 250 ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 300 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC 335 H8B5VL 서열은위치 에위치한링커 GGGSGGGG( 서열번호 10) 에의해 HBCRCVH 서열에융합된다. HBCRCVH 서열은위치 에위치한링커 LEIK( 서열번호 268) 에의해 Fc 서열에융합된다 ( 둘다위에서밑줄쳐보여줌 ). 폴리뉴클레오티드암호화 H8B5VL-HBCRCVH M48I, M62K_(-4)LEIK_hKappa 서열을암호화하는폴리뉴클레오티드는 : ( 서열번호 275): gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc

132 [1062] [1063] [1064] [1065] [1066] [1067] [1068] [1069] [1070] [1071] [1072] [1073] [1074] [1075] [1076] [1077] [1078] [1079] [1080] [1081] [1082] [1083] [1084] [1085] [1086] [1087] [1088] [1089] [1090] [1091] [1092] [1093] [1094] [1095] gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcctggagat caagcgaact gtggctgcac 700 catcggtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 750 gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt 800 acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg 850 tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 900 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt 950 cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag 1000 agtgt 1005이고, 여기서링커 : GGGSGGGG( 서열번호 10) 및 LEIK( 서열번호 268) 를암호화하는서열은각각위치 및 에위치한다 ( 둘다위에서밑줄쳐보여줌 ). HBCRCVL R45N-h8B5VH_(-4)TVSS-hG1 = HBCRCVL R45N-h8B5VH_-hG1 ( 서열번호 276): DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSASTK GPSVFPLAPS 250 SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS 300 LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCD KTHTCPPCPA 350 PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 400 VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP 450 IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW 500 ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA 550 LHNHYTQKSL SLSPGK 566 HBCRCVL 서열은위치 에위치한링커 GGGSGGGG( 서열번호 10) 에의해 h8b5vh 서열에융합된다. h8b5vh 서열은위치 에위치한링커 TVSS( 서열번호 269) 에의해 Fc 서열에융합된다 ( 둘다위에서밑줄쳐보여

133 줌 ). 폴리뉴클레오티드암호화 HBCRCVL R45N-h8B5VH_(-4)TVSS-hG1 을암호화하는폴리뉴클레오티드는 : [1096] [1097] [1098] [1099] [1100] [1101] [1102] [1103] [1104] [1105] [1106] [1107] [1108] [1109] [1110] [1111] [1112] [1113] [1114] [1115] [1116] [1117] [1118] [1119] [1120] [1121] [1122] [1123] [1124] [1125] [1126] [1127] [1128] [1129] [1130] ( 서열번호 277): gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50 gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100 gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150 cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt 600 ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg 700 tctccagcgc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 750 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga 800 ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca 850 gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 900 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta 950 catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag 1000 ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 1050 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa 1100 ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg 1150 acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1200 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag 1250 cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga 1300 atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1350 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt 1400 gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc 1450 tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1500 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct 1550 ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga 1600 gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1650 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1698 이고,

134 [1131] [1132] [1133] 여기서링커 : GGGSGGGG( 서열번호 10) 및 TVSS( 서열번호 269) 를암호화하는서열은각각위치 및 에위치한다 ( 둘다위에서밑줄쳐보여줌 ) 링커의최적화상술한바와같이, 본발명의 IgDART 디아바디는분자의 VH 서열및 Fc 서열사이에링커를함유하는것이바람직하다. 실험은수율및활성을최대화하기위해링커를최적화하기위해수행되었다. 하기링커를사용하였다. [1134] [1135] 상기링커는링커의다른조합을갖는 IgDART 디아바디의세트를제조하기위해플라스미드로도입하였다 : [1136]

