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우재덕 화
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1 제 출 문 식품의약품안전청장 귀 하 이 보고서를 유전자재조합식품 모니터링(부산광역시보건환경연구원/정구영) 과제의 연구 결과보고서로 제출합니다 주관연구기관명 : 부산광역시보건환경연구원 주관연구책임자 : 정구영

2 목 차 Ⅰ. 연구개발결과 요약문 (한글) (영문) Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 제6장 참고문헌

(영문)------------------------------------------ 2 Ⅱ.

3 연구결과보고서 요약문 연구과제명 중심단어 유전자재조합식품 모니터링 유전자재조합식품, 모니터링, 중합효소연쇄반응, 콩, 옥수수 주관연구기관 부산광역시보건환경연구원 주관연구책임자 정구영 연구기간 목적 ; 유전자재조합식품등의 표시기준 이 마련되어 2001년 7월부터 유전자재재조합식품에 대한 표시가 의무화되었다. 이에 표시 대상 식품인 유전자재조합 콩 및 옥수수를 함유하는 가공식품에 대한 표시의 적절성을 파악하고, 시중 유통 중인 식품의 유전자재조합 원료 혼입 실태를 파악하 고자 모니터링을 실시하였다. 2. 시험대상 : 부산지역에서 유통 판매되는 콩과 옥수수 원료 및 가공식품 100건을 구입하였다, 3. 시험방법 : 콩 및 옥수수가 5대 원료로 포함된 식품에서의 내재 유전자(Le1n, SSIIb)와 재조합유 전자(P35S, NOS, RRS, Bt11, Bt176, GA21, T25, MON810)의 함유 여부를 PCR을 이용하여 정성검사 하였다. 4. 시험결과 : 총 100건중 38건(38.0%)에서 유전자재조합 성분이 정성 확인되었다. 생산지별로 구 분하여 분석한 결과 국내 생산 가공식품 82건 중 32건(39.0%), 해외 생산된 수입식품 18건 중 6건(33.3%)에서 각각 유전자재조합 성분이 혼입된 것으로 확인되었다. 원료별로 구분하여 분석 한 결과 콩을 주원료로 한 가공식품 80건 중 23건(28.7%)과 옥수수를 주원료로 한 가공식품 20 건 중 15건(75.0%)에서 유전자재조합 성분이 혼입된 것으로 확인되었다. 정성시험 결과 양성인 경우 제조회사 및 수입회사로부터 원료에 대한 구분유통증명서 또는 생산국 정부증명서를 확인하 였으며, 유전자재조합 성분이 혼입된 것으로 나타난 제품 모두가 3% 이하의 비의도적 혼입에 의 한 것으로 확인되어 표시제 위반사례는 없는 것으로 나타났다. 5. 기대효과 : 본 실험 결과에 의해 유전자재조합식품의 표시제 사후관리실태 및 국내 유통 식품 중 유전자재조합 원료 혼입 실태를 확인하고, 국민에게 정보를 제공함으로써 소비자의 알권리를 충 족시키고자 한다

시험방법 : 콩 및 옥수수가 5대 원료로 포함된 식품에서의 내재 유전자(Le1n, SSIIb)와 재조합유 전자(P35S, NOS, RRS, Bt11, Bt176, GA21, T25, MON810)의 함유 여부를 PCR을 이용하여 정성검사 하였다. 4. 시험결과 : 총 100건중 38건(38.0%)에서 유전자재조합 성분이 정성 확인되었다.

4 Summary Title of Project Key Words Monitoring of Genetically Modified Organism in Processed Food GM Food, Monitoring, PCR, Soybean, Maize Institute Busan Institute of Health and Environment Project Period Project Leader Jung Gu Young 1. Purpose : The regulation "labelling criterion for genetically modified(gm) foods" was enforced by KFDA(Korean food and drug adminstration) after So GM soybean and GM maize processed foods must be labeled as GMO derived. We surveyed the propriety of keeping the rule and the distributive statue of GM processed foodstuff. 2. Material : We purchased 100 kinds of foodstuff which may be processed with soybean or maize originally in Busan area. 3. Method : To monitor GM soybean and maize processed foods, we use PCR method targeting on indigenous gene((le1n, SSIIb) and recombinant gene(p35s, NOS, RRS, Bt11, Bt176, GA21, T25, MON810). 4. Results : Out of 100 sample, 32 items(39.0%) were detected by PCR qualitatively as containing with recombinant gene. Among 82 domestic made items and 18 imported items, 32(39.0%) and 6(33.3%) were related with GM ingredients respectively. And among the total 80 soybean foodstuff and 20 maize foodstuffs, 23(28.7%) and 15(75.0%) were sensitive to detect GM soybean and GM maize respectively. All the GM positive food products are examined more through IP(Identity Preservation) or certificate of state and that were proved to be contained within the non attentional contaminated values. As the results, any labelling regulation-violent case were not found at all. 5. Expected Effects : The results of this study will help to keeping the regulations of GM labelling and be informative to people who want to know the statue of GM foods

Purpose : The regulation "labelling criterion for genetically modified(gm) foods" was enforced by KFDA(Korean food and drug adminstration) after 2001.

