공개특허 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2010년07월09일 (51) Int. Cl. C12N 15/31 ( ) C12N 15/63 (

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2010년07월09일 (51) Int. Cl. C12N 15/31 ( ) C12N 15/63 ( ) A61K 39/02 ( ) C07K 14/195 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 ( 국제출원일자 ) 2007 년 08 월 03 일 심사청구일자 없음 (85) 번역문제출일자 2010 년 03 월 02 일 (86) 국제출원번호 PCT/EP2007/ (87) 국제공개번호 WO 2008/ 국제공개일자 전체청구항수 : 총 44 항 2008 년 02 월 14 일 (71) 출원인 스파이로진피티와이리미티드 오스트레일리아더블유. 에이. 머독사우스스트리트머독유니버시티캠퍼스드라이브빌딩 191 (72) 발명자 벨가드매튜 오스트레일리아웨스턴오스트레일리아 6156 아타데일캠피온크레센트 20 햄슨데이비드존 오스트레일리아웨스턴오스트레일리아 6112 벳포데일캐러다인로드 416 라톰 오스트레일리아웨스턴오스트레일리아 6149 파크우드아베케언웨이 49 (74) 대리인 (54) 브라키스피라하이오디센테리애의유전자와단백질및이의용도 (57) 요약 유미특허법인 브라키스피라하이오디센테리애의신규한폴리뉴클레오티드및아미노산에관한것이다. 이들의서열은동물에서브라키스피라하이오디센테리애질병의진단과동물에서브라키스피라하이오디센테리애질병의치료학적치료또는예방학적치료에있어유용하다. 또한, 이들서열은브라키스피라인테르메디아 (B. intermedia), 브라키스피라수아나티나 (B. suanatina), 브라키스피라알비니풀리 (B. alvinipulli), 브라키스피라알보르기 (B. aalborgi), 브라키스피라이노센스 (B. innocens), 브라키스피라무르도치 (B. murdochii) 및브라키스피라필로시콜리 (B. pilosicoli) 등의다른브라키스피라종에의해야기되는질병을동물에서진단및치료학적및 / 또는예방학적치료에유용할수있다

2 특허청구의범위청구항 1 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65로이루어진군으로선택되는서열을포함하는폴리뉴클레오티드. 청구항 2 제1항의폴리뉴클레오티드를포함하는플라스미드. 청구항 3 제2항에있어서, 상기플라스미드가발현벡터인것을특징으로하는플라스미드. 청구항 4 제2항의플라스미드를포함하는세포. 청구항 5 제3항의플라스미드를포함하는세포. 청구항 6 제3항의플라스미드를포함하는면역조성물. 청구항 7 제3항의발현벡터를포함하는브라키스피라하이오디센테리애 (Brachyspira hyodysenteriae) 의치료또는예방용백신조성물. 청구항 8 제4항의세포를포함하는브라키스피라하이오디센테리애의치료또는예방용백신조성물. 청구항 9 제1항의폴리뉴클레오티드와 70% 이상동일한서열을포함하는 DNA 분자. 청구항 10 제9항의폴리뉴클레오티드를포함하는플라스미드. 청구항 11 제9항에있어서, 상기 DNA 분자가제1항의폴리뉴클레오티드와 80% 이상동일한것을특징으로하는 DNA 분자. 청구항 12 제11항의폴리뉴클레오티드를포함하는플라스미드. 청구항 13 제9항에있어서, 상기 DNA 분자가제1항의폴리뉴클레오티드와 90% 이상동일한것을특징으로하는 DNA 분자. 청구항 14 제13항의폴리뉴클레오티드를포함하는플라스미드. 청구항 15 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, - 2 -

3 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66으로이루어진군으로부터선택되는서열을포함하는폴리펩타이드. 청구항 16 제15항의폴리펩타이드를코딩하는서열을포함하는폴리뉴클레오티드. 청구항 17 제16항의폴리뉴클레오티드를포함하는플라스미드. 청구항 18 제17항에있어서, 상기플라스미드가발현벡터인것을특징으로하는플라스미드. 청구항 19 제17항의플라스미드를포함하는세포. 청구항 20 제19항의세포를포함하는면역조성물. 청구항 21 제15항의폴리펩타이드와 70% 이상상동한서열을포함하는단백질. 청구항 22 제21항에있어서, 상기단백질이제15항의폴리펩타이드와 80% 이상상동한것을특징으로하는단백질. 청구항 23 제21항에있어서, 상기단백질이제15항의폴리펩타이드와 90% 이상상동한것을특징으로하는단백질. 청구항 24 제23항의단백질을포함하는면역조성물청구항 25 제15항의폴리펩타이드를포함하는면역조성물. 청구항 26 제15항의폴리펩타이드를포함하는브라키스피라하이오디센테리애의치료또는예방용백신조성물. 청구항 27 제15항의폴리펩타이드에결합하는단일클론항체. 청구항 28 제27항의단일클론항체를포함하는, 동물에서브라키스피라하이오디센테리애의존재를진단하기위한키트. 청구항 29 제15항의폴리펩타이드를포함하는, 동물에서브라키스피라하이오디센테리애의존재를진단하기위한키트. 청구항 30 제1항의폴리뉴클레오티드를포함하는, 동물에서브라키스피라하이오디센테리애의존재를진단하기위한키트. 청구항 31 제24항의면역조성물을동물에게투여하는단계를포함하는, 동물에서브라키스피라하이오디센테리애에대한 - 3 -

4 면역반응을형성시키는방법. 청구항 32 제25항의면역조성물을동물에게투여하는단계를포함하는, 동물에서브라키스피라하이오디센테리애에대한면역반응을형성시키는방법. 청구항 33 제6항의면역조성물을동물에게투여하는단계를포함하는, 동물에서브라키스피라하이오디센테리애에대한면역반응을형성시키는방법. 청구항 34 제20항의면역조성물을동물에게투여하는단계를포함하는, 동물에서브라키스피라하이오디센테리애에대한면역반응을형성시키는방법. 청구항 35 제7항의백신조성물을치료학적유효량으로동물에게투여하는단계를포함하는, 치료가필요한동물에서브라키스피라하이오디센테리애로인한질병을치료또는예방하는방법. 청구항 36 제8항의백신조성물을치료학적유효량으로동물에게투여하는단계를포함하는, 치료가필요한동물에서브라키스피라하이오디센테리애로인한질병을치료또는예방하는방법. 청구항 37 제26항의백신조성물을치료학적유효량으로동물에게투여하는단계를포함하는, 치료가필요한동물에서브라키스피라하이오디센테리애로인한질병을치료또는예방하는방법. 청구항 38 동물에서브라키스피라하이오디센테리애에대한면역반응을형성시키기위한약제제조에있어서의제23항의단백질의용도. 청구항 39 동물에서브라키스피라하이오디센테리애에대한면역반응을형성시키기위한약제제조에있어서의제15항의단백질의용도. 청구항 40 동물에서브라키스피라하이오디센테리애에대한면역반응을형성시키기위한약제제조에있어서의제3항의플라스미드의용도. 청구항 41 동물에서브라키스피라하이오디센테리애에대한면역반응을형성시키기위한약제제조에있어서의제19항의세포의용도. 청구항 42 치료가필요한동물에서브라키스피라하이오디센테리애로인한질병을치료또는예방하기위한약제제조에있어서의제3항의발현벡터의용도. 청구항 43 치료가필요한동물에서브라키스피라하이오디센테리애로인한질병을치료또는예방하기위한약제제조에있어서의제4항의세포의용도

5 청구항 44 치료가필요한동물에서브라키스피라하이오디센테리애로인한질병을치료또는예방하기위한약제제조에 있어서의제 15 항의폴리펩타이드의용도. 명세서 [0001] 기술분야본발명은브라키스피라하이오디센테리애 (Brachyspira hyodysenteriae) 의신규유전자및이로부터코딩되는단백질에관한것이다. 본발명은또한브라키스피라하이오디센테리애질병의진단, 브라키스피라하이오디센테리애백신, 및브라키스피라하이오디센테리애를사멸시키거나브라키스피라하이오디센테리애의병원성을차단시키는화합물을스크리닝하기위한신규한유전자및단백질의용도에관한것이다. 또한, 이들서열은브라키스피라수아나티나 (B. suanatina), 브라키스피라인테르메디아 (B. intermedia), 브라키스피라알비니풀리 (B. alvinipulli), 브라키스피라알보르기 (B. aalborgi), 브라키스피라이노센스 (B. innocens), 브라키스피라무르도치 (B. murdochii) 및브라키스피라필로시콜리 (B. pilosicoli) 등의다른브라키스피라종에의해야기되는질병을, 동물에서진단적, 치료학적및 / 또는예방학적으로처리하는데유용할수있다. [0002] [0003] [0004] 배경기술돼지이질은호주와전세계적으로심각한돼지풍토병이다. 돼지이질은전염성의점액출혈성설사병으로, 대장의상피표면에서의광범위한염증과괴사가특징이다. 돼지이질로인한경제적손실은주로성장지연, 약물치료비용및사망으로인한것이다. 돼지이질의원인물질은최초로 1971년에혐기성스피로헤타 (spirocheta)(treponema hyodysenteriae) 인것으로동정되었고, 최근들어브라키스피라속의브라키스피라하이오디센테리애로재지정되었다. 돼지이질이어떤양돈장에방생하는경우에, 질병스펙트럼은경증의일시적이거나뚜렷하지않은수준에서부터중증의심지어치명적인수준까지다양할수있다. 개별양돈장에서의약물요법전략은임상적인징후를가릴수있으며, 일부양돈장에서는질병을알아채지목한채지나가거나또는단순히의심만받을수도있다. 명백한질병이발생되든발생되지않든간에, 브라키스피라하이오디센테리애는감염된돼지나설치류와같은다른기생숙주또는환경에서존속할수있다. 이러한모든소스들은감염되지않은무리에질병을전파시킬수있는잠재력을가지고있다. 또한, 브라키스피라하이오디센테리애는야외조건에서일반적으로어떤방식으로발생되는지는명확하지않지만, 상업적인가금 (commercial poultry) 들에브라키스피라하이오디센테리애가군락을이룰수도있다. 브라키스피라하이오디센테리애의군락화는스피로헤타에대한강력한면역반응을이끌어내므로, 스피로헤타에대한노출의비간접적인증거는감염된동물의혈액중의순환성항체역가를측정함으로써확보할수있다. 이러한항체역가는돼지이질에서회복된동물에서도낮은수준으로유지되는것으로보고되었다. 그래서, 항체를검출하기위한혈청검사는무증상감염과대장내스피로헤타수준을검출할수없는회복한보균돼지를검출하는데상당한잠재력이있다. 이검사는효소-연계면역흡착분석과같은키트형태로사용하기용이하다는점에서특히유익하다. 비간접형광항체테스트, 헴어글루틴화테스트 (haemagglutination test), 미세역가어글루틴화테스트, 보체고정테스트및리포폴리사카라이드나초음파분해된전체스피로헤타를항원으로이용하는 ELISA 등의, 순환성브라키스피라하이오디센테리애항체의존재를확인하기위한다양한기법들이개발되고있다. 그러나, 관련성있는비병원성장스피로헤타는교차반응성항체를유발할수있어, 이러한테스트들모두특이성에문제가있다. 이러한테스트들은질병이명확하고순환성항체역가가높은무리를검출하는데에는유용하지만, 감염된무증상무리와감염된개별돼지를확인하는데에는문제가있다. 그래서, 지금까지브라키스피라하이오디센테리애항체검출에이용될수있는매우민감하며특이적인분석법은없는실정이다. 적절한진단테스트의부재는돼지이질을방제하는데걸림돌이된다. 항균제의예방학적이용에서부터감염된무리의완전한정리및감염된보균돼지의재진입예방에이르기까지다양하게, 돼지이질을방제하기위해수많은방법들이사용되고있다. 이러한모든방안들은비싸고, 충분히유효하지않아, 진행을모니터링하기위한세심한진단테스트의사용이요구되고있다. 현재, 무증상의감염된무리와개별건강한보균동물들에서돼지이질을검출하는것이주된난제로남아있어, 효과적인방제조치를이행하는데방해가되고있다. 돼지이질의최종진단에는전통적으로병에걸린돼지의변이나점액으로부터브라키스피라하이오디센테리애를분리및동정하는것이필요하다. 이와관련된주요문제점은, 이들혐기성박테리애는증식이느리고영양요구성이까다롭고, 돼지장내정상적인미생물균총에형태적으로유사한 - 5 -

