Transcription

1

2

3 BIONEER CORPORATION Preface 본책자는포스트게놈시대의생명공학연구실의필수적인연구장비인 ExiProgen 에관한설명서입니다. ExiProgen 은무세포 transcription, translation 반응과 magnetic affinity purification 을이용하여 DNA 로부터다양한단백질들을전자동으로합성하고고순도로정제할수있어생명공학의획기적인발전을가져올수있는신개념의장비입니다. 지난 30 년간은유전자혁명의시대였습니다 년 automatic DNA sequencer 가발명된이후 30 년간 sequencing 장비들이눈부시게발전하여 10 년걸렸던인간게놈해독이이제는하루안에가능하게되었습니다. 그리하여 GeneBank 에는 3 억개이상의단백질을만들수있는유전정보가축적되어있고, NGS 장비의보급에따라, 매년 2 배씩유전정보의양이늘어날것으로예상하고있습니다. 또한, 유전자합성기술도빠르게발전하고있어 1 kb 의 gene 을 200 달러대에만들수있는시대가되었습니다. 이제이러한기술을기반으로하여모든생명체들의유전정보로부터유용단백질을대량으로발굴하고이를활용하는합성생물학시대가빠르게열리고있습니다. 구조생물학의발전에따라서새로운서열을갖는유전자를설계하고대량합성할수있어생명체유래의단백질보다우수한성능을갖는신규단백질이빠른속도로개발되어생명공학의제 2 의전성기를맞이하게될것입니다. 그러나단백질을제조하는데는여전히많은시간이걸리고전문가들만이할수있어, 엄청난 DNA 정보들을활용하는후속연구가쫓아가지못하고있습니다. 시험관에서 DNA 를합성할수있는 PCR 이 1988 년개발되어보급되기전에는, 원하는 DNA 를얻기위한방법이세포를이용한유전자재조합방법밖에없었기때문에많은시간이소모되고전문가들만이실험을수행할수있었습니다. 시험관에서짧은시간안에 DNA 를합성하는 PCR 이발명되고이를자동화한 thermal cycler 가개발되어 1990 년초부터널리보급됨에따라생명공학이눈부신속도로발전해왔습니다. 세포추출액을사용하여시험관내에서단백질을만드는방법이개발된지 50 여년이넘었지만현재까지이원리를이용한효율적인자동화장비가개발되지않아서지금까지도단백질을만들기위해서는세포를이용하는방법이주로사용되고있습니다. 그래서유용단백질을발견하는데있어서가장시간과비용이많이들어가는것은유전자로부터순수한단백질을만들어내는과정입니다. 본장비는포스트게놈시대의생명공학의새로운도약을위해, 누구나쉽게많은단백질들을만드는것이가능하여, 엄청난유전정보로부터단백질을고속으로만들어활용할수있게하는장비입니다. ExiProgen 에 template DNA 와단백질합성 kit 를장착하여가동시키면, 전자동으로무세포단백질합성과 affinity purification 을통해고순도의단백질을제조할수있습니다. ExiProgen 은원하는단백질들을전자동으로만들어낼수있을뿐만아니라, 생체시료로부터 DNA 나 RNA 를전자동으로추출할수있는기능도가지고있어, 유전자를다루는실험실의생산성을획기적으로높일수있는장비입니다. ExiProgen 은각각의목적에최적화된 protocol 을내장하고있어서, 각각의 protocol 에사용되는다양한 kit 들을이용하여고순도, 고수율로단백질과핵산을전자동으로얻을수있습니다. 당사는 ExiProgen 을한국과미국의주요바이오회사들과공공연구기관들에공급하기시작하여, 이들기관의연구원들로부터놀라운찬사를받고있습니다. 현재전세계의생명공학연구실부터분자진단실험실까지전자동단백질합성과다양한생체시료로부터 DNA, RNA 를전자동으로추출하는데광범위하게사용되고있습니다. 본기기를사용하시는순간부터수많은유전자들로부터유용단백질을찾아나가는데있어포스트게놈시대의선도자가되실것입니다. Bioneer 는전세계생명공학연구실에 ExiProgen 을지속적으로보급하고있습니다. 본장비가 PCR 장비처럼생명공학의새로운지평을열어나가는차세대실험실의필수장비로사용될것입니다. 그럼으로써포스트게놈시대의 3

4 수많은유전자정보를최대한활용하여고속으로유용한단백질들을만들수있게되어생명공학의제 2 의르네상스를가속화하는데크게기여할수있을것으로기대됩니다. 당사는지속적인연구개발투자로세계수준의 oligonucleotide 대량합성기술을개발하고, 이를이용한고속 gene 합성기술을개발하여다양한서비스들을제공해오고있습니다 ( 이제경제적가치와직결되는단백질을전자동으로합성할수있는기술을개발함으로써유전자로부터고부가가치단백질을개발하는전과정을고객들께제공할수있게되어고객들께서더욱값진연구결과들을얻는데큰도움이될수있을것입니다. 바이오니아 (KOSDAQ 64550) 는 1992 년에설립된한국바이오벤처 1 호기업으로써, 설립이래 20 여년간끊임없는연구개발투자로독창적인 400 여개의특허들을발명하여, 포스트게놈시대의생명공학연구에핵심적인수만여종의첨단시약들과장비들을개발, 상용화하여생명공학의핵심인유전자기술을보급하는데기여해왔습니다. 그동안축적된성공과실패의소중한경험을기반으로, 창의적인아이디어로과감하게한계에도전하는포스트게놈시대의 Pioneer 가되고자합니다. 혁신적인생명공학연구와유전자기반의분자진단 sirna 신약의원천기술들을개발하여유전자기술을통해인류의건강한삶과지속가능한사회를만들어나가는데기여해나갈것입니다. 본 Guide Book 을통해서 ExiProgen 에대한새로운정보를얻으시고가까운시일내에 ExiProgen 사용자로서신약개발, 종자개발, 식품, 화학, 소재산업등에서무한한가능성에도전하는단백질 Discovery 의 Pioneer 가되시길기원합니다 년 3 월대표이사박한오 4

5 Contents Preface 3 Part I - ExiProgen 7 Part II - Protein Synthesis & Purification 11 Template Preparation & Protein Product Selection Guide Introduction Protein Synthesis (Expression & Purification) Principle of cell-free protein expression Principle of affinity purification with magnetic beads ExiProgen 단백질합성을위한 template DNA 준비 ExiProgen 단백질합성을위한 template DNA 준비가이드 단백질의유전자 sequence 정보만알고있는경우 cdna, clone 또는 PCR product 형태로단백질유전자를갖고있는경우 단백질의유전자 clone 을 T7 발현벡터 (pet, pk7, pivex 등 ) 로갖고있는경우 ExiProgen 단백질발현용 template DNA 구조 Fast and parallel template preparation with PCR 21 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit Cloning in pbivt vectors Template DNA 를이용한단백질발현확인 24 AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit Template DNA 농도최적화 25 AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit Effect of template DNA purity on protein synthesis Protein Expression & Purification ExiProgen kits for protein synthesis(expression & Purification) 한번에다종의단백질들의합성여부를보려고할때 34 ExiProgen EC Protein Synthesis Kit mg 이상의단백질을손쉽게얻고싶을때 38 ExiProgen EC-Maxi Protein Synthesis Kit Histidine tag 이제거된단백질을얻고자할때 40 ExiProgen EC-Tagfree Protein Synthesis Kit Disulfide bond 가있는목적단백질을얻고자할때 43 ExiProgen EC-Disulfide Protein Synthesis Kit 4.2. AccuRapid kits for protein expression The easy method for protein synthesis!! 46 AccuRapid Protein Synthesis Kit Screening for protein expression 48 AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit Protein synthesis with manual kit 49 AccuRapid Midi Protein Expression Kit AccuRapid Maxi Protein Expression Kit 4.3. ExiProgen kits for protein purification Cell-free protein 의 purification 51 ExiProgen His-Tagged Protein Purification Kit 5

6 Contents Modified protein 의 purification 53 ExiProgen Cell Based Protein Purification Kit 4.4. Level up of protein expression Codon optimization for the maximal expression of the protein Batch expression vs Continuous expression Effect of reaction temperature on protein synthesis Application ExiProgen kit 를이용한독성단백질합성 ExiProgen kit 를이용한막단백질합성 ExiProgen kit 를이용한상업용단백질합성 Troubleshooting guide Ordering Information Service Information References 72 Part III - Nucleic Acid Extraction Introduction Principle and Selection Guide Principle of nucleic acid extraction Selection guide Product Information ExiProgen Blood Genomic DNA Kit ExiProgen Tissue Genomic DNA Kit ExiProgen Bacteria Genomic DNA Kit ExiProgen Plant Genomic DNA Kit ExiProgen Nano-Plus Plasmid DNA Kit ExiProgen Gel Extraction Kit ExiProgen PCR Purification Kit ExiProgen Tissue Total RNA Kit ExiProgen Plant Total RNA Kit ExiProgen Viral DNA/RNA Kit Application ExiProgen 을이용한소고기조직의 genomic DNA 추출 ExiProgen 을이용한쌀종자 genomic DNA 추출 ExiProgen 을이용한 parraffin embedding sample 에서의 genomic DNA 추출 Troubleshooting Guide Ordering Information 122 6

7

8 ExiProgen ExiProgen 은 cell-free protein synthesis 기능과 affinity expression 기능을병합하여전자동화시켜, template DNA 와 kit 를넣고가동시키면, 하루만에다양한단백질을전자동으로제조할수있는장비입니다. 뿐만아니라, 1 시간내외에세포나조직등다양한시료로부터전자동으로핵산을추출하는기능도가지고있어생명공학연구실의혁신을주도할신개념의장비입니다. ExiProgen 에사용되는당사의다양한단백질합성 kit 를이용하여다양한단백질들을각각의목적에적합하게고순도로얻을수있습니다. 제조하려는단백질의특성에따라단백질을 coding 하고있는 template DNA 를각 kit 와함께장착한후각 kit 에해당하는 protocol 을실행하면전자동으로작동되어고순도의단백질을얻을수있습니다. ExiProgen 을이용한단백질합성은 E. coli 단백질발현시스템에적합한 template DNA 를단백질합성 kit 에첨가한후, ExiProgen 에장착해가동시키면전자동으로단백질을발현시키고, 발현된단백질을 affinity tag 을이용하여정제한후, 최종적으로목적단백질을제공해주는방법입니다. 1 회반응으로최대 16 종의각기다른단백질을만들수있으며, 이단백질들은고순도를갖습니다. 또한, ExiProgen 은 affinity protein purification 과정만별도로수행할수있으며세포에서발현된 affinity tag 를가지는단백질을고순도로정제할수도있습니다. ExiProgen 은다양한시료로부터각시료에최적화된핵산추출 kit 를이용하여 DNA, RNA 를전자동으로획득할수있습니다. 배양세포, 조직, 등으로부터고품질의 RNA (RNA Quality Score >9.0) 를추출할수있고또, 다양한조직으로부터 genomic DNA 을고순도로정제할수있는기능을가지고있습니다. ExiProgen 의특징은다음과같습니다. 각각의목적에맞게최적화된 protocol 이내장되어있음 ExiProgen 에는최적화된단백질합성 / 정제및핵산추출용 protocol 이내장되어있으며, ExiProgen 이지원하는모든 protocol 을이용하여누구나쉽게재현성있는실험들을수행할수있습니다. 또한, 추가적으로개발되는단백질합성 / 정제및핵산추출에해당하는 protocol 들은당사의홈페이지에서무상으로다운받은후네트워크 (TCP/IP) 연결을통해손쉽게장비에설치할수있도록되어있습니다. Temperature Controlled Block 이장착되어있음 ExiProgen 은특별히제작한 Temperature Controlled Block 을장착하고있어온도를 4~90 범위에서변경할수있으며, 이는원하는온도에서단백질합성을수행하거나, 단백질합성 / 정제와핵산추출실험을거쳐얻은최종산물을낮은온도에서안정하게보관할수있게해줍니다. 8

9 Magnet & Heating Block ExiProgen 은은단백질합성 / 정제또는핵산을추출할때사용할수있도록자석을포함하는 Magnet & Heating block 이장착되어있습니다. Heating block 위에배치된자석은단백질정제또는핵산추출에사용되는자성입자들을각 well 의벽면에균등하고빠르게부착시켜고순도, 고효율로단백질정제및핵산추출을수행할수있도록해줍니다. 또한, Heating block 은 30~90 범위에서일정한온도유지를위한제어가가능하여, 단백질합성시온도를유지하거나, 핵산추출시가온반응을통해 ethanol 을완전히증발시켜고순도의핵산을얻을수있도록해줍니다. ( 한국등록특허 ). 오염방지장치 (Contamination Shield) ExiProgen 에장착된오염방지장치는핵산추출과정중에피펫을사용하여빈번히용액들을이동시키는데이때피펫으로부터용액이낙하되어다른 well 로떨어져발생될수있는교차오염을완전히차단하도록고안된장치입니다. 오염방지장치는장비가동중피펫팁하단에위치하며용액이떨어지는것을방지합니다. 터치스크린을이용한편리한사용 3.5 인치터치스크린을이용하여실험 protocol 및 elution volume 등을선택하여실행할수있습니다. 또한, 실험진행률을실시간으로확인할수있어보다편리한사용이가능합니다. 자동 UV 살균 lamp ExiProgen 은강력한살균램프를장착하고있어단백질을합성 / 정제하거나핵산을추출하기전후장비내부를살균할수있습니다. 이것은각실험에따른오염을막아더욱정확한결과를얻을수있는환경을제공합니다. 정확한 Pipette Volume ExiProgen 은 0.1 mm 까지조정가능한 syringe motor 를장착하여자동분주과정에서발생할수있는오차범위를최소화하였으며, 용액을 25 μl~1000 μl 부피범위에서분주할수있도록하여다양한실험에적용할수있습니다. 9

10 Protocol no. Protein Synthesis & Purification Kit (Cat. no.) ExiProgen His-Tagged Protein Purification Kit (K-7200) ExiProgen EC Protein Synthesis Kit (K-7300,7301,7302) ExiProgen EC-Maxi Protein Synthesis Kit (K-7310) ExiProgen EC-Tagfree Protein Synthesis Kit (K-7320) ExiProgen EC-Disulfide Protein Synthesis Kit (K-7330) ExiProgen Cell-Based Protein Purification Kit (K-7230) Protocol no./name 901, Protein : Purification 902, Protein : Synthesis 903, Protein : Synthesis_Maxi 904, Protein : Synthesis_TF 905, Protein : Synthesis_DS 906, Protein:Purification_Cell Nucleic Acid Preparation Kit (Cat. no.) ExiProgen Blood Genomic DNA Kit (K-4311) ExiProgen Tissue Genomic DNA Kit (K-4312) ExiProgen Bacteria Genomic DNA Kit (K-4314) ExiProgen Plant Genomic DNA Kit (K-4315) ExiProgen Tissue Total RNA Kit (K-4342) ExiProgen Plant Total RNA Kit (K-4344) ExiProgen Viral DNA/ RNA Kit (K-4371) ExiProgen Nano-Plus Plasmid DNA Kit (K-4381) ExiProgen Gel Extraction Kit (K-4391) ExiProgen PCR Purification Kit (K-4392) Protocol no./name 101,Genomic DNA : Whole Blood 102, Genomic DNA : Animal tissue 103, Genomic DNA : FFPE tissue 108, Genomic DNA : Gram (+) bacteria 109, Genomic DNA : Gram (-) bacteria 104, Genomic DNA : Plant tissue 105, Genomic DNA : Plant seed 202, Total RNA : Animal tissue 204, Total RNA : Plant tissue 205, Total RNA : Plant seed 412, Viral DNA : Plasma 413, Viral DNA : Serum 703, Fragment DNA : Plasmid DNA 803, Fragment DNA : Gel slice 804, Fragment DNA : PCR product 10

11

12 12 Template Preparation & Protein Product Selestion Guide

13 1. Introduction 단백질은효소, 호르몬, 구조단백질, 조절단백질등의다양한기능으로생체를구성하는물질중에가장다양하고복잡한기능을하는중요한물질입니다. 포스트게놈시대에이러한단백질들을만드는수많은유전자들의염기서열들이알려졌기때문에, 이러한유전자들이만들어내는단백질들의기능및구조등에대한연구수요가급격하게늘어나고있습니다. 특정단백질의기능과특성의연구는단백질발현정제부터시작됩니다. 단백질을제조하는방법은대장균, 효모, 동물세포등다양한세포주를이용할수있으며, 단백질을발현할수있는재조합벡터를세포내로주입하여형질전환시키고세포주를배양하고재조합단백질을발현시킨후, 이세포를파쇄하여발현된단백질을정제하는방법들이일반적으로사용되고있습니다. 이방법은재조합벡터를만들어서단백질을안정하게발현시키는균주선발과정과최적의발현조건을찾는과정이필요하며, 이후세포배양, 세포파쇄, 그리고단백질정제의일련의과정을거쳐야하므로많은시간과노동력이필요합니다. 뿐만아니라세포주에독성을나타내는단백질인경우에는단백질을발현시키는것이어려워특수한발현조건들을시도해야만합니다. 또세포내에서발현된단백질이 inclusion body로형성되면이것을 soluble protein으로만들기위해많은노력이필요하여하나의순수한단백질을제조하기까지최소일주일에서길게는수개월의시간이소요됩니다. 이러한문제점을극복하고자세포를이용하지않고짧은시간내에반응용기내에서단백질을합성하는무세포단백질발현법이개발되어사용되고있습니다. 이방법은반응용기에단백질을발현할수있는 template DNA (expression vector 또는 PCR product) 와세포추출액, 그리고아미노산과핵산그리고에너지물질이들어있는단백질발현용액을첨가한후, 적정온도에서반응을시켜목표단백질을발현시키는방법으로, 세포를사용하여단백질을발현시키는방법에비해서소요시간을획기적으로줄일수있을뿐만아니라세포내에서독성을가지는단백질도발현을시킬수있다는장점을가지고있습니다. 바이오니아에서는무세포단백질발현방법을 ExiProgen 에적용시킨다양한 kit들을개발하여판매하고있습니다. 단백질내에이황화결합이없는일반적인단백질을 ~ 100 μg 정도의양을얻을수있는 kit, 대량으로 500 μg 내외의단백질을얻을수있는 kit, 이황화결합이 2개이상인단백질을합성하는 kit, His-tag이없는고순도의단백질을제조할수있는 kit들을제공하고있습니다. 또한무세포발현용벡터와 PCR을이용하여무세포발현용 template DNA 제작할수있는 kit 등을개발하여공급하고있습니다. 이러한 kit들은 E. coli 세포추출액으로만들어져있고 T7 promoter를이용하여발현시키는시스템으로서 T7 발현염기서열을포함하는 template DNA (Expression vector 또는 PCR product) 만가지고있으면곧바로단백질합성이가능합니다. 또한그밖에도당사는 ExiProgen 을이용하여기존의세포배양방식을이용하여발현시킨재조합단백질을전자동으로손쉽게정제할수있는단백질정제kit도판매하고있습니다. 이 kit는최대 16종의시료를동시에정제할수있는 kit로, 동일단백질에대한최적화된발현조건을확인하는실험등에활용될수있습니다. 13

14 2. Protein synthesis (Expression & Purification) 2.1. Principle of cell-free protein expression 무세포단백질발현이이루어지기위해서는, rntp 와 T7 RNA polymerase, ribosome 과 trna (transfer RNA) 등이필요합니다. 당사의모든 kit 에는 T7 RNA polymerase, ribosome, trna 등을공급해주는 E. coli extract 와 rntp, 아미노산및에너지원을공급해주는 Master mix 가포함되어있습니다. 무세포단백질발현법의조작과정과원리는아래와같습니다. E. coli extract 와 Master mix 가들어있는시험관튜브에단백질을암호화하는 template DNA 를첨가한후잘섞어서, 30 의온도를일정시간동안유지시켜주면, 아래와같이튜브내에서단백질발현이이루어지게됩니다. 당사의단백질발현 / 합성 kit 는아래의그림과같이첨가해준 DNA 를 template 으로하여시험관내에서 rntp 를이용하여전사 (transcription) 가일어나고이어서가해준아미노산과에너지원을이용하여번역 (translation) 이진행되어원하는단백질이만들어지는원리를기반으로하고있습니다. Step I: Prepare of Reaction Mixture Step II: Protein Expression (in reaction tube) 14

15 2.2. Principle of affinity purification with magnetic beads 자성입자는핵산, 단백질, 항체의약품과같은 biomolecule들의정제에다양하게이용되고있으며, 정제과정을자동화시키는데적합합니다. 자성입자표면에코팅된잔기들에의하여 biomolecule들이결합하고, 그후, 세척과정과추출과정을거치게됩니다. ExiProgen 단백질합성및정제 kit류는당사의독자적인기술력으로개발된실리카나노자성입자를사용하고있으며, 이자성입자의표면에는 Ni-NTA 로코팅되어있어서 His-tag을가지고있는목적단백질을정제할수있습니다. 자성입자를이용하여목적단백질을정제하는원리는다음과같습니다. 15

