Product Description Apoptosis 혹은 necrosis등에의하여죽거나손상된세포에서방출되는 Lactate dehydrogenase(ldh) 의양을고감도로측정함으로써 cytotoxicity/cytolysis를간단하게측정할수있는 kit 입니다. Cytot

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상호 경
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1 EZ-LDH Cell Cytotoxicity Assay Kit Cat. No. DG-LDH500 DG-LDH1000 FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES. 1 ( 주 ) 대일랩서비스부설두젠생명공학연구소

Product Description Apoptosis 혹은 necrosis등에의하여죽거나손상된세포에서방출되는 Lactate dehydrogenase(ldh) 의양을고감도로측정함으로써 cytotoxicity/cytolysis를간단하게측정할수있는 kit 입니다.

Lactate dehydrogenase(ldh) 는세포질에존재하는 stable enzyme으로통상적으로는세포막을통과하지못하여세포밖으로배출되지않으나, 세포막이손상되거나세포가죽는경우배지중으로방출됩니다. 그렇기때문에배지중의 LDH양은죽거나혹은상해를입은세포의수와비례하게됩니다.

2 Product Description Apoptosis 혹은 necrosis등에의하여죽거나손상된세포에서방출되는 Lactate dehydrogenase(ldh) 의양을고감도로측정함으로써 cytotoxicity/cytolysis를간단하게측정할수있는 kit 입니다. Cytotoxicity (Cell death) 는 cell viability test를통하여간접적으로측정할수있지만, 더 sensitive하고, 정확한측정을위해서는 cell death 또는 cell damage와관련된효소를이용한방법으로실험하는것이좋습니다. Lactate dehydrogenase(ldh) 는세포질에존재하는 stable enzyme으로통상적으로는세포막을통과하지못하여세포밖으로배출되지않으나, 세포막이손상되거나세포가죽는경우배지중으로방출됩니다. 그렇기때문에배지중의 LDH양은죽거나혹은상해를입은세포의수와비례하게됩니다. EZ-LDH cytotoxicity Assay kit는이러한 LDH의특성에기반하여, 세포에서방출된 LDH의양을 water soluble tetrazolium salt (WST) 를이용하여흡광도 (450nm) 를측정하는방식을통해 cell cytotoxicity test를간편하고빠르게수행할수있습니다. Fig. Cell cytotoxicity detection mechanism with EZ-LDH Kit Contents and Storage Conditions Component DG-LDH500 DG-LDH assay 1000 assay Part Number WST Substrate Mix 1 vial (-20 ) 2 vials (-20 ) DG-LDH S1 LDH Assay Buffer 50ml (0~4 ) 100ml (0~4 ) DG-LDH B50 Cell Lysis Solution 6ml (0~4 ) 6ml x 2 (0~4 ) - Stop Solution 6ml (0~4 ) 6ml x 2 (0~4 ) - * 동결건조된 WST Substrate 는 -20 에서 6 개월간안정하며, 용해시킨후 4 에서 2 개월동안안정합니다. 2 T F

3 Media 10% FBS가함유된 media를사용하여실험을진행합니다. Background를낮추고싶은경우무혈청배지를사용하시거나, 혹은 FBS의함량을낮추어사용하면됩니다. Preparation of Working Solution Solution Preparation Storage and Stability WST Substrate Mix Reaction Mixture ( Protect from light ) 하나의 vial에증류수 1.1ml을첨가한후, 10분간혼합하여완전히용해한다. ** do not vortex For 100 tests : 200μl WST Substrate Mix 와 10ml LDH Assay Buffer를혼합한다. 용해한용액은 4 에서 2개월동안안정합니다. 반응혼합액은 4 에서수주간안정하나, 사용직전에혼합하여사용하는것이좋습니다. Preparation of Control 실험방법은적정세포수를정하기위한예비실험외에크게 Normal Cytotoxicity assay 와 Cell mediated Cytotoxicity assay 두가지방법으로나눌수있으며, 실험에공통적으로필요한 control 군은다음과같습니다. 1) Background control Media의 FBS에포함되어있는 LDH를측정합니다. 2) Low control 실험과정중자연적으로죽거나손상된세포에서방출되는 LDH의양을측정합니다. 3) High control 실험에사용된세포에 Lysis solution 10μl를첨가시켜세포를인위적으로살해하여, 세포에서방출가능한최대의 LDH의양을측정합니다. 4) Volume control Assay media 100μl에 Lysis solution 10μl을첨가하여측정하며, High control에서 lysis solution 사용에의해늘어난 volume을보정하기위하여필요합니다. 3 ( 주 ) 대일랩서비스부설두젠생명공학연구소

Optimization of Cell Concentration LDH의함량은세포의종류에따라차이가있으므로보다정확한실험결과를얻기위해서는예비실험을통하여최적의세포농도를결정하는것이좋습니다. ( Cell mediated cytotoxicity assay의경우 Target cell만예비실험을진행합니다. ) 1.