6 스피로헤타가존재함으로인한혼동이다. 병에걸린개별돼지를진단하는데있어현저한개선은배설물에서스피로헤타를검출하는중합효소연쇄반응 (PCR) 분석을개발함으로써달성되었다. 그러나, 공교롭게도, 실제적용에서는, PCR의검출한계로인해무증상감염된보균동물을검출할순없다. 이러한진단문제로인해, 돼지무리와개별돼지수준에서브라키스피라하이오디센테리애의감염을검출할수있는간단하고효과적인진단툴을개발할필요성이명백해지고있다. [0005] [0006] [0007] [0008] 강력한면역반응은먼저스피로헤타에대해, 다음으로브라키스피라하이오디센테리애의군락화에대해유발되며, 돼지이질에서회복한돼지는재감염이예방된다. 그럼에도불구하고, 돼지이질을방제하기위한백신의개발시도가이루어졌지만그성공은매우제한적인데, 그이유는백신이돼지무리단위에대해불충분한예방을제공하거나또는백신을생산하는것이매우어렵고비용이많이들어서상업적으로실행가능성이없기때문이다. 박테린백신은어느정도의예방을제공하지만, 리포폴리사카리아드혈청군-특이적인경향이있어, 다가 (multivalent) 박테린의사용이요구된다. 또한, 스피로헤타의까다로운혐기성증식요건으로인해대규모로생산하기어렵고비용이많이든다. 돼지이질에대한약독화된생백신을개발하기위한시도가수차례이루어졌다. 이러한시도는약독화된균주의군락화가감소되어면역자극이감소되는문제가있다. 또한, 특히브라키스피라하이오디센테리애에서의유전자조절및조직화에대해선거의알려져있지않아, 병독성으로의반전될가능성으로인해, 돼지이질에대한생백신을사용하는것은제조사나수의사측에서도꺼려한다. 재조합서브유닛백신을사용하는것은, 제품이명확하고 ( 등록을위해서는필수임 ) 비교적대규모생산이용이하기때문에, 매력적인대안책이될수있다. 지금까지, 백신후보로서브라키스피라하이오디센테리애유래의재조합단백질 (38K kda 플라젤라단백질 ) 을사용한최초의보고에서는돼지에서의군락화를예방하지못했다. 이런실패는사용한특정재조합단백질뿐만아니라전달시스템과경로, 투여율, 보강제선택등의다른다은스트림이슈들과특이적으로관련있을것이다 (Gabe, JD, Chang, RJ, Slomiany, R, Andrews, WH and McCaman, MT (1995) Isolation of extracytoplasmic proteins from Serpulina hyodysenteriae B204 and molecular cloning of the flab1 gene encoding a 38-kilodalton flagellar protein. Infection and Immunity 63: ). 백신에사용되어, 최초로보고된, 부분적으로예방적인, 재조합브라키스피라하이오디센테리애단백질은, 다양한병원성박테리애의메티오닌-결합성지단백질과상동성을가지는, 29.7 kda의외막지단백질 (Bhlp29.7, 또한 BmpB 및 BlpA이라고도함 ) 이었다. His-테그형재조합 Bhlp29.7 단백질을돼지백신접종에사용한후브라키스피라하이오디센테리애를실험감염시킨결과, 백신접종하지않은대조군돼지에서의발병율은 50-70% 인데비해, 백신접종한돼지에서의발병율은 17-40% 이었다. Bhlp29.7 백신접종한돼지에서의질병발생율은대조군돼지에서의발생율보다유의하게낮기때문에 (P=0.047), Bhlp29.7은돼지이질백신성분으로서의잠재력이있는것으로명확해졌다 (La, T, Phillips, ND, Reichel, MP and Hampson, DJ (2004). Protection of pigs from swine dysentery by vaccination with recombinant BmpB, a 29.7 kda outermembrane lipoprotein of Brachyspira hyodysenteriae. Veterinary Microbiology 102:97-109). 재조합백신성분으로서사용할수있는브라키스피라하이오디센테리애유래외막단백질 (outer envelop protein) 을동정하기위한그외많은시도들이행해졌지만, 아직까지는성공적인백신은만들어지지않았다. 브라키스피라하이오디센테리애유래의잠재적으로유용한면역성의재조합단백질을동정하는데훨씬더막대한세계적인연구가필요하다. 지금까지, 백신접종에 DNA를이용하는연구는 1건만보고되어있다. 이연구에서, 페리틴으로추정되는단백질을코딩하는브라키스피라하이오디센테리애의 ftna 유전자를발리스틱백신접종용금비드코팅에사용하는 E. coli 플라스미드및플라스미드 DNA에클로닝하였다. 돼지이질에대한뮤라인모델을사용하여, DNA 및 / 또는재조합단백질을이용한백신접종의예방특성을확인하였다. 재조합단백질을이용한백신접종은페리틴에대해양호한전신반응을유도하였지만, DNA 백신접종은검출가능한수준의전신반응만유도하였다. DNA 백신을접종한후재조합단백질로부스트접종하면, 단백질로부스트접종한후에만페리틴에대한전신면역반응이유도되었다. 그러나, 테스트한백신접종요법들은모두마우스에브라키스피라하이오디센테리애군락화및관련병태에대한예방을제공할수없었다. 흥미롭게도, 마우스에 DNA로백신접종하면질병이현저하게악화된다 (Davis, A.J., Smith, S.C. and Moore, R.J. (2005). The Brachyspira hyodysenteriae ftna gene: DNA vaccination and real-time PCR quantification of bacteria in a mouse model of disease. Current Microbiology 50: ). 발명의내용 - 6 -

7 [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] 해결하려는과제본발명의과제는브라키스피라하이오디센테리애유래의신규유전자및상기유전자에의해코딩되는단백질을제공하는것이다. 본발명의다른과제는, 신규유전자및상기유전자에의해코딩되는단백질을치료및진단목적에사용하는것이다. 이에브라키스피라하이오디센테리애백신과브라키스피라하이오디센테리애감염진단에유전자및 / 또는단백질을사용할수있다. 본발명의과제는서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65에포함된뉴클레오티드서열을가진신규한브라키스피라하이오디센테리애유전자를제공하는것이다. 또한, 본발명의과제는서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65와동일한뉴클레오티드서열을제공하는것으로, 동일성 % 는 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상및 70% 이상 ( 및각각의정수는 100 내지 70) 일수있다. 또한, 본발명은서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65의뉴클레오티드서열및상기서열들과 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상및 70% 이상 ( 각정수는 100 내지 70) 동일한서열을포함하는, DNA 백신또는 DNA 면역조성물을포함한다. 또한, 본발명은서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65의뉴클레오티드서열및상기서열들과 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상및 70% 이상 ( 각정수는 100 내지 70) 동일한서열을가진, DNA를포함하는진단분석을포함한다. 또한, 본발명의과제는서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65의서열을가진 DNA를함유하는플라스미드 ; 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65의서열을가진 DNA를포함하는진핵및 / 또는원핵발현벡터 ; 및서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65의서열을가진 DNA를함유하는플라스미드를포함하는세포를제공하는것이다. 본발명의과제는서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함되는아미노산서열을가진신규한브라키스피라하이오디센테리애단백질을제공하는것이다. 본발명의다른과제는서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함된서열과 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상및 70% 이상의상동성 ( 각각의정수는 100 내지 70) 을보이는단백질을제공하는것이다. 본발명의다른과제는서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함된아미노산서열을가진단백질, 또는서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함된서열과 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상및 70% 이상상동한아미노산서열을가진단백질을포함하는백신또는면역조성물을제공하는것이다. 본발명의다른측면은서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함되거나, 또는서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함된서열과 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상및 70% 이상상동한서열을가진, 1종이상의단백질을포함하는진단키트를제공하는것이다. 본발명의다른측면은서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함되는아미노산서열을가진단백질을코딩하거나서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함되는서열과 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상및 70% 이상상동한 ( 각각의정수는 100 내지 70) 아미노산서열을코딩하는, 뉴클레오티드서열을제공한다. 또한, 본발명은서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함되는아미노산서열을가진단백질을코딩하거나서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함되는서열과 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이 - 7 -

8 상, 75% 이상및 70% 이상상동한 ( 각각의정수는 100 내지 70) 아미노산서열을코딩하는, DNA 를포함하는, 플 라스미드, 진핵및원핵발현벡터, 및 DNA 백신을망라한다. 이들플라스미드및발현벡터를포함하는세포 도본발명에포함된다. [0014] [0015] [0016] 본발명은서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함되는아미노산서열을가진단백질에결합하거나, 또는서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함되는서열과 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상및 70% 이상상동한 ( 각각의정수는 100 내지 70) 단백질에결합하는, 단클론항체를포함한다. 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함되는아미노산서열을가진단백질에결합하거나, 또는서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함되는서열과 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상및 70% 이상상동한 ( 각각의정수는 100 내지 70) 단백질에결합하는, 단클론항체를포함하는진단키트도본발명에포함된다. 상기진단키트는동물에서브라키스피라하이오디센테리애의존재를검출할수있다. 동물은바람직하게는임의의포유류및조류이며, 더바람직하게는닭, 거위, 오리, 칠면조, 잉꼬류 (parakeet), 개, 고양이, 햄스터, 저빌쥐, 토끼, 흰담비, 말, 소, 양, 돼지, 원숭이및인간이다. 또한, 본발명은 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65에열거된 1종이상의뉴클레오티드서열또는상기서열들과 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상및 70% 이상 ( 각정수는 100 내지 70) 동일한 1종이상의서열을포함하는 DNA 백신을동물에게투여함으로써동물에서브라키스피라하이오디센테리애감염을예방또는치료하는방법에관한것이다. 또한, 본발명은서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함되는서열또는상기서열과 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상및 70% 이상상동한 ( 각각의정수는 100 내지 70) 서열을가진 1종이상의단백질을포함하는백신을동물에게투여함에의한동물에서브라키스피라하이오디센테리애감염을예방또는치료하는방법을포함한다. 동물은바람직하게는임의의포유류및조류이며, 더바람직하게는닭, 거위, 오리, 칠면조, 잉꼬류 (parakeet), 개, 고양이, 햄스터, 저빌쥐, 토끼, 흰담비, 말, 소, 양, 돼지, 원숭이및인간이다. 또한, 본발명은 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65에열거된 1종이상의뉴클레오티드서열또는상기서열들과 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상및 70% 이상 ( 각정수는 100 내지 70) 동일한 1종이상의서열을포함하는면역조성물을동물에게투여함에의한, 동물에서면역반응을발생시키는방법에관한것이다. 또한, 본발명은서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 및 66에포함되는서열또는상기서열과 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상및 70% 이상상동한 ( 각각의정수는 100 내지 70) 서열을가진 1종이상의단백질을포함하는면역조성물을동물에게투여함에의한동물에서면역반응을발생시키는방법을포함한다. 동물은바람직하게는임의의포유류및조류이며, 더바람직하게는닭, 거위, 오리, 칠면조, 잉꼬류 (parakeet), 개, 고양이, 햄스터, 저빌쥐, 토끼, 흰담비, 말, 소, 양, 돼지, 원숭이및인간이다. [0017] [0018] [0019] [0020] 발명을실시하기위한구체적인내용본원에서사용되는관사 " 하나 (a, an)" 는관사의문법상의대상하나또는 2이상을의미한다. 예로 " 요소 " 는하나의요소또는하나이상의요소를의미한다. 용어 " 아미노산 " 은아미노관능성및산성관능성둘다를포함하며천연아미노산으로구성된폴리머에포함될수있는, 천연또는합성의모든분자를망라하는것으로의도된다. 아미노산의예로는천연아미노산 ; 이의유사체, 유도체및동족체 (congener); 다양한측쇄를가진아미노산유사체 ; 및전술한물질들중임의의것의모든입체이성질체를포함한다. 동물은임의의포유류또는조류일수있다. 포유류의예는개, 고양이, 햄스터, 저빌쥐, 토끼, 흰담비, 말, 소, 양, 돼지, 원숭이및인간이다. 조류의예는닭, 거위, 오리, 칠면조및잉꼬류이다. 용어 " 보존된잔기 " 는특정한공통된특성을가진아미노산군에속하는아미노산을의미한다. 용어 " 보존적 - 8 -