16 3. ExiProgen 단백질합성을위한 template DNA 준비 ExiProgen 장비와 kit 그리고단백질발현용 template DNA 를가지고원하는목적단백질을합성정제할수있습니다. ExiProgen system 에서목적단백질을발현하기위해서는무세포단백질발현용 template DNA 를먼저준비해야합니다. 단백질발현용 Template DNA 를준비하실때유의하실사항은다음과같습니다. *. ExiProgen 의단백질정제는 His-tag 과 Ni-NTA bead 를이용하므로, 목적단백질의 template DNA 에쓰일유전자 sequence 에는 6x His tag sequence 가반드시포함되어있어야합니다 (Chapter. 3.2 참조 ). *. 목적단백질에 Post-translational modification 이필요한경우, E. coli expression system 을이용하는 ExiProgen 단백질합성 kit 에서 post-translational modification 이이뤄지지않으므로, Eukaryotic protein expression system 을이용하여단백질발현을수행한후, ExiProgen 에서단백질을정제할수있습니다. 위의사항을유념하시고, 아래와같이 Template DNA 를준비하실수있습니다. Eukaryotic protein 을합성, 정제하는경우에는 codon 특이성차이로 ExiProgen 의 E. coli expression system 에서발현이저하되는경우가있을수있습니다. 이경우에는바이오니아의 Gene 합성서비스를통해 E.coli 에 codon optimization 된상태의 gene 을확보하여단백질발현용 template DNA 를제작하여사용하면, 목적단백질합성량을높일수있습니다 (Chapter 참조 ). 더세부적인사항은다음페이지의차트에안내되어있습니다. 차트를보시고본 Chapter 의해당페이지에서관련된정보를확인하세요. 16

17 3.1 ExiProgen 단백질합성을위한 template DNA 준비가이드 단백질의유전자 sequence 정보만알고있는경우 합성하려는단백질의유전자 sequence 정보 (NCBI access number 등 ) 만알고있는경우, 바이오니아의 Codon optimization & Gene 합성서비스를이용하여간편하게 6x His-taq sequence가포함된단백질발현용 template DNA를준비할수있습니다. mg 단위의발현량을필요로하는경우에는 cloning 서비스를이용하여 T7 E.coli expression vector로 template DNA를준비하는것을권장합니다. 아래의차트표의해당페이지에서자세한내용을확인할수있습니다. 17

18 3.1.2 cdna, clone 또는 PCR product 형태로단백질유전자를갖고있는경우 단백질유전자의 cdna, clone 또는 PCR product (6x His-tag sequence 포함 ) 로부터단백질을합성을하고자하는경우, 바이오니아의 ExiProgen ProXpress PCR Template kit (Cat. no. K-7400, K-7401) 을이용하시면, 2 번의 PCR 반응을통해간편하게단백질발현용 template DNA 를준비할수있습니다. mg 단위의발현량을필요로하는경우에는 Cloning 서비스를이용하여 T7 E.coli Expression vector 로 template DNA 를준비하는것을권장합니다. 아래의차트표의해당페이지에서자세한내용을확인할수있습니다. 18

19 3.1.3 단백질의유전자 clone 을 T7 발현벡터 (pbivt, pet, pk7, pivex 등 ) 로갖고있는경우 단백질유전자를 T7 E.coli 발현벡터 (pet, pk7, pivex 등 ) 에삽입된 clone (6x His-tag sequence 포함 ) 으로갖고있는경우, ExiProgen 단백질발현용 template DNA 로바로이용할수있습니다. 아래의차트표의해당페이지에서자세한내용을확인할수있습니다. 19

20 3.2. ExiProgen 단백질발현용 template DNA 구조 무세포단백질발현용 template DNA 로는발현벡터또는 PCR product 를사용할수있습니다. template DNA 는 T7 promoter - Ribosome binding site (RBS) - Target gene (6x His-tag sequence 포함 ) - T7 terminator 의구조를가지고있어야하며, 그구조는아래의그림과같습니다. 또한 target gene 은 start codon 과 stop codon 을가지고있어야하며, 정제를위하여 5 말단또는 3 말단에 6x His-tag 을가지고있어야합니다. 1) NH constructs (5 end 6x His-tagged template) 2) CH constructs (3 end 6x His-tagged template) T7 Promoter---RBS ATG x His-tag - stop T7 terminator 발현벡터는 바이오니아에서판매하는 In vitro translation 전용벡터인 pbivt 벡터 (Cat. No. K-7350) 에클로닝하여사용할수있 고, 그밖에도 pk7, pivex, pet 벡터등을사용할수있습니다. 발현벡터의경우, 각각의 template DNA 마다최대의단백질합성율을보이는최적의 DNA 농도가다릅니다. 따라서 DNA 농도별스크리닝을하여각 Kit에맞는최적의 DNA양을선정하시기바랍니다. PCR product로부터 cloning을하지않고바로 template DNA를제작하기위해서는당사의 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit (Cat. No. K-7400,7401) 를이용하여제작할수있습니다. 많은종류의단백질을빠르게소량으로만들어서성능을평가해볼때매우유용한 Kit로서 Genomic DNA, cdna 또는 T-vector 등에서간편하게 1일내로단백질을만들수있는장점이있습니다. ExiProgen 으로발현된단백질을정제하기위해 6x His-tag 이필요합니다. His-tag 은목적단백질의 N- 말단또는 C- 말단에위치할수있습니다. ( 단, Tag free 실험을위해서는 His-tag 은 N- 말단에위치해야합니다.) 일반적으로 His-tag 의존재는단백질의구조변화에영향을주지는않습니다 (Carson M et al, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr Mar;63(Pt 3): ). 그러나단백질 3 차구조형성시안쪽으로말려들어가서 Ni column 에결합하지못할수있습니다. 이러한경우에는단백질정제가불가능할수있어, 이경우는 His-tag 의위치를변경해야합니다. 또한효소의활성과단백질의구조분석측면에있어서도 affinity tag 의위치가영향을미친다고알려져있으며, 한예로 Solanum dulcamara, Solanaceae 의종의효소를 tag 의위치를달리하여성능을비교한실험에서는두가지의효소중 C- 말단에 tag 가있는효소는활성을나타내지못한결과를얻을수있었습니다 (Freydank et al. Proteins Jul;72(1):173-83). 단백질을최대한많이합성하기위해서는 template DNA의순도가높아야합니다. DNA의순도는 A260/280:>1.8, A260/230:>1.5일수록좋으며, 만약준비하신 template DNA의순도가낮은경우에는당사의 AccuPrep PCR purification Kit (Cat. No. K-3034) 를이용하여재정제한후, 사용하시면됩니다. 또한 DNA의서열상의 E.coli codon usage가단백질합성량에영향을미치며, 만약코돈최적화 (codon optimization) 가되어있지않은경우당사의 codon optimization & AccuGeneBlock synthesis service를통해서최적의 template DNA 를경제적으로합성하실수있습니다. 또한, 당사의 In vitro translation vector에클로닝된상태로제공받으실수있는 gene synthesis Service도제공하고있습니다. 자세한내용은홈페이지를참조하시기바랍니다. 20

21 Fast and parallel template preparation with PCR 본 kit 는 cloning 과정없이 PCR 반응을이용하여 cell-free protein expression 용 template DNA 를제작할수있는 kit 로서, 표적유전자증폭용 1 차 primer set 를제외한 template DNA 제조반응에필요한모든구성품 (2 차 primer set, PCR premix 등 ) 이 kit 에포함되어있습니다. 본 kit 로제작된단백질발현용 template DNA 는 AccuRapid Protein Expression Kit 류 ( 매뉴얼방식 ) 및 ExiProgen Protein Synthesis Kit 류에사용가능합니다. 특징및장점 Rapid & Easy Preparation of Linear Template DNA (for Protein Expression): 목적단백질의유전자를포함하는 cdna, genomic DNA 등으로부터두단계의 PCR 반응을통해단백질합성용 template DNA 를제조할수있으며, ExiProgen kit 와연계하여하루만에목적단백질합성을완료할수있습니다. Accurate Protein Template by High fidelity PCR: 본 kit는당사의대표적인 Long & high fidelity PCR PreMix인 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix를사용하여, PCR 반응시생길수있는 error rate를줄여주기때문에정확한 sequence를가진단백질발현용 template DNA를제작할수있습니다. High Efficiency: 본 kit 를이용하여제조한단백질발현용 template 는 ExiProgen 에최적화되어소량의 DNA 만으로도 100 μg 이내의단백질을합성할수있습니다. (ex: template DNA 길이에따른최대단백질합성을위한권장 DNA 사용량 : 1 kb 이하 ng, 1~2 kb - 1 μg) 실험방법 본 kit 를사용하여 cloning 없이 PCR 반응만으로단백질합성에바로사용할수있는 template DNA 를얻는과정은두단계로진행되며그과정은아래그림과같습니다. 1) 1 차 PCR: 합성하려고하는단백질의 structural gene 의 DNA (cdna, genomic DNA, plasmid DNA) 로부터합성하려고하는 start codon 과 termination codon 을포함하는 coding region 을 PCR 로증폭 (1 차 extended primer 사용 : 바이오니아홈페이지에서주문하실수있습니다. Ordering Information 참조 ) 2) 2 차 Overlapping PCR: 1 차 PCR 에서확보된 target gene(coding region) 을모든 primer 들이포함되어있는 PCR kit 에가하여 2 차 PCR 을수행하여 5 쪽말단에 T7 promoter 및 RBS 서열을연결하고 3 쪽말단에 T7 terminator 서열을연결하는 overlapping PCR 을거쳐서얻은최종 template DNA 를 gel purification 하여얻을수있습니다. 21

22 실험결과 st 1 PCR products st 2 PCR products M M M2 Figure 1. PCR agarose gel data M: 100 bp DNA Ladder (D-1030, Bioneer), M2: 1 kb DNA Ladder (D-1040, Bioneer) 1: SAV (Template pt), 2: RNase H (Template BL21 (DE3) gdna), 3: hgh (Template pt) 4: CAT (Template - pbivt), 5: UDG (Template - BL21 (DE3) gdna), 6: AcGFP (Template pbivt) 7: EVO (Template pt), 8: RFP (Template pivex), 9: Poly A polymerase (Template pet15b) Figure 2. SDS-PAGE gel data of synthesized proteins. Each linear template DNA generated by ExiProgen ProXpress PCR Template Kit and those are used as template for protein synthesis with ExiProgen EC Protein Synthesis Kit. M; AccuLadder Protein Size Marker (Low)(Bioneer, D-2020), 1; SAV (13 kda), 2; RNase H (20 kda), 3; hgh (23 kda), 4; CAT (26.5 kda), 5; UDG (28 kda), 6; AcGFP (28 kda), 7; EVO (30 kda), 8; RFP (31 kda), 9; Poly A polymerase (54 kda) 22

23 Related Products Cat. no. Products K-7400 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit, 16 reactions N 차 primer F/R sets (N terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 N 차 primer F/R sets (C terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 K-2631 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction/tube D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/ μl) K AccuPrep PCR Purification Kit, 50 reactions K AccuPrep Gel Purification Kit, 50 reactions C-9100 Agarose, 100 g C X TBE, 1 gal C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml A MyGenie 32 Thermal Block A-7040 ExiSpin, Instrument A-7020 Agaro-Power System 1 Oligo synthesis service 문의 23

24 Cloning in pbivt vectors 당사의무세포단백질합성전용벡터인 pbivt 벡터세트 (pbivt-1, pbivt-2) 는 ExiProgen 단백질합성시스템의모든 kit 에적용가 능합니다. 본벡터세트는 N-terminal (pbivt-1) 또는 C-terminal (pbivt-2) 에 6x His-tagging 이가능하며, 구조는아래와같습니다. Related Products Cat. no. Products K-7350 pbivt vector set-1 E-1211 BamH I, 5,000 U E-1981 SaI I, 1,000 U K AccuPrep Gel Purification Kit, 50 reactions D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) E-3061 T4 DNA Ligase, 20,000 U 24

25 3.3. Template DNA 를이용한단백질발현확인 본 kit 는반응튜브내에서 template DNA 를이용하여 3 시간만에원하는단백질을 20 μg 내외로발현할수있는 kit 로서 AccuRapid E. coli extract 와 AccuRapid Master mix 를포함하고있습니다. 이중 AccuRapid E. coli extract 는 T7 RNA polymerase 를포함하고있으며, AccuRapid Master mix 는아미노산, NTPs, 에너지원을비롯하여 RNA 합성및단백질생산에필요한모든성분을포함하고있어손쉽게사용이가능합니다. 특징및장점 High Speed 3시간만에 DNA로부터단백질을발현할수있습니다. Flexibility T7 promoter/terminator site와 RBS(Ribosomal Binding Site) 를포함하고있는다양한 DNA로부터원하는단백질의합성이가능합니다. High Performance Host 세포에독성을나타내어기존의 cloning 방법으로발현이불가능했던단백질의발현이가능합니다. Compatibility 본 kit 는 ExiProgen 단백질합성 kit 류와데이터가호환됩니다. 실험방법 본 kit 를이용한실험방법은다음과같습니다. 미리준비한발현벡터또는 PCR product 를키트에서제공되는 E. coli extract 와 Master mix 와혼합한후, 이반응물을 PCR machine 에넣고, 30, 3 시간동안유지시켜주면단백질발현이이루어지게됩니다. 발현이끝난시료는일반적으로 SDS-PAGE gel 에서확인할수있으며, 만약확인이어려운경우에는 western blot 이나형광값측정방법등을이용하여확인하시면됩니다. 25

26 실험결과 66 kda M kda 29 kda PTP18 GFP CAT 20.1 kda 14.4 kda 1. AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit 를이용한단백질발현 Figure 1. Protein expression data of AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit. Lane M; AccuLadder Protein Size Marker (Low), Lane 1,3,5; Negative control (No-DNA), Lane 2; CAT (Chloramphenicol acetyl transferase), Lane 4; GFP (Green fluorescence protein), Lane 6; PTP1B (Protein tyrosine phosphatase 1B) M kda 45 kda 29 kda 20.1 kda 14.4 kda Bioneer Company A Company B 2. 타사 kit 와의성능비교 Figure 2. Comparison of protein expression between AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit and protein expression kits from other companies. Lane M; AccuLadder Protein Size Marker (Low), Lane 1,3,5 ; Negative control (No-DNA), Lane 2; Bioneer s kit and control DNA, Lane 4; Company A s kit and control DNA, Lane 6; Company B s kit and control DNA 26

27 Related Products Cat. no. Products K-7400 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit, 16 reactions N 차 primer F/R sets (N terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 N 차 primer F/R sets (C terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 K-2631 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction/tube D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl ) K AccuPrep PCR Purification Kit, 50 reactions K AccuPrep Gel Purification Kit, 50 reactions C-9100 Agarose, 100 g C X TBE, 1 gal C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml K-7350 pbivt vectors set-1 C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml k-7250 AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl A MyGenie 32 Thermal Block A-7040 ExiSpin, Instrument A-7020 Agaro-Power System 1 Oligo synthesis service 문의 27

28 3.4. Template DNA 농도최적화 ExiProgen EC series 를이용하여단백질을합성할때, template DNA 의양에따라서단백질합성량에차이가있을수있습니다. 먼저 AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit 를사용하여 template DNA 농도에따른단백질의최대발현조건을스크리닝합니다. 이결과를바탕으로선정된 template DNA 농도를반영하여 ExiProgen EC series 로단백질을합성하면, 최대한많은양의단백질을얻을수있습니다. 실험방법 Step I ; AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit 를이용한 template DNA 농도스크리닝 1. Template DNA 를각농도별로준비 - 25, 50, 100, 200, 300, 400 (ng/μl) 2. kit 의사용설명서에따라서단백질발현실험진행 1 Reaction mixture 준비 - Reaction volume; 45 μl - Sample DNA; 1 번에서준비한 DNA 를각 2 μl 씩첨가 Final DNA 의양 : 50, 100, 200, 400, 600, 800 ng 2 반응물을 30 에서 3 시간반응 (PCR machine 이용 ) 후, SDS-PAGE gel 을통해서최적발현농도확인 Step II; ExiProgen EC Protein Synthesis Kit series 를이용한단백질합성 K-7300, K-7301, K-7302 ExiProgen EC Protein Synthesis Kit - 발현시료부피 ; 750 μl - DNA 사용량 ; Step I에서확인된최적발현양을보이는 template DNA 농도의 16.7배사용 - kit 사용설명서에따라서셋팅한후, ExiProgen 902번프로토콜로단백질합성 K-7310 ExiProgen EC-Maxi Protein Synthesis Kit - 발현시료부피 ; 450 μl - DNA 사용량 ; Step I에서확인된최적발현양을보이는 template DNA 농도의 10배사용 - kit 사용설명서에따라서셋팅한후, ExiProgen 903번프로토콜로단백질합성 K-7320 ExiProgen EC-Tagfree Protein Synthesis Kit - 발현시료부피 ; 450 μl - DNA 사용량 ; Step I에서확인된최적발현양을보이는 template DNA 농도의 10배사용 - kit 사용설명서에따라서셋팅한후, ExiProgen 904번프로토콜로단백질합성 28

29 실험결과 1. AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit 를이용한 DNA 농도스크리닝 - sample; pk7-rfp - Reaction volume; 45 μl - Reaction condition; 30, 3 hr - Sampling; 총 20 μl ( 시료 5 μl + D.W. 10 μl + 4x loading dye 5 μl) 제조후, 95, 5 min 열처리 - SDS-PAGE gel running; 시료 5 μl/well 로딩 (10 x 8(cm 2 ), 10 wells) - 결과 66 kda 45 kda 29 kda M NC PC M; AccuLadder Protein Size Marker (Low) NC; Negative control (no-dna) PC; Positive control (pbivt-acgfp, 400 ng) 1; pk7-rfp 50 ng 2; pk7-rfp 100 ng 3; pk7-rfp 200 ng 4; pk7-rfp 400 ng 5; pk7-rfp 600 ng 6; pk7-rfp 800 ng 20.1 kda 2. ExiProgen EC Protein Synthesis Kit 를이용한단백질합성 - sample; pk7-rfp - Reaction volume; 750 μl 정제후최종 250 μl 회수 - Sampling; 총 20 μl ( 시료 15 μl + 4x loading dye 5 μl) 제조후, 95, 5 min 열처리 - SDS-PAGE gel running; 시료 10 μl/well 로딩 (10 x 8(cm 2 ), 10 wells) - 결과 66 kda 45 kda 29 kda M NC PC M; AccuLadder Protein Size Marker (Low) NC; Negative control (no-dna) PC; Positive control (pbivt-acgfp, 6.67 μg) 1; pk7-rfp 0.84 μg 2; pk7-rfp 1.67 μg 3; pk7-rfp 3.34 μg 4; pk7-rfp 6.68 μg 5; pk7-rfp 10 μg 6; pk7-rfp μg 20.1 kda 29

30 Related Products Cat. no. Products K-7400 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit, 16 reactions N 차 primer F/R sets (N-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 N 차 primer F/R sets (C-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 K-2631 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction/tube D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) K AccuPrep PCR Purification Kit, 50 reactions K AccuPrep Gel Purification Kit, 50 reactions C-9100 Agarose, 100 g C X TBE, 1 gal C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml K-7350 pbivt vectors set-1 K-3111 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit, 200 reactions K-3122 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Midi Extraction Kit, 25 reactions K-3131 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Maxi Extraction Kit, 25 reactions K-3030 AccuPrep Plasmid Extraction Kit 200 reactions C % Sodium Dodecyl Sulfate(SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml k-7250 AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl A MyGenie 32 Thermal Block A-7040 ExiSpin, Instrument A-7020 Agaro-Power System 1 Oligo synthesis service 문의 30

31 3.5. Effect of template DNA purity on protein synthesis 무세포단백질발현방법을이용하여단백질을합성할때, template DNA 의순도에따라서합성량에차이가있을수있습니다. 따라서 DNA 를준비하실때, 높은순도 (A260/280 값이 1.8 이상, A260/230 값이 1.5 이상 ) 로준비하는것을권장합니다. 실험결과 Template DNA 는 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit 를이용하여제작하였으며, 제작한시료를 ExiProgen EC Protein Synthesis Kit 로단백질을합성한결과, 최종시료의순도에따라단백질합성량에차이가있는것을확인할수있습니다. 1 2 Sample 이름 A260/280 A260/230 AcGFP CAT AcGFP CAT Template DNA; Each PCR product 500 ng - kit; ExiProgen EC Protein Synthesis Kit (Cat. no. K-7300) - Protocol no.; Sampling; 총 20 μl ( 시료 15 μl + 4x loading dye 5 μl) 제조후, 95, 5 min 열처리 - SDS-PAGE gel running; 시료 10 μl/well 로딩 (10 x 8 (cm 2 ), 10 wells) - 결과 66 kda 1 2 M AcGFP CAT AcGFP CAT 45 kda 29 kda 20.1 kda 14.4 kda M; AccuLadder Protein Size Marker (Low) 1; Sample group 1 2; Sample group 2 31

