등록특허 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2010년05월11일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2010년04월30일 (51) Int. Cl. A61K 38/04 ( )

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2010년05월11일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2010년04월30일 (51) Int. Cl. A61K 38/04 ( ) A61P 3/04 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2007 년 09 월 21 일 심사청구일자 2007 년 09 월 21 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2008 년 03 월 28 일 (30) 우선권주장 년 09 월 25 일대한민국 (KR) (56) 선행기술조사문헌 JP A US A1 KR B1 (73) 특허권자 ( 주 ) 에스제이바이오메드 경기도안산시사 1 동 1271 한양대학교창업보육센터 604 호 (72) 발명자 김효준 경기도안산시상록구성포동선경아파트 이희종 경기도광명시철산 3 동철산한신아파트 (74) 대리인 KR A 전체청구항수 : 총 8 항 심사관 : 박정웅 (54) 항비만용면역원성하이브리드폴리펩타이드및이를포함하는항비만백신조성물 (57) 요약 본발명은 N 말단으로부터순차적으로아포지단백질 B-100(Apolipoprotein B-100) 의 B 세포에피토프의모조펩타이드 ; 광견병바이러스헬퍼 T 세포에피토프또는 B 형간염바이러스표면항원헬퍼 T 세포에피토프 ; 및마우스아포지단백질 CⅡ 의 C- 말단펩타이드절편또는아포지단백질 B-100 의 B 세포에피토프의모조펩타이드가융합된면역원성하이브리드폴리펩타이드, 및상기면역원성하이브리드폴리펩타이드를포함하는비만예방또는치료용백신조성물에관한것이다. 또한본발명은상기면역원성하이브리드폴리펩타이드를코딩하는폴리뉴클레오타이드, 상기폴리뉴클레오타이드를포함하는재조합발현벡터, 상기재조합발현벡터로형질전환된숙주세포및상기재조합발현벡터로형질전환된숙주세포를배양하여면역원성하이브리드폴리펩타이드를제조하는방법에관한것이다. 손민 대표도 - 1 -

2 특허청구의범위청구항 1 삭제청구항 2 삭제청구항 3 삭제청구항 4 삭제청구항 5 삭제청구항 6 삭제청구항 7 삭제청구항 8 삭제청구항 9 삭제청구항 10 삭제청구항 11 삭제청구항 12 삭제청구항 13 서열번호 9의아미노산서열을갖는면역원성하이브리드폴리펩타이드. 청구항 14 삭제청구항 15 서열번호 10의아미노산서열을갖는면역원성하이브리드폴리펩타이드

3 청구항 16 삭제청구항 17 서열번호 11의아미노산서열을갖는면역원성하이브리드폴리펩타이드. 청구항 18 제13항, 제15항및제17항중어느한항의면역원성하이브리드폴리펩타이드를포함하는비만예방또는치료용백신. 청구항 19 제13항, 제15항및제17항중어느한항의폴리펩타이드를코딩하는폴리뉴클레오타이드. 청구항 20 제 19항의폴리뉴클레오타이드를포함하는재조합발현벡터. 청구항 21 제 20 항의재조합발현벡터로형질전환된숙주세포. 청구항 22 제 20 항의재조합발현벡터로형질전환된숙주세포를배양하여서열번호 9, 서열번호 10, 또는서열번호 11 의 아미노산서열을갖는면역원성하이브리드폴리펩타이드를제조하는방법. 명세서 발명의상세한설명 [0001] 기술분야본발명은 N 말단으로부터순차적으로아포지단백질 B-100(Apolipoprotein B-100) 의 B 세포에피토프의모조펩타이드 ; 광견병바이러스헬퍼 T 세포에피토프또는 B형간염바이러스표면항원헬퍼 T 세포에피토프 ; 및마우스아포지단백질 CⅡ의 C-말단펩타이드절편또는아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프의모조펩타이드가융합된면역원성하이브리드폴리펩타이드에관한것이다. 또한본발명은상기면역원성하이브리드폴리펩타이드를포함하는비만예방또는치료용백신조성물에관한것이다. 또한본발명은상기면역원성하이브리드폴리펩타이드를코딩하는폴리뉴클레오타이드, 상기폴리뉴클레오타이드를포함하는재조합발현벡터, 상기재조합발현벡터로형질전환된숙주세포및상기재조합발현벡터로형질전환된숙주세포를배양하여면역원성하이브리드폴리펩타이드를제조하는방법에관한것이다. [0002] 배경기술최근서구적식생활의영향으로비만에의한대사성질환인당뇨병, 동맥경화증및관상동맥질환 (coronary atherosclerotic disease: CAD) 이점차적으로증가추세에있으며, 이는사람뿐만아니라개나고양이와같은애완동물또는가축의경우에도마찬가지이다. 이러한질환의원인이되는혈청지질로는콜레스테롤 (cholesterol), 트리글리세라이드 (triglyceride: TG), 유리지방산 (free fatty acid) 및포스포리피드 (phospholipid) 등이있으며, 이들혈청지질은아포지단백질 (apolipoprotein) 과함께지단백질 (lipoprotein) 을형성하여혈액순환을통해운반되고있다. 그중에서 VLDL(very low density lipoprotein) 및 LDL(low density lipoprotein) 은주로 TG 및콜레스테롤의운반을담당하고있으며 LDL-콜레스테롤수치의변화는위와 - 3 -

4 같은질병의예후를나타내는척도가된다. [0003] [0004] 지질대사와관련된성인병의주요인자인 LDL-콜레스테롤은각조직의세포막의 LDL 수용체에결합하여조직내에저장, 활용되거나청소세포 ( 스카벤져탐식세포 ) 에포획되어진후가수분해되어유리콜레스테롤형태로아포지단백질과함께 HDL로전달되어간에서재활용되거나담즙산형태로처리되어배설되는경로가밝혀져있다. 이과정에서아포지단백질은지단백의구조적항상성을유지하고, 지방질분해효소의보조인자기능및세포막상의특정수용체와결합하는매우중요한기능을수행하고있다. 아포지단백질 B-100(Apolipoprotein B-100: Apo B-100) 은이러한저밀도지단백질 (LDL) 의주된단백질성분이며또한 IDL(intermediate density lipoprotein ), VLDL에존재하고있기때문에, 혈중에있는항체가아포지단백질 B-100을인식하도록유도한다면식세포에의한 LDL-소거 (clearance) 가용이하게일어날수있을것이다. 이와같은근거로최근백신을이용하여 LDL-콜레스테롤의수치를낮추고동맥경화를감소시키기위한연구가시도되고있다. 이와같은항-콜레스테롤백신요법에의해유도된항체는 IgM 타입으로 VLDL, IDL 및 LDL과결합하는것으로보여지며, 이것을통해서고콜레스테롤및아테롬성동맥경화증에대한예방및치료용백신의가능성이제시되고있다 (Bailey, et al., Cholesterol vaccines. Science 264, , 1994; Palinski W., et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 821-5, 1995; Wu R. de Faire U., et al., Hypertension. 33, 53-9, 1999). 또한, 아포지단백질 B-100은 4560개의아미노산잔기 (24개의시그널펩타이드를포함하여 ) 로구성된거대한단백질분자로, 분자량은 500 kda을초과한다 (Elovson J., et al., Biochemistry, 24: , 1985). 아포지단백질 B-100은주로간에서분비되고양친매성을가지는분자이기때문에지단백질의리피드와상호작용할수도있고수용액의환경과도상호작용이가능하다 (Segrest J. P., et al., Adv. Protein Chem., 45: , 1994). 아포지단백질 B-100은 LDL 입자의크기와구조를안정화시키는역할과수용기와의결합을통하여혈장내 LDL-콜레스레롤의항상성을조절하는중요한역할을한다 (Brown MS., et al., Science, 232 : 34-47, 1986). [0005] [0006] 본원발명자에의해출원된한국특허등록번호제 호는아포지단백질 B-100의에피토프에대한모조펩타이드 (mimetic peptide) 가항비만효과를가지며, 이를헬퍼 T 세포에피토프와융합시킨면역원성하이브리드폴리펩타이드 (B4T) 및이를포함하는조성물이비만을예방또는치료하는데효과적임을개시하고있다. 그러나상기출원에서는단지아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프의모조펩타이드및이와결합된헬퍼 T 세포에피토프의융합폴리펩티드가사람에게있어서비만을예방또는치료하는데효과적이라고개시하였을뿐, 사람외의동물의경우는사람과는다른면역관련물질및대사작용으로인해동일한효과를기대할수는없다. 또한, 상기등록된융합폴리펩타이드는단백질의구조 (folding) 가다소불안정하여한그룹내에서동일하게면역화되더라도개체에따라항체유도반응의편차가큰문제가있다. 한편, 합텐의면역원성을높이기위하여매체단백질과융합시키려는시도가많이있었지만일률적인상승효과를얻을수는없었다. 특히본발명에서와같은 B 세포에피토프와 T 세포에피토프의선형연결시, 이들의방향성, 각각의에피토프의종류등에의해오히려면역원성이소실되는경우도있었으며 (Francis, M. J. et al., Nature 330: , 1987), 링커의존재로인하여항원성이감소하는경우도발생하였다 (Partidos, C. et al., Mol. Immunol. 29: , 1992). 이와같이, 펩타이드백신디자인에는일관적으로적용할수있는양태가존재하지않으며, 디자인된백신의효능또한예측할수없다. 동일한이유로, 소수성이매우강한아포지단백질 B-100의에피토프에대한모조펩타이드를, 이종펩타이드인광견병바이러스헬퍼 T 세포에피토프또는 B형간염바이러스표면항원헬퍼 T 세포에피토프, 또는아포지단백질 CⅡ와융합시킬경우, 오히려항원성을나타내는부위를분자내부로몰입시켜항체유도능이저하될가능성도배제할수없다. [0007] 이러한배경하에서, 본발명자는사람뿐만아니라개나소등의가축을포함하는동물에도적용가능하며, 개체간에균일한항체반응을유도할수있는안정적인항비만백신을제공하기위해다양한시도를하였으며, 그결과, N 말단으로부터순차적으로아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프의모조펩타이드의사량체 (B4) 에광견병바이러스헬퍼 T 세포에피토프 (R) 또는 B형간염바이러스표면항원헬퍼 T 세포에피토프 (T), 및아포지단백질 CⅡ의 C-말단펩티드절편 (CⅡ) 또는아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프의모조펩타이드의이량체 (B2) 를융합시킨융합폴리펩타이드가우수한면역증강효과를나타내어사람뿐만아니라동물에서도비만의예방또는치료에효과적으로사용될수있음을확인함으로써본발명을완성하였다