135 [1137] 생산된 IgDART 의응집성질을결정하였다. [1138] [1139] [1140] [1141] [1142] [1143] [1144] [1145] [1146] [1147] [1148] 901A/901B; 903A/903B; 및 908A/908B에서사용한것과같은링커를갖는컨스트럭트가예상치못하게보여준데이터는 910A/911B와같은링커를갖는대조군보다극적으로뛰어난결과를주었다 ( 더적은저중합체화및 / 또는더적은단편생산 ) E-코일 /K-코일 DART 상기의관점에서올바로인식될것인바, 이중특이성 DART의개별폴리펩티드는두종의동형이량체및한종의이형이량체를형성할수있다. 본발명의한구체예에서, 전하를띤폴리펩티드는하나, 또는더욱바람직하게는두 DART 폴리펩티드의 C-말단에첨가될수있다. 이중특이성 DART의개별폴리펩티드에대하여반대전하의전하를띤폴리펩티드를선별함으로써, 이런전하를띤폴리펩티드의세포함유물은이형이량체의형성을선호하고, 동형이량체의형성을적게한다. 바람직하게는, 양성전하를띤폴리펩티드는아르기닌, 글루타민, 히스티딘및 / 또는라이신 ( 또는이런아미노산의혼합물 ) 의실질적내용물을함유할것이고, 음성전하를띤폴리펩티드는아스파레이트또는글루타메이트 ( 또는이런아미노산의혼합물 ) 의실질적내용물을함유할것이다. 실질적내용물로리신을함유하는양성전하를띤폴리펩티드및실질적내용물로글루타메이트를함유하는음성전하를띤폴리펩티드가특히바람직하다. 이런상반된전하를띤폴리펩티드사이의정전기적인력을최대화하기위하여, 나선형배좌를자발적으로취할수있는폴리펩티드를사용하는것이바람직하다. 따라서, 바람직한구체예에서, 양성전하를띤, "E-코일" 이이중특이성 DART를형성하는데사용될폴리펩티드중하나에첨가될것이고, 음성전하를띤 "K-코일" 이 DART의제 2의폴리펩티드에첨가될것이다 ( 도 37). 특히바람직한 E-코일은서열 :(EVAALEK) 4 : 서열번호 299 EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK를가질것이다. 특히바람직한 K-코일은서열 :(KVAALKE) 4 : 서열번호 300 KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE를가질것이다. 이런 E-코일을소유하는바람직한 DART 폴리펩티드는일반적서열 : [VL 도메인 ]-[GGGSGGGG]-[VH 도메인 ]- [(EVAALEK) 4 ]-GGGNS을가질것이고, 여기서 VL은 DART의가변경 Ig 도메인이고, GGGSGGGG는서열번호 10이고, VH는 DART의가변중 Ig 도메인이고, (EVAALEK) 4 는서열번호 299이고, 그리고 GGGNS는서열번호 301이다. 이런 K-코일을소유하는바람직한 DART 폴리펩티드는일반적서열 : [VL 도메인 ]-[GGGSGGGG]-[VH 도메인 ]- [(KVAALKE) 4 ]-GGGNS을가질것이고, 여기서 VL은 DART의가변경 Ig 도메인이고, GGGSGGGG는서열번호 10이고, VH는 DART의가변중 Ig 도메인이고, (KVAALKE) 4 는서열번호 300이고, 그리고 GGGNS는서열번호 301이다. [1149] [1150] [1151] 6.16 E-코일 /K-코일 FC-함유 DART 나아간구체예에서, Fc-부위는 E-코일또는 K-코일 DART의 E 및 / 또는 K에연결될수있다. Fc-함유 DART의 Fc 영역및 DART VH 도메인사이의한층더한분리가이런도메인의덜분리된배열이이런도메인및그들의결합리간드사이의감소된상호작용을야기하거나달리 DART 회합을방해하는경우에바람직하다. 임의의아미노산서열이사용될수있을지라도, 가변도메인으로부터 Fc 도메인을최대한멀리연장하고돌출시킬수있도록 α 헬릭스코일을형성할수있는분리자를사용하는것이바람직하다 ( 도 37). 상반되는전하