5 총괄연구개발과제 연구결과 제1장. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 1.1 총괄연구개발과제의 목표 1. 연구의 필요성 생명공학의 발달 및 인구 증가에 따라 다양한 유전자재조합식품의 계속적인 개발과 전 세계적 인 유전자재조합 농작물의 경작지 확대 등으로 인하여 유전자재조합식품의 국내 유입이 계속 증가함에 따라 소비자의 불안이 가중되고 있음. 이에 우리나라에서는 식품위생법 제15조에 의해 유전자재조합식품의 안전성심사를 의무화하고, 식품위생법 제10조에 의해 소비자의 알권리를 보장하기 위한 유전자재조합식품의 표시제를 시 행하고 있음. 유전자재조합식품의 개발 실용화는 사회적 논란과 무관하게 계속되고 있으므로 새로이 개발되 는 유전자재조합식품을 제도권 내에서 관리하고, 안전성 확보 및 소비자의 알권리 보장이라는 제도의취지가 충분히 성공적으로 이행되도록 해야 함. 이를 위해서는 지속적인 안전성 평가 심사의 실시와 함께 심사 완료 품목의 국내 유통실태를 파 악하고 표시제 사후관리를 위한 검사법의 확립이 필요함. 안전성 심사 의무화제도 및 표시제도 등 안전관리제도의 실질적인 사후관리 및 관련제도의 검 토 및 보완을 위하여 국내 유통 중인 수입식품 및 수입 원료를 사용하여 제조한 국내생산식품 에 대한 지역별 모니터링을 통해 유통과정을 파악 추적하는 전국적인 사후감시체계의 구축이 필요함. 개발된 검사법의 국제적 인증을 위해서는 다실험실간 공동실험에 의한 검증이 요구되므로 용 역사업으로 개발한 신속검사법에 대한 다실험실간 검증실험에 의한 검사법 확립이 필요함. 2. 연구개발 목표 콩, 옥수수 가공식품의 유전자재조합 성분 혼입 실태 파악 국내 유통되는 수입식품 및 국내제조식품에서의 유전자재조합체의 혼입여부 확인에 의한 표시 제 실시에 따른 검증 부산지역 유통 가공식품에 대한 모니터링을 실시하여 다른 지역과의 차이 등 유통현황 파악 용역사업으로 개발한 신속검사법의 확립을 위한 다실험실간 검증실험 참여 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 부산지역에서 생산 및 유통되고 있는 유전자재조합식품 표시대상 가공식품에 대하여 유전자재조 합 성분의 혼입 여부 분석 (100건) 용역사업으로 개발한 신속 검사법에 대한 검증실험 참여 정보네트워크 공유체계 구축 - 3 -

유전자재조합식품의 개발 실용화는 사회적 논란과 무관하게 계속되고 있으므로 새로이 개발되 는 유전자재조합식품을 제도권 내에서 관리하고, 안전성 확보 및 소비자의 알권리 보장이라는 제도의취지가 충분히 성공적으로 이행되도록 해야 함.

6 1.3 국내 외 기술개발 현황 1. 국외연구동향 가. 일본 2001년 4월부터 표시제가 의무화되어 현재 대두, 옥수수 등 농작물 69종과 식품첨가물 12종 의 안전성이 확인 유통되고 있음. 1989년도부터 3차년 연구사업이 계속되어 현재 5회 차로 2002년도 유전자재조합식품 검사의 신뢰성 확보에 관한 조사연구에 2.56억엔 지원. 나. 미국 1992년도 안전성심사지침 마련 후 안전성평가 및 안전성기술개발사업이 계속 이루어지고 있음. 12개 작물 70여종의 농작물에 대하여 안전성이 확인되어 유통되고 있음. GMO 개발 및 생산을 주도하나 비정부단체 등에서 잠재적 위해성 문제를 제기 다. EU 유전자재조합 농산물에 대한 표시제 의무화 규정 채택 (98.05). 2001년 수정안을 내어 분석결과에 의해서가 아닌 GMO를 원료로 사용한 모든 가공식품에 대 해서 표시를 하도록 하였음. 7개 작물 18종의 농작물에 대하여 안전성이 확인되어 유통되고 있음. 독일, 이태리를 비롯하여 EU 국가들도 자체적으로 유전자재조합 콩과 옥수수 검사법을 확립 하였으며, 지속적으로 검사법 개발연구를 수행하고 있음. 2. 국내연구동향 식품의약품안전청에서 식품의기준및규격중개정고시(식약청 고시 제2005-3호)에 의해 유전자 재조합식품의 시험법 을 2005년 2월 1일자로 제정하였다. 식품의약품안전청에서 용역연구개발사업에 의해 유전자재조합 옥수수 8종의 동시분석법을 개 발하여 검증을 위한 공동연구를 실시 중이다. 제2장. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 1. 연구내용 부산지역에서 생산 및 유통되고 있는 유전자재조합식품 표시대상 가공식품에 대하여 유전자재조합 성분 함유 여부 분석 (100건) 용역사업으로 개발한 신속 검사법에 대한 검증실험 참여 정보네트워크 공유체계 구축 2. 연구방법 가. 유전자재조합식품 모니터링 부산지역에서 유통되고 있는 수입식품 및 국내생산 제품 중 유전자재조합식품 표시대상 가공식품 100건을 수거하여 유전자재조합 성분 함유여부 분석 식품의기준및규격 중 유전자재조합식품의 시험법 ( , 식약청고시제 호)에 따라 시험 1) QIAGEN Plant Maxi kit를 이용한 genomic DNA의 추출 - 4 -

2001년 수정안을 내어 분석결과에 의해서가 아닌 GMO를 원료로 사용한 모든 가공식품에 대 해서 표시를 하도록 하였음. 7개 작물 18종의 농작물에 대하여 안전성이 확인되어 유통되고 있음. 독일, 이태리를 비롯하여 EU 국가들도 자체적으로 유전자재조합 콩과 옥수수 검사법을 확립 하였으며, 지속적으로 검사법 개발연구를 수행하고 있음. 2.