9 아미노산치환 " 은한군의아미노산을동일군의다른아미노산으로 ( 개념상또는달리 ) 치환하는것을의미한다. 2개의개별아미노산들간의공통된특성을정의하는기능적방법은동종유기체의대응단백질들간의정상적인아미노산변화빈도를분석하는것이다 (Schulz, G. E. and R. H. Schinner., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). 이러한분석에서, 아미노산의군들은군에속하는아미노산들을서로선호적으로교환하여전체단백질구조에대한영향이서로가장비슷한것으로정해질수있다 (Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). 이런방식으로정해진아미노산군의예는, (i) Lys, Arg 및 His를포함하는양으로하전된군, (ii) Glu 및 Asp를포함하는음으로하전된군, (iii) Phe, Tyr 및 Trp를포함하는방향족군, (iv) His 및 Trp을포함하는질소고리군, (v) Val, Leu 및 De을포함하는큰지방족무극성군, (vi) Met 및 Cys를포함하는약한극성군, (vii) Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, GIn 및 Pro를포함하는소형잔기군, (viii) Val, Leu, De, Met 및 Cys를포함하는지방족군, 및 (ix) Ser 및 Thr를포함하는작은, 하이드록시군을포함한다. [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] " 융합단백질 " 또는 " 융합폴리펩타이드 " 는용어가당해분야에공지되어있으며, 당해분야에공지된방법을이용하여구축할수있는키메라단백질을의미한다. 융합단백질에대한다수의예로서, 2가지의상이한폴리펩타이드서열이있으며, 어떤경우에는더많이있을수있다. 융합단백질을코딩하는폴리뉴클레오티드서열은융합단백질이정확하게번역될수있도록인프레임 (in frame) 으로작동가능하게연결될수있다. 융합단백질은동일한종또는상이한종유래의폴리펩타이드서열을포함할수있다. 다양한구현예에서, 융합폴리펩타이드는제1 폴리펩타이드에융합된하나이상의아미노산서열을포함할수있다. 2종이상의아미노산서열이제1 폴리펩타이드에융합된경우, 융합서열은동일서열의복수카피이거나또는상이한아미노산서열일수있다. 융합폴리펩타이드는제1 폴리펩타이드의 N-말단, C-말단또는 N-말단과 C-말단에융합될수있다. 융합단백질의예로는, 글루타티온 S-트랜스퍼라제텍 (GST-tag), 히스티딘텍 (His-tag), 면역글로불린도메인또는면역글로불린결합도메인을포함하는폴리펩타이드가있다. 용어 " 분리된폴리펩타이드 " 는특정구현예에서재조합 DNA 또는 RNA로부터제조되거나또는합성기원이나천연기원의폴리펩타이드, 또는이의일부조합을의미하며, 폴리펩타이드는 (1) 천연에서정상적으로발견되는단백질과조합되어있지않으며, (2) 정상적으로형성되는세포로부터분리되며, (3) 동일한세포소스의다른단백질이없으며, (4) 여러가지종으로부터세포에서발현되거나, 또는 (5) 천연에서생성되지않는것이다. 분리된폴리펩타이드는존재가능하지만정제된폴리펩타이드로서의자격을갖춘것은아니다. 용어 " 분리된핵산 " 및 " 분리된폴리뉴클레오티드 " 는게놈 DNA, cdna, mrna, trna, rrna, irna, 또는세포기관 ( 예, 미토콘드리아및엽록체 ) 으로부터수득되는폴리뉴클레오티드이거나또는합성기원의폴리뉴클레오티드로서, 이는 (1) " 분리된핵산 " 이천연에서발견되는세포와조합되어있지않거나, 또는 (2) 천연에서연결되어있지않은폴리뉴클레오티드와작동가능하게연결되어있다. 분리된폴리뉴클레오티드는존재가능하지만정제된폴리뉴클레오티드로서의자격을갖춘것은아니다. 용어 " 핵산 " 및 " 폴리뉴클레오티드 " 는리보뉴클레오티드또는데옥시리보뉴클레오티드등의뉴클레오티드의중합형태, 또는어느한가지타입의뉴클레오티드의변형된형태를의미한다. 또한, 이용어는등가체, 뉴클레오티드유사체로제조된 RNA 또는 DNA의유사체를포함하며, 구현예로서단일가닥 ( 예, 센스또는안티센스 ) 및이중가닥폴리뉴클레오티드를포함하는것으로이해되어야한다. 용어 " 본발명의핵산 " 및 " 본발명의폴리뉴클레오티드 " 는본발명의폴리펩타이드를코딩하는핵산을의미한다. 본발명의폴리뉴클레오티드는대상핵산서열 ; 대상핵산서열과적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 ( 각각의정수는 60 내지 100) 뉴클레오티드서열 ; 대상핵산서열과엄격조건에서혼성하는뉴클레오티드서열 ; 본발명의폴리펩타이드와기능적으로등가인폴리펩타이드를코딩하는뉴클레오티드서열 ; 대상아미노산서열과적어도약 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상의상동성또는동일성을가진폴리펩타이드를코딩하는뉴클레오티드서열 ( 각각의정수는 60 내지 100); 대상아미노산서열과적어도약 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는그이상의상동성또는동일성을가지면본발명의폴리펩타이드의활성을지닌폴리펩타이드를코딩하는뉴클레오티드서열 ( 각각의정수는 60 내지 100); 대상핵산서열의, 대립유전자변이체와같이, 1 내지약 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75 또는그이상의뉴클레오티드치환, 부가또는결손에의해차이가있는뉴클레오티드서열 ; 대산핵산서열로부터유래되며진화적으로관련있는핵산 ; 이들의상보체 ; 및본발명의전술한모든핵산과그외핵산에대해, 유전자코드축중 (degeneracy) 으로발생되는핵산서열을전체또는일부분만포함할수있다. 또한, 본발명의핵산은대상핵산서열의, 또한특정유기체 ( 예, 숙주세포 ) 에서의발현이코돈최적화된대상핵산서열의변이체의, 상동제, - 9 -

10 예컨대오르소로그 (ortholog) 및파라로그 (paralog) 를포함한다. [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] 2개의핵산영역들간의관련성을기술할때의용어 " 작동가능하게연결된 " 은, 상기영역이의도한방식으로기능하게하는관계로있는, 병렬분포를의미한다. 예로, 적절한분자 ( 예, 유발자및중합효소 ) 가조절서열이나조절서열 ( 들 ) 에결합되었을때와같이, 코딩서열에대해 " 작동가능하게연결된 " 조절서열은상기코딩서열의발현이조절서열과혼용가능한조건하에서달성되는방식으로결찰되어있다. 용어 " 폴리펩타이드 " 및용어 " 단백질 " 및 " 펩타이드 " 는본원에서상호호환적으로사용되며, 아미노산폴리머를의미한다. 폴리펩타이드의예로는, 유전자산물, 천연단백질, 상보체, 오르솔로그, 파라로그, 단편및전술한것의그외등가체, 변이체및유사체를포함한다. 용어 " 폴리펩타이드단편 " 또는 " 단편 " 은기준폴리펩타이드에대해사용되었을때, 기준폴리펩타이드자체와비교하여아미노산잔기가결손되어있으며, 나머지아미노산서열이기준폴리펩타이드내대응위치와일반적으로동일한폴리펩타이드를의미한다. 이러한결손은기준폴리펩타이드의아미노-말단이나카르복시-말단, 또는양쪽말단에서이루어질수있다. 단편은전형적으로 5개, 6개, 8개또는 10이이상의아미노산길이, 14 개이상의아미노산길이, 20, 30, 40 또는 50개이상의아미노산길이, 75개이상의아미노산길이또는 100, 150, 200, 300, 500 또는그이상의아미노산길이이다. 단편은기준폴리펩타이드의생리활성들중한가지이상의보유할수있다. 특정구현예에서, 단편은원하는생리활성을가진도메인을포함할수있으며, 선택적으로아미노산의수가 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는최대 100개이상의잔기일수있는추가적인아미노산을도메인의한쪽말단이나양말단에포함할수있다. 추가로, 단편은유래된영역의기능을지닌, 특이적인영역의서브-단편을포함할수있다. 다른구현예에서, 단편은면역성특성을가질수있다. 용어 " 본발명의폴리펩타이드 " 는대상아미노산서열또는이의등가체나단편을포함하는폴리펩타이드에관한것이다. 본발명의폴리펩타이드는대상아미노산서열 ; 1 내지약 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75개또는그이상의보존적인아미노산치환이있는대상아미노산서열 ; 대상아미노산서열과적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상상동한아미노산서열 ( 각각의정수는 60 내지 100); 및이들의기능적단편들전체또는일부를포함하는, 폴리펩타이드이다. 본발명의폴리펩타이드는또한대상아미노산서열의상동체, 예컨대오르소로그및파라로그를포함한다. 또한, 치료학적또는예방학적효과, 또는안정성 ( 예, 생체외수명, 생체내단백질분해성변성내성등 ) 을증강시키기위한목적으로본발명의폴리펩타이드의구조를변형시킬수있다. 상기변형된폴리펩타이드는, 단백질의천연형태의한가지이상의활성을지니도록설계되었을때, 본원에더욱상세하게기술된폴리펩타이드의 " 기능등가체 " 로간주된다. 이러한변형된폴리펩타이드는예컨대아미노산의치환, 결손또는부가에의해제조할수있으며, 치환은전체또는부분적으로는보존적인아미노산치환으로구성될수있다. 예컨대, 루신의이소루신또는발린으로, 아스파테이트의글루타메이트로, 트레오닌의세린으로의치환과같은, 분리된보존적인아미노산치환은, 생성되는분자의생리활성에중요한영향을미치지않을것으로예상하는것이합당하다. 폴리펩타이드의아미노산서열상의변화가기능상동체를만드는지는변형체폴리펩타이드가천연형단백질과유사한반응을발생시키는능력을분석함으로써쉽게결정할수있다. 치환이 2개이상이루어진폴리펩타이드는동일한방식으로쉽게테스트할수있다. 용어 " 정제된 " 은대상종이존재하는종들에서우세한것을의미한다 ( 즉. 조성물에서임의의다른개별종보다더다량인몰기준 ). " 정제분획 " 은대상종이존재하는모든종들에서약 50% 이상 ( 몰기준 ) 인조성물이다. 용액또는분산액중의종의순도를결정하는데있어, 종이용해또는분산되어있는용매또는매트릭스는일반적으로그러한결정에포함되지않으며 ; 대신용해또는분산된종 ( 대상물질포함 ) 만고려된다. 일반적으로, 정제조성물은한종을조성물에서모든존재종들중약 80% 이상, 약 85%, 90%, 95%, 99% 또는그이상으로포함할것이다. 대상종은조성물이반드시단일종으로구성된필수적인동질성 ( 오염종들은통상적인검출방법에의해서는조성물에서검출될수없음 ) 으로정제될수있다. 당업자는본원의방법에따라표준적인단백질정제기법을이용하여본발명의폴리펩타이드를정제할수있다. 폴리펩타이드의순도는예컨대아미노-말단아미노산서열분석, 겔전기영동, 질량-분광측정법및본원에기술된방법등의당해분야의당업자에게공지된다수의방법을결정할수있다. 용어 " 재조합단백질 " 또는 " 재조합폴리펩타이드 " 는재조합 DNA 기법에의해생산되는폴리펩타이드를의미한다. 이러한기법의예로는발현된단백질을코딩하는 DNA를적정발현벡터에삽입한다음숙주세포에형질전환하여 DNA에의해코딩되는단백질또는폴리펩타이드를생산하는경우가있다

11 [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] 용어 " 조절서열 " 은명세서전체에서개시신호, 인핸서, 레귤레이터및프로모터와같이, 이것이작동가능하게연결된코딩및비코딩서열의발현에작용하는데필수적이거나또는바람직한, 폴리뉴클레오티드서열을의미하는일반명사이다. 조절서열의예는 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990) 에기술되어있으며, 예로, 초기및후기 SV40 프로모터, 아데노바이러스또는사이토메갈로바이러스즉시초기프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T7 RNA 중합효소에의해발현이지시되는 T7 프로모터, 파지람다의주요오퍼레이터 (major operator) 및프로모터영역, fd 코트단백질에대한조절영역, 3-포스포글리세레이트키나제또는그외글리콜분해효소에대한프로모터, 산포스파타제 ( 예, Pho5) 의프로모터, 효모알파-메이팅인자의프로모터, 원핵또는진핵세포또는그바이러스의유전자발현을조절하는것으로알려져있는베큘로바이러스시스템및그외서열의폴리헤드론프로모터, 및이들의다양한조합이있다. 이러한조절서열의특성과용도는숙주유기체에따라다를수있다. 원핵에서, 이러한조절서열은일반적으로프로모터, 리보솜결합부및전사종결서열이다. 용어 " 조절서열 " 은이의존재가발현에영향을미칠수있는최소구성을포함하는것으로의도되며, 또한이의존재가유익한부가적인구성, 예컨대리더서열및융합파트너서열을포함할수있다. 특정구현예에서, 폴리뉴클레오티드서열의전사는발현이의도된세포유형에서폴리뉴클레오티드의발현을조절하는프로모터서열 ( 또는그외조절서열 ) 의통제하에있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는폴리뉴클레오티드의천연형태의발현을조절하는서열과동일하거나상이한조절서열의통제하에있을수있다. 용어 " 서열상동성 " 은 2종의아미노산서열간의염기매치율또는 2종의아미노산서열간의아미노산매치율이다. 서열상동성을퍼센트, 예컨대 50% 로표현하였을때, 퍼센트는어떤다른서열과비교되는원하는서열의전체서열길이에서매치되는비율을나타낸다. 갭 (2종의서열들중어느한쪽에 ) 은매칭을최대화시키는것으로, 일반적으로갭길이는 15 베이스이하이고, 보다빈번하게는 6 베이스이하이고, 가장빈번하게는 2 베이스이하이다. 용어 " 서열동일성 " 은비교창상에서동일한 ( 즉, 핵산의뉴클레오티드대뉴클레오티드베이스또는폴리펩타이드의아미노산대아미노산베이스 ) 것을의미한다. 용어 " 서열동일성 %" 는, 비교창에서 2종의최적으로정렬된서열을비교하는단계, 2종의서열에서아미노산또는뉴클레오티드가동일하여매칭되는위치의갯수를산출하는단계, 매칭되는위치의수를비교창내총위치수로나누는단계, 및결과에 100을곱하여서열동일성 % 를산출하여, 계산한다. 서열동일성을계산하는방법은당해분야의당업자에게공지되어있으며, 추가적인하기내용에기술되어있다. 본원에서, 본발명의폴리펩타이드또는그외단백질과관련하여, 용어 " 가용성 " 은세포배양에서발현시, 발현되는폴리펩타이드또는단백질의어떤일부분이상이세포의세포질부분에남아있으며세포용혈및용혈물의원심분리시세포잔해물로분획화되지않는것을의미한다. 폴리펩타이드의용해성은이종아미노산서열에융합, 아미노산잔기의결손, 아미노산치환 ( 예, 소수성측쇄를가진아미노산잔기를포함하는서열의농화 ) 및화학적변형 ( 예, 친수성기의부가 ) 등의, 당해분야에공지된다양한방법으로증가시킬수있다. 폴리펩타이드의용해성은, 응집상태를결정하기위한다이나믹광산란, UV 흡광, 비응집물질로부터응집물을분리하기위한원심분리및 SDS 겔전기영동 ( 예, 가용분획내단백질의양은가용분획과불용분획물을합한분획내단백질의양과비교함 ) 등의, 당해분야에공지된다양한기법으로측정할수있다. 본발명의폴리펩타이드는숙주세포에서발현되었을때, 적어도약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는그이상이가용성일수있으며, 예컨대세포에서발현되는단백질의총량의적어도약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는그이상이세포질분획에서발견된다. 특정구현예에서, 본발명의폴리펩타이드를발현하는세포배양물 1 L는가용성단백질을적어도약 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 mg을생산할것이다. 예시적인구현예에서, 본발명의폴리펩타이드는적어도약 10% 가가용성이며, 배양배양물 1 L로부터단백질을약 1 mg 이상으로생산할것이다. 용어 " 특이적으로혼성한다 " 는검출가능하며특이적인핵산결합을의미한다. 본발명의폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드및핵산은비특이적인핵산에대한검출가능한결합의인지가능한수준을최소화하는혼성화및세정단계하에서핵산가닥에선택적으로혼성한다. 엄격조건을이용하여당업계및본원에기술된선택적인혼성화조건을달성할수있다. 일반적으로, 본발명의폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드및본발명의핵산과관심핵산서열간의핵산서열동일성은적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는그이상 ( 각각의정수는 30 내지 100) 일것이다. 임의예에서, 혼성화및세정조건은통상적인혼성화과정및본원에추가적으로기술된엄격조건하에서이루어진다. 용어 " 엄격조건 " 또는 " 엄격혼성화조건 " 은이중가닥을형성하도록 2종의상보적인폴리뉴클레오티드가닥들간에특이적인혼성화를촉진시키는조건을의미한다. 엄격조건은피정의이온세기및 ph에서소정의폴리뉴

