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진모 강
5 years ago
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1 Product News Letter 4 호 User s Guide for Ligation Independent Cloning Inspect into "Overlap Cloner" Cloning 의일반적인방법 미래기술 Recombineering "Overlap Cloner" 의원리와응용분야 자주하는질문 Trouble Shooting 은단백질전문기술기업입니다기술혁신형중소기업입니다고객상담전화 ISO9001 인증기업입니다 ( 주 ) 엘피스바이오텍은단백질전문생명공학기업입니다

2 Cloning 의일반적방법 Gene cloning은현대분자생물학의핵심기초기술로서유전자의기능, 구조연구는물론유용단백질의기초연구및산업적활용분야에이르기까지필수적으로사용되는가장기초적이면서가장중요한위치를차지하고있는기술입니다. 1970년대초반, 제한효소 (restriction enzyme) 그리고 DNA ligase와같이유전자의절단과연결에필수적인효소들이발견되면서독립적인두 DNA 분자를절단하거나연결할수있는유전자조작의방법적가능성이제시되고, 환상 DNA의제작과대장균으로의형질전환방법이확립되면서 cloning으로명명되는본격적인유전자조작의시대가열리게되었습니다. 제한효소와 DNA ligase를사용하는이와같은전통적인 cloning 방법은현재까지도널리사용되는가장기초적인유전자조작방법이지만다루고자하는 DNA 조각의크기에한계가있다는점과함께제한효소자리의유무가모든것을결정하는치명적인제약을가지고있었고또한절단 / 연결로이어지는과정에서정제 / 조작 / 정제의순환반복으로인한시간적소모성이크다는단점이있었습니다. 또한연결하고자하는 DNA의중간부분에사용할제한효소자리가하나또는그이상으로존재하는경우, 적합한다른제한효소를찾아보거나중간의제한효소자리를변형 / 제거하는지루한작업으로인해 cloning의완성도는실험자의경험과지식에따라달라지는, 즉유전자디자인의완성도에따라결과의품질이달라지는양상을보여왔습니다. 현대분자생물학의또다른핵심기반기술인 PCR (polymerase chain reaction) 방법의발전과함께 cloning 방법도비약적으로발전하였으나여전히제한효소 /DNA ligase를이용하는시스템의전략적변화없이 50년의세월이흘렀습니다. PCR 산물의 cloning에오랜동안사용되어온 TA cloning 방법역시제한효소 /ligase를이용하는틀을벗어나지는못한기술이었고 ligase independent 기술의일종인 Topo cloning 방법은여전히마이너기술로서이를대체하지못하고있는실정입니다. 이러한점에주목하면서 cloning 방법의일반적인방법들을개발순서별로정리해보고최근미래기술로각광받고있는 "recombineering" 의장점과중요성에대해부각함으로써본글에서강조하고자하는 overlap cloning 방법의장점과편리성그리고중요성에대해말씀드리고자합니다. 앞서언급한대로제한효소 /DNA ligase를이용하는유전자조작방법은지금도여전히 cloning 목적의실험방법에있어서는대세를이루고있으며어떤방법이제시되더라도가장보편적인유전자조작툴로서의위치는확고하여앞으로도크게변하지않을것으로예측하고있습니다. 그러나예전과달리다량의유전자를다뤄야하는상황이많아지고유전자들의정보가기하급수적으로쌓이면서보다간단하고조작이용이하며한번이라도손이덜가는새로운방법들에대한끊임없는탐구가이루어져왔습니다. 특히한번에많은유전자들의기능을같은조건에서살펴보고자하는 high-throughput 분석시스템들이 lab수준에서이루어지는기능연구는물론기업체가주도하는의약학분야에서도활발히적용되면서새로운 cloning 방법의필요성은더절실해지고있는실정입니다. 90년대초반에 Aslanidis와 de Jong에의해제시된 LIC (ligation independent cloning) 방법은 T4 DNA polymerase의 exonuclease 활성을이용하여상보적인 base pairing을만들어준후두개의 DNA 조각을이어붙인다는원리에근거를두고완전히엉뚱한방향의 cloning 방법을제시하였지만 vector를준비하는과정이비교적까다롭다는이유로실험자들의외면을받을수밖에없었습니다. 이후 uracil DNA glycosylase (UDG) 효소를이용하는방법, exonuclease 효소를이용하는방법, type IIs 제한효소를이용하는방법, circular PCR을이용하는방법등다양한방법들이꾸준히제시되어왔으나논문으로서만그칠뿐실제로제품화되고상용화된기술은 T4 DNA polymerase를이용하는방법정도였습니다. 또다른방향에서는 topoisomerase를이용한 PCR cloning system 개발과이를이용한 directional cloning 방법의개발이꾸준히이루어져왔고, Cre/loxP, Flip/Flop, lambda Integrase/exisionase 등의 site-specific recombinase 효소들을이용하는 system 들이거의동시간대에개발되어다수의유전자조각들을빠르게 cloning하고분석할수있는기술적실마리를얻게되었습니다. 현재다양한제품들이상용화되어판매되고있지만 (Invitrogen사의 Gateway, Clontech사의 Creator, Gene Bridges사의 Red/ET) 사용자의수적측면에서는이방법들또한여전히제한적인것또한사실입니다. 필자의경우에도 site-specific recombination 방법인 lambda Integrase/exisionase 효소를이용하는시스템을 10여년전완벽히구축해놓고도일절사용을하지않았습니다. 그이유는재조합과정에반드시있어야하는 DNA 특이서열의추가로인해불필요한아미노산군더더기서열이붙을수밖에없는구조라는점이너무나큰단점으로대두되었기때문입니다. 결과적으로 native 상태의최종단백질산물을얻기위해서는별도의 subcloning 작업을거치거나또는군더더기를없애기위한추가작업을해야하는번거로움이오히려방법자체의편리성보다더강한단점으로작용한결과라할수있습니다. 다만실험적편리성에있어서는기존의제한효소 /DNA ligation 방법에비해월등한진보가있었음을부정할수는없을것입니다. 이후상동서열의재접합기술을이용한다양한제품들이출시되었고 (Clontech사의 In-Fusion, System Biosciences사의 Cold Fusion, GenScript사의 CloneEZ), 기존의 site-specific recombination 방법들의단점들을보완할수있는대체기술로떠오르고있습니다. 그러나가격적인문제와함께, 서열의크기와 DNA의조각의갯수제한그리고까다로운반응조건등이약점으로평가되고있습니다. 하지만 2000년대이후꾸준히제시되어온 sequence & ligation independent cloning (SLIC) 기술에가장근접한기술들로평가할수있습니다. 결론적으로, 현재 cloning 기술은 1) 빠르며 2) 조작이간단하고 3) 정확하며 4) 한번에많은 sample을다루는데불편함이없고또한 5) cloning하고자하는 DNA 조각의크기제한이나 6) DNA 조각의갯수제한이적은조건들을충족할수있는방향으로개발되고있습니다. 한 vector로부터목적 vector로의유전자전달즉 subcloning이한층간편하고유전자조각들끼리의 hybrid fusion이쉬우며 cloning error가적은새로운유전자 cloning 방법의개발은향후유전자를이용한의약학생물산업의발전에있어서가장중요한역할을담당하게될것으로믿어의심치않습니다. 이러한관점에서저희엘피스바이오텍에서개발하여제품으로출시하게된 Overlap Cloning 기술은보다편리하고정확한 cloning 방법의새로운패러다임을제시해드릴것입니다.