32 Related Products Cat. no. Products K-7400 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit, 16 reactions N 차 primer F/R sets (N-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 N 차 primer F/R sets (C-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 K-2631 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction/tube D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) K AccuPrep PCR Purification Kit, 50 reactions K AccuPrep Gel Purification Kit, 50 reactions C-9100 Agarose, 100 g C X TBE, 1gal C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml C % Sodium Dodecyl Sulfate(SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl A-5041 ExiProgen, Instrument A MyGenie 32 Thermal Block A-7040 ExiSpin, Instrument A-7020 Agaro-Power System 1 Oligo synthesis service 문의 32

33 4. Protein Expression & Purification 당사의단백질발현및합성키트는 2가지제품군으로나누어집니다. Manual 방식으로손쉽게재조합단백질발현및정제할수있는 AccuRapid series 및 ExiProgen 을이용하여전자동으로단백질을발현하고정제할수있는 ExiProgen series 로나누어집니다. 해당 kit를이용하여최소 μg단위부터최대 mg단위까지단백질의합성이가능하며, 제품군은아래와같이분류됩니다 (Template DNA 제조와관련된내용은 P.16 에서확인할수있습니다 ). 33

34 4.1. ExiProgen kits for protein synthesis (expression & purification) 한번에다종의단백질들의합성여부를보려고할때 본 kit는 ExiProgen 장비에서단백질을합성할수있는 kit입니다. template DNA를첨가한 kit를 ExiProgen 에장착한후, Protocol no. 902 ( 약 6시간 ) 를가동시키면전자동으로단백질을발현하고발현된목적단백질을 His-tag를이용하여정제합니다. 1회반응으로최대 16종의서로다른단백질을고순도로얻을수있으며, 실험환경에따라서상이한결과를얻을가능성이있는 Manual 방법과는달리재현성높은결과를얻을수있습니다. 특징및장점 Fully Automatic: DNA-in-Protein-out 1~10 μg DNA를 kit와함께 ExiProgen 에장착한후가동시키면전자동으로약 6시간이내에고순도의단백질을얻을수있습니다. High Performance 본 kit는기존의 cloning으로생산이불가능한세포독성을갖는단백질의합성도가능합니다. High Purity and High Yield 각각의반응 well 당순도 90% 이상의단백질을 100 μg 내외로얻을수있습니다. Reproducibility Template DNA 만첨가하면원하는단백질을손쉽게얻을수있어재현성이높습니다. 실험방법및원리 본 kit 를이용한실험방법은다음과같습니다. 미리준비한발현벡터또는 PCR product 를 kit 의 Cartridge 2 에첨가하고, ExiProgen 장비에장착한후, 장비를가동시킵니다. 34

35 ExiProgen 은전자동으로 30, 3 시간동안단백질을발현시킨후, Ni-affinity 를이용하여목적단백질을정제하며, 그원리는아래의그림과같습니다. 모든반응이끝난후, 목적단백질은최종적으로정제버퍼에용해된상태로회수할수있으며, 반응이끝난시료는 SDS- PAGE gel 에서확인할수있습니다. 실험결과 1. 본 kit 는형광단백질을발현할수있는 DNA 를 control 로제공하며, kit 로합성된형광단백질은아래와같이육안으로확인이가능합니다. <Detection of color> SfGFP RFP AcGFP <Detection of fluorescence> SfGFP RFP AcGFP Figure1. Detection of fluorescence emitted from fluorescent proteins synthesized with ExiProgen. This result indicates that these synthesized SfGFP, RFP, and AcGFP are functionally active. Left panel: Color of each protein elution samples detected with naked eyes Right panel: Fluorescence from protein elution samples detected with UV illuminator 2. 동시에 16 개의반응을진행할수있으며, 반응 well 사이의편차가없습니다. 66 kda 45 kda (well) M E P E P E P E P E P E P E P E P 29 kda 20.1 kda 14.4 kda 66 kda 45 kda 29 kda 20.1 kda (well) M E P E P E P E P E P E P E P E P Figure2. Expression and purification of the CAT enzyme. Reproducibility is seen in all 16 wells with no detectable variation between wells. Lane 1~16: Number of the well, M: AccuLadder Protein Size Marker (Low), E: Expression sample, P: Purification sample 14.4 kda 35

36 3. 다양한크기의단백질을동시에합성할수있습니다. (Plasmid DNA - 10~120 kda, PCR product - 10~60 kda 합성가능 ) < Template DNA; plasmid DNA > 66 kda 45 kda 29 kda 20.1 kda M M2 116 kda 97.4 kda 66 kda 45 kda 29 kda 20.1 kda M1; AccuLadder Protein Size Marker (Low) 1; CalmL3 (17.5 kda), 2; RNase H (20 kda), 3; DUSP 3 (22 kda), 4; CAT (24 kda), 5; AcGFP (29 kda), 6; EF-Ts (34 kda), 7; VF (45 kda), 8; Poly A polymerase (50 kda), 9; MMLV RTase (75 kda), 10; BM3 (117 kda) M2; AccuLadder Protein Size Marker (Broad) 14.4 kda 14.4 kda < Template DNA; PCR product > M kda 45 kda 29 kda M; AccuLadder Protein Size Marker (Low), 1; SAV (13 kda), 2; RNase H (20 kda),3; hgh (23 kda), 4; CAT (26.5 kda), 5; UDG (28 kda), 6; AcGFP (28 kda), 7; EVO (30 kda), 8; RFP (31kDa), 9; Poly A polymerase (54 kda) 20.1 kda 14.4 kda Figure 3. SDS-PAGE data of various proteins synthesized from various templates (Plasmid & PCR products). Up to 16 types of proteins can be expressed and purified simultaneously with an average of over 90% purity. Amount of loading sample is 1/35 of total sample. 4. 본 kit 로합성한단백질들은활성을나타냅니다. M E P kda 45 kda 29 kda 20.1 kda Base line BSA Negative control DUSP3 sample 14.4 kda Time(min) 36 Figure 4. SDS-PAGE & enzyme activity data of DUSP3 Left panel: Expression and purification of DUSP3 (protein tyrosine phosphatase). M: AccuLadder Protein Size Marker (Low), E: Expression sample, P: Purification sample Right panel: DUSP3 synthesized with ExiProgen has an enzyme activity. DUSP3 phosphatase activity was measured by incubating with 500 μm 3-O-methylfluorescein phosphate (OMFP). (Reaction buffer: 100 mm Tris-HCl (ph8.2), 40 mm NaCl, 1 mm DTT, 20% Glycerol)

37 166 kda 97.4 kda 66 kda 45 kda M E P M NC1 NC2 Sample 29 kda GAPDH (500 bp) 20.1 kda 14.4 kda Figure 5. SDS-PAGE & enzyme activity data of MMLV RTase. Left panel: Expression and purification of MMLV RTase. M: AccuLadder Protein Size Marker (Broad), E: Expression sample, P: Purification sample Light panel: Amplification of GAPDH of Human total RNA with MMLV RTase was synthesized with ExiProgen. Lane M: 100 bp DNA Ladder, Lane NC1: Negative control 1 (No-RNA), Lane NC2: Negative control 2 (No-enzyme), Lane Sample: 10 ng Human total RNA from HeLa cell Related Products Cat. no. Products K-7400 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit, 16 reactions N 차 primer F/R sets (N-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 N 차 primer F/R sets (C-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 K-2631 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction/tube D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) K AccuPrep PCR Purification Kit, 50 reactions K AccuPrep Gel Purification Kit, 50 reactions C-9100 Agarose, 100 g C X TBE, 1 gal C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml K-7350 pbivt vectors set-1 k-7300 ExiProgen EC Protein Synthesis Kit, 16 reactions C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl A-5041 ExiProgen, Instrument A MyGenie 32 Thermal Block A-7040 ExiSpin, Instrument A-7020 Agaro-Power System 1 Oligo synthesis service 문의 37

38 mg 이상의단백질을손쉽게얻고싶을때 본 kit 는당사의특허기술인 ExiProgen 장비의 SECF(Stepwise Exchange Cell-Free) 단백질합성법을이용하여전자동으로많은양의단백질을합성할수있는 kit 입니다. template DNA 를첨가한 kit 를 ExiProgen 에장착한후, Protocol No. 903( 약 25 시간 ) 을가동시키면하루만에순도 90% 이상의단백질을최대 500 μg 합성할수있습니다. 또한단백질발현 / 정제및투석까지모든반응이전자동으로이루어지며, 최종목적단백질은원하는 storage buffer 에용해된상태로회수할수있습니다. 특징및장점 Fully Automatic: DNA-in-Protein (in storage buffer)-out 1~6 μg DNA 를 kit 와함께 ExiProgen 에장착한후가동시키면전자동으로단백질을합성하고, 목적단백질정제용액을투석버퍼로치환한상태로회수할수있습니다. Parallel Processing 본 kit 는 1~8 종의단백질을동시에합성할수있습니다. High Purity and High Yield 각각의반응 well 당순도 90% 이상의단백질을최대 500 μg 까지얻을수있습니다. 실험방법및원리 본 kit 는당사의 SECF 단백질발현법을이용하여단백질을발현하고, 발현된단백질을 Ni-NTA magnetic bead 를이용하여정제하는 kit 입니다. SECF 단백질발현법은단백질발현에필요한에너지원등을단계적으로공급해주어단백질발현효율을극대화시킨 kit 이며, 실험개요는아래와같습니다 상기와같이 Template DNA 를 kit 에서제공하는 E. coli extract 와 Master mix 와함께섞은후, 이반응용액을반응튜브에첨가하시기바랍니다. 그후반응튜브를 ExiProgen 의반응블록에삽입한후, 나머지 kit 를장착하고장비를가동시키면됩니다. 그후, ExiProgen 은아래와같은방식으로단백질발현에필요한아미노산과에너지원을단계적으로공급하면서단백질을발현시키고, ExiProgen EC Protein Synthesis Kit 의정제방법과동일한방식으로 Ni-affinity 를이용하여목적단백질을정제하게됩니다. Note) Template DNA로 ExiProgen ProXpress PCR template Kit를이용하여제작한 PCR product를사용하는경우, ExiProgen EC Protein Synthesis Kit에비해합성량이크게증가되지않기때문에, 본 kit를사용하실때에는 T7 expression vector plasmid (pbivt, pk7, pivex, pet 등 ) 에목적단백질유전자를상입한 plasmid DNA를 template DNA로사용하실것을권장합니다. 38

39 Note) Template DNA 로 ExiProgen ProXpress PCR template Kit 를이용하여제작한 PCR product 를사용하는경우, ExiProgen EC Protein Synthesis Kit 에비해합성량이크게증가되지않기때문에, 본 kit 를사용하실때에는 T7 expression vector plasmid (pbivt, pk7, pivex, pet 등 ) 에목적단백질유전자를상입한 plasmid DNA 를 template DNA 로사용하실것을권장합니다. 실험결과 1. 다양한크기의단백질을동시에합성할수있으며, 각단백질당최대 500 μg 까지합성이가능합니다. M1; AccuLadder Protein Size Marker (Low) 1; CalmL3 (17.5 kda), 2; DUSP 3 (22 kda), 3; CAT (24 kda), 4; AcGFP (29 kda), 5; RFP(30 kda), 6; EF-Ts (34 kda), 7; VF (45 kda), 8; BM3 (117 kda) M2; AccuLadder Protein Size Marker (Broad) Figure 1. Expression and purification of various proteins. Proteins can be expressed and purified simultaneously with an average of over 90% purity. Amount of loading sample is 1/80 of total sample. Related Products Cat. no. Products K-7310 ExiProgen EC-Maxi Protein Synthesis Kit, 8 reactions K-7350 pbivt vectors set-1 K-3111 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit, 200 reactions K-3122 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Midi Extraction Kit, 25 reactions K-3131 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Maxi Extraction Kit, 25 reactions K-3030 AccuPrep Plasmid Extraction Kit 200 reactions C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml K-7250 AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl A-5041 ExiProgen, Instrument 39

40 Histidine Tag 이제거된단백질을얻고자할때 본 kit 는당사의 ExiProgen 장비를이용하여원형그대로의단백질을전자동으로합성할수있는 kit 입니다. 목적단백질을 His-tag 이있는상태로발현시킨후, 이를제거하여고순도의단백질을얻을수있는 kit 입니다. Template DNA 를첨가한 kit 를 ExiProgen 에장착한후, Protocol no. 904 ( 약 25 시간 ) 를가동시키면하루만에순도 95% 이상의목적단백질을얻을수있으며, 최종목적단백질은 storage buffer 에용해된상태로회수할수있습니다. 특징및장점 Protein Synthesis without His-tag Template DNA 를 kit 와함께 ExiProgen 에장착한후가동시키면전자동으로단백질을발현되고, 발현된목적단백질은 Protease 의처리에의해서 His-tag 이제거된상태로회수됩니다. Fully Automatic: DNA-in-Protein (in storage buffer)-out 목적단백질은투석버퍼에용해된상태로회수됩니다. Parallel Processing and High Purity 본 kit 는 1~8 종의단백질을동시에합성할수있으며, 순도 95% 이상의단백질을얻을수있습니다. 실험방법및원리 본 kit 는당사의 ExiProgen EC-Maxi Protein Synthesis Kit 와같이 SECF 법으로단백질을발현시키고, 발현된단백질을 Ni-NTA magnetic bead 와결합시킨후, kit 에포함되어있는특정아미노산서열을인식하여자르는 TEV (Tobacco Etch Virus) protease 를처리하여순수한목적단백질을정제할수있는 kit 로, 실험방법과원리는아래와같습니다. 40

41 Template DNA 구조 본 kit 로단백질을발현하기위해서 template DNA 는아래와같은구조로되어있어야합니다. T7 Promoter---RBS ATG 6x His-tag - TEV site - Target stop T7 terminator 즉, 5 - 말단에 6x His-tag 과 TEV site 의서열을서열을가지고있어야하며, 이때, TEV site 의아미노산서열은다음과같습니다. 이서열을기반으로합성된단백질은정제과정을마친후, 최종적으로목적단백질앞에 Glycine ( 또는 Serine) 아미노산한개만을추가로가지게됩니다. X의위치에는 20개의아미노산중어느것이나사용가능하며, Positive control로제공되는 DNA의서열은 Glu- Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly을암호화하고있습니다. Note) 단, 목적단백질의 N-terminal에다른아미노산이있을때발현이저해되거나, 용해도가낮아지는단백질에는사용이불가능할수도있습니다. 따라서본 kit를사용하기전에 AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit (26 page 참조 ) 를이용하여 template DNA의발현여부를확인하시기를권장합니다. 실험결과 1. 다양한크기의단백질을동시에합성할수있으며, 각단백질당 200 μg 내외로합성이가능합니다. ExPression sample M ExPression sample M kda 45 kda 29 kda 66 kda 45 kda 29 kda 20.1 kda 14.4 kda 20.1 kda 14.4 kda Figure 1. Expression and purification of various proteins. M; AccuLadder Protein Size Marker (Low) (Bioneer, D-2020), 1; DUSP3 (22 kda), 2; hgh (23 kda), 3; AcGFP (28 kda), Note) DUSP3: Dual specificity protein phosphatase 3, hgh: Human growth hormone 2. 본 kit로발현, 정제된단백질의최종형태는 His-tag이없는목적단백질입니다. 1. SDS-PAGE Gel Data 2. Western Blot Data (k Da) M Figure 2. Data of SDS-PAGE and Western blot with His-tag antibody M: AccuLadder Protein Size Marker (Low), 1: Expression sample of pbivt-tev-acgfp 2: His-tag-TEV-AcGFP (His tagged sample), 3: AcGFP (His tag-free sample) 41

42 Application 본 kit 는목적단백질을 His-tag 이없는상태로고순도로합성할수있으므로, 단백질의구조분석이나, 단백질의약품개발, 항원단백질합성에응용될수있습니다. Related Products Cat. no. Products K-7320 ExiProgen EC-Tagfree Protein Synthesis Kit, 8 reactions K-7400 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit, 16 reactions N 차 primer F/R sets (N-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 N 차 primer F/R sets (C-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 K-2631 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction/tube D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) K AccuPrep PCR Purification Kit, 50 reactions K AccuPrep Gel Purification Kit, 50 reactions C-9100 Agarose, 100 g C X TBE, 1 gal C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml K-7350 pbivt vectors set-1 K-3111 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit, 200 reactions K-3122 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Midi Extraction Kit, 25 reactions K-3131 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Maxi Extraction Kit, 25 reactions K-3030 AccuPrep Plasmid Extraction Kit 200 reactions C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl A-5041 ExiProgen, Instrument A MyGenie 32 Thermal Block A-7040 ExiSpin, Instrument A-7020 Agaro-Power System 1 Oligo synthesis service 문의 42

43 4.1.4 Disulfide bond 가있는목적단백질을얻고자할때 본 kit 는당사의 ExiProgen 장비를이용하여이황화결합 (disulfide bond) 을가지고있는목적단백질을전자동으로합성할수있는 kit 입니다. Template DNA 를첨가한 kit 를 ExiProgen 에장착한후, Protocol no. 905 ( 약 36 시간 ) 를가동시키면단백질발현 / 정제및투석까지모든반응이하루만에전자동으로이루어지며, 최종목적단백질은 storage buffer 에용해된상태로회수할수있습니다 특징및장점 Protein Synthesis with Disulfide Bond 본 kit 는이황화결합 (1~9 개 ) 을가지고있는단백질을합성하는데사용되며, 합성된단백질은고유의활성을나타냅니다. Fully Automatic: DNA-in-Protein (in storage buffer)-out 목적단백질은투석버퍼에용해된상태로회수됩니다. Parallel Processing System 본 kit 는 1~8 종의단백질을동시에합성할수있습니다. 실험방법및원리 본 kit 는단백질발현시에너지원등을지속적으로공급해주는 SECF(Stepwise Exchange Cell-Free) 방법을사용하여단백질을발현시키며, 발현된단백질을 Ni-NTA magnetic bead 를이용하여정제하는 kit 입니다. 또한본 kit 는단백질발현시최적의단백질 folding 을돕기위한샤페론단백질이첨가되어있고이황화결합을갖는단백질을합성할수있도록최적의조성으로구성되어있습니다. 43

44 실험결과 1. 본 kit 로이황화결합을갖는단백질을합성할수있으며, 합성된단백질은고유의활성을나타냅니다. M kda 45 kda 29 kda 20.1 kda Amount of active rpa (ug/ml) Figure 1. SDS-PAGE & enzyme activity data Left Pannel: Expression and purification of ScFV and rpa. M: AccuLadder Protein Size Marker (Low), 1: ScFV (it has 2 disulfide bonds.), 2: rpa (it has 9 disulfide bonds) * Amount of purification sample is 1/40 of total sample Right panel: rpa synthesized has an enzyme activity. 1: Synthesis sample using ExiProgen EC-Maxi Protein Synthesis Kit 2: Synthesis sample using ExiProgen EC-Disulfide Protein Synthesis Kit * rpa activity was measured by incubating with chromogenic substrate S-2288 Application 본 kit 는 pharmaceutical protein,scfv 합성및항체스크리닝에응용될수있습니다. 44

45 Related Products Cat. no. Products K-7330 ExiProgen EC-Disulfide Protein Synthesis Kit, 8 reactions K-7400 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit, 16 reactions N 차 primer F/R sets (N-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 N 차 primer F/R sets (C-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 K-2631 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction/tube D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) K AccuPrep PCR Purification Kit, 50 reactions K AccuPrep Gel Purification Kit, 50 reactions C-9100 Agarose, 100 g C X TBE, 1 gal C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml K-7350 pbivt vectors set-1 K-3111 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit, 200 reactions K-3122 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Midi Extraction Kit, 25 reactions K-3131 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Maxi Extraction Kit, 25 reactions K-3030 AccuPrep Plasmid Extraction Kit 200 reactions C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl A-5041 ExiProgen, Instrument A MyGenie 32 Thermal Block A-7040 ExiSpin, Instrument A-7020 Agaro-Power System 1 Oligo synthesis service 문의 45

46 4.2. AccuRapid kits for protein expression The easy method for protein synthesis!! AccuRapid Protein Synthesis Kit 는매뉴얼방식으로원하는단백질의발현및정제여부를확인할수있는 kit 입니다. 본 kit 는 E. coli 무세포발현및 Ni-affinity 정제실험에사용되는모든구성품을포함하고있으며, 반응당정제된목적단백질을 100 μg 내외로회수할수있습니다. 특징및장점 High Simplicity and High Performance 세포를이용하지않고시험관튜브내에서손쉽게단백질을합성할수있으며, 기존의세포배양방법으로발현이불가능했던단백질도합성이가능합니다. Flexibility T7 시스템에서발현이가능한다양한 DNA 로부터원하는단백질의발현및정제여부를손쉽게확인할수있습니다. Compatibility ExiProgen EC Protein Synthesis Kit 와호환이가능합니다. 실험방법 본 kit 를이용한실험방법은다음과같습니다. 미리준비한발현벡터또는 PCR product 를키트에서제공되는 E. coli extract 와 Master mix 와혼합한후, 이반응물을 water bath 에넣고, 30 에서단백질을발현시킵니다. 그후, 발현이끝난시료를 kit 에서제공하는 Ni- NTA magnetic bead 와 buffer 를이용하여목적단백질을정제합니다. 46