7 가) 콩 또는 콩 가공품 균질하게 분쇄된 시료 1g을 폴리프로필렌 튜브(50ml용)에 넣고, 미리 65 로 가온한 AP1완 충액 10ml와 RNase A(100mg/ml) 20μl를 가하여 혼합기로 잘 혼합하여, 65 에서 1시간 동안 반응시킨다. 이때 매 15분마다 10초간 혼합기를 사용하여 시료와 반응액이 충분히 혼합되도록 한다. 1시간 반응 이후 3,000 g로 10분간 실온에서 원심 분리하고 상층에 생기는 막과 침전 물을 건드리지 않게 조심하면서 상층액(7ml)을 취하여 새로운 50ml 튜브에 옮긴다. AP2 완충 액 2.5ml를 가하여 얼음 속에 15분간 정치한 후, 3,000 g로 35분간 실온에서 원심 분리한다. 맑은 상층액(8ml)을 QIA Shredder Spin Column에 옮긴 후, 스윙로터를 이용하여 3,000 g에 서 5분간 실온에서 원심분리한다. 칼럼을 통과한 여액(7.5ml)을 새로운 50ml 튜브에 옮겨 10 초간 잘 혼합한 후 이 액(6.8ml)을 새로운 50ml 튜브에 옮긴다. 에탄올을 첨가한 AP3용액을 1.5배량(10.2ml) 넣어 10초간 잘 혼합한 후, DNeasy Maxi Spin Column에 옮기고 스윙로터를 이용하여 3,000 g에서 5분간 실온에서 원심분리하여 DNA를 칼럼에 부착시키고 칼럼을 통과 한 여액은 버린다. 칼럼에 AW 용액 12ml를 가하고 3,000 g에서 15분간 실온에서 원심분리하 여 세척한 후, 칼럼을 새로운 50ml 튜브에 옮겨, 미리 65 로 가온한 멸균증류수 1ml를 가하 고 실온에서 5분간 둔 후 스윙로터를 이용하여 3,000 g에서 10분간 실온에서 원심 분리하여 DNA를 용출시킨다. 용출액을 2ml 튜브에 옮겨 동량의 이소프로필알콜을 가하고 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후 실온에서 5분간 정치한다. 12,000 g로 15분간 4 에서 원심분리한 후 침 전물에 닿지 않도록 주의하면서 마이크로피펫을 이용하여 상층액을 제거한다. 70% 에탄올 500μl를 가하여 튜브 벽에 붙은 침전물이 분리될 때까지 조심스럽게 씻어낸다. 12,000 g로 3 분간 4 에서 원심분리한 후 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거한 후 침전물을 건조시킨다. 건조된 침전물에 50μl의 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH 8.0)을 가하고 4 에서 12~24시간 정치하면서 완전히 녹여 이를 DNA 시료 원액으로 한다. 나) 옥수수 또는 옥수수 가공품 균질하게 분쇄된 시료 1g을 폴리프로필렌 튜브(50ml용)에 넣고, 미리 65 로 가온한 AP1완충 액 5ml와 RNase A(100mg/ml) 10μl를 가하여 혼합기로 잘 혼합하여, 65 에서 1시간 동안 반 응시킨다. 이때 매 15분마다 10초간 혼합기를 사용하여 시료와 반응액이 충분히 혼합되도록 한다. AP2 완충액 1.8ml를 가하여 얼음 속에 15분간 정치한 후, 3,000 g로 15분간 실온에서 원심 분리한다. 맑은 상층액(4.2ml)을 QIA Shredder Spin Column에 옮긴 후, 스윙로터를 이용 하여 3,000 g에서 5분간 실온에서 원심분리한다. 칼럼을 통과한 여액(4ml)을 새로운 50ml 튜 브에 옮겨 10초간 잘 혼합한 후 이 액(3.4ml)을 새로운 50ml 튜브에 옮긴다. 에탄올을 첨가한 AP3용액을 1.5배량(5.1ml) 넣어 10초간 잘 혼합한 후, DNeasy Maxi Spin Column에 옮기고 스윙로터를 이용하여 3,000 g에서 5분간 실온에서 원심분리하여 DNA를 칼럼에 부착시키고 칼럼을 통과한 여액은 버린다. 칼럼에 AW 용액 12ml를 가하고 3,000 g에서 15분간 실온에서 원심분리하여 세척한 후, 칼럼을 새로운 50ml 튜브에 옮겨, 미리 65 로 가온한 멸균증류수 1 ml를 가하고 실온에서 5분간 둔 후 스윙로터를 이용하여 3,000 g에서 10분간 실온에서 원심 분리하여 DNA를 용출시킨다. 용출액을 2ml 튜브에 옮겨 동량의 이소프로필알콜을 가하고 상 하로 10회 정도 뒤집어 준 후 실온에서 5분간 정치한다. 12,000 g로 15분간 4 에서 원심분 리한 후 침전물에 닿지 않도록 주의하면서 마이크로피펫을 이용하여 상층액을 제거한다. 70% 에탄올 500μl를 가하여 튜브 벽에 붙은 침전물이 분리될 때까지 조심스럽게 씻어낸다. 12,000 g로 3분간 4 에서 원심분리한 후 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거 한 후 침전물을 건조시킨다. 건조된 침전물에 50μl의 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH 8.0)을 가하고 4 에서 12~24시간 정치하면서 완전히 녹여 이를 DNA 시료 원액으로 한다

맑은 상층액(8ml)을 QIA Shredder Spin Column에 옮긴 후, 스윙로터를 이용하여 3,000 g에 서 5분간 실온에서 원심분리한다. 칼럼을 통과한 여액(7.5ml)을 새로운 50ml 튜브에 옮겨 10 초간 잘 혼합한 후 이 액(6.8ml)을 새로운 50ml 튜브에 옮긴다. 에탄올을 첨가한 AP3용액을 1.5배량(10.

