Nuclease (핵산 분해 효소)

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준용 마
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1 7. Nuclease ( 핵산분해효소 )

2 Nuclease Nuclease 란? DNA 를중합하는 DNA polymerase 와는달리핵산을분해하는효소 Nuclease 의중요성 생체내에서는항상핵산을분해하는일이일어나고있으므로생명현상을공부한다는점에서중요 실제의분자생물학실험에서 polymerase 보다더자주쓰이고있기때문에중요

3 Nuclease Nuclease 를실험에이용할때염두해두어야할내용 Sugar specificity : Nuclease 가작용하는기질이 DNA 인지 RNA 인지알아야함 Endonuclease, 또는 exonuclease 인지알아야함 Exonuclease 라면 5 exo 인지 3 exo 인지알아야함 ss DNA-specific 한지 ds DNA-specific 한지를구별해야함 분해산물의 phosphate group 이 3 에남아있는지또는 5 에남아있는지알아야함 Base specificity : trna 가만들어지는과정에관여하는 RNase 들과같이핵산의특정염기를인식하고절단하는 RNase 가있는반면 DNase 중에는그러한것이없음

4 Nuclease Nuclease 를실험에이용할때염두해두어야할내용 Chop or nick : 핵산을절단할때양쪽가닥을모두절단하는지 (chopping) 한쪽가닥만절단하는지를 (nicking) 알아야함 Processivity : Exonuclease 의경우핵산에결합한후얼마나많은 nucleotide 를분해하고나서분리되는지를알아야함 Nuclease 의반응을위해 Mg 2+, ATP, S-adenosyl methionine 과같은 cofactor 가필요한지를알아야함 Substrate size : 어떤 nuclease 는길이가짧은 DNA 를잘절단하는가하면어떤것은긴 DNA 를선호하는것처럼보이는실험결과를얻을때가있음

5 8. DNA Ligase (DNA 연결효소 )

6 DNA Ligase 란? DNA 복제및수복때 2 중나선중한쪽사슬의절단부인 3'- 하이드록시기와 5'- 인산기를포스포디에스테르결합시키는효소 효소적특성, kinetics, 반응 mechanism 이완전이규명된효소 DNA Ligase 의발견 Okazaki, Messelson : DNA 를연결시켜주는 DNA ligase 의존재를주장 DNA ligase 의양이부족한 mutant 들이만들어졌는데이들 mutant 에서는 Okazaki fragment 가큰 DNA 로연결되는과정이느려지는현상과 recombination 이보다빈번히일어나는현상이관찰되었다.

7 DNA Ligase 의발견 Ligase activity 를발견할수있는몇가지독립적인분석 system 1 Gellert : Lambda DNA 의 sticky end 가 circular form 이된후생기는두개의 nick 을 ligase 가연결시켜주면이때생기는 covalently closed circular (CCC) form 의 DNA 를 alkaline sucrose gradient centrifugation 으로분리하여정량하는방법으로 assay 하였다. (alkaline 조건에서는 ligation 된 DNA 반응물이대단히 compact 한구조를이루기때문에 s 값이매우커지며이방법은분석시간이오래걸리는단점이있다.)

9 DNA Ligase 의발견 Ligase activity 를발견할수있는몇가지독립적인분석 system 2Richardson, Lehman, Hurwitz : DNA 의 nick 부위에있는 5 phosphate 를 32 P 로치환해주고여기에 ligation 이일어나면 phosphatase 가 32 P 로 label 된 phosphate 를떼어내지못하게되는현상을이용하여분석하였다.

11 DNA Ligase 의발견 Ligase activity 를발견할수있는몇가지독립적인분석 system 3Cozzarilli : Oligo dc 가붙은 cellulose 에 poly di 와동위원소로 label 된 oligo dc 를넣어주고 ligation 반응을수행후 alkali 로 denaturation 시켜 oligo dc 에연결되지않은 label 된 oligo dc 를 제거한후 filter 에 cellulose 를걸러쉽게 분석하였다.