3 미래기술 Recombineering 재조합을의미하는 Recombination과공학을의미하는 Engineering의합성어인 "Recombineering" 은생물체가가지고있는다양한재조합방법들이밝혀지면서이를인위적으로이용하여생물의염색체수준에서특정유전자서열을추가또는제거, 변형하는등인위적인조작을가하거나또는유전자조각을보다간편하게다루고자하는목적을위해지속적으로개발되어왔습니다. 간단하게는 bacteriophage의 recombination system을이용한방법들에서부터최근소개되어각광을받기시작한 CRISPR/Cas9 system에이르기까지다양한방법들과기술들이개발되어왔으며폭넓은분야로적용범위를넓히고있는상황입니다. Recombineering 을이용한유전자조작기술은기존의방법들이할수없었던거대유전자의조작을가능하게하였으며, 염색체수준에서의염기서열조작 을용이하게했고, 무엇보다도간단한원리와조작과정으로인해실험적편리성을제공하고있기때문에향후미래의전략기술로사용될가능성이점점더 높아지고있습니다. 이는제한효소 /ligation 시스템으로는엄두도내지못하던일들이었기때문에그가치는더높아질것으로예상하고있습니다. 생물체는다양한재조합시스템을가지고있으며이를 in vitro 에서적용하기위한연구의발전속도와 recombineering 의발전속도는비례해왔다고볼수 있습니다. 유전체를대상으로하는분야는본글의핵심을벗어나는분야이므로 recombineering 분야전체보다는범위를축소하여 in vitro 에서적용가능 하고누구나하고있는일이지만항상어렵게만느껴지는기존의 cloning 방법들을대체하여사용할수있는기술을위주로설명하고자합니다. Overlap Cloner 의원리와응용분야 Overlap Cloner는유전자의상동재조합 (homologous recombination) 을 in vitro 에서구현한기술로서 DNA 조각의각말단에 15 bp 이상의크기로동일서열을갖는두유전자조각을이어붙이는방식에기초하고있습니다. 이방식의유전자연결방법은 site-specific recombination을이용한방법에서처럼 attb/p나 loxp와같은특별한염기서열을필요로하지않으며제한효소자리의유무에영향을받지않고또한유전자를실험자의의도에맞게맞춤재단으로임의조작할수있다는큰장점을가지고있습니다. 또한말단에상동서열만있으면중간서열이다른두개이상의유전자조각을한 tube에섞어준후한번반응하는것만으로도어렵지않게여러 DNA 조각들을이어붙일수도있기때문에다수의서로다른유전자조각들을이어붙여, 기존에는존재하지않았던새로운유전자를재창조할수있다는기술적이점도제공하고있습니다. 지금까지두세개이상의유전자를이어붙여야하는경우에흔히사용하던방법들은일련의 subcloning 과정을반복하거나또는 overlapping PCR 방법을사용하는것이고작이었으나두가지방법모두결과가나오기전까지는성공여부를가늠하기가어려웠습니다. 그이유는이러한방법들이실험자의손을많이타는실험방법이라는것과또한최종산물을얻기까지의시간이오래걸린다는단점을가지고있었기때문이었습니다. 이러한문제점들을한방에해결한기술이 Overlap Cloner 기술입니다. 저희연구실에서성공가능한 DNA 단편의최대수를시험해본결과 4개조각까지는 90% 이상의효율로연결이가능하며 6개조각의경우는 transformation 효율이떨어지지만제대로이어진클론을얻는데문제가없는, 성공적인결과를얻을수있었습니다. DNA 1 Linear Vector DNA 2 Overlap Cloner 37 C min DNA 1 DNA 2 Cloned Vector 제한효소자리를이용하거나또는 site-specific recombination을이용하는경우에대두되는또하나의문제점은유전자조각이나또는발현산물인단백질에불필요한염기서열이나아미노산서열이추가된다는점입니다. 가장간단하게하더라도 6 bp를인식하는제한효소자리는두개이상의아미노산을최종발현단백질에추가하게되는데최종적으로완벽한 native 조건의단백질을얻고자하는경우라면제한효소자리에의한아미노산의추가가충분히문제될수도있는상황으로서이를원래의 native 조건으로만들기위해서는 protease를사용하는등의복잡한추가과정을거쳐야만했습니다. Site-specific recombination을이용하는방법에있어서는 attb에는 8개그리고 LoxP에는 11개의추가아미노산들이발현단백질에추가되며이정도크기의추가아미노산들은발현단백질의본래기능에영향을줄수도있는크기나구조를형성할가능성도있습니다. 그러나 Overlap Cloner를이용하는유전자제작방법에서는불필요한염기서열의추가없이 100% native 조건의발현산물을얻을수있으며그여부는실험자의서열디자인에따라서완벽하게결정된다는것입니다. 즉원하는모든서열을 100% 임의조작가능하다는얘기이며그어떤방법보다도가장깔끔한 cloning 결과를얻을수있는방법이기도합니다. 실제로 Overlap Cloner 방법을이용하여, 상용화된 vector 내에서불필요한서열들을임의로제거함으로써정확한기능의최소단위로이루어지는깔끔한 vector를만드는데현재이용하고있으며, vector의각활성서열들을카세트 (gene cassette) 로제조하여필요에맞게맞춤 vector를만들기도하고있습니다. 세계적으로는합성생물학 (synthetic biology) 분야에서새로운유전자또는유전자복합체의인위적합성에많은연구를하고있으며최소유전자단위를 biobrick으로합성하고이를재조합하고자하는노력을진행하고있습니다 (Shetty et al., Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5 (2008)).