12 클레오티드이중나선에대한열용융점 (Tm) 보다약 5 낮도록선택될수있다. 상보적인폴리뉴클레오티드가닥의길이와이의 GC 함량은이중나선의 Tm을결정할것이므로, 혼성화조건은원하는혼성화특이성을수득하는데필수적이다. Tm은, 폴리뉴클레오티드서열의 50% 가완벽하게매칭되는상보가닥과혼성화하는온도 ( 피정의이온세기및 ph) 이다. 특정예에서, 특정이중나선의 Tm과거의동일하게혼성화조건의엄격성을증가시키는것이바람직할수있다. [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] Tm을추산하기위한다양한기법들을이용할수있다. 전형적으로, 이중나선에서의 G-C 염기쌍은 Tm에약 3 높이는것으로계산되지만, A-T 염기쌍은이론상최대약 까지약 2 높이는것으로계산된다. 그러나, 보다정교한 Tm 모델은, G-C 스텍킹 (stracking) 상호작용, 용매효과, 바람직한분석온도등을고려하여이용할수있다. 예컨대, 프로브는식 : Td = (((3 x #GC) + (2 x #AT)) x 37) - 562)/#bp) - 5을이용하여약 60 의해리온도 (Td) 를갖도록설계될수있으며, 상기식에서, #GC, #AT 및 #bp는각각이중나선형성에참여하는구아닌-사이토신염기쌍의수, 아데닌-티민염기쌍수및총염기쌍수이다. 혼성화는적어도약 1시간, 2시간, 5시간, 12시간또는 24시간동안 x SSC, 4x SSC, 3x SSC, 2x SSC, 1x SSC 또는 0.2x SSC에서수행될수있다. 혼성화온도는반응을엄격성을조절하기위해높일수있으며, 예로, 약 25 ( 실온 ) 에서약 45, 50, 55, 60 또는 65 로높일수있다. 또한, 혼성화반응은엄격성에영향을미치는다른물질을포함할수있으며, 50% 포름아미드의존재하에실시된혼성화는소정의온도에서혼성화엄격성을증가시킨다. 혼성화반응후, 염도및온도가동일하거나다를수있는, 세정단일단계또는 2 단계이상의세정단계가수반될수있다. 예로, 세정온도는약 25 ( 실온 ) 에서약 45, 50, 55, 60 또는 65 그이상으로엄격성을조절하기위해높일수있다. 세정단계는세제의존재하에, 예컨대 0.1 또는 0.2% SDS 존재하에수행할수있다. 예를들어, 혼성화다음에, 각각 65 에서 20분간 2x SSC, 0.1% SDS에서이루어지는 2번의세정단계를수행할수있으며, 선택적으로각각 65 에서 20분간 0.2x SSC, 0.1% SDS에서의 2번의추가적인세정단계를수행할도있다. 엄격혼성화조건의예로는, 50% 포름아미드, 10x 덴하트 (0.2% Ficoll, 0.2% 폴리비닐피롤리돈, 0.2% 소혈청알부민 ) 및 200 μg /ml 변성운반체 DNA, 예절단된연어정자 DNA(sheared salmon sperm DNA) 를포함하는용액중에서 65 에서밤새혼성화한다음, 각각 65 에서 20분간 2x SSC, 0.1% SDS에서의 2번의세정단계와각각 65 에서 20분간 0.2x SSC, 0.1% SDS에서의 2번의세정단계를수행하는것을포함한다. 혼성화는용액중에서 2종의핵산을혼성화하거나, 또는고체지지체, 예컨대필터에부착된핵산에용액중에서핵산을혼성화하는단계로이루어질수있다. 한종의핵산이고형지지체상에있으면, 혼성화하기전에예비-혼성화단계를수행할수도있다. 예비-혼성화는혼성화용액과동일한온도에서동일한용액중에서적어도약 1시간, 3시간또는 10시간동안 ( 상보적인폴리뉴클레오티드가닥없이 ) 수행할수있다. 적절한엄격조건은당해분야의당업자들에게공지되어있거나, 또는당업자가실험을통해결정할수도있다. 예로, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), ; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; S. Agrawal (ed.) Methods in Molecular Biology, volume 20; Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization With Nucleic Acid Probes, e.g., part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York; and Tibanyenda, N. et al., Eur. J. Biochem. 139:19 (1984) 및 Ebel, S. et al., Biochem. 31:12083 (1992) 을참조한다. 용어 " 벡터 " 는벡터에연결된다른핵산서열을이동시킬수있는핵산을의미한다. 본발명에따라사용할수있는벡터의한가지유형은에피솜, 즉염색체이외의 DNA 복제 (extra-chromosomal replication) 가능한핵산이다. 다른벡터로는, 벡터에연결된핵산의자율복제및발현을가능한것을포함한다. 작동가능하게연결된유전자의발현을지시할수있는벡터는본원에서 " 발현벡터 " 라고한다. 일반적으로, 재조합기법에유용한발현벡터는흔히벡터형태에서염색체에결합되지않는, 원형의이중가닥 DNA 분자를의미하는 " 플라스미드 " 형태이다. 그러나, 본발명은등가의기능을제공하며이후에당해분야에서알려지기시작한, 다른발현벡터형태를포함하는것으로의도된다. 본발명의핵산은, 본발명의핵산의발현수준결정과같이, 이들이특이적으로결합하는타겟 DNA 또는 RNA 서열의존재또는부재를검출하기위한진단시약으로서사용될수있다. 일측면에서, 본발명은샘플에서

13 본발명의핵산또는이의일부분의존재를검출하는방법에관한것으로, 상기방법은 (a) 8개이상의뉴클레오티드길이이며본발명의핵산의일부분에상보적인올리고뉴클레오티드를제공하는단계 ; (b) 상기올리고뉴클레오티드와본발명의핵산또는이의일부분과의혼성화를허용하는조건에서, 상기올리고뉴클레오티드를하나이상의핵산을포함하는샘플과접촉시키는단계 ; 및 (c) 샘플에서상기올리고뉴클레오티드와핵산의혼성화를검출하여, 샘플에서본발명의핵산또는이의일부분을검출하는단계를포함한다. 다른측면에서, 본발명은, (a) 각각이 8개이상의뉴클레오티드길이이며본발명의핵산서열과상보적인, 단일가닥의올리고뉴클레오티드한쌍을제공하는단계로서, 상기올리고뉴클레오티드가상보적인서열들은적어도 10개이상의뉴클레오티드길이로서로떨어져있는것을특징으로하는단계 ; (b) 상기올리고뉴클레오티드를하나이상의핵산을포함하는샘플과혼성화조건에서접촉시키는단계 ; (c) 2종의올리고뉴클레오티드프라이머사이의뉴클레오티드서열을증폭시키는단계 ; 및 (d) 증폭된서열의존재를검출하여, 샘플내본발명의핵산또는이의일부분의존재를검출하는단계에의한, 샘플내에본발명의핵산또는이의일부분의존재를검출하는방법에관한것이다. [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] 본발명의다른측면에서, 본발명의폴리뉴클레오티드는본발명의폴리펩타이드를코딩하며하나이상의조절서열에작동가능하게연결된뉴클레오티드서열을포함하는발현벡터에제공된다. 발현벡터의설계는형질전환시킬숙주세포및 / 또는발현시키길원하는단백질유형의선택과같은그러한인자에따라결정될수있음을이해하여야한다. 벡터의카피수, 카피수의조절능력및벡터에의해코딩되는항생제마커와같은임의의다른단백질의발현을고려하여야한다. 그런후, 본발명의폴리뉴클레오티드를포함하는발현벡터는브라키스피라하이오디센테리애에감염된동물을치료하기위한약학제제로서또는동물의브라키스피라하이오디센테리애감염을예방하거나또는동물이감염되기시작하였다면질병의증상이나진행을감퇴시키기위한백신 ( 또한약학제제 ) 으로서, 사용될수있다. 약학제제로서발현벡터를이용하는한가지방법은감염위험성이있는동물이나감염된후의동물에게핵산백신을투여하는것이다. 핵산백신기술은당해분야에잘기술되어있다. 일부설명들은미국특허 6,562,376 (Hooper et al.); 미국특허 5,589,466 (Felgner, et al.); 미국특허 6,673,776 (Felgner, et al.); 및미국특허 6,710,035 (Felgner, et al.) 에서찾아볼수있다. 핵산백신은근육이나진피내에주사하거나, 지질조성물 ( 미국특허 5,703,055, Felgner, et al) 이나당해분야에공지된다른메카니즘을통해동물에게전기천공할수있다 (WO 01/23537, King et al.; 및 WO 01/68889, Malone et al.) 또한, 발현벡터는발현벡터상에포함된본발명의뉴클레오티드에의해코딩되는단백질에대한면역반응을유도하기위해타겟동물에게투여할수있는벡터로형질전환시킬수있다. 발현벡터는본발명의뉴클레오티드가숙주동물에서전사및번역되도록원색발현서열을포함할수있다. 다른예로, 발현벡터는박테리애에서전사된후숙주동물에서번역될수있다. 발현벡터의운반체로서사용되는박테리애는약독화되어야하지만, 여전히침투성이있어야한다. 약독화되어있지만여전히침투성을지닌, 단지몇가지시겔라 spp. 살모넬라 spp., 에스케리치아 spp., 및에로모나스 spp. 을사용할수있다. 이러한방법에대한예들은미국특허 5,824,538 (Branstrom et al); 미국특허 5,877,159 (Powell, et al.); 미국특허 6,150,170 (Powell, et al.); 미국특허 6,500,419 (Hone, et al.); 및미국특허 6,682,729 (Powell, et al.) 에서확인할수있다. 다른예로, 본발명의폴리뉴클레오티드는벡터에서작용하는특정바이러스내에위치될수있다. 바이러스벡터는본발명의단백질을바이러스의표면상에발현하거나, 또는폴리뉴클레오티드가전사되어단백질로번역되는동물세포로본발명의폴리뉴클레오티드를운반할수있다. 바이러스벡터에감염된동물은본발명의폴리뉴클레오티드에의해코딩되는단백질에대한면역반응을발생시킬수있다. 그로인해, 바이러스벡터를수용한동물에서는브라키스피라하이오디센테리애감염을완화시키거나또는예방할수있다. 바이러스벡터의예들은미국특허 5,283,191 (Morgan et al.); 미국특허 5,554,525 (Sondermeijer et al) 및미국특허 5,712,118 (Murphy) 에서확인할수있다. 본발명의폴리뉴클레오티드는, 예컨대융합단백질또는폴리펩타이드등의단백질이나폴리펩타이드를생산하기위해, 배양으로증식된세포에서본발명의폴리펩타이드의발현및과다-발현을유도하는데사용할수도있다. 본발명은본발명의폴리펩타이드를발현하기위해재조합유전자로형질감염된숙주세포를포함한다. 숙주세포는임의의원핵또는진핵세포일수있다. 예컨대, 본발명의폴리펩타이드는 E. coli와같은박테리애세포, 곤충세포 ( 베큘로바이러스 ), 효모, 식물또는포유류세포에서발현될수있다. 숙주세포가인간인경우에살아있는개체이거나아닐수있다. 다른적합한숙주세포들은당해분야의당업자들에게공지되어