13 DNA Ligase 의특성 새로운효소가발견되었을때가장먼저수행하는 kinetics 실험 substrate 의양을충분히많이넣어준상태로효소농도 ([E]) 를증가시켜주면서반응속도를관찰한다.

14 DNA Ligase 의특성 Bacteriophage T4 로 infection 된 E. coli 를터뜨린 extract 를효소로사용하여실험한결과 1st order kinetics 를보이지못하고 lagging period 가나타난다는사실이발견 이 lagging period 동안에는반응에필요한 cofactor 가부족했었다는것을알게됨 T4 DNA ligase 가필요로했던 cofactor 를추적하여분석한결과 cofactor 는바로 ATP 였음이밝혀졌으며추후실험을통하여 E. coli DNA ligase 의경우에는 ATP 대신 NAD 가 cofactor 로쓰이고있음을알게됨 NAD 는본래전자전달계에서쓰이는물질이지만 E. coli DNA ligase 경우는 NAD 가 high energy bond donor 로사용되고있음을알게됨 ATP 와 NAD 는 AMP 구조를공통으로가지고있으며바로이 AMP 가 DNA ligation 반응에서 energy relay 에이용

15 DNA Ligase 특성 DNA Ligase

16 DNA Ligase 의특성 Kinetics DNA ligase 는전형적인 double displacement kinetics 를따른다

17 DNA Ligase 의특성 Reaction mechanism

18 DNA Ligase 의특성 DNA ligase 의반응메커니즘을규명하게해준몇가지실험내용들 1 DNA independent pyrophosphate (PPi) exchange 가일어난다. : DNA 가없는상태에서 32 P 로 label 된 pyrophosphate 와 label 되지않은 ATP 를넣어주면 ligase 에의하여 DNA 가없어도 label 된 ATP 와 label 되지않은 pyrophosphate 가얻어진다.

19 DNA Ligase 의특성 DNA ligase 의반응메커니즘을규명하게해준몇가지실험내용들 2 DNA ligase 에 AMP 가공유결합으로결합한다. : -32P ATP 를사용하였을경우 32P 로 label 된효소를얻을수있다. AMP 가결합된 ligase 를 adenylated ligase 라고하는데이것을분리하여가수분해하면 AMP 는 ligase 의 Lysine residue 에연결되어있음을알수있다. Adenylated enzyme 에 nicked DNA 를섞어주면 ATP 없이도 ligation 이일어나는것으로보아이것은 ligation 과정의 true inter mediate 임이틀림없다.

DNA Ligase 의특성 DNA ligase 의반응메커니즘을규명하게해준몇가지실험내용들 3 Activated nick 의존재 : Activated nick 은 AMP 가 nick 의 5 phosphate 에붙어있는상태의 transient 중간체이기때문에쉽게분리되지않는다.

20 DNA Ligase 의특성 DNA ligase 의반응메커니즘을규명하게해준몇가지실험내용들 3 Activated nick 의존재 : Activated nick 은 AMP 가 nick 의 5 phosphate 에붙어있는상태의 transient 중간체이기때문에쉽게분리되지않는다. 그러나 Dideoxyneucleotide 를사용하였을경우에는 3 hydroxyl group 이없기때문에다음단계로넘어가지못하고 transient 중간체가축적될수밖에없으므로 activated nick 의분리가가능해진다. Activated nick 은처음부터화학합성을할수도있으며합성된중간체에 free(unadenylated) ligase 를섞어주었을때 ligation 이일어나며이때 adenylated enzyme 을넣어주면아무반응도일어나지않는것으로보아이 transient 중간체는 true 중간체임을알수있다.

21 DNA Ligase 의특성 DNA ligase 의반응메커니즘을규명하게해준몇가지실험내용들 4DNA ligation 반응은거의비가역적인반응이지만 supercoiled DNA 에 ligase 와 excess AMP 를넣어줄경우순간적인역반응이일어나고그역반응은곧다시정반응으로되돌아가게된다. 이때 supercoiled DNA 는 relaxed form 으로풀리는결과를초래한다.

23 DNA Ligase 의특성 Substrate specificity DNA ligase 는 nicked DNA 를 ligation 시켜주는역할을하지만 sticky end DNA 와 blunt end DNA 도 ligation 시켜줄수있다. DNA ligase 가고려하는것은어디까지나 ligation 반응이일어난후의구조가 B form helix 인가에대한것이다. 따라서 ligation 이일어나기직전의 DNA 모양이 sticky end 이건 blunt end 건관계없이 ligation 반응을수행할수있다. 다만 blunt end ligation 의경우에는 helix 의외형에준하는모양이만들어질확률이 sticky end 인경우보다어렵기때문에 100 배이상높은효소가필요하다.

Chapter 4. Bacteria (the first microbes)

Chapter 4. Bacteria (the first microbes) - DNA 정제후클로닝을위한효소적절단과연결필요 -> restriction enzyme, ligase 가중요 1. DNA 조작효소범위 - 촉매반응에따라 5 분류 1. Nuclease : 핵산분자의절단, 단편화 2. Ligase : 핵산분자의연결 3. Polymerase : DNA 사슬합성 4. Modifying enzyme : 화학기능기의첨가, 제거 5. Topoisomerase