8 2) DNA 시료의 농도 및 순도 확인 DNA 시료 원액의 농도는 DNA 시료 원액을 TE완충액(pH 8.0)으로 적절히 희석한 후 분광광도 계를 사용하여 260nm에서 흡광도(Absorbance, A)를 측정하고, 그 값이 1일 때 DNA 농도가 50ng/μl인 것으로 하여 계산한다. 한편, 추출된 DNA의 순도를 확인하기 위하여 230, 260,280nm 에서 흡광도를 각각 측정한다. A 260 /A 280 과 A 260 /A 230 이 1.7~2.0일 경우 PCR에 적합한 DNA로 판 단한다. 다만, 가공식품의 경우 이러한 순도 적용이 어려운 경우가 있으므로 반드시 적용되는 것 은 아니다. 만일 A 260 /A 280 이 낮아 단백질 유래 불순물의 혼입이 우려되는 경우 단백질 분해효소 (protease)로 처리한 후 DNA를 회수하며, A 260 /A 230 이 낮을 경우 전분 분해효소(amylase)로 처 리한 후 DNA를 회수하여 PCR에 사용한다. DNA 시료 원액에 대한 DNA 농도로부터 PCR에 필요한 DNA 농도가 되도록 TE완충액(pH 8.0) 또는 멸균증류수로 희석하여 잘 흔들어 섞은 후 spin down한 것을 PCR용 DNA 시료로 하고, 20μl씩 0.5ml 튜브에 분주하여 -20 이하에서 냉동 보존한다. 소분 보관 중인 PCR용 DNA 시 료는 사용 전 실온에서 서서히 녹여 잘 흔들어 섞은 후 spin down하여 사용하고, PCR 후 남은 용액은 재사용하지 않고 폐기한다. 또한 DNA시료 원액의 농도가 PCR에 필요한 농도보다 낮을 경우 재추출하고, 그래도 PCR에 필요한 농도보다 낮을 경우 원액을 PCR용 DNA 시료로 사용한다. 3) PCR 각 추출 DNA에 대한 PCR은 2회의 확인시험으로 나누어 표1의 프라이머를 사용하여 아래의 방법으 로 실시하며, 1차 확인시험에서는 내재유전자와 전사개시인자(promoter 35S) 및/또는 전사종결인 자(NOS terminator)에 대한 프라이머로 PCR을 실시한다. 그 결과 2 반복 추출 시료 중 하나 이상 에서 목적하는 증폭산물(내재성 유전자와 35S 프로모터 및/또는 NOS 터미네이터)이 모두 검출된 추출 유전자를 주형 DNA로 하여 구조유전자에 대한 프라이머를 사용하여 2차 확인시험을 한다. 가) Master mixture의 조제 PCR을 하고자 하는 시료 수에 맞춰 사용하는 튜브의 수를 정하고, 이에 따른 전체 필요량에 여유분을 더하여 master mixture의 양을 정한다. 주형 DNA를 뺀 나머지 성분이 표 2의 PCR 반응액의 조성과 같이 되도록 하여 혼합한다. Master mixture는 얼음 위에서 취급하며, PCR용 튜브에 각 22.5μl씩 소분한다. 프라이머를 사용하지 않는 음성대조군에 대해서는 별도로 프라 이머를 함유하지 않은 master mixture로부터 22μl를 분주하고 멸균증류수 0.5μl를 가한다 나) 주형 DNA의 첨가 분취한 master mixture 22.5μl에 주형 DNA용액 2.5μl를 첨가한다. 주형 DNA의 첨가는 음성대 조군, 추출 DNA(20ng/μl), 양성대조군의 순서로 행한다. 다) PCR 증폭 모든 반응액을 분주한 후 PCR을 실시하는데, PCR의 반응조건은 표 3과 같다. 95 에서 10분 간 방치하여 최초의 변성이 일어나게 한 후, 95 에서 30초간 변성시키고(denaturation), 60 에서 30초간 유전자를 결합시키며(annealing), 72 에서 30초간 신장반응(extension)이 일어나 도록 하는 것을 1회로 하여, 40회를 반응시킨다. 이후 72 에서 7분간 최종 신장반응 (elongation)을 하고, 모든 반응이 종료되면 4 를 유지하도록 설정한다. 이상에서 얻어진 PCR 산물은 바로 전기영동하여 증폭산물을 확인하거나 냉동 보관한다. 4) 결과확인 PCR 증폭 결과는 아가로스겔(agarose gel)을 이용한 전기영동 후 전염색법을 한다

만일 A 260 /A 280 이 낮아 단백질 유래 불순물의 혼입이 우려되는 경우 단백질 분해효소 (protease)로 처리한 후 DNA를 회수하며, A 260 /A 230 이 낮을 경우 전분 분해효소(amylase)로 처 리한 후 DNA를 회수하여 PCR에 사용한다.

9 표 1. 본 연구에 사용된 프라이머(Primers used in this study) 검출 대상 유전자 프라이머 쌍 증폭산물 크기 비 고 [콩] 내재성유전자 (전사개시유전자) (전사종결유전자) (구조유전자) Le1n02-5' Le1n02-3' P35S1-5' P35S1-3' NOS ter 2-5' NOS ter 2-3' RRS 01-5' RRS 01-3' 118bp 101bp 151bp 121bp Le1/sense Le1/antisense P35S/sense P35S-pro/antisense tnos/sense tnos/antisense CTP4 from P.hybrida/sense EPSPS/antisense [옥수수] 내재성유전자 (전사개시유전자) (전사종결유전자) (Bt176 검출용) (Bt11 검출용) (GA21 검출용) (T25 검출용) (M810 검출용) SSIIb 1-5' SSIIb 1-3' P35S 1-5' P35S 1-3' NOS ter 2-5' NOS ter 2-3' Bt ' Bt ' Bt11 3-5' Bt11 3-3' GA21 3-5' GA21 3-3' T25 1-5' T25 1-3' M ' M ' CaM03-5' 151bp 101bp 151bp 100bp 127bp 133bp 149bp 113bp 170bp zssiib/sense zssiib/antisense P35S/sense P35S/antisense tnos/sense tnos/antisense cryia(b)/sense PEPC#9 intron /antisense adh1-1s/sense cryia(b)/antisense OTP/sense m-epsps/antisense pat/sense t35s/antisense hsp70 /sense cryia(b)/antisense CaM03/sense 표 2. PCR 반응액의 조성 성 분 Stock용액 농도 최종 농도(튜브) 1회 분량 DNA polymerase* 5U/μl 0.625U 0.125μl 완충액 10 x 1 2.5μl MgCl 2 ** 25mM 1.5mM 1.5μl dntps 2.5mM 200μM 2μl 프라이머 각 25μM 각 0.5μM 0.5μl 주형DNA 20ng/μl 50ng 2.5μl 멸균증류수 전체량 반응 총액이 25μl가 되도록 첨가 μl 25μl - 7 -