4 다음의모식도는 Overlap Cloner 를이용해적용가능한실험들의예를보여주고있습니다. 가장보편적이며많이사용하는실험적내용만을요약한것으로 서 Overlap Cloner 의적용분야는무궁무진하며이는실험자의상상력에따라그영역이달라질수있습니다. PCR Cloning Multiple Fragment Ligation Subcloning Library Construction Doner Vector PCR Product Linearized Vector DNA Fragments with homology at their ends Linearized Vector Restriction Enzyme Cut Linearized Vector DNA Library with different size Linearized Vector Vector Library Recombinant Vector Recombinant Vector Recombinant Vector 상동서열 (>15bp) Overlap Cloner는또한 DNA의양말단이 100% 일치하지않는경우, 즉불일치서열이말단쪽으로추가되어있는경우에도작동하며, 효율은불일치서열의길이에비례하여줄어드는경향을보이지만기존의다른 cloning 기술들을이용해서는상상도할수없었던다양한유전자조작의기술적실마리를제공하고있습니다. 그예중하나가 gene fishing의가능성을열어주었다는것입니다. 본회사의연구실에서는 gene fishing 가능성에대해현재다각도의연구를진행하고있습니다. Gene Fishing DNA Library in vitro or in vivo Linear Bait Vector with HomologousSequence Gene Clone Captured by Bait Vector Products Qty Cat. No. 가격 ( ) OVERLAP CLONER DNA Cloning Kit 샘플은 5 회사용량으로제공됩니다. 본제품에는 competent cell 이포함되어있지않습니다. 1,000 회분량이상도저렴한가격에구매가능합니다. Kit 구성 : - Overlap Cloner Enzyme Mix - Overlap Cloner 10x Reaction Buffer - Control Vector - Control Insert (LacZ DNA) 25 rxn EBK , rxn EBK ,000 No Restriction, No Ligation, 10~40 kbp 의큰 DNA 까지, 4 개까지의유전자조각도, 90% 이상의높은효율로, 짧은시간동안, 완전정확하게, 그리고저렴하게 Cloning 을할수있습니다 제품문의 : elpis@elpisbio.com