5 발명의내용 [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] 해결하고자하는과제따라서, 본발명의목적은 N 말단으로부터순차적으로아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프의모조펩타이드 ; 광견병바이러스헬퍼 T 세포에피토프또는 B형간염바이러스표면항원헬퍼 T 세포에피토프 ; 및마우스아포지단백질 CⅡ의 C-말단펩타이드또는아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프의모조펩타이드가융합된면역원성하이브리드폴리펩타이드를제공하는것이다. 본발명의다른목적은상기면역원성하이브리드폴리펩타이드를포함하는비만예방또는치료용백신조성물을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은상기면역원성하이브리드폴리펩타이드를코딩하는폴리뉴클레오타이드를제공하는것이다. 본발명의또다른목적은상기폴리뉴클레오타이드를포함하는재조합발현벡터를제공하는것이다. 본발명의또다른목적은상기재조합발현벡터로형질전환된숙주세포를제공하는것이다. 본발명의또다른목적은상기재조합발현벡터로형질전환된숙주세포를배양하여상기면역원성하이브리드폴리펩타이드를제조하는방법에관한것이다. [0014] 과제해결수단하나의양태로서, 본발명은 N 말단으로부터순차적으로아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프의모조펩타이드 ; 광견병바이러스헬퍼 T 세포에피토프또는 B형간염바이러스표면항원헬퍼 T 세포에피토프 ; 및마우스아포지단백질 CⅡ의 C-말단펩타이드절편또는아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프의모조펩타이드가융합된면역원성하이브리드폴리펩타이드에관한것이다. [0015] 본발명에서사용되는용어 에피토프의모조펩타이드 (mimetic peptide of epitope) 는에피토프의최소부분을모방하는펩타이드로, 항체에의해인식될수있도록천연에피토프와충분히유사하거나천연에피토프와교차반응하는항체를증가시킬수있는에피토프를의미하며, 미모토프 (mimotope) 라고도한다. 이러한모조펩타이드는생체내에서비자기 (non-self) 로인지되어면역반응에서자기내성 (self tolerance) 의문제를극복할수있다는장점이있다. 상기한 " 아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프의모조펩타이드 " 는아포지단백질 B-100과특이적으로결합하는항체에의해인식되는것으로서, 아포지단백질 B-100과특이적으로결합하는항체는아포지단백질 B-100을특이적으로인식하여결합하는다클론항체와단클론항체를포함하며이들의단편, 예를들어 Fc, Fab, F(ab ) 2, scfv 등도포함한다. 이중바람직하게는단클론항체가사용될수있으며, 보다바람직하게는 Mab B9 및 B23 이사용된다. [0016] 본발명에서아포지단백질 B-100의에피토프의모조펩타이드는서열번호 1, 2 및 3 중에서선택된아미노산서열을포함한다. 본발명자는한국특허등록번호제 호에서개시한바와같이파아지디스플레이드펩타이드라이브러리 (phage displayed peptide library) 로부터바이오패닝 (biopanning) 에의해아포지단백질 B- 100에대한단클론항체 Mab B9 또는 Mab B23에의해인식될수있는모조펩타이드 ( 서열번호 1, 2 및 3) 를밝혀내었다. 상기한서열번호 1, 2 및 3 중에서선택된아미노산서열을포함하는아포지단백질 B-100의에피토프의모조펩타이드는상기한서열번호의아미노산서열 1개로이루어진단량체형태일수도있으나면역원성을더욱증강시키기위해상기한서열번호의아미노산서열이 2개이상, 바람직하게는 3 내지 8개, 보다바람직하게는 3 내지 6개가연결된다량체형태를취할수있으며, 더욱바람직하게는 4개가연결된사량체 ( 서열번호 4) 를사용할수있다. 다량체의형태를취하는경우, 단량체를형성하는아미노산서열은직접적으로나또는링커를통해공유결합으로연결될수있다. 링커를통해연결되는경우아미노산예를들어, 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산을 1개내지 5개씩사용하여연결시킬수있으며사용될수있는바람직한아미노산으로는발린, 루이신, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 프롤린을예시할수있다. 보다바람직하게는유전자조작의용이성을고려하여발린, 루이신, 아스파르트산등중에서선택된 2개의아미노산을연결하여사용할수있다. 바람 - 5 -

6 직하게는, 상기한서열번호 1, 2 및 3 중에서선택된아미노산서열이상기한링커를통해 2 개이상연결된모조 펩타이드가사용된다. [0017] [0018] [0019] 본발명에서사용되는용어 T 세포에피토프 는적당한효율로 MHC 클래스Ⅱ 분자에결합할수있고 T 세포를자극하거나또한 MHC 클래스Ⅱ와복합체로 T 세포와결합할수있는아미노산서열을의미한다. 이는 T 세포상에존재하는특정수용체에의해인식되고 B 세포가항체생산세포로분화하는데요구하는신호를제공하는역할도하고세포독성 T 세포 (CTL) 를유도하여표적세포의용균을유도하기도한다. 본발명의목적상, 상기인식부위로는헬퍼 T 세포에피토프가바람직하게사용되며, 본원발명의경우특히광견병바이러스헬퍼 T 세포에피토프또는 B형간염바이러스표면항원헬퍼 T 세포에피토프를사용하는경우효과가좋음을발견하였다. 광견병바이러스 (Rabies virus) 는개, 고양이와같은애완용동물뿐만아니라가축, 들짐승에도전염되는질병으로수의학적으로필수적으로백신접종이실행되는대상이다. 따라서본발명에서는광견병바이러스리보뉴클레오단백질 (ribonucleoprotein) 유전자 (NCBI gene ID; AF406695) 로부터의유전자조작에의해숙주의헬퍼 T 세포에피토프를포함하는 58개아미노산의펩타이드단편 (R) 을도입하였으며그아미노산서열을서열번호 6 으로나타내었다 (Ertl, H.C.J., et al., Journal of Virology, 63(7), , 1989). B형간염바이러스 (hepatitis B virus, HBV) 유전자의크기는 3.2 kb로서, 크게네가지의중요한단백질에대한정보를가지고있으며, S 유전자 ( 표면항원단백질 ), C 유전자 ( 코어단백질 ), P 유전자 (DNA 중합효소 ) 및 X 유전자로구성되어있다. 이중 S 유전자의경우 HBsAg을코딩하고있는 S 영역과 pres 영역으로나눌수있다. pres 영역은 HBV의균주에따라서 108 또는 119개의아미노산를코딩하고있는 pres1과서브타입에관계없이 55개의아미노산잔기로이루어진 pres2로나누어진다. HBV pres2 단백질은체내면역반응과정에서헬퍼 T 세포를활성화시키며이것은 HBV에대한항체형성을촉진시킬수있다. 본발명에서사용한 HBV 헬퍼 T 세포에피토프에대한아미노산서열을서열번호 7로나타내었다 [0020] [0021] [0022] 또한, 본발명의면역원성하이브리드폴리펩타이드는 C 말단에마우스아포지단백질 CⅡ의 C-말단펩타이드절편또는아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프의모조펩타이드를포함한다. 마우스아포지단백질 CⅡ는소장과간에서주로생성되는분자량 8,800Da, 79 아미노산펩타이드 (Hoffer, M.J., et al., Genomics 17(1), 45-51, 1993) 로서카일로마이크론 (chylomicron), VLDL 및 HDL에존재하며, 아포지단백질리파아제 (LPL) 가효소활성을나타내기위한필수적보조인자 (essential cofactor) 의기능을나타낸다 (Storjohann, R., et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1486, p253~264, 2000). 본발명의바람직한실시예에서는아포지단백질 CⅡ의 LPL 활성을조절하는 C-말단의 33개아미노산으로구성되는펩타이드를마우스의아포지단백질 CⅡ 유전자 (NCBI gene ID; NM009695) 로부터클로닝하였으며, 이를서열번호 8 로표시하였다. 본발명의면역원성하이브리드폴리펩타이드의 C 말단에결합하는아포지단백질 B-100의에피토프의모조펩타이드는상기한서열번호 1, 2 및 3 중에서선택된아미노산서열을포함한다. 상기한서열번호 1, 2 및 3 중에서선택된아미노산서열을가지는아포지단백질 B-100의에피토프의모조펩타이드는상기한서열번호의아미노산서열 1개로이루어진단량체형태일수도있으나면역원성을더욱증강시키기위해상기한서열번호의아미노산서열이 2 내지 4개가연결된다량체형태를취할수있으며, 더욱바람직하게는 2개가연결된이량체를사용할수있다. 다량체의형태를취하는경우, 단량체를형성하는아미노산서열은직접적으로나또는링커를통해공유결합으로연결될수있다. [0023] [0024] 본발명에서사용된용어 면역원성 이란세포성면역및체액성면역반응모두를유도하여이물질에대해대처하는능력을말하며, 이러한면역반응을유도하는물질을면역원이라한다. 본발명은면역원성물질로서아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프, 광견병바이러스헬퍼 T 세포에피토프또는 B형간염바이러스표면항원헬퍼 T 세포에피토프, 및아포지단백질 CⅡ의 C-말단펩타이드절편으로이루어진융합폴리펩타이드를사용한다. 본발명에따른폴리펩타이드의경우와같이, B세포의에피토프와 T세포의에피토프부분이융합되어면역원성물질로사용되는경우, T 세포에피토프가폴리펩타이드접힘 (folding) 구조의안쪽에, B 세포에피토프가바깥 - 6 -