Background control : 100 μl assay media 를 3 개의 well 에준비합니다. Volume Control : 100 μl assay media 를 3 개의 well 에준비합니다. 3. 실험조건에맞게적절한시간동안 incubator에서반응시킵니다. ( e.g. 6, 12, 24, 48 hours등본실험의경우와동일시간배양합니다.

4 Optimization of Cell Concentration LDH의함량은세포의종류에따라차이가있으므로보다정확한실험결과를얻기위해서는예비실험을통하여최적의세포농도를결정하는것이좋습니다. ( Cell mediated cytotoxicity assay의경우 Target cell만예비실험을진행합니다. ) 1. 배양중인세포를모아 5 X 10 4 cells/ml 의농도가되도록세포현탁액을준비합니다. 2. Low control과 High control을각각 3개씩설정하여준비한세포현탁액을 2배씩 serial dilution을합니다. 이때 Background control과 Volume control도준비합니다. Background control : 100 μl assay media 를 3 개의 well 에준비합니다. Volume Control : 100 μl assay media 를 3 개의 well 에준비합니다. 3. 실험조건에맞게적절한시간동안 incubator에서반응시킵니다. ( e.g. 6, 12, 24, 48 hours등본실험의경우와동일시간배양합니다. ) 4. 배양이끝난 plate상의 High control군과 Volume control군에 Lysis solution을 well 당 10μl씩넣어줍니다. ( Lysis 가잘되도록 pipetting 해주거나상온에서 5분동안반응시킵니다. ) 5. 원심분리기를이용하여, 배지중에떠있는세포를침전시켜줍니다 ( at 600xg, for 5min ). 6. 상층액 10μl를취하여새로운 96well plate에옮깁니다. ( 세포의침전이흐트러지지않도록주의합니다.) 7. LDH Reaction Mixture 을제조하여각 well 에 100 μl씩첨가한후, 조심스럽게섞어줍니다. 8. Plate 를빛이차단된상온에서 30 분간 * 반응시킵니다. * multiple time point 측정이가능하여반응시간조절이가능합니다. 흡광도 Low control OD 450 < 0.8, High control OD 450 < 2.0 범위안에서적절한흡광도값을가지는시간으로조절하시기바랍니다. 9. 흡광도를측정하기전부드럽게 shaking 한후, Plate reader를이용하여 450nm에서흡광도를측정합니다. ( Reference wavelength 600~650nm ) 10. Low control과 High control의흡광도차이가최대가되는세포농도로적정세포수를결정합니다. 4 T F

* 세포의최적농도결정의예 Optimization of Cell Concentration 의방법에따라실험후, High control 과 Low control 을 Volume control 과 Background control 로각각보정하여다음과같은결과를얻었을경우실험에적합한최적의세포수는흡광도의차이가가장많이나는

Optimization of Cell Concentration 예비실험을통해결정된세포수의 2 배농도로세포현탁액을준비하여 96well plate 에 well 당 50 μl씩분주하여, 24 시간정도 CO 2 incubator 에서배양합니다. ( e.g., at 37, 5% CO 2 ) 2.

5 * 세포의최적농도결정의예 Optimization of Cell Concentration 의방법에따라실험후, High control 과 Low control 을 Volume control 과 Background control 로각각보정하여다음과같은결과를얻었을경우실험에적합한최적의세포수는흡광도의차이가가장많이나는 25,000cells/well(100 μl ) 입니다. General Protocol Cell Cytotoxicity Assay A. Normal Cytotoxicity Protocol 1. Optimization of Cell Concentration 예비실험을통해결정된세포수의 2 배농도로세포현탁액을준비하여 96well plate 에 well 당 50 μl씩분주하여, 24 시간정도 CO 2 incubator 에서배양합니다. ( e.g., at 37, 5% CO 2 ) 2. 다양한농도로준비된실험물질을각 well 에 50 μl씩첨가합니다. ( 이때각각의 control 군에는배지 50 μl씩넣어총 volume 을 100 μl로맞추어줍니다. ) 3. 실험조건에맞게적절한시간동안 incubator 에서반응시킵니다. ( e.g. 6, 12, 24, 48 hours ) 4. High control 군과 Volume control 군에 Lysis solution 을 well 당 10 μl씩넣어줍니다. ( Lysis 가잘되도록 pipetting 해주거나상온에서 5 분동안반응시킵니다. ) 5 ( 주 ) 대일랩서비스부설두젠생명공학연구소