136 의상술한코일화폴리펩티드가이형이량체형성을증진시키기위하여추가적으로기능하기때문에, 이런분자는분리자가특히바람직하다. 이런코일-함유 Fc-DART 분자는개선된혈청반감기및이펙터기능보충을포함하는 Fc-DART의것들과유사한이익을제공한다. 상술한 E-코일및 K-코일폴리펩티드는이목적에특히바람직하다. [1152] 따라서, 바람직한구체예에서, E- 코일 Fc- 함유 DART 는일반적서열 : [VL 도메인 ]-[GGGSGGGG]-[VH 도메인 ]- [(EVAALEK) 4 ]-GGG-D234 에서시작하는 Fc 도메인 (Kabat 넘버링 ) 을가질것이고, 여기서 VL 은 DART 의가변경 Ig 도메인이고, GGGSGGGG 은서열번호 10 이고, VH 은 DART 의가변중 Ig 도메인이고, 그리고 (EVAALEK) 4 는서열번호 299 이다. [1153] 유사하게, 바람직한구체예에서, K- 코일 Fc- 함유 DART 는일반적서열 : [VL 도메인 ]-[GGGSGGGG]-[VH 도메인 ]- [(KVAALKE) 4 ]-GGG-D234 에서시작하는 Fc 도메인 (Kabat 넘버링 ) 을가질것이고, 여기서 VL 은 DART 의가변경 Ig 도메인이고, GGGSGGGG 는서열번호 10 이고, VH 는 DART 의가변중 Ig 도메인이고 (KVAALKE) 4 는서열번호 300 이다. [1154] [1155] [1156] [1157] [1158] [1159] [1160] [1161] [1162] [1163] 앞에서나타낸바와같이, 코일-함유 DART 분자또는코일-함유 Fc-함유 DART 분자는오직단일의이런코일분리자를함유할수있거나, 하나이상의이런분리자를함유할수있다 ( 예컨대, 두개의분리자, 바람직하게는이중하나가 DART의폴리펩티드의 VH 도메인의각각에연결된상반되는전하 ). 이런분리자분자에 Fc 영역을연결함으로써, 사슬스와핑에의해 Fc-DART 분자의이량체, 사량체등의버전을만들기위한능력이향상된다 ( 도 39). 도 39에서보여준바와같이, Fc-DART 분자는 Fc 도메인이 DART VH 도메인의하나또는양쪽에연결되어있는지여부에의존하여단량체또는이량체를형성하도록생산할수있다 E-코일 /K-코일 FC-함유 DART의기능적활성 E-코일및 / 또는 K-코일 Fc-DART 종은 :(1) CD79b(BCR 복합체 )-반응항체, CB3의가변경및중부위, 및 (2) CD32B-반응항체, 2B6의저친화성변이체 ("YA" 변이체로불림 ) 의가변경및중부위를갖는이중-특이성 DART 분자로부터생산된다. 이항체의이경쇄가변부위는돌연변이 : N50Y 및 V51A를함유하는항체 2B6의것과다르다. 따라서, 항체 YA2B6은경쇄가변부위서열 : EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRTSQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNTWPFTFGGGT KVEIK( 서열번호 302) 를갖는다. 이항체의중쇄가변부위의서열은 : QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIHWVRQAPGQGLEWMGVIDPSDTYPNYNKKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARNGDS DYYSGMDYWGQGTTVTVSS( 서열번호 303) 이다. 저친화성항체는 CD79b를발현하는세포 (B 세포 ) 에서시스 (cis) 로 CD32B에선택적으로결합할것인것으로부터선별하였다. 그자체로, 상대적배치는다른 CD32B-발현세포 ( 단핵구, 내피세포, 간 ) 와의상호작용뿐만아니라원하지않는트랜스상호작용을줄일것이다. 이런 h2b6yahcb3 DART의 E-코일및 / 또는 K-코일유도체및 E-코일및 / 또는 K-코일 Fc-함유유도체를제조하였다. 크기배재크로마토그래피를생산된분자의대략적크기및이질성을분석하기위해사용하였다. 도 40에서보여준바와같이, 이량체는 K-코일도메인에연결된단독으로연결된 Fc 영역을갖는 E-코일 /K-코일뿐만아니라 E-코일도메인에연결된단독으로연결된 Fc 영역을갖는 E-코일 /K-코일 DART로부터형성되었다. 원하는단량체뿐만아니라이량체분자는 Fc 영역이동일한 DART 분자의 E 및 K 코일모두에연결된표본으로부터회수되었다. 도 41은생산된이량체분자의가능한구조를보여준다. 크기배재크로마토그래피분획을생산된분자의구조의나아간분석을위해 SDS-폴리아크릴아마이드겔전기영동을사용하여분석하였다 ( 도 42). E-코일 /K-코일 DART 유도체 (Fc 영역없음 ) 는대략 28 kd(kfc-함유폴리펩티드및약간작은 EFc-함유폴리펩티드에상응함 ) 의각각의두개의우세한밴드및대략 49 kd(e-코일 /K-코일 DART에상응함 ) 에서의덜우세한밴드로서이동하였다. 크기배재크로마토그래피로부터의 E-코일 /K-코일 Fc-함유 DART 유도체 (EFc/K 또는 E/KFc) 의단량체분획은오직대략 28 kd에서더크거나더작은분자량밴드중어느하나 (DART가 KFc-함유 DART( 더큰분자량밴드 ) 인지또는 EFc-함유 DART( 더적은분자량밴드 ) 인지여부에따라상응함 ) 를보였다. 물질은대략 49KD(E-코일 /K-코일 DART에상응함 ) 에서우세하게이동하였다. 유의하게높은분자량밴드가또한관찰되었다. 이중특이성결합 ELISA는생산된분자를특징화하기위해수행하였다. CD79를 ELISA 플레이트위에올려두었다