47 일반적으로 SDS-PAGE gel 에서확인할수있으며, 만약확인이어려운경우에는 Western blot 이나형광값측정방법등을이용하여확인하면됩니다. 실험결과 AccuRapid Protein Synthesis Kit 를이용한단백질합성 Expression sample Purification sample Figure 1. SDS-PAGE data of various proteins synthesized from various templates M; AccuLadder Protein Size Marker (Broad) 1; CalmL3 (17.5 kda), 2; DUSP 3 (22 kda), 3; CAT (24 kda), 4; AcGFP (29 kda), 5; ERFP (31 kda), 6; EF-Ts (34 kda), 7; VF (45 kda), 8; BM3 (117 kda) Related Products Cat. no. Products K-7280 AccuRapid Protein Synthesis Kit, 5 reactions K-7400 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit, 16 reactions N 차 primer F/R sets (N-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 N 차 primer F/R sets (C-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 K-2631 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix, 96 tubes, 20 ul reaction/tube D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) K AccuPrep PCR Purification Kit, 50 reactions K AccuPrep Gel Purification Kit, 50 reactions C-9100 Agarose, 100 g C X TBE, 1 gal C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml K-7350 pbivt vectors set-1 K-3111 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit, 200 reactions K-3122 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Midi Extraction Kit, 25 reactions K-3131 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Maxi Extraction Kit, 25 reactions K-3030 AccuPrep Plasmid Extraction Kit 200 reactions C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml D-2010 AccuLadder Protein Size Marker (Broad), 500 μl A MyGenie 32 Thermal Block A-7040 ExiSpin, Instrument A-7020 Agaro-Power System 47

48 Screening for protein expression 본 kit 는반응튜브내에서 template DNA 를이용하여 3 시간만에원하는단백질의발현을확인할수있는 kit 로서 E. coli extract 와 Master mix 를포함하고있습니다. 이중 E. coli extract 에는 T7 RNA polymerase, ribosome 등이포함되어이고, Master mix 는아미노산, NTPs, 에너지원등이포함되어 template DNA 만있으면, 손쉽게목적단백질의발현을확인할수있습니다. Related Products Cat. no. Products K-7250 AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit, 45 μl x 24 reactions K-7400 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit, 16 reactions N 차 primer F/R sets (N-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 N 차 primer F/R sets (C-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 K-2631 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction/tube D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) K AccuPrep PCR Purification Kit, 50 reactions K AccuPrep Gel Purification Kit, 50 reactions C-9100 Agarose, 100 g C X TBE, 1 gal C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml K-7350 pbivt vectors set-1 K-3111 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit, 200 reactions K-3122 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Midi Extraction Kit, 25 reactions K-3131 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Maxi Extraction Kit, 25 reactions K-3030 AccuPrep Plasmid Extraction Kit 200 reactions C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl A MyGenie 32 Thermal Block A-7040 ExiSpin, Instrument A-7020 Agaro-Power System 1 Oligo synthesis service 문의 48

49 Protein expression with manual kit 본 kit 는당사의무세포발현시스템을이용하여단백질을발현할수있는매뉴얼타입의 kit 로, kit 에는무세포단백질발현에필요한 E. coli extract 와 Master mix 가포함되어있습니다. 각각의용액은총 1 ml x 5 reactions 의단백질발현용액을만들수있도록제공되고있으며, 실험에따라서원하시는반응용량 (ex) 500 μl 발현또는 750 μl 발현에맞게비율을조절하여사용가능합니다. Template DNA 를첨가한반응액을제조한, 1.5 ml 튜브에넣어밀폐하여 30 항온조에서 3 시간동안유지시켜주면단백질이발현됩니다. 본 kit 를이용하면 300 μl/ml 내외의단백질이발현가능합니다. 만약단백질의용해도를높이고자한다면온도를낮추어반응을진행합니다. 본 kit 는당사의무세포발현시스템을이용하여단백질을발현할수있는매뉴얼타입의 kit 로, kit 에는무세포단백질발현에필요한 E. coli extract 와 Master mix 가포함되어있습니다. 각각의용액은총 10 ml x 1 reactions 의단백질발현용액을만들수있도록제공되고있으며, 실험에따라서원하시는반응용량에맞게조절하여사용가능합니다. Template DNA 를첨가한반응액을제조한후, 15~50 ml 튜브에넣어밀폐하여 30 항온조에서 3 시간동안유지시켜주면단백질이발현됩니다. 또한본 kit 는무세포발현시스템의 CECF(Continuous Exchange Cell-Free) 단백질합성의원리를이용하여고효율로단백질을대량으로발현할수있으며, 이때에는추가로 K AccuRapid Protein Expression Kit_Feeding buffer 를구매하신후, 사용하실수있습니다. Template DNA 를첨가한반응액을투석용멤브레인에넣고반응액이들어있는멤브레인을밀봉하여, 적절한반응용기에넣습니다. 그후, 멤브레인이잠길정도로반응용기를채운후, 30 항온장비 (shaking 가능 ) 에서 16 시간이상동안유지시켜주면고농도로목적단백질이발현됩니다. Related Products Cat. no. Products K-7260 AccuRapid Midi Protein Expression Kit, 1 ml x 5 reactions K-7270 AccuRapid Maxi Protein Expression Kit, 10 ml x 1 reaction K-7350 pbivt vectors set-1 K-3111 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit, 200 reactions K-3122 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Midi Extraction Kit, 25 reactions K-3131 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Maxi Extraction Kit, 25 reactions K-3030 AccuPrep Plasmid Extraction Kit 200 reactions C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl 49

50 4.3. ExiProgen kit for protein purification ExiProgen 을이용하여재조합단백질이발현된 E. coli 세포또는무세포발현시료로부터단백질을정제할수있으며, 그원리는아래의그림과같습니다. N 말단또는 C 말단에 6x His-tag 을가지고있는단백질을발현시킨시료를전처리하여 kit 에넣은후장비를가동시키면, Ni-affinity 를이용하여전자동으로목적단백질을정제할수있습니다. Equilibrium buffer 로평형화된자성입자에세포파쇄액또는무세포발현시료가첨가되면, 목적단백질의 His-tag 이자성입자표면의니켈이온과결합하게됩니다. 그후, washing buffer 를이용하여자성입자와반응용기내의불순물을세척하고, imidazole 이포함된 elution buffer 를이용하여자성입자로부터목적단백질을분리합니다. 50

51 Cell-free protein 의 purification 본 kit 는 ExiProgen 을사용 (protocol no. 901) 하여재조합단백질이발현된 E. coli 파쇄액또는무세포단백질발현시료로부터 His-tag 을가지고있는목적단백질을고순도로정제할수있는 kit 입니다. 본 kit 는 ExiProgen 을사용 (protocol no. 901) 하여재조합단백질이발현된 E. coli 파쇄액또는무세포단백질발현시료로부터 His-tag 을가지고있는목적단백질을고순도로정제할수있는 kit 입니다. kit 내에는 Ni-NTA magnetic bead 와정제에필요한버퍼가 pre-filled 되어있는 cartridge 가포함되어있습니다. Ni-NTA magnetic bead 는당사가개발한자성실리카입자로외부에노출된니켈이온이단백질의 His-tag 과결합할수있어, his-tag 을가지고있는목적단백질을고순도로정제할수있습니다. 특징및장점 Availability of Various Sample 본 kit 는 In vivo (E. coli 발현 ) 또는 In vitro ( 무세포발현 ) 로발현된재조합단백질의정제가가능합니다. Pre-filled Buffer Cartridge System 단백질정제에필요한모든버퍼가들어있는 pre-filled cartridge 가제공되므로, 세포파쇄액또는무세포단백질발현시료만준비하시면즉시사용이가능합니다. Parallel Processing and High Purity 본 kit 는 1~16 종의단백질을동시에정제할수있으며, 순도 90% 이상의단백질을얻을수있습니다. 실험방법 본 kit 를이용한실험방법은다음과같습니다. 미리준비한세포파쇄액또는무세포발현시료를 kit 의 Cartridge 2 에첨가하고, ExiProgen 장비에장착한후, 장비를가동시킵니다. 모든반응이끝난후, 목적단백질은최종적으로정제버퍼에용해된상태로회수할수있으며, 반응이끝난시료는 SDS-PAGE gel 에서확인할수있습니다. 51

52 실험결과 1. 목적단백질발현세포준비 M BI I 45 kda 29 kda 20.1 kda Figure 1. Recombinant E. coli cell with expressed of DUSP3. M: AccuLadder Protein Size Marker (Low), BI; Pre-induction sample I; Post-Induction sample 2. ExiProgen 을이용한단백질정제 M CL P 45 kda 29 kda Figure 2. Purification of DUSP3 with ExiProgen. M: AccuLadder Protein Size Marker (Low), CL; Sample of recombinant cell lysate P; Sample of purification 20.1 kda Related Products Cat. no. Products K-7220 ExiProgen His-Tagged Protein Purification Kit, 16 reactions C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl A-5041 ExiProgen, Instrument 52

53 Modified Protein 의 purification ExiProgen Cell-Based Protein Purification Kit 는 ExiProgen 을사용 (protocol no. 906, 약 7 시간 ) 하여 eukaryotic cell 에서발현된목적단백질을고순도로정제할수있는 kit 입니다. 본 kit 에는 Cell lysis buffer, Ni-NTA magnetic bead, 정제및투석버퍼등이포함되어있어, 목적단백질이포함된세포추출물또는세포배양액을첨가하면전자동으로목적단백질을고순도로정제한후, 단백질보관용완충용액에투석한상태로회수할수있습니다. 특징및장점 Fully Automatic: Cell-in-Protein (in storage buffer)-out 재조합단백질 (his-tagged protein) 발현시료를 kit 에넣은후 ExiProgen 에장착한후가동시키면, 투석버퍼에용해된목적단백질을회수할수있습니다. Pre-filled Buffer Cartridge System 세포파쇄, 단백질정제및투석에필요한모든버퍼가들어있는 pre-filled cartridge 가제공되므로, 시료만준비하면즉시사용이가능합니다. Parallel Processing and High Purity 본 kit 는 1~8 종의단백질을동시에정제할수있으며, 고순도의단백질을얻을수있습니다. 실험방법 본 kit 를이용한실험방법은다음과같습니다. 미리준비한세포파쇄액또는세포배양액을 kit 의 Cartridge 2 에첨가하고, ExiProgen 장비에장착한후, 장비를가동시키면됩니다. 모든반응이끝난후, 목적단백질은최종적으로투석버퍼에용해된상태로회수할수있으며, 반응이끝난시료는 SDS-PAGE gel running 또는 Western blot 으로확인할수있습니다. 53

54 실험결과 1. 목적단백질발현세포준비 Light Fluorescent Figure 1. Light and fluorescent microscope images of HEK293 cells. HEK293 cells were transfected with 2 μg of AcGFP expression plasmid mixed with Lipofectamine 2000 in a 6-well plate. AcGFP expression was assessed under fluorescent microscope 48 hours after later. 2. ExiProgen 을이용한단백질정제 Figure 2. Purification of AcGFP with ExiProgen. M: AccuLadder Protein Size Marker (Low), CL; Sample of recombinant cell lysate P; Sample of purification Related Products Cat. no. Products K-7230 ExiProgen Cell-Based Protein Purification Kit, 16 reactions C % Sodium dodecyl sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl A-5041 ExiProgen, Instrument 54

55 4.4. Level up of protein expression Codon optimization for the maximal expression of the protein Eukaryotic gene 을무세포단백질발현방법을이용하여단백질을합성할때에는서열특이성때문에 E. coli 에서발현이잘되지않는경우가많습니다. 이러한경우에는동일한유전자에대해서 E. coli codon optimization 을하여 gene 합성한후, 사용하면단백질합성량을높일수있습니다. 실험결과 Eukaryotic gene 중하나인 FGF2 (Fibroblast Growth Factor-2) 유전자를가지고단백질을합성한결과, E. coli codon optimized DNA 를사용한경우단백질합성량이크게증가하는것이확인할수있습니다. - Template DNA; pbivt-fgf2, pbivt-fgf2_opti. - kit; ExiProgen EC Protein Synthesis kit (Cat. no. K-7300) - Protocol No.; Sampling; 총 20 μl ( 시료 15 μl + 4x loading dye 5 μl) 제조후, 95, 5min 열처리 - SDS-PAGE gel running; 시료 10 μl/well 로딩 (10 x 8 (cm 2 ), 10 wells) - 결과 M; AccuLadder Protein Size Marker (Low) Negative; Negative control (No-DNA), FGF2; pbivt-fgf2 (Original sequences) FGF2_opti.; pbivt-fgf2_opti. (E. coli codon optimized sequences) E; Expression sample, P; Purification sample Related Products Cat. no. Products K-7300 ExiProgen EC Protein Synthesis Kit, 16 reactions K-7310 ExiProgen EC-Maxi Protein Synthesis Kit, 8 reactions K-7320 ExiProgen EC-Tagfree Protein Synthesis Kit, 8 reactions K-7330 ExiProgen EC-Disulfide Protein Synthesis Kit, 8 reactions K-7350 pbivt vectors set-1 1 D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl 1 Gene synthesis service 문의 55

56 Batch expression vs Continuous expression 무세포단백질발현시, 에너지원이한정되어있는경우에는단백질발현양이제한적일수있습니다. 따라서투석막을이용하여에너지원을지속적으로공급하는경우에는단백질발현양이증가될수있습니다. 실험결과 본실험에서세포배양방법으로합성이어려운 Poly A polymerase 를에너지원이한정되어있는 batch 방식의무세포발현법과에너지원을지속적으로공급하는 Continuous 방식의무세포발현법으로합성을하였으며, Continuous 방식으로발현시최종합성량이증가될수있음을확인하였습니다. 1. Template DNA ; pet15b(+)-poly A polymerase (6 μg) 2. Protein Expression Condition - kit; AccuRapid Midi Protein Expression Kit 1 Batch type - Reaction mixture; volume μl - Reaction condition; temperature 26ºC, time - 3 hrs - Equipment; water bath 2 Continuous type - Reaction mixture; volume 750 μl - AccuRapid Protein Expression Kit Feeding buffer; 100 ml - Cut off size of dialysis membrane; 6-8 kda - Reaction condition; temperature 26ºC, time 22 hrs - Equipment; Hybridization incubator 3. Protein Purification Condition - Bead; Ni-NTA magnetic bead 50 mg - Final sample; 0.25 ml 4. Result - Sampling Expression; 시료 5 μl + 4x loading dye 5 μl + D.W. 10 μl 로제조후, 95ºC, 5 min 열처리 Purification; 시료 15 μl + 4x loading dye 5 μl 로제조후, 95ºC, 5 min 열처리 - SDS-PAGE gel running Expression; 5 μl/well Purification; 10 μl/well 1 Batch type 2 Continuous type M: AccuLadder Protein Size Marker (Low), E; Expression, P; Purification 56

57 Related Products Cat. no. Products K-7270 AccuRapid Maxi Protein Expression Kit, 10 ml x 1 reaction K AccuRapid Protein Expression Kit_Feeding buffer K-7350 pbivt vectors set-1 K-3111 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit, 200 reactions K-3122 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Midi Extraction Kit, 25 reactions K-3131 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Maxi Extraction Kit, 25 reactions K-3030 AccuPrep Plasmid Extraction Kit 200 reactions C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl A-5041 ExiProgen, Instrument 57

58 Effect of reaction temperature on protein synthesis ExiProgen 을이용한무세포단백질합성시, 단백질발현온도는최종단백질합성량에영향을줄수있으며, 단백질에따라서최적의합성온도가다를수있습니다. 실험결과 본실험에서 AcGFP (Aequorea victoria green fluorescence protein), CAT (Chloramphenicol acetyl transferase), FGF2 (Fibroblast growth factor 2), hgh (Human growth hormone), Poly A polymerase 및이황화결합을가진단백질 ScFV (Single chain antibody), rpa (Recombinant plasminogen activator) 의단백질합성시반응온도의영향에대해확인하였습니다. 1. Template DNA ; pbivt-acgfp (6 μg), pbivt-cat (6 μg), pbivt-fgf2 (1.2 μg), pbivt-hgh (1.2 μg), pet15b(+)-poly A polymerase (6 μg), ScFV (1 μg), rpa (2 μg) 2. 각키트를이용한단백질합성 1 Normal Proteins - Sample; AcGFP, CAT, FGF2, hgh, Poly A polymerase - kit; ExiProgen EC-Maxi Protein Synthesis Kit - Reaction temperature; 26, 30, 34ºC - Protocol No.; Disulfide bonded proteins - Sample; ScFV, rpa - kit; ExiProgen EC-Disulfide Protein Synthesis Kit - Reaction temperature; 18, 26, 34ºC - Protocol No.; Result 1 Normal Proteins - Sampling; 총 20 μl ( 시료 5 μl + 4x loading dye 5 μl + ADW 5 μl) 제조후, 95ºC, 5 min 열처리 - SDS-PAGE gel running; 시료 10 μl/well 로딩 (10 x 8(cm 2 ), 10 wells) M : AccuLadder Protein Size Marker (Low), 26; 26 ºC setting, 30; 30 ºC setting, 34; 34 ºC setting 58

59 2 Disulfide bonded proteins - Sampling; 총 20 μl ( 시료 15 μl + 4x loading dye 5 μl) 제조후, 95ºC, 5 min 열처리 - SDS-PAGE gel running; 시료 10 μl/well 로딩 (10 x 8(cm 2 ), 10 wells) M : AccuLadder Protein Size Marker (Low), 18; 18ºC setting, 26; 26ºC setting, 34; 34ºC setting Related Products Cat. no. Products K-7310 ExiProgen EC-Maxi Protein Synthesis Kit, 8 reactions K-7320 ExiProgen EC-Tagfree Protein Synthesis Kit, 8 reactions K-7330 ExiProgen EC-Disulfide Protein Synthesis Kit, 8 reactions K-7400 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit, 16 reactions N 차 primer F/R sets (N-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 N 차 primer F/R sets (C-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 K-2631 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction/tube D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl ) K AccuPrep PCR Purification Kit, 50 reactions K AccuPrep Gel Purification Kit, 50 reactions C-9100 Agarose, 100 g C X TBE, 1 gal C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml K-7350 pbivt vectors set-1 K-3111 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit, 200 reactions K-3122 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Midi Extraction Kit, 25 reactions K-3131 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Maxi Extraction Kit, 25 reactions K-3030 AccuPrep Plasmid Extraction Kit 200 reactions C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl A-5041 ExiProgen, Instrument A MyGenie 32 Thermal Block A-7040 ExiSpin, Instrument A-7020 Agaro-Power System 1 Oligo synthesis service 문의 59

60 5. Application 5.1. ExiProgen kit 를이용한독성단백질합성 일반적으로세포에독성을나타내는유전자는세포배양방법으로단백질을합성하기어려울뿐만아니라이유전자가클로닝된발현벡터를증량도어려울수있습니다. 따라서이러한독성유전자를발현시키기위해서무세포단백질발현방법으로단백질을발현하는당사의 ExiProgen 시스템이활용될수있습니다. 실험결과 당사는독성유전자중 DNase I 과 Proteinase K 의유전자를합성하여 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit 로단백질발현용 template 를제작하였으며, 이 DNA 를이용하여 ExiProgen 으로단백질을합성하였습니다 1. Gene synthesis - 바이오니아 Gene synthesis service 를이용한유전자합성및 T vector 클로닝 2. Template DNA 제작 - Template DNA; pt-dnase I, pt-proteinase K - kit; ExiProgen ProXpress PCR Template Kit (Cat no. K-7400) M NC DNase NC ProteinaseK M; 100 bp DNA Ladder (Bioneer, D-1030), NC; Negative control (No-template) 1; Dnase (Template pt), 2; Proteinase K (Template pt) 3. 단백질발현확인 - Template DNA; DNase I, Proteinase K PCR products each 10 ng - kit; AccuRapid Cell-Free Protein Expression kit (Cat. No. K-7250) - 반응조건 ; MyGenie 96으로 30ºC, 3시간반응 - Sampling; 총 20 μl ( 시료 5 μl + DW 10 μl+ 4x loading dye 5 μl) 제조후, 95ºC, 5 min 열처리 - SDS-PAGE gel running; 시료 5 μl/well 로딩 (10 x 8(cm 2 ), 10 wells) - 결과 M NC PC DNase PK 66 kda 45 kda 29 kda M: AccuLadder Protein Size Marker (Low), NC; Negative control (No-DNA), PC; Positive control (AcGFP), DNase; DNase I, PK; Proteinase K 20.1 kda 60

61 4. 단백질합성 - Template DNA; DNase I, Proteinase K PCR products each 500 ng - kit; ExiProgen EC Protein Synthesis Kit (Cat. no. K-7300) - Protocol No. ; Sampling; 총 20 μl ( 시료 15 μl + 4x loading dye 5 μl) 제조후, 95ºC, 5 min 열처리 - SDS-PAGE gel running; 시료 10 μl/well 로딩 (10 x 8(cm 2 ), 10 wells) - 결과 (k Da) M PC DNase PK M: AccuLadder Protein Size Marker (Low), NC; Negative control (No-DNA), PC; Positive control (AcGFP), DNase; DNase I, PK; Proteinase K 단백질활성확인 (A) DNase I M NC S Lambda DNA was degraded by DNase I synthesized with ExiProgen. (All sample were incubated at 37ºC for 3 hours.) M: 1 kb DNA Ladder (D-1040, Bioneer), NC: Negative control (No DNase I treated) S: DNase I treated sample (B) Proteinase K M NC S BSA protein was degraded by Proteinase K synthesized with ExiProgen. (All sample were incubated at 37ºC for 16 hours.) M: AccuLadder Protein Size Marker (Low) (D-2020, Bioneer), NC: Negative control (No Proteinase K treated), S: Proteinase K treated sample 61

