Glutathione Excellose handbook - Purification of GST fusion proteins - Looking for more detail Purification protocol? - Glutathione Excellose Spin Kit

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본임 박
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MiniExcellose - Glutathione Excellose www.

1 Glutathione Excellose handbook - Purification of GST fusion proteins - Looking for more detail Purification protocol? - Glutathione Excellose Spin Kit - Glutathione MiniExcellose - Glutathione Excellose Tel : Fax :

2 Introduction Glutathione Excellose 는 바이오프로젠이개발한단백질및펩타이드분리정제용크로마토그래피담체인 Excellose 에 GST (glutathione S-transferase) 와선택적으로결합하는 ligand 를도입하여 GST 융합단백질을 one-step 으로정제하기위해사용하는친화성크로마토그래피담체입니다. Glutathione Excellose 는정제목적및스케일에따라다양한형태로제공되고있습니다. 제품 사용목적 Binding capacity* 제품용량 Cat. No. Glutathione Excellose Spin Kit 소량의배양액 (1 ml ~ 10 ml) 으로부터단백질을정제 단백질정제조건을최적화하기위해한번에많은실험을수행 75 μg/ spin column (final vol. of resin = 250 μl) 20 rxns 52 rxns AEx-GL-SK20 AEx-GL-SK50 Glutathione MiniExcellose ie 배양액 (20 ml ~ 100 ml) 으로부터단백질을정제 발현율이낮은단백질의정제조건을최적화하기위해한번에많은실험을수행 ~ 1 mg/ column 3 ml AEx-GL-M03 Glutathione Excellose 대량단백질의정제 300 μg/ resin ml 10 ml 50 ml 100 ml AEx-GL-1 AEx-GL-2 AEx-GL-3 *Binding capacity 를위해사용된단백질은 glutathione S-transferase (GST, 25 kda) 이발현되도록형질전환된균주로부터얻은 cell lysates 상태입니다.

3 Flow Chart of Process using Glutathione Excellose Spin Kit Cell lysate Glutathione Excellose Binding Washing Centrifuge Elution Pure GST fusion protein

4 Protocols of Glutathione Excellose Spin Kit 크로마토그래피중에서가장정제효율이높은흡착 (affinity) 크로마토그래피는근래에가장많이일반적으로사용되고있는정제방법입니다. 그러나높은순도의단백질을얻고자한다면한가지방법혹은일률적인방법으로는불가능합니다. 대부분의경우, 최적의정제법을확립하기위해서는다소의시행착오를염두에두고행해져야합니다. 본매뉴얼에제공되는방법은가장일반적인정제조건입니다. 따라서정제하고자하는단백질을고순도로얻기위해서는정제조건의변화나다른정제시스템이도입되어지는것이바람직합니다. Kit contents Product Quantity Cat. No. Component Composition (1X 기준 ) Glutathione Excellose Spin Kit (20) 20 rxn AEx-GL- SK20 10 X Washing buffer 1 X Elution buffer PBS (137 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 10 mm Na 2 HPO 4, 2 mm KH 2 PO 4 ) PBS + 10 mm reduced glutathione Spin column 20 Collection tube 20 Glutathione Excellose Spin Kit (50) 52 rxn AEx-GL- SK50 10 X Washing buffer 1 X Elution buffer Spin column 52 PBS (137 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 10 mm Na 2 HPO 4, 2 mm KH 2 PO 4 ) PBS + 10 mm reduced glutathione Collection tube 52

5 Preparation of the cell lysate 세포파쇄에앞서 SDS-PAGE를통해정제하고자하는단백질의성질 ( 불용성단백질, 가용성단백질 ) 및단백질의발현율을확인합니다. 단백질의발현율이높은경우 (> 10 mg / liter) 에는원래배양액의 5X 로농축되어져야합니다. 다시말해서정제하고자하는단백질이발현율높은가용성단백질이라면 10 ml의배양액은 2ml의buffer* 를첨가하여 sonication 한후에원심분리를통해상등액을회수하면됩니다. 단백질의발현율이낮은경우 ( 2 ~ 5 mg/liter), 원래배양액의 20X 로더높은농축이필요합니다. * 메뉴얼에제공되는정제조건을이용할경우 buffer 는 washing buffer 를사용하시면됩니다. 만일정제하고자하는단백질용액과본메뉴얼에사용되는 washing buffer 가다르다면 1) 정제하고자하는단백질용액을 washing buffer 로바꾸거나혹은 2) Washing buffer 를단백질용액과같은 buffer system 으로바꿔서사용하시면됩니다. ex) 단백질용액 50 mm sodium acetate, 0.3 M NaCl, ph 6.0일경우 -1) 처음부터 cell을다시키워서buffer system을맞출수도있고dialysis를이용하여 buffer 교환할수있습니다. 단백질용액 : PBS, ph 7.4 Washing buffer : PBS, ph 7.4 Elution buffer : Washing buffer + 10 mm reduced glutathione -2) 단백질용액 : 50 mm sodium acetate, 0.3 M NaCl, ph 6.0 Washing buffer : 50 mm sodium acetate, M NaCl, ph Elution buffer : Washing buffer + 10 mm reduced glutathione