14 있다. 추가적으로, 숙주세포에폴리펩타이드의발현을최적화하기위해숙주에서전형적으로발견되지않는 trna 분자가보충될수있다. 다른예로, 뉴클레오티드서열은숙주세포에서의발현을최적화하기위해변형될수있지만, 생산되는단백질은본래코딩된단백질과높은상동성을가져야한다. 폴리펩타이드의발현을최대화하는데적합한방법들은당해분야의당업자들에게잘알려져있을것이다. [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] 또한, 본발명은본발명의폴리펩타이드를제조하는방법을포함한다. 예컨대, 본발명의폴리펩타이드를코딩하는발현벡터로형질감염된숙주세포는상기폴리펩타이드의발현이이루어질수있는적절한조건하에서배양될수있다. 상기폴리펩타이드는분비되어, 세포와폴리펩타이드를포함하는세포배지의혼합물로부터분리할수있다. 다른예로, 폴리펩타이드는세포질에체류할수있으며, 세포를회수하고, 세포용혈시켜단백질을분리할수있다. 세포배양물은숙주세포, 배지및그외부산물을포함한다. 세포배양에적합한배지는당해분야에잘알려져있다. 폴리펩타이드는이온교환크로마토그래피, 한외여과, 전기천공및본발명의폴리펩타이드의특정에피토프에특이적인항체를이용한면역친화성정제등의단백질정제에대한당해분야에공지된기법들을이용하여세포배양배지, 숙주세포또는이들모두에서분리할수있다. 따라서, 본발명의폴리펩타이드의전체또는선택부분을코딩하는뉴클레오티드서열을이용하여미생물또는원핵세포과정을통해단백질의재조합형태를제조할수있다. 서열을발현벡터와같은폴리뉴클레오티드구조체로연결시키고, 이를숙주, 진핵 ( 효모, 조류, 곤충또는포유류 ) 또는원핵 ( 박테리애세포 ) 에형질전환또는형질감염시키는것은표준적인방법이다. 미생물수단또는조직-배양기법에의해본발명의재조합폴리펩타이드를제조하는데있어, 이와유사한방법이나변형된방법을사용할수있다. 본발명의폴리펩타이드의발현에적합한벡터는다음과같은타입의플라스미드를포함한다 : E. coli와같은원색세포발횬용 ptrchis-유래플라스미드, pet-유래플라스미드, pbr322-유래플라스미드, pembl-유래플라스미드, pex-유래플라스미드, pbtac-유래플라스미드및 puc-유래플라스미드. 숙주유기체의플라스미드제조및형질전환에사용되는다양한방법들은당해분야에잘알려져있다. 원핵및진핵세포둘다에대한그외적합한발현시스템뿐만아니라일반적인재조합공정에대해서는 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Chapters 16 and 17을참조한다. 대상폴리펩타이드의코딩서열은여러가지폴리펩타이드를코딩하는뉴클레오티드서열을포함하는융합유전자의일부분으로서병합될수있다. 본발명은본발명의핵산과이종의폴리펩타이드를포함하는융합단백질을코딩하기위해본발명의핵산의뉴클레오티드서열에인프레임으로연결된이종의펩타이드를코딩하는 1 종이상의이종서열을포함하는, 분리된폴리뉴클레오티드를포함한다. 상기이종의폴리펩타이드는 (a) 본발명의폴리펩타이드의 C-말단, (b) 본발명의폴리펩타이드의 N-말단, 또는 (c) 본발명의폴리펩타이드의 C- 말단과 N-말단에융합될수있다. 특정예에서, 이종서열은융합된폴리펩타이드의검출, 분리, 가용화및 / 또는안정화를허용하는폴리펩타이드를코딩한다. 또다른구현예에서, 이종서열은폴리 His 텍, myc, HA, GST, 단백질 A, 단백질 G, 칼모듈린-결합펩타이드, 티오레독신, 말토스-결합성단백질, 폴리아르기닌, 폴리 His- Asp, FLAG, 면역글로불린단백질의일부분및트랜스사이토시스펩타이드와같은폴리펩타이드를코딩한다. 융합발현시스템은본발명의폴리펩타이드의면역성단편제조에바람직할때유용할수있다. 예로, 로타바이러스의 VP8 캡시드단백질은단량체형태나바이러스입자의형태로폴리펩타이드의일부분에대한면역성운반체단백질로서사용할수있다. 항체를발생시키는본발명의폴리펩타이드의일부분에해당되는핵산서열은, 비리온의일부분으로서단백질의일부분을포함하는융합단백질을발현하는재조합바이러스의세트를생산하기위해, 후기백시니아바이러스구조단백질의코딩서열을포함하는융합유전자구조체에병합될수있다. B형간염바이러스의표면항원역시이러한역할로이용할수있다. 마찬가지로, 본발명의폴리펩타이드의일부와폴리오바이러스의캡시드단백질을포함하는융합단백질을코딩하는키메라구조체를만들어면역성을증강시킬수있다 ( 예, EP Publication NO: ; and Evans et al., (1989) Nature 339:385; Huang et al., (1988) J. Virol. 62:3855; and Schlienger et al., (1992) J. Virol. 66:2). 융합단백질은단백질의발현및 / 또는정제를용이하게할수있다. 예로, 본발명의폴리펩타이드는글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 융합단백질로서제조될수있다. 이러한 GST 융합단백질은글루타티온-유도체화된매트릭스를통한방법과같이, 본발명의폴리펩타이드의정제를간단하게하기위해사용할수있다 ( 예, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)). 다른구현예에서, 재조합단백질의바람직한일부분의 N-말단에폴리-(His)/ 엔테로키나제절단부위와같은정제리더서열을코딩하는융합유전자는, i 2+ 금속레진을이용한친화성크로마토그래피에의해발현되는융합단백

15 질을정제할수있게한다. 그런후, 리더서열은엔테로키나제처리에의해제거하여, 정제된단백질을제공 한다 ( 예, Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411: 177; and Janknecht et al., PNAS USA 88:8972). [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] 융합유전자의제조기법은잘알려져있다. 본질적으로, 여러가지폴리펩타이드서열을코딩하는다양한 DNA 단편들의연결은블런트-말단연결또는스테거말단연결, 적절한말단을제공하기위한제한효소절단, 코헤시브말단의적절한충진, 부적절한연결을방지하기위한알카리포스파타제처리, 및효소적연결을이용하여, 통상적인기법에따라수행한다. 다른구현예에서, 융합유전자는자동 DNA 합성기등의통상적인기법에의해합성할수있다. 다른예로, 유전자단편의 PCR 증폭을이후에어닐링되어키메라유전자서열을제조할수있는 2가지의병행유전자들간에상보적인오버행잉을만드는앵커프라이머를이용하여수행할수있다 ( 예, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et ai., John Wiley & Sons: 1992). 다른구현예에서, 본발명은플레이트, 마이크로타이터플레이트, 슬라이드, 비드, 파티클, 구, 필름, 가닥, 침전물, 겔, 시트, 관류, 컨테이너, 캐필러리, 패드, 슬라이드등의고형표면상에고정화된본발명의핵산을제공한다. 본발명의핵산은칩에어레이의일부로서고정화될수있다. 어레이는본원에기술된본발명의하나이상의폴리뉴클레오티드를포함할수있다. 일구현예에서, 칩은폴리뉴클레오티드 ( 들 ) 와같은일부병원성종으로부터유래된폴리뉴클레오티드서열의어레이일부분으로서본발명의하나이상의폴리뉴클레오티드를포함한다. 본발명의바람직한예로서, 본원에기술된분리된브라키스피라하이오디센테리애폴리펩타이드와이들폴리펩타이드를코딩하는폴리뉴클레오티드서열을제공한다. 보다바람직하게는, 브라키스피라하이오디센테리애폴리펩타이드는실질적으로정제된형태로제공된다. 본발명의바람직한폴리펩타이드는천연의전장폴리펩타이드의한가지이상의생물학적특징 ( 예, 생체내, 시험관내또는면역특성 ) 을가질것이다. 또한, 무기능성폴리펩타이드도예컨대기능성폴리펩타이드의길항제로서사용될수있기때문에본발명의범위에포함된다. 천연형태에상대적인유사체, 단편또는유도체의생물학적특성은예컨대생물분석에의해결정할수있다. 유사체, 단편및유도체등의폴리펩타이드는합성에의해제조할수있다 ( 예, 잘알려져있는고상또는액상펩타이드합성기법이용 ). 바람직하게는, 고상합성기법을사용한다. 다른예로, 본발명의폴리펩타이드는전술한공지된유전자조작기법을이용하여제조할수있다. 또다른구현예에서, 폴리펩타이드는비제한적으로돼지, 닭, 거위, 오리, 칠면조, 잉꼬류, 인간, 원숭이, 개, 고양이, 말, 햄스터, 저빌쥐, 토끼, 흰담비, 말, 소, 및양등의동물의혈장, 배설물, 혈청또는뇨등과같은비제한적인체액으로부터정제 ( 예, 면역친화성정제에의해 ) 할수있다. 브라키스피라하이오디센테리애폴리펩타이드유사체는, 하나이상의아미노산이분자의생물학적활성에는실질적으로변화를주지않는다른아미노산으로치환된, 아미노산서열을가진폴리펩타이드를포함한다. 본발명에서, 재조합또는화학합성에의해제조된본발명의폴리펩타이드및그것의단편, 다른유도체또는유사체는, 융합단백질을포함하여, 폴리펩타이드를인지하는항체를제조하기위한면역원으로서사용할수있다. 분자가면역글로불린 ( 항체 ) 또는 T 세포항원수용체와같은면역계의항원인지분자와특이적으로사용할수있을때, 분자는 " 항원성 " 이다. 항원성아미노산서열은적어도약 5개이상의, 바람직하게는약 10개이상의아미노산서열을포함한다. 분자의항원성부분은항체나 T 세포수용체인지에있어면역우세한부분일수있거나, 또는면역화를위한운반체분자에항원성부분을접합함으로써분자에대한항체를만드는데이용할수있는부분일수있다. 항원성인분자자체가면역원성일필요는없으며, 즉운반체없이면역반응을도출할수없다. " 항체 " 는특이적인에피토프에결합하는, 항체및그것의단편등의임의의면역글로불린이다. 이용어는다클론, 단일클론및키메라항체뿐만아니라 Fab, F(ab') 2 및 F(v) ( 단쇄항체포함 ) 등의항체의항원결합부를 포함하며, 키메라항체는미국특허 4,816,397 및 4,816,567에추가적으로기술되어있다. 따라서, 본원에서다양한문법형태에서의 " 항체분자 " 라는표현은온전한면역글루불린분자와항원조합부를포함하는면역글루불린분자의면역활성부분둘다를포함한다. " 항체조합부 " 는항원에특이적으로결합하는경쇄및중쇄의가변부및초가변부로구성된항체분자의구조부분이다. [0070] 항체분자는예는온전한면역글로불린분자, 실질적으로온전한면역글로불린분자, 및 Fab, Fab', F(ab') 2 및