Overlap Cloner 를이용한실험예 Vector DNA 의준비 : 1. 제한효소절단을이용한 vector 준비 : Cloning 에사용하고자하는 vector 를제한절단하여선형화한후반응에사용할수있습니다. 단하는것이 self-ligation 을방지하여효율을높일수있는방법입니다. 이때가능하면, 두가지다른종류의효소를이용하여절 2.

Cloning 하고자하는부위의염기서열과 insert DNA의말단상동성부위 (15 bp 이상 ) 를포함한 primer를이용하여 vector를 template로 PCR 하는방법입니다. 이때 PCR에는 PCR error가적은 Pfu 계열의중합효소사용이필수적이며반응에사용하기전 template를 Dpn I 제한효소로제거해주는과정이필수적입니다.

이때, 양쪽말단에 vector DNA 말단과상동서열을가지고있어야하며, 서열의확보가용이치않은경우다음과같이 PCR을이용하는방법으로 inset DNA를준비합니다. 2.

5 Overlap Cloner 를이용한실험예 Vector DNA 의준비 : 1. 제한효소절단을이용한 vector 준비 : Cloning 에사용하고자하는 vector 를제한절단하여선형화한후반응에사용할수있습니다. 단하는것이 self-ligation 을방지하여효율을높일수있는방법입니다. 이때가능하면, 두가지다른종류의효소를이용하여절 2. Inverse PCR을이용한 linear vector 준비 : 적절한제한효소위치가없는경우이거나또는임의의상동부위를넣어주고싶은경우, inverse PCR을수행하여 vector를준비할수있습니다. Cloning 하고자하는부위의염기서열과 insert DNA의말단상동성부위 (15 bp 이상 ) 를포함한 primer를이용하여 vector를 template로 PCR 하는방법입니다. 이때 PCR에는 PCR error가적은 Pfu 계열의중합효소사용이필수적이며반응에사용하기전 template를 Dpn I 제한효소로제거해주는과정이필수적입니다. Vector Template Inverse PCR Linear Vector Insert DNA의준비 : 1. 제한효소를이용하는경우 : Insert DNA를잘라낼수있는양쪽의제한효소를이용하여자른후 gel extraction을통해단일 DNA 조각으로정제한후 cloning에사용합니다. 이때, 양쪽말단에 vector DNA 말단과상동서열을가지고있어야하며, 서열의확보가용이치않은경우다음과같이 PCR을이용하는방법으로 inset DNA를준비합니다. 2. PCR을이용하는경우 : PCR을이용하여 vector를준비하는방법에서처럼, vector의말단부위와상동부위 (15 bp 이상 ) 를가질수있도록 primer를합성하여 PCR을한후정제하여 cloning 반응에이용할수있습니다. 이때, 재조합에사용되는추가서열에제한효소위치를넣어주면 cloning의성공여부를확인하는과정에서유용하게사용될수도있습니다. PCR Insert DNA 3. 두개이상의 insert DNA를이어붙이고자하는경우 : Overlap Cloner의가장중요한장점인여러조각의 DNA를추가부분없이이어붙이고자하는경우, 각 DNA의상동부위를그림과같이순서대로만들수있도록디자인된 primer를이용해 PCR을하고 vector DNA와섞은후반응하여 cloning하면됩니다. 이때, 각상동부위가유사하지않도록하는것이클로닝효율에도움을줍니다. PCR 실험예 1 : Subcloning 한 vector 에들어있는 insert DNA 를다른 vector 로옮기고자하는경우로서 vector 내에존재하는상동서열에대한 primer 로 vector DNA 를 inverse PCR 로 준비하고 insert DNA 를 PCR 로준비한후 DNA 단편을정제하고 Overlap Cloner 로반응하여 E.coli 에 transformation 하였음 Vector DNA Insert DNA 1 Insert DNA 2 Ligation reaction by overlap cloner 1. Vector DNA : prepared by PCR 2. Insert DNA 1 : prepared by PCR 3. Vector Insert DNA 1 : Overlap Cloner 4. Insert DNA 2 : prepared by PCR 5. Vector Insert DNA 2 : Overlap Cloner 37 C, 30 min, 10 ml reaction Transformation, Overnight growth on LB/Amp plate, Colony picking & growth, Colony PCR Red arrow : Vector Insert fusion DNA 1 ml transformation to DH5a competent cells Colony picking & growth PCR with specific primer pair PCR, colony #