6 배양 원심분리 (6,000 rpm, 15 min) 상등액제거 Washing (50 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8.0) 원심분리 (6,000 rpm, 15 min) 상등액제거 세포파쇄 원심분리 (12,000 rpm, 20 min) 상등액회수 Pellet 제거 Filtering (0.22 μm) 단백질용액

7 Instrument and lab supplies Table top centrifuge, 1.5ml microtubes, microtube rack Buffers Washing Buffer : PBS (137 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 10 mm Na 2 HPO 4, 2 mm KH 2 PO 4 ), ph 7.4 Elution Buffer : washing buffer + 10 mm reduced glutathione 1. Collection tube에 spin column을끼운후마이크로튜브랙에놓습니다. 2. Glutathione Excellose 를잘흔들어섞은후 0.5 ml 씩컬럼에분주합니다 (final resin vol ml). - 정확한양을분주하고싶으시다면 microtube에 pipet을이용하여 0.25 ml의 D.W. 를첨가하여유성펜으로표시하고표시된만큼 Glutathione Excellose 를첨가하여 volume을맞추어사용하시면됩니다 X g ( 약 2,000 rpm) 에서 2분간원심분리한후 collection tube안의 eluate를버립니다. 4. Washing buffer 를 ml 가한후 pipeting 을통하여잘섞어줍니다. 2분간원심분리한후 collection tube안의 eluate를버립니다. 5. Spin column에단백질용액을 0.5 ml 가하고 pipeting을통하여잘섞어준후 2분간상온에방치한후에2분간원심분리합니다. - 발현율이낮은단백질용액의경우 5번과정을한번더반복하면정제 yield를높일수있습니다. - 원심분리속도는매우중요합니다. 원심분리속도가너무높다면단백질용액과 resin이접촉하는시간이짧아져서 binding capacity가낮아질수있습니다. - 원심분리시간은단백질용액의농축된상태나점도에따라더많은시간이소요될수도있습니다. 6. 컬럼을통과한 flow-through fraction을 microtube에옮겨둡니다. 7. Washing buffer를 0.5 ml 가하고 pipeting을통하여잘섞어준후2분간 원심분리합니다 ( 필요시 2 회더반복 ).

8 - 발현율이높은단백질인경우 washing은 2회정도면충분합니다. 그러나발현율이낮은단백질의경우높은순도의단백질을얻기위해서 3회의 washing이필요합니다. 8. 컬럼을통과한 wash fraction을모아둡니다. 9. Elution buffer를 0.3 ml 가하고 pipeting을통하여잘섞어준후에원심분리합니다. - 효율적인 elution을위하여최소한첨가된 resin과동량의 buffer를첨가하여 pipeting으로충분히섞어준후원심분리합니다. 10. 컬럼을통과한 eluate를모아보관합니다. 11. SDS-PAGE를이용하여 purification yield를분석합니다. - 단백질용액과 flow-through fraction, wash fraction, elution fraction순으로 SDS-PAGE 걸어정제효율을분석합니다. 상기에언급된방법은일반적인방법으로서사용자의단백질결합특성에따라정제방법이달라질수도있습니다.

Protocols of Glutathione MiniExcellose Before starting 메뉴얼에제공되는 Glutathione Miniexcellose 방법은원심분리기대신중력을이용한다는부분만다를뿐앞서설명한 Glutathione Excellose Spin Kit 사용방법과유사합니다.

Composition of Glutathione MiniExcellose Column cap Excellose resin End cap Frits Test tube Buffers Washing Buffer : PBS, ph 7.

9 Protocols of Glutathione MiniExcellose Before starting 메뉴얼에제공되는 Glutathione Miniexcellose 방법은원심분리기대신중력을이용한다는부분만다를뿐앞서설명한 Glutathione Excellose Spin Kit 사용방법과유사합니다. 본메뉴얼에제공되는방법은가장일반적인정제조건입니다. 따라서사용자의단백질결합특성에따라정제조건이달라질수도있습니다. Composition of Glutathione MiniExcellose Column cap Excellose resin End cap Frits Test tube Buffers Washing Buffer : PBS, ph 7.4 Elution Buffer : Washing buffer + 10 mm reduced glutathione 1. Column cap과보존액을제거합니다. 2. End cap을제거하고컬럼을 test tube와연결하여랙에고정합니다. - 제품에첨가된 test tube들은컬럼과연결시압력이걸리는것을막기위하여 tube 위쪽에작은구멍이뚫어져있습니다. 3. Washing buffer 6 ml을컬럼에분주합니다. 4. 중력에의하여모아진 washing buffer를버립니다. 5. 3, 4 단계를한번더반복합니다. 6. 컬럼에단백질샘플을가하고컬럼을통과한 flow-through fraction을 tube에모아둡니다. - 발현율이낮은단백질용액의경우 6번과정을한번더반복하면정제 yield를높일수있습니다.

