anti-mouse IgG 등 ) 으로판매되고있으며, 자신이이용하는일차항체의급 (isotype) 에맞는효소결합항 체를구입하여사용하면된다. 3) Sandwich ELISA ( 샌드위치정량법 ); 항원의정량, 정성에이용항원이 plate에잘결합하도록, 항원에대한항체를먼저플레

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보람 군
6 years ago
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1 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay) ( 주 ) 다인바이오연구소 효소면역정량법 (ELISA) 는오늘날가장널리이용되는면역정량법이다. 이방법은 Ag-Ab interaction을이용하여 Ag or Ab를정성, 정량할수있는감도가매우우수한실험법 ( 수 ng/ml) 이다. 이방법은항체에효소를결합시켜항원-항체반응을확인하는방법으로, 그방법이간단하고비용이많이들지않으며다량분석이가능하여현재가장널리쓰이고있는항원-항체분석법의하나가되고있다. 1970년대초프랑스 (Avrameas와 Guilbert, 1971년 ) 와스웨덴 (Engvall과 Perlman, 1971년 ) 에있는두그룹에의해동시에고안되었다. ELISA라는이름에서알수있듯이이방법에는효소가이용된다. 항원의농도는기질전환정도에따라결정된다. 또한 ELISA라는명칭으로부터항체나항원이고체상에흡착 (immunosorbent) 되어있는원리가포함되어있음을알수있다. 고체상의흡착은결합하지않은자유 (free) 항원을세척을통해제거할수있도록해준다. 이방법은 mouse나 rabbit 등을 immunization한후얻은 serum이나 fusion을통하여얻은 hybridoma의 culture supernatant 안에우리가원하는 ( 즉, immunization에사용한 antigen에 specific한 ) antibody가생성되어있는지를확인하기위한실험이다. 특히이방법은방사능면역시험법 (RIA, Radio Immunoassay) 과같이매우민감한반응이면서도 RIA에서처럼방사능을사용하지않는다는이점이있어서그사용이증가되고있는방법이다. 다양한면역정량법이개발되고있지만샌드위치와경쟁적 ELISA 방법이가장빈번히이용된다. 대개의경우, 샌드위치 ELISA는높은민감도를갖는다. Direct ELISA법도사용되는데이것은항체가아닌항원이고체상에고정된다. Direct ELISA법은환자의혈청이나 hybridoma 배양상층액에존재하는항원특이적항체를검출하기위해이용된다. 항체에결합되는효소중에는간단한기질용액을넣어주면색깔을띄는반응이이용되는데, 대표적인효소로는염기성인산분해효소 (alkaline phosphatase) 나양고추냉이과산화효소 (HRP, horseradish peroxidase) 등이많이이용되고있다. 이들효소는항체분자의 Fc 지역에공유결합되도록화학반응을이용하여결합시켜사용한다. 1. ELISA 의종류 1) Direct ELISA (Direct 정량법 ) direct method 는항원과반응하는항체에바로효소를결합시켜사용하는방법을말한다. a) 항원의양을측정, b) 항체에대한표지항체가요구됨, c) 항원이요구됨 2) Indirect ELISA 항원과결합하는항체 (1차항체, primary antibody) 에는효소가없고, 그항체와결합하는항체 (2차항체, secondary antibody) 에효소가결합되어있는분석방법. 일반적으로 isotype에대한항체에효소가결합된형태 (enzyme conjugated anti-isotype antibody, 예를들어 alkaline phosphatase conjugated

a) 항원의양을측정, b) 두개의항원-특이적항체가요구됨, c) 합텐검출에적합하지않음, d) 민감도가높음 4) Competitive ELISA ( 경쟁적정량법 ); 항체의정량, 정성에이용경쟁적정량법은항체의같은결합부위에대한 2가지항원간의경쟁에의해이루어진다.

2 anti-mouse IgG 등 ) 으로판매되고있으며, 자신이이용하는일차항체의급 (isotype) 에맞는효소결합항 체를구입하여사용하면된다. 3) Sandwich ELISA ( 샌드위치정량법 ); 항원의정량, 정성에이용항원이 plate에잘결합하도록, 항원에대한항체를먼저플레이트에결합시키고, 그항체에항원을결합시킨다음, 직접법이나간접법으로조사하는방법이다. 항원의양이적을때또는미지의샘플에들어있는항원을조사할때사용한다. a) 항원의양을측정, b) 두개의항원-특이적항체가요구됨, c) 합텐검출에적합하지않음, d) 민감도가높음 4) Competitive ELISA ( 경쟁적정량법 ); 항체의정량, 정성에이용경쟁적정량법은항체의같은결합부위에대한 2가지항원간의경쟁에의해이루어진다. 2가지항원중하나는동위원소나효소에의해표지된항원이며다른하나는표지되지않은것이다. 경쟁적정량법은표지된항원, 표준곡선 (standard curve) 을만들기위한비표지된항원 ( 정량하고자하는항원 ), 항원에특이적으로결합하는단클론항체 ( 혹은항혈청 ) 및항원을포함하는시료가준비되어야한다. 시료에포함되어있는비표지된항원과항체의반응에따라반응결합물에서약한표지신호가검출되는원리이며표준곡선에의해미지시료속에포함된항원을정량할수있다. 경쟁원리에따라항체의자유로운결합부위가반응용액내에서 제한요인 (limiting factor)' 이된다. a) 항원의양을측정, b) 표지항원이요구됨, c) 항원-특이적항체가요구됨, d) 합텐검출에적합함 Fig. 1. ELISA 의종류.