Cell number Cell number Cell number 실험예 2 : Multi Fragments Fusion Ligation 3 kbp의 LacZ 유전자서열을 20 bp정도의상동서열을가지도록여러조각으로나눈후, linearized

DNA preparation LacZ M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2 조각 1 : vector 2-3 : 2 fragment 4-6 : 4 fragment 4, 6-11: 6 fragment 4 조각 Transformation :

colony 4 : 4 fragment white colony 5 : 6 fragment blue colony 6 : 6 fragment white colony 6 조각 실험예 3 : Overlap Cloner 반응의최적화 : DNA 농도,

kit에제공하는 enzyme 1 ml를사용했을때, 약 300-400 ng의 DNA를사용하고 37 C에서 30-60 분반응하는조건이최적임을알수있었음.

) Overlap Cloner의반응조건에따른효율변화 Enzyme Concentration M 1 2 3 4 5 6 DNA Concentration M 1 2 3 4 5 6 Reaction Time M 1 2 3 4 5 * Red arrow :

0625 μl DNA 농도는동일 M : marker 1 : 200ng 2 : 100ng 3 : 50ng 4 : 25ng 5 : 12.5ng 6 : 6.

6 Cell number Cell number Cell number 실험예 2 : Multi Fragments Fusion Ligation 3 kbp의 LacZ 유전자서열을 20 bp정도의상동서열을가지도록여러조각으로나눈후, linearized vector와섞고하나의 tube에서반응하여 LacZ 활성을갖는정상적인 LacZ 유전자가만들어지는지의여부를 blue/white screening 방법으로확인함. DNA preparation LacZ M 조각 1 : vector 2-3 : 2 fragment 4-6 : 4 fragment 4, 6-11: 6 fragment 4 조각 Transformation : Blue colonies Colony PCR assay 6 조각 4 조각 2 조각 M : 2 fragment blue colony 2 : 2 fragment white colony 3 : 4 fragment blue colony 4 : 4 fragment white colony 5 : 6 fragment blue colony 6 : 6 fragment white colony 6 조각 실험예 3 : Overlap Cloner 반응의최적화 : DNA 농도, 반응온도, 반응시간등 3 kbp의 LacZ 유전자를실험모델로하여 Overlap Cloner 반응의최적조건을확인함. kit에제공하는 enzyme 1 ml를사용했을때, 약 ng의 DNA를사용하고 37 C에서 분반응하는조건이최적임을알수있었음. ( 단, vector와 insert DNA의크기에따른양과시간이다를수있으므로, 별도의최적화실험이필요할수있음.) Overlap Cloner의반응조건에따른효율변화 Enzyme Concentration M DNA Concentration M Reaction Time M * Red arrow : Vector Insert fusion DNA M : marker 1 : control 2 : 1 μl 3 : 0.5 μl 4 : 0.25 μl 5 : μl 6 : μl DNA 농도는동일 M : marker 1 : 200ng 2 : 100ng 3 : 50ng 4 : 25ng 5 : 12.5ng 6 : 6.25ng Enzyme 농도는동일 M : marker 1 : 5min 2 : 15min 3 : 30min 4 : 1hr 5 : 3hr Enzyme, DNA 농도는동일 Enzyme concentration 200ng 100ng 50ng DNA Concentration 25ng 12.5ng6.25ng 5min 15min 30min 1hr 3hr Reaction time 관련제품 Products Qty Cat. No. 가격 ( ) Pfu Plus DNA Polymerase Pfu Plus 5x PCR Master Mix Dpn I Gel Extraction Kit (spin-type) 500 unit EBT ,000 1 ml (250 rxn) EBT , unit EBR , prep EDB ,000

