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12 MHC T cell Receptor Antigen Antigen-presenting cell Antigen-reactive T cell CD28 B7 Activation (proliferation Cytokine production Cytotoxicity) Antigen-presenting cell Antigen-reactive T cell Dormant State (unresponsiveness) Antigen engagement without inflammation(costimulation) Unresponsiveness to subsequent stimulation

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14 Molecular dissection of tolerance-related molecules/negative regulators of T cells (Spry1, Ndr1, Cbl-b, TGF-beta, CTLA-4, etc.) Development of reagents modulating regulators (Dominant negative mutants / sirna in lentivirus/adeno-associated virus) Tumor-bearing mouse Stimulation with Tumor antigen Modulated T cells

15 anti-tcr anti-tcr anti-cd28 Rest for 5-7 days Proliferation IL-2 production IL-2(pg/ml) Effect of various reagents on anergy induction Effect of various reagents on mrna induction Sprouty1 Average difference Mock Signa l 1 Only 1 + Cs A Combined 0 Mock Signa l 1 Only 1 + CsA Combined Ndrg1 Average difference Mock Signal 1 Only 1 + Cs A Combined

16 Ndrg1-overexpressed A.E7 Anergic A.E Buffer TAT-Ndr Anergized, 10ug/ml Unanergized 3500 TAT-GFP 8000 IL-2(pg/ml) IL-2 (pg/ml) anti-cd3(ug/ml) anti-cd3 (ug/ml) Buffer TAT-Ndr Anergized, 10ug/ml Unanergized TAT-GFP cpm IL-2 (pg/ml) anti-cd anti-cd3 (ug/ml)

17 TAT-GFP TAT-Ndr1 Buffer cpm IL-2 (ng/ml)

18 (A) Effect of TAT-sprouty1 on IL-2 production IL-2 (pg/ml) IL-2 (pg/ml) Buffer TAT-Spry TAT-GFP Anti-CD3 Ab (μg/ml) Anti CD3 Ab (ug/ml) AE7 T cell clone F1.A2 T cell clone (B) TAT-Spry1 inhibits activation of MAPK and NFAT Un CD3 Ab (10ug/ml) + CD28 Ab Buffer TAT-Spry1 TAT-GFP CD3 Ab (1ug/ml) + CD28 Ab CD3 Ab (10ug/ml) + CD28 Ab IB: p-erk Un Buffer TAT-Spry1 TAT-GFP Buffer TAT-Spry1 TAT-GFP IB: NFATc2 IB: Total Erk

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29 Unstimulated Stimulated Luc. activity Ndr1 0ug Ndr1 2ug Ndr1 5ug Ndr1 10ug unstimulated acd3 alone acd3+acd unstimulated acd3 alone acd3+acd28 Luc. activity Luc. activity NFAT/Luc. phm6 NFAT/Luc. Ndr1 0 AP-1/Luc. phm6 AP-1/Luc. Ndr unstimulated acd3 alone acd3+acd28 Luc.activity NFkB/Luc. phm6 NFkB/Luc. Ndr1

30 phm6 10ug Ndr1 10ug unstimulated 1ug/ml acd3 10ug/ml acd3 1ug/ml acd3 + 10ug/ml acd28 10ug/ml acd3 + 10ug/ml acd28 PMA+Iomontcin

31 With bait With vector : Positive control - : Negative control lacz expression Filter assay Master plate SD-LW HIS3/ADE2 expression SD-LWHA With bait With vector : Positive control - : Negative control lacz expression Filter assay Master plate SD-LW HIS3/ADE2 expression SD-LWHA

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34 T cell Receptor Zeta-chain PLC-γ Lck ZAP-70 LAT? Spry1 PIP 2 Ca 2+ IP 3 + DAG Ras-GRP Ras NF-AT MAPK NF-AT AP-1 IL-2 luciferase activity unstimulated stimulated with acd3 + acd v ector-2ug v ector-5ug sprouty1-2ug sprouty1-5ug

35 250 unstimulated stimulated uninduced induced 200 anti-flag (Spry1) anti-actin IL-2(pg/ml) uninduced induced

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43 Master plate With bait With vector With bait With vector With bait With vector : Negative control + : Positive control SD-LW lacz expression URA3 expression ADE2 expression Filter assay SD-LWU SD-LWA

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46 Sprouty unstimulated acd3+acd28 luciferase activity Empty vector WT-Spry1 WT-Spry1+dRBM Sprouty2 Sprouty4 IL-2 Luciferase activity unstimulated stimulated empty vector Spry 2 Spry 2 + drbm IL-2 Luciferase activity unstimulated stimulated empty vector Spry4 Spry4 + drbm

47 Transgenic Construct of DN-Spry bp Transgene to be injected 4401bp Not I Sal I Sal I Not I 2700bp CD4 promoter DN-Spry1 p37.1 HA tag PolyA tail

48 IL-2 IFN-r IL-2 secreting population /transfected population (% positive) Empty vector Spry1 drbm IFN-r secreting population /transfected population (% positive) Empty vector Spry1 drbm hr 1hr 2hr 4hr 18hr Duration of stimulation hr 1hr 2hr 4hr 18hr Duration of stimulation

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mau A B C Qsepharose051229manual001:1_UV@01,SHFT Qsepharose051229manual001:1_Conc Qsepharose051229manual001:1_Fractions Qsepharose051229manual001:1_Inject Manual run 3:1_UV@01,SHFT Manual run 3:1_Fractions

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