7 쪽에위치하여야효율적인면역반응이유도될수있다는것이공지된사실인바 (Partidos C, et al., Eur J Immunol., 22(10): , 1992), 본원발명자들은아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프의모조펩타이드와 T 세포에피토프만을연결시킨기존의 B4T 융합폴리펩타이드의구성에추가하여, T 세포에피토프의 C 말단에아포지단백질 CⅡ의절편또는아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프의모조펩타이드를추가연결시켰으며, 그결과본발명에따른융합폴리펩타이드는 T 세포에피토프가 B세포에피토프에의해둘러싸여바깥노출되는부분이최소화되어융합폴리펩타이드의단백질접힘 (folding) 구조가더욱안정화될뿐아니라보다균일한항체반응을유도할수있음을확인하였다. [0025] [0026] [0027] [0028] 본발명에서사용되는용어 폴리펩타이드 는 2개이상의아미노산을포함하는잔기가공유펩타이드결합에의해결합된모든길이의아미노산쇄를포함하는용어로서디펩타이드, 트리펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드등이이에포함되며, 특히본발명에서는수개내지수십개의아미노산이공유결합된펩타이드 2종이상이서로연결된하이브리드폴리펩타이드를의미한다. 폴리펩타이드를구성하는각각의펩타이드서열은상기한바와같은에피토프에해당하는아미노산서열을포함하며그에인접하게배치된서열도함께포함할수있다. 이들펩타이드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는두가지상이한배치의아미노산의다양한조합을취할수있다. 본발명에서사용되는용어 " 하이브리드폴리펩타이드 " 는일반적으로기원이다른이종펩타이드가연결된형태의펩타이드를일컬으며, 본발명에서는 B 세포에피토프에, 광견병바이러스헬퍼 T 세포에피토프 (R) 또는 B 형간염바이러스표면항원헬퍼 T 세포에피토프 (T), 및아포지단백질 CⅡ의 C-말단펩티드절편 (CⅡ) 또는아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프의모조펩타이드를연결한형태의펩타이드를의미한다. 바람직한한양태에서, 본발명에따른하이브리드폴리펩타이드는서열번호 1의아미노산서열을갖는펩타이드 4개가연결된폴리펩타이드 (B4), 상기펩타이드의 C 말단에연결된광견병바이러스헬퍼 T 세포에피토프 (R), 및상기헬퍼 T 세포에피토프의 C 말단에연결된마우스아포지단백질 CⅡ의 C-말단펩타이드절편 (CⅡ) 이융합된폴리펩타이드 (B4RCⅡ) 를의미한다 ( 서열번호 9). 또다른양태에서는, 서열번호 1의아미노산서열을갖는펩타이드 4개가연결된폴리펩타이드 (B4), 상기펩타이드의 C 말단에연결된광견병바이러스헬퍼 T 세포에피토프 (R), 및상기헬퍼 T 세포에피토프의 C 말단에연결된서열번호 1의아미노산서열을갖는펩타이드 2 개가연결된폴리펩타이드 (B2) 가융합된폴리펩타이드 (B4RB2) 를의미한다 ( 서열번호 10). 또다른양태에서는, 서열번호 1의아미노산서열을갖는펩타이드 4개가연결된폴리펩타이드 (B4), 상기펩타이드의 C 말단에연결된 B형간염바이러스표면항원헬퍼 T 세포에피토프 (T), 및상기헬퍼 T 세포에피토프의 C 말단에연결된서열번호 1의아미노산서열을갖는펩타이드 2개가연결된폴리펩타이드 (B2) 가융합된폴리펩타이드 (B4TB2) 를의미한다 ( 서열번호 11). 본발명의하이브리드폴리펩타이드는전적으로상기한바와같은 B 세포에피토프, 광견병바이러스헬퍼 T 세포에피토프또는 B형간염바이러스표면항원헬퍼 T 세포에피토프, 아포지단백질 CⅡ의 C-말단펩타이드절편, 및임의로이의인접서열을포함한항원성부분으로만이루어질수도있으며부가서열도포함할수있다. 그러나, 이런부가서열은전체면역원성 (immunogenicity) 을감소시키지않는것이바람직하다. 이러한부가서열로는링커서열을예로들수있다. 링커를통해연결되는경우이에의한면역반응유도에불리한영향을끼치지않도록선정되어야한다. [0029] 또다른양태로서, 본발명은상기한면역원성하이브리드폴리펩타이드를코딩하는폴리뉴클레오티드및이를 포함하는재조합벡터, 그리고상기재조합벡터로형질전환된숙주세포및상기숙주세포를배양하여상기폴 리펩타이드를생산하는방법에관한것이다. [0030] [0031] 본발명의하이브리드폴리펩타이드는각각의파트너가결정된후화학적으로합성하거나또는유전자재조합방법으로발현및정제하여수득할수있다. 구체적으로, 유전자재조합방법으로본발명의면역원성하이브리드폴리펩타이드를생산하는과정은다음단계들을포함한다 : 첫째, 하이브리드펩타이드를코딩하는유전자를벡터에삽입하여재조합벡터를제조하는단계이다. 외래유전자를삽입하기위한벡터로는플라스미드, 바이러스, 코즈미드등다양한형태의벡터를사용할수있다. 재조합벡터는클로닝벡터및발현벡터를포함한다. 클로닝벡터는복제기점, 예를들어플라스미드, 파지또 - 7 -

8 는코스미드의복제기점을포함하며, 다른 DNA 절편이부착되어부착된절편이복제될수있는 레플리콘 ' 이다. 발현벡터는단백질을합성하는데사용되도록개발되었다. 재조합벡터는통상외래 DNA의단편이삽입된캐리어로서일반적으로이중가닥의 DNA의단편을의미한다. 본원에서 외래 DNA 란외래종으로부터기원되는 DNA를의미하거나, 동일한종으로부터기원되는경우에는본래의형태로부터실질적으로변형된형태를의미한다. 또한, 세포에서정상적으로발현되지않는비변화된 DNA 서열도포함한다. 이경우외래유전자는전사될특정목적핵산으로폴리펩타이드를암호한다. 재조합벡터는숙주세포에서형질감염유전자의발현수준을높이기위해서는해당유전자가선택된발현숙주내에서기능을발휘하는전사및해독발현조절서열에작동가능하도록연결되어야만한다. 상기재조합벡터는개체의세포내에서유전자삽입물이발현되도록작동가능하게연결된필수적인조절요소를포함하는유전자작제물로서, 이러한유전자작제물을제조하기위해표준재조합 DNA 기술을이용할수있다. 재조합벡터의종류는원핵세포및진핵세포의각종숙주세포에서목적하는유전자를발현하고, 목적하는단백질을생산하는기능을하면특별히한정되지않지만, 강력한활성을나타내는프로모터와강한발현력을보유하면서자연상태와유사한형태의외래단백질을대량으로생산할수있는벡터가바람직하다. 재조합벡터는적어도, 프로모터, 개시코돈, 목적하는단백질을암호화하는유전자, 종결코돈터미네이터를포함하고있는것이바람직하다. 그외에시그널펩타이드를코드하는 DNA, 인핸서서열, 목적하는유전자의 5 측및 3 측의비해독영역, 선별마커영역, 또는복제가능단위등을적절하게포함할수도있다. [0032] [0033] [0034] [0035] 둘째, 상기재조합벡터를사용해서숙주세포를형질전환시킨후배양하는단계이다. 재조합벡터를숙주세포에도입하여형질전환체를제조하기위한방법으로는문헌 (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판 ), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989) 에기재된인산칼슘법또는염화캄슘 / 염화루비듐법, 일렉트로포레이션법 (electroporation), 전기주입법 (electroinjection), PEG 등의화학적처리방법, 유전자총 (gene gun) 등을이용하는방법등이있다. 상기재조합벡터가발현되는형질전환체를영양배지에서배양하면유용한단백질을대량으로제조, 분리가능하다. 배지와배양조건은숙주세포에따라관용되는것을적당히선택하여이용할수있다. 배양시세포의생육과단백질의대량생산에적합하도록온도, 배지의 ph 및배양시간등의조건들을적절하게조절하여야한다. 본발명에따른재조합벡터로형질전환될수있는숙주세포는원핵세포와진핵세포모두를포함하며, DNA의도입효율이높고, 도입된 DNA의발현효율이높은숙주가통상사용된다. 세균, 예를들어에쉐리키아, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와같은주지의진핵및원핵숙주들, 스포도프테라프루기페르다 (SF9) 와같은곤충세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10 등의동물세포등이사용될수있는숙주세포의예이다. 바람직하게는이. 콜라이가사용될수있다. 셋째, 하이브리드펩타이드의발현을유도, 축적하는단계이다. 본발명에서는유도인자 IPTG를사용하여펩타이드발현을유도하였고, 유도시간은단백질의양을최대화되게조절하였다. 마지막으로, 하이브리드펩타이드를분리, 정제하는단계이다. 일반적으로재조합적으로생산된펩타이드는배지또는세포분해물로부터회수될수있다. 막결합형인경우, 적합한계면활성제용액 ( 예, 트리톤-X 100) 을사용하거나또는효소적절단에의해막으로부터유리될수있다. 하이브리드펩타이드발현에사용된세포는동결-해동반복, 음파처리, 기계적파괴또는세포분해제와같은다양한물질적또는화학적수단에의해파괴될수있으며, 통상적인생화학분리기술에의해서분리. 정제가능하다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990). 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피 ( 이온교화크로마토그래피, 친화력크로마토그래피, 면역흡착친화력크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔침투 HPLC), 등전성포커스및이의다양한변화및복합방법을포함하나이에국한되지않는다. 본발명자는바람직한실시일례로서, B 세포에피토프를가지고있지만이자체로는 T 세포에피토프부분이결여되어있는항비만기능적펩타이드인아포지단백질 B-100 모조펩타이드의 4량체형태인 B4의 C 말단부분과 T 세포에피토프를가지고있는광견병바이러스의뉴클레오단백질유전자의일부 (R 단편 ) 및마우스아포지단백질유전자의일부 (CⅡ 단편 ) 을연결하여 B4RCⅡ 유전자단편을제작하였다 ( 도 3). B4 단편은한국특허등록번호제 호에서개시한 B4 단편을사용하였으며, 아포지단백질 CⅡ와 RVNP(Rabbis Virus 의단백질 중헬퍼 T 세포의에피토프가존재하는핵단백질부분 ) 는 RT-PCR 법에의해각각의유전자를얻었다. B4RCⅡ 의 발현을위해서는 pqe30 플라스미드를사용하였는데, 이는벡터자체내에있는시작코돈으로부터단백질발현 이시작되고, 정제를편리하게하기위해히스티딘 6 개도같이발현이되며엔테로키나아제부위도발현된다