62 Related Products Cat. no. Products k-7300 ExiProgen EC Protein Synthesis Kit, 16 reactions K-7400 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit, 16 reactions N 차 primer F/R sets (N-terminus 6x His-tag), each 5 nmole N 차 primer F/R sets (C-terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 K-2631 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction/tube D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) K AccuPrep PCR Purification Kit, 50 reactions K AccuPrep Gel Purification Kit, 50 reactions C-9100 Agarose, 100 g C X TBE, 1 gal C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml K-7350 pbivt vectors set-1 K-3111 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit, 200 reactions K-3122 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Midi Extraction Kit, 25 reactions K-3131 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Maxi Extraction Kit, 25 reactions K-3030 AccuPrep Plasmid Extraction Kit 200 reactions C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl A-5041 ExiProgen, Instrument A MyGenie 32 Thermal Block A-7040 ExiSpin, Instrument A-7020 Agaro-Power System 1 Oligo synthesis service 문의 62

63 5.2. ExiProgen kit 를이용한막단백질합성 일반적으로막단백질은일반적인 E. coli 발현환경 (in vivo 또는 in vitro) 에서는발현되기어려우며, detergent 를첨가해주어야합성이가능합니다. 당사의 ExiProgen 단백질합성 kit 를이용하면 detergent 첨가만으로도손쉽게막단백질을합성할수있습니다. 실험결과 본실험에서는막단백질중 FLAP (5-lipoxygenase activating protein, 4 개의 transmembrane domain 을가짐 ) 와 br (bacteriorhodopsin, 7 개의 transmembrane domain 을가짐 ) 의유전자를합성하여 pet32a (+) 에클로닝하여단백질발현용벡터를제작하였으며, 이발현벡터를 template 로하여 ExiProgen 으로단백질을합성하였습니다. 1. Gene synthesis - 바이오니아 Gene synthesis service 를이용한 E. coli codon optimized 유전자합성 2. Cloning 방법을이용한 Template DNA 제작 - Vector DNA; pet32a(+) - Insert DNA; pt-flap, pt-br - Competent cell; DH-5a M; 100bp DNA Ladder (Bioneer, D-1030), 1; pet32a(+)-flap, 2; pet32a(+)-br 3. 단백질합성 - Template DNA; pet32a(+)-flap (3 μl), ; pet32a(+)-br (6 μg) - kit; ExiProgen EC Protein Synthesis Kit (Cat. no. K-7300) Detergent 첨가 - 발현용액과정제버퍼에 final 0.5% BriJ35 첨가 - Protocol no. ; Sampling; 총 20 μl ( 시료 5 μl + 4x loading dye 5 μl) 제조후, 95ºC, 5 min 열처리 - SDS-PAGE gel running; 시료 10 μl/well 로딩 (10 x 8(cm 2 ), 10 wells) - 결과 M: AccuLadder Protein Size Marker (Low), 1; FLAP (35 kda), 2 ; br (43 kda) 63

64 Related Products Cat. no. Products K-7300 ExiProgen EC Protein Synthesis Kit, 16 reactions D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) C-9100 Agarose, 100 g C X TBE, 1 gal C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml K-7350 pbivt vectors set-1 K-3111 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit, 200 reactions K-3122 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Midi Extraction Kit, 25 reactions K-3131 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Maxi Extraction Kit, 25 reactions K-3030 AccuPrep Plasmid Extraction Kit 200 reactions C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl A-5041 ExiProgen, Instrument A-7020 Agaro-Power System 1 Oligo synthesis service 문의 64

65 5.3. ExiProgen kit 를이용한상업용단백질합성 Potential Value of ExiProgen! ExiProgen 은 template DNA 만가지고있다면, 누구나손쉽게단백질을만들수있는장비입니다. 따라서실험실에서사용하는단백질중상업적으로판매되고있는고가의단백질도 ExiProgen 으로손쉽게만들어사용할수있습니다. 1. 제조사별단위가격비교표 단백질이름 회사 제품구성 가격 ( 원 ) 단가 ( 원 /μg) Bioneer 30 μg 27, Sigma 25 μg 259,000 10,360 FGF2 Prospecbio 50 μg 130,000 2,600 Ambion 10 μg 150,000 15,000 BioVision 50 μg 195,000 3,900 hgh Bioneer 66 μg 27, Sigma 10 μg 241,000 24,100 Calml3 Bioneer 40 μg 27, Abnoba 10 μg 309,000 30,900 hlif Bioneer 30 μg 27, Abnoba 2 μg 259, ,500 단백질이름 회사 제품구성 가격 ( 원 ) 가격 ( 원 / Unit) Bioneer 100 units 27, TAKARA 100 units 441,000 4,410 Poly A Ambion 80 units 207,000 2,587 polymerase NEB 100 units 150,000 1,500 Elpisbio 50 unit 88,000 1,760 65

66 2. ExiProgen 합성결과 - Protein 종류 ; FGF2 (Fibroblast growth factor 2), hgh(human Growth Hormone), Calml3(Calmoduline like protein), hlif (Leukemia inhibitory factor), Poly A polymerase - kit; ExiProgen EC Protein Synthesis Kit (Cat. no. K-7300) M: AccuLadder Protein Size Marker (Low), 1; Calml3 2; hgh 3; FGF2 4; hlif 5; Poly A polymerase Related Products Cat. no. Products k-7300 ExiProgen EC Protein Synthesis Kit, 16 reactions K-7310 ExiProgen EC-Maxi Protein Synthesis Kit, 8 reactions 66

67 6. Troubleshooting Guide 당사의 ExiProgen 단백질합성 kit 류를이용하여목적단백질의합성이잘되지않는경우, 아래의 troubleshooting guide 를참조하시어해결하시기바랍니다. 단, 아래의내용은일반적인단백질의합성에대한해결방법을제시해줄수있으나, 모든단백질의합성문제의해결방안에해당되지는않을수있다는점을유의하시기바랍니다. 1. Positive control 단백질의합성이되지않는경우 원인 핵산분해효소 (DNase, RNase) 의오염 해결방안 실험을하실때에는항상장갑을끼고, DNase-, RNase-free 한 pipette tips 을이용하시기바랍니다. Pipetting error 또는시약미첨가 실험을하기전 pipettes 을체크하시고, 정확한양의 DNA 또는시약을첨가하시기바랍니다. 또한 protocol 에따라서모든시약이빠짐없이혼합되었는지확인하시기바랍니다. 시약의보관상태 kit 내의모든시약및구성품은권장하는온도에서보관하시기바라며, 특히 E. coli extract 는 freezing/thawing 을반복하지않도록주의하시기바랍니다. 2. Positive control 단백질은합성되나, 목적단백질이합성되지않는경우 원인 Template DNA 의염기서열 발현벡터의구조 Template DNA 의오염 해결방안 Target gene 을포함하는 codon 의프레임 (ATG (start) ~ TAA, TGA, TAG (Stop)) 이올바른지확인하시기바랍니다. Template DNA 의 ORF (Open Reading Frame) 에 mutation 이생기는경우 translation 중간에합성이끝날수있으니, 반드시 ORF 의서열을확인하시기바랍니다. 목적단백질을발현할수있는유전자는 T7 Promoter 와 terminator 가있는벡터 (ex) pbivt, pk7, pivex, pet 일부 ) 에클로닝하여사용하여야하며, endogenous lac repressor 가생성될수있는벡터의경우에는 IPTG 를첨가하여합성을하셔야합니다. Template DNA 를준비하는과정에서핵산분해효소의오염에의해서 DNA 가분해된경우에는단백질합성이되지않습니다. 3. 목적단백질의합성량이낮은경우 원인 Template DNA 의순도 해결방안 최적화된단백질합성을하기위해서는 template DNA 의순도가높아야합니다. A260/280 값이 1.8~2.0, A260/230 값이 1.5 이상일수록합성효율이높아집니다. 만약 DNA 의순도가낮은경우에는단백질의합성이되지않을수도있습니다. Template DNA 의농도 TemplateDNA 의 E. coli codon 최적화여부 Template DNA 의농도에따라서단백질의합성량에차이가있을수있습니다. 단백질합성량의최대화하기위해서는실험에앞서발현스크리닝을통해서최적 DNA 농도를결정한후, 단백질합성을하시기바랍니다. Template DNA 의염기서열이 E. coli codon 최적화가이루어지지않은경우에는단백질의합성이되지않거나, 합성량이낮을수있습니다. His-tag 의위치 His-tag 의위치에따라서목적단백질의발현을저해시킬수있으며, 단백질의발현에는영향을주지는않으나, 3 차구조형성시외부로노출되지않아서정제가되지않는경우가생길수있습니다. 이러한경우에는 tag 의위치를변경하시기를권장합니다. 67

68 4. 목적단백질의활성또는 solubility 가낮은경우 원인 Post-translational modification 을필요로하는단백질인경우 단백질활성에특정요소를필요로하는경우 단백질의 solubility 가낮아서 aggregation 이되는경우 해결방안 E. coli 를이용한무세포단백질합성시스템에서는 glycosylation, phosphorylation 등과같은 post translational modification 이필요한단백질은합성이불가능합니다. 합성된단백질이활성을나타내기위해서특정요소등을필요로하는경우에는최종적으로정제된단백질용액에이러한요소들을첨가해준후활성을확인하셔야합니다. 단백질합성온도를낮춰주거나, 단백질의 folding 을도와주는 chaperone protein 을첨가한후합성을하면, solubility 가향상될가능성이있습니다. 68

69 7. Ordering Information Instruments ExiProgen (Cat no. A-5041) 세계최초전자동단백질합성및핵산추출장비 MyGenie 96/384 Gradient Thermal (Cat. no. A ) 1분만에 384 well, 1536 well 등의다른 block으로쉽게교체하여사용할수있는혁신적인 PCR Machine Agaro-Power (Cat. no. A-7020) loading adapter가부착된 agarose gel electrophoresis kit 미숙련자도최대 96개의 sample을 2~3분내로빠르게 loading 할수있도록개발된제품 ExiSpin (Cat. no. A-7040) 실험과정중반복되는 vortex 와 spin-down 과정을결합한자동화장비로서 Centrifuge 와 vortex 기능을사용자가기기자체의 program 을이용하여자동으로반복수행할수있음 LabChip GX (122000) 단백질분석및정량을위한완벽한솔루션, Perkin Elmer 사의장비 69

70 Protein Synthesis & Purification kits Cat. no. Products K-7400 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit, 16 reactions K-7401 ExiProgen ProXpress PCR Template Kit, 32 reactions K-7250 AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit, 45 μl x 24 reactions K-7260 AccuRapid Midi Protein Expression Kit, 1 ml x 5 reactions K-7270 AccuRapid Maxi Protein Expression Kit, 10 ml x 1 reaction K-7280 AccuRapid Protein Synthesis Kit, 5 reactions k-7300 ExiProgen EC Protein Synthesis Kit, 16 reactions K-7301 ExiProgen EC Protein Synthesis Kit, 32 reactions K-7302 ExiProgen EC Protein Synthesis Kit, 96 reactions K-7310 ExiProgen EC-Maxi Protein Synthesis Kit, 8 reactions K-7320 ExiProgen EC-Tagfree Protein Synthesis Kit, 8 reactions K-7330 ExiProgen EC-Disulfide Protein Synthesis Kit, 8 reactions K-7220 ExiProgen His-Tagged Protein Purification Kit, 16 reactions K-7221 ExiProgen His-Tagged Protein Purification Kit, 32 reactions K-7230 ExiProgen Cell-Based Protein Purification Kit, 16 reactions 70

71 Related Products Cat. no. Products N 차 primer F/R sets (N terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 N 차 primer F/R sets (C terminus 6x His-tag), each 5 nmole 1 K-2631 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction/tube D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) D-1040 AccuLadder 1 Kb DNA Ladder, 500 μl (130 ng/μl) K K C-9100 Agarose, 100 g C AccuPrep PCR Purification Kit, 50 reactions AccuPrep Gel Purification Kit, 50 reactions Agarose, 500 g C X TBE, 1 gal C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml K-7350 pbivt vectors set-1 K-3111 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit, 200 reactions K-3112 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit, 50 reactions K-3122 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Midi Extraction Kit, 25 reactions K-3131 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Maxi Extraction Kit, 25 reactions K-3132 AccuPrep Nano-Plus Plasmid Maxi Extraction Kit, 10 reactions K-3030 AccuPrep Plasmid Extraction Kit 200 reactions K AccuPrep Plasmid Extraction Kit 50 reactions C % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 500 ml C % Acrylamide, 500 ml D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low), 500 μl D-2010 AccuLadder Protein Size Marker (Broad), 500 μl 8. Service Information Cell Free Protein Synthesis/Expression Service 바이오니아단백질연구팀 Tel : / , Proteinsupport@bioneer.co.kr Gene Synthesis Service 바이오니아 Gene 합성팀 Tel : / , Genesynthesis-support@bioneer.co.kr Sequencing Service 바이오니아 Sequencing 팀 Tel : / , Sequencing-support@bioneer.co.kr Oligo (Primer) Service 바이오니아 DNA 팀 Tel : / , Oligo-support@bioneer.co.kr 1 Oligo synthesis service 문의 71

72 9. References Kim HC, Kim TW, Kim DM (2011) Prolonged production of proteins in a cell free protein synthesis system using polymeric carbohydrates as an energy source. Process Biochemistry 46: Chursov A, Walter MC, Schmidt T, Mironov A, Shneider A, et al. (2011) Sequence-structure relationships in yeast mr- NAs. Nucleic Acids ResIn press. Trotta E (2011) The 3-base periodicity and codon usage of coding sequences are correlated with gene expression at the level of transcription elongation. PLoS ONE 6: e Park S, Hamad-Schifferli K (2010) Enhancement of in vitro translation by gold nanoparticle DNA conjugates. ACS Nano 4: Keum JW, Ahn JH, Kang TJ, Kim DM (2009) Combinatorial, selective and reversible control of gene expression using oligodeoxynucleotides in a cell-free protein synthesis system. Biotechnol Bioeng 102: Ahn JH, Kang TJ, Kim DM (2008) Tuning the expression level of recombinant proteins by modulating mrna stability in a cell-free protein synthesis system. Biotechnol Bioeng 101: Ahn JH, Keum JW, Kim DM (2008) High-throughput, combinatorial engineering of initial codons for tunable expression of recombinant proteins. J Proteome Res 7: Hino M, Kataoka M, Kajimoto K, Yamamoto T, Kido J, Shinohara Y, Baba Y (2008) Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli, wheat germ, and rabbit reticulocytes. J Biotechnol, 133(2): Kim TW, Oh IS, Keum JW, Kwon YC, Byun JY, et al. (2007) Prolonged cell free protein synthesis using dual energy sources: Combined use of creatine phosphate and glucose for the efficient supply of ATP and retarded accumulation of phosphate. Biotechnol Bioeng 97: Ohashi H, Shimizu Y, Ying BW, Ueda T (2007) Efficient protein selection based on ribosome display system with purified components. Biochem Biophys Res Commun, 352(1): Keum JW, Ahn JH, Choi CY, Lee KH, Kwon YC, et al. (2006) The presence of a common downstream box enables the simultaneous expression of multiple proteins in an E. coli extract. Biochem Biophys Res Commun 350: Kim TW, Keum JW, Oh IS, Choi CY, Park CG, et al. (2006) Simple procedures for the construction of a robust and costeffective cell-free protein synthesis system. J Biotechnol 126: Swartz J (2006) Developing cell-free biology for industrial applications. J Ind Microbiol Biotechnol, 33(7): Villemagne D, Jackson R, Douthwaite JA (2006) Highly efficient ribosome display selection by use of purified components for in vitro translation. J Immunol Methods, 313(1-2): Katzen F, Chang G, Kudlicki W (2005) The past, present and future of cell-free protein synthesis. Trends Biotechnol, 23(3): Josephson K, Hartman MC, Szostak JW (2005) Ribosomal synthesis of unnatural peptides. J Am Chem Soc, 127(33): Shimizu Y, Kanamori T, Ueda T (2005) Protein synthesis by pure translation systems. Methods, 36(3): Underwood KA, Swartz JR, Puglisi JD (2005) Quantitative polysome analysis identifies limitations in bacterial cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng, 91(4): Forster AC, Cornish VW, Blacklow SC (2004) Pure translation display. Anal Biochem 2004, 333(2):

73 Torizawa T, Shimizu M, Taoka M, Miyano H, Kainosho M (2004) Efficient production of isotopically labeled proteins by cell-free synthesis: a practical protocol. J Biomol NMR 30: Ying BW, Taguchi H, Ueda H, Ueda T (2004) Chaperone-assisted folding of a single-chain antibody in a reconstituted translation system. Biochem Biophys Res Commun 2004, 320(4): Gualerzi CO, Giuliodori AM, Pon CL (2003) Transcriptional and posttranscriptional control of cold-shock genes. J Mol Biol, 331(3): Rungpragayphan S, Nakano H, Yamane T (2003) PCR-linked in vitro expression: a novel system for high-throughput construction and screening of protein libraries. FEBS Lett 540: Kigawa T, Yamaguchi-Nunokawa E, Kodama K, Matsuda T, Yabuki T, et al. (2002) Selenomethionine incorporation into a protein by cell-free synthesis. J Struct Funct Genomics 2: Frydman J (2001) Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annu Rev Biochem, 70: Shimizu Y, Inoue A, Tomari Y, Suzuki T, Yokogawa T, Nishikawa K, Ueda T (2001) Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol, 19(8): Ramachandiran V, Kramer G, Hardesty B (2000) Expression of different coding sequences in cell-free bacterial and eukaryotic systems indicates translational pausing on Escherichia coli ribosomes. FEBS Lett, 482(3): Jermutus L, Ryabova LA, Pluckthun A (1998) Recent advances in producing and selecting functional proteins by using cell-free translation. Curr Opin Biotechnol, 9(5): Netzer WJ, Hartl FU (1997) Recombination of protein domains facilitated by co-translational folding in eukaryotes. Nature, 388(6640): Roberts RW, Szostak JW (1997) RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Proc Natl Acad Sci U S A, 94(23): Frydman J, Hartl FU (1996) Principles of chaperone-assisted protein folding: differences between in vitro and in vivo mechanisms. Science, 272(5267): Kuriki Y (1986) Stimulation in vitro of expression of the amp gene of pbr322 by soluble protein fractions isolated from E. coli. Biochem Int, 12(4): Zubay G (1973) In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu Rev Genet, 7:

74 74

75 75

76 1. Introduction 핵산추출은유전공학분야에서가장널리사용되는보편적인기술입니다. 생명체에대한유전정보를담고있는핵산은세포나조직, 바이러스나박테리아에서추출되어다양한실험에서사용되고있으며추출이후다음단계의성공적인실험을위해서는고순도의핵산을얻는것이매우중요한일입니다 이러한핵산분리방법으로는유전자재조합기술이발전하면서여러가지방법이개발되어왔습니다. 초기에사용하였던페놀을이용하여핵산을분리정제하는방법은고순도로핵산을추출할수있지만페놀유기용매의위험성으로인해지금은많이사용되지않고있습니다. 이후실리카 resin이나 filter가들어있는 column을사용한형태의추출방식이주목받게되고안정성및그성능을인정받아대부분의핵산정제 kit에서일반적으로사용되고있습니다. 한편유전공학분야의발달과함께다양한시료에서의핵산추출과한번에여러개의시료에서동시에핵산을추출해야하는필요성이증대되면서사용자의편의성및핵산추출효율을높이기위해자동화의필요성이대두되어 silica magnetic bead를사용하여 DNA를추출하는방법이실리카막을사용하는방식에비해막힘현상이없어자동핵산추출에널리사용되고있습니다. 일반적으로 DNA나 RNA를분리하기위해서는먼저세포막을파괴해야합니다. 세포막을파괴하기위하여 guanidine hydrochloride, guanidine thiocyanate, SDS등이사용되며 gram (-) bacteria나효모같이세포벽이있는시료의경우세포벽을가수분해하는 lysozyme 등의전처리를통해세포벽을분해시키는과정이필요합니다. 이후 DNA의경우단백질이나 RNA 혼입을최소한으로하도록진행하며 Proteinase K나 RNase A 처리및세척과정을거치게됩니다. RNA의경우엔세포막파괴시핵막이파괴되지않도록최대한주의하여 DNA 혼입을피하고 RNase에의한 RNA 가수분해를최대한적게하면서고순도의 RNA를추출해야합니다. 바이오니아에서는다양한샘플시료 ( 혈액, 동물조직, 배양세포및식물조직등 ) 로부터고순도, 고수율로 DNA나 RNA를추출할수있는전자동핵산추출장비인 ExiProgen 을개발하였습니다. 본제품은높은 DNA/RNA binding 효율을갖는실리카자성입자 ( 대한민국특허등록번호 : ) 를사용하는제품이며, 사용자편의성을고려하여핵산추출에필요한모든시약 ( 각종효소류포함 ) 이미리분주되어있는 pre-filled buffer cartridge system을채택하였습니다. 또한, 샘플시료및추출하고자하는핵산의타입에따라최적화된구동 protocol이장비에내장되어있어재현성이우수한핵산추출을가능하게하였습니다. 76