5. 원심분리기를이용하여, 배지중에떠있는세포를침전시켜줍니다 ( at 600xg, for 5min ). 6. 상층액 10 μl를취하여새로운 96well plate 에옮깁니다. ( 세포의침전이흐트러지지않도록주의합니다. ) 7. LDH Reaction Mixture 을제조하여각 well 에 100 μl씩첨가한후, 조심스럽게섞어줍니다. 8.

흡광도를측정하기전부드럽게 shaking 한후, Plate reader 를이용하여 450nm 에서흡광도를측정합니다. ( Reference wavelength 600~650nm ) * 10 μl Stop solution 을넣어반응을정지시킬수있습니다. * Calculation of cytotoxicity B.

6 5. 원심분리기를이용하여, 배지중에떠있는세포를침전시켜줍니다 ( at 600xg, for 5min ). 6. 상층액 10 μl를취하여새로운 96well plate 에옮깁니다. ( 세포의침전이흐트러지지않도록주의합니다. ) 7. LDH Reaction Mixture 을제조하여각 well 에 100 μl씩첨가한후, 조심스럽게섞어줍니다. 8. Plate 를빛이차단된상온에서 30 분간 * 반응시킵니다. * multiple time point 측정이가능하여반응시간조절이가능합니다. 흡광도 Low control OD 450 < 0.8, High control OD 450 < 2.0 범위안에서적절한흡광도값을가지는시간으로조절하시기바랍니다. 9. 흡광도를측정하기전부드럽게 shaking 한후, Plate reader 를이용하여 450nm 에서흡광도를측정합니다. ( Reference wavelength 600~650nm ) * 10 μl Stop solution 을넣어반응을정지시킬수있습니다. * Calculation of cytotoxicity B. Cell mediated Cytotoxicity Protocol 1. Effector cell ( NK cell, CTLs 등 ) 를측정배지를이용하여 2 배씩희석하여 96well plate 에 50 μl씩분주하여줍니다. 이때 Effector cell 에서자연적으로방출되는 LDH 측정을위해 effector cell control 군도설정하여준비합니다. 2. Target cell 을 Optimization of Cell Concentration 예비실험을통해결정된세포수의 2 배농도로세포현탁액을준비하여 effector cell 이있는 well 에 50 μl씩넣어줍니다. 이때 Target cell 의 Low control 과 High control 을각각 3 개의 well 에만들어줍니다. ( 각각의 control 군에는배지 50 μl씩넣어총 volume 을 100 μl로맞추어줍니다. ) 6 T F

3. 실험조건에맞게적절한시간동안 incubator 에서반응시킵니다. ( e.g. 2, 4, 6 hours ) 4. Target cell High control 군과 Volume control 군에 Lysis solution 을 well 당 10 μl씩넣어줍니다. ( Lysis 가잘되도록 pipetting 해주거나상온에서 5 분동안반응시킵니다. ) 5.

7 3. 실험조건에맞게적절한시간동안 incubator 에서반응시킵니다. ( e.g. 2, 4, 6 hours ) 4. Target cell High control 군과 Volume control 군에 Lysis solution 을 well 당 10 μl씩넣어줍니다. ( Lysis 가잘되도록 pipetting 해주거나상온에서 5 분동안반응시킵니다. ) 5. Normal Cytotoxicity Protocol 의 5~9 과동일하게측정합니다. * Calculation of cytotoxicity Related Product Product Catalog No. Assay EZF tests EZ-Fluor * EZF tests EZ tests EZ-Cytox ** EZ tests * 형광측정법을이용한 Cell Viability & Cytotoxicity Assay Kit ** WST 기질을이용한 Cell Proliferation / Viability Assay kit. 7 ( 주 ) 대일랩서비스부설두젠생명공학연구소

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