9 이렇게발현되는단백질은, 아미노산의분자량으로계산된크기가약 21KDa 이며, SDS-PAGE 로계산된크기는약 22KDa 이었다. 시간대별로샘플을얻어 SDS-PAGE 를통해서발현이되는것을확인을하였다 ( 도 9). [0036] 또다른양태로서, 본발명은상기면역원성하이브리드폴리펩타이드를포함하는비만예방또는치료용백신 조성물에관한것이다. [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] 전술한바와같이, 펩타이드백신디자인에일관적으로적용할수있는양태가존재하지않으며디자인된백신의효능또한예측할수없다. 동일한이유로소수성이매우강한 PB14 펩타이드를이종펩타이드인 T 세포에피토프와융합시킬경우오히려항원성을나타내는부위를분자내부로몰입시켜항체유도능이저하될가능성도배제할수없다. 이와같이그결과를유추하기어려운상황에서, 본발명자들은 N 말단으로부터순차적으로아포지단백질 B-100의 B 세포에피토프의모조펩타이드에광견병바이러스헬퍼 T 세포에피토프또는 B형간염바이러스표면항원헬퍼 T 세포에피토프, 및아포지단백질 CⅡ의 C-말단펩티드절편또는아포지단백질 B- 100의 B 세포에피토프의모조펩타이드를융합시킨융합폴리펩타이드를설계하고, 항비만에대한이들의면역원성을입증하였다. 본발명에따른면역원성하이브리드폴리펩타이드를상기한바와같이유전자재조합방법에따라발현및정제하여마우스에접종한후, 동물개체의 (a) 체중증가추이관찰, (b) 혈청내항체역가관찰및 (c) 혈청내지질함량의변화를통해면역반응효과를검정하고항원의우수한형태를입증하였다. 그결과, 하이브리드폴리펩타이드 (B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2) 로백신화된그룹이대조군그룹에비해체중증가가억제되고모조펩타이드에대한항체역가가높고잔존기간이길며 TG 및 LDL-콜레스테롤수치도낮아진다는것을확인하였다. 구체적으로, 항원주사에따른체중의변화를 6주령 ICR 마우스에정제한 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2를복강에 50 μg / 150 μl로 2주간격 3회주사한후체중의변화를체중증가그래프로확인을하였다 ( 도 11). 1차부스팅이후고지방식을먹여 DIO (diet induced obesity) 를유도하였다. 일차주사와부스팅때까지는각그룹별신체질량은 22 내지 23 g으로비슷하였지만 DIO를시작한이후대조군 ( 비만, Obesity) 은급격히체중이증가한반면 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2를주사한그룹은경미한체중증가를보였다. 14주령 ( 첫번째주사로부터 8주경과 ) 일때대조군과 B4RB2를주사한그룹의체중의차이는약 8g의차이가나타났다. 이는최초주사 (primary) 에의해미약한면역반응이 2차주사에의해부스팅된후증강된면역응답반응에의해체중증가가억제됨을시사하는것이다. 그리고 3차주사후의체중증가의편차는예상하였던대로유지되고있음을알수있었다. 또한백신처리된그룹에서 ICR 마우스의항체역가는 7, 10, 12, 14, 16, 18주령에서간접적 ELISA 분석하였다 ( 도 12). 또한, 혈청내지질수준은백신처리된그룹이백신처리하지않은대조군 ( 비만 ) 그룹보다전체적으로총콜레스테롤 (TC), 중성지방 (TG), HDL 콜레스테롤및 LDL 콜레스테롤수치가낮게나타났다 ( 도 13). 상기결과들로부터본발명에따른 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2 융합폴리펩타이드는효과적인항비만용백신으로사용될수있음을알수있다. 이들융합폴리펩타이드는기존의 B4T 융합폴리펩타이드에비해더욱균일하고안정적인면역반응을유도함으로써, 효과적인항비만용백신조성물을구성할수있다. [0042] 본발명의항비만백신은항원, 약제학적허용가능한담체, 적절한보조제, 기타통상적인물질들로구성되고면역학적효과량으로투여한다. 본발명에서 " 면역학적효과량 " 이란비만치료및예방효과를나타낼수있을정도의충분한양과부작용이나심각한또는과도한면역반응을일으키지않을정도의양을의미하며정확한투여농도는투여될특정면역원에따라달라지며면역반응의발생을검사하기위하여당업자가공지의방법을이용하여이를결정할수있다. 또한, 투여형태및경로, 수용자의연령, 건강및체중, 증상의특성및정도, 현재치료법의종류, 및치료횟수에따라변화될수있다. 담체는당분야에공지의것으로안정화제, 희석제및완충액을포함한다. 적절한안정화제는솔비톨, 락토즈, 만니톨, 전분, 당, 덱스트란및포도당같은탄수화물 ; 알부민또는카제인같은단백질등을포함한다. 적절한희석제에는염, Hanks 균형염및링거액등을포함한다. 적절한완충액에는알칼리금속인산염, 알칼리금속탄산염및알칼리토금속탄산염등을포함한다. 또한백신에는면역반응을개선또는강화시키기위하여하나이상의보조제등을포함한다. 적절한보조제에는펩타이드 ; 알루미늄하이드록시드 ; 알루미늄포스페이트 ; 알루미늄옥시드 ; Marcol 52 같은미네랄오일또는식물성오일및하나이상의유화제로구성된조성물또는리졸세시틴, 다가양이온, 다가음이온같은표면활성물질등이포함한다. 본발명의백신조성물은개별치료제로투여하거나다른치료제와병용하여 - 9 -