137 이후 DART를플레이트에결합시켰다. DART 결합을 scd32b-바이오틴의사용에이어스트렙타비딘-hrp과배양에의해검출하였다. 도 43에서보여준바와같이, E-코일 /K-코일 Fc-함유 h2b6yahcb3 DART 유도체 (EFc/K 또는 E/KFc) 는 h2b6yahcb3 DART, 또는 EFc/KFc h2b6yahcb3 DART 유도체와비교하여결합의유의한상승을보여주었다. [1164] [1165] [1166] [1167] [1168] [1169] [1170] [1171] [1172] [1173] [1174] [1175] CD79b에결합한항체의교차-결합이 B세포활성화에이른다 (Van Kooten, C. et al.(1997) "Cross-Linking Of Antigen Receptor Via Ig-B(B29, CD79b) Can Induce Both Positive And Negative Signals In CD40-Activated Human B Cells," Clin. Exp. Immunol. 110: ). h2b6yahcb3 DART 분자가 CD79b 및 CD32B 억제수용체모두에결합할수있으므로, 그들은 CD79b 결합영역에 CD32B를 " 보완 " 할수있는능력이있고, 따라서 B 세포증식을차단할수있다. 이능력을증명하기위하여, DART를교차결합하여결합된항-CD79b 항체에노출된 B 세포와함께배양하였다. 이실험의결과는도 44에서보여준다. 결과는 CD79b 또는 CD32B에대해서만단지지시된항체 ( 각각, Ch2B6N297Q 및 ChCB3.1N297Q, 각각 ) 가 B 세포증식에실해하였음을보여준다. EFc/KFc h2b6ya x hcb3 DART 유도체는 B 세포증식을억제하는것에서 h2b6ya x hcb3 DART 그자체및 h2b6ya x hcb3 VF 대조군보다실질적으로더효과적이었다. 오직단일연결 Fc 영역을갖는 E-코일 /K-코일 DART(E/KFc h2b6ya x hcb3 DART 유도체및 EFc/K h2b6ya x hcb3 DART 유도체 ) 는 B 세포증식에서가장큰억제를발휘하는것을발견하였다 생체내혈청반감기를바꾸기위한 DART 변형상술한바와같이, 이중특이성단일-사슬분자와같은작은재조합항체분자 ( 예컨대, 대략 55 kda의분자크기로처리하는것 ) 는순환으로부터급속히제거되고, 마우스에서의 DART 분자의생체내약동학적연구는예상된대략 2시간의짧은말단반감기를보여주었다. 일부구체예에서, 급성염증조건의치료에서와같이, 이런짧은반감기가요구되지만, 그러나암, 및만성질환및이상의치료에서와같이다른구체예에서, 더긴반감기를나타내는본발명의 DART 분자가바람직하다. 이런용도를위한 DART 분자의생체내약동학적성질을개선시키기위하여, DART 분자는 DART 분자의하나이상의말단에서혈청-결합단백질의폴리펩티드부분을함유하기위하여변형될수있다. 가장바람직하게는, 혈청-결합단백질의이런폴리펩티드부분은 DART 분자의 C-말단에장치될것이다. 이목적을위한혈청-결합단백질의특히바람직한폴리펩티드부분은연쇄상구균단백질 G의알부민-결합도메인 (ABD) 이다. 스트렙토코쿠스균주 G 148의단백질 G의알부민-결합도메인 3(ABD3) 이특히바람직하다. 스트렙토코쿠스균주 G 148의단백질 G의알부민-결합도메인3(ABD3) 은안정된세가지-헬릭스묶음을형성하는 46개아미노산잔기로구성되고, 넓은알부민결합특이성을갖는다 (Johansson, M.U. et al.(2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules" J. Biol. Chem. 277(10): ). 알부민은혈장에서가장풍부한단백질이고, 인간에서 19일의반감기를갖는다. 알부민은그것을다른단백질에비-공유적으로결합할수있게하는몇몇의작은분자결합영역을소유하고, 그것에의해그들의혈청반감기를증가시킨다. DART의반감기를확장하기위한혈청단백질의폴리펩티드부분의능력을증명하기위하여, 연쇄상구균단백질 G의 ABD3 도메인을재조합항체분자, hcd16-hcd32b ABD-DART을생산하기위하여재조합이중특이성 DART(hCD16 및 hcd32b 항원과면역반응함 ) 에융합시켰다 ( 도 45). 이 ABD-DART는두항원뿐만아니라인간혈청알부민 (HSA) 과특이적결합을보여주었고, 시험관내에서이펙터세포를재표적할수있었다. 대조군 DART와비교하여, 이 ABD-DART는마우스에서혈청반감기의강한증가를보여주었다. 이접근은 DART아같은잠재적으로중요한약제의반감기를 90분이상, 2시간이상, 5시간이상, 10시간이상, 20시간이상, 및가장바람직하게는, 30시간이상증가시키기위하여실행가능한루트로서사용할수있다. 물질및방법 : ABD DART의설계및구축 : hcd16-hcd32b ABD DART를사슬 1로서 : hcd16vl-g3sg4-hcd32bvh-k 코일 [(KVAALKE) 4 ] 를사용하고, 여기서 CD16VL은 3G8 CD16VL을표시하고, G3SG4는서열번호 10을표시하고, hcd32bvh는 2B6 CD32BVH를표시하고, 그리고 (KVAALKE) 4 는서열번호 300을표시하고 ; 그리고사슬 2로써 :

138 [1176] [1177] hcd32bvl-g3sg4-hcd16vh-ggcggg-e 코일 [(EVAALEK) 4 ]-GGGNS-ABD 를사용하여제조하였고, 여기서 CD32BVL 은 CD32BVL 을표시하고, G3SG4 는서열번호 10 을표시하고, hcd16vh 는 CD16VH 을표시하고, GGCGGG 는서열번호 267 의잔기 2-7 이고, E 코일 [(EVAALEK) 4 ] 는서열번호 299 이고, GGGNS 는서열번호 301 이고, 및 ABD 는 LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALID EILAALP( 서열번호 304) 이다. [1178] [1179] [1180] [1181] [1182] [1183] [1184] [1185] [1186] [1187] [1188] [1189] [1190] [1191] [1192] [1193] [1194] [1195] [1196] [1197] [1198] [1199] [1200] [1201] [1202] [1203] [1204] [1205] [1206] [1207] [1208] [1209] 따라서, 사슬 1(h3G8VL1-G3SG4-h2B6VH4-K코일-GGGNS) 의서열은 : DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY TFGQGTKLEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YWIHWVRQAP GQGLEWIGVI DPSDTYPNYN KKFKGRVTMT VVVSTSTAYM ELRSLRSDDT AVYYCARNGD SDYYSGMDYW GQGTTVTVSS GGCGGGKVAA LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKEGGGNS ( 서열번호 305) 이다. 바람직한폴리뉴클레오티드암호화사슬 1(h3G8VL1-G3SG4-h2B6VH4-K코일-GGGNS) 은 : gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct ggggtcccag acaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc agcctgcagg ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga agatccgtac acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggcgg cggaggccag gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt ctggttacac ctttaccaac tactggatac actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc ttgagtggat tggagtgatt gatccttctg atacttatcc aaattacaat aaaaagttca agggcagagt caccatgacc gtagtcgtat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aaacggtgat tccgattatt actctggtat ggactactgg gggcaaggga ccacggtcac cgtctcctcc ggaggatgtg gcggtggaaa agtggccgca ctgaaggaga aagttgctgc tttgaaagag aaggtcgccg cacttaagga aaaggtcgca gccctgaaag agggcggcgg gaattct ( 서열번호 306) 이다. 따라서, 사슬 2(h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-E코일-GGGNS-ABD) 의서열은 : EIVLTQSPDF QSVTPKEKVT FTCRTSQSIG TNIHWYQQKP DQSPKLLIKE VSESISGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDAATYYCQQ SNTWPFTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSGMG VGWIRQPPGK ALEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SKNQVVLTMT NMDPVDTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG NSLAEAKVLA NRELDKYGVS DYYKNLINNA KTVEGVKALI DEILAALP ( 서열번호 307) 이다. 바람직한폴리뉴클레오티드암호화사슬 2(h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-E코일-GGGNS-ABD) 는 : gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc

139 [1210] [1211] [1212] [1213] [1214] [1215] [1216] [1217] [1218] [1219] [1220] [1221] [1222] [1223] [1224] [1225] [1226] [1227] [1228] [1229] ttcacctgca ggaccagtca gagcattggc acaaacatac actggtacca gcagaaacca gatcagtctc caaagctcct catcaaggag gtttctgagt ctatctctgg agtcccatcg aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct gaagatgctg caacgtatta ctgtcaacaa agtaatacct ggccgttcac gttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt taccctgaga gagtctggcc ctgcgctggt gaagcccaca cagaccctca cactgacttg taccttctct gggttttcac tgagcacttc tggtatgggt gtaggctgga ttcgtcagcc tcccgggaag gctctagagt ggctggcaca catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg aagagccgac tgacaatctc caaggatacc tccaaaaacc aggtagtcct cacaatgacc aacatggacc ctgtggatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc cgcctggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctccg gaggatgtgg cggtggagaa gtggccgcac tggagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa aggcggcggg aattctctgg ccgaagcaaa agtgctggcc aaccgcgaac tggataaata tggcgtgagc gattattata agaacctgat taacaacgca aagaccgtgg aaggcgtgaa agcactgatt gatgaaattc tggccgccct gcct ( 서열번호 308) 이다. 각각의 VL 및 VH 단편을주형으로써 hcd 16-hCD32B DART를사용하여 PCR에의해증폭시켰다. 사슬 2에있어서, E 코일및 ABD을함유하는뉴클레오티드서열은프라이머이량체에의해형성되었고, 이후, 제한효소분해및리게이션을사용하여 hcd16의 VH 부위의 C-말단끝에서브클로닝하였다. 두사슬모두는 NheI-NotII 부위에서 pcineo 벡터 (Promega, inc.) 로클로닝되었다. 저마다 NgoMIV-NheI에서효소분해된사슬1 및 BstBI-PmeI에서효소분해된사슬2 발현카세트를품고있는개별플라스미드를이후안정세포주를생성하기위해 CHO 세포로형질도입하기위하여단일플라스미드로클로닝하였다. 단백질의발현및정제 : 안정된형질도입을위해, CHO-S 세포를 hcd16-hcd32b EK ABD-DART 플라스미드 DNA로형질전환시켰다. ABD-DART 단백질을 CNBr 활성화 Sepharose 4B와결합된 FcRIIB 항원의가용성버전을이용하여친화성크로마토그래피에의해정제되었다. 농축된단백질을 Superdex 200HR 10/30을사용한크기배재크로마토그래피에의해더정제하였다. ELISA에의한결합분석 : CD-16 기반포획에있어서, 플레이트는 FcRIIB 항원을 2ug/mL의농도로 4 에서밤새코팅하였다. 이후플레이트를 PBS-T에있는 0.5% 펩톤으로차단하였다. 두배의일련의희석으로희석한정제된단백질을플레이트에 1시간동안상온에서결합시켰다. 최종적으로검출을바이오틴화 CD32B(50 ng/nil) 에이은 HRP 접합스트렙타비딘 (1/1000, BD-Pharm) 을사용하여수행하였다. HRP 활성을 TMB의첨가에의해측정하였고, 플레이트를 OD 450nm로플레이트리더에서읽었다. 인간혈청알부민 (HSA) 포획, 플레이트를 2ug/mL의농도에서 HSA를 4 에서밤새코팅하였다. 이후동일한절차가이중친화성 ELISA를수행하기위해뒤따랐다. 말초-혈액단핵구세포-매개 ADCC 분석 : 세포독성은 LDH 분비분석에의해측정되었다. 말초혈액단핵구세포 (PBMC) 는 Ficoll-Hypaque(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 농도기울기원심분리에의해전체인간혈액 (Lonza Walkersville, Inc, Gaithersburg, MD) 으로부터제조사의지침서에따라정제되었다 표적세포를둥근-바닥 96-웰조직배양플레이트의각각의웰에깐다. 다른 DART 또는항체분자의하나내지네개의일련의희석을플레이트에서세포에첨가한다. 이후, PBMC를동일한웰에첨가한다. 이후, 플레이트는 37 및 5% CO 2 배양기에서밤새배양한다. 플레이트는이후 5분동안 1200 rpm으로원심분리하고, 50 μl의상 청액을편평한바닥 ELISA 플레이트에옮긴다. 50 μl 의 LDH 기질용액 (Promega) 을각각의웰에첨가하고, 플레 이트를암조건에서 30 분동안상온에서배양한다. 이후 50 μl 의정지용액을각각의웰에첨가하고, 플레이트 를 1 시간내에 490 nm 에서읽는다. 각각의웰의퍼센트세포독성을하기와같이읽은가공하지않은 O.D. 와함