7 자주하는예상질문 1) 제한효소 /ligase를이용한방법과비교하여 Overlap Cloner를이용한 cloning 효율이더좋은지요? 저희엘피스바이오텍에서제공하는 Overlap Cloner Cloning Kit는완전히새로운개념의 cloning 방법으로서기존의방법들과는원리부터가다른제품입니다. Overlap Cloner의특징은일반적인 ligation 방법과는달리어느위치든지 cloning이가능하고여러 DNA 조각들도한번에이어붙여서 cloning할수있다는것입니다. 어느반응이나마찬가지지만 Overlap Cloner의사용에있어서도최적의조건이필요하고이에따라나오는효율은달라질수있습니다. 보편적인 ligation 방법의경우에도 DNA의상태나반응조건에따라효율적인측면에서많은편차를보이듯이 Overlap Cloner를사용할때또한최적화조건에따라효율이달라질수있으므로, 효율적인측면에서는두가지방법을직접비교할수는없고, 반응이간편하다는점에서점수를더주어야할것으로판단됩니다. 또한 Overlap Cloner를이용하는 cloning에서는제한효소자리를찾는데귀중한시간을낭비하지않아도됩니다. 또한여러조각을이어붙이는실험에서제한효소자리를찾느라골머리를싸매지않아도됩니다. 2) 상동서열의길이가꼭 15 bp 이상이어야하는지요? Overlap Cloner에사용하는 enzyme mix의기본적인기능테스트결과최소한의상동서열이 15 bp 이상이어야하는것을알수있었습니다. 일반적으로, bp가적당한길이로되어있으며, 그이상의상동서열도가능하나, primer 제작과 PCR 반응으로 cloning에사용할 insert DNA를얻어야하므로이에따른효율문제등을고려했을때, 본연구소에서권장하는상동서열의길이는최소 15 bp에서 20 bp 정도입니다. 제한효소를이용해 vector와 insert DNA를준비하는경우 overlap서열은 100 bp 이상이되어도무난하지만 overlap 서열이길어질수록 transformation 효율은감소하는경향을보이고있습니다. 따라서 DNA를준비하는최소비용을고려하고효율극대화를고려했을때최소 bp의 overlap 서열을이용하는것이최상의조건이라할수있습니다. DNA의말단에비매칭서열이존재해도 cloning은되지만비매칭서열의길이에따라효율은급격히감소합니다. 3) Transformation 후 colony 갯수가매우적은경우엔무엇이문제인가요? Overlap Cloner 는일반적인 cloning 방법과마찬가지로 vector DNA와 insert DNA의기본적인반응양 ( ng) 과몰비 (1:1) 등의최적화조건을필요로하는방법입니다. 따라서, 이러한조건들이맞지않을경우, transformation 효율이매우낮아질수도있습니다. 10 ml 표준반응용액에서는 vector의양을 ng으로사용하는것이가장효율적입니다. 반응의전체볼륨을늘려야하는경우에는 vector DNA는물론 insert DNA의양과넣어주는 enzyme mix의양도비례하여늘려주어야합니다. 더불어 vector DNA와 insert DNA 의몰비 ( 양적비율이아닙니다 ) 는항상 1:1로맞춰주는것이가장높은효율을얻는방법입니다. Transformation 효율이낮아질수있는또하나의원인은 cloning을위해준비한 DNA들의정제도에문제가있는경우입니다. DNA에오염될수있는 phenol, ethanol과같은유기용매는효소반응을저해하며, EDTA는효소반응을정지시킬수도있습니다. 따라서충분한 wash를거쳐 PCR purify 또는 gel extraction을한 DNA를사용해야합니다. 4) Insert DNA의크기에는제한이없는지요? Overlap Cloner는 insert DNA의크기제한없이사용할수있습니다. 50 bp 미만의크기부터수 kb의크기를가진 insert DNA를사용해도무방합니다만크기가커질수록대장균의 transformation 효율이급격히떨어지므로이점을사전에충분히감안해서실험을해야합니다. 일반적인 ligase를이용한방법과비교를했을때, 크기가큰 insert DNA의경우 cloning 효율이더좋으며, 이론적으로는수십 kb의 insert DNA도기존의방법보다높은효율로 cloning 할수있습니다. 10 kb정도의 insert DNA는어렵지않게 cloning 되는결과를얻었습니다. 