10 투여될수있고종래의치료제와순차적또는동시에투여될수있다. 백신조성물은공지의투여경로를통하여투여된다. 이와같은방법에는경구, 경피, 근육, 복막, 정맥, 피하, 비강경로를이용할수있지만이에국한되지는않는다. 또한제약조성물은활성물질이표적세포로이동할수있는임의의장치에의해투여될수있다. [0043] 효과본발명의면역원성하이브리드폴리펩타이드를포함하는백신조성물은사람뿐만아니라개나소, 고양이등의가축을포함하는동물에도적용가능하며, 개체간에균일한항체반응을유도할수있는안정적인백신으로서, 사람및동물의비만예방및치료에도효과적이다. [0044] 발명의실시를위한구체적인내용 이하실시예를통하여본발명을좀더구체적으로설명한다. 이는단지예시하기위한것으로서하기실시예에 의해서본발명의범위가한정되는것은아니다. [0045] [0046] [0047] [0048] 실시예 1. 실험재료및실험동물의준비 DNA 미니프렙키트 (miniprep kit) 와겔에서 DNA를추출하기위하여사용된키트는 Nucleogen 제품을, 세포배양에필요한박토-트립톤 (bacto-trypton), 박토-효소추출물 (bacto-yeast extract), 아가 (agar) 등은 Difco사 (Detroti, MI) 제품을, 제한효소는 Takara 제품을, T4 DNA 리가제는 NEB 제품을사용하였다. 사용벡터는 pbluescript Ⅱ SK(Stratagene사 ), pqe30(qiagen사 ) 를, 사용된균주는이. 콜라이 JM109 및 M15(Qiagen사 ) 를사용하였다. 단백질생성을유도하기위한 IPTG는 Sigma사의것을, 발현된단백질을정제하기위하여사용된 Ni-NTA 레진은 Amersham 제품을사용하였다. SDS-PAGE 및웨스턴블랏팅, ECL 등에사용된예비염색된마커 (prestained marker) 로는 NEB사제품을사용하였다. 단백질을변성상태로만들기위해사용된요소는 Duchefa 제품을사용하였으며, 정제를할때사용한이미다졸은 USB 제품을사용하였다. 투석에사용된막은 MWCO 3,500 Spectrum 제품을, 단백질응집방지를위해사용된시약은 CHAPS이며 Amresco 제품을사용하였다. ELISA에사용된항체는 HRP 결합된항-흰쥐 IgG로서 Sigma 제품을사용했다. 웨스턴블랏과 ECL에사용된기질용액으로 ECL+plus 웨스턴블랏검출시약은 Amersham 제품을사용하였다. 보조제는프로인트애쥬번트 (Freund adjuvant; Sigma 사 ) 와수산화알루미늄 (aluminum hydroxide; Reheis사 ) 을사용하였다. 단백질정량은 BCA 단백질검사법 (Pierce) 을사용하였다. ICR mouse는 ( 주 ) 중앙실험동물에서구입하였으며, 6주령이상의암컷을사용하였다. ICR 마우스는부스팅때까지는 normal diet를 (( 주 ) 샘타코제품, 성분 : 천연단백질 18% 이상, 조지방 5.3%, 조섬유 : 4.5%, 회분 : 8.0%) 로사육하였고, 그이후는고지방식 (60%kCal fat, D12492, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ) 으로사육하였다. [0049] [0050] [0051] 실시예 2: 마우스 ApoCⅡ 유전자클로닝 2-1. 쥐간조직으로부터전체 RNA의분리전체 RNA의분리는 TRIzol(Invitirogen) 을사용하여분리하였고, 모든용액은 0.1% diethyl pirocarbonatetreated water (DEPC-dH2O) 를처리하여 RNase 활성을저해하였다. 마우스로부터분리한간조직 50mg 당 TRIzol 2 ml을가하고균질화하여분쇄하였다. 얼음에서 20분간반응한후, 분쇄물을 4, 14,000 r.p.m. 의속도로 15분간원심분리하였다. 새튜브에단백질이딸려오지않도록주의하여상층액만을옮긴후, 200 μl의클로로폼 (Merck) 을넣어 30초간 vortex하였다. 얼음에서 20분간반응한후, 혼합물을 4, 14,000 r.p.m. 의속도로 15분간원심분리하였다. 새튜브에상층액만을옮기고동량의페놀 / 클로로폼, 0.2 M 아세트산나트륨 (ph5.2) 를넣어서 5초동안 vortex하였다. 얼음에서 20분간반응한후, 혼합물을 4, 14,000 r.p.m. 의속도로 15분간원심분리하였다. 상층액과동일양의이소프로판올 (Merck) 을첨가하여섞고, -70 에서 1시간보관한

11 후, 4, 14,000 r.p.m. 의속도로 10분간원심분리하여전체 RNA 펠렛 (pellet) 을확인할수있었다. RNA 펠렛을 1 ml의 75% 에탄올로씻어준후건조시키고, DEPC-dH20로재균질화시킨뒤 -70 에서보관하였다. RNA 농도는 Genequant II (Pharmarcia biotech) 로측정하였고, 분리한 RNA는 1% 아가로스겔 (0.5% TAE) 에 1 μl를전개해서확인하였다. [0052] [0053] 2-2. 전체 RNA를이용한 cdna 합성 cdna 합성은 cdna cycletm Kit(Invitrogen) 를사용하였다. PCR튜브에위에서얻은 RNA를 400 ng 넣고반응용액의부피가 11.5 μl이되도록 DEPC-dH2O를넣었다. 올리고 dt 프라이머 1 μl를넣고잘섞어 65 water bath 에서 10 분간, 상온에서 2분간반응시켰다. 여기에 RNase 반응억제제 1.0 μl, 5X RT 버퍼 4.0 μl, 100 mm dntps 1.0 μl, 80 mm 소디움피로포스페이트 (sodium pyrophosphate) 1.0 μl, AMV 역전사효소 0.5 μl를가하고가볍게두드려섞은후, 42 water bath에서 1시간, 95, 2분간반응시킨후, 빨리얼음에보관하였다. 0.5 M EDTA(pH 8.0) 1.0 μl, 페놀-클로로폼 20 μl를넣고 vortex한후, 4, 14,000 r.p.m. 의속도로 15분간원심분리하였다. 상층액을새튜브로옮겨, 암모늄아세테이트 22 μl, 75% 에타놀 88 μl를넣어 vortex한후, -70 에서하룻밤 (overnight) 보관하였다. 4, 14,000 r.p.m. 의속도로 15분간원심분리한후, 상층액을버리고, 펠렛을 20 μl 3차증류수로현탁 (resuspension) 시키고, 1% 아가로스겔 (0.5% TAE 버퍼 ) 에전개하여확인하였다. [0054] [0055] 2-3. 마우스아포지단백질 CⅡ의 C-말단단편의 PCR 본실험에사용된모든 PCR은 DNA Thermal cycler 480을사용하였다. 마우스아포리포프로테인 CⅡ의 lipase activating region을포함한 99개유전자를증폭하기위하여 apocⅡ-센스프라이머 (5' tc aga GTC GAC gat gag aaa ctc agg gac 3') 와 apocⅡ-안티센스프라이머 (5' tat AAG CTT ggg ctt gcc tgg cag cag cta c 3') 를사용해 PCR을수행하였다. 먼저 PCR 튜브에 apocii-센스프라이머와 apocii-안티센스프라이머 (2pmol/ul) 를각각 1ul씩넣고, 에서만든 cdna를 2ul를넣었다. 10X buffer 5 μl, dntp 8 μl, Taq DNA 중합효소 (Takara) 1 μl를넣어최종부피가 50 μl가되도록준비하였다. PCR 조건은 94 에서 5분반응후, 98 에서 30초, 56 에서 30초, 72 에서 30초를 1set으로 30회반복반응한후, 72, 5분반응하여얼음에보관하였다. 1.5% 아가로스 (0.5% TAE 버퍼 ) 에 1 μl전개하여확인하였다 ( 도 1b). [0056] [0057] [0058] 2-4. ApoCⅡ/pQE30의제작 ApoCⅡ 단편을얻기위해서 apocⅡ PCR 단편은 SalI과 HindIII를그리고이단편을삽입하기위한 pqe30 벡터도또한 SalⅠ과 HindⅢ 제한효소를이용하여잘라내었다. pqe30과 CⅡ 단편을 T4 DNA 리가아제를이용하여 16 에서밤새연결시켰다. 단백질을발현하기위하여선택된벡터시스템은 pqe30 플라스미드시스템으로이벡터는발현시키고자하는단백질이 6X 히스티딘과융합단백질형태로발현되어정제가용이하도록고안되었다. JM109 이. 콜라이 strain에형질전환시킨후플라스미드를분리하여 SalⅠ과 HindⅢ로잘라단편이삽입되었음을확인하였다. [0059] [0060] [0061] 실시예 3. RCⅡ 인공유전자작성 3-1. 광견병바이러스 (Rabies virus) strain ERA로부터의유전자 RNA의분리전체 RNA의분리는 TRIzol(Invitirogen) 을사용하여분리하였고, 모든용액은 0.1% diethyl pirocarbonatetreated water (DEPC-dH2O) 를처리하여 RNase 활성을저해하였다. 광견병예방백신에들어있는광견병바이러스 (Rabies virus) 로부터 total RNA를분리하기위하여, 먼저백신 1.2ml에 2.5 M NaCl을포함하는 20%(W/V) 폴리에틸렌글리콜-8000 용액을 200μl가하고 1시간동안얼음에방치한다음 14,000 r.p.m., 4, 10분간원심분리하였다. 이렇게얻어진바이러스펠렛에 TRIzol 1 ml을가하고피펫 (pipetting) 하여잘풀어주었다. 얼음에서 20분간반응한후, 분쇄물을 4, 14,000 r.p.m. 의속도로 15분간원심분리하였다. 새튜브에단백질이딸려오지않도록주의하여상층액만을옮긴후, 200 μl의클로로폼을넣어 30초간 vortex하였다. 얼음에서 20분간반응한후, 혼합물을 4, 14,000 r.p.m. 의속도로 15분간원심분리하였다. 새튜브에상층액만을옮기고동량의페놀 / 클로로폼, 0.2 M 아세트산나트륨 (ph5.2) 를넣어서 5초동안 vortex하였다. 얼음에서 20분간반응한