140 께계산하고, [1230] [1231] [1232] [1233] [1234] [1235] [1236] (Sample-AICC)/( 표적 Max-표적자발적 ) 100 여기서 AICC는항체-의존성세포독성이다. 투여량반응곡선을 Prism 소프트웨어를사용하여생성한다. 약동학적연구 : C57B1/6 마우스에 5mg/kg으로 hcd16-hcd32b DART의단일정맥주사를주입하였다. 마우스혈청을투여전, 2, 30분 ; 1, 3, 6, 24 및 72시간에서수득하였다. 혈청에서 hcd16-hcd32b DART 농도를정량하였다. hcd16-hcd32b DART의약동학적계산은약동학적소프트웨어패키지 WinNonlin Professional 5.1(Pharsight Corporation, USA) 의수단에의해수행되었다. 매개변수를비-구획화분석 (NCA) 에의해결정하였다. 비-구획화분석은약물의정맥주사를요구하는모델 (Model 201) 에기반을두었다. 직선의사다리꼴방법을매개변수계산을위해사용하였다. 결과 ELISA에의한발현및결합연구 : hcd 16-hCD32B ABD-DART는포유동물 CHO-S 세포에서리터당 6.5 mg의농도에서효과적으로발현되었다. 저마다의항원에대한정제된 ABD-DART 단백질의결합활성을 ELISA에의해평가하였다. 결과는 hcd16-hcd32b ABD-DART가항원, CD16뿐만아니라 CD32B 모두에서동시에결합하는것을보여주었다 ( 도 46a). 결합프로파일은대조군 hcd16-hcd32b DART 단백질결합과일치하였다. 인간혈청알부민 (HSA) 에대하여정제된 hcd16-hcd32b ABD-DART의친화성을또한 ELISA에의해증명하였다 ( 도 46b). 결과는 HSA에대한 ABD 융합 DART의강력한결합을보여주는데반해, 대조군 hcd16-hcd32b DART에대하여결합을보여주지않았다. ABD-DART의시험관내세포독성 : 이펙터세포위의하나및표적세포위의하나의두항원에대한이이중특이성 ABD-DART의동시에일어나는결합을증명하기위하여, 재추적세포사멸분석을수행하였다. 이펙터세포로서인간 PBMC를사용하여, hcd16-hcd32b ABD-DART는강력하고, 투여량-의존적이며, CD32B 양성 B 세포주, Daudi에대한세포독성을유도하였다 ( 도 47). 결과는 ABD-DART의효능이모 DART의그것과동등함을보여주었다. ABD-DART의약동학적성질 : 약동학적성질 of hcd16-hcd32b ABD-DART의약동학적성질을 C57B1/6 마우스로의단일투여량 i.v. 주사후혈청샘플의 ELISA에의해분석하였다 ( 도 48). 단백질, DART 및 ABD-DART 모두는순환으로부터이상 (biphasic) 으로제거되는것을보여주었다. ABD-DART의 PK 연구는일반적 DART의 1.2 시간과비교하여 35.1시간의연장된순환시간을보여주었다 ( 도 48, 표 31). 또한약동학적성질의향상도곡선하면적 (AUG) 의비교에의해증명되었다. 컨스트럭트 ABD-DART에대하여, AUC는 ABD에대한융합후거의 30개의인자에의해증가되었다 ( 표 31). 표 31 [1237] ABD-DART DART T 1/2 (hr) Cmax (ug/ml.) Tmax (hr) AUC [1238] [1239] [1240] [1241] 요약하자면, DART 단백질에융합된알부민결합도메인 (ABD-DART로서지칭됨 ) 은성공적으로설계되고생산되었다. hcd16-hcd32b ABD-DART는그것의두가지인식된항원성결정자 : CD16 및 CD32B에대하여특이성을유지하는것을확인하였다. ABD-DART는인간혈청알부민과높은친화성을보여주는것으로발견되었다. ABD의융합은생물학적활성을감소시키지않았다 ( 즉, 종양세포사멸을재추적하기위한 DART의효능 ). ABD에대한 DART 분자의융합은그것의생체내반감기에서실질적인향상 ( 증가 ) 을이끌었고, 크기에서극적인증가없이이목적을달성하였다. 작은크기를유지하는능력은종양조직으로확산하기위한 DART의능력을촉진하기때문에중요하고유리하다 Her2/B 세포수용체 DART IgDART 디아바디는 Her2/neu 및 T-세포수용체 ("TCR") 에결합할수있는가변부위를함유하도록구축되었다. 상술한바와같이, TCR은 CD4+ 또는 CD8+ T-세포에의해천연적으로발현되고, 이런세포가항원-제시세포의클래스 I 또는클래스 II MHC 단백질에의해결합되고제시된항원성펩티드를인식할수있게한다. TCR에의