다만문제는대장균의 transformation 효율이 DNA의크기에비례하여떨어진다는점입니다. 5) Vector와 insert DNA의비율은어떻게계산해야하나요? Vector와 insert DNA의비율은 molar ratio ( 몰비 ) 1:1로하는것이가장좋은효율을보입니다. 일반적으로 vector와 insert DNA의크기가같을경우같은양의비율로반응시키면됩니다. 그러나보통 insert DNA의크기가 vector DNA와다를경우가더많으므로크기에따른몰비를계산해서 1:1 정도가되게맞추어반응시키는것이좋습니다. 이를수식으로만들어보면다음과같습니다 Insert DNA 양 = (Insert DNA 크기 / Vector DNA 크기 ) * vector DNA 양 예를들어, vector DNA 크기가 3 kbp, inset DNA 가 1 kbp 크기라면, 100 ng 의 vector DNA 을사용하고자할때, insert DNA 는 33 ng 을넣어주면, 몰비가 1:1 이됩니다. 6) 일반적인 ligation방법에서처럼 overnight 반응도가능한지요? 기존의유사한 kit들의경우엔짧은반응시간또는높은온도등의까다로운반응조건들을제시하고있지만, 저희엘피스바이오텍의 Overlap Cloner는 37 o C 온도에서반응시간의제약없이그리고전처리나후처리과정없이도충분한 cloning 효율을보이고있으며, overnight 반응시에도주목할만한효율의변화가없는것으로확인되고있습니다. 이러한점에서타사제품들과는차별화된다고볼수있습니다. 7) Vector와 insert DNA 모두정제후사용해야하는지요? Overlap Cloner의경우에는 DNA의정제후사용을필히권장하고있습니다. 그이유는 PCR buffer나제한효소 buffer에포함된성분들이 cloning 반응의저해요인으로작용할수있기때문입니다. 또한, PCR을이용해 DNA를준비하는경우 template로사용한 DNA의오염이 background로나타날수있으므로 template DNA를제거하는과정을거치거나 ( 가령 Dpn I의처리 ), gel extraction 또는 PCR purification을병행하여 DNA를정제한후 cloning 반응에사용하는것이좋습니다. 8) Transformation을하기전효소반응을정지시키는과정이필요하거나또는반응산물의정제과정이필요한가요? Overlap Cloner는상당히안정적인효소반응을이용하므로 heat inactivation과같은효소반응정지과정이불필요하며반응산물을 ice에둘필요도없습니다. 반응이끝난후바로 transformation에이용하거나또는장기보관할경우반응산물을 -20 C에보관하시었다가나중에사용하시면됩니다. 또한반응후반응산물을특별히정제해사용할필요도없습니다. 반응산물 1-2 ml를직접 transformation에사용할수있으며정제를해도 transformation 효율에는크게영향을주지않습니다. Electro transformation을하는경우, 반응용액에존재하는 salt가 spark를일으킬수있으므로정제를권하지만 40 ml의 electro competent cell을사용하고단지 1 ml 미만의반응산물만을 transformation에사용하는경우라면굳이정제를하지않더라도 salt에의한 spark는일어나지않습니다. 9) 반응으로생성된 hybrid DNA는어떤형태인가요? Overlap Cloner를이용하여만들어진 DNA hybrid는 ligation을이용한반응에서처럼두 DNA 분자가공유결합으로붙어있지않은상태입니다. 상동서열의 DNA 교환에의해수소결합으로 base pairing이되어있고양끝에 nick이형성되어있는상태이므로반응산물의온도를높이면두분자는그대로떨어지는구조입니다. 따라서반응산물에높은온도를가하게되면두 DNA는떨어지므로 transformation 효율에영향을줄수있습니다. Nick을가지고있는 plasmid DNA는대장균내로들어가 repair과정을거쳐정상적인 closed circle 형태의온전한 plasmid가됩니다 10) Overlap Cloner kit 의보관기준은어떤지요? 본 kit 의보관은일반효소의경우처럼 -20 o C 에서의보관을권장하고있습니다. -20 C 에서는최소 1 년간은뚜렷한활성저하를보이지않습니다. 모든효소제품들과마찬가지로반 복적인제품의온도변화는효소의활성에치명적인영향을줄수도있습니다.