hybrida/sense EPSPS/antisense [옥수수] 내재성유전자 (전사개시유전자) (전사종결유전자) (Bt176 검출용) (Bt11 검출용) (GA21 검출용) (T25 검출용) (M810 검출용) SSIIb 1-5' SSIIb 1-3' P35S 1-5' P35S 1-3' NOS ter 2-5' NOS ter 2-3' Bt176 2-5'

10 표 3. PCR 반응 조건 온도 시간 cycle 수 최초의 변성 분 1 cycle 변성 (denaturation) 결합 (annealing) 초 30 초 40 cycle 신장 (extension) 초 최종신장 (elongation) 72 7 분 1 cycle 보존 가) 영동조의 준비 전기영동하고자 하는 대상이 시료에서 추출한 DNA와 크기가 100~200bp 전후의 PCR 증폭산 물이므로 이에 적합한 아가로스 겔을 제조사의 설명서를 참고하여 사용한다. 필요량의 아가로 스를 칭량하여, TAE(Tris -acetate/edta)완충액(0.5배)을 넣고 가열하여 아가로스를 녹인다. 또한 200bp이하의 작은 크기의 PCR 증폭산물을 전기영동하므로 아가로스는 겔 강도가 높은 것을 사용한다. 아가로스가 충분히 녹아 겔이 균일하게 되면 55 정도로 식혀서 100ml당 1μl 의 에티디움 브로마이드(EtBr) 용액(10mg/ml)을 넣고 잘 혼합한다. 겔이 55 정도로 식으면 겔 조제용 틀에 겔을 넣고 홈을 끼운 후 30분가량 방치하여 충분히 겔을 굳힌다. 겔이 굳으면 겔 이 잠기도록 TAE 완충액(0.5배)을 부어 홈을 조심스럽게 뺀다. 겔을 전기영동조에 장착하고, 겔의 윗면이 충분히 잠길 정도로 TAE 완충액(0.5배)을 채운다. 나) 전기영동 PCR 증폭산물에 1/6배의 염색액(gel loading buffer)을 혼합 후 겔의 각 홈에 시료를 조심스럽 게 넣으며, 양끝의 각 홈에는 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA (Marker DNA)을 넣는다. 이때 용량은 최대 10μl를 넘지 않도록 한다. 시료를 주입 후, 50~100V의 전 압에서 전기 영동한다. 염색액에 함유된 BPB(Bromophenol Blue)가 겔의 1/2에서 2/3가량 진 행하면 전기영동을 멈추고 화상분석기 등을 이용하여 전기영동 결과를 확인한다. 다) 결과의 확인 화상분석기의 Trans-illuminator에 식품포장용 랩을 깔고, 그 위에 염색이 끝난 겔을 올려놓고 자외선을 조사한다. CCD 카메라에 의한 촬영으로 영동 유형을 확인하며, 표식유전자와 비교하 여 목적하는 위치에서 밴드(band)가 얻어졌는지를 확인한 후 결과는 화상데이터로 보존해둔다. 5) 판정 전기영동 결과로부터 목적하는 PCR 증폭산물이 얻어졌는지를 확인한 후 다음과 같이 분석결과를 판정한다. 가) 우선 반응 대조군 중 음성대조군(negative control)인 가 DNA를 함유하지 않는 것과 나 프라 이머를 함유하지 않는 것에서 PCR산물이 검출되지 않음을 확인한 후, 양성대조군(positive control)인 다 비유전자재조합(non-GMO) DNA을 함유한 것에서 내재유전자의 PCR 산물은 검출되나 PCR 산물은 검출되지 않음과 라 목적하는 를 함유한 것에 서 내재유전자 PCR 산물과 도입된 PCR 산물이 모두 검출되는지를 확인하여야 하며, 이들 결과 중 어느 하나라도 일치하지 않는 경우에는 재시험을 하여야한다. 나) 2반복 추출 DNA에 대한 PCR 결과 하나 이상의 추출 DNA에서 1차 및 2차 확인 시험에 의 해 내재유전자와 도입된 특이 PCR산물이 모두 확인된 경우 검출 로 판정하며, - 8 -

또한 200bp이하의 작은 크기의 PCR 증폭산물을 전기영동하므로 아가로스는 겔 강도가 높은 것을 사용한다. 아가로스가 충분히 녹아 겔이 균일하게 되면 55 정도로 식혀서 100ml당 1μl 의 에티디움 브로마이드(EtBr) 용액(10mg/ml)을 넣고 잘 혼합한다.