12 후, 혼합물을 4, 14,000 r.p.m. 의속도로 15분간원심분리하였다. 상층액과동일양의이소프로판올 (Merck) 을첨가하여섞고, -70 에서 1시간보관한후, 4, 14,000 r.p.m. 의속도로 10분간원심분리하여전체 RNA 펠렛을확인할수있었다. RNA 펠렛을 1 ml의 75% 에탄올로씻어준후건조시키고, DEPC-dH20로재균질화시킨뒤 -70 에서보관하였다. RNA 농도는 Genequant Ⅱ(Pharmarcia biotech) 로측정하였고, 분리한 RNA는 1% 아가로스겔 (0.5% TAE) 에 1 μl를전개해서확인하였다. [0062] [0063] 3-2. Genomic RNA를이용한 cdna 합성 cdna 합성은 cdna 싸이클 TM Kit(Invitrogen) 를사용하였다. PCR튜브에위에서얻은 RNA를 400 ng 넣고반응용액의부피가 11.5 μl이되도록 DEPC-dH2O를넣었다. Random hexamer 1 μl를넣고잘섞어 65 water bath에서 10 분간, 상온에서 2분간반응시켰다. 여기에 RNase 저해제 1.0 μl, 5X RT 버퍼 4.0 μl, 100 mm dntps 1.0 μl, 80 mm 피로인산나트륨 (sodium pyrophosphate) 1.0 μl, AMV 역전사효소 0.5 μl를가하고가볍게두드려섞은후, 42 water bath에서 1시간, 95, 2분간반응시킨후, 빨리얼음에보관하였다. 0.5 M EDTA(pH 8.0) 1.0 μl, 페놀-클로로폼 20 μl를넣고 vortex한후, 4, 14,000 r.p.m. 의속도로 15분간원심분리하였다. 상층액을새튜브로옮겨, 아세트산암모늄 (ammonium acetate) 22 μl, 75% 에탄올 88 μl를넣어 vortex한후, -70 에서밤새보관하였다. 4, 14,000 r.p.m. 의속도로 15분간원심분리한후, 상층액을버리고, 펠렛을 20 μl 3차증류수로재현탁 (resuspension) 시키고, 1% 아가로스겔 (0.5% TAE 버퍼 ) 에전개하여확인하였다. [0064] [0065] 3-3. 광견병바이러스 (Rabies virus) strain ERA 핵단백질유전자 (nucleoprotein gene) 의 PCR 광견병바이러스 (Rabies virus) strain ERA의핵단백질유전자 (nucleoprotein gene) 중 T 세포에피토프로밝혀진 (2) 174개유전자를증폭하기위하여 RVNP-센스프라이머 (5'-ATA CTC GAG GAC GTA GCA CTG GCA GAT G- 3') 와 RVNP-안티센스프라이머 (5'-ATA CTC GAG GTT TGG ACG GGC ATG ACG-3') 를사용해 PCR을수행하였다. 먼저 PCR 튜브에 RVNP-센스프라이머와 RVNP-안티센스프라이머 (2pmol/ul) 를각각 1ul씩넣고, 에서만든 cdna를 2ul를넣었다. 10X 버퍼 5 μl, dntp 8 μl, Taq DNA 중합효소 (Takara) 1 μl를넣어최종부피가 50 μl가되도록준비하였다. PCR 조건은 94 에서 5분반응후, 98 에서 30초, 54 에서 30초, 72 에서 30초를 1set으로 30회반복반응한후, 72, 5분반응하여얼음에보관하였다. 1.5% 아가로스 (0.5% TAE 버퍼 ) 에 1 μl전개하여확인하였다. [0066] [0067] 3-4. RCⅡ/pQE30의제작 R 단편을얻기위해서, RVNP PCR 단편은 XhoI으로, 이단편을삽입하기위한 ApoCII/pQE30 벡터는 XhoI과 Sal Ⅰ제한효소를이용하여잘라내었다. Linearized ApoCII/pQE30과 R 단편을 T4 DNA 리가아제를이용하여 16 에서밤새결합시켰다. JM109 이. 콜라이 strain에형질전환시킨후플라스미드를분리하여 SalI과 HindⅢ로잘라단편이올바른방향으로삽입되었음을확인하였다. [0068] [0069] 실시예 4. pb4rcⅡ 벡터작성한국특허등록번호제 호에서개시한바와같은 pqe30에들어있는 B14 단편을 XhoⅠ으로잘라서얻었다. RCII 단편이삽입되어있는 pqe30 벡터를 XhoI으로자른후위에서얻은 B14 단편과 T4 DNA 중합효소로 16 에서밤새결합시켜 BL4RCII/pQE30(pB4RCII) 을얻었다. 클로닝된 pb4rcii의염기서열을확인하기위해 ( 주 ) 코스모진텍에 DNA 시퀀싱을플라스미드농도 300~500 ng/ μl로의뢰를하였다. 또한, BL4RCII/pQE30 벡터로형진전환시킨이. 콜라이 JM109로부터플라스미드를분리하여 SalI으로잘라단편이올바른방향으로삽입되었음을확인하였다 ( 도 2b). B4RCII의아미노산서열은서열번호 9로나타내었다. [0070] [0071] 실시예 5. pb4rb2 벡터작성 한국특허등록번호제 호에서개시한 BX2/pQE30(pB2) 벡터를 SalⅠ 과 XhoⅠ 제한효소를이용하여잘라 내었고, 선형화된 BX2/pQE30 와실시예 3 에서얻은 R 단편을 T4 DNA 리가아제를이용하여 16 에서밤새결합시

13 켜 RBX2/pQE30(pRB2) 을얻었다. [0072] 실시예 4에서얻은 pb4rcii를 XhoⅠ제한효소로잘라 B4 단편을얻은후, XhoⅠ로자른 ptb2와 T4 DNA 리가아제를이용하여 16 에서 15시간이상반응시켜 B4RBX2/pQE30(pB4RB2) 를얻었다. B4RBX2/pQE30 벡터로형진전환시킨이. 콜라이 JM109로부터플라스미드를분리하여 SalI으로잘라단편이올바른방향으로삽입되었음을확인하였다 ( 도 2c). B4RB2의아미노산서열은서열번호 10으로나타내었다. [0073] [0074] [0075] 실시예 6. pb4tb2 벡터작성한국특허등록번호제 호에서개시한 BX2/pQE30(pB2) 벡터를 SalⅠ과 XhoⅠ제한효소를이용하여잘라내어선형화된 BX2/pQE30을얻었고, 한국특허등록번호제 호에서개시한 PCR 2.1 벡터를 SalI 제한효소를이용하여절단하여얻은 T 단편을얻었다. 상기선형화된 BX2/pQE30와 T 단편을 T4 DNA 리가아제를이용하여 16 에서밤새결합시켜 TBX2/pQE30(pTB2) 을얻었다. 한국특허등록번호제 호에서개시한 pbluescript Ⅱ SK 를 SalI과 XhoⅠ 제한효소를이용하여절단하여 B4 단편을얻었으며, SalⅠ으로자른 ptb2와 B4 단편을 T4 DNA 리가아제를이용하여 16 에서밤새결합시켜 B4TBX2/pQE30(pB4TB2) 을얻었다. B4TB2/pQE30 벡터로형진전환시킨이. 콜라이 JM109로부터플라스미드를분리하여 SalI과 HindⅡ로잘라단편이올바른방향으로삽입되었음을확인하였다 ( 도 2d). B4TB2의아미노산서열은서열번호 11로나타내었다. [0076] [0077] 실시예 7. 재조합 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2의발현펩타이드발현에사용한숙주세포는 M15로써암피실린 (Ampicillin) 와카나마이신 (Kanamycin) 이함유된 LB 플레이트에도말 (smearing) 하여콜로니를얻은다음 Amp (50 μg / ml ) 과 Kan (50 μg / ml ) 이함유된 LB 배지 10 ml에서밤새배양하였다. 시간변화에따른단백질의유입 (induction) 을알아보기위하여밤새배양한배양액중 1 ml를신선한 LB 배지에 50 ml에주입 (inoculation) 했다. 본배양액을 600 nm에서흡광도가 0.4~0.5 될때까지 37 에서 1시간 30분동안흔들면서배양 (shaking incubation) 한후, IPTG를최종 1 mm 농도가되게가하고 5시간동안배양을계속하여매 1시간마다 1 ml씩분취하였다. IPTG를가하기전에 1 ml를미리취하여비유도대조군으로사용하였다. 각각의배양액은 14,000 rpm에서 1분간원심분리하여펠렛을얻은후 2X SDS 샘플버퍼 30 μl에녹여 SDS-PAGE시샘플로사용하였다. 이렇게해서계산된단백질의크기는각각 B4RCⅡ는 22kDa, B4RB2 는 21kDa, B4TB2는 20kDa이며, 시간대별로샘플을얻어 SDS-PAGE를통해서발현이되는것을확인한결과를도 9(a)(b)(c) 에나타내었다. [0078] [0079] [0080] 실시예 8. 재조합 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2의웨스턴블랏 SDS-PAGE에서크기분석을통해 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2를확인하였지만, 정확한단백질이발현되는지확인하기위하여 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2를인식할수있는 2가지항체를사용하여웨스턴블랏팅을수행하였다. 웨스턴블랏팅의대조군으로는 M15에클로닝되지않은 pqe30 벡터를형질전환시켜서사용했다. 샘플은 IPTG로유도하기전과유도후 4시간때의것으로하였다. 1차항체는래빗 (rabbit) 항-PB14 다클론항체를 PBS에 1:10000으로희석하여사용하였다. 1차항체를인식할수있는 2차항체는퍼옥시다제가결합되어있는고트 (goat) 항-래빗 IgG를 PBS에 1:10000으로희석하여사용하였다. 발색반응은 ECL+Plus 웨스턴블랏팅키트를사용하였으며막을카세트에넣고후지의학 (Fuji medical) X-선필름을넣은후 10초동안노출하여현상하였다. 도 9(d) 에서보이는바와같이 B4RCⅡ가정확히발현되었음을확인할수있었다. [0081] [0082] 실시예 9. 재조합 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2의박테리아세포위치확인실시예 5 방법처럼유도된세포를 4, 9,000 rpm에서 30분간원심분리를한후얻어진펠렛을잠시 -20 에얼렸다가얼음에서녹인후초음파분해완충액을펠렛 1 g에대해 5 ml비율로넣어재현탁하였다. 세포를용해 (lysis) 시키기위하여 30초씩 15 사이클 ( 사이클사이에 1분간휴지 ) 로초음파파쇄하였다. 4, 9000 rpm에서