16 F(v) 로서당해분야에공지된부분등의, 파라토프를포함하는면역글로불린분자의일부분이며, 상기부분들은 본원의치료방법에사용하기바람직하다. [0071] 항체의 Fab 및 F(ab') 2 부분은잘알려져있는방법에의해실질적으로온전한항체분자에대한각각의파파인 및펩신의단백질분해반응을통해제조된다. 예로, Theofilopolous 등의미국특허 4,342,566을참조한다. Fab' 항체부분역시잘알려져있는데, 2곳의중쇄부분을연결하는이황화결합을머캅토에탄올로환원시킨후, 요오도아세트아미드와같은시약으로제조되는단백질머캅탄을알킬화함으로써 F(ab') 2 부분으로부터제조한다. 온전한항체분자를포함하는항체가본원에서바람직하다. [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] 다양한문법적형태로서의 " 단일클론항체 " 라는표현은특정항원과면역반응할수있는항체조합부를한종류만가지고있는항체를의미한다. 즉, 단일클론항체는전형적으로이와면역반응하는임의의항원에대한단일의결합친화성을나타낸다. 단일클론항체는따라서각각이상이한항원에대한면역특이적인항체조합부를여러개가지고있는항체분자를포함할수있으며, 예로 2중특이적인 ( 키메라 ) 단일클론항체가있다. 용어 " 보강제 " 는항원에대한면역반응을증강시키는화합물또는혼합물을의미한다. 보강제는항원을서서히방출시키는조직저장소로서제공할수있으며, 또한면역반응을비특이적으로증강시키는림프계활성자로서도제공할수있다 [Hood et al., in Immunology, p. 384, Second Ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, California (1984)]. 종종, 보강제없이항원만을이용한 1차시험감염은체액성또는세포성면역반응을도출하는데실패할것이다. 보강제로는, 완전프레운드보강제, 불완전프레운드보강제, 사포닌, 알루미늄하이드록사이드와같은미네랄겔, 라이소렉시틴, 플루로닉폴리올, 폴리음이온, 오일또는하이드로카본에멀젼과같은계면활성제, 키홀임펫트헤모시아닌, 디니트로페놀및 BCG(bacille Calmette-Guerin) 코리네박테리움파르붐과같이잠재적으로유용한인간보강제가있으나, 이들로한정되는것은아니다. 바람직하게는, 보강제는약학적으로허용가능하다. 본발명의폴리펩타이드에대한다클론항체를제조하기위해당해분야에공지된다양한방법들을이용할수있다. 항체의제조에있어, 토끼, 마우스, 랫, 양, 염소등의비제한적인다양한숙주동물에게본발명의폴리펩타이드를주사하여면역화할수있다. 일구현예에서, 본발명의폴리펩타이드는면역성운반체, 예컨대소혈청알부민 (BSA) 또는키홀림펫트헤모시아닌 (KLH) 에접합할수있다. 프레운드 ( 완전및불완전 ), 알루미늄하이드록사이드와같은미네랄겔, 라이소렉시틴과같은계면활성제, 플루로닉폴리올, 폴리음이온, 펩타이드오일에멀젼, 키홀림펫트헤모시아닌, 디니트로페놀및 BCG(bacille Calmette-Guerin) 및코리네박테리움파르붐과같이잠재적으로유용한인간보강제등의비제한적으로다양한보강제를사용하여, 면역반응을증가시킬수있다. 본발명의폴리펩타이드에대한단일항체의제조를위해, 배양에서연속세포주에의해항체분자를생산하게하는임의의기법을사용할수있다. 이러한방법으로는 Kohler et al., (1975) Nature, 256: 에의해처음으로개발된하이ㅡ리도마기법, 트리오마기법, 인간 B-세포하이브리도마기법 [Kozbor et al., (1983) Immunology Today, 4:72], 및인간단일클론항체를생산하기위한 EBV-하이브리도마기법 [Cole et al., (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp , Alan R. Liss, Inc.] 이있으나, 이들로한정되는것은아니다. B 림프구에발암성 DNA의직접형질전환또는엡스타인-바르바이러스를이용한형질감염과같은, 융합이외의다른기법에의해, 불멸의항체-생산세포주를만들수있다. 예로, 미국특허 Nos. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; 및 4,493,890을참조한다. 본발명의다른구현예에서, 단일클론항체는최근기법을이용하여무균동물 (germ-free animal) 에서생산할수있다. 본발명에서, 닭이나돼지항체를사용할수있으며, B 세포를 EBV 바이러스로시험관내에서형질전환시키거나또는닭이나돼지하이브리도마를이용하여수득할수있다. 실제, 본발명에서, 본발명의폴리펩타이드에특이적인마우스항체분자의유전자를적절한생물활성의항체분자의유전자와스플라이싱함으로써 " 키메라항체 " 를제조하기위해개발된기법 [Morrison et al., (1984) J. Bacteriol., ; Neuberger et al., (1984) Nature, 312: ; Takeda et al., (1985) Nature, 314: ] 을사용할수있으며, 그러한항체들은본발명의범위에포함된다. 이러한키메라항체는면역반응특히알레르기반응을유도하는데이종의항체보다는훨씬낮을수있기때문에, 장질환또응장애의치료에사용하는것이바람직하다 ( 전술되어있음 ). 본발명에서, 단쇄항체의제조에대한기법 ( 미국특허 4,946,778) 을본발명의폴리펩타이드에특이적인단쇄

17 항체제조에적용시킬수있다. 본발명의다른구현예는, 본발명의폴리펩타이드에바람직한특이성을가진 단일클론 Fab 단편의신속하고용이한동정을가능하게하기위해, Fab 발현라이브러리의구축에대한기법 [Huse et al., (1989) Science, 246: ] 을이용한다. [0078] 항체분자의이디오타입을포함하는항체단편은공지된기법으로제조할수있다. 예로, 상기단편은항체분 자를펩신전달하여제조할수있는 F(ab') 2 단편 ; F(ab') 2 단편의이황화결합을환원시켜제조할수있는 Fab' 단편 ; 및파파인과환원제를항체분자에처리하여제조할수있는 Fab 단편을포함하나, 이들로한정되는것은 아니다. [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] 항체의제조시, 원하는항체의스크리닝은당해분야에공지된기법, 예컨대방사면역분석, ELISA, " 샌드위치 " 면역분석, 면역방삭측정분석, 겔확산침전반응 (gel diffusion precipitin reaction), 면역확산분석, 인시츄면역분석 ( 예로, 콜로이달골드, 효소또는방사동위원소표지물이용 ), 웨스턴블롯, 침강반응, 어글루틴화분석 ( 예, 겔어굴루틴화분석, 헴어글루틴화분석 ), 보체고정분석, 면역형광분석, 단백질 A 분석, 면역전기영동분석등에의해수행될수있다. 일구현예에서, 항체결합은 1차항체상에표지를검출하여검출한다. 다른구현예에서, 1차항체는 1차항체에대한 2차항체또는시약의결합을검출함으로써검출한다. 다른구현예에서, 2차항체는표지된다. 면역분석에서결합을검출하기위한수많은방법들이당해분야에공지되어있으며, 이들모두본발명의범위에포함된다. 예로, 본발명의폴리펩타이드의특이적인에피토프를인지하는항체를선별하기위해, 그러한에피토프를포함하는본발명의폴리펩타이드의단편에결합하는산물에대한하이브리도마를제조하는분석방법이있을수있다. 또한, 본발명은본발명의폴리펩타이드및 / 또는본발명의폴리펩타이드에결합하는항체를이용하여브라키스피라하이오디센테리애의존재를검출하는진단및예측방법과브라키스피라하이오디센테리애감염의진단및예측용키트를포함한다. 진단및예측방법은닭또는돼지와같은동물로부터수득한생물샘플을이용하여일반적으로수행할것이다. " 샘플 " 은브라아와같은브라키스피아종이나그것의폴리뉴클레오티드또는폴리펩타이드를함유하고있을것으로예상되는동물의조직또는체액을의미한다. 상기조직또는체액의예로는, 혈장, 혈청, 배설물, 뇨, 폐, 심장, 골격근, 위, 장및시험관내동물배양성분들이있으나, 이들로한정되는것은아니다. 본발명은하기단계를포함하는, 샘플에서본발명의폴리펩타이드의존재를검출하는방법을제공한다 : (a) 항체와본발명의폴리펩타이드를포함하는반응복합체의형성을허용하는조건하에서, 본발명의폴리펩타이드에특이적으로결합하는항체 ( 바람직하게는고형지지체에결합됨 ) 를본발명의폴리펩타이드가함유된것으로예상되는샘플과접축시키는단계 ; 및 (b) 샘플내본발명의폴리펩타이드와항체를포함하는반응복합체의형성을검출하는단계로서, 반응복합체의형성이검출되는것은샘플내에본발명의폴리펩타이드가존재함을의미하는것인단계. 바람직하게는, 본방법에사용되는항체는친화성-정제된다클론항체로부터유래되며, 더욱바람직하게는단일클론항체로부터유래된다. 또한, 본원에사용되는항체는 Fab, Fab', F(ab') 2 또는 F(v) 영역또는전체항체 분자형태인것이바람직하다. [0084] [0085] 전술한방법을기초로브라키스피라하이오디센테리애를검출하기위한특히바람직한방법은, 효소연계면역흡착분석, 방사면역분석, 면역방사측정분석및단일클론및 / 또는다클론항체를이용한샌드위치분석등의면역효소학적분석이있다. 특히유용한 3가지방법은, 검출가능한표지물질로표지된본발명의폴리펩타이드 ( 또는그것의단편 ), 검출가능한표지물질로표지된항체 Ab 1, 또는검출가능한표지물질로표지된항체 Ab 2 를이용한다. 이러한방법은하 기계산식으로총괄되며, 식에서 * 은입자가표지되었음을의미하며, "AA" 는본발명의폴리펩타이드를나타낸 다 : [0086] [0087] [0088] [0089] A. AA* + Ab 1 = AA*Ab 1 B. AA + Ab* 1 = AA Ab 1 * C. AA + Ab 1 + Ab 2 * = Ab 1 AA Ab 2 * 방법과적용은당해분야의당업자들에게모두친숙하며, 즉본발명의범위내에서활용할수있다. " 경쟁적 "

18 방법, 방법 A 는미국특허 3,654,090 및 3,850,752 에기술되어있다. 방법 B 는잘알려져있는경쟁적인분석 기법의예이다. 방법 C 인 " 샌드위치 " 방법은미국특허 RE 31,006 및 4,016,043 에기술되었다. 또다른방법으 로 " 더블항체 " 또는 "DASP" 방법등이알려져있으며, 이용할수있다. [0090] [0091] 각경우에, 본발명의폴리펩타이드는하나이상의항체 ( 들 ) 또는결합파트너와복합체를형성하며, 복합체의한구성물질은검출가능한표지물질로표지된다. 복합체가형성되면, 필요에따라그양은표지물질의검출에이용가능한공지방법에의해결정할수있다. Ab 2 의특징적인특성이 Ab 1 와반응할것이라는것임을전술한바로부터알수있을것이다. 이러한반응은, 어 떤포유류종에서생기는 Ab 1 이다른종에서항체 Ab 2 를생성시키는항원으로서이용될수있기때문이다. 예컨대, Ab 2 는항운으로서토끼항체를이용하여염소에서생성시킬수있다. 따라서, Ab 2 는염소에서생성된항-토끼항체일것이다. 본명세서와청구항에있어, Ab 1 은 1차항체로서언급될것이며, Ab 2 는 2차또는항-Ab 1 항체로서언급될것이다. [0092] 이러한연구들에서가장일반적으로사용되는표지물질은방사성요소, 효소, 자외선에노출되었을때형광을 발현하는화합물등이다. 표지물질로서이용할수있는형광물질의예로는플루오레세인, 로다민및아우라민 이있다. 특정한검출물질은염소에서제조되며이소티오시아네이트를통해플루오레세인과접합된, 항 - 토끼 항체이다. 바람직한동위원소의예로는 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131 I, 및 186 Re 이있다. 방사능표지물질은현재이용가능한임의의카운팅방법에의해검출할수있다. 다수의효소를이용할수있지만, 바람직한효소의예로는, 페록시다제, β-글루쿠로니다제, β-d-글루코시다제, β-d-갈락토시다제, 유레아제, 글루코스옥시다제 + 페록시다제및알카리포스파타제가있다. 효소는카르보디이미드, 디이소시아네이트, 글루타르알데하이드등의브릿지형성분자와의반응에의해선택입자와접합된다. 효소표지물질은현재이용되는임의의비색법, 분광광도측정, 형광분광광도측정, 전류측정또는가스측정기법에의해검출할수있다. 미국특허 3,654,090; 3,850,752; 및 4,016,043에는다른표지물질과방법에대한내용이예로언급되어있다. [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] 또한, 본발명은하기단계를이용하여생물샘플내본발명의폴리펩타이드에대한항체를검출하는방법을제공한다 : (a) 본발명의폴리펩타이드또는그것의단편을제공하는단계 ; (b) 생물샘플을본발명의상기폴리펩타이드와항체-항원복합체형성이가능한조건하에인큐베이션하는단계 ; 및 (c) 본발명의폴리펩타이드와의항체-항원복합체가형성되었는지를결정하는단계. 본발명의다른구현예는, 하기단계를포함하는생물샘플내에서본발명의폴리펩타이드에대한항체의수준을평가하는시험관내방법을제공한다 : (a) 전술한방법에따라생물샘풀내에서반응복합체의형성을검출하는단계 ; 및 (b) 반응복합체의양이생물샘플내에서의본발명의폴리펩타이드의수준에해당되는, 형성되는반응복합체의양을평가하는단계를포함한다. 추가로, 치료학적치료를받고있는동물숙주로부터여러가지시간대에수득한일련의생물샘플내에서본발명의폴리펩타이드에대한항체의수준을전술한바와같이평가함으로써, 동물숙주에서브라키스피라하이오디센테리애와관련있는질병의치료학적치료를모니터링하는시험관내방법을제공한다. 본발명은추가로 (a) 생물샘플을본발명의폴리뉴클레오티드프로브나폴리뉴클레오티드의프라이머와적절한혼성화조건하에접촉시키는단계 ; 및 (b) 샘플내에서프로브또는프라이머와핵산사이의형성되는임의의이중가닥을검출하는단계에의한, 생물샘플내에서브라키스피라하이오디센테리애의존재또는부재를검출하는방법을제공한다. 본발명의일구현예에서, 브라키스피라하이오디센테리애의검출은공지기법을이용하여생물샘플로부터폴리뉴클레오티드서열을직접증폭시킨후본발명의폴리뉴클레오티드서열의존재를검출함으로써달성될수있다. 본발명의일형태에있어서, 타겟핵산서열은 PCR로증폭시킨다음전술한임의의특이적인방법으로검출한다. 폴리뉴클레오티드서열의존재를검출하는데유용한그외진단기법들로는, 1) 대립유전자-특이적인 PCR; 2) 단일가닥구조분석 ; 3) 농도구배의변성겔전기영동 ; 4) RNase 보호분석 ; 5) E. coli muts 단백질과같은뉴클레오티드미스매치를인지하는단백질의사용 ; 6) 대립유전자-특이적인올리고뉴클레오티드 ; 및 7) 형광인시츄혼성화가있으나, 이들로한정되는것은아니다