3 Fig. 2. 경쟁적, 샌드위치정량법의전형적인표준곡선. 경쟁적정량법에서는항원의농도가증가함에따 라표지신호가약해지는반면샌드위치정량법에서는항원농도증가에따라신호가증가한다. 2. 코팅 (coating), 블로킹 (blocking), 세척 (washing) 1) 코팅 ELISA의첫번째단계는항체혹은항원을고체상에결합시키는 ' 코팅 (coating)' 이라는과정이다. 대체로 96-well microtiter 플레이트가고체상재료로이용된다. 항체나항원의흡착 (adsorption) 이일반적인코팅방법이다. 폴리스티렌재질의 microtiter 플레이트는유난히단백질이잘부착한다. 이러한단백질결합은소수성결합이며대부분의경우에 PBS (ph 7.4) 나 sodium carbonate 완충용액 (ph 9.6) 을용매로사용한다 (Table 1). Table 1. 코팅, 블로킹, 세척을위한용액 1 Milk powder( 분유 ) 는따뜻한 PBS 에잘녹는다.

4 실험자가항체나항원의안정성을위해사용할코팅완충용액을결정해야한다. 또한분석에요구되는코팅할적당한항체혹은항원의농도를 μg / ml의범위내에서실험적으로결정해야한다. 더높은농도를이용하면불안정한 2중혹은다중항체혹은항원층이형성되어역효과가나타난다. 코팅은대체로 96-well 플레이트의한 well 당항체혹은항원을포함하는코팅완충용액을 μl를첨가한후 2-8 에서밤새 (10~18 시간 ) 반응시킨다. 실험중여러번의세척과정동안에항원 항체복합체가손실되는것을피하기위해서항체혹은항원을광화학반응에의해활성화된폴리스티렌 microtiter 플레이트에공유결합시켜코팅하는방법도있는데, 이방법은 carbonate-bicarbonate 완충용액 (ph 9.6) 내에서 45분만에코팅이가능하므로시간을절약할수있다는장점이있다. 2) 블로킹비특이적으로흡착된효소-표지항체혹은항원분자에의해생성되는이면활성도 (background activity) 는 ELISA 정량법에문제를야기시킨다. 따라서자유단백질결합부위의블로킹은이면활성도를최소화하기위해반드시필요한단계이다. BSA, FCS, 카제인, 젤라틴등이블로킹에이용된다. 그중경제적인방법은수퍼마켓에서흔히구할수있는분유 (milk powder) 이다. 10 mm PBS % BSA가전통적인블로킹시약으로종종이용된다. Tween 20, Nonidet P-40, Triton X-100과같은비이온성세제를 % 의농도로표지항체혹은항원과반응시첨가하면특이적인항원 항체결합은방해하지않으면서고체상에대한비특이적인흡착을감소시킬수있다. 3) 세척 각각의반응단계사이에행하는세척은훌륭한표준곡선과만족할만한 ELISA 결과를얻기위해필수적이다. 세척단계에서 PBS, saline, PBS-세제, 수돗물등을사용할수있다. 보편적인세척완충용액은 PBS/0.05% Tween 20이다 (Table 1). 3. 효소와기질 ELISA에이용되는효소에는소의혈청으로부터추출한 horseradish peroxidase (HRP) 와 alkaline phosphatase (AP), Escherichia coli로부터추출한 β-galactosidase, Aspergillus niger로부터추출한 glucose oxidase 등이있다 (Table 2).