14 30 분간원심분리하여상층액을분리하여가용성단백질이들어있는가공되지않은추출물 A 로, 남아있는펠렛 은불용성의단백질이들어있는가공되지않은추출물 B 로사용하였다. 각각의샘플에 2X SDS 샘플완충액을섞 어 95 에서 5 분간끊인후 SDS-PAGE 를수행하였다 ( 도 10). [0083] [0084] 실시예 10. 재조합 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2의정제용완충용액의제조 Sonication 버퍼는 5 mm 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mm 트리스-Cl, ph 7.9, 결합버퍼는 5 mm 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mm 트리스-Cl, 8 M 우레아, ph 7.9, washing buffer는 50 mm 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mm 트리스- Cl,8 M 우레아, ph 7.9, elution buffer는 400 mm 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mm 트리스-Cl, 8 M 우레아, ph 7.9로하였다. [0085] [0086] [0087] 실시예 11. 재조합 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2의정제펩타이드를정제하기위하여히스티딘태그 (tag) 단백질용 Ni-NTA 레진 (Novagen) 을사용하였다. 이레진은레진에결합되어있는 Ni+ 과 N-말단에히스티딘헥사머융합단백질이상호작용하는성질을이용하는것으로친화력을이용한친화성크로마토그래피의한방법이다. LB 배지 10 ml을하룻밤배양한배양액을 500 ml LB 배지에전량접종하여, 600 nm에서흡광도 0.4 내지 0.5가될때까지 37 에서배양했다. IPTG를 1 mm로가하고 4시간동안배양한후 9000 rpm에서 30분간원심분리하여세포펠렛을얻어 -20 에서두었다. 얼음에서녹인펠렛에초음파분쇄완충액을습윤세포 (wet cell) 과 5 ml /g 비율로넣어재현탁시키고초음파분쇄를수행하였다. 실시예 5와같은방법으로초음파분쇄를하여세포를용해시키고, 4, 9000 rpm에서 30분간원심분리하여펠렛을얻었다. 펠렛에결합완충액을남아있던상층액의부피와동일하게넣은후재현탁시키고세포잔해를제거하기위해서초음파분쇄를 3 사이클수행하였다. 이것을다시 4, 9000 rpm에서 30분간원심분리를하여얻은상층액을정제용샘플로사용하였다. Ni-NTA 레진충진컬럼의크기는직경 1 cm, 높이 15 cm이며레진은 2 ml, 유속 (flow rate) 은 2 ml /min로하였다. 레진을컬럼에충진한후 3 내지 5배부피의증류수로세척하고 5배부피의 1X 하전된완충액 (50mM NiSO4) 를흘려주어 Ni2+ 를결합한후결합완충액으로평형화하여 Ni-킬레이트화친화성수지를제조하였다. 레진에샘플로딩을 2 사이클수행하였다. 이렇게해서샘플로딩이완료되면다시결합완충액으로 1.0 범위의 280 nm 흡광도에서기저선에도달할때까지흘렸다. 그후세척완충액으로 10분흘리고평형화가완료되면용출완충액을흘리면서용출되는단백질을튜브에모았다. 정제된단백질은 8 M 요소상태이고요소를제거하기위해 PBS를사용하여투석을수행하였다. 단백질의정확한 refolding을위해천천히요소의농도를낮춰가며수행하였다. 그결과도 6 (a, c, e) 에나타낸바와같이, 크로마토그래피과정중 280nm 흡광도를그래프로각각나타내었으며, 도 10 (b), (d), (f) 에나타낸바와같이단계별로얻은분획을각각 SDS-PAGE로확인하였다. [0088] [0089] 실시예 12. 재조합 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2의정량 B4RCII는 PBS로천천히투석을수행하여요소의농도를낮춰주더라도단백질의응집으로인한침전이발생하지않았으므로이상태에서단백질정량을수행하였다. 정량은 BCA 단백질정량법, UV 흡수법을이용하여실시하였다. BCA 단백질정량법에사용한표준은 2 mg / ml의 BSA를 1000, 500, 250, 125, 62.5 μg / ml로연차석희석하여이용하였다. BCA 분석은용액 A : 용액 B를 50:1 비율로만들었으며샘플과 37 에서 30분간반응시키고 562 nm 에서흡광도를측정하였으며정량선을이용하여단백질의농도를정량하였다. UV 흡수법은 B4RCII의 ε값은 1.63이므로 A280nm에서의흡광도를 ε값으로나누어서농도를결정하였다. [0090] [0091] 실시예 13. ICR 마우스의면역화 (Immunization) ICR 마우스에서면역은대조군 (DIO를유도한비만그룹 ), 대조군 (DIO를유도하지않은정상그룹 ), B4RCⅡ로면역화한그룹, B4RB2로면역화한그룹및 B4TB2로면역화한그룹등 5 그룹으로나누어서실행하였다. 6주령 ICR 마우스에정제한 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2를각각 50 μg을 100 μl로복강에주사를하였다. 주사는 2주간격으로 3회실시한후체중의변화를체중증가그래프로확인하였다. 1차부스팅이후고지방식을먹여 DIO (diet induced obesity) 를유도하였다. 첫번째부스팅 (boosting) 한후 1주째, 두번째부스팅한후 1주째, 3주째및

15 5 주째에꼬리에서채혈을하였다. [0092] 그결과, 도 11에나타난바와같이, 일차주사와부스팅때까지는각그룹별신체질량은 22 내지 23 g으로비슷하였지만 DIO를시작한이후대조군 ( 비만 ) 은급격히체중이증가한반면 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2를주사한그룹은경미한체중증가를보였다. 14주령 ( 첫번째주사로부터 8주경과 ) 일때대조군과 B4RB2를주사한그룹의체중의차이는약 8g의차이가나타났다. 이는최초주사 (primary) 에의해미약한면역반응이 2차주사에의해부스팅된후증강된면역응답반응에의해체중증가가억제됨을시사하는것이다. 그리고 3차주사후의체중증가의편차는예상하였던대로유지되고있음을알수있었다. [0093] [0094] [0095] 실시예 14. 간접적 ELISA를이용한각펩타이드에따른항체역가측정혈청샘플을이용하여항체역가를측정하였다. 미세역가평판에 PB14를각웰에 100 ng의농도로 100 μl씩넣었다. 그리고 4 에서밤새처리한후블럿킹용액 (PBS, 0.5% 카세인, 0.02% NaN3) 을첨가하고 37 에서 1시간동안항온처리하였다. 세척완충액으로 3번씻어내고실시예 10 방법을통해서얻은혈청을 PBS에 1/1000-1/8000 배로희석하여 100 μl씩사용하였고 37 에서 1시간동안항온처리하였다. 세척완충액으로 3번씻어낸후 2차항체로는고트항-마우스 IgG-HRP 결합항체를 1/1000배로희석하여사용하였다. OPD로발색하여 450 nm 에서흡광도에서측정하였다. 그결과, 도 12에나타난바와같이, B4RB2 및 B4TB2로면역화한그룹은 14주령까지항체역가가증가했다가그후감소하였고, B4RCⅡ로면역화한그룹은 16주령까지항체역가가증가했다가그후감소함을알수있었다. 세그룹모두항체를잘유도하여면역원성이높음을알수있었다. [0096] [0097] [0098] 실시예 15. 혈청지질함량의측정 TG와총콜레스테롤의측정은발색시약 200 μl에혈청 4 μl를넣고 37 에서 5분간항온처리한후각각 505 nm, 500 nm 흡광도를측정하였다. HDL의측정은혈청과침전시약을 1:1로섞은후실온에서 10분간방치한후 3000 rpm 이상에서 10분간원심분리를하여얻은상층액을발색시약 200 μl에 4 μl를넣고 37 에서 5분간항온처리한후 555 nm에서흡광도를측정하였다. LDL 콜레스테롤의측정은 EZ LDL 콜레스테롤키트 (Sigma 사제품 ) 를, LDL 캘리브레이터는 Randox사제품을사용하였으며, 제조사로부터제공된프로토콜에따라키트내의시약 ul에혈청 4 μl를넣고 37 에서 5분간반응시킨후시약 250 μl를첨가하여다시 37 에서 5분간반응시킨다음 600 nm에서흡광도를측정하였다. 각측정키트에서얻은흡광도와표준시액을비교하여농도를계산하였다. 그결과, 도 13에나타난바와같이, 혈청내지질수준은백신처리된그룹이백신처리하지않은대조군 ( 비만 ) 그룹보다전체적으로총콜레스테롤 (TC), 중성지방 (TG), HDL 콜레스테롤및 LDL 콜레스테롤수치가낮게나타났다. [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] 도면의간단한설명도 1의 (a) 는아포지단백질 CII 유전자의 PCR 산물을전기영동한사진이다 ( 레인 1: 25/100 bp 혼합 DNA Ladder, 레인 2 : PCR 산물, 2ul/well load. 2% 아가로스겔, TBE 버퍼시스템 ). 도 1의 (b) 는재조합 ApoCII/pQE30 벡터로형질전환된이. 콜라이 JM109에서단편의삽입여부를확인한전기영동사진이다. 도 2의 (a) 는 RVNP 유전자의 PCR 산물을전기영동한사진이다 ( 레인 1 : 100bp ladder (Bioneer), 레인 2 : PCR 산물, 2ul/well load. 2% 아가로스겔, TBE 버퍼시스템 ). 도 2의 (b) 는 B4RCII/pQE30 벡터로형질전환시킨이. 콜라이 JM109로부터플라스미드를분리하여 SalI 으로잘라단편이올바른방향으로삽입되었음을확인한결과이다. 도 2의 (c) 는 B4RB2/pQE30 벡터로형진전환시킨이. 콜라이 JM109로부터플라스미드를분리하여 SalI으로잘라단편이올바른방향으로삽입되었음을확인한결과이다. 도 2의 (d) 는 B4TB2/pQE30 벡터로형진전환시킨이. 콜라이 JM109로부터플라스미드를분리하여 SalI과 HindII로잘라단편이올바른방향으로삽입되었음을확인한결과이다