19 [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] 전술한방법들외에도, 폴리뉴클레오티드서열은통상적인프로브기법을이용하여검출할수있다. 원하는폴리뉴클레오티드서열의존재를검출하기위해프로브를이용하는경우, 혈액또는혈청과같은분석할생물샘플을필요에다라처리하여, 핵산을추출할수있다. 샘플의폴리뉴클레오티드서열은다양한방법으로준지하여타겟서열의검출을쉽게할수있으며, 그예로는변성, 제한효소절단, 전기영동또는돗블롯팅이있다. 샘플폴리뉴클레오티드서열의타겟영역은일반적으로프로브의타겟팅서열과하이브리드를형성하기위한일정부분이상의단일가닥이어야한다. 서열이천연단일가닥인경우, 변성은필요하지않을것이다. 그러나, 서열이이중가닥인경우, 서열은변성시킬필요가있을수있을것이다. 변성은당해분야에공지된다양한기법에의해달성될수있다. 샘플의폴리뉴클레오티드서열과프로브는프로브내타겟서열과샘플의원하는것으로추정되는폴리뉴클레오티드서열의안정적인하이브리드형성을촉진시키는조건하에서인큐베이션한다. 가급적, 위양성을방지하기위해고엄격조건을사용한다. 형성되는하이브리가있다면이의검출은표지된프로브를사용하여일반적으로수행된다. 다른예로, 프로브는표지하지않을수있으며, 직접또는간접적으로표시된리간드와의특이적인결합을통해검출할수있다. 적합한표지물질과프로므와리간드를표지하는방법은당해분야에알려져있으며, 그예로는공지의방법 ( 닉번역 (nick translation), 랜덤프라이밍 (random priming) 또는키나징 (kinasing)) 으로병합할수있는방사능표지물질. 바이오틴, 형광성그룹, 화학발광그룹 ( 예, 디옥세탄, 특히촉발된디옥세탄 (triggered dioxetane)), 효소, 항체등이있다. 이러한기본적인방법에대한변형방법은당해분야에공지되어있으며, 외부물질로부터검출시킬하이브리드의분리를용이하게하며및 / 또는표지된모이어티로부터신호를증폭시키는변형법을포함한다. 또한, 본발명의핵산프로브분석은본발명의원하는폴리뉴클레오티드서열을검출할수있는핵산프로브칵테일을이용할수있으며, 이역시본발명의범위에포함된다. 따라서, 세포샘플에서본발명의폴리뉴클레오티드서열의존재를검출하기위한한가지방법으로, 폴리뉴클레오티드서열에상보적인 2종이상의프로므를사용하고, 특히상이한프로브의수는다른예로 2, 3 또는 5개의상이한핵산프로브서열이다. 본원에기술된폴리뉴클레오티드서열 ( 바람직하게는프로브형태 ) 은또한비제한적으로, 브라아, 브라키스피라인테르메디아 (B. intermedia), 브라키스피라알비니풀리 (B. alvinipulli), 브라키스피라알보르기 (B. aalborgi), 브라키스피라이노센스 (B. innocens), 브라키스피라무르도치 (B. murdochii) 및브라키스피라필로시콜리 (B. pilosicoli) 등의브라키스피라종의검출을위한고상지지체에고정될수있다. 다른예로, 본원에기술된폴리뉴클레오티드서열은브라키스피라하이오디센테리애와같은브라키스피라종유래의여러가지다수의유전자를동시에검출하기위해사용할수있는 DNA 분자라이브러리의일부를형성할것이다. 본발명의또다른구현예에서, 본원에기술된폴리뉴클레오티드서열은다른폴리뉴클레오티드서열 ( 예, 다른박테리애나바이러스유래 ) 와함께브라키스피라하이오디센테리애와같은브라키스피라종의존재의동정이가능한방식으로고형지지체에고정시킬수있으며및 / 또는임의의다른폴리뉴클레오티드서열을고체지지체상에결합시킬수있다. DNA 분자의고정화된라이브러리를제조하는기법은당해분야에개시되어있다. 일반적으로, 가장최근의방법은예컨대매스킹기법을이용하여고체기판상의다양한개별위치에서다양한서열행렬을제조하는단일가닥핵산분자라이브러리의합성방법이다. 미국특허 5,837,832에는, 큰대규모의기법을기초로실리콘기질에고정된 DNA 어레이를제조하는개선된방법이기술되어있다. 특히, 미국특허 5,837,832에는본발명의고정화된 DNA 라이브러리제조에이용할수있는기판상에공간적으로정해진위치에특이적인프로브세트를합성하는 " 틸링 (tiling)" 이라는전략이기술되어있다. 미국특허 5,837,832에는또한역시사용할수도있는초기기법에대한내용이제공되어있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드서열프로브는기질의표면상에인시츄로합성할수잇다. 다른예로, 단일가닥분자는고체기판에서분리되어합성될수있으며, 각각의미리-생성된서열을고체기판상에분리된위치에적용할수있다. 예로, 폴리뉴클레오티드서열은핀이나피조전기장치가장착된로보트장치를이용하여기판상에직접프린트할수있다. 라이브러리서열은전형적으로고체기판상에또는별개의영역내에고정화된다. 기판은기판내부에서의고정화가가능하게유공성이거나또는실질적으로무공성일수있으며, 이경우라이브러리서열은전형적으로기판의기질상에고정된다. 고체기판은폴리펩타이드가직접또는간접적으로결합할수있는임의의물질로만들어질수있다. 적합한고체기판의예로는평평한유리, 실리콘와이퍼, 운모, 세라믹및유기폴리머, 예

20 컨대폴리스티렌및폴리메타크릴레이트등의플라스틱을포함한다. 또한, 광범위하게이용가능한, 니트로셀룰로스또는나일론멤브레인과같은반투과성막을이용하는것도가능할수있다. 반투과성막은유리와같이매우튼튼한고형표면상에둘수있다. 표면은선택적으로금, 백금또는그외전이금속등의금속층으로코팅될수있다. 바람직하게는, 고체기판은일반적으로경질또는반-경질표면을가진물질이다. 바람직한구현예에서, 기판의한가지이상의표면은일부구현예에서는예컨대올라간부분또는에칭된부분 (etched trench) 이있는여러가지폴리머에대한영역을물리적으로분리합성하는것이바람직할수있지만, 실질적으로평평할것이다. 또한, 고체기판은전형적으로 50 내지 100 μm의별개면적에 내지 dots/cm -2 밀도로 DNA 서열을고밀도로제공하는데적합한것이바람직하다. [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] [0114] [0115] 고체기판은통상적으로섹션으로분할된다. 이는, 광에칭과같은기법에의해또는소수성잉크, 예컨대테플론계잉크 (Cel-line, USA) 의사용에의해수행될수있다. 라이브러리의각각의상이한구성원이위치된개별위치는, 임의의통상적인형태, 예컨대원형, 사각형, 타원형, 쐐기형등을취할수있다. 폴리뉴클레오티드서열을기판에부착시키는것은공유결합또는비공유수단에의한것일수있다. 폴리뉴클레오티드서열은라이블리서열이결합된분자층을통해기판에부착될수있다. 예로, 폴리뉴클레오티드서열을바이오틴으로표지할수있으며, 기판을아미딘및 / 또는스트렙타비딘으로코팅할수있다. 바이오틴화된폴리뉴클레오티드서열을이용하는데있어편리한점은, 고체기판의커플링효과를쉽게결정할수있다는것이다. 폴리뉴클레오티드서열은일부고형기판에불충분하게결합할수있기때문에, 흔히고형기판 ( 예, 유리의경우 ) 과핵산서열사이에화학적상호작용의제공이필수적이다. 적합한화학적인터페이스의예는폴리라이신이코팅된유리를사용하는것이며, 폴리라이신은표준적인방법을이용하여화학변형시켜, 친화성리간드를도입한다. 커플링제를이용하여고체기판의표면에분자를부착시키는다른방법들은당해분야에공지되어있으며, 예로 WO98/49557을참조한다. 고정된핵산라이브러리에상보적인폴리뉴클레오티드서열의결합은결합된폴리뉴클레오티드서열의광학특성 ( 예, 에티듐브로마이드사용에의함 ) 변화와같은다양한방법에의해, 또는형광체로표지된폴리펩타이드와같은표지된핵산의사용에의해결정할수있다. 표지물질의사용이필요하지않은그외검출기법으로는광음향법 (optoacoustic), 반사율측정법, 타원계측법및표면플라즈몬공명과같은광학기법이있다 (WO97/49989 참조 ). 따라서, 본발명은본발명의 1종이상의폴리뉴클레오티드, 바람직하게는본발명의 2종이상의폴리뉴클레오티드가그위에고정되어있는고형기판을제공한다. 또한, 본발명은닭및돼지와같은동물에서체액성및세포성반응을자극하여브라키스피라하이오디센테리애, 브라키스피라수아나티나 (B. suanatina), 브라키스피라인테르메디아 (B. intermedia), 브라키스피라알비니풀리 (B. alvinipulli), 브라키스피라알보르기 (B. aalborgi), 브라키스피라이노센스 (B. innocens), 브라키스피라무르도치 (B. murdochii) 및브라키스피라필로시콜리 (B. pilosicoli) 등의브라키스피라종의군집화에대한방어를제공하기위해사용할수있는, 예방제또는치료제로서사용할수있다. 브리와와같은브라키스피라종의자연감염은본원에기술된단백질에대한순환성항체역가를유도한다. 따라서, 본원에기술된아미노산서열또는그것의일부는전신또는경구투여되는예방제또는치료제의토대를형성하여장의스피로헤타증에대한보호를제공하는잠재력을가진다. 따라서, 일구현예에서, 본발명은본원에기술된아미노산서열또는그것의단편, 또는본원에기술된아미노산서열또는폴리뉴클레오티드서열과결합하는항체를, 약학적으로허용가능한운반체, 희석제또는부형제와혼합되어치료학적유효량으로제공한다. 본원에서, 표현 " 치료학적유효량 " 은숙주동물의활성, 기능및반응에대한임상적으로유의한결함을약 15% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱바람직하게는 90% 이상감소시키거나, 가장바람직하게는예방하는데충분한양을의미한다. 다른예로, 치료학적유효량은동물숙주에서임상적으로유의한증상개선을초래하는데충분하다. 표현 " 약학적으로허용가능한 " 은동물에게투여하였을때생리적으로허용되며알레르기반응이나비슷한복통등의바람직하지않은반응은발생시키지않는, 분자물질및조성물을의미한다. 용어 " 운반체 " 는화합물과함께투여되는희석제, 보강제, 부형제또는비히클을의미한다. 이러한약학적운반체는페트롤륨, 동물, 식물또는합성오리진의오일, 예컨대땅콩유, 콩유, 미네랄오일, 참기름등의, 물및오일과같은멸균액체일