141 한 pmhc( 펩티드-MHC) 복합체의인식은사이토카인의생산및항원-제시세포의용해를야기하는세포면역반응의전파를개시한다. ErbB 패밀리의중요한멤버인 HER2/neu는그것의몇몇의인간암종및포유동물발달에서의역할때문에널리연구되어왔다 (Hynes and Stern(1994) Biochim. et Biophys. Acta 1198: ; 및 Dougall et al.(1994) Oncogene 9: ; Lee et al.(1995) Nature 378: ). 인간 HER2/neu 유전자및 HER2/neu 단백질은 Semba et al.(1985) Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 82: 및 Yamamoto et al.(1986) Nature 319: 에서기술하고, 서열은접근번호 X03363으로서 GenBank에서사용가능하다. HER2/neu는네개의도메인 : 리간드에결합하는세포밖도메인 ; 친유성막통과도메인 ; 보존된세포내티로신키나아제도메인 ; 및인산화될수있는몇몇의티로신잔기를보유하는카르복실-말단신호전달도메인을포함한다 (Plowman et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 90: ). HER2/neu 세포밖 (ECD) 도메인의서열은 Franklin et al.(2004) Cancer Cell. 5(4): 에의해기술되었으며, Protein DataBank Record 1S78(2004) 에서사용할수있다. [1242] [1243] [1244] [1245] [1246] [1247] [1248] [1249] [1250] [1251] [1252] HER2/neu는성장인자수용체로서기능하고, 유방암세포주, 결장암, 방광세포암, 난소암및폐암과같은종양에서종종발현된다. HER2/neu는인간유방암및난소암의 25~30% 에서과발현되고, 이들환자에서공격적인임상진행및나쁜예후와관견된다.(Slamon et al.(1987) Science 235: ; Slamon et al.(1989) Science 244: ). HER2/neu의과발현이또한위, 자궁내막, 침샘, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장및방광의암종을포함하는다른암종에서관찰되었다.( 예컨대, King et al.(1985) Science 229:974; McCann et al.(1990) Cancer 65:88-92; Yonemura et al.(1991) Cancer Research 51 :1034을참조하라 ). 특히, 단백질의막통과부위와매우근접하여존재하는 HER2/neu의시스테인-풍부 II 도메인에서세포밖에피토프 ( 아미노산 529 내지 627) 를인식하고 4D5(HERCEPTIN, Genentech, Inc.) 로알려진설치류단일클론항체의인간화변이체를포함하는, HER-1 또는 HER2/neu를표적하는다수의단일클론항체및소분자티로신키나아제억제자가개발되었다. 연구는 HER2/neu 과발현유방암세포주세포에서화학요법제제 ( 예컨대, 시스플라틴, 독소유비신, 탁솔 ) 와조합된 HER2/neu에특이적인항체를사용한치료가화학요법단독만을사용한치료보다더높은세포독성반응을이끌어내는것을보여주었다.(Hancock et al.(1991) Cancer Res. 51 : ; Arteaga et al.(1994) Cancer 54: ; Pietras et al.(1994) Oncogene 9: ). HER2/neu 항체가화학요법제제에대한반응을향상시킬수있는한가지가능한기작은 HER2/neu 단백질발현을조절하거나 DNA 복구를간섭하는것에의한것이다.(Stancovski et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 88: ; Bacus et al.(1992) Cell Growth & Diff. 3: ; Bacus et al.(1993) Cancer Res. 53: ; Klapper et al.(1997) Oncogene 14: ; Klapper et al.(2000) Cancer Res. 60: ; Arteaga et al.(2001) J Clinical Oncology 19(18s):32s-40s. 특정경우에서, HERCEPTIN과같은항-HER2/neu 항체가환자에대한치료적이점을제공함에도불구하고, 유방암세포주의과반수및다른환자는이런항체에대하여난치성반응을나타낸다. 일부에서이들반응은환자의암세포에의한 HER2/neu의과발현의범위에서의차이를반영한다. Her2/neu 및 T-세포수용체 ("TCR") 에결합할수있는가변부위를함유하는결과로서, DART는 HER2-발현세포에결합할수있는능력을갖고, 그로인해 T-세포수용체에결합할수있는이런세포도메인에부착한다. 이런 T 세포가이도메인에결합하였을때, 그들은 HER2-발현세포의사멸을야기하는면역반응의개시를활성화시킨다. 이런 DART에대한아미노산및핵산서열을하기에제공하고, VL 및 VH 서열은평이한문자, VL-VH 링커는밑줄친문자, C-말단이형이량체화모티프를암호화하는서열 ( 서열번호 313: GFNRGEC 또는서열번호 314: GVEPKSC) 은볼드체및이탤릭체로나타내었다. TCRVL-HER2VH 아미노산서열 ( 서열번호 315) EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ SGPELVKPGA SLKLSCTASG FNIKDTYIHW VKQRPEQGLE WIGRIYPTNG YTRYDPKFQD KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV TVSSGFNRGE C TCRVL-HER2VH-암호화핵산서열 ( 서열번호 316)