10 7. 컬럼을새 tube와연결한후, washing buffer 6 ml을가합니다. 8. 컬럼을통과한 wash fraction을 tube에모아둡니다. - 발현율이높은단백질인경우 washing은 2회정도면충분합니다. 그러나발현율이낮은단백질의경우높은순도의단백질을얻기위해서 3회의 washing이필요합니다. 9. Elution buffer를 3 ml 가하고컬럼을통과한 eluate를모아보관합니다. - 효율적인 elution을위하여최소한첨가된 resin과동량이상의 buffer를첨가하여 elution 합니다. - 본제품에공급되는 tube의상단부에는작은구멍이뚫어져있는관계로 eluate를보관할때는새로운 tube로옮겨서보관해주시기바랍니다. 10. SDS-PAGE를이용하여 purification yield를분석합니다. - 단백질용액과 flow-through fraction, wash fraction, elution fraction순으로 SDS-PAGE 걸어정제효율을분석합니다. 상기에언급된방법은일반적인방법으로서사용자의단백질결합특성에따라정제방법이달라질수도있습니다.

11 Protocols of Glutathione Excellose Batch protocol Instrument and lab supplies Column, LC system Buffers Washing Buffer : PBS, ph 7.4 Elution Buffer : washing buffer + 10 mm reduced glutathione 1. Resin을필요한양만큼분주합니다. -Resin의양은메스실린더나눈금이있는 tube를이용해측정합니다. 2. Resin 안에있는기포를충분히제거합니다 (degasing). 3. Glutathione Excellose 를기포가들어가지않도록컬럼안쪽에유리막대를대고천천히유리막대를따라흘리도록합니다. 4. Resin이충분히가라앉으면 LC system과연결합니다. 5. 충진한 resin에 resin volume의 3 ~ 5 배정도의 D.W. 를흘려줍니다. 6. Washing buffer를 resin volume의 5배정도를흘려 resin을충분히평형화 시킵니다. 7. Column에단백질용액을가하여 resin과단백질용액이결합되도록합니다. - 충진한 resin volume의 binding capacity를고려하여적절한단백질용액을 loading 합니다. 8. Washing buffer를 resin volume의 5배정도로흘려결합하지않은단백질과 contaminant protein을제거합니다. 9. Elution Buffer를 resin volume의 5배정도흘려줍니다. 10. Column을통과한fractions은 SDS-PAGE를이용하여 purification yield를분석합니다. - 단백질용액과 flow-through fraction, wash fraction, elution fraction순으로 SDS-PAGE 걸어정제효율을분석합니다. 상기에언급된방법은일반적인방법으로서사용자의단백질결합특성에따라정제방법이달라질수도있습니다.

12 Regeneration & storage 1. 충진한 resin 에 resin volume 의 5 배정도의 D.W. 를흘려줍니다. 2. Column에 resin volume의 5배정도의 50 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, ph 8.5 용액을흘려줍니다. 3. 다시 resin volume 의 5 배정도의 D.W. 를흘려줍니다. 4. Column 에 resin volume 의 5 배정도의 100 mm sodium acetate, 0.5 M NaCl, ph 4.5 용액을흘려줍니다. 5. Resin volume 의 5 배정도의 D.W. 를다시흘려줍니다. 6. 곧바로사용하기위해서는 washing buffer 를흘려 resin 을충분히평형화시킨후 정제실험을진행합니다. 만일장기간보관할시에는 20% ethanol 용액을흘려미생물로부터 resin 을 보호합니다,

13 Troubleshooting Guide 단백질이 Glutathione Excellose 와결합하지않는경우 1) GST tag 의존재유무확인 Sequencing 을통해 sequence 확인및 reading frame 체크한다. 2) GST tag 의 glutathione binding 부분이단백질구조상안으로숨은경우 3) 결합조건이적합하지않은경우 소량의 denaturants 나 detergents 를첨가하여정제과정을수행한다. 모든용액과 buffer의 ph가같은지확인 (resin을평형화시킨 buffer와단백질용액의 ph가다른경우결합이일어나지않으며 aggregation이발생할수도있음 ) 한다. 단백질이 washing 과정중에용출되는경우 1) Buffer 의문제적합한 ph 인지확인한다. 2) GST tag 의 glutathione binding 부분의일부분이단백질구조상안으로숨은경우 소량의 denaturants 나 detergents 를첨가하여정제과정을수행한다. 정제과정중단백질이침전되는경우 1) 온도문제정제과정중온도가너무낮은경우에발생할수있으며상온에서다시실험을수행한다. 단백질이 elution 과정중에용출되지않는경우 1) Elution 조건확인 Glutathione 의농도나 salts 의농도를높인다. 단백질이 elution 과정중에다른많은 contaminant protein 과함께용출된경우 1) 단백질들간의 interaction 문제 ~ 20 mm β-mercaptoethanol을첨가하여 S-S 결합을약화시킨다. Salts 혹은 detergents의농도를높여준다. Washing 단계에서 buffer에 ethanol이나 glycerol을첨가해서 washing 을수행한다.

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