21 수있다. 물또는염수용액및수계덱스트로스및글리세롤용액이바람직하게특히주사용액에서운반체로서사용된다. 적합한약학적운반체는 Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990) 에기술되어있다. [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] [0122] 본발명의더욱특별한예로, 본원에기술된아미노산서열, 또는이의유사체, 단편또는유도체산물, 또는그것에대한항체를치료학적유효량으로약학적으로허용가능한희석제, 보존제, 용해제, 유화제, 보강제및 / 또는운반체와함께포함하는약학조성물을제공한다. 이러한조성물은완충제함량 ( 예, Tric-HCl, 아세테이트, 포스페이트 ), ph 및이온세기가다양한희석제와세정제및용해제 ( 예, 트윕 80, 폴리소르베이트 80) 등의첨가제, 항산화제 ( 예, 아스코르브산, 소듐메타바이설피트 ), 보존제 ( 예, 티메르솔, 벤질알코올 ) 및벌킹물질 ( 예, 락토스, 만니톨 ) 을포함한다. 상기물질은폴리락트산, 폴리글리콜산등의폴리머화합물의미립자조제물에병합하거나또는리포좀에병합할수있다. 히알루론산역시사용할수있다. 이러한조성물은본발명의단백질및유도체의물리적상태, 안정성, 생체내방출속도및생체내소거속도에영향을미칠수있다. 예로, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 를참조하며, 본원에원용에의해포함된다. 조성물은액체형태로제조되거나또는동결건조형태와같은건조분말로제조될수있다. 다른예로, 본발명의폴리뉴클레오티드는식물 ( 옥수수 ) 발현용으로최적화될수있다. 식물은최적화된폴리뉴클레오티드를포함하는플라스미드로형질전환시킬수있다. 그런후, 식물을키우고, 본발명의단백질을식물에서발현시키거나또는식물-최적화된버전을발현시킨다. 그런후식물을수확하고, 본발명의단백질이포함된식물의절편을동물사료로가공한다. 동물사료는동물에게섭취되었을때브라키스피라하이오디센테리애에대한면역성을부여해줄것이다. 이러한방법에대해상세하게나타낸종래기술의예는미국특허 5,914,123 (Arntzen, et al.); 미국특허 6,034,298 (Lam, et al.); 및미국특허 6,136,320 (Arntzen, et al.) 에서찾아볼수있다. 본발명에따라제공되는약학조성물은당해분야에공지된임의수단에의해투여될수있는것으로이해될것이다. 바람직하게는투여용약학조성물은주사에의해, 경구또는폐에의해또는코경로에의해투여된다. 본원에따른아미노산서열또는그로부터유래된항체는더바람직하게는정맥내, 동맥내, 복막내, 근육내또는피하투여경로로전달된다. 다르게는, 본원에따른아미노산서열또는그로붙유래된항체는적절하게제형화되어코또는경구투여에의해투여될수있다. 또한, 본발명은본발명의폴리뉴클레오티드서열뿐만아니라본발명에따른아미노산서열을코딩하는폴리뉴클레오티드서열에혼성가능한안티센스및라이보자임폴리뉴클레오티드서열의, 브라키스피라하이오디센테리애관련질병을변화시키기위한약제의제조에있어서의용도를포함한다. 치료방법에사용하기위한안티센스구조체또는라이보자임을코딩하는폴리뉴클레오티드서열은네이키드핵산구조체로서직접투여되는것이바람직하다. 박테리애세포에의한네이키드핵산구조체의흡수는몇가지공지된형질감염기법, 예컨대형질감염제의사용등의방법에의해증가된다. 이러한제제의예로는양이온성제제 ( 예, 칼슘포스페이트및 DEAE-덱스트란 ) 및리폭펙턴트가있다. 전형적으로, 핵산구조체는형질감염제와혼합되어조성물을이룬다. 다른예로, 안티센스구조체또는라이보자임은약학적으로허용가능한운반체나희석제와조합되어약학조성물을형성할수있다. 적합한운반체및희석제로는등장성염수액, 예컨대포스페이트-완충화된염수가있다. 조성물은비경구, 근육내, 정맥내, 피하, 강내, 경구또는경피투여용으로제형화될수있다. 숙력된실무자는임의의특정동물및증상에따른최적투여경로및임의의투여량을쉽게결정할수있을것이므로, 기술된투여경로는가이드일뿐이다. 또한, 본발명은브라키스피라하이오디센테리애와같은브라키스피라종으로감염된것으로의심되는동물을스크리닝하거나또는동물이브라키스피라하이오디센테리애와같은브라키스피라종으로감염되었는지를확인하기위한키트를포함한다. 본발명의추가적인구현예에서, 전문가가사용하기에적합한키트는, 감염의심동물에서브라키스피라하이오디센테리애, 브라키스피라수아나티나 (B. suanatina), 브라키스피라인테르메디아 (B. intermedia), 브라키스피라알비니풀리 (B. alvinipulli), 브라키스피라알보르기 (B. aalborgi), 브라키스피라이노센스 (B. innocens), 브라키스피라무르도치 (B. murdochii) 및브라키스피라필로시콜리 (B. pilosicoli) 등의브라키스피라종의존재또는부재를결정하거나, 또는비제한적으로브라키스피라하이오디센테리애, 브라키스피라수아나티나 (B. suanatina), 브라키스피라인테르메디아 (B. intermedia), 브라키스피라알비니풀리 (B. alvinipulli), 브라키스피라알보르기 (B. aalborgi), 및브라키스피라필로시콜리 (B

22 pilosicoli) 등의브라키스피라종감염을정량적으로측정하도록제조될수있다. 전술한테스트기법에있어서, 그러한키트는본원에기술된아미노산서열들중한가지또는그것의결합파트너, 예컨대그것에특이적인항체의적어도표지된버전과, 선별방법, 예컨대 " 경쟁적 ", " 샌드위치 ", "DASP" 등에따른지침서를포함할수있다. 이와는다르게, 상기키트는본원에기술된폴리뉴클레오티드서열중어느하나의일부분에상보적인하나이상의폴리뉴클레오티드서열과이의사용설명서를포함할수있다. 또한, 키트에는완충제, 안정화제등의주변시약이포함될수도있다. [0123] [0124] [0125] [0126] [0127] [0128] [0129] [0130] [0131] [0132] [0133] [0134] [0135] [0136] [0137] [0138] [0139] [0140] 따라서, 브라키스피라하이오디센테리애, 브라키스피라수아나티나 (B. suanatina), 브라키스피라인테르메디아 (B. intermedia), 브라키스피라알비니풀리 (B. alvinipulli), 브라키스피라알보르기 (B. aalborgi), 브라키스피라이노센스 (B. innocens), 브라키스피라무르도치 (B. murdochii) 및브라키스피라필로시콜리 (B. pilosicoli) 등의브라키스피라종의존재입증을위한테스트키트에는하기가포함될수있다 : (a) 검출가능한표지물에본원에기술된아미노산서열들중어느하나나또는그것에특이적인결합파트너의간접또는직접부착에의해수득되는, 소정량의 1종이상의표지된면역화학적반응성분 ; (b) 그외시약 ; 및 (c) 키트의사용지침서. 더욱구체적으로는, 진단테스트키트에는하기가포함될수있다 : (a) 고상에일반적으로결합되어면역흡착제를형성하거나, 또는다른예로적합한텍에결합된, 기지량 (known amount) 의전술한바와같은본원에기술된아미노산서열들중하나 ( 또는결합파트너 ), 또는복수개의그러한최종산물이있음 ; (b) 필요에따라, 그외시약 ; 및 (c) 상기테스트키트의사용설명서. 다른예로, 테스트키트에는하기가포함될수있다 : (a) 본원에기술된아미노산서열들중하나를검출가능한표지물과커플링시켜수득한표지된성분 ; (b) 리간드또는고정된리간드인, 1종이상의추가적인면역화학시약으로서, 상기리간드는하기성분들로이루어진군으로부터선택됨 : (i) 상기표지된성분 (a) 와결합할수있는리간드 ; (ii) 상기표지된성분 (a) 의결합파트너와결합할수있는리간드 ; (iii) 결정할 1종이상의상기성분 (a) 와결합할수있는리간드 ; 또는 (iv) 결정할 1종이상의상기성분 (a) 의결합파트너들중한가지이상과결합할수있는리간드 ; 및 (c) 본원에기술된아미노산서열들중어느하나와그것에특이적인결합파트너간의한가지이상의면역화학반응구성요소를검출및 / 또는결정하기위한프로토콜수행설명서. 게놈라이브러리의제조게놈라이브러리는호주돼지야생분리물인브라키스피라하이오디센테리애 (WA1 균주 ) 를이용하여제조한다. 이균주는특정화가잘되어있으며, 돼지에대한실험감염에서병독성인것으로확인되었다. 세틸트리메틸암모늄브로마이드 (CTAB) 방법을이용하여, 게놈 DNA 라이브러리제조에적합한고품질의염색체 DNA를제조한다. 브라키스피라하이오디센테리애는 100 ml의혐기성트립티카제소이배지배양물에서세포밀도 10 9 세포 /ml로키운다. 세포를 4,000 xg에서 10 분간회수하고, 세포펠릿은 9.5 ml TE 완충제에재현탁한다. 여기에 SDS를최종농도 0.5 % (w/v) 로첨가하고, 세포를 1시간동안 37 에서프로테나제 K 100 μg으로세포용혈시킨다. 여기에 NaCl을최종농도 0.7 M으로첨가하고, 1.5 ml의 CTAB/NaCl 용액 (10% w/v CTAB, 0.7 M NaCl) 을첨가한후, 20분간 65씨에서인큐베이션한다. 세포용혈물은동일부피의클로로포름 / 이소아밀알코올로추출하고, 튜브를 10분간 6,000 xg에서원심분리하여상을분리시킨다. 수층은새튜브로옮기고, 여기에 0.6 부피의이소프로판올을첨가하여, 고분자량의 DNA를침전시킨다. 침전된 DNA를후크형의유리막대로취합하여, 70 % (v/v) 에탄올 1 ml이들어있는튜브로옮긴다. 튜브를 10,000 xg에서원심분리하고, 펠릿화된 DNA는 4 ml TE 완충액에밤새재용해한다 g/ml CsCl 및 0.5 mg/ml 에티듐브로마이드를포함하는세슘클로라이드농도구배를

23 재용해한 DNA 용액을이용하여만든다. 이농도구배는 4 ml의밀봉가능한원심분리튜브로옮겨, 15 에서 70,000 xg로밤새원심분리한다. 분리된 DNA를자외선광하에서눈으로확인하고, 고분자량 DNA를 15 g 바늘을이용하여농도구배에서빼낸다. CsCl-포화된이소프로판올로연속추출하여 DNA로부터에티듐브로마이드를제거한다. 정제된염색체 DNA를 2 L의 TE 완충액에서투석하고, 이소프로판올로침전시킨다. 재현탁한게놈 DNA는 GeneMachines Hydroshear (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI) 를이용하여자르고, 잘린 DNA는클레나우 DNA 중합효소로메워블론트-엔드단편을만든다. 블런트-엔드 DNA 단편을 25 ng의 psmart VC 벡터 (Lucigen, Meddleton, WI) 와 CloneSmart DNA 라이게이즈를이용하여연결시킨다. 연결된 DNA는 E. coli 일렉트로컴피턴트 (electrocompetent) 세포로전기천공으로이동시킨다. 소삽입체 (2-3 kb) 라이브러리및중간크기의삽입체 (3-10 kb) 라이브러리를 psmart VC 벡터의저카피수버전에구축시킨다. [0141] [0142] [0143] [0144] [0145] [0146] [0147] [0148] 게놈서열분석게놈라이브러리를수득한후, psmart VC 벡터가포함된 E. coli 클론각각을선별한다. 플라스미드 DNA를정제하고서열분석한다. 정제된플라스미드를 psmart VC 벡터에특이적인정방향및역방향프라이머를이용하여 psmart VC를자동조절서열분석을수행한다. 각서열분석반응은 200 ng의플라스미드 DNA, 2 pmol의프라이머및 4 μl의 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) 으로구성된, 10 μl부피로수행한다. 사이클링조건은, 96 에서 2분간의변성단계 -> (96, 10초, 변성 -> 60, 4분, 프라이머어닐링및연장조합 ), 25회사이클이다. 85 mm 소듐아세테이트 (ph 5.2), 3mM EDTA (ph 8) 를포함하는 95% (v/v) 에탄올로침전및진공건조하여, 서열분석산물로부터잔여염료터미네이터를제거한다. 플라스미드는각프라이머를이용하여 2세트로서열분석한다. 서열분석결과는 ABI 373A DNA Sequencer (PE Applied Biosystems) 에서분석한다. 주석브라키스피라하이오디센테리애에대한일부게놈서열을조합하고, 데이타분석에대한품질보증과정의일부로서서열을분석및재분석하기위한퍼블릭도메인바이오인포매틱스를이용하여주석을단다. 오픈리딩프레임 (ORF) 은 GeneMark, GLIMMER, ORPHEUS, SELFID 및 GetORF 등의다양한프로그램을이용하여예측한다. 추정의 ORF는 BLAST 및 FASTA 등의검색을이용하여기존국제데이타베이스와상동성 (DNA 및단백질 ) 을조사한다. 예측한 ORF 모두분석하여, PSI-BLAST, FASTA, MOTIFS, FINDPATTERNS, PHD, SIGNALP 및 PSORT 등의프로그램으로그것의세포내위치를결정한다. Interpro, Prosite, ProDom, Pfam 및 Block 등의데이타베이스를이용하여, 트랜스멤브레인도메인, 리더펩타이드, 공지의표면단백질에대한상동제, 지단백질시그네쳐, 외막앵커링모티프및숙주세포결합도메인과같은표면관련단백질을예측한다. 계통발생분석및그외분자진화분석은동정한유전자및그외종들로수행하여, 기능을정하는것을보조한다. 부분적으로서열분석된게놈양쪽의실리코 (in silico) 분석을통해, 이용가능한서열데이타에존재하는예측된모든 ORF에대한포괄적인리스트를작성한다. 각각의 ORF에는, 천연유전자산물의시험관내특성과상호관련가능하게하기위해, 예상되는분자량, 등전전점, 소수성및세포내위치등의설명정보를기재한다. 표면에위치한성분및 / 또는그외병원성박테리애에서병독성인자와유사한단백질을코딩하는예측되는유전자를잠재적인백신타겟으로선택한다. 바이오인포메틱스결과브라키스피라하이오디센테리애게놈의샷건 (shotgun) 서열분석으로, 게놈의 94.6% ( 예상한 3200 kb 중 kb) 가서열분석되었다. 브라키스피라하이오디센테리애서열은, 컨티그 (contig) 의평균크기가 10.3 kb인 294 개의컨티그로구성되어있다. 브라키스피라하이오디센테리애의경우, 2,593개의오픈래딩프레인 (ORF) 가 294개의컨티그들에서예상된다. 핵산및단백질데이타베이스에존재하는유전자들과예측되는 ORF를비교한결과, ORF의약 70% 가공공데이타베이스에포함된유전자와상동성을보이는것으로나타난다. 예측되는 ORF 의나머지 30% 는동일성이없다. 백신후보백신후보로서테스트할 ORF의수를줄이는것을돕기위해, 공공데이타베이스에존재하는외막단백질, 분비 형단백질및가능성있는병독성인자에대해적절한상동성 (E 값 < e -15 ) 을보이는 ORF를잠재적인백신후보로선택한다. 게놈샷건서열분석에서수득한 2,593개의 ORF 중에서, 다수가이테스트를통과하였지만, 34개의유전자의결과만명세서에나타낸다. 표 1은잠재적인백신타겟으로선택된 32종의유전자와이의 SWISS- PROT 데이타베이스로부터수득한그외공지의아미노산서열과의유사성을나타낸다. 아미노산의동일성 % 은