5 Table 2. ELISA 에이용되는효소와기질 효소최적 ph 기질효소의 검출제한 [mol/l] 효소 - 표지 lgg 의 검출제한 [ng/ml] Horseradish peroxidase 5-7 H 2 O 2 /ABTS (c) H 2 O 2 /opd (c) H 2 O 2 /TMB (c) H 2 O 2 /HPPA (f) Alkaline phosphatase 9-10 pnpp (c) MUP (f) x x β-galactosidase 6-8 onpg (c) MUG (f) 2 x x Glucose oxidase 4-7 Coupled reaction with peroxidase; addition of glucose, peroxidase, and substrate for the peroxidase (c); chromogenic substrate, (f); fluorimetric-detectable substrate, ABTS; 2,2-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin)-6-sultanate, HPPA; 3-(phydroxyphenyl) propionic acid, MUG; 4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside, MUP; 4-methylumbelliferyl phosphate, onpg; o- nitrophenyl-β-d-galactopyranoside, opd; o-phenylenediamine, pnpp; p-nitrophenyl phosphate, TMB; 3,3,5,5 -tetramethylbenzidine. 효소활성도는색변화 (colorimetric-), 형광 (fluorimetric-) 혹은발광 (luminometric-) 검출성기질에의해검출될수있다. 색변화를보이는기질이널리이용되며다음과같은장점이있다 : 1 반응을멈추어도색깔을띠는최종산물이오랜시간동안안정적으로유지될수있다. 2 선별과정중, microtiter 플레이트를빠르게시각적으로감지할수있다. 3 상대적으로값싼광도계로빠르게산물을측정할수있다. 형광및발광-검출성기질을이용하여측정하면민감도를대략 2-10배증가시킬수있지만측정장비가비싸고최종반응물이빨리사라진다. 그러나측정할수있는시료가제한되어있는경우에형광-검출성기질을이용하면검출시시작용액부피를감소시킬수있기때문에유용하다. 표 2-2에서 ELISA 이용되는효소와기질을나타내고있다. 만약민감도가특히중요한정량법이라면효소는 HRP, 기질은형광-검출성기질인 HPPA 혹은색변화-검출성기질인 TMB를이용할수있다.

6 4. ELISA 실습 Fig. 3 에전형적인샌드위치 ELISA 와경쟁적 ELISA 방법을비교하여도식화하였다. 제시된반응시간은 특정실험실에서실험적으로증명된방법이다. Fig. 3. 샌드위치 ELISA 와경쟁적 ELISA 방법에대한모식도. 효소반응은적당한 ph 의특정완충용액에서의기질첨가로시작된다. 각각의효소에대한적정 ph 와 기질을 Table 2 에서나타내었다. 효소반응을끝내기위한정지용액을첨가한다 (Table 3). Table 3. ELISA 에이용되는효소와기질 기질정지용액측정파장 ABTS opo TMB pnpp onpg 1M citric acid % NaN 3 2.5M H 2 SO 4 2.0M H 2 SO 4 3M NaOH 1M Na 2 CO nm 490 nm 370 nm (without stop solution) 450 nm (after addition of H 2 SO 4 ) 405 nm 405nm ABTS; 2,2-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin)-6-sultanate, onpg; o-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside, opd; o-phenylenediamine, pnpp; p-nitrophenyl phosphate, TMB; 3,3,5,5 -tetramethylbenzidine.

7 적절한지점에서반응을정지시킨후효소 - 기질반응의산물을적당한파장에서측정한다. Table 4 에서는 ELISA 할때예기치못한문제가발생하였을때극복하기위한방법을요약하고있다. Table 4. ELISA 실험문제발생시해결책 문제가능한문제발생이유해결책 높은이면도 불충분한세척으로인한기질용액의 오염 더세척하거나다른세척 buffer 를이용 기질용액의색이없어져야함 ; 새로운용액이용 호소접합물의불충분한희석 불충분한블로킹 효소접합물을더희석함 다른블로킹시약을이용 신호가없거나약한신호 Avidin 효소접합물을이용할때 : 접합물의비특이적인결합 불충분한코팅 Avidin은다른표면에쉽게비특이적으로결합하므로최대 15 분으로반응시간을최소화하거나 streptavidin-효소접합물을이용코팅 buffer내항체나항원농도를증가다른코팅 buffer 이용 효소접합물의과희석 희석배율을낮춤 불량표준곡선및동일 시료의다중결과값 반응시효소저해제가포함반응시간이너무짧음시료를덜섞었을때 Microtiter plate가더러움 NaN 3 는 horseradish peroxidase를저해함. 다른효소를이용하거나저해제없는시료 buffer를이용함. 반응시간을늘림모든표준시료, 시료를완전히섞어줌깨끗한 plate를이용 5. References 1) 재미있는분자생물학그림여행 Biomedical research Lab, 유욱준, 신인철, 분자방, ) 3) 4)

Chapter 14

Chapter 14 5 주 Gycoysis 5.1 Gycoysis의일반적특징 Gycoysis - Gucose가 degradation 과정을거쳐두개의 pyruvate를형성하는과정. - 이때발생하는 free energy는 ATP와 NADH로보존됨. - Gucose 2 Pyruvate - ADP phosphoryation을통하여, ATP 형성 - NAD + 로 hydride ion