8 Trouble Shooting 문제점가능한원인해결방안 Transformation 효율이너무낮은경우 보유한 competent cells 의 transformation 효율을 puc19 와같은표준 plasmid 를이용해확인해 봅니다. 최소 1 X 10 7 /mg DNA 이상의효율을보이는 cells 을이용하기바랍니다. 적절한 antibiotics 를사용하지않은경우 Antibiotics selection 을통한 cloning 을위해서는사용한 vector DNA 가가지고있는 antibiotics resistance 유전자에해당하는 antibiotics 를사용해야합니다. 일반적으로 puc19 계열의 vector 는 ampicillin 을사용하며, 50 mg/ml 의농도를 LB plate 에넣어줘야합니다. 너무많은양의반응액을 transformation 에사용한경우 일반적인 transformation protocol 에따라 DNA 양을사용하고, 경우에따라반응액이 competent cell 에 toxic 할수있으므로, TE buffer 나증류수에희석해서 (1:5-1:10) 사용하여결과를보기바랍니다. Transformation 후 colony 숫자가매우적거나거의없는경우 Vector 또는 insert DNA 의양이너무적은경우 Vector 또는 insert DNA 에최소 15 bp 이상의상동서열이존재하지않는경우 Overlap Cloner는상동서열을인지하여연결해주는기작으로작동하기때문에충분한 DNA의양이필요합니다. 따라서, 최소 50 ng 이상의 vector DNA와 insert DNA가필요하며, 권장양인 ng의 DNA를이용하여반응시키기바랍니다. 기존 vector를제한효소로잘라이용한경우, cloning 위치에상동염기서열이존재하는지확인해야합니다. PCR을이용하여 vector 또는 inset DNA를준비한경우, 사용한 primer의염기서열이제작한염기서열과맞는지확인해봐야합니다. 중간또는말단에맞지않는염기서열이의도치않게들어가있으면, cloning 효율이급감합니다. 준비과정에서도 DNA에손상이생길수있으며이경우에도같은문제가발생할수있습니다. DNA 준비과정에도주의가필요합니다. Overlap Cloner enzyme mix 가적절히보관되지않은경우 Overlap Cloner enzyme mix 는 -20 o C 에서보관해야하며, 장시간상온보관시성능이크게떨어지며, 또한반복된 freezing 과 thawing 으로인해성능이떨어질수있습니다. Overlap Cloner 의반응온도와반응시간이적절치않은경우 Overlap Cloner enzyme 의반응시간은본연구소의테스트결과 overnight 반응시에도크게떨어지지 는않으나, 약 3 시간이내에서가장높은효율을얻을수있고, 37 o C 온도에서가장효율이높은것으로 확인되었습니다. 따라서이에준하는조건에맞춰반응을하는것이좋습니다. 대부분의 transformation colony 가 insert DNA 를가지고있지않거나또는다른서열의 DNA 를가지고있는경우 Vector DNA 가완전히 linearized 되어있지않은경우 Contaminated DNA 가반응에포함되었을경우 Overlap Cloner에서 vector의 linearization은매우중요합니다. 완전히 linear 되어있지않은 vector 또는남아있는 template DNA는반응전에모두제거되어야합니다. 문제가생기면다시 cutting하고정제해서사용할것을권장합니다. Vector의오염여부를확인하기위해서는 vector만을가지고 transformation을수행하여 colony가형성되는지확인해야합니다. PCR을이용해얻은 vector나 insert DNA에는 template DNA가완전히제거되지않고남아있을수있습니다. Circular 형태의 DNA는 transformation에우선적으로사용되므로이러한 DNA의오염이있는경우얻어지는대부분의 colony는의도하지않았던다른 DNA를가지고있을확률이높아집니다. 가급적 size구분이가능한 gel purification 방법으로 DNA를준비하는것이유리하며, vector DNA는 methylated template를구분하여자르는 Dpn I 같은효소로미리처리한후정제하여사용하는것이좋습니다. 또한정제과정이나 DNA 준비과정에서각종시약이나전기영동장치에오염되어있던 DNA가반응에오염되어 transformation후엉뚱한 colony로출현할가능성도있습니다. 주변환경은언제나청결해야합니다. Insert DNA 가비특이적 PCR 반응물인경우 비특이적 PCR 산물을반응에그대로사용한경우예상했던것과는완전히다른서열의 cloning 결과를얻을수도있습니다. PCR 조건이적절한지확인을해야합니다. Primer 조건이나, annealing 온도, 사이클조건등최적화조건을확인하고, 최종산물을제한효소절단같은방법을통해미리검증한후반응에사용하면, 이런문제를줄일수있습니다. ELPIS-Biotech. Inc. 보다자세한자료를원하시면 을방문하시거나이메일 elpis@elpisbio.com 또는 전화 로문의를주시면성심껏답변을드리겠습니다

Cloning

Cloning Takara 와함께하는 Cloning 2014-11-13 다카라코리아바이오메디칼 목차 Cloning 이란? Cloning Flow Chart Cloning DNA / RNA 추출 High Fidelity PCR 제한효소 /ligation/e.coli 형질전환 Clone 확인 이것만은꼭!!! 2 Cloning 이란? Clone 세포나개체의증식에의해서생긴유전적으로동일한세포군