77 2. Principle and Selection Guide 2.1. Principle of nucleic acid extraction Chaotropic salt를이용한핵산추출 / 정제기술에대한이론은명확하지않으나일반적으로 structured water와관련된 entropy 효과와 collective salt bridge에근거하고있습니다. 자사제품의 lysis buffer에포함되어있는 chaotropic salt인 guanidine hydrochloride 나 guanidine thiocyanate가세포주위의물분자구조를붕괴하는성질을이용하여표면에있는물분자를제거하여세포막및단백질 3차구조를파괴합니다. 추가로시료종류에따라가온과정이나별도의성분을사용하기도합니다. 이후핵산이유리된상태에서 silica magnetic bead와 chaotropic salt가만나게되면 bead 표면에있는물분자들과용액내에있는양이온분자가치환되고 bead 표면의극성이양극화되어음이온으로되어있는핵산의 backbone이붙게됩니다. 이상태에서장비내에장착되어있는자석으로 bead를잡고 washing buffer로핵산을제외한단백질이나 cell debris, buffer 내의 salt 물질을세척합니다. 생체시료에는다양한종류의 PCR 반응저해물질들이포함되어있어각각의생체시료의구성물질의특성에따라이를제거하기위한최적의세척용액들이사용됩니다. 핵산을정제하는마지막단계로핵산의최적 ph에적합한완충제가포함되어있는수용액을가하게되면 silica bead 표면에결합해있던핵산이 bead에서떨어져나와원하는핵산이고순도로포함되어있는용액을얻을수있게됩니다. Figure I: 실리카자성비드를이용한핵산추출과정 샘플 용해 자성비드와핵산결합 Washing buffer를이용한불 순물제거 핵산용출 77

78 2.2. Selection guide 당사는다양한샘플시료각각에최적화된제품을개발하였습니다. 제품군은크게 DNA prep kit 와 RNA prep kit 로구분할수있으며이에해당되는제품은아래와같습니다. 각각의 kit 는핵산추출에필요한효소및시약이분주되어있는 pre-filled buffer cartridge 및 disposable filter tip, elution tube 등의소모품을제공하며, 최소 1 개부터 16 개의시료에서동시에핵산을추출할수있습니다. 또한 ( 주 ) 바이오니아의독자적인기술로개발된고효율의실리카자성입자가포함되어있어, 고순도고수율의 DNA 및 RNA 를추출할수있습니다. 78

79 3. Product Information 3.1. ExiProgen Blood Genomic DNA Kit ExiProgen Blood Genomic DNA Kit 는전자동핵산추출장비인 ExiProgen 을이용하여전혈시료로부터 genomic DNA 를추출할수있는제품입니다. 본제품은 Lysis Buffer 와 Proteinase K 가 cartridge 내에모두포함되어있어, 전혈시료를별도의전처리없이 sample loading well 에넣으면전자동핵산추출장비에서고순도, 고수율의핵산을재현성있게추출할수있습니다. Features and Benefits 핵산추출에필요한 enzyme 및시약이분주된 pre-filled Buffer cartridge system 사용. 최소 1개부터최대 16개까지의샘플시료를사용가능. 바이오니아의독자적기술로개발, 생산된고효율실리카자성입자사용. 전자동핵산추출장비 (ExiProgen ) 를이용하는제품으로항상재현성있는결과를얻을수있음 Specification Sample type Sample amount DNA yield Ratio OD260/280nm Protocol no. Human Blood 200 μl Up to 3 μg > 1.8 Pig Blood 200 μl Up to 10 μg > Cattle 200 μl Up to 10 μg > 1.8 Application 79

80 Experimental Data Figure 1: 전혈에서추출된 genomic DNA 의전기영동분석결과 M; Size marker (1 kb DNA Ladder, D-1040, Bioneer) S; Extraction with whole blood sample B; Extraction with D.W. only 전혈 (200 μl) 으로부터 genomic DNA 를추출한후 1% agarose gel 에서전기영동을수행한결과입니다. Genomic DNA 추출과정중 cross-contamination 발생여부를확인하기위해전혈을 cross 로넣고나머지 well 에는 D.W. 만넣은후 genomic DNA 추출을진행하였습니다. 실험결과 genomic DNA 추출과정중 cross-contamination 은발생되지않았으며추출된 genomic DNA 의수율은평균 3 μg, 순도 (A260/280) 는평균 1.8 이상으로나타났습니다. Figure 2: ExiProgen Blood Genomic DNA Kit 를이용한 genomic DNA 의추출재현성자동화장비 ExiProgen 을이용하여동일한샘플 ( 전혈 200 μl) 을 16 개각각의 sample loading well 에넣어추출한 genomic DNA 의농도와순도를측정한결과입니다. 모든샘플의농도와순도는각각 10%, 0.7% 의 CV 값으로높은재현성을보입니다. Related Products Cat. no. Products A-5041 ExiProgen K-4311 ExiProgen Blood Genomic DNA Kit, 96 preps D-1040 AccuLadder 1 kb DNA Ladder, 500 μl (130 ng/μl) C-9100 Agarose, 100 g C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml A-7020 Agaro-Power System 80

81 3.2. ExiProgen Tissue Genomic DNA Kit ExiProgen Tissue Genomic DNA kit 는전자동핵산추출장비인 ExiProgen 을이용하여동물조직시료로부터높은수율로고순도의 genomic DNA 를추출할수있는제품입니다. 본제품은 Tissue Lysis buffer 와 Proteinase K 가함께제공되어사용자매뉴얼의시료전처리방법에따라동물조직을매우효과적으로분해할수있습니다. 전처리가완료된 lysate 를 sample loading well 에넣으면전자동핵산추출장비에서재현성있는결과를얻을수있습니다. Features and Benefits 핵산추출에필요한 enzyme 및시약이분주된 pre-filled Buffer cartridge system 사용. 다양한동물조직 lysis에최적화된 Tissue Lysis Buffer 제공. 최소 1개부터최대 16개까지의샘플시료를사용가능. 바이오니아의독자적기술로개발, 생산된고효율실리카자성입자사용. 전자동핵산추출장비 (ExiProgen ) 를이용하는제품으로항상재현성있는결과를얻을수있음. Specification Sample type Sample amount DNA yield Ratio OD260/280nm Protocol no. Skeletal Muscle ~25 mg Up to 20 μg > 1.8 Rat Liver ~25 mg Up to 20 μg > 1.8 Rat Lung ~25 mg Up to 10 μg > 1.8 Mouse Tail-tip ~1 cm Up to 15 μg > Mouse Brain ~25 mg Up to 30 μg > 1.8 Mouse Heart ~25 mg Up to 10 μg > 1.8 Mouse Kidney ~25 mg Up to 30 μg >

82 Application * Muscle, spleen 과같은연한조직 조직 25 mg 을 1.5 ml tube 에넣고 20 μl Proteinase K (20 mg/ml) 와 Tissue Lysis Buffer 400 μl 를첨가하여 60 에서 incubation 합니다. 조직이완전히분해되면 8,000 rpm 에서 2 분간원심분리하여상층액 200 μl 를 sample loading well 에넣고추출을시작합니다. * Mouse Tail 과같은단단한조직 액체질소와막자사발을이용하여조직을파쇄한후 25 mg 을 1.5 ml tube 에옮겨담습니다. Proteinase K (20 mg/ml) 20 μl 와 Tissue Lysis Buffer 400 μl 를첨가하여 60 에서 incubation 합니다. 조직이완전히분해되면 8,000 rpm 에서 2 분간원심분리하여상층액 200 μl 를 sample loading well 에넣고추출을시작합니다. * Tissue Homogenization Set 이용 Tissue filter tube에조직 25 mg을넣은다음 Tissue Lysis Buffer 100 ul를먼저첨가하여 Tissue Homogenizer로샘플이튀지않도록주의하며갈아줍니다. 조직이완전히갈아지면 Tissue Lysis Buffer 100 μl를추가로더넣고 12,000 rpm에서 1분간원심분리하여 filter를통과한용액 200 ul를 sample loading well에넣고추출을시작합니다. 82

83 Experimental Data Figure 1: 동물조직에서추출된 genomic DNA 의전기영동분석결과 M; Size marker (1 kb DNA Ladder, D-1040, Bioneer) 홀수 lane; Extraction with mouse tissue sample 짝수 lane; Extraction with D.W. only 동물조직들 (25 mg/each) 으로부터 genomic DNA 를추출한후 1% agarose gel 에서전기영동을수행한결과입니다. Genomic DNA 추출과정중 cross-contamination 발생여부를확인하기위해 tissue sample 을 cross 로넣고나머지 well 에는 D.W. 만넣은후 genomic DNA 추출을진행하였습니다. 실험결과 genomic DNA 추출과정중 cross-contamination 은발생되지않았으며추출된 genomic DNA 의수율은 15~20 μg, 순도 (A260/280) 는평균 1.8 이상으로나타났습니다. Figure 2: ExiProgen Tissue Genomic DNA Kit를이용한 genomic DNA의추출재현성자동화장비 ExiProgen 을이용하여동일한샘플 (Rat Liver 10 mg) 을 16개각각의 sample loading well에넣어추출한 genomic DNA의농도와순도를측정한결과입니다. 모든샘플의농도와순도는각각 3.3%, 1.2% 의 CV값으로높은재현성을보입니다. 83

84 Related Products Cat. no. Products A-5041 ExiProgen K-4312 ExiProgen Tissue Genomic DNA Kit, 96 preps KA-7030 Tissue Homogenization Set (Mixer, Sticks, and Tubes), 100 reactions KA-7031 Tissue Homogenization Sticks, 100 ea KA-7032 Tissue Filter Tubes, 100 ea KA-7033 Tissue Mixer D-1040 AccuLadder 1 kb DNA Ladder, 500 μl (130 ng/μl) C-9100 Agarose, 100 g C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml A-7020 Agaro-Power System 84

85 3.3 ExiProgen Bacteria Genomic DNA Kit ExiProgen Bacteria Genomic DNA Kit 는 ExiProgen 을이용하여 gram (-) bacteria, gram (+) bacteria 시료로부터높은수율로고순도의 genomic DNA 를추출할수있는제품입니다. 각각의 bacterial cell 배양액으로부터수집된 bacterial cell 에본제품에포함된 Resuspension Buffer 를넣고 vortex mixer 를이용하여완전히섞어줍니다. Resuspension 된시료를 sample loading well 에넣으면 Binding Buffer 와혼합되어실리카자성입자와결합합니다. 자성입자와결합된핵산은 washing 과정을거치면서불순물이제거되어고순도의 genomic DNA 로추출됩니다. Features and Benefits 핵산추출에필요한 enzyme 및시약이분주된 Pre-filled Buffer cartridge system 사용. Bacterial cell resuspension 및 lysis에최적화된 Resuspension buffer 제공. 바이오니아에서독자개발한고효율실리카자성입자사용. ExiProgen 를이용하여항상재현성있는결과를얻을수있음. Specification Sample type Sample amount DNA yield Ratio OD260/280nm Protocol no. Cultured E.coli Up to 1x10 9 cells Up to 10 μg > 1.8 HeLa cells Up to 2x10 6 cells Up to 20 μg > Lyphocytes Up to 2x10 6 cells Up to 10 μg >

86 Application * Gram (-) Bacteria 선택배지에서배양된박테리아를 3,000 rpm 에서 5 분간원심분리하여상층액을제거합니다. ( 최대 1x10 9 cells, OD 600nm =1.0 인경우약 1ml) 또는배양액 1 ml 을취하여 1.5 ml microtube 에옮겨담습니다. 12,000 rpm 에서 1 분간원심분리하여상층액을제거합니다. 제공된 Resuspension Buffer 200 μl 를넣어 pellet 을풀어준다음 sample loading tube 에넣고추출을시작합니다. * Gram (+) Bacteria Gram (+) bacteria의경우 cell wall을분해하기위하여 lysozyme을이용한전처리가반드시필요합니다. 시료전처리및 suspension 과정이불충분할경우 lysis 효율이떨어져수율저하를일으킬수있습니다. 선택배지에서배양된박테리아를 3,000 rpm에서 5분간원심분리하여상층액을제거합니다 ( 최대 1x10 9 cells, OD 600nm =1.0인경우약 1ml) 또는배양액 1 ml을취하여 1.5 ml microtube에옮겨담고 12,000 rpm에서 1분간원심분리하여상층액을제거합니다. 1 x TE (ph 8.0) Buffer 200 μl를넣어 pellet을풀어준후 lysozyme (50 mg/ml) 20 μl를넣고 37 에서 1시간동안반응시킵니다. 반응액을 13,000 rpm에서 5분간원심분리하여상층액을제거합니다. 제공된 Resuspension Buffer 200 μl를넣어 pellet을풀어준다음 sample loading tube에넣고추출을시작합니다. Experimental Data Figure 1: E.coli cell (1X10 9 cells) 를이용한실험결과 M; Size marker (1 kb DNA Ladder, D-1040, Bioneer) S; Extraction with E.coli cell sample B; Extraction with D.W. only E.coli cell (1X10 9 cells) 로부터 genomic DNA 를추출한후 1% agarose gel 에서전기영동을수행한결과입니다. Genomic DNA 추출과정중 cross-contamination 발생여부를확인하기위해 E.coli sample 을 cross 로넣고나머지 well 에는 D.W. 만넣은후 genomic DNA 추출을진행하였습니다. 실험결과 genomic DNA 추출과정중 cross-contamination 은발생되지않았으며추출된 genomic DNA 의수율은평균 10 μg, 순도 (A260/280) 는평균 1.8 이상으로나타났습니다. Figure 2: ExiProgen Bacteria Genomic DNA Kit를이용한 genomic DNA의추출재현성자동화장비 ExiProgen 을이용하여 Staphylococcus aureus 배양샘플을희석하여각각의 sample loading well에넣어추출한 genomic DNA를 Real-Time PCR로증폭한결과입니다. 1x10 5 copies/well 샘플의 Ct value는 1.1% 의 CV값을보이며, 1x10 3 copies/ well 샘플은 0.8% 의 CV값으로높은재현성을보입니다. 86

87 Related Products Cat. no. Products A-5041 ExiProgen K-4314 ExiProgen Bacteria Genomic DNA Kit, 96 preps D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) D-1040 AccuLadder 1 kb DNA Ladder, 500 μl (130 ng/μl) K-2012 AccuPower PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction C-9100 Agarose, 100 g C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml C-9024 PBS (Phosphate-Buffered Saline), 500 ml C-9005 TE (ph 8.0), 500 ml K-6251 AccuPower 2X GreenStar Master mix Solution, 100 rxn A MyGenie 96 Gradient Thermal Block A-2060 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block A-7040 ExiSpin A-7020 Agaro-Power System 87

88 3.4. ExiProgen Plant Genomic DNA Kit ExiProgen Plant Genomic DNA Kit 는전자동핵산추출장비인 ExiProgen 을이용하여각종 plant sample (leaf tissue, seed, root 등 ) 시료로부터고수율, 고순도의 genomic DNA 를추출할수있는제품입니다. 본제품에포함된 Plant Lysis Buffer 와 Proteinase K 는함께제공된사용자매뉴얼의시료전처리방법에따라식물조직을매우효과적으로분해할수있습니다. 분해된시료를 sample loading well 에넣으면 Binding Buffer 와혼합되어실리카자성입자와결합합니다. 자성입자와결합된핵산은 washing 과정을거치면서불순물이제거되어고순도의 genomic DNA 로추출됩니다. Features and Benefits 핵산추출에필요한 enzyme, disposable filter tip, elution tube 등소모품류함께제공. Plant sample의종류에따라최적화된각각의 Plant Lysis Buffer 제공. 바이오니아의독자기술로개발된고효율실리카자성입자사용. 전자동핵산추출장비 (ExiProgen ) 를이용하는제품으로항상재현성있는결과를얻을수있음. Specification Sample type Sample amount DNA yield Ratio OD260/280nm Protocol no. 상추 Up to 15 μg > 1.8 부추 Up to 15 μg > 1.8 Plant Tissue 오이 Up to 100mg wet weight 20mg dry weight Up to 15 μg > 감자 Up to 15 μg > 1.8 브로콜리 Up to 4 μg > 1.8 옥수수 Up to 10 μg > 1.8 Plant Seed 보리 Up to 100mg wet weight 20mg dry weight Up to 8 μg > 콩 Up to 8 μg >

89 Application * 식물조직액체질소를이용하여식물조직을파쇄하여각각 tube 에넣습니다. 샘플에담긴 tube 에제공된 Proteinase K (20 mg/ml) 20 μl 와 Plant Lysis Buffer 300 μl 를넣습니다. 60 에서최소 1 시간 shaking incubation 후 13,000 rpm 에서 5 분간원심분리합니다. 분리된상층액을 sample loading well 에넣고추출을시작합니다. Experimental Data Figure 1: 다양한식물시료에서추출된 genomic DNA 의전기영동분석결과 M; Size marker (1 kb DNA Ladder D-1040, Bioneer), Lane 1-8; 추출된 genomic DNA 다양한샘플시료로부터 genomic DNA 를추출한후 1% agarose gel 에서전기영동을수행한결과입니다. 추출된 genomic DNA 는모두 degradation 없이온전하게잘추출되었음을확인할수있으며추출된 genomic DNA 의수율은 1~10 μg, 순도 (A260/280) 는평균 1.8 이상으로나타났습니다. 89

90 Figure 2: ExiProgen Plant Genomic DNA Kit 를이용한 genomic DNA 의추출재현성자동화장비 ExiProgen 을이용하여동일한샘플 ( 건조된배추 20 mg) 을 16 개각각의 sample loading well 에넣어추출한 genomic DNA 의농도와순도를측정한결과입니다. 모든샘플의농도와순도는각각 4.0%, 0.4% 의 CV 값으로높은재현성을보입니다. Related Products Cat. no. Products A-5041 ExiProgen K-4315 ExiProgen Plant Genomic DNA Kit, 96 preps KB-0111 Proteinase K Powder, 25 mg x 2 ea D-1040 AccuLadder 1 kb DNA Ladder, 500 μl (130 ng/μl) C-9100 Agarose, 100 g C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml A-7020 Agaro-Power System 90

91 3.5. ExiProgen Nano-Plus Plasmid DNA Kit ExiProgen Nano-Plus Plasmid DNA Kit 는 Plasmid DNA 가삽입된 Competent Cell 에서 Plasmid DNA 를분리하기위한 kit 입니다. Silica magnetic bead 와그에최적화된시약으로고농도, 고순도 plasmid DNA 를분리 / 정제할수있도록고안된제품입니다. Kit 에서제공되는 Solution 1, 2, 3 는 Birnboim 의 alkaline lysis method 에바이오니아의독창적인세포잔해입자및단백질제거기술 ( 대한민국등록특허 : ) 이결합된용액들로써용액내포함된 nano-particle 에의해 insoluble complex (nano debris) 가매우단단하게 tube 벽면에고정됨으로써종래실험방법에비해훨씬더깨끗하게 cleared lysate 를얻을수있습니다. 이러한전처리를거친 sample 을 kit 의 loading 칸에주입하여최대 16 개의샘플을 20 분만에추출하여실험자의실험적인시간낭비를최소화하여생물공학연구에많은기여를할수있습니다. Features and Benefits 핵산추출에필요한 enzyme 및시약이분주된 pre-filled buffer cartridge system 사용. 핵산추출에필요한 disposable filter tip, elution tube 등소모품류함께제공. 전자동핵산추출장비 (ExiProgen ) 를이용하는제품으로항상재현성있는결과를얻을수있음. 자동화추출장비로추출된고순도 plasmid DNA는다양한실험에이용. Ligation & transformation Transfection Microinjection Restriction digestion PCR & Real-Time PCR Fluorescent sequencing Specification Sample type Sample amount DNA yield Ratio OD260/280nm Protocol no. E.coli competent cell ~ 4x10 9 CFU/ml Up to 20 μg >

92 Application * Growth of bacterial cultures Plasmid DNA 경우선택 marker 인항생제가포함된배지에서배양된박테리아로부터추출합니다. 추출되는 plasmid DNA 의수율, quality 등은 copy number, stain, 배지종류, 배양시간에따라좌우됩니다. 37 에서 12~16 시간동안진탕배양기에서흡광도 (OD 600nm ) 1.0~2.0 으로배양합니다. 배양된박테리아를 alkaline lysis 하여 cleared lysate 을만든후, 상층액을 sample loading well 에넣고추출을시작합니다. Technical Note * Antibiotic Selection Marker Plasmid DNA 의삽입유무를확인하기위해서사용되는항생제는여러가지종류가있으며사용자의용도와편의에알맞게사용할수있습니다. 적정농도는아래표와같습니다. Antibiotics Working concentration Ampicillin 100 μg/ml Chloramphenicol 170 μg/ml Kanamycin 50 μg/ml Streptomycin 50 μg/ml Tetracycline HCl 50 μg/ml Carbenicillin 50 μg/ml * Antibiotic Selection Marker Plasmid Origin replication Copy number Classification psc101 and derivatives psc10 ~5 Very low copy pacyc and derivatives p15a 10~12 Low copy pbr322 and derivatives pmb1 15~20 Low copy pgem vectors pmb1 300~400 High copy pbluescript vectors ColE1 300~500 High copy puc vectors pmb1 500~700 High copy ptz vectors pmb1 >1,000 High copy 92