142 [1253] [1254] [1255] [1256] [1257] [1258] [1259] [1260] [1261] [1262] [1263] [1264] [1265] [1266] [1267] [1268] [1269] [1270] [1271] [1272] [1273] [1274] [1275] [1276] [1277] [1278] [1279] [1280] [1281] [1282] [1283] [1284] [1285] [1286] gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag gccaggttca gctgcagcag tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct ccggattcaa caggggagag tgt HER2VL-TCRVH 아미노산서열 ( 서열번호 317) DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSSGVEPK SC HER2VL-TCRVH-암호화핵산서열 ( 서열번호 318) gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctccggagt tgagcccaaa tcttgt 바람직한구체예에서, 이런컨스트럭트는이형이량체의형성을촉진시킬수있는 E 코일또는 K 코일도메인을함유하도록변형된다 ( 즉, TCRVL-HER2VH x HER2VL-TCRVH 이량체 ). 이런 DART에대한아미노산및핵산서열은하기에서제공되고, VL 및 VH 서열은평이한문자, VL-VH 링커는밑줄친문자, 이량체화를위한 Cys-함유링커를암호화하는서열 (GGCGGG; 서열번호 267의잔기 2-7) 은이탤릭체로나타내었다. K 코일이형이량체화도메인

143 의 E 코일은기울기 - 밑줄쳐나타내었다 ( 바람직한 "E- 코일 " 서열은 4 개의 EVAALEK 의 7 량체반복 ; 서열번호 299 이 고 ; 바람직한 "K- 코일 " 서열은 4 개의 KVAALKE 의 7 량체반복 : 서열번호 300 이다 ). E 코일또는 K 코일뒤에따르 는서열은기능이없다. [1287] [1288] [1289] [1290] [1291] [1292] [1293] [1294] [1295] [1296] [1297] [1298] [1299] [1300] [1301] [1302] [1303] [1304] [1305] [1306] [1307] [1308] [1309] [1310] [1311] [1312] [1313] [1314] [1315] [1316] [1317] [1318] [1319] TCRVL-HER2VH-E 코일아미노산서열 ( 서열번호 319) EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ SGPELVKPGA SLKLSCTASG FNIKDTYIHW VKQRPEQGLE WIGRIYPTNG YTRYDPKFQD KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV TVSSGGCGGG EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKGG GNS TCRVL-HER2VH-E 코일-암호화핵산서열 ( 서열번호 320) gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag gccaggttca gctgcagcag tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct ccggaggatg tggcggtgga gaagtggccg cactggagaa agaggttgct gctttggaga aggaggtcgc tgcacttgaa aaaaaaatca caaccctaaa gaaaggcggc gggaattct HER2VL-TCRVH-K 코일아미노산서열 ( 서열번호 321) DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSSGGCGG GKVAALKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKEG GGNS HER2VL-TCRVH-K 코일-암호화핵산서열 ( 서열번호 322) gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg

144 [1320] [1321] [1322] [1323] [1324] [1325] [1326] [1327] [1328] [1329] [1330] ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctccggagg a tgtggcggt ggaaaagtgg ccgcactgaa ggagaaaatt gctgctttga aagagaaggt cgccgcactt aaggaaaagg tcgcagccct gaaagagggc ggcgggaatt ct Her2 및 T-세포수용체 (TCR) 결합도메인을갖는 DART를저수준의 HER2 발현을나타내는것으로서이전에특징화된다양한유방암세포주, 결장암및방광암세포주에서그들의세포독성의매개하는능력에대하여시험하였다 ( 그리고따라서항-Her2/neu 항체, Herceptin를사용한치료에대하여난치성인지 ). 시험한유방암세포주는 ZR75-1(HER2 2+)( 도 49a), MCF-7(HER2 1+)( 도 49b) 및 MDA-MB468(HER2-ve)( 도 49c) 이다. 시험한비-유방암세포주는 HT-29( 결장암세포주 )( 도 49d) 및 SW780( 방광암세포주 )( 도 49e) 이다. 도 49a-e에서보여준것과같이, 이런 DART 분자는동등한세포독성을달성하기위해필요한농도의면에서, 및관찰된세포독성의최대수준의면에서모두종양-유래세포주의세포독성을매개하는것에서 HERCEPTIN보다실질적으로더욱효과적이었다. 본발명의많은변경및변형이당업자에의해명백할것인바그것의정신및범주를벗어나지않고만들어질수있다. 본발명에서기술한특이적구체예는오직예시의방법으로만제공되고, 본발명은이런청구범위가주장하는등가물의전체범주에따라서첨부한청구항의용어에의해서만오직제한될것이다. 본발명에인용된모든참고문헌, 특허및비-특허는, 마치각각의개별발행물, 또는특허또는특허출원이명확하고개별적으로모든목적에대하여그전체가참고문헌으로써포함되는것처럼동일한범위로모든목적에대하여그전체가참고문헌으로써본발명에포함된다. 도면 도면 1a

145 도면 1b

146 공개특허 도면2 도면3 도면4a

147 도면 4b 도면

148 도면 6a 도면 6b 도면 6c

149 도면 7a 도면 7b 도면 7c

150 도면 7d 도면 7e 도면

151 도면 9 도면

152 도면 11 도면

153 도면 13 도면

154 도면 15a 도면 15b

155 공개특허 도면16 도면17 도면

156 도면 19 도면 20 도면

157 도면 22 도면

158 도면 24 도면

159 도면 26 도면

160 도면 28 도면

161 도면 30 도면

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168 도면 41 도면