11 2반복 추출 DNA에 대하여 내재유전자의 PCR산물은 모두 검출되나, 특이 PCR 산물이 검출되지 않은 경우에는 불검출 로 판정하며, 2반복 모두 내재유전자의 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 유전자추출과정부터 다시 반복 시험한다. 반복시험 결과에서도 내재 유전자의 증폭산물이 검출되지 않은 경우 검사불능 으로 판정한다 다) 유전자재조합 작물 중 전사개시유전자(프로모터)로 35S를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, Bt176, T25, Mon810이 있으며, 전사종결유전자(터미네이터)로 NOS를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, GA21이 있다. 라) 이상과 같이 하여 정성분석에서 검출 로 판정된 경우 구분유통증명서 등의 구비여부를 확인 하여 표시제도 위반 여부를 확인하며, 농산물에 대해서는 정량분석을 실시한다. 유전자재조합 유전자 검출 시 해당제품에 대하여 구분유통증명서 또는 정부증명서의 구비 여 부를 확인하고 동 증명서가 없을시 행정조치 유전자재조합식품 안전관리 홈페이지에 시험결과를 입력함으로서 모니터링사업 참여기관간의 정보 공유체계 구축 나. 유전자재조합식품 검사법 검증실험 용역사업으로 개발한 유전자재조합 옥수수 8종(Mon810, Bt11, GA21, T25, E176, Mon863, NK603, TC1507) 동시분석법의 검증 확립을 위하여 식약청에서 실시하는 다실험실간 공동연 구에 참여 (프로토콜, 시료, 시약, 프라이머 등은 식약청에서 제공) 제3장. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 1. 검체 구매 검체는 부산지역 대형마트에서 연구 기간 내에 주기적으로 6회 분할 구입하였다. 전체 시료 구입건수 는 100건으로 콩(80건), 옥수수(20건)이었다. 식품유형별 구입건수는 두유(13건), 된장(14건), 혼합 장(6건), 청국장(3건), 춘장(2건), 고추장(1건), 두류가공품(17건), 곡류가공품(5건), 두부류(11건), 영아용 성장기용 조제식(5건), 기타가공품(3건), 옥수수 통조림(6건), 과자류(7건), 옥수수차(3건), 빵 류(2건), 옥수수전분(1건), 면류(1건)이었으며, 생산지별로 분류하면 국산(82건), 수입산(18건)이었 다. 그 중 수입산의 원산지별 구분은 일본(11건), 미국(3건), 프랑스(2건), 태국(1건), 네덜란드(1건) 이며 식품유형별 구분은 옥수수통조림(6건), 혼합장(2건), 된장(5건), 영아용.성장기용 조제식(1건), 면류(1건), 두류가공품(3건) 이었다(Fig. 1). 총 100건 콩 가공식품 80 건 옥수수 가공식품 20 건 검출 23 건 검사불능 2 건 불검출 55 건 검출 15 건 검사불능 1 건 불검출 4 건 Fig. 1 Classification of total sample - 9 -

라) 이상과 같이 하여 정성분석에서 검출 로 판정된 경우 구분유통증명서 등의 구비여부를 확인 하여 표시제도 위반 여부를 확인하며, 농산물에 대해서는 정량분석을 실시한다.

12 2. DNA 추출 및 확인 가공식품에서 추출한 DNA의 순도 및 농도는 Table 2와 같다. 추출한 DNA를 0.8% agarose gel에서 전기영동한 결과 두부, 두유, 된장 등의 가공식품에서의 DNA는 분해되어 다양한 작은 크기로 존재하 는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 DNA 분포들은 콩 및 옥수수의 가공공정 중에 DNA가 파괴되는 것 으로 판단된다. 3. PCR에 의한 정성검사 부산지역에서 유통하는 콩 및 옥수수가 5대 원료로 포함된 가공식품 총 100건을 수거하여 내재 유전 자(Le1n, SSIIb)와 재조합 외래유전자(P35S, NOS, RRS, Bt11, Bt176, GA21, T25, MON810)의 존 재 여부를 PCR을 이용하여 정성 확인하였다. 결과 판정은 1차적으로 내재유전자 및 P35S, NOS 유 전자를 확인한 다음 2차적으로 구조유전자를 확인하여 최종 양성판정 하였다. 검사 결과 38건 (38.0%)의 가공식품에서 각 이벤트별 유전자재조합 성분이 검출됨이 확인되었다. 가. 생산지별 검사결과 국내 생산 가공식품 82건 중 32건(39.0%), 해외 생산된 수입식품 18건 중 6건(33.3%)에서 각각 유 전자재조합 성분이 확인되었다. 검출된 수입식품의 유형은 혼합장(0/2건), 옥수수통조림(5/6건 :83.3%), 된장(0/5건), 영아용.성장기용 조제식(1/1건), 면류(0/1건), 두류가공품(0/3건)이었다. 나. 원료별 검사결과 콩을 주원료로 한 가공식품 80건 중 23건(28.7%)과 옥수수를 주원료로 한 가공식품 20건 중 15건 (75.0%)에서 유전자재조합 성분이 확인되었으며 양성으로 정성 확인된 제품에 대하여는 제조사 또는 수입사에 IP(Identity Preservation, 구분유통증명서)를 확인한 결과 모두 IP를 보유하고 있었다. 다. 콩 가공식품 80건의 식품 유형별 정성 확인결과 두유(11/13건), 된장(1/14건), 혼합장(1/6건), 청국장(0/3건), 춘장(1/2건), 고추장(0/1건), 두류가공 품(1/17건), 곡류가공품(1/5건), 두부류(3/11), 영아용 성장기용 조제식(4/5건), 기타가공품(0/3건)으 로 두유에서 비교적 높은 검출율(84.6%)을 나타내었다(Fig. 2). 라. 옥수수 가공식품20건의 식품유형별 정성 확인결과 옥수수통조림(5/6건), 과자류(7/7건), 옥수수차(0/3건), 면류(0/1), 빵류(2/2), 옥수수전분(1/1)으로 과자류에서 100%의 검출율을 나타내었으며 옥수수통조림의 경우도 비교적 높은 검출율(83.3%)을 나 타내었다(Fig. 3). 마. 검사불능 사례 내재유전자(콩 : Le1n, 옥수수 : SSIIb)가 검출되지 않는 검사 불능 사례는 3건으로 고추장(1/1건), 두류가공품(1/17건), 옥수수차(1/3건)에서 각각 1건이었다. 이는 원료 중 DNA함유량이 낮거나 가공 처리 중 DNA의 절편화 또는 PCR시 반응 저해물질의 오염 등에 기인한다고 사료된다. 4. 유전자재조합식품 검사법 검증실험 옥수수 8종 동시분석법에 대한 검증실험을 수행하였으며, 그 결과는 식약청에 별도 송부하였다

PCR에 의한 정성검사 부산지역에서 유통하는 콩 및 옥수수가 5대 원료로 포함된 가공식품 총 100건을 수거하여 내재 유전 자(Le1n, SSIIb)와 재조합 외래유전자(P35S, NOS, RRS, Bt11, Bt176, GA21, T25, MON810)의 존 재 여부를 PCR을 이용하여 정성 확인하였다.