93 * enda- and enda+ E.coli Strains enda+ Strains: JM83, JM101, JM110, BL21(DE3), HB101, CJ236, LE392, MC1061, RR1, TB1, TG1, BMH71-18, ES1301, P2392, Q358, NM series, PR series, Y10 series, wild-type enda- Strains: DH5α, DH1, DH20, DH21, BJ5183, JM103, JM105, JM106, JM107, JM108, JM109, NM294, SK1590, SK1592, SK2267, SRB, XL1-Blue, XLO Experimental Data Figure 2: ExiProgen 으로추출한 plasmid 전기영동이미지 M; Size marker; 1 kb DNA Ladder (D-1040, Bioneer) lane1~8; Plasmid extraction from DH-5αcell pgem vector plasmid 를삽입한 DH-5αcell 을 LB broth 에 overnight 하여배양하여 O.D 600nm 에서 1.5 ( 약 1 x 10 9 copies/ml) 의배양액 3 ml 에서추출한결과입니다 ( 동일시료로 8 회반복 ). Related Products Cat. no. Products A-5041 ExiProgen K-4381 ExiProgen Nano-Plus Plasmid DNA Kit, 96 preps D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) D-1040 AccuLadder 1 kb DNA Ladder, 500 μl (130 ng/μl) C-9100 Agarose, 100 g C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml E-1111 ~ E2162 Restriction Enzymes A-7020 Agaro-Power System 93

94 3.6. ExiProgen Gel Extraction Kit ExiProgen Gel Extraction Kit 는전자동핵산추출장비인 ExiProgen 을이용하여최대 500 mg 의 gel 에서다양한 size 의 fragment DNA 를추출하는데있어서매우높은 recovery 를나타내는제품입니다. 본제품에포함된 solubilization buffer 처리후 sample loading well 에넣으면 Binding Buffer 와혼합되어실리카자성입자와결합합니다. 자성입자와결합된핵산은 washing 과정을거치면서불순물이제거되어고순도의 fragment DNA 로추출됩니다. Features and Benefits 핵산추출에필요한시약이분주된 pre-filled buffer cartridge system 사용. 다양한 size의 fragment DNA 추출에최적화된 solubilization buffer 제공. ( 주 ) 바이오니아의독자적기술로개발, 생산된실리카자성입자사용. 고순도, 고수율의 fragment DNA 추출가능. 전자동핵산추출장비 (ExiProgen ) 를이용하는제품으로항상재현성있는결과를얻을수있음. Specification Sample type Sample amount Ratio OD260/280nm Protocol no. Gel slice ~ 500 mg > Application 94

95 * Pre-treatment 정제할 gel slice 를 1.5 ml microtube 에넣고 solubilization buffer 를 1.3 ml 까지채워넣습니다. 60 에서 gel slice 가완전히녹으면용출액 1.3 ml 를모두 sample loading well 에넣고추출을시작합니다. Experimental Data Figure 1: Gel에서추출된 fragment DNA의전기영동분석결과 Lane M; 1 kb DNA Ladder (D-1040, Bioneer), Lane 1, 2, 3, 4; ExiProgen Gel Extraction Kit (K-4391, Bioneer) Lane 5, 6, 7, 8; Company A s kit AccuPower ProFi Taq PCR PreMix (K-2631, Bioneer) 와 MyGenie 96 Gradient Thermal Block (A , Bioneer) 를사용하여 PCR 수행후예상크기가 500 bp인 DNA를합성하였습니다. 합성된시료를 1% agarose gel에서전기영동후 500 mg이되도록 gel 을잘라자사제품및경쟁사의gel extraction kit를사용하여추출후전기영동을수행하여성능을비교하였습니다. 전기영동결과상에서성능을보다객관적으로확인하기위하여좌측에시료사용량의 100%-20% 에해당하는계산수치상의양을전기영동수행하였습니다. 전기영동사진확인결과 500 bp 크기의 fragment DNA의회수율은 80% 이상으로나타났으며각각의순도 (A260/280) 값은모두 1.8 이상으로나타났습니다. Figure 2: Gel에서추출된 fragment DNA의단백질합성결과 Lane M; 1 Kb DNA Ladder (D-1040, Bioneer), Lane 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8; ExiProgen Gel Extraction Kit (K-4391, Bioneer) P; Positive control AccuPower ProFi Taq PCR PreMix (K-2631, Bioneer) 와 MyGenie 96 Gradient Thermal Block (A , Bioneer) 를사용하여 PCR 수행후예상크기가 500 bp인 DNA를합성하였습니다. 합성된시료를 1% agarose gel에서전기영동후 500 mg이되도록 gel을잘라자사제품및경쟁사의gel extraction kit를사용하여추출후전기영동을수행하여성능을비교하였습니다. 이후추출한 fragment DNA로 ExiProgen EC Protein Synthesis Kit (K-7302, Bioneer) 를사용해단백질합성을시도하여합성에문제가없는지확인하였습니다. 대조군과비교해볼때단백질합성에이상이없음을확인하였습니다. 95

96 Related Products Cat. no. Products A-5041 ExiProgen K-4391 ExiProgen Gel Extraction Kit, 96 preps K-2631 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix, 96 tubes D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) D-1040 AccuLadder 1 kb DNA Ladder, 500 μl (130 ng/μl) C-9100 Agarose, 100 g C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml E-1111 ~ E2162 6X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml K-7103 AccuPower Ligation PreMix, 96 tubes, 0.2 ml 8-tube strip, 96tubes, 20 μl reaction/tube A MyGenie 96 Thermal Block A-7040 ExiSpin A-7020 Agaro-Power System 96

97 3.7. ExiProgen PCR Purification Kit ExiProgen Purification Kit 는전자동핵산추출장비인 ExiProgen 을이용하여 PCR 반응물을비롯한다양한효소반응물로부터각종불순물들을완벽히제거하여고순도의 fragment DNA 를정제할수있도록개발된제품입니다. 본제품에포함된 Binding Buffer 를첨가후 sample loading well 에넣으면실리카자성입자를이용해핵산을결합합니다. 자성입자와결합된핵산은 washing buffer 처리로불순물이제거되어고순도의 fragment DNA 로추출됩니다. 정제된 fragment DNA 는 sub-cloning, sequencing, southern blotting, northern blotting 등다양한 downstream 실험에사용됩니다. Features and Benefits 핵산추출에필요한시약이분주된 pre-filled buffer cartridge system 사용. 다양한 size의 fragment DNA 추출에최적화된 Binding buffer 제공. ( 주 ) 바이오니아의독자적기술로개발, 생산된실리카자성입자사용. 고순도, 고수율의 fragment DNA 추출가능. 전자동핵산추출장비 (ExiProgen ) 를이용하는제품으로항상재현성있는결과를얻을수있음. Specification Sample type Sample amount Ratio OD260/280nm Protocol no. PCR product 200 μl > Application 97

98 * PCR product PCR product 에바로 PCR Binding Buffer 0.5 ml 를넣고잘섞은후 buffer cartrdige 1 의 sample loading well 에 500 μl 넣고추출을시작합니다. Experimental Data Figure 1: PCR 반응물에서추출된 fragment DNA 의전기영동분석결과 Lane M; 1 kb DNA Ladder (D-1040, Bioneer), Lane 1, 2; Company A s kit, Lane 3, 4; ExiProgen PCR purification kit (K-4392, Bioneer). AccuPower ProFi Taq PCR PreMix (K-2632, Bioneer) 와 MyGenie 96 Gradient Thermal Block (A , Bioneer) 를사용하여 PCR 수행후예상크기가 500 bp, 3 kb, 5 kb, 9 kb 인 DNA 를합성하였습니다. 합성된시료를자사제품및경쟁사의 PCR purification kit 를사용하여추출후전기영동을수행하여성능을비교하였습니다. 전기영동결과상에서성능을보다객관적으로확인하기위하여좌측에시료사용량의 100% - 20% 에해당하는수치상의 DNA 양으로전기영동을수행하여비교하였습니다. 전기영동사진확인결과 500 bp 크기의 fragment DNA 의회수율은 80% 이상으로나타났으며각각의순도 (A 260/280) 값은모두 1.8 이상으로나타났습니다. Related Products Cat no. Products A-5041 ExiProgen K-4392 ExiProgen PCR Purification Kit, 96 preps D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) D-1040 AccuLadder 1 kb DNA Ladder, 500 μl (130 ng/μl) K-2012 AccuPower PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction C-9100 Agarose, 100 g C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml A MyGenie 96 Thermal Block A-7040 ExiSpin A-7020 Agaro-Power System 98

99 3.8. ExiProgen Tissue total RNA Kit ExiProgen Tissue total RNA Kit 는전자동핵산추출장비인 ExiProgen 을이용하여동물조직시료로부터고수율, 고순도의 total RNA 를추출할수있는제품입니다. 본제품에포함된사용설명서에따라 Tissue Lysis Buffer 1 을이용하여동물조직시료전처리를수행합니다. 시료전처리가완료된샘플에 Tissue Lysis Buffer 2 를넣고잘섞어준후 4, 13,000 rpm 에서 15 분간원심분리를수행합니다. 본과정을통해 lysis 된 cell debris 와 denature 된 protein, chromosomal DNA 가제거됩니다. 이때하얀색의막이형성되는데이막을손상시키지않은채상층액만을조심스럽게취하여 sample loading well 에넣으면 binding buffer 와혼합되어실리카자성입자와결합합니다. 자성입자와결합된핵산은 washing 과정을거치면서불순물이제거되어고순도의 RNA 로추출됩니다. Features and Benefits 핵산추출에필요한시약이분주된 pre-filled buffer cartridge system 사용. 핵산추출에필요한 disposable filter tip, elution tube 등소모품류함께제공. 다양한종류의 animal tissue sample의 lysis에최적화된 Tissue Lysis Buffer 제공. 바이오니아의독자적기술로개발, 생산된실리카자성입자사용. 전자동핵산추출장비 (ExiProgen ) 를이용하는제품으로항상재현성있는결과를얻을수있음. Specification Sample type Sample amount DNA yield Ratio OD260/280nm Protocol no. Liver 15 mg 25 μg > 1.9 Eye-ball 1 ea 10 μg > 1.9 Brain 20 mg 8.5 μg > Tail-tip 15 mg 4 μg >

100 Application * 막자사발을이용한방법 액체질소와막자사발을이용하여 20 mg 의조직을파쇄한후 1.5 ml tube 에넣고 Tissue Lysis Buffer μl 를첨가하여 15 초간 vortex 합니다. Tissue Lysis Buffer μl 를첨가하여 15 초간 vortex 하고얼음에서 5 분간둡니다. 4 로 rpm 에서 15 분간원심분리하고상층액 200 μl 를 sample loading well 에넣고추출을시작합니다. * 기계적파쇄를이용한방법최소얼음위에서 20 mg 의조직을 Tissue Lysis Buffer μl 를첨가하여 Tissue Ruptor 등의기계믹서혹은 Bead Crusher 로파쇄한후 Tissue Lysis Buffer μl 를첨가하여 15 초간 vortex 하고얼음에서 5 분간둡니다. 4 로 rpm 에서 15 분간원심분리하고상층액 200 μl 를 sample loading well 에넣고추출을시작합니다. 100

101 Experimental Data Figure 1: Rat 의조직에서추출된 total RNA 의분석결과 Rat liver sample (15 mg) 로부터 total RNA 를추출한후 LabChip GX (Caliper Life Science) 를이용하여추출된 RNA 의 quality 를분석한결과입니다. rrna 의각 subunit 이잘관찰되는것으로보아 total RNA 추출과정중 RNA 의분해없이온전하게 RNA 가추출되었음을알수있습니다. 또한, 수율은평균 25 μg 이며평균 RQS 는 9.5 이상으로나타났습니다. RQS (RNA Quality Score): 추출된 RNA 의 quality 를수치화하여나타낸값으로각 rrna 피크의높이및넓이, 분해된 RNA fragment 피크등을종합적으로계산하여표시합니다. Agilent 사에의해개발된 RIN (RNA Integrity Number) 와동일한개념이며, 보통 0 부터 10 까지수치로나타나는데 10 에가까울수록 RNA 의 quality 가좋은것으로판단할수있습니다. Figure 2: 추출된 total RNA를이용한 RT-PCR 결과 Rat liver sample 15 m으로부터 total RNA를추출한후 Accuowr RocketScrpt RT PreMix (K-2101, Bioneer) 와 AccuPower Dualstar qpcr PreMix (K-6110, Bioneer) 그리고 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block (A-2060) 를이용하여 RT-qPCR을수행한결과입니다. 101

102 Related Products Cat. no. Products A-5041 ExiProgen K-4342 ExiProgen Tissue total RNA Kit, 96 preps KA-7030 Tissue Homogenization Set (Mixer, Sticks, and Tubes), 100 reactions KA-7031 Tissue Homogenization Sticks, 100 ea KA-7032 Tissue Filter Tubes, 100 ea KA-7033 Tissue Mixer KB-0111 Proteinase K Powder, 25 mg x 2 ea D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) D-1040 AccuLadder 1 kb DNA Ladder, 500 μl (130 ng/μl) K-2101 AccuPower RocketScrpt RT PreMix, 96 tubes K-2501 AccuPower RocketScrpt RT-PCR PreMix, 96 tubes C-9100 Agarose, 100 g C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml A MyGenie 96 Thermal Block A-7040 ExiSpin A-7020 Agaro-Power System 102

103 3.9. ExiProgen Plant total RNA Kit ExiProgen Plant total RNA Kit 는전자동핵산추출장비인 ExiProgen 을이용하여 leaf tissue, root, flower, seed 등다양한종류의식물시료로부터고수율, 고순도의 total RNA 를추출할수있는제품입니다. 본제품에포함된사용성명서에따라전처리가완료된식물시료를 sample loading well 에넣으면 binding buffer 와혼합되어실리카자성입자와결합합니다. 자성입자와결합된핵산은 washing 과정을거치면서불순물이제거되어고순도의 RNA 로추출됩니다. Features and Benefits 핵산추출에필요한시약이분주된 pre-filled buffer cartridge system 사용. 핵산추출에필요한 disposable filter tip, Elution tube 등소모품류함께제공. 다양한종류의식물시료에최적화된 Plant Lysis Buffer 제공. 바이오니아의독자적기술로개발, 생산된실리카자성입자사용. 전자동핵산추출장비 (ExiProgen ) 를이용하는제품으로항상재현성있는결과를얻을수있음. Specification Sample type Sample amount DNA yield Ratio OD260/280nm Protocol no. 벼잎 Up to 3 μg >9.5 Up to 100 mg wet Plant 브로콜리 weight, Up to 5 μg >9.5 Tissue 배추 20 mg dry weight Up to 10 μg > 옥수수 Up to 100 mg wet Up to 5 μg >9.5 Plant Seed 배추 weight, Up to 10 μg > 콩 20 mg dry weight Up to 10 μg >

104 Application * Plant tissue, Seed 액체질소를이용하여 100 mg 의식물조직을파쇄하고 tube 에넣습니다. 샘플이담긴 tube 에 Proteinase K (20 mg/ml) 20 μl 와 Plant Lysis buffer 300 μl 를넣습니다. 60 에서최소 1 시간 shaking incubation 후, 13,000 rpm 에서 5 분간원심분리합니다. 분리된상층액 200 μl 를 sample loading well 에넣고추출을시작합니다. 104

105 Experimental Data Figure 1: 다양한식물시료에서추출된 total RNA 의분석결과 다양한식물시료로부터 total RNA 를추출한후 agarose gel 에서전기영동을수행한결과입니다. rrna 의각 subunit 이잘관찰되는것으로보아 total RNA 추출과정중 RNA 의분해없이 intact 하게 RNA 가추출되었음을알수있습니다. Figure 2: 식물시료에서추출된 total RNA 의 LabChip GX 분석결과 식물조직으로부터 total RNA 를추출한후 LabChip GX (Caliper Life Science) 를이용하여추출된 RNA 의 quality 를분석한결과입니다. rrna 의각 subunit 이잘관찰되는것으로보아 total RNA 추출과정중 RNA 의분해없이 intact 하게 RNA 가추출되었음을알수있습니다. 또한, 수율은평균 10 μg 이며평균 RQS 는 9.5 이상으로나타났습니다. 105

106 Related Products Cat. no. Products A-5041 ExiProgen K-4344 ExiProgen Plant total RNA Kit, 96 preps D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) D-1040 AccuLadder 1 kb DNA Ladder, 500 μl (130 ng/μl) K-2101 AccuPower RocketScrpt RT PreMix, 96 tubes K-2501 AccuPower RocketScrpt RT-PCR PreMix, 96 tubes C-9100 Agarose, 100 g C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml A MyGenie 96 Thermal Block A-7040 ExiSpin A-7020 Agaro-Power System 106

107 3.10. ExiProgen Viral DNA/RNA Kit ExiProgen Viral DNA/ RNA Kit 는전자동핵산추출장비인 ExiProgen 을이용하여 serum, plasma, CSF, saliva 등 cell free body fluid 와 swab 등다양한시료로부터고순도의 Viral DNA/RNA 를추출할수있는제품입니다. 본제품에포함된사용설명서에는 serum, plasma, CSF, saliva 등다양한검체에따라각각최적화된전처리방법이자세히설명되어있습니다. Buffer Cartridge 에는추출과정중바이러스핵산의분해방지및 binding 효율증대를위한 carrier RNA 및효율적인 sample lysis 를위한 Proteinase K 가건조된상태로들어있습니다. Features and Benefits 핵산추출에필요한 enzyme 및 carrier RNA, 시약들이분주된 pre-filled buffer cartridge system 사용. 다양한검체종류에최적화된전처리실험방법제공. 최소 1개부터최대 16개까지의샘플시료를사용가능. 바이오니아의독자적기술로개발, 생산된실리카자성입자사용. 전자동핵산추출장비 (ExiProgen ) 를이용하는제품으로항상재현성있는결과를얻을수있음. Application * Storage 추출된바이러스핵산을장시간보관할경우 -20 에서보관해야합니다. 냉동보관된핵산을반복적으로냉 해동할경우핵산분해의원인이될수있으므로소량분주하여보관합니다. 107

108 Experimental Data Figure 1: HBV 표준물질을이용한최소추출한계확인 저농도 HBV 표준물질과 AccuPower HBV Quantitative PCR Kit (HBV-1111, Bioneer), Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block (A-2060, Bioneer) 을이용하여추출효율을확인한결과 10 IU/ml 이하의저농도바이러스도높은효율로추출됩니다. Figure 2: Body fluid에포함된 impurity의제거확인결과혈액내포함될수있는다양한물질과혼합된저농도샘플 (30 IU/ml HBV) 을추출하여 Real-Time PCR 결과에미치는영향을확인하였습니다. AccuPower HBV Quantitative PCR Kit (HBV-1111, Bioneer) 와 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block (A-2060, Bioneer) 을이용하여추출한 eluant를증폭한결과 control 표준물질과간섭물질이포함된표준물질의 ΔCt 값이 0.7이며, 고순도 viral DNA가추출된것을확인할수있습니다. 108

109 Related Products Cat. no. Products A-5041 ExiProgen K-4371 ExiProgen Viral DNA/RNA Kit, 96 preps D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) D-1040 AccuLadder 1kb DNA Ladder, 500 μl (130 ng/μl) K-2101 AccuPower RocketScrpt RT PreMix, 96 tubes K-2501 AccuPower RocketScrpt RT-PCR PreMix, 96 tubes K-2012 AccuPower PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction C-9100 Agarose, 100 g C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml A MyGenie 96 Thermal Block A-2060 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block A-7040 ExiSpin A-7020 Agaro-Power System 109

110 4. Application 4.1 ExiProgen 을이용한소고기조직의 genomic DNA 추출 한우판별검사에서이용하는소고기조직의 genomic DNA 를추출하기위하여 ExiProgen TM Tissue Genomic DNA Kit 를사용합니다. 소고기시료로부터 genomic DNA 를매우효율적으로추출할수있도록최적화된 lysis buffer 를비롯하여 genomic DNA 추출에필요한효소 (Proteinase K, RNase A) 및시약들이분주된 buffer cartridge 가제공됩니다. Specification Sample type Sample amount DNA yield Ratio OD260/280nm Protocol no. Bovine Muscle 10~40 mg Up to 10 μg > Application * 연한조직조직 25 mg을 1.5 ml tube에넣고 20 ul Proteinase K (20 mg/ml) 와 Tissue Lysis Buffer 400 μl를첨가하여 60 에서 incubation 합니다. 조직이완전히분해되면 8,000 rpm에서 2분간원심분리하여상층액 200 μl를 sample loading well에넣고추출을시작합니다. 110 * Tissue Homogenization Set 이용 Tissue filter tube 에조직 25 mg 을넣은다음 Tissue lysis buffer 100 μl 를먼저첨가하여 Tissue Homogenizer 로샘플이튀지않도록주의하며갈아줍니다. 조직이완전히갈아지면 Tissue Lysis Buffer 100 μl 를추가로더넣고 12,000 rpm 에서 1 분간원심분리하여여 filter 를통과한용액 200 μl 를 sample loading well 에넣고추출을시작합니다.