16 [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] 도 3은 B4RCII 융합폴리펩티드를발현하는재조합발현벡터의제조과정을나타내는개략도이다. 도 4는 B4RB2 융합폴리펩티드를발현하는재조합발현벡터의제조과정을나타내는개략도이다. 도 5는 B4TB2 융합폴리펩티드를발현하는재조합발현벡터의제조과정을나타내는개략도이다. 도 6은 pb4rcii 의유전자및단백질서열을 DNA 시퀀싱을통해확인한결과이다. 도 7은 pb4rb2 의유전자및단백질서열을 DNA 시퀀싱을통해확인한결과이다. 도 8은 pb4tb2 의유전자및단백질서열을 DNA 시퀀싱을통해확인한결과이다. 도 9의 (a) 는형질전환된에쉐리키아콜라이 (Escherichia coli) M15/pB4RCⅡ를 IPTG로 B4RCⅡ의발현을유도한후시간에따라 SDS-PAGE로분석한결과를나타낸것이다 ( 레인 M : 단백질크기마커 (NEB), 레인 1 : IPTG-유도되지않은이. 콜라이 M15, 레인 2 내지 5 : IPTG-유도 1 내지 4 시간후의이. 콜라이 M15/pB4RCⅡ. pb4tb2 도 9의 (b) 는형질전환된에쉐리키아콜라이 (Escherichia coli) M15/pB4RB2를 IPTG로 B4RB2의발현을유도한후시간에따라 SDS-PAGE로분석한결과를나타낸것이다 ( 레인 M : 단백질크기마커 (NEB), 레인 1 : IPTG-유도되지않은이. 콜라이 M15, 레인 2 내지 5 : IPTG-유도 1 내지 4 시간후의이. 콜라이 M15/pB4RB2. 도 9의 (c) 는형질전환된에쉐리키아콜라이 (Escherichia coli) M15/pB4TB2를 IPTG로 B4RB2의발현을유도한후시간에따라 SDS-PAGE로분석한결과를나타낸것이다 ( 레인 M : 단백질크기마커 (NEB), 레인 1 : IPTG-유도되지않은이. 콜라이 M15, 레인 2 내지 3 : IPTG-유도 3 내지 5 시간이후의이. 콜라이 M15/pB4TB2, 레인 4 : total soluble protein, 레인 5 : total solublized protein by 8M 요소 ). [0114] 다. 도 9 의 (d) 는토끼 (Rabbit) 항 -PB14 다클론항체를이용한 B4RCⅡ 의웨스턴블랏결과를나타낸것이 [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] 도 10의 (a) 는레진에결합된 B4RCⅡ를용출하기위해이미다졸선형농도구배를정제그래프로나타낸것이고, 도 6의 (b) 는 SDS-PAGE로나타낸것이다 (M1: NEB prestained 마커, 레인 1 : no induction cell crude extract, 레인 2 : 4hr induction cell crude extract, 레인 3 : total soluble protein, 레인 4 : total solublized protein by 8M 요소 ( 레진결합전 ), 레인 5 : flow-through, 레인 6 : wash fraction (50mM 이미다졸 ), 레인 7 : 용출조각 (500mM 이미다졸 ). 웰당각분획 7.5ul 씩을로딩함. 도 10의 (c) 는레진에결합된 B4RB2를용출하기위해이미다졸선형농도구배를정제그래프로나타낸것이고, 도 10의 (d) 는 SDS-PAGE로나타낸것이다 (1: Elpis prestained protein 마커, 레인 2 : total soluble protein, 레인 3 : total solublized protein by 8M 요소 ( 레진결합전 ), 레인 4 : flow-through, 레인 6: 용출조각 (500mM 이미다졸 ). 웰당각분획 3 ul 씩을로딩함. 도 10의 (e) 는레진에결합된 B4TB2를용출하기위해이미다졸선형농도구배를정제그래프로나타낸것이고, 도 10의 (f) 는 SDS-PAGE로나타낸것이다 (1: Elpis prestained protein 마커, 레인 2 : total soluble protein, 레인 3 : total solublized protein by 8M 요소 ( 레진결합전 ), 레인 4 : flow-through, 레인 5 : wash fraction (50mM 이미다졸 ), 레인 6 : 용출조각 (500mM 이미다졸 )-1, 레인 7 : 용출조각 (500mM 이미다졸 )-2. 웰당각분획 7.5 ul 씩을로딩함. 도 11은 B4RCII, B4RB2 및 B4TB2를주사했을때 C57BL/6 마우스그룹의체중증가를비교한그래프이다. 파란화살표는 DIO의시작점을, 빨간화살표는백신처리하는시점을나타낸다. 도 12는 B4RCII, B4RB2 및 B4TB2의접종에따른항 B14 특이적항체농도의변화를나타낸다. 도 13은백신의 3차부스팅한지일주일후 (16주령) 얻은혈청내지방성분의농도를나타낸다

17 도면 도면 1 도면

18 도면

19 도면

20 도면 5 도면

21 도면 7 도면

22 도면

23 도면

24 도면

25 도면

26 도면 13 서열목록 <110> SJ BIOMED INC. <120> Anti-obese immunogenic hybrid polypeptides and anti-obese vaccine composition comprising the same <150> KR <151> <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mimetic peptide for apolipoprotein B-100 epitope <400> 1 Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe <210>

27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mimetic peptide for apolipoprotein B-100 epitope <400> 2 Arg Phe Arg Gly Leu Ile Ser Leu Ser Gln Val Tyr Leu Asp Pro <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mimetic peptide for apolipoprotein B-100 epitope <400> 3 Ser Val Cys Gly Cys Pro Val Gly His His Asp Val Val Gly Leu <210> 4 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for terameric mimetic peptide <400> 4 gtcgaccgta atgttcctcc tatcttcaat gatgtttatt ggattgcatt cctcgaccgt 60 aatgttcctc ctatcttcaa tgatgtttat tggattgcat tcctcgaccg taatgttcct 120 cctatcttca atgatgttta ttggattgca ttcctcgacc gtaatgttcc tcctatcttc 180 aatgatgttt attggattgc attc

28 <210> 5 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for terameric mimetic peptide <400> 5 Val Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe 65 <210> 6 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rabbis virus Nucleoprotein <400> 6 Asp Val Ala Leu Ala Asp Asp Gly Thr Val Asn Ser Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly Glu Thr Arg Ser Pro Glu Ala Val Tyr Thr Arg Ile Met Met Asn Gly Gly Arg Leu Lys Arg Ser His Ile Arg Arg Tyr Val

29 Ser Val Ser Ser Asn Arg His Ala Arg Pro Asn Leu Asp <210> 7 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis B virus pres2 <400> 7 Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Ala Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Lys Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse apolipoprotein C-II <400> 8 Lys Leu Arg Asp Met Tyr Ser Lys Ser Ser Ala Ala Met Ser Thr Tyr Ala Gly Ile Phe Thr Asp Gln Leu Leu Thr Leu Leu Arg Gly Glu

30 <210> 9 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of B4RCII <400> 9 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Ala Phe Leu Asp Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Thr Asp Val Ala Leu Ala Asp Asp Gly Thr Val Asn Ser Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly Glu Thr Arg Ser Pro Glu Ala Val Tyr Thr Arg Ile Met Met Asn Gly Gly Arg Leu Lys Arg Ser His Ile Arg Arg Tyr Val Ser Val Ser Ser Asn Arg His Ala Arg Pro Asn Leu Asp Asp Glu Lys Leu Arg Asp Met Tyr Ser Lys Ser

31 Ser Ala Ala Met Ser Thr Tyr Ala Gly Ile Phe Thr Asp Gln Leu Leu Thr Leu Leu Arg Gly Glu 180 <210> 10 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of B4RB2 <400> 10 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Thr Asp Val Ala Leu Ala Asp Gly Thr Val Asn Ser Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly Glu Thr Arg Ser Pro Glu Ala Val Tyr Thr Arg Ile Met Met Asn Gly Gly Arg Leu Lys Arg Ser His Ile Arg Arg Tyr Val Ser Val Ser Ser Asn Arg His Ala Arg Pro Asn Leu Asp Leu Glu Arg Asn Val Pro Pro Phe Asn Asp Val Tyr

32 Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe 180 <210> 11 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of B4TB2 <400> 11 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Asp Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe Leu Thr Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Ala Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Lys Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Leu

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