13 콩 가공식품 (검출수/검체수) ; 23/80 건 (검출율 28.7%) 양성건수 음성건수 3 건수 두유 된장 혼합장 청국장 춘장 고추장 두류가공품 곡류가공품 두부류 조제식 식품유형 Fig. 2 GMO Detection rates of soybean processed foods 옥수수가공식품(검출수/검체수) ; 15/20 건 (검출율 75.0%) 건수 옥수수통조림 과자류 옥수수차 면류 빵류 옥수수전분 식품유형 양성건수 음성건수 Fig. 3 GMO Detection rates of maize processed foods

14 제4장. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 생명공학기술의 발달로 농작물 등에 제초제 내성, 해충 저항성, 저장성 및 영양학적으로 향상된 특성 을 갖게 하는 유전자재조합생물체(genetically modified organism, GMO)가 개발 및 상용화되고 있다. 이들 중 glyphosate 제초제 내성 유전자인 epsps(5-enolpyruvylshikimate-3-phospate synthase)를 삽입한 Monsanto사의 glyphosate 내성 콩 상품명 : Roundup Ready soybean(rrs), 해충저항성 옥 수수(MON810 및 Event176), glyphosate 내성 옥수수(GA21), glufosinate 내성 옥수수(T25), 해충저 항성 옥수수(Bt11) 등이 안전성 심사 승인을 받았으며, 유전자재조합식품의 시험법(식약청고시 제 호) 에는 상기 품종에 대한 PCR을 이용한 유전자 검사법을 기술함으로써 가공식품에서의 유전자재조합식품 등의 표시기준(식약청고시 제 호) 의 이행여부의 확인이 가능하게 되었다. 따라서 표시제 실시에 따른 검증으로서 국내유통 수입식품 및 국내 제조식품에서의 유전자재조합체의 함유여부 확인 및 지역별 모니터링을 실시하여 지역간의 유통현황을 파악하고 GM식품에 대한 소비자의 알권리 보호 및 올바른 정보제공의 필요성이 대두되었다. 이에 본 연구는 부산지역에서 유통되는 콩(대두) 및 옥수수를 원료로 사용한 가공식품 100건을 구입 하여 유전자재조합원료의 혼입 여부를 분석하고, 표시제 실시에 따른 이행 여부 및 국내 유통식품에서 의 GMO 혼입 여부를 모니터링하였다. 본 모니터링 연구결과 총 100건중 38건(38.0%)에서 유전자재조 합 성분이 정성적으로 확인되었다. 생산지별로 구분하여 국내 생산 가공식품 82건 중 32건(39.0%), 해 외 생산된 수입식품 18건 중 6건(33.3%)에서 각각 유전자재조합 성분이 확인되었다. 원료별로 구분하 면 콩을 주원료로 한 가공식품 80건 중 23건(28.7%)과 옥수수를 주원료로 한 가공식품 20건 중 15건 (75.0%)에서 유전자재조합 성분이 확인되었다. 본 연구결과는 유전자재조합식품 표시제 시행에 따른 이행여부 확인 및 소비자의 알권리를 충족시키는 정보로서 그 활용도가 높다고 사료된다. 또한, 옥수수 8종 동시분석법 검증을 위한 공동연구에 참여하여 재현성, 감도시험 등을 수행함으로써 검사대상품목의 증가에 따른 비용 및 검사시간을 줄일 수 있는 스크리닝 검사법의 확립이 가능하게 되 었다

glufosinate 내성 옥수수(T25), 해충저 항성 옥수수(Bt11) 등이 안전성 심사 승인을 받았으며, 유전자재조합식품의 시험법(식약청고시 제 2005-3호) 에는 상기 품종에 대한 PCR을 이용한 유전자 검사법을 기술함으로써 가공식품에서의 유전자재조합식품 등의 표시기준(식약청고시 제2000-43호) 의 이행여부의 확인이 가능하게 되었다.

15 제5장. 총괄연구개발과제의 연구성과 5.1 활용성과 총괄과제명 총괄과제책임자 유전자재조합식품 모니터링 정구영 / 부산광역시보건환경연구원 / 환경과학 가. 연구논문 번호 논문제목 저자명 저널명 집(권) 페이지 Impact factor 1 해당없음 국내/국외 SCI여부 나. 학술발표 번호 발표제목 발표형태 발표자 학회명 연월일 발표지 국내/국제 1 해당없음 다. 지적재산권 번호 출원/ 등록 특허명 출원(등록)인 출원(등록)국 출원(등록)번호 IPC분류 1 해당없음 라. 정책활용 유전자재조합 성분 혼입 실태 및 유통 현황을 파악하여 효율적인 유전자재조합식품 사전 관 리 제도를 보강하기 위한 기초 자료로 활용 유전자재조합식품 표시제 이행여부를 확인하여 표시제 관리에 필요한 자료로 활용 모니터링 결과를 행정처분 등 관련 제도 집행에 실질적으로 활용하기 위해 표시제 사후관리와 연계하여 실시 마. 타연구/차기연구에 활용 공동검증실험 결과에 의한 신속 동시분석법 확립 유전자재조합식품 안전관리 홈페이지에 모니터링 결과를 입력하여 타 모니터링기관이 입력 결과 를 참조하여 지역별 특색 있는 제품과 검출율이 높은 제품을 집중적으로 모니터링 바. 언론홍보 및 대국민교육 과학적 검증으로 소비자에게 유전자재조합 성분 사용 식품에 대한 올바른 정보를 제공 사. 기타 해당없음