111 Experimental Data M S B S B S B S B S B S B S B S B Figure 1: 소고기조직시료에서추출된 genomic DNA의전기영동분석결과 M; Size marker (1 kb DNA Ladder, D-1040, Bioneer) S; Extraction with bovine tissue sample B; Extraction with D.W. only 소고기조직시료 (40 mg) 으로부터 genomic DNA를추출한후 1% agarose gel에서전기영동을수행한결과입니다. Genomic DNA 추출과정중 cross-contamination 발생여부를확인하기위해소고기조직시료를 cross로넣고나머지 well에는 D.W. 만넣은후 genomic DNA 추출을진행하였습니다. 실험결과 genomic DNA 추출과정중 cross-contamination은발생되지않았으며추출된 genomic DNA의수율은평균 10 μg, 순도 (A260/280) 는평균 1.8 이상으로나타났습니다. Figure 2: 소고기조직의 genomic DNA에서 GAPDH 유전자를증폭한결과소고기조직 (40mg) 에서 genomic DNA를추출한후, MyGenie TM 96 Thermal Block (A ) 을이용하여 GAPDH 유전자를증폭한후 1% agarose gel로확인한결과입니다. 16개의샘플에서모두동일한사이즈 (1kb) 에서증폭되어높은재현성을확인할수있습니다. Figure 3: Real-Time PCR을이용하여한우판별결과 Black; FAM - 한우판별 probe ExiProgen Tissue Genomic DNA Kit를이용하여추출한 genomic DNA를 template로한우판별 marker 증폭한결과입니다. 판별 marker 유전자를포함하고있는샘플의경우 signal이 detection 됩니다. 111

112 Related Products Cat. no. Products A-5041 ExiProgen K-4312 ExiProgen Tissue Genomic DNA Kit, 96 preps KA-7030 Tissue Homogenization Set (Mixer, Sticks, and Tubes), 100 reactions KA-7031 Tissue Homogenization Sticks, 100 ea KA-7032 Tissue Filter Tubes, 100 ea KA-7033 Tissue Mixer, 1 ea KB-0111 Proteinase K Powder, 25 mg x 2 ea D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) D-1040 AccuLadder 1 kb DNA Ladder, 500 μl (130 ng/μl) K-2012 AccuPower PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction C-9100 Agarose, 100 g C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml A MyGenie 96 Thermal Block A-2060 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block A-7040 ExiSpin A-7020 Agaro-Power System 112

113 4.2 ExiProgen 이용한쌀종자 genomic DNA 추출 쌀품종판별을위하여 genomic DNA 를추출할경우자동핵산추출장비인 ExiProgen 과 ExiPrep Rice Genomic DNA (K-3200-CR) 를사용할수있습니다. 쌀시료로부터 genomic DNA 를매우효율적으로추출할수있도록최적화된 lysis buffer 와 enzyme 및시약들이분주된 buffer cartridge 가모두제공되어사용자편의성이극대화되었습니다. Specification Sample type Sample amount DNA yield Ratio OD260/280nm Protocol no. Rice 10~20 mg 1~2 μg > Application * 쌀알건조된쌀알을막자사발을이용하여파쇄하거나액체질소를이용하여파쇄한후각각 tube에넣습니다. 샘플에담긴 tube에제공된 Proteinase K (20 mg/ml) 20 μl와 Rice Lysis Buffe 400 μl를넣습니다. 60 에서최소 30분간 shaking incubation 하여쌀조직이분해되면 Rice Binding Buffer를 200 μl를넣고강하게 vortex합니다. 13,000 rpm에서 5분간원심분리하여분리된상층액을 sample loading well에넣고추출을시작합니다. 113

114 Experimental Data M Figure 1: 쌀에서추출된 genomic DNA 의전기영동분석결과 M; Size marker (1 kb DNA Ladder, D-1040, Bioneer) Lane 1-8; Extraction with rice samples 도정된백미시료로부터 genomic DNA 를추출한후 1% agarose gel 에서전기영동을수행한결과입니다 M M cv. samkwang cv. wunkwang M M Figure 2: 쌀에서추출된 genomic DNA 를이용한 PCR 결과 M; Size marker (100 bp DNA Ladder, D-1030, Bioneer) Lane 1-8; PCR product with extracted genomic DNA 추출된 genomic DNA 를이용하여각각의 PCR primer set 로 PCR 을수행한후 1% agarose gel 에서전기영동을수행한결과입니다. 삼광, 운광품종에대한 marker size band 가정확히확인되며 DK34, DK2401 marker size 도일치합니다. DK34 primer set DK2401 primer set Figure 3: ExiProgen Rice Genomic DNA Kit를이용한 genomic DNA의추출재현성자동화장비 ExiProgen 을이용하여동일한샘플 ( 쌀알 10 mg) 을 16개각각의 sample loading well에넣어추출한 genomic DNA의농도와순도를측정한결과입니다. 모든샘플의농도와순도는각각 21.8%, 1.8% 의 CV 값으로높은재현성을보입니다. 114

115 Related Products Cat. no. Products A-5041 ExiProgen K-3200-CR ExiPrep Rice Genomic DNA Kit, 96 preps KB-0111 Proteinase K Powder, 25 mg x 2 ea D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) D-1040 AccuLadder 1 kb DNA Ladder, 500 μl (130 ng/μl) K-2012 AccuPower PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction C-9100 Agarose, 100 g C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml A MyGenie 96 Thermal Block A-2060 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block A-7040 ExiSpin A-7020 Agaro-Power System K-2010 ~ K-2017 AccuPower PCR PreMix K-2018 ~ K AccuPower PCR Master mix K-2611 ~ K-2614 AccuPower PyroHotStart Taq PCR PreMix K-2631 ~ K-2634 AccuPower ProFi Taq PCR PreMix K-2022 ~ K-2027 AccuPower Pfu PCR PreMix K-6100 ~ K-6104 AccuPower DualStar qpcr PreMix K-6200 ~ K-6214 AccuPower Greenstar qpcr PreMix K-6251 ~ K-6254 AccuPower 2X Greenstar qpcr Master Mix K-6600 ~ K-6603 AccuPower Plus DualStar qpcr PreMix 115

116 4.3 ExiProgen 을이용한 paraffin embedding sample 에서의 genomic DNA 추출 ExiProgen Tissue Genomic DNA kit 를사용하여조직검사를위한 FFPE sample 에서 genomic DNA 를추출할수있습니다. Specification Sample type Sample amount DNA yield Ratio OD260/280nm Protocol no. Tissue Parraffin ribbon 1 Slide Up to 3 μg > Application * FFPE Slide 시료 FFPE Slide 시료 (~ 3 μg) 를 1.5 ml tube 에옮기고, 1 ml 의 xlyene 을넣어 10 초간강하게섞은후 2 분간실온에서 13,000 rpm 이상으로원심분리합니다. 상층액을제거한후, 1 ml 의 ethanol 을넣고잘섞어줍니다 (voltex). 다시실온에서 2 분간 13,000 rpm 이상으로원심분리하여상층액을제거하고뚜껑을연상태로 10 분간실온에두어남아있는 ethanol 을증발시켜제거합니다. ExiProgen Tissue Genomic DNA Kit 의 lysis buffer 200 μl 와 Proteinase K 20 μl 를사용하여 56 도에서 1 시간 incubation 하고, 13,000 rpm 에서 5 분간원심분리하여분리된상층액을 sample loading well 에넣고추출을시작합니다. 116

117 Experimental Data Figure 1: Breast cancer FFPE Slide 의 genomic DNA 에서유전자를 Real-Time PCR 로증폭한결과 Breast cancer FFPE Slide sample 에서추출한 genomic DNA 로다양한 gene 을 target 으로하여 Real-Time PCR 한결과입니다. PCR Inhibition 없이원활하게증폭됨을확인할수있습니 Related Products Cat. no. Products A-5041 ExiProgen K-4312 ExiProgen Tissue Genomic DNA Kit, 96 preps KB-0111 Proteinase K Powder, 25 mg x 2 ea D-1030 AccuLadder 100 bp DNA Ladder, 250 μl (135 ng/μl) D-1040 AccuLadder 1 kb DNA Ladder, 500 μl (130 ng/μl) K-2012 AccuPower PCR PreMix, 96 tubes, 20 μl reaction C-9100 Agarose, 100 g C X TAE, 500 ml C X Agarose Gel Loading Buffer, 2 ml A MyGenie 96 Thermal Block A-2060 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block A-7040 ExiSpin A-7020 Agaro-Power System 117

118 5. Troubleshooting guide 당사의 ExiProgen 핵산추출키트류를이용하여핵산추출이잘되지않는경우, 아래의 troubleshooting guide 를참조하시어해결하시기바랍니다. 아래의내용은당사의제품을사용하는데있어서효율적인핵산추출을위해흔히발생할수있는일반적인문제점에대한해결방법을예시하고있습니다. 아래의모든경우에해당하지않는문제점이있으실경우나특수한시료로부터핵산추출문제에대해서는 으로문의해주시기바랍니다. ( 단, 새로운프로토콜개발을통한고객지원은당사의자체적인판단에의해결정되며무상지원대상에해당되지않을수도있다는점을유의하시기바랍니다.) 1. 핵산이추출되지않는경우원인 시료의양이너무적거나많음 전처리과정의미처리 유효기간이지난제품의사용 부적절한제품보관 kit 와맞지않는 Protocol 의사용 장비오작동 카트리지위치의뒤바뀜 Tip 을 Tip rack 에꽂지않은경우 카트리지 Sealing film punching 을하지않은경우 시료를 Sample loading well 에분주하지않은경우 잘못된위치에 Elution tube 를삽입한경우 해결방안 사용설명서에명시된시료량을사용하지않을경우성능을보장할수없습니다. 반드시사용설명서에표기된양을사용하여주시기바랍니다. 시료에따라별도의전처리과정이필요합니다. 전처리과정진행시반드시사용설명서에표기된방법으로진행하여주시기바랍니다. 당사의핵산추출키트의유효기간은 2 년입니다. 반드시제품옆면에유효기간을확인하여사용해주시기바랍니다. 유효기간의지난제품의경우성능을보장할수없습니다. 키트보관온도는 입니다. 15 이하에서보관할경우용액내석출이발생할수있으며 30 이상에서보관할경우 cartridge 의포장에이상이발생하여오염될수있습니다. 제품보관에유의하여주시기바랍니다. 핵산추출 kit 마다 ExiProgen 장비에서의고유 protocol 이있습니다. ExiProgen 장비에서사용하시는핵산추출 kit 에적용되는 protocol 외에다른 protocol 을선택하여사용하시는경우핵산이추출되지않을수있습니다. 사용하시고자하는핵산추출 kit 에해당하는 protocol 을장비에서선택하여사용해주시기바랍니다. 장비의성능을개선하기위해 ExiProgen 장비의 protocol 업데이트가진행되었을시, 재부팅하지않고사용하시면장비가오작동하여핵산이추출되지않을가능성이있습니다. ExiProgen 장비의 protocol 업데이트를하신경우, 장비를재부팅해주시기바랍니다. 1 번 cartridge 와 2 번 cartridge 의위치가뒤바뀐경우, 핵산추출이되지않습니다. Base plate 에핵산추출 kit 를올바르게위치하여사용해주시기바랍니다. Tip rack 에 Tip 을꽂아장비내장착하지않으면, 장비는구동되나핵산이추출되지않습니다. 반드시사용설명서를숙지하시고 Tip 을 Tip rack 에꽂아사용해주시기바랍니다. 매뉴얼을숙지하시고샘플수에맞춰사용하는 Tip 의위치와일치하도록정확한위치의 cartridge Sealing film 에구멍을뚫어사용해주시기바랍니다. 시료는반드시 Sample loading well 에분주하여야합니다. 다른위치에분주할경우, 핵산추출이되지않을수있습니다. 잘못된 elution tube rack 위치에 elution tube 가삽입된경우추출된핵산을회수할수없게됩니다. 사용설명서를숙지하시고 elution tube 를정확한 elution tube rack 위치에삽입한후사용해주시기바랍니다. 118

119 2. 추출된핵산의농도 (Yield) 가낮은경우 원인 해결방안 시료의양이너무적거나많음 사용설명서에명시된시료량을사용하지않을경우추출된핵산의농도가낮아질수있습니다. 반드시사용설명서에표기된양을사용하여주시기바랍니다. 부적절한전처리과정 전처리가필요한시료의경우반드시사용설명서에표기된방법에따라전처리를수행하여주시기바랍니다. Lysis buffer 를시료에처리시시료가완전히녹지않을경우추출효율이떨어질수있습니다. Lysis buffer 처리후가온과정이필요한 kit 의경우 incubation 과정중간에여러차례 inverting 을실시해주시면추출율을높일수있습니다. 시료의보관상태이상 시료보관중에핵산이분해되어추출된핵산의농도가낮을수있습니다. 가급적신선한시료를사용하여주시기바랍니다. Catridge 의뒤집힘또는기울어짐 Cartridge 보관및사용전기울이거나반대로뒤집어둔경우, cartridge 내용액이 cartridge 벽면또는윗면에남게되어추출효율에영향을줄수있습니다. 이러한경우 cartridge 를 spin down 하여용액이 cartridge 벽면또는윗면에남아있지않도록한후, 사용해주시기바랍니다. 유효기간이지난 kit 의사용 유효기간이지난제품의경우성능을보장할수없습니다. 당사의핵산추출 kit 의유효기간은 2 년입니다. 반드시제품옆면에유효기간을확인하여사용해주시기바랍니다. 변질된핵산추출 kit 의사용 kit 보관온도는 입니다. 15 이하에서보관할경우용액내석출이발생할수있으며, 이런경우용액의조성비의변하여추출효율이떨어질수있습니다. 30 이상에서보관할경우 cartridge 의변형및용액의변성이발생할수있습니다. 보관온도에유의하여사용해주시기바랍니다. kit 와맞지않는 protocol 의사용 핵산추출 kit 마다 ExiProgen 장비에서의고유 Protocol 이있습니다. ExiProgen 장비에서사용하시고자하는핵산추출 kit 에적용되는 protocol 외에다른 protocol 을선택하여사용하시는경우핵산추출효율이떨어지거나추출이안될수있습니다. 사용하시고자하는핵산추출 kit 에해당하는 protocol 을장비에서선택하여사용해주시기바랍니다. 119

120 3. 추출된핵산의순도 (Purity) 가낮은경우 원인 해결방안 유효기간이지난 kit 의사용 유효기간의지난제품의경우성능을보장할수없습니다. 당사의핵산추출 kit 의유효기간은 2 년입니다. 반드시제품옆면에유효기간을확인하여사용해주시기바랍니다. 변형된 cartridge 의사용 kit 보관온도는 입니다. 30 이상에서보관하여 cartridge 가변형되면 elution buffer 에에탄올및염의오염이발생될수있습니다. 제품의보관온도조건에유의하여주시고, 외관상부풀어올랐거나휘어짐이나타난 cartridge 는사용하지마시기바랍니다. Cartridge Sealing 필름의 Punching 이불완전하게된경우 Cartridge Sealing 필름이불완전하게뚫린경우, Tip 끝에 sealing 필름이닿아용액간오염이발생하여수있습니다. 사용전 cartridge Sealing 필름을완전하게뚫고사용해주시기바랍니다. 시료의양이너무많음 사용설명서에명시된시료량을초과하여사용하는경우추출된핵산의순도가낮아질수있습니다. 반드시사용설명서에표기된양을사용하여주시기바랍니다. 불충분한전처리과정 전처리과정이충분히진행되지않은경우, 경우에따라단백질제거가불완전하게진행되어추출된핵산의순도가떨어질수있습니다. 전처리가필요한시료의경우반드시사용설명서에표기된방법에따라전처리를수행하여주시기바랍니다 kit 와맞지않는 protocol 의사용 핵산추출 kit 마다 ExiProgen 장비에서의고유 Protocol 이있습니다. ExiProgen 장비에서사용하시고자하는핵산추출 kit 에적용되는 protocol 외에다른 protocol 을선택하여사용하시는경우핵산추출효율및추출된핵산의순도가떨어집니다. 반드시사용하시고자하는핵산추출 kit 에해당하는 protocol 을장비에서선택하여사용해주시기바랍니다. 120

121 4. 장비의이상동작이발생한경우 장비의이상동작으로작동이멈추었을때는 LCD 화면의작동모드에서 STOP 혹은 Pause 를클릭하고충돌이일어난위치랑장비및 kit 의손상여부를확인합니다. 동작을중지시키고장비가초기화되면 kit 를모두제거하는것을권장합니다. Tip 이장비에장착되어있을경우모든 kit 제거후장비 Display 초기 Menu 의 MISC SET 버튼으로 Syringe Block 을앞으로가져오고 Tip 을버릴빈용기를밑에두고 Setup - TIP OUT 버튼으로제거할수있습니다. 만약초기화및 kit 제거불량등의이상이발생하여실행이불가능하면업체에수리의뢰를요청합니다. 원인 장비 Protocol 업데이트 cartridge Sealing 필림을 Punching 하지않고동작시킴 Waste tray 의미장착 cartridge 커버를제거하지않았음 해결방안 장비의성능을개선하기위해 ExiProgen 장비의 Protocol 업데이트가진행되었을시, 재부팅하지않고사용하시면장비의오작동가능성이있습니다. ExiProgen 장비의 Protocol 업데이트를하신경우, 장비의전원을껐다가다시켜주시기바랍니다. cartridge Sealing 필름을뚫지않고사용하게되면, Tip 이 cartridge 에꽂혀작동이멈추게됩니다. 반드시사용전 cartridge Sealing 필름을뚫고사용해주시기바랍니다. Waste tray 를장착하지않고사용하시면, cartridge 내모든용액이장비내부로스며들어장비의회로계통의고장을일으킬수있습니다. 사용전사용설명서를숙지하시고 Waste tray 를반드시장착하신후장비를구동하시기바랍니다. cartridge 커버 ( 투명한플라스틱재질 ) 를제거하지않고장비를동작시키면 Tip 과커버가충돌하여장비동작이상을일으킬수있습니다. cartridge 커버를제거하신후장비를동작시켜주시기바랍니다. cartridge 의불완전한장착 cartridge 가 Base plate 에들뜬상태로끼워진경우, Tip 이휘어지며장비가오작동하게됩니다. cartridge 를장착하실때, Base plate 에밀착하도록장착해주시기바랍니다. 휘어진 Tip 의사용 휘어진 Tip 을사용하는경우, Tip 과 cartridge 의충돌이발생할수있습니다. 휘어진 Tip 이있을경우, 반드시정상 Tip 으로교환하여사용해주시기바랍니다. 5. 장비이상동작관련원인 장비의이상혹은전원이상, 잘못된 protocol 업데이트 해결방안 Protocol 을재업데이트하고아무것도넣지않는상태로작동시켜정상적으로종료되는지확인합니다, 필요시업체에수리의뢰를요청합니다. Tip loading 중충돌, Buffer Cartridge 뚜껑미제거, 기기내 kit 의잘못된장착또는잘못된 protocol 업데이트 충돌확인시 LCD 화면의작동모드에서 STOP 혹은 Pause 를클릭하고충돌이일어난위치와장비및 kit 의손상여부를확인합니다. 손상시동작을중지시키고장비가초기화되면 kit 를모두제거하고재실험하는것을권장합니다. Tip 이 Syringe Block 에꽂혀있는경우모든 kit 제거후장비 Display 초기 Menu 의 MISC SET 버튼으로 Syringe Block 을앞으로가져옵니다. Tip 을버릴바구니를밑에두고 Setup - TIP OUT 버튼으로제거할수있습니다. 만약초기화및 kit 제거불량등의이상이발생하여실행이불가능하면업체에수리의뢰를요청합니다. 121

122 6. Ordering Information Instruments ExiProgen (Cat no. A-5041) 세계최초전자동단백질합성및핵산추출장비 MyGenie 96/384 Gradient Thermal (Cat. no. A ) 1분만에 384 well, 1536 well 등의다른 block으로쉽게교체하여사용할수있는혁신적인 PCR Machine Agaro-Power (Cat. no. A-7020) loading adapter가부착된 agarose gel electrophoresis kit 미숙련자도최대 96개의 sample을 2~3분내로빠르게 loading 할수있도록개발된제품 ExiSpin (Cat. no. A-7040) 실험과정중반복되는 vortex 와 spin-down 과정을결합한자동화장비로서 Centrifuge 와 vortex 기능을사용자가기기자체의 program 을이용하여자동으로반복수행할수있음 LabChip GX (122000) 단백질분석및정량을위한완벽한솔루션 122