정책활용 유전자재조합 성분 혼입 실태 및 유통 현황을 파악하여 효율적인 유전자재조합식품 사전 관 리 제도를 보강하기 위한 기초 자료로 활용 유전자재조합식품 표시제 이행여부를 확인하여 표시제 관리에 필요한 자료로 활용 모니터링 결과를 행정처분 등 관련 제도 집행에 실질적으로 활용하기 위해 표시제

16 5.2 활용계획 1. 기대성과 유전자재조합 원료사용 실태 파악으로 효율적인 사전 관리 제도를 보강하가 위한 기초 자료 로 이용 유전자재조합식품 표시제 이행여부를 확인하여 표시제 관리에 필요한 자료로 활용 과학적 검증으로 소비자에게 유전자재조합 성분 사용 식품에 대한 올바른 정보를 제공 2. 활용방안 모니터링 결과를 행정처분 등 관련 제도 집행에 실질적으로 활용하기 위해 표시제 사후관리와 연계하여 실시 국내 모니터링 결과로 파악한 유통현황을 유전자재조합식품 관리방안 재검토 시 기초자료로 활용 소비자의 알고 선택할 권리 보장하기 위해 홈페이지 등에 결과 공개 유전자재조합식품 안전관리 홈페이지에 모니터링 결과를 입력하여 타 모니터링기관이 입력 결 과를 참조하여 지역별 특색 있는 제품과 검출율이 높은 제품을 집중적으로 모니터링 공동검증실험 결과에 의한 신속 동시분석법 확립 제6장. 참고문헌 1. 식품의기준및규격중 유전자재조합식품의 시험법 (식약청고시 제2005-3호, ), 식품의약품안전청. 2. 김묘영, 김재환, 김현중, 박선희, 우건조, 김해영. PCR을 이용한 국내시장에 유통중인 유전자재조합 콩 및 가 공식품의 모니터링. J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol. 46(4), , 김영미, 손성한, 정순일, 윤문섭, 김태산, 박용환. 유전자변형 콩의 검정법, J. Korean Soc. Agric. Chem.Biotechnol. 45(4), , 김현중, 박선희, 김해영. PCR을 이용한 glyphosate 저항성 콩의 검출법에 관한 연구. Korean J. Food Sci.Technol. 33(5), , 허문석, 김재환, 박선희, 우건조, 김해영. PCR을 이용한 국내에서 안전성이 확인된 유전자재조합 옥수수의 분 석 방법. Korean J. Food Sci. Technol. 35(6), , Markus, L., Brodmann, P., Pietsch K., Pauwels, J. and Anklam, E. : IUPAC collaborative trial study of a method to detect genetically modified soybeans and maize in dried powder. Journal of AOAC International. 82(4), , Matsuoka, T., Kawashima, Y., Akiyama, H., Miura, H., Goda, Y., Sebata, T., Isshiki, K., Toyoda, M, and Hino, A. : A detection method for recombinant DNA from genetically modified soybeans and processed foods containing them. J. Food Hyg. Soc. Japan, 40(2), , Matsuoka, T., Kuribara H., Akiyama, H., Miura, H., Goda, Y., Kusakabe Y., Isshiki, K., Toyoda, M, and Hino, A. A multiplex PCR method of detecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize. J. Food Hyg. Soc. Japan, 42, 24-32, Meyer, R. Development and application of DNA analytical methods for the detection of GMOs in food. Food Control, 10, ,

과를 참조하여 지역별 특색 있는 제품과 검출율이 높은 제품을 집중적으로 모니터링 공동검증실험 결과에 의한 신속 동시분석법 확립 제6장. 참고문헌 1. 식품의기준및규격중 유전자재조합식품의 시험법 (식약청고시 제2005-3호, 2005. 02. 01), 식품의약품안전청. 2. 김묘영, 김재환, 김현중, 박선희, 우건조, 김해영.

17 총괄 연구과제 요약 과제 고유번호 사업명 과제명 유전자재조합식품(GMO) 안전관리 유전자재조합식품 모니터링 공개가능여부 성 명 정구영 주민등록번호 연구책임자 소속 기관명 부산광역시보건환경연구원 전자우편 전화번호 연구목표 콩 및 옥수수 가공식품의 유전자재조합 성분 혼입 실태 파악 표시제도의 실시에 따른 검증으로서 국내에 유통되는 수입식품 및 국내제조식품에서의 유전자재조합 성분 혼입 여부 확인 부산지역 유통 가공식품에 대한 모니터링을 실시하여 다른 지역과의 차이 등 현황 파악 연구내용 부산지역에서 생산 및 유통되고 있는 유전자재조합식품 표시대상 가공식품에 대하여 유전 자재조합 성분 혼입 여부 분석 (100건) 용역사업으로 개발한 신속 검사법에 대한 검증실험 참여 정보네트워크 공유체계 구축 연구성과(응용분야 및 활용범위포함) 유전자재조합 성분 혼입 실태 파악으로 효율적인 사전 관리 제도를 보강하기 위한 기 초 자료로 이용 유전자재조합식품 표시제 이행여부를 확인하여 표시제 관리에 필요한 자료로 활용 과학적 검증으로 소비자에게 유전자재조합원료사용 식품에 대한 올바른 정보를 제공 총괄 참여연구원 성 명 주민등록번호 성 명 주민등록번호 정구영 이주현 박연경 Keywords (5개 내외) 한글 영문 유전자재조합식품, 모니터링, PCR, 콩, 옥수수 GM Food, Monitoring, PCR, Soybean, Maize